Comparao de mtodos de identificao e

quantificao de cianobactrias e suas toxinas na

Albufeira do Torro (Rio Tmega)

Ana Vanessa Basto Regueiras

Dissertao de Mestrado em Contaminao e Toxicologia

Ambientais

2009

Ana Vanessa Basto Regueiras

Comparao de mtodos de identificao e quantificao de

cianobactrias e suas toxinas na Albufeira do Torro (Rio
Tmega)

Dissertao de Candidatura ao Grau de Mestre em

Contaminao e Toxicologia Ambientais submetida
ao Instituto de Cincias Biomdicas de Abel
Salazar e Faculdade de Cincias da Universidade
do Porto.
Orientador Professor Doutor Vtor Vasconcelos
Categoria Professor Catedrtico
Afiliao Faculdade de Cincias da Universidade
do Porto

Agradecimentos

Ao Prof. Doutor Vtor Vasconcelos, que me apresentou pela primeira vez a

problemtica das cianobactrias ainda durante a licenciatura conseguindo cativar-me.
Agradeo-lhe tambm pela orientao do trabalho, mas essencialmente pela calma e
confiana que sempre me transmitiu.
A todas as pessoas ligadas ao Laboratrio de Ecotoxicologia, Genmica e Evoluo
(LEGE), gostaria de agradecer pelo ptimo ambiente e bom-humor e por toda a ajuda
que cada um deu, mesmo que s para falar e relaxar um pouco.
Em particular, do LEGE, gostaria ainda de agradecer:
Marisa, que me acompanhou em todo este ano, ajudando-me em cada momento.
Ao Antnio, por toda a ajuda que me deu na parte molecular, nas amostragens e pela
disponibilidade para tirar qualquer dvida a qualquer momento.
Micaela pela ajuda nas identificaes das cianobactrias e na anlise de ELISA.
Viviana por toda a ajuda prestada na identificao e isolamento das cianobactrias,
assim como a ajuda na preparao das amostras para MALDI-TOF MS.
Cristiana, minha companheira de amostragens, pela ajuda na parte molecular.
Joana, pela ajuda no HPLC.
Ao Vtor, Isabel e Rosrio pela ajuda na identificao.

Ao Dr. Martin Welker, do Technissche Universitat Berlin na Alemanha, por realizar a

anlise de MALDI-TOF MS.
Fundao para a Cincia e Tecnologia (FCT) pelo apoio, atravs do Projecto
PTDC/AMB/67075/2006.
A todos os professores do ano curricular do mestrado, por tudo o que me ensinaram,
e que me ajudou na execuo da tese.

A toda a minha famlia, em especial a minha av, que em cada momento soube
sempre as palavras certas que me ajudaram a percorrer este caminho at aos dias de
hoje. minha irm, Andreia, por me aturar durante a escrita da tese.
Ao Filipe, que me tem acompanhado e apoiado. Por toda a pacincia e calma que me
transmitiu nos momentos de maior stress.

minha Me, que fez de mim o que sou hoje e a quem tenho tudo para agradecer e a
quem dedico este trabalho.

Resumo

As cianobactrias so organismos procariticos que habitam ambientes terrestres e

aquticos. Apesar da diversidade de estudos j efectuados acerca da ocorrncia destes
organismos em sistemas dulciaqucolas, muito permanece ainda por esclarecer. A
proliferao de cianobactrias ocorre essencialmente nos meses de vero, no entanto,
recentemente, tm-se observado casos de persistncia destes organismos e da produo
de cianotoxinas ao longo do ano. A deteco precoce de estirpes de cianobactrias
txicas em amostras de gua indispensvel para a preveno de problemas de sade
pblica, permitindo a aplicao atempada de medidas correctivas.
O objectivo deste trabalho foi monitorizar o aparecimento de cianobactrias e suas
toxinas (microcistinas, nodularinas e cilindrospermopsina) por diferentes metodologias,
Microscopia, PCR e PCR em tempo Real, ELISA, HPLC e MALDI-TOF MS, e optimizar
os volumes de amostragem necessrios para essa monitorizao.
A albufeira do Torro, no rio Tmega, foi o local escolhido por apresentar um historial
de aparecimento de florescncias de cianobactrias txicas. Dois locais de amostragem
foram seleccionados, um junto cidade do Marco de Canaveses, onde existe um local de
captao de gua para consumo, e um outro local, a jusante, junto a barragem
hidroelctrica do Torro. As amostragens realizaram-se entre o final do Vero e princpio
do Outono, de modo a verificar a persistncia de cianobactrias para alm dos meses
mais quentes.
Na albufeira do Torro verificou-se, alm de ocorrncia de cianobactrias, a produo
de microcistinas, com valores sempre mais elevados no Marco, at 10,62g/L de MC-LR
equivalente, do que no Torro. As espcies M. aeruginosa e A. flos-aquae mostraram ter
ciclos alternados de dominncia, com a primeira a dominar nas duas primeiras datas e a
segunda nas ltimas. M. aeruginosa aparentou ser a principal produtora de microcistinas.
Nas amostras naturais verificou-se a ocorrncia simultnea, dentro da mesma espcie de
M. aeruginosa, de estirpes potencialmente produtoras de microcistinas e outras no
produtoras. Verificou-se que de uma maneira geral, volumes to pequenos como de
50mL parecem ser suficientes para anlises moleculares. Quanto maior a quantidade de
cianobactrias, de sedimentos e de inibidores naturais, menor dever ser o volume
amostrado.
Os resultados obtidos neste estudo sugerem que uma anlise multidisciplinar parece
ser a mais acertada para a monitorizao de cianobactrias e suas toxinas.
O uso de tcnicas moleculares em combinao com tcnicas que permitem a
quantificao da toxina providenciam uma informao completa para proteco da
populao de riscos para a sade.

Abstract

Cyanobacteria are procariotic organisms that inhabit terrestrial and aquatic

environments. In spite of the relatively high number of studies concerning the occurrence
of these organisms in freshwater ecosystems, much remains for clarifying. Proliferation of
cyanobacteria occurs essentially in warmer months, however, recently, cases of
persistence of these organisms and production of cyanotoxins throughout the year have
been observed. The early warning of toxic cyanobacteria strains in water samples is
essential for prevention of public health problems, allowing the prompt application of
corrective measures.
The aim of this study was to monitor the occurrence of cyanobacteria and their toxins
(microcystin, nodularin and cylindrospermopsin) using different methodologies, like
microscopy, PCR and Real-Time PCR, ELISA, HPLC and MALDI-TOF MS, and to
optimize sampling volumes collection.
Torro reservoir, in Tmega river, was chosen because of the history of cyanobacteria
blooms and toxins appearance. Two sampling locations were selected, one next to the
city of Marco de Canaveses (Marco), near a water supply for human consumption, and
another site, downstream, next to Torro hydroelectric-power dam (Torro). Samples
were collected between the end of the summer and beginning of autumn, in order to
quantify the persistence of cyanobacteria beyond the hottest months.
In Torro reservoir apart from the occurrence of cyanobacteria, we detected the
production of microcystins, with the highest values in all sampling dates for Marco:
10,62g/L of MC-LR equivalents. M. aeruginosa and A. flos-aquae showed a seasonal
cycle of dominance, with the first one dominating in the two first sampling dates and the
second in the last ones. According to the results, M. aeruginosa seems to be the main
microcystin producer. In environmental samples we detected the simultaneous occurrence
of potentially microcystin producing strains and non producing ones of M. aeruginosa. It
was also confirmed that small sampling volumes, such as 50mL, seems to be enough for
molecular analyses. As big the amount of cyanobacteria, sediments and natural inhibitors,
as small should be the sampling volume.
The results of this study suggest that a multidisciplinary analysis seems to be the best
way to monitor cyanobacteria and their toxins in freshwaters.
Molecular techniques in combination with techniques that allow the quantification of
the cyanotoxins provide complete information for population protection from health risks.

ndice

1.

2.

Introduo........................................................................................................... 1
1.1.

Biologia das cianobactrias ......................................................................... 1

1.2.

Cianotoxinas................................................................................................ 4

1.2.1.

Hepatotoxinas: microcistinas e nodularinas .......................................... 6

1.2.2.

Citotoxinas: cilindrospermopsina .......................................................... 8

1.3.

Ocorrncia de cianobactrias e suas toxinas em Portugal......................... 10

1.4.

Metodologias para identificao de cianobactrias e suas toxinas ............ 11

1.5.

Objectivos.................................................................................................. 16

Materiais e mtodos ......................................................................................... 17

2.1.

rea de estudo .......................................................................................... 17

2.1.1.
2.2.

Amostragem de cianobactrias.................................................................. 19

2.3.

Isolamento, cultura e identificao de cianobactrias ................................ 20

2.4.

Anlise molecular ...................................................................................... 22

2.4.1.

Extraco de DNA .............................................................................. 22

2.4.2.

Quantificao do DNA ........................................................................ 24

2.4.3.

Amplificao por PCR......................................................................... 24

1.1.1.

Preparao das amostras para sequenciao .................................... 26

1.1.2.

Amplificao por PCR em tempo real ................................................. 28

1.2.

Ensaios enzimticos ELISA ....................................................................... 30

1.2.1.

Preparao das amostras................................................................... 30

1.2.2.

Deteco de toxinas por ELISA .......................................................... 31

1.3.

Deteco e quantificao de microcistinas por HPLC................................ 32

1.3.1.

Preparao das amostras................................................................... 32

1.3.2.

Deteco e quantificao por HPLC de microcistinas......................... 33

1.1.
2.

Caracterizao dos locais de amostragem ......................................... 17

Deteco de toxinas por MALDI-TOF MS .................................................. 34

Resultados........................................................................................................ 35

2.1.

Parmetros fsico-qumicos e ocorrncia de cianobactrias nos locais

amostrados ................................................................................................................. 35
2.2.

Isolamento e cultura de cianobactrias...................................................... 39

2.3.

Identificao de cianobactrias (fenotpica e genotpica) ........................... 42

2.4.

Anlise de PCR para deteco de espcies potencialmente produtoras de

toxinas e de genes envolvidos na produo destas..................................................... 44

3.

2.4.1.

Amostras ambientais .......................................................................... 46

2.4.2.

Amostras ambientais para optimizao do volume ............................. 47

2.4.3.

Estirpes isoladas ................................................................................ 49

2.5.

Quantificao das toxinas por ELISA e HPLC ........................................... 51

2.6.

Deteco das toxinas por MALDI-TOF MS ................................................ 54

2.7.

Anlise por PCR em Tempo Real .............................................................. 55

Discusso ......................................................................................................... 60
3.1.

Parmetros fsico-qumicos, ocorrncia, cultura e identificao (fenotpica e

genotpica) de cianobactrias...................................................................................... 60
3.2.

Amostras ambientais ................................................................................. 66

3.3.

Amostras ambientais para optimizao do volume de amostragem........... 74

3.4.

Estirpes isoladas........................................................................................ 76

4.

Concluso......................................................................................................... 81

5.

Bibliografia........................................................................................................ 85

Anexo I......................................................................................................................... I
Anexo II....................................................................................................................... V
Anexo III.................................................................................................................... XII
Anexo IV ..................................................................................................................XVI

ndice de Figuras

Figura 1 - Estrutura qumica da microcistina-LR, caracterizada pela presena de leucina (L)

e arginina (R) como L-aminocidos nas posies 2 e 4 (Funari e Testai 2008). ............................... 7
Figura 2 - Estrutura qumica de uma nodularina (Funari e Testai 2008). ................................... 7
Figura 3 - Estrutura qumica da cilindrospermopsina (Funari e Testai 2008). ............................ 9
Figura 4 - Locais de amostragem (imagem obtida atravs do software Google Earth
5.0.11733.9347)................................................................................................................................ 18
Figura 5 - Albufeira do Torro. Local de amostragem: Marco. ................................................. 18
Figura 6 - Albufeira do Torro. Local de amostragem: Torro.................................................. 18
Figura 7- Esquema do plano de amostragem e posterior metodologia laboratorial. ................ 20
Figura 8- Cultura de cianobactrias em meio Z8, em tubos de ensaio estreis de
poliestireno de 12ml.......................................................................................................................... 21
Figura 9 - Cultura de cianobactrias em meio Z8 slido, em placas de petri de poliestireno
estreis. ............................................................................................................................................ 21
Figura 10 Cultura de cianobactrias em meio Z8, em frascos de poliestireno estreis de
50mL. ................................................................................................................................................ 21
Figura 11 Crescimento de cianobactrias.............................................................................. 21
Figura 12 Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb) (a) e 100bp EZ
Load Molecular Ruler (BioRad) (b). .................................................................................................. 23
Figura 13 - Valores de temperatura superficial da gua (C) determinados no Marco e
Torro em cada data de amostragem. ............................................................................................. 35
Figura 14a e 14b - Valores de oxignio dissolvido (mg/L) e saturao de oxignio (%)
determinados no Marco e Torro em cada data de amostragem. ................................................... 36
Figura 15 - Valores de pH determinados no Marco e Torro em cada data de amostragem. . 36
Figura 16 - Valores de condutividade determinados no Marco e Torro em cada data de
amostragem. ..................................................................................................................................... 36
Figura 17 - Florescncia de cianobactrias no Marco na data de 19-Set. ............................... 37
Figura 18 - Fotografias de espcies de cianobactrias identificadas por microscopia ptica. . 38
Figura 19 - Morfotipos de M. wesenbergii identificados em cultura de laboratrio, nas
diferentes datas do Torro e do Marco............................................................................................. 40
Figura 20 - Produto da amplificao para o gene 16S rRNA para as estirpes 2, 3, 4, 5, 8,
10, 12, 13, 14, 15, 20, 21, 22; (+) Controlo positivo; (B) controlo negativo. Marcador 1Kb plus
(Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb) ...................................................................................... 42
Figura 21 - Produto da amplificao dos fragmentos 16S rRNA especfico de Microcystistis
sp., mcyA e mcyB para um volume de 20L, numa reaco de multiplex PCR. Marcador 1Kb
plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb)............................................................................... 45
Figura 22 Produto da amplificao do fragmento do gene mcyA para um volume de
20L. (1) Marco 19-Set; (2) Marco 1-Out; (3) Marco 15-Out; (4) Marco 29-Out; (5) Torro 19-

Set; (6) Torro 1-Out; (7) Torro 15-Out; (8) Torro 29-Out; (+) Controlo positivo (estirpe M6);
(B) Controlo negativo. ....................................................................................................................... 46
Figura 23 - Produto da amplificao do gene HEP para um volume de 20L. (1-4) Marco
19-Set; (5-7) Marco 1-Out; (8-11) Torro 19-Set; (12-14) Torro 1-Out; (1) 15mL; (2) 50mL; (3)
250mL; (4) 500mL; (5) 250mL; (6) 500mL; (7) 1000mL; (8) 50mL; (9) 250mL; (10) 500mL; (11)
1000mL; (12) 250mL; (13) 500mL; (14) 1000mL; (+) Controlo positivo (estirpe M6); (B) Controlo
negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb) ....................................... 48
Figura 24 - Produto da amplificao do fragmento do gene mcyA para um volume de 20L.
(1-4) Marco 19-Set; (5-7) Marco 1-Out; (8-11) Torro 19-Set; (12-14) Torro 1-Out; (1) 15mL;
(2) 50mL; (3) 250mL; (4) 500mL; (5) 250mL; (6) 500mL; (7) 1000mL; (8) 50mL; (9) 250mL; (10)
500mL; (11) 1000mL; (12) 250mL; (13) 500mL; (14) 1000mL; (15) Controlo positivo (estirpe
M6); (16) Controlo negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb)......... 48
Figura 25 - Produto da amplificao para o fragmento do gene mcyB para as estirpes 1, 7,
11, 16 e 18; (+) Controlo positivo; (B) controlo negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen)
(fragmentos de 100bp a 12kb).......................................................................................................... 50
Figura 26 - Comparao dos resultados da anlise de ELISA para as amostras ambientais.
Os valores esto expressos em g MC-LR equivalentes por litro. ELISA AA corresponde ao
ensaio de ELISA para a quantidade de toxina existente no meio e ELISA AT a quantidade total
da toxina (toxina no meio+toxina endgena).................................................................................... 52
Figura 27 - Cromatograma resultante da anlise de HPLC para a amostra ambiental do
Marco a 19 de Setembro. ................................................................................................................. 53
Figura 28 - Resultado de um dos espectros de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental
do Marco e 1-Out, onde possivel ver a presena de MC-LR a 995,48 m/z. ................................. 55
Figura 29 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL
para as amostras ambientais do Marco............................................................................................ 57
Figura 30 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL
para as amostras ambientais do Torro. .......................................................................................... 57
Figura 31 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL
para as amostras ambientais com vista optimizao do volume de amostragem, do Marco. ...... 58
Figura 32 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL
para as amostras ambientais com vista optimizao do volume de amostragem, do Torro ...... 59

ndice de tabelas

Tabela I Condies das reaces de PCR para cada par de primers utilizados................. 27
Tabela II - Condies da reaco de PCR em tempo real para cada par de primers ............ 30
Tabela III - Espcies microscopicamente identificadas nas amostras do Marco e do Torro
em cada uma das datas de amostragem ......................................................................................... 37
Tabela IV - Resultados da sequenciao para identificao genotpica das estirpes
cultivadas, incluindo n de acesso da base de dados BLAST e percentagem (%) de similaridade 43
Tabela V - Cianobactrias identificadas genotipicamente e microscopicamente ..................... 44
Tabela VI - Resultados da anlise de PCR para as amostras ambientais................................ 46
Tabela VII - Resultados da anlise de PCR para optimizao do volume de amostragem
das amostras ambientais .................................................................................................................. 47
Tabela VIII - Resultados da anlise de PCR para as estirpes cultivadas ................................. 50
Tabela IX - Resultados da quantificao da toxina por anlise de ELISA das estirpes
cultivadas em g de MC-LR equivalentes/L ..................................................................................... 52
Tabela X - Pptidos identificados atravs da anlise de MALDI-TOF MS ................................ 54
Tabela XI - Eficincias e parmetros da curva padro da anlise de PCR em tempo real
para as amostras ambientais e amostras ambientais para optimizao do volume, para os
fragmentos dos genes 16S rRNA, 16S rRNA especfico de Microcystis sp. (m16S rRNA), mcyA
e mcyB .............................................................................................................................................. 56

ndice de abreviaturas

A. flos-aquae Aphanizomenon flos-aquae

Bp base pairs (pares de bases)
BSA Bovine Serum Albumin
C. raciborskii Cylindrospermopsis raciborskii
Ct Threshold cycle
CYN Cilindrospermopsina
DNA cido Desoxirribonucleico
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA-AA Ensaio de ELISA para a amostra ambiental
ELISA-AT Ensaio de ELISA para a amostra total
ETA Estao de Tratamento de guas
HPLC High-Performance Liquid Chromatography
HPLC-DAD High Performance Liquid Chromatography Diode Array
IARC International Agency for Research on Cancer
M. aeruginosa Microcystis aeruginosa
M. wesenbergii Microcystis wesenbergii
MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass
Spectrometry
MC - Microcistina
MC-LR Microcistina-LR
MS Mass Spectrometry
NHMRC Nacional Health and Medical Research Council
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
PCR Polimerase Chain Reaction
PP1 Protena Fosfatase Enzimtica Tipo 1
PP2 Protena Fosfatase Enzimtica Tipo 2
PSD Post-Source Decay
RNA cido Ribonucleico
RT-qPCR PCR em Tempo Real
UV Radiao ultraviolota
WHO World Health Organization

Introduo

1. Introduo

1.1.

Biologia das cianobactrias

As cianobactrias so organismos procariticos fotossintticos, gram-negativos

(Adams e Duggan 1999; Mankiewicz et al. 2003). Contrariamente maioria dos
procariotas, apresentam uma grande diversidade morfolgica, fisiolgica e metablica
(Adams e Duggan 1999; Dittmann e Wiegand 2006). Morfologicamente compreendem
organismos unicelulares, coloniais ou formas filamentosas multicelulares (WHO 1999).
Registos fsseis apontam para a existncia de cianobactrias, tanto unicelulares,
como filamentosas, h pelo menos 3,5 bilies de anos, tendo sofrido poucas alteraes
at aos dias de hoje (Adams e Duggan 1999). Assim, estes organismos encontram-se
entre os pioneiros da vida na terra, tendo provavelmente sido dos primeiros produtores de
matria orgnica e libertadores de oxignio para a atmosfera primitiva (WHO 1999). A
taxa de evoluo extremamente lenta deve-se provavelmente elevada capacidade de
tolerncia destes organismos (Adams e Duggan 1999), ocorrendo principalmente em
guas superficiais, onde toleram diferenas elevadas de salinidade, temperatura e
intensidade luminosa (Funari e Testai 2008). Podem ainda ocorrer em rochas e solos,
desertos e regies vulcnicas (WHO 1999).
Podem formar associaes simbiticas com uma grande variedade de organismos
como fungos, brifitas, pteridofitas, gimnosprmicas e angiosprmicas (Adams e Duggan
1999; WHO 1999).
So organismos fotoautotrficos, que realizam a fotossntese de modo semelhante
realizada nos cloroplastos de algas eucariticas e plantas superiores (Adams e Duggan
1999). O facto de serem organismos fotossintticos, e devido s suas caractersticas
morfolgicas e ao seu tamanho, inicialmente as cianobactrias foram classificadas como
algas azuis-verdes. Contudo, quando nos anos 70 se comeou a aperceber da sua
natureza procaritica, o nome de cianobactria foi comeando a ser mais aceite (Adams
e Duggan 1999).
Contrariamente s microalgas eucariticas, as cianobactrias no possuem organelos
subcelulares delimitados por membranas (WHO 1999). Apesar de possurem um
mecanismo de fotossntese semelhante ao das algas, no possuem cloroplastos (Adams
e Duggan 1999; Mankiewicz et al. 2003) e os pigmentos fotossintticos encontram-se nos
tilacides (WHO 1999). Elas contm clorofila-a, carotenos, xantofilinas, c-fitocianina azul
e c-ficocianina vermelha, sendo que as duas ltimas so exclusivas das cianobactrias
(Mankiewicz et al. 2003).

