CONTROLO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Para obtermos resultados fiveis temos de garantir que todas as culturas no so

acidentalmente contaminadas, o que pode acontecer atravs do meio de cultura ou do material.
Assim meios de cultura e materiais so esterilizados e usam-se tcnicas de assepsia na
manipulao de culturas para evitar contaminaes.
O controlo do crescimento microbiano pode ser efectuado quer atravs da inibio do
crescimento quer da induo da morte dos microrganismos viveis, podendo ser alcanado por
descontaminao, desinfeco e esterilizao, por mtodos fsicos ou qumicos.
Mtodos fsicos
o Calor hmido = AUTOCLAVE
o Calor quente = Estufa
o Incinerao por material ao rubro
o Filtrao
o Radiaes raios gama, raios UV, raios X
Mtodos qumicos
o Compostos qumicos que visam matar ou inibir o crescimento microbiano. Ex
Formaldedo, xido de Etileno, Glutaraldedo.
Objectivos:
Assepsia: ambiente isento de MOO, anti-spticos: impedem que os MOO se
multipliquem
Desinfeco: destruio de todas as formas de vida vegetativas mas no
necessariamente dos seus esporos
Esterilizao: destruio irreversvel de todas as formas de vida, s/ capacidade de
reproduo. Forma de esterilizao depende dos meios disponveis e materiais a
esterilizar.
PREPARAO DE MATERIAIS NO LABORATRIO
Recuperao
Todo material utilizado; sujo ou contaminado susceptvel de tratamento trmico
Metal bandeja e depois autoclavagem (calor hmido); 121C/ 1 hora
Vidro soluo desinfectante c/ elevada concentrao: formol, germicida, lixvia
Material no recupervel como plstico e placas de petri 1 lquido germicida e
depois destruio pelo calor = autoclavagem (dentro de saco fechado resistente calor)
Lavagem
Pode ser em mquina lavar loua especfica
Geral
o Lavagem profunda de todo o material, eliminao de sujidade
o gua quente corrente, detergente (...outros)
o Escovilhes, esfrego, imerso em gua quente (lixvia, detergente)
o gua quente corrente
o Passagem final - gua destilada
Pipetas
o Retirar vedante
o gua quente corrente
o Imerso em soluo detergente+fervura
o gua quente corrente
o gua destilada
o *sujidade extrema imerso em lixvia
Secagem+Preparao
Secagem
o Estufa - ar quente; 80C; 1 a 2 horas
o Invertido
Preparao
o Vedar algodo cardado (tubos, bales)
o pipetas graduadas e de pasteur embocadura vedada
o Placas de petri grupos de duas em papel kraft
o Utenslios embalados individualmente e selados com cordel ou fita adesiva
o Pipetas colocadas em recipientes prprios
Esterilizao
Tratamento trmico para eliminao de todas as formas de vida

AUTOCLAVE
121C / 50 minutos
Indicaes fraca resistncia ao calor seco (borracha, tampas...)
o Estufa
180C / 2 horas
Indicaes todos os outros (vidro, inox, os fechados com papel kraft...)
Armazenagem
por categorias ao abrigo de poeiras e humidade
o Gavetas; placas de petri, caixas com pipetas, tubos ensaio, utenslios
o Armrios; frascos, bales, provetas, suportes
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura (preparaes slidas, lquidas ou semi-slidas que contm todos os
nutrientes necessrios para o crescimento de microrganismos). Um meio de cultura lquido tem
esses nutrientes (por exemplo amido). O slido preparado pela adio ao meio de cultura
lquido de uma agente solidificante (por exemplo agar-agar). Os semi-slidos levam uma
quantidade inferior de gelificante e permitem observar MOO mveis. O conhecimento do
habitat natural de um dado MOO muitas vezes til na seleco do meio de cultura adequado,
j que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo habitat.
Se queremos testar a presena de fungos (bolores ou leveduras) adiciona-se antibitico ao
meio de cultura (bactrias crescem + rpido) meio de cultura rosa bengala.
Existem outros meios de cultura especficos: PCA para desenvolvimento especfico de
bactrias.
Umas vez inoculados com o MOO os meios de cultura so colocados a incubar em condies
ptimas de temperatura.
Depois da incubao um meio de cultura lquido torna-se turvo. Nos slidos as colnias
(aglomerados de milhes de bactrias) tornam-se visveis a olho nu. UFC unidades
formadoras de colnias formou-se 1 colnia a partir de 1 bactria.
Colnias podem ser, conforme espcie da bactria:

