Instituto Superior Tcnico de Lisboa

Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica

Bioqumica e Biologia Molecular
1 semestre 2015/2016

TP1 - Titulao potenciomtrica de Aminocidos

TP2 - Determinao da concentrao de uma protena pelo
mtodo de Bradford. Anlise de protenas por
Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Ana Barriga

N 80865

Diana Serrano

N 81860

Miguel Tenreiro N 81856

ndice
Pgina
Resumo........3
Fundamentos Tericos e Experimentais4
Resultados..7
Discusso..13
Anexos...20
Bibliografia.22

Resumo
As protenas, macromolculas biolgicas, so constitudas por aminocidos. Existem,
no total, 20- aminocidos fundamentais, sendo estes determinados pelo cdigo gentico.
Cada um dos aminocidos contm um carbono central ou que se liga a um grupo amina,
NH2, um grupo carboxilo, COOH, um tomo de hidrognio e um grupo R, varivel de
aminocido para aminocido. As protenas desempenham variados papis na clula, desde o
de suporte/estrutura, ao cataltico e regulador da expresso gnica, sendo o seu estudo de
grande interesse para a Bioqumica. A funcionalidade das protenas est diretamente
relacionada com a sua estrutura: arranjos 3D (estrutura terciria) ou mesmo associao de
vrias protenas (estrutura quaternria) viabilizam e facilitam a funo das protenas,
conferindo-lhes maior estabilidade, cooperatividade e eficincia na sua atividade.
No TP1 foi realizada uma titulao potenciomtrica para dois aminocidos: a alanina
e o cido glutmico. Esta tem com o objetivo a determinao, a partir do mtodo da derivada,
os valores de pKa da alanina e do cido glutmico. Os valores de pKa da alanina obtidos foram
pKa1 = 2,71 e pKa2 = 9,44. A partir destes dados foi possvel calcular o ponto isoeltrico deste
aminocido, pI = 6,33. Os valores de pKa do cido glutmico, obtidos foram pKa1 = 2,65,
pKaR = 4,18 e pKa2 = 9,73.
No TP2 foi determinada a concentrao de solues de Azurina, Catalase, BSA e
Ovalbumina pelo mtodo de Bradford, bem como a estimativa do seu peso molecular por
eletroforese SDS-PAGE. A determinao da concentrao da Azurina, Catalase, BSA e
Ovalbumina foi feito com recurso a valores de absorvncia experimentais, obtendo-se,
respetivamente, os seguintes valores: 440,33 mg/L, 468,67 mg/L, 178,67 mg/L, 281,17 mg/L
e 257,00 mg/L. A tcnica de eletroforese, que se baseiam na sujeio das protenas a um
campo eltrico e consequente migrao em funo da sua densidade de carga, permitiu
determinar o peso molecular das solues de protenas utilizadas por comparao da
mobilidade eletrofortica com a de protenas de massa molecular conhecida (peso molecular
padro). Comprovou-se que quanto maior for o peso molecular, menor a distncia percorrida
no gel. Os valores obtidos para a Azurina, Catalase, BSA e Ovalbumina foram,
respetivamente, 15,58 KDa, 60,08 KDa, 60,74 KDa e 46,85 KDa, para um primeiro gel; e 15,90
KDa, 57,87 KDa, 60,04 KDa e 46,85 KDa, para um segundo gel.

Fundamentos Tericos e Experimentais

Titulao potenciomtrica de Aminocidos
Na 1 experincia foi estudado o comportamento cido-base
de dois aminocidos: a alanina e o cido glutmico (ver Figura 1). A
pH 7 (pH neutro em sistemas biolgicos), o aminocido apresenta o
grupo amina protonado e o grupo carboxilo desprotonado, para alm
de que o seu grupo R tambm pode se encontrar
protonado/desprotonado dependendo da sua constituio. Assim,
aminocidos que no contenham um grupo adicional cido ou bsico
no grupo R comportam-se como cidos diprticos. o caso da
alanina. Por sua vez, o cido glutmico possui um grupo R cido,
comportando-se como cido triprtico. No primeiro caso, na titulao
potenciomtrica com uma base forte gera-se uma curva de dois
patamares; no segundo caso a curva tem 3 patamares.

Figura 1_Estrutura da alanina (em cima);

Estrutura do cido glutmico (em baixo).