Introduo
As caractersticas das cianobactrias tm dificultado a sua classificao. Inicialmente
foram classificadas segundo o Cdigo de Nomenclatura Internacional de Botnica, devido
ao facto do principal pigmento fotossinttico ser a clorofila-a e de realizarem fotossntese
oxignica. O aparecimento da microscopia ptica e os testes bioqumicos acabaram por
fazer com que estes organismos fossem classificados no reino das bactrias, por serem
organismos procariontes, passando a ser regidos pelo Cdigo de Nomenclatura
Bacteriolgica (WHO 1999; Dittmann e Wiegand 2006).
Um dos processos mais caractersticos do metabolismo das cianobactrias a
capacidade de fixao de azoto (Mankiewicz et al. 2003). Gneros de espcies
filamentosas, como Anabaena, Aphanizomenon e Nostoc, podem possuir clulas
especializadas, heterocistos, que permitem a fixao do azoto (WHO 1999). Em
condies ambientais de limitao de azoto estas espcies de cianobactrias so
favorecidas. Podem igualmente possuir clulas de resistncia a condies ambientais
extremas, denominadas de acinetos (Adams e Duggan 1999), tendo ainda a capacidade
de armazenar no citoplasma nutrientes essenciais e metabolitos (WHO 1999).
Muitas espcies de cianobactria apresentam ainda vesculas gasosas. Estas so
incluses citoplasmticas, que permitem que estes organismos se possam ajustar
verticalmente na coluna de gua (WHO 1999), posicionando-os na zona euftica, onde
podem realizar a fotossntese devido presena de luz, ou atingir camadas mais
profundas, ricas em nutrientes (Dittmann e Wiegand 2006). portanto, um mecanismo de
importncia ecolgica para as espcies planctnicas.
As cianobactrias possuem um metabolismo secundrio bastante activo. Metabolitos
secundrios referem-se aos compostos que no so usados pelo prprio organismo no
seu metabolismo primrio, ou seja, na diviso celular ou metabolismo, incluindo
compostos que actuam como hormonas, antibiticos, aleloqumicos e toxinas
(Carmichael 1992; Vasconcelos 2001). Toxinas so metabolitos secundrios que tm
efeitos adversos noutros tecidos, clulas ou organismos (Carmichael 1992; Pearson e
Neilan 2008). Contudo, nem todas as cianobactrias produzem compostos txicos,
havendo, no entanto, uma larga disperso mundial dos gneros potencialmente
produtores (Carmichael 1992).
A eutrofizao um processo natural de aumento da produo biolgica em
ecossistemas aquticos, sendo o aumento dos nveis de nutrientes, especialmente de
compostos de fsforo e azoto, apontados como a principal causa (Vasconcelos 2006).
Alguns lagos so naturalmente eutrofizados mas na maioria dos ecossistemas aquticos,
o aumento de nutrientes tem origem antropognica, resultantes de efluentes industriais e
domsticos ou de escoamento de terrenos agrcolas (pesticidas e fertilizantes)
(Mankiewicz et al. 2003; Vasconcelos 2006). A construo de barragens nos rios tem
2

Introduo
igualmente sido apontada como aceleradora do processo de eutrofizao (Vasconcelos
2006).
A eutrofizao tem causado uma diminuio da qualidade das guas, trazendo srios
problemas para o uso desta, nomeadamente guas para consumo (WHO 1999). O
desenvolvimento massivo de macrfitas aquticas e o aparecimento de florescncias de
fitoplncton so sinais deste fenmeno (Vasconcelos 2006). A ocorrncia de
florescncias de fitoplncton o fenmeno mais comum em guas eutrofizadas podendo
ser responsveis por danos a nvel do ecossistema e da sade humana. Embora exista
uma grande diversidade de grupos de fitoplncton capazes de formar florescncias, os
que causam os efeitos mais negativos em termos de diminuio da qualidade das guas
so os dinoflagelados, as diatomceas e as cianobactrias (Vasconcelos 2006).
Florescncias de cianobactrias ocorrem intensivamente em guas de superfcie
eutrofizadas (lagos, albufeiras e rios) (WHO 1999; Mathys e Surholt 2004; Akcaalan et al.
2006). O aparecimento das florescncias pensa-se ser causada por uma complexa
interaco entre a concentrao de nutrientes, luz solar, temperaturas elevadas, turbidez,
pH, condutividade, salinidade, carbono disponvel e existncia de correntes fracas ou at
guas estagnadas (Apeldoorn et al. 2007).
Alguns dos efeitos das florescncias de cianobactrias so uma diminuio da
transparncia das guas, elevadas alteraes dos nveis de oxignio e a libertao de
toxinas (WHO 1999; Mankiewicz et al. 2003; Vasconcelos 2006).
Devido produo de toxinas pelas cianobactrias, a Organizao para o
Desenvolvimento e Cooperao Econmica (OECD- Organization for Economic CoOperation

and

Development)

classificou

estes

organismos

como

patognicos

emergentes, ainda que no possuam a capacidade de colonizar ou invadir hospedeiros

(OECD 2005).
Embora muitos dos trabalhos de cianobactrias se foquem apenas nos aspectos dos
impactos negativos destes organismos nos ecossistemas, tm aumentado o nmero de
trabalhos que mostram que as cianobactrias so capazes de produzir compostos com
uma actividade biolgica de interesse, podendo ser usados, por exemplo, na indstria
farmacutica (Singh et al. 2005). Alm do mais, estes organismos so importantes
produtores primrios, possuindo um papel crucial nos ecossistemas (Codd et al. 2005;
Dittmann e Wiegand 2006).

Introduo

1.2.

Cianotoxinas

A diminuio da qualidade das guas e o aumento da eutrofizao das guas doces

traduzem-se numa maior ocorrncia e persistncia de florescncias de cianobactrias
(Carmichael 1992). Uma vez que as florescncias de cianobactrias so potenciadas por
processos de eutrofizao, a ocorrncia de florescncias txicas tende a aumentar em
tamanho e durao, traduzindo-se numa maior probabilidade de os humanos serem
expostos a nveis causadores de toxicidade aguda (Carmichael 1992; Bittencourt-Oliveira
2003).
Segundo Carmichael (1992) as toxinas de cianobactrias so a maior fonte natural de
biotoxinas em guas doces superficiais. O aparecimento de florescncias txicas de
cianobactrias conhecido por todo o mundo, podendo causar efeitos agudos ou
crnicos em animais domsticos e selvagens, organismos aquticos, aves e humanos
(Vasconcelos 2001; Codd et al. 2005; Sangolkar et al. 2006; Apeldoorn et al. 2007).
O problema causado por cianotoxinas e o aparecimento de florescncias comeou a
ser tido em ateno atravs de documentaes de intoxicaes animais, sendo que o
primeiro caso verdadeiramente documentado remonta a 1878, na Austrlia, onde foi
descrito o envenenamento de gado aps o consumo de gua de um lago contaminado
por cianobactrias (WHO 1999). Aps este estudo, vrios trabalhos comearam a surgir
focando o potencial txico das cianobactrias, sendo que a evoluo e descoberta de
novas toxinas continua a acontecer. Hoje, mais de 84 variantes de cianotoxinas esto
descritas, embora apenas uma pequena fraco delas esteja bem documentada (WHO
1999) (mudar a referncia). Os efeitos das cianotoxinas nos animais no so os nicos
reportados. Contudo, at data ainda no foi reportado nenhum caso de morte humana
por ingesto de cianotoxinas. O caso mais grave, envolvendo humanos, ficou conhecido
como o sndrome de Caruaru, tendo ocorrido na cidade de Caruaru, no Brasil (Azevedo
et al. 2002). Neste incidente, mais de 60 pessoas morreram aps uma sesso de
hemodilise, realizada com guas no devidamente tratadas de um reservatrio
eutrofizado (Azevedo et al. 2002).
Estima-se que mais de 40 gneros diferentes de cianobactrias seja produtores de
toxinas contudo, os gneros mais importantes so Anabaena, Aphanizomenon,
Cylindrospermopsis, Lyngbya, Microcystis, Nodularia, Nostoc e Oscillatoria (Planktothrix)
(Vasconcelos 2001; Apeldoorn et al. 2007). Cada cianotoxina pode ser produzida por
mais do que uma espcie e, dentro da mesma espcie de cianobactria, podem ser
produzidas diferentes toxinas (WHO 1999; Funari e Testai 2008).
A contaminao por cianotoxinas em humanos pode ocorrer por ingesto, inalao,
contacto drmico e por modo intravenoso (Vasconcelos 2001). Para alm do problema
4

Introduo
directo de contaminao das guas superficiais, as cianotoxinas podem-se acumular ao
longo da cadeia trfica, produzindo diversos sintomas de intoxicao e efeitos crnicos,
os quais so difceis de diagnosticar e prevenir, j tendo sido reportados vrios casos de
elevadas mortalidades de peixes e animais domsticos (Bittencourt-Oliveira 2003).
Os compostos txicos produzidos pelas cianobactrias so quimicamente diversos,
podendo a classificao dos diferentes tipos de toxinas se basear nos seus efeitos nos
organismos afectados. Segundo esta classificao, existem 5 classes de toxinas
produzidas pelas cianobactrias de gua doce: hepatotoxinas (microcistinas e
nodularinas), neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a(s) e saxitoxina), citotoxinas
(cilindrospermopsina), dermatoxinas (Mankiewicz et al. 2003; Dittmann e Wiegand 2006;
Sangolkar et al. 2006). A quinta classe refere-se aos lipopolissacardeos (LPS), os quais
possuem diversos efeitos adversos nos organismos afectados (Mankiewicz et al. 2003;
Dittmann e Wiegand 2006; Sangolkar et al. 2006).
Estas toxinas, nos ecossistemas aquticos encontram-se na sua maioria no interior
das clulas, sendo libertados quando ocorre a lise celular (Mankiewicz et al. 2003;
Sangolkar et al. 2006; Funari e Testai 2008), embora tambm possa ocorrer libertao
activa da toxina durante o crescimento celular (WHO 1999; Sangolkar et al. 2006; Funari
e Testai 2008). O aparecimento de estirpes txicas e no txicas de cianobactrias no
possvel de prever, alm de que diferentes estirpes de uma mesma espcie podem no
ser txicas ou produzir diferentes toxinas (Sangolkar et al. 2006; Apeldoorn et al. 2007).
Outros dos problemas que se levantam reside no facto de que os qumicos usados para
controlar e erradicar as florescncias de cianobactrias contribuem para a libertao da
toxina, como o caso de alguns algicidas (Sangolkar et al. 2006; Funari e Testai 2008).
Uma vez libertadas na gua, a persistncia das toxinas no ambiente vai depender da
eficincia de degradao (fotlise, hidrlise e degradao bacteriana) (Funari e Testai
2008).

De todas as cianotoxinas at data encontradas, as hepatotoxinas, como as

microcistinas, so as que ocorrem com maior frequncia, tanto a nvel mundial, como a
nvel de Portugal (Martins et al. 2009). A cilindrospermopsina ainda no foi detectada em
Portugal mas, a principal espcie produtora, Cilindrospermopsis raciborskii tem sido
identificada, estando actualmente classificada como uma espcie invasora (Saker et al.
2003). Assim, as toxinas pesquisadas no presente trabalho incluram hepatotoxinas e
citotoxinas, seguindo-se um resumo sobre estas.

Introduo

1.2.1. Hepatotoxinas: microcistinas e nodularinas

As hepatotoxinas so pptidos cclicos, compreendendo as microcistinas e as
nodularinas (Vasconcelos 2001; Bittencourt-Oliveira 2003; Funari e Testai 2008).
As microcistinas diferem das nodularinas no contedo de aminocidos. Ambos
contm um aminocido hidrofbico nico, ADDA, apenas presente neste tipo de toxinas,
o qual indispensvel para a actividade biolgica destas molculas, pelo que, qualquer
alterao a nvel da cadeia deste aminocido, conduz a uma reduo da toxicidade das
hepatotoxinas (WHO 1999; Vasconcelos 2001; Mankiewicz et al. 2003; Dittmann e
Wiegand 2006; Msagati et al. 2006).
As microcistinas constituem um dos principais grupos de cianotoxinas devido sua
ocorrncia mundial e elevada toxicidade, sendo a cianotoxina que mundialmente mais
reportada (WHO 1999; Apeldoorn et al. 2007). Podem ser produzidas por inmeros
gneros, como Microcystis, Anabaena, Planktothrix (Oscillatoria), Nostoc, Hapalosiphon,
Anabaenopsis, entre outros (Akcaalan et al. 2006; Sangolkar et al. 2006). O nome destas
hepatotoxinas deriva da primeira espcie de cianobactria em que a toxina foi detectada,
Microcystis aeruginosa (Carmichael 1992). So um grupo de heptapeptidos cclicos (DAla-L-X-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha) compostos por aminocidos comuns como
alanina, arginina, triptofano, leucina, e um aminocido especial, o ADDA. (Vasconcelos
2001; Sangolkar et al. 2006). Existem cerca de 70 isoformas diferentes (Rcker et al.
2007) at data identificadas, com diversos nveis de toxicidade (Bittencourt-Oliveira
2003; Akcaalan et al. 2006). As variantes de microcistina so formadas por substituio
dos locais dos aminocidos, por metilao ou desmetilao da molcula, por variaes a
nvel da estrutura da cadeia ADDA, ou por modificaes no cido D-glutmico, inferindo
estas variaes na toxicidade (Mankiewicz et al. 2003; Sangolkar et al. 2006). Na figura 1
encontra-se a estrutura qumica da microcistina-LR, a variante mais comum de
microcistina, caracterizada pela presena de leucina (L) e arginina (R), nas posies 2 e
4 da molcula (Funari e Testai 2008).
As nodularinas tm uma estrutura similar s microcistinas, diferindo no nmero de
aminocidos (Vasconcelos 2001). So constitudas por 5 aminocidos, j tendo sido
isoladas 7 variantes, todas elas na espcie Nodularia spumigena (Mankiewicz et al. 2003;
Akcaalan et al. 2006). Na figura 2 encontra-se representada a estrutura qumica de uma
nodularina.

Introduo

Figura 1 - Estrutura qumica da microcistina-LR, caracterizada pela presena de leucina (L) e arginina (R)
como L-aminocidos nas posies 2 e 4 (Funari e Testai 2008).

Figura 2 - Estrutura qumica de uma nodularina (Funari e Testai 2008).

A actividade biolgica de microcistinas e nodularinas semelhante. As hetatotoxinas

causam disrupo do fgado, por aumento do volume deste e choque hipovolmico
(hepatomegalia) (Mankiewicz et al. 2003).
As vias de intoxicao podem ser por ingesto, inalao ou absoro cutnea
(Mankiewicz et al. 2003). As hepatotoxinas so resistentes digesto sendo
posteriormente transportadas para o fgado. Uma vez que so solveis em gua, no
conseguem penetrar as membranas lipdicas directamente (WHO 1999). Assim, o
hepatotropismo das microcistinas faz-se atravs de transportadores de membrana, como
o sistema de transporte do cido biliar, levando inibio nos eucariticos de protenas
fosfatases enzimticas especficas, tipo 1 ou 2A (PP1 ou PP2), ligando-se
covalentemente a estas, nas clulas do fgado. Estas so importantes componentes na
manuteno da estrutura e funo celular (Vasconcelos 2001). Assim, a ligao das
microcistinas a protenas fosfatases provoca um aumento da fosforilao de vrias
protenas citoslicas e do citosqueleto envolvidas na transduo de sinais (Mankiewicz et
al. 2003; Funari e Testai 2008). A nveis elevados de exposio os hepatcitos perdem
volume, conduzindo a hemorragia heptica (Vasconcelos 2001). O sangue vai
progressivamente ocupando os espaos entre as clulas (hemorragia intra-heptica),
levando morte por choque hipovolmico (Vasconcelos 2001; Dittmann e Wiegand
2006).
A inibio das protenas fosfatase por hepatotoxinas quebra o balano natural dos
processos celulares, resultando em proliferao celular e promoo de tumores, ou
7

Introduo
apoptose e morte celular (Vasconcelos 2001; Mankiewicz et al. 2003; Dittmann e
Wiegand 2006).
A severidade da toxicidade induzida por hepatotoxinas vai depender dos nveis e
durao da exposio, que influenciam a quantidade de toxina absorvida, destoxificada e
excretada (Mankiewicz et al. 2003; Funari e Testai 2008), podendo ocorrer efeitos
crnicos ou agudos (Sangolkar et al. 2006)
Segundo Funari e Testai (2008), a agncia internacional para estudos do cancro
(IARC International Agency for Research on Cancer) classificou, com base nos
trabalhos relativos promoo de tumores pelas microcistinas, a microcistina-LR como
possvel carcinognico para humanos (grupo 2B).
Para alm dos hepatcitos, as hepatotoxinas podem afectar outras clulas. A inibio
da actividade PP1 e PP2 pode ocorrer em qualquer clula eucaritica, embora necessite
de transportadores para atravessar as membranas celulares (Mankiewicz et al. 2003).
Estas toxinas tm igualmente a capacidade de se bioacumular ao longo da cadeia
trfica, normalmente causando efeitos crnicos, resultando num problema acrescido de
sade pblica (Dietrich e Hoeger 2005; Apeldoorn et al. 2007). Existem numerosos
trabalhos que reportam ainda a acumulao de microcistinas em organismos aquticos,
assim como em vegetais irrigados por gua contaminada (Apeldoorn et al. 2007). Nos
ltimos anos, tm tambm comeado a surgir estudos sobre a exposio involuntria, em
humanos, a microcistinas atravs de suplementos alimentares (Saker et al. 2007b)
O valor guia de microcistina-LR (MC-LR) em guas para consumo foi introduzida pela
Organizao Mundial de Sade (WHO) (WHO 1999), com um limite recomendado de 1g
de MC-LR por litro. O mesmo valor foi transposto para a legislao portuguesa, atravs
do decreto-lei 306/2007 de 27 de Agosto.

1.2.2. Citotoxinas: cilindrospermopsina

A cilindrospermopsina (CYN) um alcalide que possui uma guanina cclica ligada ao
grupo hidroximetiluracil (figura 3), sendo produzida por vrias espcies como
Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Anabaena bergeii, Aphanizomenon
flos-aquae, Aphanizomenon issatschenkoi, Aphanizomenon ovalisporum, Raphidiopsis
curvata, e Lyngbya wollei (Falconer e Humpage 2006; Apeldoorn et al. 2007).

Introduo

Figura 3 - Estrutura qumica da cilindrospermopsina (Funari e Testai 2008).

A cilindrospermopsina foi descrita inicialmente como uma toxina produzida pela

espcie C. raciborskii, uma cianobactria tropical e subtropical. Contudo, esta
cianobactria tem vindo a ser reportada em latitudes mais temperadas, tendo-se tornado
uma espcie comum em habitats de guas temperadas por todo o mundo (WHO 1999;
Saker et al. 2003; Falconer e Humpage 2006). Recentemente, tem sido detectada a
presena da cianotoxina em florescncias e culturas de C. raciborskii da Europa (Blhov
et al. 2009; Kokocinski et al. 2009). Desde 2003 que a espcie C. raciborskii tem sido
isolada em diversos locais do centro e sul de Portugal (Saker et al. 2003; Valrio et al.
2005).
De acordo com Gcsi e colaboradores (2009), a cilindrospermopsina est classificada
como uma toxina de elevada prioridade, podendo inclusive ser mais perigosa que a
microcistina. Devido inexistncia de um valor guia para esta cianotoxina, Humpage e
Falconer (2003), propuseram um limite de 1g/L de CYN total, em guas para consumo.
Ao contrrio de outras cianotoxinas, CYN encontra-se sobretudo na forma dissolvida,
pelo que a ingesto directa pela gua pode ser uma importante via de contaminao
(Ibelings e Chorus 2007; Funari e Testai 2008).
O primeiro caso reportado de intoxicao humana ocorreu em Palm Island, Australia,
em 1979. Os efeitos txicos observados nos humanos eram consistentes com os
reportados em estudos de toxicidade em animais (Falconer e Humpage 2006). Na
mesma altura foi observada a morte de gado, induzida pela cilindrospermopsina, aps a
ingesto de gua de uma albufeira contaminada (Saker et al. 1999).
Esta cianotoxina encontra-se classificada como sendo uma citotoxina que bloqueia a
sntese proteica, sendo os rgos alvo primrios o fgado e o pncreas; contudo, afectam
igualmente os rins, pulmes, corao, estmago e glndulas adrenais (Funari e Testai
2008; Smith et al. 2008). Os primeiros sinais clnicos de intoxicao so falncia heptica
e renal (Mankiewicz et al. 2003).
O mecanismo celular envolvido na toxicidade desta cianotoxinas ainda
desconhecido (Smith et al. 2008). Tem sido reportada como causadora de necrose
celular, fragmentao do DNA e iniciadora de tumores ou mutagenicidade (Apeldoorn et
al. 2007). Vrios estudos tm demonstrado que a cilindrospermopsina no reage
9

Introduo
directamente com o DNA, mas que causa alteraes a nvel do citosqueleto e do ncleo,
bem como potencia a necrose e a apoptose (Fessard e Bernard 2003; Gcsi et al. 2009).
Humpage

colaboradores

(2000),

sugeriram

que

os

danos

induzidos

pela

cilindrospermopsina provocam quebras nas cadeias de DNA e perda de cromossomas

(aneuploidia), tendo j sido observada a produo de aductos e quebras nas cadeias de
DNA por Shen e colaboradores (2002). Estudos apontam igualmente para a possibilidade
da cilindrospermopsina ser promotora de tumores (Falconer e Humpage 2001). Estudos
recentes demonstram igualmente uma aco da cianotoxina como disruptora endcrina
(Young et al. 2008).
Froscio e colaboradores (2003) e Norris e colaboradores (2002) concluram que para
ocorrer citotoxicidade necessrio que ocorra biotransformao pelo citocromo P450.
Vrios estudos tm sido reportados em organismos aquticos e invertebrados, com o
objectivo de compreender melhor o mecanismo de aco da toxina (Saker e Eaglesham
1999; Metcalf et al. 2002; Nogueira et al. 2004; Saker et al. 2004; Kinnear et al. 2007;
White et al. 2007). Estes estudos apontam para uma capacidade de acumulao da
toxina em organismos aquticos, mesmo aps perodos de depurao, apresentando
assim um risco acrescido para a populao humana.

