Fundamentos de Engenharia Gentica

A Engenharia Gentica permite manipular directamente os genes de determinados organismos com

objectivos prticos. So vrias as aplicaes da Engenharia Gentica e as tcnicas utilizadas.
Tecnologia do DNA recombinante
Permite combinar na mesma molcula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas no
necessariamente de espcies diferentes, dando origem a uma molcula de DNA recombinante (rDNA).
Esta tcnica baseia-se na utilizao de ferramentas moleculares como as enzimas de restrio, as ligases do
DNA e os vectores.
As enzimas de restrio reconhecem determinadas sequncias de DNA e cortam a molcula nesses locais.
As zonas de restrio correspondem a sequncias de DNA curtas e simtricas que se lem da mesma forma
nas duas cadeias na direco 5- 3.
A actividade das enzimas de restrio d origem a fragmentos de DNA em dupla hlice com extremidades
em cadeia simples. Aos fragmentos de DNA que resultam da actividade das enzimas de restrio chamam-se
fragmentos de restrio e as extremidades em cadeia simples chamam-se extremidades coesivas.

As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio seccionam a molcula de DNA quando encontram sequncias
especificas de nucletidos.

Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de

restrio obtidos com a mesma enzima. As extremidades coesivas emparelham atravs de ligaes de
hidrognio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a
formao de ligaes fosfodister.
As enzimas de restrio so bastante especficas e ocorrem naturalmente em bactrias.

Produo de DNA recombinante exemplos de vectores utilizados na tecnologia do DNA recombinante.

Para produzir DNA recombinante necessrio que enzimas de restrio cortem o DNA em fragmentos manipulveis
que contm o gene pretendido.
Os fragmentos obtidos so, ento, incorporados num vector, isto , numa molcula capaz de transportar o fragmento de
DNA para uma clula.
Os bacterifagos (vrus que atacam bactrias) e os plasmdeos (pequenos fragmentos livres de DNA com forma
circular que esto presentes em bactrias) so dois exemplos de vectores utilizados na tecnologia do DNA
recombinante.
Para que o fragmento de DNA estranho seja incorporado no vector, necessrio que a mesma enzima de restrio que
actuou sobre esse DNA actue sobre o vector, de forma a expor uma sequncia nucleotdica complementar. Os dois
segmentos de DNA so ligados por aco da enzima DNA ligase produzindo uma nova molcula estvel DNA
recombinante ou rDNA.

Esta tcnica permite, por exemplo, introduzir pores de DNA de uma determinada espcie num microrganismo, que,
em condies adequadas, se divide, permitindo a criao de inmeras cpias do gene (ou do produto do gene) a
inserido. Trata-se de uma clonagem do segmento de DNA manipulado.
A nova molcula de DNA presente nos clones do microrganismo onde foi inserido o DNA recombinante permitir a
produo de uma nova protena, de acordo com a nova informao gentica que possui. Desta forma, possvel, por ex.,
introduzir um gene humano em bactrias para que estas produzam, em larga escala, uma determinada protena
humana.
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PRODUO DE INSULINA HUMANA UTILIZANDO A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

A insulina uma hormona produzida pelo pncreas e controla a entrada de glicose nas clulas. A sua falta provoca uma
doena conhecida por diabetes. Durante anos, a nica forma de obter insulina era extraindo-a do pncreas de porco.
A tecnologia do DNA recombinante permitiu baixar o custo de produo de insulina e, sobretudo, torn-la mais segura,
evitando-se as reaces alrgicas. Para tal, os investigadores procederam ao isolamento do gene responsvel pela
produo desta hormona, atravs da utilizao de enzimas de restrio e sua insero em bactrias, tendo, para esse
efeito, utilizado plasmdeos como vectores. Dado que as bactrias utilizadas se reproduzem muito rapidamente, ao fim
de um curto intervalo de tempo, possvel obter um elevado nmero destes microrganismos capazes de produzir
insulina humana em larga escala. De seguida, a insulina isolada do meio que contm diversos nutrientes e produtos do
metabolismo bacteriano, sendo purificada de forma a poder ser utilizada no tratamento da diabetes.
Actualmente, alm da insulina, muitas outras substncias so produzidas custa da tecnologia do DNA recombinante.

DNA complementar cDNA

Os procariontes so organismos muito utilizados em Engenharia Gentica como receptores de DNA estranho porque
so fceis de cultivar, tm um crescimento rpido e processos bioqumicos bem conhecidos. No entanto, no processam
o mRNA e, quando recebem genes com intres, estes no so retirados e a protena produzida no funcional.
Este problema pode ser ultrapassado pela obteno e transferncia de DNA complementar ou cDNA.
O cDNA uma molcula de DNA sem intres que directamente transcrita numa molcula de mRNA funcional.
O processo de obteno de cDNA o seguinte:

1. Isola-se uma molcula mRNA funcional das clulas.

2. Adiciona-se transcriptase reversa e nucletidos livres. A transcriptase reversa cataliza a sntese de uma cadeia
simples de DNA a partir de um molde de mRNA.
3. Junta-se uma enzima que degrada o mRNA que serviu de molde e DNA polimerase que cataliza a formao da
cadeia complementar do DNA.

Reaces de polimerizao em cadeia PCR

Uma questo que se levanta quando se pretende trabalhar com os genes dos indivduos a da quantidade de DNA que
necessria para este procedimento, cerca de 1 micrograma, quando, por vezes, no se dispe de mais que um cabelo.
Como obter tal quantidade de DNA?
Uma das tcnicas utilizadas foi desenvolvida em 1983 e chama-se reaco de polimerizao em cadeia (PCR).

Reaco de polimerizao em cadeia (PCR).

O PCR uma tcnica que permite amplificar qualquer poro de DNA fora das clulas.
Consta das seguintes etapas:
1. O fragmento de DNA a amplificar aquecido de modo a separar as duas cadeias da dupla hlice.
2. Adicionam-se nucletidos livres e DNA polimerase resistente ao calor (obtida a partir de microrganismos
termfilos). A DNA polimerase cataliza a formao das cadeias complementares reconstituindo a dupla hlice.
3. O procedimento repetido e em cada ciclo a quantidade de DNA duplica.
Esta tcnica permite a obteno de bilies de cpias de uma poro de DNA em poucas horas e executada por
aparelhos.

DNA fingerprint ou impresses digitais genticas

No genoma humano existem sequncias de DNA repetitivas que so reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas
de restrio. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimenses e composio em nucletidos variam de
pessoa para pessoa.
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese (tcnica em que
determinadas molculas so sujeitas aco de um campo elctrico num meio poroso) e o resultado um padro de
bandas que difere de indivduo para indivduo.