Colnias de bolores so aveludadas, de leveduras tm cores brilhantes

MICROSCPIO PTICO
Microrganismos so todos os organismos que no so vistos pelo olho humano e da terem de
ser analisadas com uma lente de ampliao de forma a poder se observar as suas
caractersticas fsicas (tamanho, forma, mobilidade, cor).
Os microscpios compostos usam duas lentes, uma lente objectiva e uma lente ocular, para
ampliar a amostra. Os melhores microscpios compostos so capazes de fazer ampliaes de
aproximadamente 1.200X, mas a maioria atinge apenas as 1.000X.
A resoluo (capacidade de diferenciar 2 pontos) de um microscpio de 0.25m (olho
humano - 0.1mm). Tipos:
campo claro contrasta com algo que absorve a luz bactrias geralmente mortas
campo escuro as bactrias ficam brilhantes geralmente vivas
contraste de fase d ideia tridimensionalidade e estt bactria
fluorescncia por adio de corante detectam-se clulas especficas
electrnicos - resoluo 0,003 m, conseguem-se ver vrus com muito detalhe, s se
consegue observar estt mortas, funcionam como Rx.
Lentes:
o ocular ampliao 10x
o no revlver: 4x, 10x, 40x, 100x
o ampliao o resultado da conjugao das 2 lentes
o com lente 100x s podemos usar parafuso micromtrico e colocamos 1 gota de
leo mineral na placa.
Componentes do microscpio:

COLORAO DE GRAM
Este tipo de colorao descrito em 1883 por Christian Gram, importante pois permite a
diferenciao entre bactrias Gram+ e Gram-.
A diferente colorao que se d nestes dois grupos de clulas baseia-se nas diferenas que
apresentam nas suas paredes celulares, sobretudo no que se refere ao peptidoglicano: nas
Gram+ a camada de peptidoglicano muito mais espessa que nas Gram-.
Esta diferena permite que o primeiro corante (cristal violeta) que se utiliza (que penetra com a
mesma facilidade em ambos os tipos de clulas) seja retido mais facilmente nas Gram
positivas. Por isso, quando se aplica um agente descolorante, as Gram+ retm-no, enquanto
que as Gram- o perdem. Posteriormente, ao tingir com outro corante, o corante de contraste
(saframida) de cor vermelho claro, tingir-se- as clulas que haviam perdido o corante; o que
far com as diferentes clulas fiquem com coloraes distintas.

Preparao do esfregao - bactrias:

o Identificar lmina no verso assim como a zona onde ficar esfregao, fazer trao
no canto superior direito de modo a identificar frente e verso da lmina
o Segurar lmina com mola
o Se a cultura for lquida colocar ansa passada chama no tubo de ensaio e
depositar gota na lmina (no centro da zona marcada).
o Se a cultura for slida colocar gota de gua destilada na lmina e s depois
transferir colnia.
o Espalhar o material com movimentos de rotao para se obter um esfregao
uniforme de forma oval e fino.
o Deixar o esfregao secar naturalmente, por cima da chama, em zona onde mo
suporta o calor
o Fixar chama passar a lmina pela chama azul 3x coagular protenas
o Adicionar o primeiro corante, cristal de violeta por 1 minuto (placa totalmente
coberta corante);
o Inclinar a lmina para retirar o excesso de cristal violeta, e colocar o lugol (fixa
cristal violeta parede das bactrias). Deixar por um minuto;
o Arrastar o lugol com lcool e deix-lo actuar por 20 segundos (retira corante s
Gram- mas no s +);
o Lavar com gua imediatamente;
o Adicionar o corante de contraste, safranina. Deixar por um minuto;
o Lavar com gua;
o Deixar secar ao ar ou chama;
o Observar ao microscpio.
COLORAO DE FUNGOS
Lactofenol (esclarecedor) penetra na parede dos fungos e torna-a menos opaca
Corante azul de algodo ajuda a visualizar
SEMENTEIRAS
A propagao de microrganismos, vulgo sementeira, uma tcnica que consiste na
transferncia de microrganismos (inculo) de um meio de cultura para outro, disponibilizando
as condies ideais para se multiplicarem.
A propagao de microrganismos pode ser feita de e para meios de cultura slidos ou lquidos
Regra geral, fazem-se propagaes para meios slidos quando se pretende analisar colnias
isoladas ou contar colnias, e para meios lquidos quando se pretende aumentar a biomassa.
Propagao a partir de meios de cultura lquidos
Agitar meio de cultura no vrtex antes da colheita.
Propagao para meios de cultura lquidos
o Diluio - Transferir uma quantidade certa de uma suspenso bacteriano para
soluo com meio de cultura. Geralmente diluies de 1:10.
Propagao para meios de cultura slidos
o Objectivo: diminuio da populao microbiana, + espaamento entre elas.
o 3 tipos de tcnicas frequentemente utilizadas:
Espalhamento
Tem por objectivo especfico espalhar o mximo
possvel o inculo de modo a que as colnias cresam
tambm separadas, de forma a poder cont-las. Com a
ajuda de uma micropipeta ou de uma pipeta volumtrica
vamos transferir 0,1 ou 0,2 ml de inculo para o meio de
cultura slido. Com um semeador vamos fazer
movimentos circulares num sentido enquanto rodamos a
placa de petri no inverso.
Esgotamento
Tem por objectivo especfico obter colnias isoladas, de modo a poderem ser estudadas.
Com a ajuda de uma ansa esterilizada vamos transferir o inculo para o meio de cultura slido,
tentado usar a maior superfcie possvel da placa de petri de modo a esgot-lo. Em metade da
placa deveremos fazer movimentos horizontais muito apertados, depois rodar 90 e na restante
superfcie fazer j linhas mais separadas de modo a tentar obter colnias separadas.

 Incorporao
Com a ajuda de uma micropipeta ou de uma pipeta volumtrica vamos transferir 0,1 ml de
inculo para uma caixa de petri sem nenhum meio de cultura. Depois vamos despejar sobre o
inculo cerca de 15 ml de meio de cultura lquido (PCA) a uma temperatura de 45-46C.
Depois necessrio tapar a caixa de petri e com a ponta do dedo assente em cima da tampa
realizar movimentos circulares para a esquerda e depois para a direita e depois movimentos
horizontais e verticais, num total de: 8/8, 4/4 e 2/2 esquerda/ direita e 8/8, 4/4 e 2/2 horizontal/
vertical. Estes movimentos devero ser feitos de uma forma suave de modo a que o lquido no
toque na tampa da caixa de petri. Depois s deixar a caixa repousar cerca de 15 minutos
para solidificar.
Propagao a partir de meios de cultura slidos
Propagao para meios de cultura lquidos
o Suspenso transferncia de 1 colnia para um meio de cultura lquido, agitando
bem a ansa.
Propagao para meios de cultura slidos
Podemos aqui utilizar a tcnica de esgotamento j referida acima ou usar a propagao
por picada central. Esta ltima implica ter um meio de cultura slido que foi deixado a
solidificar inclinado, tendo por objectivo analisar o crescimento bacteriano em meios com e sem
oxignio, a fim de determinar se as bactrias so aerbias ou anaerbias. Neste caso depois
de picarmos uma colnia com um estilete esterilizado deveremos inserir o estilete at ao fim do
meio de cultura (conforme figura) e depois riscar toda a superfcie do meio de cultura com o
mesmo. Se desejarmos fazer este estudo partindo de um meio de cultura lquido deveremos
primeiro fazer um esgotamento e s ento depois poderemos fazer uma picada central.