1.3.

Ocorrncia de cianobactrias e suas toxinas em Portugal

Portugal um pas localizado numa zona temperada onde tm sido reportados

inmeros casos de florescncias de cianobactrias txicas em rios e albufeiras
(Vasconcelos 1994; Vasconcelos 1995; Vasconcelos et al. 1996; Vasconcelos 2001).
ainda de referir que muitos dos cursos de gua do pas se encontram eutrofizados, o que
potencia o aparecimento das florescncias. Acresce ainda a este problema, o facto de
que muitos destes cursos de gua so utilizados para produo de gua para consumo
(Vasconcelos et al. 1996), pondo em risco a sade pblica.
Vasconcelos (1994) investigou a presena de cianobactrias, e toxicidade associada
em 36 lagos, albufeiras e grandes rios de Portugal, durante o perodo de 1989-92. Destas
36 massas de gua, 30 apresentaram florescncias de cianobactrias, das quais 60%
revelaram-se txicas atravs de bioensaios com murganhos. De acordo com este estudo,
constatou-se que a espcie M. aeruginosa era a espcie dominante de cianobactria,
seguindo-se as espcies Anabaena flos-aquae, Aphanizomenon flos-aquae e M.
wesenbergii (Vasconcelos 1994). Saker et al. (2007a), num estudo feito em 26
reservatrios de gua naturais do norte e centro de Portugal determinou que em 81% dos
casos ocorria a presena do gnero Microcystis, sendo que a maioria destes locais
apresentou resultados positivos de microcistina.
10

Introduo
Em Portugal, as microcistinas so o tipo de cianotoxinas com maior ocorrncia
(Vasconcelos 2001). Dentro destas, a microcistina-LR a toxina dominante de
florescncias e de estirpes isoladas e caracterizadas em laboratrio, embora tambm
ocorram microcistinas-RR e microcistinas-YR (Vasconcelos et al. 1996; Vasconcelos
2001; Saker et al. 2005a). Martins e colaboradores (2009) detectaram em amostras de
albufeiras, rios e lagos do norte e centro de Portugal diversas variantes de microcistinas,
sendo as mais comuns microcistina-LR, -FR, -RR, -WR e YR. J foram at presente
data reportadas 13 variantes diferentes de microcistinas no pas (Vasconcelos 2006).
Desde 2003 que a espcie C. raciborskii tem sido isolada em diversos locais do
centro e sul de Portugal (Saker et al. 2003; Valrio et al. 2005). Anlise toxicolgica das
estirpes isoladas por Saker e colaboradores (2003) verificou toxicidade letal em
bioensaios com ratos contudo, a cilindrospermopsina no foi identificada, podendo ser
que outras toxinas, com aco similar, possam estar envolvidas.
No existem casos reportados de intoxicaes em humanos que demonstrem ter sido
provocados por cianotoxinas, muito em parte por falta de informao da populao em
geral. At porque em muitos casos as cianobactrias podem desaparecer antes de se
poder fazer uma relao causa-efeito, ou podem at nem chegar a formar florescncias.

1.4.

Metodologias para identificao de cianobactrias e suas toxinas

At recentemente, a identificao de cianobactrias assentava em mtodos

taxonmicos tradicionais para anlise de fitoplncton, normalmente baseada em
caractersticas morfolgicas. Contudo, estes mtodos nem sempre tm sido suficientes,
principalmente porque muitas estirpes, quando em cultura, podem alterar as dimenses,
forma ou caractersticas das colnias (Neilan 2002; Vasconcelos 2006). A informao
obtida por anlise microscpica pode, no entanto, ser importante para determinao de
qual a melhor metodologia a usar (Apeldoorn et al. 2007).
A incapacidade de prever a produo de toxinas das florescncias de cianobactrias
sem recorrer a isolamento e determinao da produo da toxina dificulta a
monitorizao das guas. Estirpes txicas e no-txicas no apresentam diferenas
predictveis no seu aparecimento, e diferentes estirpes de uma mesma espcie podem
ser ou no txicas, podendo ainda produzir diferentes toxinas (Sangolkar et al. 2006). O
nvel da toxina produzida vai depender do estado da florescncia e das espcies e
estirpes envolvidas, o que impossibilita o exame microscpico para determinar a
produo da toxina (Sangolkar et al. 2006).
At ao desenvolvimento de tcnicas e mtodos de deteco analticos e moleculares,
devido inexistncia de uma relao entre caractersticas fisiolgicas e morfolgicas com
11

Introduo
a produo de toxina, era complicada a determinao, uma vez que se baseava apenas
em bioensaios com animais (bactrias, invertebrados e ratos) (Pearson e Neilan 2008).
Estes mtodos tm como principal desvantagem no permitir a determinao de baixas
concentraes de cianotoxinas (WHO 1999; Masango et al. 2008), alm de que so
poucos sensveis, de custos elevados e acarretam diversos problemas ticos (Pearson e
Neilan 2008).

O desenvolvimento de mtodos analticos fiveis para a monitorizao de toxinas de

cianobactrias, como as microcistinas, em amostras ambientais, tem sido alvo de
inmeros estudos. A determinao de microcistinas pode ser feita recorrendo a tcnicas
analticas como o HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) e espectrometria de
massa (mass spectrometry MS) (Sangolkar et al. 2006). O mtodo de HPLC o mais
utilizado para deteco de microcistinas, em monitorizaes de rotina (WHO 1999). Este
mtodo,

assim

como

mtodo

de

MALDI-TOF

MS

(Matrix-Assisted

Laser

Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry) so bastante sensveis contudo,

so tcnicas morosas, tecnicamente exigentes (Sangolkar et al. 2006). O HPLC,
combinado com deteco UV permite providenciar uma informao quantitativa e
qualitativa contudo, para tal necessita de padres de toxina purificada, a qual por vezes
difcil de obter, alm de necessitar de grandes volumes de amostra quando a toxina se
encontra em baixas concentraes e de passos adicionais para purificao das amostras
(Rivasseau et al. 1999; Rapala et al. 2002; Mathys e Surholt 2004; Sangolkar et al. 2006;
Pearson e Neilan 2008). A grande vantagem do MALDI-TOF MS, quando comparado
com outras tcnicas analticas que permite uma completa anlise de pequenas
amostras, sem necessidade de se fazer uma pr-purificao (Sangolkar et al. 2006;
Apeldoorn et al. 2007).

Outra das metodologias usadas baseia-se no uso de ensaios imunolgicos com

anticorpos mono ou policlonais (Sangolkar et al. 2006). O teste ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) rpido, de baixo custo, requer pouca quantidade de amostra
(Rivasseau et al. 1999; Mathys e Surholt 2004; Sangolkar et al. 2006), sendo ainda capaz
de detectar quantidades dentro dos limites estabelecidos pela legislao. Quando
comparado com tcnicas analticas, como o HPLC, tem como principal vantagem ter um
menor limite de deteco (Metcalf e Codd 2003). Apesar destas vantagens, a elevada
variao estrutural que ocorre, por exemplo, entre as microcistinas, pode levar a
reaces cruzadas entre os anticorpos com diferentes variantes da toxina ou com outros
compostos que possam estar presentes nas amostras, podendo estas reaces no
exprimirem correctamente valores de concentrao da toxina (Rapala et al. 2002;
12

Introduo
Sangolkar et al. 2006), alm de que este teste no providencia informao sobre as
variantes de microcistinas presentes (Masango et al. 2008).

A necessidade de novas tcnicas, possveis de ser aplicadas tanto a amostras

ambientais, como a culturas de laboratrio, levou ao desenvolvimento de mtodos
moleculares para a identificao de espcies de cianobactrias (Neilan et al. 1997; Saker
et al. 2005b).
Muitos dos estudos para deteco de cianotoxinas baseiam-se em tcnicas como
ELISA e HLPC. Este tipo de tcnicas so teis para identificar concentraes de
cianotoxinas potencialmente perigosas contudo, no providenciam informao referente
origem do contaminante. O uso de tcnicas como o da reaco em cadeia de polimerase
(PCR Polimerase Chain Reaction) permite identificar os organismos que esto a
provocar a contaminao.
O uso da tcnica de PCR cada vez mais comum, at porque simples de executar,
rpida, de baixo custo e extremamente sensvel (Pearson e Neilan 2008).
Quando o objectivo a deteco de espcies potencialmente txicas, em PCR devese procurar genes indispensveis para a produo da toxina. necessrio ter ainda em
conta que estes genes devem ser conservados no grupo de cianobactrias alvo, mas
divergentes de uma maior grupo de cianobactrias (Pearson e Neilan 2008).
As microcistinas e nodularinas so produzidas no ribossomalmente, por um
complexo multienzimtico constituido por unidades pptido sintetase (NRPS) e
poliquetidos sintetase (PKS), todos codificados por um cluster de genes da microcistina
sintetase (mcy) e nodularina sintetase (nda) (Sangolkar et al. 2006; Pearson e Neilan
2008). Estes clusters tm vindo a ser sequenciados e caracterizados num grande nmero
de espcies (Pearson e Neilan 2008). A descoberta de sequncias de genes
responsveis pela produo das mais comuns cianotoxinas foi um enorme passo dado
nesta rea. Hoje em dia, apenas com uma colnia possvel obter informaes sobre a
presena de clusters de genes envolvidos na produo das toxinas.
A sequenciao do DNA permitiu que se conhecesse a codificao dos genes mcy
em trs dos maiores produtores, Anabaena, Microcystis e Planktothrix (Sangolkar et al.
2006). Estudos comparativos de clusters de genes mcy de diferentes espcies
pertencentes a diferentes gneros mostraram a existncia de variao no arranjo dos
genes, embora se pense que o processo biossinttico de produo de toxina se
mantenha igual (Pearson e Neilan 2008).
Os genes mcy, em M. aeruginosa esto organizados num cluster com dois operes,
contendo, no total, 10 genes (mcy A-C e mcy D-J) (Ouahid et al. 2005; Sangolkar et al.
2006; Pearson e Neilan 2008). Um opero inclui genes codificantes NRPS (mcyA, mcyB
13

Introduo
e mcyC) e o outro opero contm um gene codificante PKS (mcyD), dois genes hbridos
codificantes NRPS e PKS (mcyE e mcyG) e ainda genes codificantes de enzimas
envolvidas na metilao (mcy J), epimerizao (mcy F), desidratao (mcy I) e
localizao (mcy H) (Ouahid et al. 2005; Sangolkar et al. 2006; Pearson e Neilan 2008). A
sequenciao destes genes permitiu o desenho de primers (iniciadores), permitindo a
deteco e identificao de espcies potencialmente produtoras de toxinas em amostras
naturais, mesmo quando estas surgem em quantidades muito pequenas (Sangolkar et al.
2006). Estudos tm comprovado que o primers relativos a genes mcy so mais fiveis
para distinguir espcies produtoras ou no de microcistinas, quando comparado com
outros primers de genes diferentes (Sangolkar et al. 2006).
Genes codificantes NRPS, como o mcyA e o mcyB tm sido os alvos mais utilizados
para a deteco de genotipos hepatotxicos. Saker e colaboradores (2007b), com vista a
facilitar e diminuir o tempo de realizao de vrias anlises de PCR, desenvolveram um
multiplex PCR para a determinao, numa s reaco dos genes mcyA, mcyB e
permitindo ainda verificar a presena do gnero Microcystis. O gene mcyE tem sido cada
vez mais usado como alvo, uma vez que essencial para a sntese da cadeia ADDA e a
activao e adio do D-glutamato molcula de microcistina (Ouahid et al. 2005). Estes
dois aminocidos so essenciais para a toxicidade e sofrem menos variaes nas
diferentes isoformas, que os outros aminocidos (Pearson e Neilan 2008).
O cluster de cilindrospermopsina contm 15 regies de leitura que codificam enzimas
para todas as funes necessrias para a biossntese, regulao e exportao desta
toxina, incluindo uma amidinotransferase (CyrA), uma mistura NRPS/PKS (CyrB), quatro
mdulos PKS (CyrC-F), duas citosinas diaminases homlogas (CyrG e H), uma
hidroxilase (CyrI), uma bomba de fluxo (CyrK) e uma transposase (CyrL).
Schembri e colaboradores (2001) sugeriram que tanto os PKS como os NRPS
estavam envolvidos na produo de cilindrospermopsina, demonstrando que em C.
raciborskii existe uma relao directa entre a presena destes dois pptidos e a
capacidade de produzir a toxina. Assim, Fergusson e Saint (2003) desenvolveram uma
anlise de PCR em multiplex com o objectivo de determinar a presena dos genes
codificantes PKS, NRPS e ainda uma parte do gene rpoC1, especfica da cianobactria
C. raciborskii, permitindo identificar cianobactrias produtoras de cilindrospermopsina, ao
mesmo tempo que diferencia se a produo feita pela espcie C. raciborskii.
Vrios estudos moleculares demonstram que certas estirpes de cianobactrias com a
presena de genes envolvidos na biossntese das toxinas, podem no ser txicas. O
motivo pelo qual no ocorre a sntese da toxina ainda incerto. Estes resultados
apontam para que uma anlise molecular apenas assente no carcter toxignico pode
levar a concluses no correctas (Pearson e Neilan 2008). Assim, principalmente quando
14

Introduo
este tipo de testes utilizado em amostras naturais, uma abordagem multidisciplinar
demonstra ser a mais correcta.

A quantificao potencial da produo de toxina possvel recorrendo ao PCR

quantitativo em tempo real (RT-qPCR) (Sangolkar et al. 2006). Esta anlise bastante
sensvel, permitindo resultados fiveis com apenas algumas clulas por reaco
(Pearson e Neilan 2008). Este mtodo tem sido utilizado tanto para a deteco de
cianobactrias, como tambm para deteco de genes mcy, assim como genes
envolvidos na produo de cilindrospermopsina (Kurmayer e Kutzenberger 2003; RintaKanto et al. 2005). Esta metodologia pode ter grandes vantagens, essencialmente
quando aplicada a amostras ambientais, uma vez que permite distinguir nas
comunidades ambientais espcies dominantes dos ecossistemas e que possam ser mais
problemticas (Pearson e Neilan 2008).

15

Introduo

1.5.

Objectivos

No presente trabalho foram utilizadas tcnicas de microscopia para identificar as

principais espcies presentes; tcnicas moleculares de PCR para identificar a presena
de genes de cianobactrias, de espcies de cianobactrias potencialmente produtoras de
toxinas e envolvidos na produo das toxinas, e de PCR em tempo real para quantificar a
quantidade de cianobactrias e de espcies potencialmente produtoras de toxina;
ensaios

imunolgicos

(ELISA)

para

quantificao

da

toxina

(microcistina

cilindrospermopsina); ensaios cromatogrficos (HPLC) para quantificao de microcistina,

assim como anlises de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) para detectar as
diferentes variantes de toxinas nas amostras.

So objectivos especficos deste trabalho, os seguintes:

Pesquisa, identificao, isolamento e cultura de cianobactrias no rio

Tmega, na albufeira do Torro, utilizando microscopia ptica e tcnicas de
biologia molecular (PCR e sequenciao);

Optimizao dos volumes de amostragem, utilizando tcnicas de biologia

molecular (PCR e RT-qPCR) e tcnicas imunolgicas (ELISA);

Pesquisa de genes para identificao de cianobactrias (fragmento do 16S

rRNA especfico de cianobactrias), de espcies potencialmente produtoras
de cianotoxinas (fragmento do gene 16S rRNA especfico de Microcystis spp.
e fragmento do gene rpoC1, especfico de Cylindrospermopsis raciborskii) e
de genes envolvidos na produo das toxinas nas amostras ambientais e nas
estirpes cultivadas com tcnicas de biologia molecular (PCR e RT-qPCR);

Deteco e/ou quantificao das toxinas presentes nas amostras ambientais

e nas estirpes cultivadas por tcnicas cromatogrficas (HPLC), imunolgicas
(ELISA), e de espectrometria de massa (MALTI-TOF MS).

16

Materiais e Mtodos

2. Materiais e mtodos

2.1.

rea de estudo

O presente trabalho foi efectuado em dois locais pertencentes albufeira do Torro,

no Rio Tmega, um na regio da cidade de Marco de Canaveses (N- 41,19562; W8,16045) e um segundo junto barragem hidroelctrica do Torro (N- 41,09698; W8,25737). Os locais foram seleccionados tendo em conta a importncia destes para as
populaes locais, a importncia do Rio Tmega em relao ao Rio Douro, e trabalhos
anteriores (Vasconcelos 1994; Vasconcelos 1995; Vasconcelos et al. 1995; Vasconcelos
et al. 1996; Pereira 1998; Saker et al. 2005a; Martins 2007; Saker et al. 2007a; OlivaTeles et al. 2008).

2.1.1. Caracterizao dos locais de amostragem

O Rio Tmega o maior e mais comprido afluente do Rio Douro no territrio nacional.
A margem da bacia hidrogrfica do Rio Tmega constituda por terrenos
essencialmente agrcolas. Em 1988 foi construda no leito do rio, uma barragem
hidroelctrica, levando formao, a montante, da albufeira do Torro (Martins 2007).
Devido construo de barragens ao longo do rio, os ecossistemas tm vindo a ser
alterados, surgindo essencialmente ecossistemas lticos, os quais alternam com
ecossistemas lnticos e semi-lnticos (Martins 2007).
O rio encontra-se eutrofizado desde a cidade de Chaves, podendo a albufeira do
Torro piorar esta situao, caso no tenha uma gesto adequada (Pereira 1998). O
facto de nas margens se fazer uma actividade essencialmente agrcola, aliada aos
efluentes urbanos de zonas como a cidade do Marco de Canaveses, propiciam o
aumento da eutrofizao.
A albufeira do Torro uma importante fonte de gua para consumo e recreativa do
norte de Portugal. comum o aparecimento de florescncias txicas de ciabactrias,
dominadas pelas espcies M. aeruginosa e Aphanizomenon flos-aquae (Oliva-Teles et al.
2008). O aparecimento das florescncias ocorre essencialmente nos meses quentes,
uma vez que possuem uma taxa de crescimento muito dependente da temperatura
(Oliva-Teles et al. 2008). Segundo Oliva-Teles e colaboradores (2008), o aparecimento
das florescncias nesta albufeira tem sido atribudo eutrofizao, em combinao com
a construo da barragem a jusante.

17

Materiais e Mtodos
Na albufeira do Torro foram seleccionados dois pontos de amostragem (fig.4). O
primeiro local de amostragem situa-se no Marco de Canaveses (fig.5), prximo da ETA
(estao de tratamento de guas). O segundo local foi seleccionado mesmo junto
barragem (fig.6), com o objectivo de se determinar se a contaminao encontrada no
local anterior se mantm ou alterada. Este local possui uma grande importncia, at
porque j se situa muito prxima do rio Douro.

Figura 4 - Locais de amostragem (imagem obtida atravs do software Google Earth 5.0.11733.9347).

Figura 5 - Albufeira do Torro. Local de

amostragem: Marco.

Figura 6 - Albufeira do Torro. Local de

amostragem: Torro.

Segundo Martins (2007), estes locais de amostragem possuem caractersticas semilnticas, com uma acentuada diminuio da corrente. Ainda segundo a referida autora,
esta albufeira encontra-se hipereutrofizada, sendo comum o aparecimento de
florescncias fitoplantonicas entre o vero e at meados de Outubro. Junto cidade do
18

Materiais e Mtodos
Marco de Canaveses, foi igualmente inaugurado, em Dezembro de 2008, um parque
fluvial, atraindo para este local pessoas que acabam por utilizar estas guas igualmente
para fins recreativos.

2.2.