No laboratrio precedeu-se titulao

potenciomtrica destes dois aminocidos com o NaOH
com o intuito de determinar os valores de pKa.
A Figura 2 representa a curva de titulao tpica
para um aminocido que se comporta como cido
diprtico, sem grupo R ionizvel. Esta uma curva de
dois patamares pelo que existiro dois valores de pKa.
Num aminocido, pKa1 corresponde ionizao do
grupo carboxilo e pKa2 corresponde ionizao do
grupo amina. Os pontos A e C representam os pontos
de equivalncia da titulao, em que a concentrao de
cido igual de base. Atendendo equao de
Handerson-Hasselbach
pH = pKa + log (

[Base]
[cido]

Figura 2_Curva de titulao tpica de dois

patamares para um aminocido.

conclui-se que os pKa pretendidos correspondem aos valores de pH medidos nos pontos A e
C, i.e., a ordenada desses pontos. A determinao desses pontos feito com base no mtodo
da derivada. Sabe-se que os pontos de inflexo correspondem a mximos da 1 derivada,
pelo que desenhando a derivada da curva de titulao facilmente se determina as
coordenadas dos pontos B e D. A partir da, determinam-se as coordenadas de A e C (pontos
mdios) e, consequentemente, o valor pretendido.

Determinao da concentrao de uma protena pelo mtodo de Bradford. Anlise

de protenas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)
As tcnicas de electroforese constituem na migrao de ies sob a ao de um campo
eltrico. A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) de protenas um mtodo rpido e
sensvel para analisar a composio de misturas proteicas complexas (crude), utilizando uma
propriedade comum a todas elas: apresentam carga eltrica global ao estarem num meio cujo
pH diferente do ponto isoeltrico. Assim, submetendo a mistura a um campo eltrico,
possvel provocar a sua migrao. A PAGE utiliza gis de poliacrilamida (polmero de
acrilamida) que permitem a separao molecular segundo tamanho/forma bem como a
mobilidade electofortica. Em gel, a mobilidade electofortica de molculas de menores
dimenses bastante superior s de maiores dimenses. Por sua vez, o pH do gel
suficientemente elevado (~ 9) para que a grande maioria das protenas fique com carga
eltrica negativa, movendo-se em direo ao polo positivo do eltrodo quando a corrente
estiver ligada. Isto deve-se adio Dodecil Sulfato de Sdio (SDS)
+
[CH3 (CH2 )10 CH2 O SO
3 ]Na

detergente fortemente negativo (rodeia as cadeias proteicas e confere-lhes carga negativa) e

desnaturante. Deste modo, a electroforese em gel SDS-PAGE permite garantir que migrao
electrofortica das protenas depender apenas da razo carga/massa. Tal como ilustrado
na Figura 3, no final obtm-se as protenas dispostas segundo o seu peso molecular. As
bandas so visualizadas recorrendo a corantes como o nitrato de prata ou o azul de
coomassie. Na figura as colunas 2, 10 e 17 contm amostras de massa molecular padro que
serviro para elaborar a reta de calibrao do logaritmo da massa molecular em funo da
mobilidade relativa das protenas, i.e., distncia percorrida. Consequentemente, ser possvel
determinar uma estimativa para a massa molecular de cada uma das protenas da mistura e,
caso for necessrio, proceder sua identificao.

Figura 3_Aspecto final da SDS-PAGE com

azul de coomassie.

No laboratrio, pipetou-se, em primeiro lugar, 25 L de cada protena em pequenos

tubos, aos quais tambm foi adicionado 25 L de uma soluo contendo o corante azul de
Coomassie e tambm Dodecil Sulfato de Sdio (SDS). Utilizou-se amostras de Albumina
Srica Bovina (BSA), Catalase, Azurina e Ovalbumina, todas elas puras. De seguida, em cada
um desses tubos foi colocado em gua a ferver durante cerca de 5 minutos para que as
protenas sofressem desnaturao. A desnaturao fundamental realizao da
electroforese, uma vez que destri a estrutura terciria e quaternria da protena. De seguida,
5

prosseguiu-se para a montagem da electroforese, a qual consiste em duas placas, uma de

vidro e outra de cermica, que assentam numa base, entre as quais se encontra o gel
desnaturante de poliacrilamida. Na elaborao dos gis procedemos de acordo o que estava
indicado no protocolo [1]. Na parte superior existem poos atravs das quais se vo colocar
as amostras anteriormente preparadas. Dado que usmos dois gis, cada um deles com 15
poos, foram utilizados no total 30 poos para dentro dos quais pipetou-se cerca de 5 L de
cada soluo preparada. Em alguns dos poos, normalmente o primeiro e o ltimo, pipetouse a mesma quantidade de soluo padro.
Finalmente, j com a soluo tampo de electroforese na base, a qual permite a
manuteno de um valor de pH constante, ligou-se os eltrodos da electroforese fonte de
energia, regulada para uma voltagem de 150 V. A base da electroforese funcionou como
nodo e a parte superior como ctodo, pelo que as protenas migraram para a base do
aparelho. Uma vez concluda a migrao das protenas, que durou cerca de uma hora,
desligou-se os eltrodos da fonte de energia. O azul de coomassie, por estabelecer ligaes
muito fortes com as protenas e muito fracas com o gel de poliacrilamida, permite que as
protenas, uma vez separadas, no se movam no gel, aps a finalizao da eletroforese. Findo
o processo de espera, separou-se, cuidadosamente, as placas dos gis, mergulhando-os
imediatamente na soluo de electroforese. Foram posteriormente descorados, para as
bandas se tornarem mais evidentes.