AMOSTRAGEM
Amostra representativa: constituda por 1 conjunto de unidades amostrais de acordo
com o estabelecido no plano amostral. Aplicada em lotes.
Amostra indicativa: amostra com um n de unidades inferior ao definido no plano
amostral. Aplicada a lotes <100unid., lotes fraccionados, venda a granel
Unidade amostral: poro da amostra total (se amostra so 15 unidades 1 uma
unidade amostral)
o
o
o
o

Alimentos de lojas ou restaurantes

10 unidades de cada item
recolher amostras de todas as fases do alimento (slida, lquida, etc.)
Colheitas devido a surtos
colher amostras de cada tipo de alimento
registar tempos e temperaturas de conservao do produto
Alimentos preparados industrialmente
Se possvel colher 10 amostras, 3 unidades amostrais por lote
identificar lote
Alimentos secos ou contaminados de forma heterognea
Homogeneizar

COLHEITA
Uma boa anlise comea na colheita, pois nesta se mal feita pode dar-se contaminao da
amostra = falso positivo.
O material de colheita deve ser inerte (no pode ser usada madeira, papel, etc.) O ideal vidro
ou inox, devidamente esterilizados, ou plstico esterilizado e descartvel. Em caso de
emergncia ferver material em gua ou leo a ferver (descontaminao).
O recipiente onde se coloca a amostra tem de ser tb esterilizado e totalmente estanque.
Quanto maior a sua abertura melhor. O saco no deve ficar aberto na vertical.
A colheita no deve ser feita s escondidas. Pessoal deve ver o que estamos a colher.
Colheitas de 200g ou 200ml por unidade amostral (mnimo dos mnimos 25g)
No colher alimentos notoriamente estragados
Tcnica
o Feita com os devidos cuidados de asspsia
Material da colheita s pode tocar no alimento, no se pode pousar. Para cada
colheita deve ser usado um conjunto de material diferente.
As mos no devem contactar com alimento ou interior do recipiente
o Em ambiente prprio
Deve ser feita em ambiente calmo, longe de correntes de ar, de janelas, de
pessoas a passar, sem vapores por perto. Ideal seria perto do fogo com um
bico ligado.
o Higiene pessoal do operador
Bata, cabelo apanhado, mos lavadas, sem anis ou pulseiras.
o O recipiente
Deve ficar aberto o mnimo possvel e o mnimo possvel na vertical
Se no for de plstico deve ser flamejada tampa e bocal antes e depois da
colheita da amostra
o Colheita consoante o tipo de alimento
Embalagem aberta, se no muito grande, o ideal ser enviar toda a
embalagem para o laboratrio. Ou se pequena fechada.
Se material de colheita muito quente deix-lo arrefecer 1.
Se lquido homogeneizar.
Se pastoso colher de pontos diferentes
Se slido um bocadinho do interior, do exterior, etc. consoante o que se
prev estar + contaminado
Se colheita de gua chamuscar torneira ou desinfectar com lcool e deixar
correr uns minutos antes da colheita.
Se alimento composto (cozido) colher um bocadinho de cada coisa.

Identificao da amostra:
O que
Data de validade da embalagem
Condies da amostra aquando da colheita e outros dados pertinentes
Temperatura do artigo na hora da colheita e temperatura de transporte
Data e hora da colheita
Nome de quem colheu
Motivo da colheita
Finalidade e tipo de anlise
Transporte
Alimentos devem ser transportados a temperaturas entre 1 e 4 (contentor
isotrmico com acumuladores trmicos ou gelo seco)
S devem chegar congelados se foram colhidos congelados
Alimentos desidratados ou enlatados no precisam de ser transportados
refrigerados
Tem de se comear a fazer anlise at 24h aps colheita
No se deve analisar quando
As condies a que o produto estava armazenado no eram as correctas
a embalagem da amostra estiver violada
a amostra apresentar deteriorao
quando a identificao estiver incorrecta ou incompleta