Amostragem de cianobactrias

As amostragens foram realizadas com intervalos de aproximadamente 15 dias, num

total de quatro amostragens, entre Setembro e Outubro de 2008 (19 de Setembro, 1, 15 e
29 de Outubro). Este perodo foi escolhido tendo em considerao resultados anteriores
(Vasconcelos 1994; Martins et al. 2005; Vale 2005)
No local de amostragem procedeu-se igualmente determinao de parmetros
fsico-qumicos. A temperatura e concentrao de oxignio foram determinados
recorrendo a um oxmetro (OXI 320/Set/WTW) e o pH e condutividade, obtidos por um
leitor de pH (Multiline P3pH/LF-Set/WTW).
Em cada uma das datas foram recolhidos diferentes volumes de amostra, com o
objectivo de efectuar diferentes ensaios laboratoriais. Em frascos com volumes entre 250
a 2000 mL (conforme o estado de turvao da gua devida s cianobactrias) foram
recolhidas amostras para anlise molecular, e 2000 mL para anlise cromatogrfica
(HPLC). Para anlise imunolgica (ELISA) foram amostrados 15 mL. Para posterior
isolamento das cianobactrias, foram efectuados vrios arrastos, com uma rede cnica
de plncton de malha de 50 m, para concentrao destes organismos.
Em 19 de Setembro e 1 de Outubro foram recolhidos diferentes volumes de amostra
(entre os 15 e os 1000 mL), com vista optimizao do volume amostrado para anlise
de PCR e RT-qPCR. Nas duas ltimas datas (15 e 29 de Setembro) foram igualmente
recolhidos diferentes volumes para optimizao de volume amostrado para realizar o
teste de ELISA.
Todas as recolhas de gua foram feitas na margem, subsuperficialmente, tendo-se
posteriormente transportado as amostras em malas trmicas e acondicionadas a 4C at
posterior anlise. O tratamento das amostras no laboratrio nunca excedeu as 48 horas.
O esquema de amostragem e todo o resumo da metodologia encontra-se na fig 7.

19

Materiais e Mtodos

Amostragem
Determinao de parmetro fisico-qumicos:
Temperatura
pH

Concentrao de O2
Condutividade

Identificao microscpica e
isolamento
PCR

Sequnciao
de parte do
gene 16S

Amostras
ambientais
ELISA
MALDI-TOF
MS

Optimizao do volume de
amostragem

PCR

PCR

RT-qPCR

RT-qPCR

ELISA

ELISA

HPLC
MALDI-TOF
MS
Figura 7- Esquema do plano de amostragem e posterior metodologia laboratorial.

2.3.

Isolamento, cultura e identificao de cianobactrias

As cianobactrias foram isoladas num perodo no superior a 48 horas aps

amostragem, tendo-se usado a amostra ambiental concentrada.
As diferentes espcies de cianobactrias foram isoladas e identificadas com o auxlio
de manuais de ficologia tradicional e de bacteriologia (Baker 1991; Entwisle e Sonneman
1997; Komarek e Anagnostidis 1998; Komarek e Anagnostidis 2005; Albertano et al.
2006; Cronberg e Annadotter 2006).
Para o isolamento utilizou-se um microscpio ptico com uma ampliao at 40x e
pipetas pasteur estiradas chama de lamparina. As diferentes espcies isoladas foram
lavadas em sucessivas gotas de gua destilada, at completa libertao de
contaminantes visveis. Aps lavagens as cianobactrias foram ressuspendidas em meio
Z8 descrito por Kotai em 1972 in Vasconcelos (1995), previamente preparado e
distribudo por tubos de ensaio estreis de poliestireno de 12 ml (fig.8). Os recipientes
foram enchidos com meio Z8 apenas at cerca de metade da sua capacidade, para
permitir a oxigenao.
20

Materiais e Mtodos
Uma gota de amostra concentrada foi igualmente espalhada, com o auxlio de uma
ansa esterilizada, por placas de petri de poliestireno estreis de 60 mm de dimetro com
meio Z8 slido com agar (1,5%) (fig.9).

Figura 8- Cultura de cianobactrias em meio Z8, em

Figura 9 - Cultura de cianobactrias em meio Z8

tubos de ensaio estreis de poliestireno de 12ml.

slido, em placas de petri de poliestireno estreis.

Os tubos e placas de petri foram posteriormente acondicionados numa sala de

culturas sob luz artificial (lmpadas fluorescentes Philips, 40 W), com uma temperatura
de 251C e fotoperodo de 14h dia/10h noite. As colnias de meio lquido foram
mantidas nestas condies at atingirem a fase de crescimento exponencial (entre 1 a 2
meses). Das placas de petri, aps 1 a 2 semanas, isolou-se para novas placas de petri
com meio Z8 slido as espcies de cianobactrias visveis, tendo-se procedido a este
processo at obteno de colnias puras, no axnicas, em meio slido.
Aps este perodo, tanto as colnias provenientes do meio Z8 slido, como do lquido,
foram ressuspendidas em frascos de poliestireno esterilizados de 50 mL, previamente
cheios com meio Z8 at metade do seu volume (fig.10). As condies de aclimatao
utilizadas mantiveram-se, com vista a propiciar o crescimento (fig.11).

Figura 10 Cultura de cianobactrias em meio Z8,

Figura 11 Crescimento de cianobactrias

em frascos de poliestireno estreis de 50mL.

em meio Z8.

21

Materiais e Mtodos

Durante todo o processo de isolamento as culturas foram observadas periodicamente

ao microscpio ptico para assegurar que no havia contaminaes algais e se possvel
fngicas at fase de obteno de culturas unialgais.
A partir do momento em que era obtida uma cultura pura, as cianobactrias foram
fotografadas, com recurso a um sistema composto por um microscpio ptico Leica
DMLB associado a uma cmara Leica ICCA, com o software Leica Qwin Colour.
A classificao dos gneros com recurso apenas a livros de ficologia e de
bacteriologia nem sempre fcil devido existncia de grandes semelhanas entre
diferentes gneros. Sendo assim, algumas das espcies consideradas mais importantes
em termos de ocorrncia e potencial txico, foram igualmente confirmadas por
sequenciao molecular.

2.4.

Anlise molecular

2.4.1. Extraco de DNA

A extraco de DNA foi feita tanto para amostras ambientais como para as estirpes
cultivadas de cianobactrias. A preparao das amostras para posterior extraco do
DNA diferiu conforme o propsito da amostra:
a) Amostras ambientais
Num perodo no superior a 24 horas aps amostragem, foi filtrado um volume
at colmatao do filtro. Para tal foi utilizada a tcnica de filtrao por vcuo,
recorrendo a filtros de microfibra de vidro GF/C (Whatman). O volume filtrado foi
dependente do local de amostragem e da turvao da gua.
Aps filtrao a gua foi rejeitada, apenas se aproveitando os filtros.
Todo o contedo que ficou retido no filtro foi cuidadosamente retirado com o
auxlio de um bisturi e colocado num eppendorf esterilizado, sendo
posteriormente acondicionado num congelador a -20C at extraco do DNA.
b) Amostras ambientais para optimizao de volumes
A tcnica utilizada foi a mesma que para as amostras ambientais, diferindo
apenas no volume filtrado, sendo que em nenhum caso se chegou a atingir a
colmatao dos filtros.
c) Culturas de cianobactrias
Quando as culturas se encontravam na fase de crescimento exponencial, um
volume de cerca de 1,5 mL de cultura foi retirado para um eppendorf de 2,0 mL.

22

Materiais e Mtodos
Esta amostra foi congelada, pois verificou-se que este passo facilita a extraco
do DNA. Em seguida as amostras foram centrifugadas mxima rotao por 10
minutos recorrendo a uma centrfuga Eppendorf 5415R. O sobrenadante foi
descartado e o pellet foi acondicionado num congelador a -20C at extraco
do DNA.
O DNA genmico das cianobactrias e das amostras ambientais foi extrado
recorrendo a um Kit de extraco de DNA: Genomic DNA from tissue (MachereyNagel) e segundo as indicaes do fabricante para extraco de DNA genmico de
bactrias (Support protocol for bacteria). Para o efeito utilizou-se uma centrifuga
Eppendorf 5415R e uma placa de aquecimento com agitao Eppendorf Thermomixer
compact. No passo final da extraco, na eluio, foram usados diferentes volumes de
tampo de eluio, conforme a provenincia das amostras (100 L para amostras
ambientais e 50 L para culturas).
A presena de DNA genmico foi confirmado por electroforese num gel de agarose
(Molecular Biology Agarose, BioRad) a 1%, numa soluo tampo de Tris-Acetato EDTA
(TAE 1x, BioRad 40mM Tris, 20 mM cido actico, 1 mM EDTA, pH 8,3). A voltagem
aplicada dependeu do tamanho do gel, variando entre 80 a 100V, por um perodo de 30 a
45 min. Ao gel de agarose foi adicionado 5 L de brometo de etdio (BioRad) de uma
soluo stock de 10 mg/ml. Nos poos do gel foram carregados 5 L de DNA e 1 L de
tampo de carregamento a 1x (Nucleic acid sample loading buffer 5x, BioRad 50 mM
Tris-HCL, pH=8, 25% Glicerol, 5 mM EDTA, 0,2% Azul de Bromofenol e 0,2% Xylene FF).
Foram utilizados dois marcadores diferentes ao longo do trabalho, 1Kb plus (Invitrogen)
(fragmentos de 100bp a 12kb) (fig.12a) e 100bp EZ Load Molecular Ruler (BioRad)
(fig.12b). A imagem do gel foi fotografada recorrendo a um transiluminador CSLMICRODOC System (Cleaver Scientific Ltd.), sob influncia de luz ultravioleta, acoplado
de uma cmara Cannon PowerShot G9.

Figura 12 Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb) (a) e 100bp EZ Load
Molecular Ruler (BioRad) (b).

23

Materiais e Mtodos

2.4.2. Quantificao do DNA

A quantificao foi feita recorrendo a um aparelho q-bit fluorometer (Invitrogen), de
acordo com as informaes e reagentes fornecidos pelo fabricante.

2.4.3. Amplificao por PCR

Os primers (Invitrogen) utilizados na anlise de PCR encontram-se descritos na
tabela I. Em relao s condies de reaco iniciais, foram por vezes feitas alteraes
(tabela I), com vista a melhorar a qualidade da reaco.
Para cada par de primers foram realizadas reaces de PCR num volume final de
20L. Os reagentes foram todos obtidos atravs da Bioline e cada reaco levou 2L de
tampo de reaco 10x NH4, 1L de 50mM de MgCl2, e de cada primer, 2L de 2,5mM
de dNTPs mix, 0,1L de Taq DNA polimerase 5u/L e 2 L de DNA para as amostras
ambientais e 1 L para as estirpes cultivadas de cianobactrias. Para as amostras
ambientais e amostras ambientais para optimizao dos volumes, reaco de PCR foi
adicionado 0,5L de BSA (bovine serum albumin) (10mg/mL). As reaces decorreram
num dos seguintes termocicladores: Biometra Professional Thermocycler e BioRad
MyCycler Thermal Cycler.
Para deteco dos genes relativos aos pares de primers Micr184Fw/Micr431Rv,
mcyA-cd1Fw/mcyA-cd1Rv e mcyB2959Fw/mcyB3278Rv, foi inicialmente realizado um
multiplex PCR (Saker et al. 2007b). Para os pares de primers Cyl2/Cyl4,
PKSM4/PKSM5 e K18/M14 tambm se realizou inicialmente a reaco em multiplex,
utilizando-se as condies de reaco relativas ao par de primers K18/M4. O volume de
reaco para a anlise de multiplex manteve-se nos 20 L. Com vista a melhorar a
qualidade dos resultados, aps as primeiras reaces, comeou a realizar-se os PCRs
para estes pares de primers em reaces separadas.
Os produtos de PCR foram armazenados a 4C at se proceder electroforese. Na
separao por electroforese em gel de agarose a 1,5/2%, foram usadas as mesmas
condies que para visualizao de DNA genmico.
Quando os produtos de amplificao eram muito tnues no gel de agarose ou no se
tinha a certeza se tinha ocorrido amplificao, foi realizado um nested PCR, ou seja,
realizou-se uma reaco de PCR, usando como template no o DNA genmico inicial,
mas sim o produto da amplificao do PCR. As condies da reaco do nested PCR
foram as mesmas que para a reaco de PCR.

24

Materiais e Mtodos
O controlo positivo foi efectuado com a estirpe M6 para deteco dos genes relativos
aos primers 27F/809R, 740F/1494R, Micr184F/Micr431R, mcyA-CD1F/mcyA-CD1R,
mcyB2959F/mcyB3278R, PKEF1/PKER1 e HEPF/HEPR e com a estirpe AQS para os
restantes primers. O controlo negativo foi efectuado com gua.
A anlise de PCR foi realizada em primeiro para o par de primers 27F/809R
(tabela1), com o objectivo de amplificar um fragmento de 782 bp (pares de bases) do 16S
rRNA partilhado por todas as cianobactrias. Este primeiro PCR serviu como controlo
positivo das anlises de PCR subsequentes. Aps confirmada a presena de
cianobactrias, foram realizados ensaios com vista a determinar a presena dos dois
principais grupos de cianobactrias produtoras das toxinas referidas no presente
trabalho, ou seja, para deteco do gnero Microcystis e da espcie Cylindrospermopsis
raciborskii. O par de primers Micr184F/431R foi usado para amplificar uma regio de
230 bp do gene 16S rRNA, especfica do gnero Microcystis, para confirmao destes
nas amostras. Este par de primers tem sido til para detectar uma larga diversidade de
espcies de Microcystis (Neilan et al. 1997). O par de primers cyl2/cyl4, amplifica uma
regio de 300 bp do gene rpoC1, especfico da espcie Cilindrospermopsis raciborskii
(Wilson et al. 2000).
Contudo, existem outras espcies capazes de produzir estas toxinas e, a presena de
uma espcie j descrita como produtora de toxinas no indica a produo desta. Dentro
de uma mesma espcie de cianobactrias podem existir estirpes produtoras e no
produtoras de toxinas. Segundo Pearson e Neilan (2008), a produo de toxina depende
da presena dos genes responsveis pela produo da toxina. Sendo assim, caso estes
genes estejam presentes, poder ocorrer a produo das toxinas.
No presente trabalho foram seleccionados primers de genes envolvidos na produo
de microcistina, nodularina e cilindrospermopsina.
O par de primers mcyA-Cd1F/mcyA-Cd1R amplificou um fragmento de 297 bp do
gene mcyA, o qual se encontra presente em vrias espcies produtoras de microcistinas,
como as pertencentes aos gneros Anabaena, Microcystis, e Planktothrix (Hisbergues et
al. 2003). Amostras positivas para este fragmento tm sido demonstradas como tendo
uma elevada probabilidade de produzirem microcistinas (Hisbergues et al. 2003; Saker et
al. 2005a). O par de primers mcyB 2959F/mcyB 3278R amplificou um fragmento de 320
bp do gene mcyB, gene presente em estirpes de Microcystis produtoras de microcistina.
O par de primers PKEF1/PKER1 amplificou um fragmento de 755 bp do gene mcyE,
tendo sido desenhado com base na sequncia do gene no gnero Microcystis (Ouahid et
al. 2005).
Um dos pares de primers utilizados neste estudo (HEPF/HEPR) foi desenhado como
alvo do local da aminotransferase localizada nos genes mcyE e ndaF, de microcistinas e
25

Materiais e Mtodos
nodularinas sintetases respectivamente, de todas as cianobactrias hepatotxicas
(Jungblut e Neilan 2006), amplificando um fragmento de 472 bp, ao qual se deu o nome
de HEP.
Para a deteco de cilindrospermopsina usaram-se os pares de primers
PKSM4/PKSM5, K18/M14 e M13/M14. Os dois primeiros pares de primers foram
desenhados como alvo do gene poliquetido sintetase e o ltimo para a pptido
sintetase (Schembri et al. 2001), amplificando respectivamente fragmentos de 650, 422 e
597 bp. Estes genes esto envolvidos na biossntese do metabolismo secundrio das
cianobactrias e, segundo Schembri e colaboradores (2001), a presena simultnea dos
dois genes est associada com a capacidade de produo de cilindrospermopsina.
A confirmao da amplificao por PCR foi feita por electroforese em gel de agarose,
como descrito anteriormente para a presena de DNA genmico.

1.1.1. Preparao das amostras para sequenciao

As culturas que anteriormente foram seleccionadas para anlise de PCR, devido
sua ocorrncia e potencial txico, foram preparadas para sequenciao, com vista a
determinar, de forma mais exacta o gnero, e quando possvel a espcie. A
sequenciao foi feita para os dois fragmentos do gene 16S rRNA (27F/809R e
740F/1494R).
Uma vez comprovada por PCR a amplificao do gene 16S rRNA, foi feita uma nova
amplificao dos genes, para um volume de 100 L, a fim de se poder sequenciar. O
volume dos reagentes para a reaco de PCR mantiveram-se na mesma proporo das
anteriormente descritas. Aps a reaco, o produto da reaco foi purificado recorrendo a
um kit para purificao de DNA: PCR Clean-up Gel extraction (Macherey-Nagel) de
acordo com a informaes do fabricante no protocolo para limpeza de DNA (protocol for
PCR clean-up). A nica alterao feita ao kit refere-se ao passo de eluio final que foi
feita em 30 L de gua ultra-pura estril.
Por cada amostra a sequenciar foi igualmente enviado 5 L do respectivo primer (10
pmol/L). Todas as amostras e os primers foram enviados para sequenciar para a
empresa STABVIDA.

26

Materiais e Mtodos
Tabela I Condies das reaces de PCR para cada par de primers utilizados
Reaco de PCR

Nome do primer

Sequncia do primer (5-3)

Tamanho
(bp)

27F
809R

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
GCTTCGGCACGGCTCGGGTCGATA

780

92C
2m

740F
1494R

GGCYRWAWCTGACACTSAGGGA
TACGGTTACCTTGTTACGAC

754

92C
2m

Micr184F
Micr431R

GCCGCRAGGTGAAAMCTAA
AATCCAAARACCTTCCTCCC

220

92C
2m

mcyA

mcyA-CD1F
mcyA-CD1R

AAAATTAAAAGCCGTATCAAA
AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT

297

92C
2m

mcyB

mcyB2959F
mcyB3278R

TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA
AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC

350

92C
2m

mcyE

PKEF1
PKER1

CGCAAACCCGATTTACAG
CCCCTACCATCTTCATCTTC

755

94C
5m

mcyE / ndaF

HEPF
HEPR

TTTGGGGTTAACTTTTTTGGCCATAGTC
AATTCTTGAGGCTGTAAATCGGGTTT

472

92C
2m

CYL 2
CYL 4

GGCATTCCTAGTTATATTGCCATACTA
GCCCGTTTTTGTCCCTTTGCTGC

300

95c
2m

PKS M4
PKS M5

GAAGCTCTGGAATCCGGTAA
AATCCTTACGGGATCCGGTGC

650

95C
2m

Gene codificante
Cilindrospermopsina
Poliquetido sintetase

K18
M4

CCTCGCACATAGCCATTTGC
GAAGCTCTGGAATCCGGTAA

422

94C
10m

Gene codificante
Cilindrospermopsina
Peptido sintetase

M13
M14

GGCAAATTGTGATAGCCACGAGC
GATGGAACATCGCTCACTGGTG

597

95C
2m

Gene alvo
16S rRNA (fragmento
especfico para
cianobactrias)
16S rRNA (fragmento
especfico para
cianobactrias)
16S rRNA (fragmento
especfico de
Microcystis sp.)

rpoC1 (fragmento
especfico de
Cylindrospermopsis)
Gene codificante
Cilindrospemopsina
Poliquetido sintetase

Desnaturao

Emparelhamento
92C
20 s
92C
20s
92C
20s
92C
20s
92C
20s
95C
60s
92C
20s
95C
90s
95C
90s
94C
30s
95C
90s

35 ciclos
50C
30 s
35 ciclos
50C
30s
35 ciclos
50C
30s
35 ciclos
56C
30s
35 ciclos
56C
30s
40 ciclos
52C
30s
40 ciclos
52C
30s
35 ciclos
45C
30s
35 ciclos
55C
30s
30 ciclos
45C
30s
35 ciclos
55C
30s

72C
1m
72C
1m
72C
1m
72C
1m
72C
1m
72C
1m
72C
1m
72C
50s
72C
50s
72C
1m
72C
50s

Extenso

Referncia

72C
5m

(Neilan et al.
1997; Jungblut
et al. 2005)

72C
5m

(Neilan et al.
1997)

72C
5m

(Neilan et al.
1997)

72C
5m

(Hisbergues et
al. 2003)

72C
5m

(Nonneman e
Zimba 2002)

72C
7m

(Ouahid et al.
2005)

72C
5m

(Jungblut e
Neilan 2006)

72C
7m

(Wilson et al.
2000)

72C
7m

(Schembri et al.
2001)

72C
7m

(Schembri et al.
2001;
Fergusson e
Saint 2003)

72C
7m

(Schembri et al.
2001)

27

Materiais e Mtodos
Uma vez que se amplificou a mesma regio dos genes em dois sentidos, com vista a
tornar a sequncia obtida mais completa, utilizaram-se dois programas disponveis na
internet.

primeiro

programa,

reverse

complement

(http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html), tinha como objectivo desenvolver a

sequncia

de

modo

inverso.

segundo,

multialin

(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), alinhava as duas sequncias, permitindo

por tratamento manual, completar bases em falta ou possveis erros. Este processo foi
realizado para os dois fragmentos do gene 16S rRNA, e posteriormente, recorrendo
novamente ao programa multialin, os dois fragmentos foram alinhados, com vista a que o
fragmento para determinao do gnero ou espcie fosse maior para aumentar a certeza
dos resultados. As sequncias aps todas as correces foram inseridas na base de
dados BLASTn (Basic Local Alignment and Search Tool for nucleotide), integrado no
NCBI

(Nacional

Centre

for

Biotechnology

Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&ME
GABLAST=on&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_D
EFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome), determinando-se qual a espcie ou gnero
presente na cultura. Esta determinao teve por base uma combinao do mximo
score e da percentagem de similaridade com o organismo sequenciado.