Enquanto se processava a electroforese, preparmos as amostras para a

determinao da concentrao de cada uma das protenas pelo mtodo de Bradford. O
mtodo de Bradford um mtodo colorimtrico que se baseia na formao de um complexo
entre o corante azul de coomassie e as protenas, cujo mximo de absoro corresponde a
um comprimento de onda de 595 nm.
Pipetou-se cerca de 5L de cada protena para uns tubos, diluindo-se depois a soluo
com fator 10 e juntando-se 2,5 mL de azul de coomassie. Noutro tubo, colocou-se, para
referncia 500 L de gua e tambm 2,5 mL de azul de Coomassie. Introduzidos os tubos no
espectrofotmetro, procedeu-se ao registo dos valores de asorvncia registados para cada
uma das protenas em dois ensaios. Depois de obtidos os valores para as absorvncias
calcularam-se as concentraes das protenas pela Lei de Lambert-Beer.

Resultados
Titulao potenciomtrica de Aminocidos
As curvas de titulao dos dois aminocidos foram feitas custa de dados recolhidos
laboratorialmente, a uma temperatura de 19,4 C (71 medies de pH e volume adicionado
de NaOH para o cido glutmico; 43 medies para a alanina). A derivada da curva de titulao
foi obtida, ponto a ponto, usando a noo de taxa mdia de variao (Grficos 1 e 2 e Anexos).
Aps a representao das duas curvas para cada um dos aminocidos procedeu-se
determinao dos pKa: pKa1, que corresponde ionizao do grupo carboxilo, e o pKa2 , que
corresponde ionizao do grupo amina. No caso do cido glutmico ainda existe pKaR ,
correspondente ionizao do grupo carboxilo adicional presente no radial.
Procedemos ao clculo dos respetivos pKa recorrendo ao mtodo da derivada,
fazendo interpolao linear sempre que necessrio para determinar os valores de pH para os
quais no havia medies de volume obtidas laboratorialmente.
Para a alanina obteve-se pKa1 = 2,71 e pKa2 = 9,94.
Para o cido glutmico obteve-se pKa1 = 2,65, pKaR = 4,18 e pKa2 = 9,73.

Alanina
25,0

20,0

Curva de
Titulao

pH

15,0

10,0

Derivada da
Curva de
Titulao

5,0

0,0

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

Volume de NaOH (mL)

Grfico 1_Curva de titulao da alanina e respetiva e derivada.

cido Glutmico
25,0

20,0

Curva de
Titulo

pH

15,0

10,0

Derivada da
Curva de
Titulao

5,0

0,0

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

Volume de NaOH (mL)

Grfico 2_Curva de titulao do cido glutmico e respetiva e derivada.

Determinao da concentrao de uma protena pelo mtodo de Bradford. Anlise

de protenas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Determinao da concentrao de uma protena pelo mtodo de Bradford

O mtodo de Bradford permitiu no s o clculo da

concentrao de cada uma das protenas, mas igualmente o
clculo da massa de protena que foi ser aplicada no gel da
elctroforese. Em primeiro lugar procedeu-se determinao
da concentrao das vrias amostras de protenas
preparadas. Tal como foi descrito na seco anterior foram
determinadas as absorvncias de cada soluo no
espectrofotmetro e a concentrao foi determinada por
aplicao da Lei de Lambert-Beer ( = [M]).
A equao da reta de calibrao encontrada no rtulo da
soluo de azul de coomassie + SDS (Figura 4) corresponde,
Figura 4_Reta de calibrao no rtulo da
de facto, aplicao dessa Lei em que:
soluo de azul de coomassie + SDS.

= 0,0006 + 0,0073

Absorvncia = 0,0006 concentrao + 0,0073

8

Substituindo os valores de absorvncia obtidos laboratorialmente na relao linear

obtiveram-se as seguintes concentrao de cada soluo, os quais esto detalhados na
Tabela 1.
Tabela 1_Concentrao das solues de protena aplicadas nos gis.