PREPARAO DA AMOSTRA
Transformao da amostra bruta colhida numa soluo, de forma a possibilitar o isolamento e
contagem dos microrganismos presentes na mesma, quer estejam presentes no seu interior ou
aderentes sua superfcie.
Da amostra bruta colhida (200g ou 200ml) deveremos retirar uma poro de cerca de 25g
(amostra de laboratrio) para anlise, quantidade indicada para testar a presena de
microrganismos patognicos. Esta amostra de laboratrio deve ser o mais representativa
possvel da amostra bruta, pois os MOO no esto distribudos de forma homognea. Assim,
da amostra bruta, se slida, devero ser seleccionados bocados de diferentes partes (as +
potencialmente contaminadas) do alimento e, se lquida ou pastosa, esta deve ser
homogeneizada antes da colheita. As amostras brutas congeladas devem ser parcialmente
descongeladas em frio positivo de 2 a 5C.
Depois de colhida amostra de laboratrio torna-se necessrio homogeneiz-la, o que feito por
processos mecnicos: o mais comum o stomacher (homogeneizador) que funciona com ps
que esmagam o alimento, sendo possvel regular fora e tempo. Regra geral, usado a cerca de
230 rotaes/ minuto durante cerca de 1 a 2 minutos no total, mas em perodos de 20
segundos de cada vez (de forma a no aquecer a amostra). A amostra colocada no
homogeneizador dentro de 1 saco prprio (esterilizado) com um soluto (agente diluidor). Um
dos solutos mais usados a gua peptonada tamponada (pois a tampona alimento para as
bactrias).
Trabalha-se com solues decimais o que significa que, se temos uma amostra de laboratrio
de 25g e queremos trabalhar com uma suspenso de 1:10 (1 parte de amostra e 9 partes de
-1
solvente) ou 10 , ento adicionamos essa amostra a 225ml de solvente, obtendo uma
suspenso final de cerca de 250ml, a suspenso-me.
Regra geral, a suspenso-me est demasiado concentrada e so necessrias fazer vrias
diluies para que se possam contar colnias com rigor (no se deve esperar contar
correctamente mais do que 250 a 300 colnias por placa de Petri). Assim, partindo da
suspenso-me dilui-se 1ml da mesma em 9 ml de soluto, ficando com uma suspenso com
-2
uma diluio de 1:100 ou 10 , e assim sucessivamente. De cada uma das diferentes
concentraes faz-se uma sementeira (por espalhamento ou por incorporao). Pretende-se
assim incubar diferentes diluies de forma a depois poder seleccionar a placa de petri que
contenha entre 30 a 300 unidades formadoras de colnias (UFC), todas as restantes so
descartadas. Abaixo de 30 UFC considera-se que poder ter sido uma contaminao acidental;
acima de 300 so mais do que aquelas que a vista humana consegue distinguir correctamente.
Depois de escolhida a placa adequada feita ento a contagem das UFC. O resultado obtido
-1
-2
-3
multiplicado pelo factor de diluio (10 , 10 , 10 , etc.) de modo a estimar a contaminao do
alimento original, obtendo assim o resultado por grama ou ml de alimento.

PROVAS BIOQUMICAS
Catalaze detecta presena ou ausncia da enzima catalaze
Citocromo-oxidase produo ou no da citocromo-oxidase
Manitol utilizao ou no deste acar
Teste de Kiliger/ TSI 1 usa 2 acares o 2 usa trs e outros reagentes. TSI permite
ter uma viso do metabolismo microbiano em questo
IMVIC permite distinguir os diferentes tipos de Enterobacteriaceae
Indol capacidade do MOO degradar triptofano
Vermelho de metilo capacidade de oxidar glicose mantendo altas concentraes de
produtos finais cidos
Voges/ Proskauer capacidade de produo de produtos finais neutros
Utilizao do citrato capacidade de usar citrato como nica fonte de carbono
desaminao da fenilalanina capacidade de retirar o grupo amina da fenilalanina
Reduo dos nitratos capacidade de o fazer, pois esta ocorre na ausncia de O2
Urease capacidade de desdobrar ureia usando a enzima urease
Descarboxilase capacidade de remover um grupo carboxilo de uma molcula
Descarboxilao da lisina capacidade de o fazer
ONPG capacidade de produzir a enzima b-galactosidade a partir da lactose
Coagulase capacidade de coagular plasma sanguneo
Existem sistemas miniaturizados com microtubos (ex API20E) que permitem realizar cerca de
20 provas de 1 vez s. Cada tubo tem um meio de cultura desidratado que fica hidratado
quando se insere a soluo bacteriana. Depois de incubao cerca de 24h a 37 podemos ler
os resultados. Cada cor resultante constitui o resultado da prova. Atravs de 1 sistema de 7
dgitos (consoante o n positivos) podemos encontrar qual a bactria em questo.