1.1.2. Amplificao por PCR em tempo real

O ensaio realizado no presente trabalho foi baseado no sistema de deteco com o
marcador SYBRGreen, em combinao com um sistema analtico de PCR em tempo real.
Esta molcula, quando livre no emite fluorescncia mas, quando ligada a cadeias duplas
de DNA emite um forte sinal luminoso. O fluorforo tem a capacidade de se ligar s
cadeias duplas de DNA que, com a excitao da luz emitida pelo sistema ptico do
termociclador, emite uma fluorescncia verde. medida que se vo formando mais
cadeias duplas de DNA por reaco em cadeia de polimerase, mais molculas de
SYBRGreen se vo ligando a estas. A reaco monitorizada continuamente, sendo o
aumento da fluorescncia observado em tempo real. Durante as etapas de desnaturao,
devido quebra das cadeias duplas de DNA, as molculas de SYBRGreen libertam-se,
diminuindo a fluorescncia. Uma vez que a deteco da fluorescncia ocorre no final de
cada etapa de extenso de cada ciclo de PCR, possvel monitorizar a quantidade
crescente de DNA amplificado, sendo que a intensidade do sinal gerado directamente
proporcional quantidade de produto formado.
A quantificao do DNA tem de ser feita na fase exponencial de amplificao. Por
PCR em tempo real, esta deteco feita por determinao do nmero de ciclos a partir
28

Materiais e Mtodos
do qual o aumento da fluorescncia passa a ser exponencial. O ponto em que a
fluorescncia passa este limiar (threshold) denominado por Ct (threshold cycle). No
final das reaces de amplificao tambm determinado o melting temperature, ou
seja, a temperatura qual se d a quebra da cadeia dupla de DNA. Para um par de
primers especfico, a temperatura de desnaturao sempre igual. Assim, possvel
determinar se a fluorescncia que se est a ler se deve amplificao do DNA alvo ou,
por exemplo, formao de dmeros de primers. Estes dmeros de primers que se
formam tm origem em primers que se ligam entre eles.
As condies de reaco de PCR em tempo real diferiram das de PCR convencional
e encontram-se descritos na tabela II.
A amplificao por RT-qPCR foi efectuada para as amostras ambientais e para as
amostras ambientais para optimizao dos volumes de amostragem, para os genes
relativos aos seguintes primers: Cya359F/Cya781R, Micr184F/Micr431R, mcyACD1F/mcyA-CD1R e mcyB2959F/mcyB3278R. A reaco foi realizada com 5 L de DNA,
0,4 M de cada primer (tabela II) e 1x IQ SYBRGreen Supermix (Biorad), num volume
final de reaco de 25 L. Com vista obteno de melhores resultados e para diminuir
possveis interferncias de contaminantes ambientais, as amostras foram diludas numa
proporo de 1:10. A reaco de amplificao foi feita num termociclador BioRad
ICyclerTM Real-Time PCR Detection System. No final de cada extenso da reaco de
RT-qPCR, foi ainda realizado um quarto ciclo, com o objectivo de determinar os valores
de melting temperature. Para tal, o ciclo comeou a 55C, sofrendo um aumento de
0,5C a cada 30 segundos, num total de 81x, ou seja, at se atingir os 95C. A anlise
dos dados foi feita recorrendo ao software da BioRad IQ5.
Para a quantificao do DNA alvo necessria a construo de uma recta padro. A
recta padro baseada em concentraes de clulas predeterminadas e estabelecida
automaticamente pelo software, relacionando concentraes de DNA conhecidas, com
valores de Ct dessas amostras. Como controlos para a reaco de PCR em tempo real,
foram utilizadas 6 diluies de uma cultura de uma estirpe de Microcystis aeruginosa
(M6) com concentrao inicial de 1,19x106 cls/mL (determinadas por contagem
microscpica directa), sendo que para as vrias diluies efectuadas se obteve uma
gama de concentraes entre 1,19x106 cls/ml e 1,19 cls/mL.

29

Materiais e Mtodos
Tabela II - Condies da reaco de PCR em tempo real para cada par de primers
Gene alvo

16S rRNA

Reaco de RT-qPCR

Nome do
primer

Desnaturao

Cya359F

95C

Cya781R

5 min

Emparelhamento
50 ciclos
95C

60C

72C

15 s

15 s

30 s

16s rRNA
Micr 184F

95C

especfico de

Micr 431R

5 min

mcyA - CD1F

95C

mcyA - CD1R

8 min

mcyB2959F

95C

mcyB3278R

8 min

Microcystis sp.)

mcyB

1.2.

Referncia

95C

(Nubel et al.

1 min

1997)

95C

(Neilan et al.

1 min

1997)

95C

(Hisbergues

1 min

et al. 2003)

40 ciclos

(fragmento

mcyA

Extenso

95C

52C

72C

15 s

30 s

30 s

40 ciclos
95C

59C

72C

15 s

30 s

30 s

40 ciclos
95C

59C

72C

15 s

30 s

30 s

95C
1 min

(Nonneman
e Zimba
2002)

Ensaios enzimticos ELISA

1.2.1. Preparao das amostras

Para as culturas, a preparao das amostras para ensaio de ELISA foi feito quando
estas se encontravam na fase de crescimento logartmico, pois nesta fase que ocorre a
maior produo da toxina (Apeldoorn et al. 2007).
As amostras foram congeladas a -20C. Em seguida foram sonicadas, na potncia
mxima (60 Hz) durante 1min (em gelo), utilizando uma sonda de ultrasons (Vibra Cell
Sonics & Materials Inc., Danbury, CT, USA).
As amostras ambientais foram sonicadas, como descrito para as culturas. Nas
amostras para optimizao do volume, aps sonicao o material foi novamente
congelado para poder ser liofilizado. No final da liofilizao, os extractos foram
dissolvidos num volume igual ao inicialmente utilizado, com gua ultra-pura esterilizada e
depois filtradas por filtros Millex 0.45 m.
At realizao dos testes de ELISA as amostras foram acondicionadas no congelador
a -20C.

30

Materiais e Mtodos

1.2.2. Deteco de toxinas por ELISA

A deteco de toxinas por ELISA (Highly Sensitive Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) foi feita recorrendo a dois kits de ELISA. Um dos kits tinha como objectivo a
deteco de toxinas hepatxicas, as microcistinas (EnviroGardTM Microcystins Plate Kit,
Strategic Diagnostic Inc., Newark, NJ, USA). Este teste no permite a distino entre
algumas variantes de microcistina (MC), detectando, entre outras, MC-LR, MC-RR, MCYR e Nodularinas. Assim, o resultado expresso em Microcistina-LR equivalente. O outro
kit permitia a deteco da cianotoxina cilindrospermopsina (Cylindrospermopsin ELISA
(Microtiter Plate), Abraxis).

Deteco de microcistinas por ELISA

A deteco de microcistinas por ELISA foi realizada para as amostras ambientais
(num volume de 10 mL para preparao dos extractos), para as amostras ambientais
com vista a optimizao dos volumes (volumes compreendidos entre 2 e 50 mL) e ainda
para algumas das estirpes de cianobactrias isoladas. Todas estas amostras, antes da
execuo dos ensaios foram preparadas conforme descrito no passo anterior. Para alm
destes, para as amostras ambientais, foi igualmente realizado o ensaio sem haver a
preparao prvia dos extractos. O objectivo consistiu em poder discernir entre a
quantidade de toxina j existente no meio e a quantidade aps a disrupo das clulas,
ou seja, a que se encontrava no interior das cianobactrias.
A calibrao deste teste feita atravs de uma MC-LR no txica, a nveis de 0,1;
0,2; 0,4; 0,56; 0,8 e 1,6 ppb. O kit possui anticorpos policlonais que se ligam tanto a
microcistinas, como a conjugados microcistina-enzima, e que se encontram imobilizados
nas paredes dos poos do kit. As microcistinas presentes nas amostras vo competir com
os conjugados microcistina-enzima por um nmero limitado de locais de ligao aos
anticorpos.
Uma vez que em cada poo do teste existe um igual nmero de locais de ligao aos
anticorpos, e cada poo recebe um mesmo nmero de molculas de conjugados
microcistina-enzima, uma amostra com uma menor concentrao de microcistinas
permite que se liguem aos anticorpos um maior nmero de molculas de conjugado
microcistina-enzima, obtendo-se neste caso, uma soluo azul escura. Inversamente,
uma alta concentrao de microcistinas na amostra, permite uma menor ligao de
molculas conjugadas microcistinas-enzima aos anticorpos, obtendo-se uma soluo azul
clara.
Os resultados obtidos foram analisados espectrofotometricamente a 450 nm, com o
auxlio de um espectrofotmetro Synergy HT (BioTek).
31

Materiais e Mtodos
O ensaio foi feito com todas as amostras em duplicado, assim como para os controlos
positivos e negativo. Com base nos resultados obtidos para os controlos positivos, numa
folha de Microsoft Office Excel, foi contruda uma curva de calibrao. Com base nesta
curva e nos valores obtidos por espectrofotometria para cada amostra, foi possvel
determinar a concentrao de microcistina em cada amostra. Os resultados obtidos foram
expressos em g/L. Sempre que algum valor de amostra se encontrava acima de 1,6
g/L, ou seja, fora da recta de calibrao, foi necessrio realizar diluies das amostras
(1:10 e 1:50) com o objectivo de determinar de forma mais correcta a concentrao de
microcistinas. Valores inferiores a 0,10 g/L foram considerados negativos.

Deteco de cilindrospermopsina por ELISA

A deteco de cilindrospermopsina foi feita apenas para as amostras ambientais. Este
teste

baseia-se

no

princpio

da

existncia

de

anticorpos

especficos

para

cilindrospermopsina. Quando numa amostra existe cilindrospermopsina, esta toxina,

assim como uma anloga, cilindrospermopsina-HRP vo competir para se ligarem aos
anticorpos

anti-cilindrospermopsina

presentes

na

soluo.

Os

anticorpos

de

cilindrospermopsina vo depois ligar-se a um segundo anticorpo (ovelha anti-coelho)

imobilizados na placa. Aps um passo de lavagem e da adio de uma soluo substrato,
d-se uma reaco colorimtrica. A intensidade da cor azul inversamente proporcional
concentrao de cilindrospermopsina presente na amostra. A reaco aps um tempo
especfico parada e a cor avaliada por espectrofotometria a 450 nm, com o auxlio de
um espectrofotmetro Synergy HT (BioTek).
A calibrao deste teste feita com base em 7 amostras padro de 0; 0,05; 0,10;
0,25; 0,50; 1,0 e 2,0 ng/L, assim como por um controlo de 0,75 ng/L. A anlise dos
resultados foi feita recorrendo ao uso do Microsoft Office Excel, realizando os clculos
fornecidos pelo fabricante. A concentrao das amostras foi determinada recorrendo
construo de uma curva de calibrao. Amostras com uma concentrao inferior a 0,05
ng/L de cilindrospermopsina foram consideradas negativas. Amostras com uma
concentrao superior a 2,0 ng/L foram diludas e repetido o ensaio.

1.3.

Deteco e quantificao de microcistinas por HPLC

1.3.1. Preparao das amostras

As amostras ambientais foram filtradas num perodo no superior a 24 horas aps
amostragem. O volume filtrado foi de 2000 mL. Para tal foi utilizada a tcnica de filtrao

32

Materiais e Mtodos
por vcuo, recorrendo a filtros de microfibra de vidro GF/C (Whatman). Para a filtrao
foram utilizados, por amostra, tantos filtros quantos os necessrios para permitir a
filtrao do volume total da amostra.
Num gobl foram colocados os filtros e adicionado um volume de 20 mL de metanol a
50% por filtro e triturado mecanicamente at obteno de uma soluo homognea.
Posteriormente a soluo foi submetida a ultrasons (Vibra Cell Sonics & Materials Inc.,
Danbury, CT, USA). As amostras foram mantidas durante a noite no frigorfico (4C) e
depois foram centrifugadas numa centrifugadora Survall Legend RT Centrifuge (Thermo
Electron Corporation) a uma velocidade de 4150rpm por 5 a 10 minutos (at obteno
de uma soluo lmpida). O sobrenadante foi aproveitado e colocado numa hotte e em
banho-maria (40C) at evaporao total. A amostra foi depois ressuspendida em
1000L de metanol (50%) e filtrado por um filtro de 0,2 m para um vial de HPLC e
injectado imediatamente.

1.3.2. Deteco e quantificao por HPLC de microcistinas

O mtodo HPLC (High Performance Liquid Chromatography) baseia-se na leitura de
elementos constituintes de uma amostra, comparando o tempo de reteno do padro,
com o tempo das molculas a investigar.
A concentrao de microcistinas nas amostras ambientais foi determinada seguindo o
mtodo de HPLC-DAD modificado (Pflugmacher et al. 2006). A soluo padro utilizada
foi Microcistina-LR (Batch MCLR-108, pureza de 100%), obtida atravs da DHI Water and
Environment (Hoersholm, Denmark). O padro, os controlos e as amostras foram diludos
numa soluo metanlica (50%) (VWR International, Carnaxide, Portugal). O sistema de
cromatogafia utilizado foi o Merk Lachrom HITACHI HPLC equipado com um interface D7000, um detector de fluorescncia L-7480, uma amostrador automtico L-7200 e uma
bomba L-7000. Como aparelho externo foi utilizada uma coluna de controlo de
temperatura THERMASPHERETMTS-130 (Phenomenex).
O ensaio de microcistinas foi executado usando um Lichrosphere 100 RP-18
(25cm4mm, 5m) equipado com uma coluna guarda Purosphere Star RP-18
endcapped (44mm, 5m) (Merck, VWR International, Portugal), ambos mantidos a uma
temperatura de 40C. A fase movel foi constituida por gua ultrapura Milli-Q e acetonitrilo
(VWR International, Carnaxide, Portugal), ambos contendo 0,1% (v/v) de cido
trifluoroacetico (TFA, 99,5%) (Sigma-Aldrich Inc, Sintra, Portugal). O acetonitrilo foi
previamente filtrado por filtros de membrana de polipropileno hidroflicas de 0,2m (Pall
Life Sciences).

33

Materiais e Mtodos
A separao cromatogrfica foi feita com uma taxa de fluxo de 1mL/min, usando um
gradiente de eluio que comeou com 30% de acetonitrilo, aumentando at aos 70% ao
fim de 20 min, seguido de um aumento at aos 100% por 2 min e retornando aos 30%
passados 30 min.
O volume injectado foi de 20 L. As microcistinas foram detectadas devido sua
capacidade de absorvncia UV aos 238nm e as concentraes correspondentes foram
determinadas usando uma relao linear entre as reas dos picos a 238nm e a
quantidade de toxina padro injectada. A calibrao da curva de microcistinas foi linear
entre os 0,25 e os 9,3ppm.

1.1.

Deteco de toxinas por MALDI-TOF MS

O mtodo de MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-OfFlight Mass Spectrometry) permite a deteco de pptidos e compostos semelhantes a
pptidos, eventualmente txicos (Martins et al. 2005; Saker et al. 2005a).
A deteco de toxinas por este mtodo foi feita para as amostras ambientais que
apresentaram quaisquer dos genes envolvidos na produo de microcistinas, ou seja,
resultados positivos por PCR para os genes mcyA, mcyB, mcyE ou para o fragmento
HEP. Para as estirpes cultivadas, esta anlise foi realizada sempre que houve deteco
da toxina por ELISA.
Um volume de cerca de 15 mL de amostra ambiental ou cultura pura de
cianobactrias foi congelado e, posteriormente liofilizado (EZ-DRY, FTS Systems, Stone
Ridge, New York, USA). Os extractos obtidos foram colocados em eppendorfs e enviados
para o Dr. Martin Welker do Technissche Universitat Berlin na Alemanha, onde foi
realizada a anlise.

34

Resultados

2. Resultados

2.1.

Parmetros fsico-qumicos e ocorrncia de cianobactrias nos locais

amostrados

Nos dois locais estudados foram realizadas 4 amostragens a 19 de Setembro (19Set), 1, 15 e 29 de Outubro (1-Out, 15-Out e 29-Out, respectivamente), tendo-se
detectado a presena de cianobactrias tanto no Marco como no Torro para todas as
datas.
As amostragens foram todas realizadas entre as 11h e as 12h. No local de
amostragem foram determinados os parmetros fsico-qumicos de temperatura (C)
(fig.13), oxignio dissolvido (mg/L) e saturao de oxignio (%) (fig.14), pH (fig.15) e
condutividade (S/cm) (fig.16). Na data de 19-Set, devido a problemas com o oxmetro,
no foi possvel quantificar valores de oxignio dissolvido.
Os parmetros de pH, oximetria e temperatura no variaram muito entre os dois
locais. A condutividade foi sempre superior no Torro sofrendo, neste local, oscilaes
maiores ao longo das datas. O pH nas diferentes datas mantm-se semelhante, a
oximetria vai aumentando e a temperatura da gua diminuindo.

Temperatura (C)

25
20
15
Marco
10

Torro

5
0
19-Set

01-Out

15-Out

29-Out

Figura 13 - Valores de temperatura superficial da gua (C) determinados no Marco e Torro em cada
data de amostragem.

35

10

saturao de oxignio (%)

Oxignio dissolvido (mg/L)

Resultados

8
6
4
2

120
100
80
60
40
20
0

0
01-Out

15-Out

Marco

Torro

01-Out

29-Out

Marco

15-Out

29-Out

Torro

Figura 14a e 14b - Valores de oxignio dissolvido (mg/L) e saturao de oxignio (%) determinados no
Marco e Torro em cada data de amostragem.

14
12

pH

10
8

Marco

Torro

4
2
0
19-Set

01-Out

15-Out

29-Out

condutividade (S/cm)

Figura 15 - Valores de pH determinados no Marco e Torro em cada data de amostragem.

200
150
Marco

100

Torro
50
0
19-Set

01-Out

15-Out

29-Out

Figura 16 - Valores de condutividade determinados no Marco e Torro em cada data de amostragem.

36

Resultados
Na data de 19-Set, a espcie Microcystis aeruginosa era dominante, formando
inclusiv florescncias superfcie da gua (fig.17). Este fenmeno era mais evidente no
Marco que no Torro. Ao longo das amostragens a quantidade de M. aeruginosa foi
diminuindo, sendo que a 29-Out a espcie dominante de cianobactrias era a
Aphanizomenon flos-aquae. A espcie M. wesenbergii apareceu conjuntamente com a M.
aeruginosa, com um padro de ocorrncia semelhante mas sempre em menores
quantidades.

Figura 17 - Florescncia de cianobactrias no Marco na data de 19-Set.

Por observao microscpica das amostras concentradas com a rede de plncton

identificaram-se e isolaram-se dez espcies de cianobactrias (tabela III). Na figura 18
possivel ver imagens das espcies identificadas.
Das amostras naturais foram isoladas estirpes de cianobactrias, as quais foram
mantidas em culturas monoalgais no axmicas, em meio Z8, com vista a uma
caracterizao toxicolgica.
Tabela III - Espcies microscopicamente identificadas nas amostras do Marco e do Torro em cada uma
das datas de amostragem

Espcies

Marco
19-Set

01-Out

15-Out

Torro
29-Out

19-Set

01-Out

15-Out

29-Out

Anabaena sp.
Aphanizomenon flos-aquae
Limnothrix sp.
Leptolyngbya sp.
Lyngbya sp.
Microcystis aeruginosa
Microcystis wesenbergii
Oscillatoria sp.
Pseudonabaena sp.
Synechocystis sp.

37

Resultados

10m

Anabaena sp.

100m

Aphanizomenon flos-aquae
10m

10m

Limnothrix sp.

Leptolyngbya sp.

10m

Lyngbya sp.

Microcystis aeruginosa

10m

Microcystis wesenbergii

Oscillatoria sp.

Figura 18 - Fotografias de espcies de cianobactrias identificadas por microscopia ptica.

38

Resultados

Pseudonabaena sp.

Synechocystis sp.

Figura 18 (continuao) Espcies de cianobactrias identificadas por microscopia ptica.

2.2.

Isolamento e cultura de cianobactrias

Com base na ocorrncia e potencial txico, as espcies que morfologicamente

aparentavam ser M. aeruginosa, M. wesenbergii e A. flos-aquae foram cultivadas para
posterior anlise molecular e imunolgica. Tambm foi isolada e cultivada a espcie
Limnothrix sp., pois uma espcie pouco comum e para que se pudesse comprovar por
anlise genotpica se realmente era pertencente a este gnero. Para estas 4 espcies
foram isoladas 22 estirpes.
Para a espcie M. wesenbergii, foram identificados, quando em cultura, diferentes
morfotipos, como possvel observar na figura 19. Para os morfotipos da data de 19-Set,
nos dois locais, foram medidas as dimenses das clulas, sendo que o dimetro maior foi
de 6,471,02m e o dimetro menor de 5,860,84m (mdia desvio padro).

39

Resultados

1. Marco 15-Out

2. Marco 15-Out

3. Marco 15-Out

4. Marco 19-Set

5. Marco 19-Set

6. Marco 1-Out

7. Marco 1-Out

8. Torro 1-Out

Figura 19 - Morfotipos de M. wesenbergii identificados em cultura de laboratrio, nas diferentes datas do

Torro e do Marco.

40

Resultados

1. Torro 15-Out

2. Torro 19-Set

3. Torro 19-Set

4. Torro 19-Set

5. Torro 19-Set

6. Torro 19-Set

Figura 19 (continuao) - Morfotipos de M.

wesenbergii identificados em cultura de laboratrio,
nas diferentes datas do Torro e do Marco.

7. Torro 19-Set

41

Resultados

2.3.
As

Identificao de cianobactrias (fenotpica e genotpica)

22

estirpes

de

cianobactrias

isoladas

foram

igualmente

identificadas

genotipicamente. Aps a extraco do DNA genmico, procedeu-se amplificao do

gene 16S rRNA numa reaco de 20L, com os pares de primers 27F/809R. A ttulo de
exemplo, apresenta-se na figura 20 o resultado da amplificao por electroforese, aps a
anlise de PCR. A numerao das estirpes da figura 20 refere-se s estirpes identificadas
na tabela V. Para as restantes estirpes, as fotografias dos gis encontram-se no anexo I.