Protenas

Absorvncia

Azurina
Azurina
Catalase
Catalase
BSA
BSA
Ovalbumina
Ovalbumina
Azurina
Azurina

0,268
0,275
0,115
0,114
0,169
0,183
0,107
0,216
0,286
0,291

Concentrao
(mg/L)
434,5
446,1666667
179,5
177,8333333
269,5
292,8333333
166,1666667
347,8333333
464,5
472,8333333

Determinao da massa de protena aplicada no gel

m

Sabemos que a concentrao de uma dada protena por c = V , pelo que o valor
procurado para a massa de protena o produto entre a concentrao da soluo de protena
pelo volume total de cada protena aplicada no gel.
As concentraes das vrias protenas foram anteriormente determinadas pelo mtodo de
Bradford. Para cada uma das protenas usou-se o valor mais provvel da concentrao.
Quanto ao volume, sabemos que em cada amostra utilizada foram utilizados 25 L de
protena e 25 L de soluo tampo. Em cada poo pipeta-se cerca de 5 L de cada amostra
de 50 L. Portanto, tem-se, por poo, 2,5 L de soluo de protena e 2,5 L de soluo
tampo, uma vez que a mistura homognea. Por gel tem-se:
3 amostras com BSA: 3 2,5 = 7,5 L
3 amostras com Catalase: 3 2,5 = 7,5 L
3 amostras com Ovalbumina: 3 2,5 = 7,5 L
4 amostras com Azurina: 4 2,5 = 10 L
As massas determinadas para cada protena por gel encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2_Valor mdio da massa de protena aplicada nos gis.

BSA
Catalase
Ovalbumina
Azurina

Concentrao (mg/L)

Volume (L)

Massa (g)

2,8117 104

7,5

2,11

7,5

1,34

7,5

1,98

10

4,545

1,7867 10

2,57 104
4,545 10

A massa total de protena aplicada por gel consiste na soma das massas anteriores:
+ + + = (2,11 + 1,34 + 1,98 + 4,545)g = 9,975g
10g de protena aplicadas por gel

Separao electrofortica de protenas por SDS-PAGE

Concluda a electroforese os aspectos finais dos dois gis de poliacrilamida foi a que
est ilustrada nas Figuras 5 e 6.

Figura 5_
Protenas utilizadas em cada poo no gel 1:
1,15- Soluo-padro molecular
2,7,11- BSA
3,8,12- Catalase
4,10,13- Ovalbumina
5,6,9,14- Azurina

Figura 6_
Protenas utilizadas em cada poo no gel 2:
1,15- Soluo-padro molecular
2,7,11- BSA
3,8,12- Catalase
4,10,13- Ovalbumina
5,6,9,14- Azurina

Nos poos 1 e 15 de cada um dos gis foi adicionada uma soluo de padro molecular
(NZYTECH Marker II). Medindo a distncia migrada em pixeis com o auxlio do programa
informtico Paint foi possvel a elaborao de uma reta de calibrao, uma para gel utilizado
(logaritmo na base 10 do peso molecular em kDa em funo da distncia migrada em pixeis).
Os resultados obtidos esto nas Tabelas 3 e 4 e Grficos 3 e 4.

10

Tabela 3_Pesos moleculares padro (e

logaritmo do peso molecular padro) e
correspondente distncia percorrida em pixis
para o gel 1.

Grfico 3_Reta de calibrao para o gel 1.

Tabela 4_Pesos moleculares padro (e

logaritmo do peso molecular padro) e
correspondente distncia percorrida em pixis
para o gel 2.

Grfico 4_Reta de calibrao para o gel 2.

As retas obtidas so da forma: log(Peso molecular) = Distncia percorrida + .

Essa equao equivalente a

Peso molecular = 10Distncia percorrida+ .

Utilizando a equao anterior e medindo, de forma semelhante, as distncias migradas de cada

uma das protenas colocadas em cada um dos poos dos ges foi possvel estimar o seu peso molecular
(em KDa). Os valores obridos para as protenas do gel 1 e para o gel 2 esto, respectivamente, nas
Tabelas 5 e 6.
11

Tabela 5_Pesos moleculares para as protenas aplicadas no gel 1.

Tabela 6_Pesos moleculares para as protenas aplicadas no gel 2.

de salientar que no foi possvel obter uma estimativa para o poo 11 do gel 2 por a
banda no ter ficado ntida o suficiente para se poder medir a distncia migrada.