Figura 20 - Produto da amplificao para o gene 16S rRNA para as estirpes 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 13, 14,
15, 20, 21, 22; (+) Controlo positivo; (B) controlo negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de
100bp a 12kb).

Aps confirmada uma boa amplificao do gene 16S rRNA com este par de primer,
procedeu-se anlise por PCR num volume de 100L. A amplificao foi igualmente
feita, para este volume, para outro fragmento do gene 16S rRNA, com o par de primers
740F/1494R. A amplificao foi feita neste volume para que fosse possvel sequenciar.
Os produtos dos dois PCRs realizados foram purificados e sequenciados. Do primeiro
par de primers resultou uma sequncia de 780 pares de bases entre as posies 27 e
809 e do segundo, uma sequncia de 754 pares de bases entre as posies 740 e 1494.
Estas posies no gene referem-se numerao do gene 16S rRNA de E. coli. As duas
sequncias eram contguas, apresentando uma parte comum, o que permitiu que fossem
emparelhadas,

obtendo-se

no

final

um

fragmento

do

gene

16S

rRNA

de

aproximadamente 1460 pares de bases, entre as posies 27 e 1494. As sequncias

originadas foram analisadas usando o programa BLAST do GenBank. Os resultados da
sequenciao encontram-se sumariados na tabela IV, apresentando-se referenciado o
gnero/espcie devolvido, com o respectivo nmero de acesso do exemplar e a
percentagem de similaridade com a estirpe cultivada.
Das 22 estirpes enviadas para sequenciao, foram identificadas 20. Para a estirpe 5
e 20 no se conseguiu obter resultados da sequenciao, sendo referida na tabela como
no sequenciada (N.S.). As percentagens de similaridade dos organismos sequenciados
42

Resultados
com as estirpes pertencentes base de dados BLAST foi sempre superior a 93%, sendo
que s para estirpes do gnero Limnothrix que se obtiveram percentagens de
similaridade inferiores a 99%.
Tabela IV - Resultados da sequenciao para identificao genotpica das estirpes cultivadas, incluindo
n de acesso da base de dados BLAST e percentagem (%) de similaridade

Identificao final
Estirpe
Estirpe
Aphanizomenon flos-aquae 1tu37s13
Limnothrix redekei LMECYA 145
2
Limnothrix sp. CENA110
Limnothrix redekei LMECYA 145
3
Limnothrix sp. CENA110
4
5
N.S.
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
6
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
7
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC AubB1
8
Microcystis ichthyoblabe 0BB35S01
Microcystis sp. AICB 35
9
Microcystis aeruginosa NIES-101
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
10
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
11
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
12
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
13
Microcystis wesenbergii gene
Limnothrix redekei 165c
14
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
15
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
16
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa gene isolate TAC170
17
Microcystis sp. AICB 34
18
Microcystis aeruginosa strain UWOCC AubB1
Microcystis ichthyoblabe 0BB35S01
19
Microcystis aeruginosa strain UWOCC AubB1
20
N.S.
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
21
Microcystis wesenbergii gene
Microcystis aeruginosa strain UWOCC C4
22
Microcystis wesenbergii gene
N.S. no sequenciada
1

N acesso

% similaridade

AJ630442
EU078512
EF088338
EU078512
EF088338

99%
97%
97%
97%
93%

AF139316
AF139316
AB035553
AF139304
AJ635434
AY672728
FJ461750
AF139316
AB035553
AF139316
AB035553
AF139316
AB035553
AF139316
AB035553
AJ505943
AF139316
AB035553
AF139316
AB035553
AB012340
AY672727
AF139304
AJ635434
AF139304
FJ839355
AF139316
AB035553
AF139316
AB035553

99%
99%
99%
99%
99%
100%
99%
99%
99%
99%
99%
100%
100%
99%
99%
97%
99%
99%
100%
100%
99%
99%
99%
100%
100%
99%
100%
100%
99%
99%

As sequncias amplificadas para cada uma das estirpes cultivadas encontram-se no

anexo II. Com base nos resultados das sequenciaes e na identificao microscpica,
identificou-se 1 Aphanizomenon flos-aquae, 4 Limnothrix sp., 10 M. aeruginosa e 7 M.
wesenbergii (tabela V). A distino entre M. aeruginosa e M. wesenbergii foi apenas
43

Resultados
possvel morfologicamente, sendo estas espcies classificadas como morfoespcies,
uma vez que geneticamente so iguais.
Tabela V - Cianobactrias identificadas genotipicamente e microscopicamente

Estirpe
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

Espcie
Aphanizomenon flos-aquae
Limnothrix sp.
Limnothrix sp.
Limnothrix sp.
Microcystis aeruginosa*
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis wesenbergii
Microcystis wesenbergii
Microcystis wesenbergii
Microcystis wesenbergii
Limnothrix sp.
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis aeruginosa
Microcystis wesenbergii*
Microcystis wesenbergii
Microcystis wesenbergii

*Identificao baseada apenas na anlise microscpica

2.4.

Anlise de PCR para deteco de espcies potencialmente produtoras

de toxinas e de genes envolvidos na produo destas

Aps a extraco do DNA, a eficincia da extraco e presena de DNA foi

confirmada por electroforese em gel de agarose. Para as amostras ambientais com vista
optimizao do volume foi tambm quantificado o DNA genmico atravs do mtodo do
q-Bit. Todas as amostras, ambientais ou de estirpes cultivadas apresentaram banda no
gel de agarose, confirmando a boa eficincia de extraco.
A anlise da reaco em cadeia de polimerase (PCR) foi feita para as amostras
ambientais, para as amostras ambientais com vista optimizao dos volumes e para as
22 estirpes cultivadas. Todas as fotografias referentes anlise de PCR encontram-se
compiladas no anexo I.
Inicialmente a anlise de PCR foi feita para o gene 16S rRNA. Aps a confirmao da
presena do gene, ou seja, a confirmao da presena de cianobactrias, procedeu-se
deteco de genes referentes aos dois principais grupos de organismos produtores das
toxinas estudadas no presente trabalho, ou seja, Microcystis spp. e Cylindrospermopsis
44

Resultados
raciborskii. Por fim, foram feitas amplificaes com o objectivo de detectar a presena de
genes envolvidos na produo de cilindrospermopsina, nodularina e microcistina. Nas
anlises de PCR efectuadas, os resultados relativos s amplificaes com os pares de
primers Cyl2/Cyl4, PKSM4/M5, K18/M4 e M13/M14 foram sempre negativos.
Inicialmente a anlise de PCR para os genes relativos aos pares de primers
Micr184Fw/Micr431Rv,

mcyA-cd1Fw/mcyA-cd1Rv e

mcyB2959Fw/mcyB3278Rv foi

realizada em multiplex PCR. O mesmo foi feito para os pares de primers Cyl2/Cyl4,
PKSM4/PKSM5 e K18/M14. A resoluo das imagens de electroforese, devido ao facto
de os fragmentos terem, por vezes, tamanho (em pares de bases) muito semelhantes,
no foi boa. Assim, a anlise para todos estes fragmentos passou a ser feita apenas para
um par de primers por reaco de PCR. Na figura 21 possvel visualizar um dos
resultados de multiplex PCR para os pares de primers Micr184Fw/Micr431Rv, mcyAcd1Fw/mcyA-cd1Rv

mcyB2959Fw/mcyB3278Rv.

par

de

primers

Micr184Fw/Micr431Rv amplificou um fragmento de 220 bp, e o par de primers McyAcd1Fw/mcyA-cd1Rv um fragmento de 297 bp. Na imagem a distino destes dois
fragmentos no boa, sendo que, nos casos em que s surge um deles no possvel
discernir, com toda a certeza, qual dos dois fragmentos foi amplificado.

mcyB

mcyA
m16S

Figura 21 - Produto da amplificao dos fragmentos 16S rRNA especfico de Microcystistis sp., mcyA e
mcyB para um volume de 20L, numa reaco de multiplex PCR. Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos
de 100bp a 12kb)

45

Resultados

2.4.1. Amostras ambientais

A anlise de PCR foi feita para as amostras ambientais nas 4 datas de amostragem,
para o Marco e o Torro. Os resultados da anlise de PCR encontram-se sumariados na
tabela VI. Os resultados para os pares de primers Cyl2/Cyl4, PKS M4/M5, K18/M4 e
M13/M14, no se encontram descritos na tabela por terem sido todos negativos.
Tabela VI - Resultados da anlise de PCR para as amostras ambientais

Marco

Torro

16S rRNA

Micr16S

mcyA

mcyB

mcyE

HEP

19-Set

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

1-Out

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

15-Out

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

29-Out

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Positivo

19-Set

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Positivo

Positivo

1-Out

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Positivo

Positivo

15-Out

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Positivo

Positivo

29-Out

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Em todas as amostras ambientais foi detectada a presena de cianobactrias e do

gnero Microcystis. Quanto aos genes envolvidos na produo das toxinas, foi sempre
detectado pelo menos um deles, com excepo da data de 29-Out no Torro, onde no
foi detectado nenhum deles. O gene mcyE foi o que mais vezes se detectou. Nas duas
primeiras datas de amostragem no Marco foram detectados os 4 genes, ou seja, mcyA,
mcyB, mcyE e o fragmento HEP. A figura 22 um exemplo de uma fotografia de um gel
de agarose, da amplificao do gene mcyA para as amostras ambientais.

Figura 22 Produto da amplificao do fragmento do gene mcyA para um volume de 20L. (1) Marco
19-Set; (2) Marco 1-Out; (3) Marco 15-Out; (4) Marco 29-Out; (5) Torro 19-Set; (6) Torro 1-Out; (7) Torro
15-Out; (8) Torro 29-Out; (+) Controlo positivo (estirpe M6); (B) Controlo negativo.

46

Resultados

2.4.2. Amostras ambientais para optimizao do volume

A anlise de PCR para optimizao dos volumes de amostragem foi realizada para o
Marco e o Torro nas datas de 19-Set e 1-Out. Os volumes iniciais amostrados variaram
entre 15mL e 1000mL e encontram-se descritos na tabela VII. Na mesma tabela
encontram-se os resultados da amplificao para os vrios genes.
Tabela VII - Resultados da anlise de PCR para optimizao do volume de amostragem das amostras
ambientais

Marco

19-Set

1-Out

Torro

19-Set

1-Out

16S rRNA

Micr16S

mcyA

mcyB

mcyE

HEP

15 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

50 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

250 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

500 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

250mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

500 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

1000 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

50 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Positivo

Positivo

250 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

500 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

1000 mL

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

250 mL

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

500 mL

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

1000 mL

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Os resultados da amplificao, nestas duas datas esto de acordo com os obtidos

para as amostras ambientais, com excepo do Torro a 1-10 para o gene mcyA e o
fragmento HEP. Para a amplificao do fragmento do gene mcyE, nas amostras do
Torro a 19-Set e 1-Out, e para o fragmento HEP (fig.23) para o mesmo local a 19-Set,
os resultados no foram sempre iguais. A variao do volume amostrado interferiu nos
resultados, sendo que a amplificao, ocorre sempre para o menor volume amostrado.

47

Resultados

Figura 23 - Produto da amplificao do gene HEP para um volume de 20L. (1-4) Marco 19-Set; (5-7)
Marco 1-Out; (8-11) Torro 19-Set; (12-14) Torro 1-Out; (1) 15mL; (2) 50mL; (3) 250mL; (4) 500mL; (5)
250mL; (6) 500mL; (7) 1000mL; (8) 50mL; (9) 250mL; (10) 500mL; (11) 1000mL; (12) 250mL; (13) 500mL;
(14) 1000mL; (+) Controlo positivo (estirpe M6); (B) Controlo negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen)
(fragmentos de 100bp a 12kb)

A figura 24 mostra a amplificao do fragmento do gene mcyA para optimizao do

volume de amostragem. Para alm da deteco, para os fragmentos dos genes mcyE e
para o fragmento HEP foi possivel observar mais resultados positivos para os menores
volumes. Na figura 24 possvel observar, para o gene mcyA, que o produto da
amplificao, quando positivo, parece ser maior para os menores volumes amostrados.
Esta constatao baseia-se apenas na intensidade da banda. A confirmao possvel
por PCR em tempo real, onde alm da deteco possvel a quantificao.

Figura 24 - Produto da amplificao do fragmento do gene mcyA para um volume de 20L. (1-4) Marco
19-Set; (5-7) Marco 1-Out; (8-11) Torro 19-Set; (12-14) Torro 1-Out; (1) 15mL; (2) 50mL; (3) 250mL; (4)
500mL; (5) 250mL; (6) 500mL; (7) 1000mL; (8) 50mL; (9) 250mL; (10) 500mL; (11) 1000mL; (12) 250mL; (13)
500mL; (14) 1000mL; (15) Controlo positivo (estirpe M6); (16) Controlo negativo. Marcador 1Kb plus
(Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb)

48

Resultados

2.4.3. Estirpes isoladas

Na tabela VIII esto apresentados os resultados de PCR para as estirpes isoladas.
Todas as estirpes classificadas como pertencentes ao gnero Microcystis tiveram
amplificao positiva para o fragmento do gene 16S rRNA especfico de Microcystis sp.
(micr16S). S estirpes da espcie M. aeruginosa (estirpes 5 a 13 e 15 a 22), tiveram
resultados positivos para os genes mcyA, mcyB e para o fragmento HEP, com
percentagens de 30%, 20% e 40%, respectivamente. A estirpe 15 (M. aeruginosa)
apenas apresentou amplificao para o fragmento HEP, para alm do 16S rRNA e do
fragmento do 16S rRNA especfico de Microcystis sp.. A amplificao do gene envolvido
na produo de microcistinas e nodularinas e a no amplificao de qualquer dos outros
genes envolvidos na produo de microcistinas pode indicar uma possvel produo de
nodularina.
As estirpes do gnero Limnothrix e da espcie M. wesenbergii no apresentaram
amplificao para nenhum dos genes envolvidos na biossntese da toxina pesquisados.
O gene mcyE foi amplificado em 50% das estirpes de M. aeruginosa e ainda para a
estirpe 1, A. flos-aquae. Duas das estirpes de M. aeruginosa (9 e 16) apresentaram
amplificao para todos os genes descritos na tabela VIII.
Para os pares de primers micr16S e mcyB, no foram realizadas reaces de PCR
para as estirpes que no tinham sido identificadas como pertencentes ao gnero
Microcystis, uma vez que estes primers so especficos para fragmentos dos genes
deste gnero.
Na figura 25, a ttulo de exemplo, possvel ver o produto da amplificao para o
gene mcyB.

49

Resultados
Tabela VIII - Resultados da anlise de PCR para as estirpes cultivadas

mcyA

mcyB

mcyE

Positivo

N.A.

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Limnothrix sp.

Marco 1/10

Positivo

N.A.

Negativo

N.A.

Negativo

Negativo

N.A.

Negativo

N.A.

Negativo

Negativo

Negativo

N.A.

Negativo

Negativo

HEP

Micr16S

Marco 29/10

da

A. flos-aquae

Espcie

Estirpe

16S rRNA

amostragem

Local e data

N.A.- No amplificado

Limnothrix sp.

Marco 15/10

Positivo

Limnothrix sp.

Marco 29/10

Positivo

N.A.

M. aeruginosa

Marco 19/9

Positivo

Positivo

Positivo

Negativo

Positivo

Positivo

M. aeruginosa

Marco 19/9

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

M. aeruginosa

Marco 1/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

M. aeruginosa

Marco 15/10

Positivo

M. aeruginosa

Marco 15/10

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

10

M. wesenbergii

Marco 19/9

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

11

M. wesenbergii

Marco 1/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

12

M. wesenbergii

Marco 15/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

13

M. wesenbergii

Marco 29/10

Positivo

14

Limnothrix sp.

Torro 1/10

Positivo

N.A.

Negativo

N.A.

Negativo

Negativo

15

M. aeruginosa

Torro 19/9

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

16

M. aeruginosa

Torro 15/10

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

Positivo

17

M. aeruginosa

Torro 15/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

18

M. aeruginosa

Torro 29/10

Positivo

19

M. aeruginosa

Torro 29/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Positivo

Negativo

Positivo

20

M. wesenbergii

Torro 19/9

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

21

M. wesenbergii

Torro 15/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

22

M. wesenbergii

Torro 29/10

Positivo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Figura 25 - Produto da amplificao para o fragmento do gene mcyB para as estirpes 1, 7, 11, 16 e 18;
(+) Controlo positivo; (B) controlo negativo. Marcador 1Kb plus (Invitrogen) (fragmentos de 100bp a 12kb)

50

Resultados

2.5.

Quantificao das toxinas por ELISA e HPLC

Tal como para o ensaio de PCR, o ensaio imunolgico de ELISA para quantificao
de microcistinas foi realizado para as amostras ambientais, assim como para as amostras
ambientais com vista a optimizao do volume de amostragem e para as estirpes
cultivadas. Todos os valores de toxina determinados abaixo de 0,1g/L de MicrocistinaLR (MC-LR) equivalentes foram considerados negativos, pois esto fora da recta padro
traada.
Para as amostras ambientais, os resultados de ELISA esto apresentados na figura
26. Os resultados esto expressos em g de MC-LR equivalentes/L. Este ensaio teve
como objectivo no s quantificar a toxina nas amostras naturais, mas tambm permitir
distinguir entre a quantidade de toxina liberta no meio (amostra ambiental: AA) e a
quantidade total de toxina, ou seja, endgena e exgena (amostra total: AT). Para
determinar a quantidade total da toxina, as clulas foram previamente submetidas a ultrasons e congeladas, para provocar a ruptura e assim libertar a toxina endgena. Com
excepo da amostra do Torro a 1-Out, em todas as outras no se detectou a toxina na
amostra ambiental. Nas duas ltimas datas, para os dois locais, no foi detectada a
toxina.
O maior valor de toxina determinado foi de 10,62 g/L de MC-LR equivalentes na data
de 1-Out para a amostra total do Marco.
O ensaio de ELISA para optimizao do volume de amostragem foi realizado nas
datas de 15-Out e de 29-Out para os dois locais, tendo-se amostrado volumes entre 50 e
1000mL para a primeira data e 15 e 50 mL para a segunda. Os valores de toxina
resultantes deste ensaio foram todos inferiores a 0,1g/L de MC-LR equivalentes,
considerando-se negativos.

51

Resultados

g/L MC-LR equivalentes

12
10
8
6
4
2
0

19Set

01Out

15Out

29Out

19Set

Marco

01Out

15Out

29Out

Torro

ELISA AT 0,35 10,62

0,19

1,53

ELISA AA

0,3

Figura 26 - Comparao dos resultados da anlise de ELISA para as amostras ambientais. Os valores
esto expressos em g MC-LR equivalentes por litro. ELISA AA corresponde ao ensaio de ELISA para a
quantidade de toxina existente no meio e ELISA AT a quantidade total da toxina (toxina no meio+toxina
endgena).

Os resultados do ensaio imunolgico de ELISA para as estirpes esto sumariados na

tabela IX. O ensaio foi realizado para todas as estirpes que apresentaram pelo menos a
amplificao de um dos genes envolvidos na produo da toxina, com excepo da
estirpe 5 devido inexistncia de biomassa suficiente para realizao do ensaio. Para
alm destas, o ensaio foi tambm realizado para as estirpes de M. aeruginosa 6 e 7, as
quais no apresentaram amplificao para nenhum dos genes envolvidos na biossntese
da toxina. As estirpes de M. aeruginosa que apresentaram amplificao para os genes
mcyA, mcyB, mcyE e para o fragmento HEP, estirpes 9 e 16, obtiveram valores de toxina
acima dos 1,1 g/L de MC-LR equivalentes. Nas estirpes sem amplificao por PCR de
nenhum destes 4 genes, como o caso das estirpes 6 e 7, no foi detectada a toxina.
Resultados semelhantes foram obtidos para as estirpes 15 e 19, que apresentaram
apenas amplificao para um dos genes envolvidos na produo da toxina,
respectivamente, para o fragmento HEP e mcyE. A estirpe 1, A. flos-aquae, apresentou
valores de toxina de MC-LR equivalente de 0,28g/L.
Tabela IX - Resultados da quantificao da toxina por anlise de ELISA das estirpes cultivadas em g de
MC-LR equivalentes/L

Estirpe
1
6
7
9
15
16
19

g MC-LR
equivalentes/L
0,28
0
0
1,14
0
1,16
0

52

Resultados
O ensaio enzimtico de ELISA, para as amostras ambientais e para a estirpe 1 foram
tambm realizados para deteco de cilindrospermopsina. Todos os resultados deste
ensaio foram negativos, havendo assim coerncia entre os resultados de PCR, em que
no se amplificou qualquer fragmento de genes envolvidos na biossntese desta toxina, e
os do ensaio de ELISA.

Por HPLC no foi possvel detectar a presena de MC-LR. Com base nos
cromatogramas da anlise de HPLC para o padro, foi possvel determinar que o tempo
de reteno para MC-LR foi de aproximadamente 120,1 minutos. Na figura 27 possvel
ver um dos cromatogramas obtidos pela anlise de HPLC. No mesmo tempo de reteno
do padro (aproximadamente aos 12 minutos) surgiram em todas as datas do Marco
picos mas com um espectro de absoro que no a 238nm. Este pico pode ser relativo a
um outro pptido que possa estar presente na amostra, com a mesma afinidade
(polaridade) que a MC-LR para a coluna. No espectro de HPLC, em algumas datas
surgem dois grandes picos (com tempo de reteno de aproximadamente de 20 min) mas
com um espectro de absoro a 268 nm, pelo que no podem ser relativas a outras
variantes de microcistinas. Algumas microcistinas so caracterizadas por possurem um
espectro a 220 nm, como as que possuem triptofano. Uma vez que os picos obtidos, em
qualquer dos tempos de reteno no so nem a 238nm, nem a 220nm, por HPLC no
foram detectadas microcistinas.

Pico com tempo de

reteno aos 12 min

Figura 27 - Cromatograma resultante da anlise de HPLC para a amostra ambiental do Marco a 19 de

Setembro.

53

Resultados

2.6.

Deteco das toxinas por MALDI-TOF MS

As amostras ambientais e as estirpes que apresentaram a presena de toxina por

ensaio imunolgico foram liofilizadas e enviadas para determinao das toxinas por
MALDI-TOF MS. Os resultados de MALDI-TOF MS encontram-se na tabela X.
Tabela X - Pptidos identificados atravs da anlise de MALDI-TOF MS

Amostras

Estirpes

Marco
Amostras
ambientais

Torro

Pptidos identificados
1

Microcistina ou cianopeptolina; microviridina

16

Microcistina-LR; aeruginosina

19-Set

1-Out

Microcistina-LR; aeruginosinamida; anabaenopeptina F;

anabaenopeptina A; microviridina

15-Out

29-Out

19-Set

1-Out

15-Out

29-Out

Os espectros de MALDI-TOF MS encontram-se no anexo III.

Para as amostras ambientais s foi detectada MC-LR no Marco a 1-Out (fig.28).
Nessa mesma data foram detectados outros pptidos. Devido existncia de
quantidades muito reduzidas de amostra ambiental, a quantidade de amostra enviada
para anlise de MALDI-TOF MS foi, por vezes, quase inexistente, podendo explicar o
facto de no terem sido detectados pptidos em mais nenhuma data.
A estirpe 1, apesar de por ELISA se ter detectado a toxina, no foi positivo para
microcistina por MALDI-TOF MS. Na estirpe 6 foi detectado um pico de microviridina e
um outro que tanto pode ser de microcistina, como de cianopeptolina. Na estirpe 16
detectou-se aeruginosina e MC-LR.

54

Resultados

MC-LR

Figura 28 - Resultado de um dos espectros de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco e 1Out, onde possivel ver a presena de MC-LR a 995,48 m/z.

2.7.

Anlise por PCR em Tempo Real

A anlise por PCR em tempo real (RT-qPCR) foi realizada para deteco e
quantificao dos fragmentos dos genes 16S rRNA, 16S rRNA especfico de Microcystis
spp., mcyA e mcyB. A quantificao foi feita tanto para as amostras ambientais, como
para as amostras ambientais com vista optimizao dos volumes amostrados. As
melting curves das reaces de RT-qPCR encontram-se no anexo IV.
A curva padro foi feita com base em 6 diluies do DNA da estirpe M6 de M.
aeruginosa, variando de 1,19x106 clulas por reaco (cls/reaco) at 1,19
cls/reaco.
O limite mnimo de deteco para os pares de primers Micr184F/431R e
mcyB2959F/3278R foi de 1,19 cls/reaco, e para os pares de primers Cya359F/781R
e para o mcyA-CD1F/1R foi de 1,19x101 cls/reaco. Para estes dois ltimos pares de
primers, para a concentrao de 1,19 cls/reaco o produto esperado no foi obtido e
formaram-se dmeros de primers.
Com base nos valores da quantidade inicial de DNA dos controlos e nos valores de Ct
(threshold cycle) destes foi possvel fazer, para cada reaco, uma regresso linear. Por
anlise dos melting peaks verificou-se a ausncia da formao de dmeros de primers
e que os picos dos produtos foram detectados aos 870,5C para o 16S rRNA e para o
fragmento do16S rRNA especfico de Microcystis sp. e 821C para o mcyA e 820,5C
para o mcyB.
55

Resultados
A curva padro foi construda, mantendo-se linear para os logaritmos das
concentraes padro. Os valores relativos s rectas padro encontram-se sumariados
na tabela XI.
Tabela XI - Eficincias e parmetros da curva padro da anlise de PCR em tempo real para as
amostras ambientais e amostras ambientais para optimizao do volume, para os fragmentos dos genes 16S
rRNA, 16S rRNA especfico de Microcystis sp. (m16S rRNA), mcyA e mcyB

Amostras
ambientais

Amostras
ambientais
para
optimizao
do volume

-3,691

Intercepo
com eixo do
y
37,634

0,997

88,3

-3,640

33,182

0,998

mcyA
mcyB
16S rRNA
16S rRNA

95,4
90,9
86,4

-3,436
-3,563
-3,697

31,126
33,149
37,663

0,999
0,999
0,997

(fragmento especfico para

Microcystis sp.)

83,4

-3,797

35,460

0,999

mcyA
mcyB

90,4
85,6

-3,575
-3,723

36,282
37,882

0,999
0,998

Gene alvo

Eficincia (%)

Inclinao
da recta

16S rRNA
16S rRNA

86,6

(fragmento especfico para

Microcystis sp.)

Todas as eficincias de reaco foram superiores a 85%, confirmando-se uma boa

performance.
Atravs da anlise de PCR em tempo real, foi possvel determinar o nmero de
cpias de cada gene por mililitro. Considerou-se que em cada genoma existe apenas
uma cpia do gene, pelo que cada cpia foi considerada como uma clula, designandose o valor final em clulas equivalentes/mL. A quantificao de clulas equivalentes por
mililitro de cianobactrias, Microcystis spp., mcyA e mcyB, para as amostras ambientais
encontram-se nas figuras 29 e 30, respectivamente para o Marco e para o Torro. A
quantificao de clulas equivalentes para mcyA e mcyB nem sempre foi possvel, devido
a uma grande quantidade de dmeros de primers que se formaram. Contudo, ainda que
no tendo sido possvel quantificar, foi possvel detectar a presena destes genes em
todas as amostras, com excepo da ltima data de amostragem (29-Out) no Torro.
De uma maneira geral, a quantidade de clulas vai diminuindo ao longo do tempo. A
quantidade de Microcystis sp. em relao ao total de cianobactrias tambm vai
diminuindo, atingindo valores de 1,5% e 0,5% para o Marco e Torro respectivamente.
Na data de 1-Out do Marco, a percentagem de Microcystis spp. em relao ao total de
cianobactrias bastante elevada, sendo quase de 50%.

56

Resultados

1,00E+06

1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
16S rRNA
1,00E-01
M16S rRNA

3,69E+05

7,30E+03

1,64E+03

1,94E+03

mcyA

7,30E+04
19-Set
9,35E+01

3,60E+03
01-Out
3,31E+02

7,68E+01
15-Out
2,86E-01

3,03E+01
29-Out
7,65E-01

mcyB

8,09E+01

3,05E+02

Figura 29 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL para as
amostras ambientais do Marco.

1,00E+04
1,00E+03
n de cpias do gene/mL

n de cpias do gene/mL

1,00E+05

1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
1,00E-01
16S rRNA
1,00E-02
m16S rRNA
mcyA

6,66E+02

1,10E+03

5,80E+02

4,71E+02

1,66E+00
19-Set
1,33E-01

1,77E+00
01-Out
2,93E-01

1,67E+00
15-Out
6,82E-02

1,92E-01
29-Out

Figura 30 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL para as
amostras ambientais do Torro.

57

Resultados

Para as amostras ambientais com vista optimizao do volume de amostragem,

verificou-se que os menores volumes amostrados foram os que tiveram maiores
quantidades de cpias dos genes (figs.31 e 32). Considerou-se que em cada genoma
existe apenas uma cpia do gene, pelo que cada cpia foi considerada como uma clula,
designando-se o valor final em clulas equivalentes/mL. Para o gene mcyB, para o
volume de 250mL a 19-Set e o maior volume de amostragem a 1-Out no foi possvel
quantificar o n de clulas equivalentes, com base no nmero de cpias do fragmento do
gene mcyB. A impossibilidade de quantificao tambm ocorreu para os genes mcyA e
mcyB nas amostras do Torro. Este facto deveu-se grande quantidade de dmeros de
primers que se formaram, no possibilitando a quantificao contudo, a deteco foi
sempre positiva.
Nas amostras do Marco, o nmero de cpias do gene referente ao fragmento do 16S
rRNA especfico de Microcystis sp. foi superior ao nmero de cpias do fragmento do 16S
rRNA de cianobactria.

1,00E+05

n de cpias do gene/mL

1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
1,00E-01
16S rRNA

8,76E+04
1000
15 ML 3,59E+04
50 ML 2,35E+03
250 ML 1,06E+04
500 ML 8,89E+03
250 ML 7,69E+03
500 ML 2,88E+02
ML
m16S rRNA 9,25E+04 5,61E+04 1,10E+04 1,98E+04 2,26E+04 1,80E+04 1,99E+03
19-92,79E-01 2,59E+01 1,19E+02 2,17E+02
1-10
mcyA
5,06E+02 2,13E+02
9,27E+00
mcyB

4,21E+02 3,69E+01

Marco 6,78E+01 1,41E+02

7,69E+00

Figura 31 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL para as
amostras ambientais com vista optimizao do volume de amostragem, do Marco.

58

Resultados

n de cpias do gene/mL

1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
1,00E-01
50 ML
16S rRNA

250
ML

500
ML

1000
ML

250
ML

500
ML

1000
ML

9,53E+02 1,67E+02
1,71E+01 5,52E+01 5,35E+01 5,39E+01
2,81E+01
19-9
1-10

m16S rRNA 1,28E+02 2,26E+00 6,63E-01 1,84E+00

Torro 1,96E+01 1,78E+00 1,58E+00

Figura 32 - Quantificao por PCR em tempo real do nmero de cpias de cada gene/mL para as
amostras ambientais com vista optimizao do volume de amostragem, do Torro

59

Discusso

3. Discusso

3.1.

Parmetros

fsico-qumicos,

ocorrncia,

cultura

identificao

(fenotpica e genotpica) de cianobactrias

Muitas espcies e estirpes de cianobactrias produzem compostos txicos podendo

causar problemas em guas recreativas ou em guas para consumo, levando a
intoxicaes humanas e de outros animais. A exposio a toxinas de cianobactrias pode
reflectir-se tanto a nvel de morbilidade, como de mortalidade.
A ingesto de gua contaminada a principal via de exposio a cianotoxinas,
seguindo-se o uso de lagos e rios para fins recreativos (Falconer e Humpage 2001).
A monitorizao de rotina de cianotoxinas deve ser feita preferencialmente em guas
para consumo humano. Prever onde e como as florescncias de cianobactrias ocorrem
difcil, se no mesmo impossvel. A enorme variabilidade na toxicidade de florescncias
entre diferentes anos, ou at mesmo num nico dia, torna complicado a previso de
potenciais riscos (Apeldoorn et al. 2007).

Apesar das dinmicas populacionais, a elevada variabilidade de concentraes de

microcistinas nos cursos de gua naturais tem sido atribuda a variaes das condies
naturais, as quais podem influenciar a taxa de produo da toxina (Funari e Testai 2008).
Contudo, o papel dos factores ambientais na produo da toxina ainda no
suficientemente conhecido. Alguns estudos mostram que variaes em parmetros como
a luz, a idade da cultura, temperatura, pH e nutrientes podem influenciar a produo de
microcistina (WHO 1999).
A temperatura da gua pode influenciar processos bioqumicos e fisiolgicos,
afectando a multiplicao do fitoplncton (Vale 2005). Esta variao est normalmente
associada temperatura do ambiente mas, por exemplo, descargas de efluentes
industriais podem igualmente provocar variaes significativas (Vale 2005).
A maioria das cianobactrias tem taxas de crescimento mximas a temperaturas
prximas dos 25C (WHO 1999; Oliva-Teles et al. 2008). Esta temperatura ptima
superior das algas verdes e das diatomceas, explicando assim a sua dominncia em
perodos mais quentes, como no vero (WHO 1999; Dokulil e Teubner 2000).
Na primeira amostragem, quando foram detectadas as florescncias, a temperatura
da gua rondava esta temperatura ptima. Acompanhando a diminuio da temperatura
ambiente, a temperatura da gua, ao longo das amostragens foi diminuindo, sendo que,

60

Discusso
esta diminuio foi acompanhada de uma diminuio da quantidade de cianobactrias
totais.
No trabalho realizado por Oliva-Teles e colaboradores (2008) na albufeira do Torro,
verificou-se a presena de florescncias nos meses mais quentes, constatando a
importncia da temperatura no desenvolvimento destes organismos.
Segundo Prakash e colaboradores (2009), a variante de microcistina predominante
est relacionada com as temperaturas onde ocorre. Assim, microcistina-LR
predominante em pases temperados, ao passo que microcistina-RR predominante em
pases mais quentes. Contudo, a MC-LR costuma aparecer sempre em concentraes
considerveis.
O oxignio dissolvido essencial nos processos de degradao da matria orgnica
e na manuteno das comunidades aerbias (Vale 2005). Naturalmente, o O2 dissolvido
varia de acordo com a temperatura da gua e a presso atmosfrica. Contudo, o
aumento de matria orgnica, como a resultante de descargas de efluentes urbanos, ou o
aparecimento de florescncias pode levar a uma diminuio deste (Vale 2005). Segundo
Vale (2005), valores superficiais de saturao de oxignio inferiores a 40% so
considerados indicativos de eutrofizao.
No presente trabalho, de 15-Out para 29-Out observou-se um grande aumento da
saturao de O2 (de 74% para 102% no Marco e de 66% para 89% no Torro), a qual foi
acompanhada de uma diminuio de cianobactrias.
O pH, naturalmente, varia de acordo com a natureza da gua, do solo e da vegetao
marginal (Vale 2005). O solo da regio em estudo essencialmente grantico (Martins
2007), contribuindo para a tendncia de um pH cido na gua. Contudo, os valores de pH
registados permitem classificar a gua como neutra a ligeiramente alcalina. Estes valores
so semelhantes aos registados por Vale (2005). Entre os dois locais amostrados no se
registaram diferenas apreciveis.
Valores de pH mais elevados (entre 7,5 a 9) so comuns durante perodos de
dominncia de cianobactrias, especialmente durante florescncias (Martins 2007).
Segundo Bobbin e Recknagem (2001), as florescncias de M. aeruginosa ocorrem em pH
alcalinos (pH>8,15). Os maiores valores de pH registados no presente trabalho,
correspondem primeira data de amostragem (19-Set), quando ocorriam florescncias
de Microcystis. Isto ocorre porque grandes densidades de cianobactrias levam a uma
diminuio do dixido de carbono na gua, aumentando o pH (Vale 2005). Segundo
Dokulil e Teubner (2000), o pH elevado no est directamente associado a um aumento
da proliferao de cianobactrias contudo, poder interferir na manuteno da
florescncia. Resultados semelhantes foram obtidos por Jaehnichen e colaboradores
(2001), que observaram que a produo de microcistinas por M. aeruginosa s ocorria na
61

Discusso
fase de crescimento exponencial e a pHs superiores a 8,4. Os referidos autores tambm
observaram que a produo da toxina se devia falta de carbono dissolvido na gua e
no directamente ao aumento de pH.
O facto de as cianobactrias se desenvolverem melhor em pHs elevados (pH>8,5),
confere-lhes vantagem perante os outros grupos, estando este facto relacionado com o
aparecimento de florescncias em guas eutrofizadas, no final do vero (Oliva-Teles et
al. 2008).
A condutividade mede a capacidade de uma amostra de gua conduzir a corrente
elctrica, sendo dependente da concentrao de ies e da temperatura da gua (Vale
2005). Em guas doces, a 25C, segundo Vale (2005), pode variar entre 30 e 2000
S/cm. A condutividade pode afectar a fixao de azoto pelas cianobactrias. Em solos
granticos, como o caso, apresenta geralmente valores baixos (Vale 2005).
No presente trabalho, no Marco, no houve grandes variaes da condutividade,
seguindo uma tendncia de ligeiro aumento ao longo das datas, no ultrapassando os
120 S/cm. No Torro, a condutividade sofreu alteraes, variando entre 135 e 163
S/cm em 1-Out e 15-Out, respectivamente. A condutividade no Torro foi sempre
superior determinada no Marco. Vale (2005) verificou um aumento da condutividade no
Marco entre Junho e Outubro de 2004, chegando a atingir valores de 151 S/cm. Os
aumentos

bruscos

da

condutividade

podem

ter

impacto

nas

comunidades

fitoplanctnicas, uma vez que originam fenmenos de difuso atravs da parede celular,
podendo provocar a lise das clulas (Vale 2005). No Marco, acompanhando o aumento
da condutividade, Vale (2005) observou uma queda da densidade de fitoplncton.
Segundo Jaehnichen e colaboradores (2001), os factores abiticos apenas
influenciam indirectamente a produo de toxina por M. aeruginosa. A produo
controlada pela fase de crescimento, a composio de espcies e a existncia de
carbono inorgnico dissolvido (Jaehnichen et al. 2001).
O desenvolvimento de florescncias de Microcystis e a produo da toxina devem-se
soma de vrios factores (Rinta-Kanto et al. 2009).

As cianobactrias tm caractersticas particulares, determinantes da sua importncia,

sucesso e predominncia em comunidades fitoplanctnicas (Mankiewicz et al. 2003).
Contudo, diferentes taxa de cianobactrias podem ter comportamentos diferentes
(Mankiewicz et al. 2003). As florescncias surgem normalmente durante perodos
primaveris ou em finais de vero, como o caso de espcies como a Microcystis
aeruginosa e Aphanizomenon flos-aquae (Mankiewicz et al. 2003).

62

Discusso
Martins (2007), num estudo realizado na Albufeira do Torro, no rio Tmega,
demonstrou que a comunidade fitoplanctnica, nomeadamente no que se refere a
cianobactrias tem vindo a aumentar, como consequncia da eutrofizao.
Em Portugal, estudos demonstram que 50% das estirpes de M. aeruginosa isoladas
produzem microcistinas (Saker et al. 2005a), pelo que esta cianobactria bastante
importante em termos de qualidade da gua, principalmente quando os cursos da gua
em que surgem so utilizados para captao de gua para consumo ou para fins
recreativos (Vasconcelos et al. 1995; Vasconcelos et al. 1996; Vasconcelos 2001), como
o caso da albufeira do Torro.
Dados anteriores (Pereira 1998; Vale 2005; Martins 2007) referem ser comum a
sucesso de A. flos-aquae - M. aeruginosa no Marco, tal como foi observado neste
trabalho.
Segundo Martins (2007), a comunidade fitoplanctnica do Marco, no vero e no incio
do outono dominada por cianobactrias (mais de 90% da densidade total do
fitoplncton). A mesma autora refere que nestes meses a albufeira se encontrava
hipereutrofizada.
O ciclo de sucesso A. flos-aquae e M. aeruginosa tambm foi observado por Martins
(2007), sendo que M. aeruginosa foi dominante nos meses mais quentes. Martins (2007)
e Vale (2005) justificam esta sucesso atravs das concentraes de azoto e fsforo. As
referidas autoras apontam para que estes dois compostos sejam os responsveis pelo
aparecimento das cianobactrias e pela proliferao de espcies fixadoras de azoto
versus as no fixadoras, dependendo do factor limitante.

O exame microscpico de uma florescncia muito til. A informao obtida relativa

s espcies detectadas pode indicar logo uma possvel existncia de toxinas. Esta
informao pode determinar o tipo de ensaio que se deve realizar em seguida para
determinar o nvel de toxinas.
A maioria das cianobactrias pode ser distinguida do restante fitoplncton
microscopicamente, atravs das suas caractersticas morfolgicas. A taxonomia das
cianobactrias, seguindo o cdigo de nomenclatura botnica, permite uma diferenciao
em gnero e espcie. Contudo, esta diferenciao alvo de alguma incerteza e,
organismos classificados como pertencendo mesma espcie podem possuir diferenas
genticas substanciais. Os conhecimentos existentes sobre a regulao da produo das
toxinas indicam que a distino em gnero muito importante para determinar o
potencial txico, mas que, por exemplo, a produo de microcistina varia mais a nvel de
gentipos ou estirpes, do que a nvel de espcies (WHO 1999). Segundo Rinta-Kanto e

63

Discusso
colaboradores (2009), numa populao natural de Microcystis, coexistem vrias estirpes,
fenotipicamente idnticas, txicas e no txicas genotipicamente.
A dominncia de Microcystis observada neste trabalho, nas primeiras datas de
amostragem, e a sua persistncia nas restantes datas, inferiu para a possibilidade de
estar a ser produzida microcistina, sendo que, possivelmente esta seria a principal toxina
produzida.
As colnias de M. wesenbergii, morfologicamente, distinguem-se das de M.
aeruginosa pela presena de uma bainha visvel (Komarek e Anagnostidis 1998). Tal
como no presente trabalho, Otsuka e colaboradores (2000) identificaram vrios
morfotipos de M. wesenbergii em cultura. Segundo o referido autor, as espcies de
Microcystis alteram as formas das colnias quando em ambiente natural ou em cultura,
podendo, em cultura, observar-se colnias diferentes, no descritas em meios naturais.
Segundo Via-Ordorika e colaboradores (2004) as variaes morfolgicas identificadas em
cultura so o resultado das condies no naturais a que so expostas.
Os problemas na aplicao de critrios morfolgicos na classificao de
cianobactrias advm das variaes que podem ocorrer em resposta s alteraes do
ambiente (Otsuka et al. 2000). A actual classificao morfolgica de Microcystis no
suportada pela actual anlise filogentica baseada na sequncia do gene 16S rRNA
(Otsuka et al. 2000).
Os dados genticos podem, por vezes, estar de acordo com a classificao baseada
em caractersticas morfolgicas contudo, estas diferenas parecem no ser vlidas para
a classificao a nvel da espcie. Segundo Otsuka e colaboradores (1998), atravs da
sequncia do 16S rRNA de vrias estirpes de diferentes espcies de Microcystis, no
detectaram diferenas, sendo que em muitos casos, a percentagem de similaridade era
de 100% entre diferentes morfoespcies. Os resultados obtidos pelos referidos autores
demonstraram que diferentes fentipos de Microcystis no reflectem necessariamente a
sua filogenia, sendo necessria a reconstruo da taxonomia a nvel da espcie (Otsuka
et al. 1998). Assim, a classificao morfolgica do gnero Microcystis deve ser revista,
com a percepo de que uma mesma estirpe pode ter variadas formas de colnias e que
muitas das variaes morfolgicas devem ser assumidas como variaes fenotpicas ou
intraespecficas.
As caractersticas morfolgicas podem providenciar informaes importantes
referentes a organismos de interesse; contudo, necessrio ter em ateno de que os
organismos no podem ser somente classificados com base nas caractersticas
morfolgicas. A taxonomia botnica de Microcystis apresenta assim algumas limitaes,
sendo que, a taxonomia bacteriolgica poder ser importante para resolver esta situao.