12

Discusso
Titulao potenciomtrica de Aminocidos

Estrutura e carga dos aminocidos ao longo da curva de titulao

Para a alanina, temos uma curva de titulao que indica a existncia de dois valores
de pKa distintos: um que corresponder desprotonao do grupo carboxilo e outro ao do
grupo amina. O radical metil da alanina, CH3 , no sofre ionizao.
Inicialmente a alanina apresenta-se com a composio +NH3 CHCH3 COOH, em que
nenhum dos seus grupos funcionais sofreu desprotonao (carga +1). medida que se
adiciona NaOH, atinge-se o primeiro ponto de equivalncia (PE1 , de coordenadas (2.15; 2.71)).
Neste ponto h igual concentrao de COOH e COO , sendo que metade das molculas de
alanina tem estrutura +NH3 CHCH3 COOH e a outra metade est sob a forma +NH3 CHCH3 COO.
A ordenada do primeiro ponto de equivalncia PE1 (pH do titulado) coincide tambm com o
primeiro pKa1 para este ponto de equivalncia, conforme indicado na equao de
Henderson-Hasselbach. De seguida, verifica-se uma subida de pH muito acentuada,
atingindo-se o primeiro ponto de inflexo da curva (PI1 ). O grupo carboxilo de todas as
molculas de alanina encontra-se desprotenado, sendo que esto sob a forma
+
NH3 CHCH3 COO . Este o ponto onde a carga total do aminocido nula.
O declive da curva de titulao volta a diminuir, o que indica uma estabilizao do valor
de pH at ser atingido o segundo ponto de equivalncia (PE2 , de coordenadas (4.73; 9.94)).
Verifica-se, agora, igual concentrao das espcies +NH3 e NH2 , onde em metade das moles
de alanina o grupo amina j desprotonou, encontrando-se sob a forma NH2 CHCH3 COO, e a
restante metade sob a forma +NH3 CHCH3 COO. semelhana de PE1 , a ordenada de PE2
corresponde ao valor de pKa2 .
H de novo um aumento do valor de pH, indicando que a totalidade dos grupos amina
j se encontra desprotonada. Atingiu-se o segundo ponto de inflexo da curva (PI2 ). Neste
ponto todas as molculas de alanina aminocido esto sob a forma NH2 CHCH3 COO . O
aminocido encontra-se ento com uma carga -1.

: 100% +NH3 CHCH3 COOH

: 50% +NH3 CHCH3 COOH e 50% +NH3 CHCH3 COO
: 100% +NH3 CHCH3 COO
: 50% +NH3 CHCH3 COO e 50% NH2 CHCH3 COO
: 100% NH2 CHCH3 COO

13

Grfico 5_Curva de titulao da alanina com os pontos de interesse assinalados.

Para o cido glutmico, a titulao foi semelhante mas nela foram obtidos trs valores
de pKa. Existe mesma pKa1, correspondente desprotonao do grupo carboxilo , pKa2 ,
correspondente desprotonao do grupo amina, e surge, ainda, pKaR , relacionado com a
desprotonao do grupo carboxilo presente no radical R. Este grupo carboxilo sofre
desprotonao primeiro que o grupo amina, pois revela um carcter mais cido. Este
aminocido apresenta uma carga inicial de +1.
Assim, na curva de titulao do cido glutmico, podemos distinguir os pontos:

PE1 , primeiro ponto de equivalncia (coordenadas (1.275; 2.65)), cujo valor de

pKa1 igual ao pH nesse local. A apenas 50% das moles do aminocido tm o
grupo carboxilo totalmente desprotonado.

PI1 , primeiro ponto de inflexo, indicador de uma variao brusca no valor de pH;
neste ponto os grupos carboxilo de todas as molculas de cido glutmico j se
encontram desprotonados. H um equilbrio entre as cargas positivas e as cargas
negativas, pelo que a carga total do aminocido nula.

PER , segundo ponto de equivalncia (coordenadas (3.40; 4.18)), onde metade dos
grupos carboxilos do grupo R esto desprotoados. O valor de pKaR corresponde
ao valor de pH nesse ponto.

PI2 , segundo ponto de inflexo, onde todas os grupos carboxilos dos grupos R,
esto desprotonados. A carga do aminocido , ento -1;

PE2 , terceiro ponto de equivalncia (coordenadas (6.33; 9.73)),cujo valor de pKa2

igual ao pH nesse local. A apenas 50% das moles do aminocido tm o grupo
amina totalmente desprotonado.
14

Por fim, todos os grupos amina foram ionizados e a carga final do aminocido -2.

Grfico 6_Curva de titulao do cido glutmico com os pontos de interesse assinalados.

15

Poder tampo da alanina e do cido glutmico

O poder tampo da soluo de um aminocido define-se, qualitativamente, como a

capacidade que o aminocido tem de resistir a mudanas de pH, face adio do titulante
bsico, neste caso o NaOH. Consequentemente, quanto menor a alterao do pH medida
que se adiciona NaOH, maior ser o poder tampo. Este depende do pKa e das concentraes
das vrias espcies nas solues em causa.
Em termos quantitativos, verifica-se quando a derivada da curva de titulao
aproximadamente constante. Na alanina considerou-se haver poder tampo entre as adies
1.35 mL a 2.35 mL, 3.70 mL a 5.85 mL e 7.05 mL a 9,40 mL de NaOH. No cido glutmico
verificou-se haver poder tampo entre as adies de 0.75 mL a 4.1 mL, 5.6 mL a 6.75 mL e
8.35 mL a 9.6 mL de NaOH. Estas regies correspondem a zonas na curva de titulao onde
o valor de pH estabiliza, no havendo variaes bruscas, ainda que seja adicionado um
volume considervel de titulante.

Determinao do ponto isoeltrico da alanina

No caso dos aminocidos, o ponto isoeltrico o valor de pH para o qual este tem
carga neutra, isto , o ponto para o qual o h equivalncia entre as cargas positivas e as
cargas negativas. O seu valor corresponde mdia aritmtica entre pKa1 e pKa2 .
pKa1 + pKa2
2
Para a alanina, sabe-se que este atingido no primeiro ponto de inflexo, PI1 , em que
h um equilbrio entre as cargas positiva do grupo amina, estando sob a forma +NH3 , e
negativas do grupo carboxilo, tendo o COOH passado a COO . Assim:
Ponto isoeltrico =

2,71 + 9,94
= 6,33
2

Comparao dos valores tabelados e os obtidos experimentalmente

Nas Tabelas 7 e 8 esto, novamente, indicados os valores de pKa dos aminocidos

estudados obtidos experimentalmente a uma temperatura de 19,4 C, bem como os valores
tabelados, a 25 C.
Tabela 6_Erro relativo cometido na determinao dos pKa da alanina.

experimental

tabelado

2.71

2.35

15.3

9.94

9.69

2.57

erro relativo (%)

16

Tabela 7_Erro relativo cometido na determinao dos pKa do cido glutmico.

experimental

tabelado

2.65

2.19

21.0

4.18

4.25

1.64

9.73

9.67

0.62

erro relativo (%)

Os resultados experimentais apresentam, em geral, erros relativos menores que 20%.

Desvios inferiores a 20% podem ser justificados por possveis erros de paralaxe (por exemplo,
erros na leitura da escala da bureta pelo operador). Apenas o valor de
pKa1 do cido glutmico comporta um erro superior, uma vez que foi difcil a identificao dos
mximos da derivada da curva de titulao que permitem a sua determinao. de salientar,
igualmente, que a temperatura a que foram obtidos os resultados laboratoriais distinta da
dos resultados tericos. Apesar de o pKa depender da temperatura do meio, a diferena em
5.6 C no significativa e a comparao efetuada para o clculo do erro relativo legtima.

Determinao da concentrao de uma protena pelo mtodo de Bradford. Anlise

de protenas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Comparao dos valores tabelados e experimentais das massas moleculares das

protenas. Vantagens e limitaes da tcnica SDS-PAGE

Primeiramente, comparou-se os valores obtidos experimentalmente com os valores

tabelados expectveis e determinmos o seu erro relativo. Para a tcnica considera-se uma
boa aproximao quando a estimativa de erro relativo, em percentagem, est compreendida
entre 5 e 10% [2]. Relativamente ao primeiro gel, nos poos 4, 5, 9, 11 e 14 obtiveram-se
percentagens de erro maiores, respetivamente 11,24% (Ovalbumina), 13,60% (Azurina),
10,81% (Azurina), 12,76% (BSA) e 10,81% (Azurina). Quanto ao segundo gel, apenas nos
poos 5, 7, 10 e 12 se obtiveram percentagens de erro superiores a 10%, para,
respetivamente, uma amostra de BSA, duas de Azurina e uma de Ovalbumina.
Em mdia, para cada gel, obtivemos os valores sumarizados nas Tabelas 8 e 9.

17

Tabela 8_Peso molecular estimado para as protenas do gel 1 e respetivo erro relativo.

Protena

Mdia das Distncias

(Pixis)

Peso molecular
(KDa)

Peso molecular
Tabelado (KDa)

Erro
relativo (%)

BSA
Catalase
Ovalbumina
Azurina

61,33
62,67
92,67
225,50

60,74
60,08
46,85
15,58

66,43
57,50
42,70
14,00

8,56
4,48
9,72
11,27

Tabela 9_Peso molecular estimado para as protenas do gel 2 e respetivo erro relativo.

Protena

Mdia das Distncias

(Pixis)

Peso molecular
(KDa)

Peso molecular
Tabelado (KDa)

Erro relativo
(%)

BSA
Catalase
Ovalbumina
Azurina

71,33
76,33
105,00
251,67

60,04
57,87
46,85
15,90

66,43
57,50
42,70
14,00

9,62
0,64
9,72
13,56

Portanto, em mdia, os pesos moleculares que calculados para as protenas

analisadas esto prximos dos valores tabelados. Quanto ao primeiro gel, o erro percentual
para a Catalase inferior a 5%. Para a Azurina a percentagem de erro de 11,27%,
ligeiramente mente superior a 10%, ainda assim uma boa estimativa. No segundo gel, para a
Catalase obteve-se um erro percentual de 0,64%, o que se traduz numa excelente
aproximao. Quanto Azurina, obteve-se um erro relativo de aproximadamente 14% que,
no estando compreendido entre 5 e 10%, relativamente reduzido.
Assim, quanto tcnica SDS-PAGE, pode-se afirmar que os erros cometidos tiveram
origem em eventuais erros experimentais associados. Para alm da incerteza associada s
distncias percorridas relativamente amostra padro, o que poder ter induzido erros nos
pesos moleculares, tambm ao colocar as amostras de protenas pode ter havido
contaminao de um poo com soluo de outro, afetando a distncia migrada em cada poo.
Um dos poos no foi analisado por este mesmo motivo (11 poo do segundo gel). Na
medio da distncia migrada, tambm se considera que possam ter ocorrido erros, dado que
a medio em pixis no constituiu um mtodo to preciso quanto aquilo que se pretenda.
Por exemplo, por vezes houve dificuldades em determinar ao certo a regio das bandas das
protenas onde se tinha que efetuar as medies.
Aps anlise de dados e tendo em conta que a SDS-PAGE avalia a mobilidade
eletrofortica das protenas, comprovou-se a noo terica de que a mobilidade
inversamente proporcional ao peso molecular, isto , quanto menor o peso molecular de uma
protena, maior a distncia por ela percorrida no gel e vice-versa. De facto, a Albumina
Srica Bovina (BSA) a protena que menos distncia percorreu, em mdia, em cada um dos
gis, a que tem um maior peso molecular. Por sua vez, a Azurina a molcula com menor
peso molecular (cerca de 14 kDa) e qual corresponde uma maior distncia migrada, em
mdia, para cada gel.
Foi, igualmente, possvel obter uma correlao entre as espessuras das bandas
correspondentes s protenas na electroforese e a respetiva absorvncia, a 595 nm, coradas
com azul de Coomassie. Verificou-se que quanto maior a absorvncia de uma dada protena
18

a maior a espessura da banda no poo de electroforese onde a amostra foi colocada. Por
oposio, se a espessura da banda menor, significa que o seu valor de absorvncia para o
mesmo comprimento de onda considerado menor. Tome-se a ttulo de exemplo a Azurina,
protena que maior absorvncia. Apresenta, para um comprimento de onda de 595 nm, em
mdia, uma absorvncia de 0,280. Em ambos os gis de electroforese pode-se verificar que
a banda correspondente a esta protena , de longe, muito mais espessa comparativamente
s restantes.
Uma vez que obtivemos valores experimentais relativamente prximos dos valores
tericos, pode-se inferir que este mtodo tem inmeras vantagens. Trata-se de um mtodo
muito prtico e simples de realizar, dado que o equipamento e os reagentes necessrios so
de fcil aquisio. Alm disso a quantidade de protena pura necessria bastante reduzida
(alguns microgramas). , igualmente, um mtodo muito abrangente porque o SDS consegue
solubilizar um espectro muito variado de protenas. No entanto, tal como foi enunciado,
existem erros cometidos experimentalmente associados a este mtodo e que contribuem para
o aumento da incerteza nos resultados. Alguns deles j foram referidos, mas a desnaturao
incompleta, presena de resduos e existncia de sequncias de aminocidos pouco usuais
podem, de igual modo, aumentar o erro na determinao do peso molecular. de salientar
que nesta experincia as protenas eram conhecidas, mas caso no o fossem seria difcil
proceder sua identificao dado que existem vrias protenas cujo peso molecular
semelhante.

Observaes quanto ao mtodo de Bradford

No mtodo de Bradford, para a Azurina, Catalase e BSA, encontrmos valores

consistentes entre si para a absorvncia, o que confere fiabilidade ao mtodo. Contudo, para
a Ovalbumina os valores obtidos apresentam uma elevada discrepncia entre si (0,107 e
0,216). Esta discordncia deve-se possivelmente a erros ao pipetar as vrias quantidades de
solues para a amostra utilizada no espectrofotmetro. Assim, o valor mdio entre estes dois
valores obtidos para a Ovalbumina pode afastar-se de maneira significativa do valor tabelado
para a absorvncia desta protena a 595 nm, o que altera a sua concentrao, influenciando
o clculo para determinar de massa de Ovalbumina aplicada no gel, no se obtendo uma boa
aproximao do valor real.

NOTA: neste trabalho decidimos no utilizar os gis que obtivemos no nosso turno de laboratrio, mas
sim os de outro turno, uma vez que considermos que os nossos gis no estavam nas melhores
condies para serem analisados. As bandas estavam pouco coradas e vrios poos tinham sido
deixados vazios, o que dificultava as medies e aumentava o desvio associado aos valores tericos.

19

Anexos
Titulao potenciomtrica de Alanina e cido Glutmico

Dados experimentais usados para a obteno da curva de titulao dos aminocidos e da

respectiva derivada

Alanina

(mL)

1,76
1,79
1,82
1,92
2,03
2,16
2,30
2,43
2,59
2,77
2,87
3,17
3,37
3,67
3,95
5,06
7,63
8,13
8,36
8,54
8,87
8,95
9,02
9,17
9,30
9,44
9,61
9,76
9,90
10,05
10,14
10,31
10,69
11,07
11,34
11,56
11,80
12,06
12,22
12,46
12,59
12,69
12,76

0,05
0,15
0,25
0,50
0,75
1,10
1,35
1,60
1,95
2,20
2,35
2,60
2,70
2,80
2,85
2,90
2,95
3,00
3,10
3,15
3,30
3,35
3,40
3,55
3,70
3,90
4,15
4,40
4,70
4,95
5,10
5,40
5,85
6,10
6,25
6,40
6,50
6,75
7,05
7,70
8,30
8,85
9,40

____

0,30
0,30
0,40
0,44
0,37
0,56
0,52
0,46
0,72
0,67
1,20
2,00
3,00
5,60
22,20
51,40
10,00
2,30
3,60
2,20
1,60
1,40
1,00
0,87
0,70
0,68
0,60
0,47
0,60
0,60
0,57
0,84
1,52
1,80
1,47
2,40
1,04
0,53
0,37
0,22
0,18
0,13

20

cido Glutmico

(mL)

1,86
1,9
1,94
2
2,05
2,1
2,22
2,36
2,49
2,66
2,85
3,06
3,26
3,47
3,66
3,84
4,02
4,12
4,18
4,24
4,31
4,34
4,38
4,41
4,48
4,53
4,57
4,61
4,66
4,76
4,87
5,01
5,18
5,43
5,61
5,91
6,66
7,82
8,2
8,41
8,55
8,66
8,76
8,84
8,91
8,98
9,04
9,09
9,18
9,31
9,42
9,52
9,62
9,75
9,84
9,95

0
0,1
0,2
0,3
0,55
0,6
0,75
1,05
1,2
1,5
1,75
1,95
2,2
2,45
2,7
2,95
3,25
3,35
3,45
3,6
3,7
3,75
3,8
3,85
3,95
4
4,05
4,1
4,15
4,25
4,35
4,45
4,55
4,65
4,7
4,75
4,8
4,85
4,9
4,95
5
5,05
5,1
5,15
5,2
5,25
5,3
5,35
5,45
5,6
5,75
5,9
6,05
6,25
6,4
6,55

____

0,4
0,4
0,6
0,2
1
0,8
0,466666667
0,866666667
0,566666667
0,76
1,05
0,8
0,84
0,76
0,72
0,6
1
0,6
0,4
0,7
0,6
0,8
0,6
0,7
1
0,8
0,8
1
1
1,1
1,4
1,7
2,5
3,6
6
15
23,2
7,6
4,2
2,8
2,2
2
1,6
1,4
1,4
1,2
1
0,9
0,866666667
0,733333333
0,666666667
0,666666667
0,65
0,6
0,733333333

(mL)

10,05
10,16
10,25
10,59
11,09
11,77
11,95
12,07
12,16
12,24
12,31
12,36
12,42
12,6
12,73

6,75
6,85
7
7,25
7,55
7,8
7,95
8,05
8,15
8,2
8,35
8,45
8,55
9,05
9,6

0,5
1,1
0,6
1,36
1,666666667
2,72
1,2
1,2
0,9
1,6
0,466666667
0,5
0,6
0,36
0,236363636

21

Bibliografia
[1] Fialho A., Moreira L., Leito J. H., Mira N., Teixeira M., S-Correia I., Protocolos
das Aulas Laboratoriais de Bioqumica e Biologia Molecular, 1Semestre, 2015/2016,
Instituto Superior Tcnico.
[2] Voet, Voet, Pratt, Fundamentals of Biochemestry: life at the molecular level, John
Wiley & Sons, Inc., 4 edio, 2013 (pginas 102-104).
[3] Baynes, Dominiczak, Medical Biochemestry, Mosby, 2 edio, 2014

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