64

Discusso
Percentagens de similaridade superiores a 70% so suficientes para classificar esses
organismos como pertencentes mesma espcie (Otsuka et al. 2001). Otsuka e
colaboradores (2001) e Kondo e colaboradores (2000) referem que as morfoespcies M.
aeruginosa, M. wesenbergii, M. ichthyoblabe, M. novacekii e M. viridis, uma vez que a
percentagem de similaridade referente ao 16S rRNA sempre superior a 70%, devem
ser todas consideradas como uma s espcie, de acordo com o Cdigo de Nomenclatura
Bacteriolgico.
No presente trabalho, por anlise do 16S rRNA, das 16 estirpes classificadas como
pertencendo ao gnero Microcystis, no foi possvel discernir entre M. aeruginosa e M.
wesenbergii, chegando, por exemplo, a estirpe 12 a ter 100% de similaridade com
estirpes das duas espcies (tabela IV). Estes resultados de similaridade baseiam-se em
sequncias de genes colocados por qualquer autor na base de dados do Blast (NCBI),
tendo-se partido do pressuposto de que as espcies tinham sido classificadas
correctamente pelos respectivos autores, antes de terem sido inseridas as informaes
na base de dados. Mas, uma vez que no houve acesso s estirpes, no podemos ter a
certeza sobre a correcta classificao, podendo uma estirpe, classificada na base de
dados como M. wesenbergii, ser na realidade M. aeruginosa, ou vice-versa. Assim, a
distino entre M. aeruginosa e M. wesenbergii, no presente trabalho, baseou-se nas
caractersticas morfolgicas (presena ou ausncia de bainha visvel), tendo servido a
anlise genotpica para a confirmao do gnero. Com base na anlise morfo e
genotpica, M. aeruginosa e M. wesenbergii foram consideradas como diferentes
morfoespcies, e no diferentes espcies.
Para alm das estirpes de Microcystis, foram tambm detectadas por anlise
genotpica do 16S rRNA, A. flos-aquae e Limnothrix sp. A sequenciao de mais estirpes
de A. flos-aquae no foi possvel devido dificuldade de isolamento e cultura destes
organismos. A A. flos-aquae est descrita como produtora de cilindrospermopsina,
saxitoxina (WHO 1999), anatoxina-a (Carmichael 1992) e PSP (paralitic shellfish
poisoning) (Vasconcelos 1999). A produo de PSP por A. flos-aquae j foi detectada no
rio Douro (Vasconcelos 1999). Assim, uma vez que esta espcie tem elevada ocorrncia
na albufeira do Torro, ser importante, em trabalhos futuros, verificar a presena de
outro tipo de toxinas neste local, como as saxitoxina, anatoxina-a e PSP.
O gnero Limnothrix, com base na pesquisa bibliogrfica efectuada, at data no
tinha sido detectada na albufeira, nem se encontra descrita como produtora de toxinas.
Espcies pertencentes a este gnero j foram reportadas como dominantes em rios
eutrofizados (Gkelis et al. 2005).

65

Discusso

3.2.

Amostras ambientais

Em albufeiras utilizadas para captao de guas para consumo e para fins

recreativos, como o caso da albufeira do Torro, tm sido reportados o aparecimento
de florescncias txicas de cianobactrias (Vasconcelos et al. 1996; Saker et al. 2005a).
A aplicao de tcnicas de biologia molecular na deteco de cianobactrias
txignicas tem como vantagem a capacidade de identificar constituintes microbianos
dentro de populaes naturais complexas, baseando-se unicamente em sequncias de
cidos nucleicos, permitindo identificar espcies potencialmente produtoras de toxinas. A
rapidez, baixos custos e sensibilidade destes mtodos torna-os ideais para estudos de
fisiologia microbiana e ecologia (Pearson e Neilan 2008). Alm destas vantagens, permite
a anlise das amostras sem a necessidade do cultivo dos organismos (Ouellette e
Wilhelm 2003).
A tcnica de PCR baseia-se no uso de primers (iniciadores) complementares de
pores de DNA de interesse, sendo a replicao feita por uma DNA polimerase
termoestvel. O resultado a amplificao exponencial de um fragmento gentico de
interesse.
Por PCR foi detectada a presena de cianobactrias (fragmento do 16S rRNA
especfico de cianobactrias), Microcystis spp. (fragmento do 16S rRNA especfico de
Microcystis spp.) em todas as datas, e de genes envolvidos na produo de microcistina
(mcyA, mcyB e mcyE) e na produo de microcistina/nodularina (fragmento HEP) para
algumas datas.
A capacidade de identificar espcies toxignicas, como em M. aeruginosa, baseada
na anlise de sequncias de genes como o da microcistina sintetase, tem sido abordada
em vrios estudos. Jungblut e Neilan (2006) sugerem uma evoluo convergente das
vrias espcies de cianobactrias e das microcistinas sintetases, indicando que estes
genes em espcies produtoras de microcistinas tm uma elevada relao filogentica
(Saker et al. 2005b). O gnero Microcystis um dos vrios que se conhece como
produtores de microcistinas. O uso das tcnicas moleculares deste trabalho alm de
permitir identificar estirpes de Microcystis potemcialmente produtoras de microcistina, por
amplificao com o primer para o fragmento do gene mcyB, permitiu igualmente
detectar a presena de outros gneros de cianobactrias produtoras de microcistinas,
incluindo Anabaena, Planktothrix, Nostoc, entre outros, atravs da amplificao com o
primer para o fragmento do gene mcyA.
Segundo Ouahid e colaboradores (2005) a realizao de uma anlise de PCR com o
maior nmero possvel de primers para diversos genes mcy, permite um melhor critrio
para inferir sobre o potencial txico da amostra ou estirpe em estudo. Contudo, no
66

Discusso
suficiente para garantir que esteja a ocorrer a produo da toxina. Kurmayer e
colaboradores (2004), num estudo feito com Planktothrix rubescens e P. agardhii,
detectaram a presena de todo o cluster mcy, sem que tenha havido a produo de
toxina. Apesar desta limitao, estes mtodos podem ser bastante teis para alerta da
possvel existncia de toxinas em guas, de modo rpido e simples. No presente
trabalho, foram amplificadas sequncias relativas a 4 fragmentos dos genes da
microcistina sintetase, com este objectivo. Para alm do mcyA e do mcyB, tambm foi
escolhido amplificar um fragmento do gene mcyE, que codifica uma regio para a cadeia
ADDA. O fragmento HEP, tambm amplificado no presente trabalho, amplifica uma
regio que codifica a enzima aminotrasferase do gene mcyE de microcistinas, assim
como uma regio da nodularina sintetase do gene ndaF.
No presente trabalho, as tcnicas moleculares (PCR e RT-qPCR) mostraram ser teis
na deteco de organismos e genes envolvidos na biossntese de microcistina para a
determinao do potencial txico de estirpes isoladas. Tcnicas semelhantes tm sido
usadas na identificao de estirpes de cianobactrias produtoras de toxinas em amostras
fitoplanctnicas (Baker et al. 2002; Foulds et al. 2002; Bittencourt-Oliveira 2003;
Fergusson e Saint 2003; Hisbergues et al. 2003; Kurmayer e Kutzenberger 2003; ViaOrdorika et al. 2004; Rinta-Kanto et al. 2005; Saker et al. 2005a; Valrio et al. 2005; Anjos
et al. 2006; Boaru et al. 2006; Furukawa et al. 2006; Preuel et al. 2006; Rantala et al.
2006; Gobler et al. 2007; Izaguirre et al. 2007; Mitsuhiro Yoshida et al. 2007; Saker et al.
2007a; Yoshida et al. 2007; Hotto et al. 2008; Xu et al. 2008; Rinta-Kanto et al. 2009).
Comparando os resultados obtidos por PCR convencional e RT-qPCR, para os genes
mcyA e mcyB, a segunda tcnica mostrou ser mais sensvel, uma vez que, embora nem
sempre quantificvel, foi possvel determinar a presena dos genes num maior nmero
de datas. A amplificao para o gene mcyA para todas as datas e locais foi de 62,5% por
PCR convencional e de 100% por RT-qPCR. Para o gene mcyB foi de 25% e 87,5%
respectivamente. A tcina de RT-qPCR tem ainda como vantagem permitir a
quantificao.
A tcnica de RT-qPCR tem sido aplicada com sucesso na quantificao de gentipos
produtores de microcistinas em populaes naturais (Kurmayer e Kutzenberger 2003;
Rinta-Kanto et al. 2005; Yoshida et al. 2007; Rinta-Kanto et al. 2009), permitindo
quantificar os nveis de DNA alvo inicialmente presentes na amostra, calculada pela taxa
de amplices que se vo acumulando, por gerao de um sinal fluorescente durante o
processo de amplificao. Para tal, determinado um threshold cycle (Ct), o nmero de
ciclos de PCR ao fim do qual a fluorescncia ultrapassa um determinado limiar, podendo
ser usado para determinar a quantidade inicial de DNA na amostra, com base numa
curva padro (construda a partir de amostras de concentrao conhecida) (Foulds et al.
67

Discusso
2002; Kurmayer e Kutzenberger 2003). Os valores de Ct providenciam uma informao
quantitativa que relaciona directamente o nmero de cpias dos cidos nucleicos por
amostra (Foulds et al. 2002).
No Marco, por RT-qPCR, o nmero de cianobactrias e Microcystis diminuiu bastante
ao longo das datas. No Torro, os valores de clulas eram bem menores mas, mais
constantes ao longo do tempo. A quantificao de cianobactrias potencialmente txicas
importante uma vez que estes organismos apenas se tornam problemticos quando
ocorrem em concentraes de milhares de clulas por mililitro (Rasmussen et al. 2008b).
Segundo a Organizao Mundial de Sade (WHO 2003) valores de 20000 cls/mL de
cianobactrias em guas recreativas, acarreta um risco baixo com efeitos adversos a
curto prazo, como irritaes drmicas ou doenas gastrointestinais. Um risco moderado,
com efeitos adversos a curto prazo, e a possibilidade de efeitos adversos a longo prazo
(dependendo das espcies presentes), observa-se para valores de cianobactrias
superiores a 100000 cls/mL. A possibilidade de intoxicaes agudas e efeitos adversos
a longo prazo, representam graus de risco elevados, em locais onde haja a formao de
espuma e haja risco de contacto directo, inalao ou ingesto da gua. A concentrao
de cianobactrias determinadas por RT-qPCR a 19-Set no Marco foi mais de trs vezes
superior s 100000 cls/mL, verificando-se ainda a formao de espuma.
O nmero de cianobactrias potencialmente produtoras de microcistinas (mcyA)
atingiu um mximo, em ambos os locais a 1-Out, apesar de nesta data os valores de
cianobactrias e Microcystis serem menores. Espcies de Microcystis potencialmente
produtoras de microcistinas foram determinados atravs de amplificao do gene mcyB,
cujo primer utilizado amplifica uma regio do 16S rRNA especfica desta espcie. Os
valores para mcyB s permitiram a quantificao no Marco e nas duas primeiras datas de
amostragem. Um aumento da primeira para a segunda data de amostragem foi evidente,
sendo claramente similar ao aumento de mcyA. Por comparao das quantidades de
clulas de Microcystis e de gentipos de Microcystis produtores de microcistinas (mcyB),
verifica-se a coexistncia de gentipos produtores e no produtores da toxina. RintaKanto e colaboradores (2009), num estudo realizado num lago da Amrica do Norte,
verificaram que a proporo de gentipos de Microcystis produtores/no produtores de
microcistinas no excedia os 8%. Kurmayer e colaboradores (2003) em lagos da
Alemanha detectaram variaes na proporo entre 1,7% e 71% e Yoshida e
colaboradores (2007) num lago do Japo determinaram valores de gentipos txicos em
relao ao total de Microcystis de 0,5% a 35%. No presente trabalho os valores mximos
determinados de gentipos produtores em relao a no produtores, em Microcystis foi
de 9,25%. A proporo de gentipos produtores de microcistinas em cianobactrias,

68

Discusso
relativamente quantidade total de cianobactrias variou entre 0,01% e 4,53% no Torro
a 15-Out e no Marco a 1-Out, respectivamente.
No Marco, a abundncia de Microcystis aumentou da primeira para a segunda data
de amostragem. Apesar da diminuio do nmero total de cianobactrias, a percentagem
de Microcystis foi quase de 50%. Nas ltimas datas, a abundncia relativa deste gnero
diminui bastante. A percentagem de cianobactrias potencialmente produtoras de
microcistinas e de Microcystis potencialmente txicas aumentou da primeira para a
segunda data, representando quase 10% da populao total de Microcystis. Na ltima
data de amostragem ocorre um ligeiro aumento da abundncia relativa de cianobactrias
produtoras de microcistina, a qual no acompanhada por um aumento da percentagem
de Microcystis ou de Microcystis potencialmente txicas, sugerindo o aparecimento de
outras espcies txicas. No Torro, a abundncia de Microcystis foi menos varivel,
revelando que esta espcie representa apenas uma pequena percentagem do nmero
total de cianobactrias. Neste local, na segunda data de amostragem houve um ligeiro
aumento da quantidade de cianobactrias potencialmente produtoras de toxinas. O
nmero de Microcystis potencialmente txicas no pde ser determinado em nenhuma
das datas, possivelmente devido s reduzidas quantidades de Microcystis.
Os resultados demonstram a existncia de uma grande quantidade de cianobactrias
no Marco, o qual, juntamente com a quantidade de Microcystis spp. foram diminuindo
bastante desde o final do vero at meados do outono de 2008. A variao da
percentagem relativa de cianobactrias potencialmente produtoras de microcistinas
acompanhou a variao da abundncia relativa de Microcystis e de Microcystis
potencialmente produtoras de microcistinas.
Por mtodos moleculares, foi possvel verificar que diferentes locais da mesma
albufeira demonstraram ter diferentes padres de variao da abundncia de
cianobactrias e de Microcystis ao longo do tempo. Este facto pode ser explicado pela
capacidade que as cianobactrias possuem em alterar a sua concentrao e posio nos
cursos de gua em perodos de tempo muito reduzidos, tendo j sido observados
resultados semelhantes por outros autores (Moreno et al. 2003; 2004).
Os resultados obtidos para as amostras ambientais por RT-qPCR apontam para que
esta tcnica possa ser usada para inferir sobre o potencial toxignico de uma amostra
natural. Contudo, estes resultados no reflectem directamente as concentraes de
microcistina pois, a produo da toxina varia com o estado fisiolgico das clulas e as
condies ambientais (Furukawa et al. 2006).
Por anlise do contedo txico das amostras, por ELISA, foi possvel observar uma
variao temporal e espacial. O local de amostragem do Marco apresentou maior
concentrao de microcistina em relao ao Torro, sendo que, para os dois locais, nas
69

Discusso
ltimas datas, a quantidade de toxina foi diminuindo. Estas alteraes podem estar
relacionadas com as caractersticas dos locais em estudo e das variantes ambientais ou
dever-se ao facto de as concentraes destes organismos estarem a diminuir. Os
maiores valores de toxina ocorreram no Marco a 1-Out. Para o Torro, foram igualmente
determinados os maiores valores de MC-LR equivalente/mL na mesma data, ainda que
estes valores sejam bem menores que no Marco. A 1-Out foram determinadas as
maiores concentraes de cls equivalentes/mL com os genes mcyA e mcyB por RTqPCR, mostrando a existncia de uma boa relao entre os dois mtodos. Por PCR
convencional, nas duas primeiras datas no Marco, foram detectados todos os genes
pesquisados envolvidos na produo da toxina. No Torro, nas referidas datas, o mcyB
foi detectado mas apenas por RT-qPCR. Assim, confirma-se igualmente a necessidade e
a importncia de se pesquisar vrios genes do cluster mcy para inferir sobre a possvel
presena da toxina. Nas restantes datas do Marco e a 15-Out no Torro, foram
detectados os genes mcyA, mcyB e mcyE sem que se tenha detectado a toxina,
confirmando que a toxina no sempre produzida quando ocorrem os genes. A 29-Out
no Torro o gene mcyB no foi detectado, assim como a toxina. Outros estudos tm
igualmente detectado uma relao entre os mtodos moleculares e a quantificao da
toxina. Boaru (2006) encontrou uma relao entre a presena dos genes mcyA e mcyB
(analisado por PCR) e a presena de toxina (determinada por ELISA) em amostras
ambientais de rios da Romnia. Em lagos na Finlndia, Vaitomaa e colaboradores (2003)
detectaram uma relao, na maioria dos casos entre o nmero de cpias do gene mcyE
(determinado dor RT-qPCR) e o contedo de microcistinas.
O contedo de microcistinas no pode ser relacionado com a biomassa de gneros
de cianobactrias potencialmente produtores de toxinas (Dittmann e Brner 2005). Dois
factores podem contribuir para as flutuaes no contedo de microcistinas em amostras
naturais, a curto e longo prazo. Em primeiro, factores ambientais podem ter impacto nas
taxas de produo de microcistina celular e, em segundo, as variaes nas
concentraes de microcistinas detectados podem ser o resultado de alteraes nas
dinmicas populacionais que levam a variaes na proporo de gentipos txicos dentro
das populaes de cianobactrias (Dittmann e Brner 2005).
Quesada e colaboradores (2004) realizaram um estudo sobre a ocorrncia de
cianobactrias

em

Espanha,

verificando

aparecimento

de

cianobactrias

potencialmente txicas por todo o pas, sendo que estes organismos dominam as
comunidades fitoplnctonicas em pelo menos uma poca do ano. Dados bibliogrficos
descritos neste trabalho, relativos Europa, demonstram que cerca de 70% das
amostras potencialmente txicas, so txicas (Quesada et al. 2004).

70

Discusso
As microcistinas encontram-se maioritariamente no interior das clulas, sendo
libertadas aquando da morte celular. Assim, no momento de ocorrncia de uma
florescncia de cianobactrias a toxina estar presente tanto na gua (toxina extracelular,
livre ou dissolvida) e nas clulas das cianobactrias (intracelular) (Apeldoorn et al. 2007).
No presente trabalho foram determinados estes dois valores de microcistina por cada
data. Em quase todas as datas amostradas, a quantidade de toxina livre foi abaixo do
limite de deteco deste mtodo, pelo que se considera que a toxina se encontrava
quase a 100% no interior das clulas. A nica excepo foi na data de 1-Out, no Torro,
em que 16% da toxina j se encontrava dispersa no meio. Estes valores apontam para
que as cianobactrias estivessem a entrar num estado de senescncia, havendo
libertao da toxina para o ambiente. Por RT-qPCR verificou-se que de 1-Out para 15Out, no Torro, ocorre uma diminuio da quantidade total das cianobactrias. A quase
inexistncia de toxina dispersa no meio na albufeira do Torro tem sido observada
noutros trabalhos. Nas amostragens realizadas entre Setembro e Outubro, Vale (2005)
no detectou toxina dispersa no meio, sendo que os valores que detectou correspondiam
sempre a toxina no interior das clulas. Pereira (1998) no detectou microcistina dispersa
na gua contudo, nas clulas os valores mximos detectados foram de 0,95 g/L.
A quantidade de toxina determinada a 1-Out no Marco foi bastante elevada (10,62
g/L). Vale (2005) determinou valores mximos de toxina total entre os meses de Junho e
Agosto na albufeira do Torro. Entre Setembro e Outubro, a referida autora apenas
verificou valores de 0,2 g/L. Martins (2007) detectou valores de concentrao de
microcistinas totais de 1,4 a 142,5 g MC-LR/L.
Os valores detectados neste trabalho e os observados na bibliografia apontam para
um agravamento da situao, uma vez que a toxina parece estar a persistir por um maior
nmero de meses, no se restringindo apenas aos meses de vero. Vasconcelos (1994)
e Oudra e colaboradores (2001) j tinham observado, em cursos de gua naturais de
Portugal e Marrocos, respectivamente, que a ocorrncia de cianobactria e toxinas no
era confinado aos meses de vero.
O valor limite de microcistinas-LR na legislao Portuguesa, para guas para
consumo, de 1g/L. O NHMRC (National Health and Medical Research Council),
pertencente ao governo australiano (NHMRC, 2008) prope um valor guia de um mxino
de 10g/L de microcistinas totais em guas recreativas. A derivao deste valor teve por
base os valores guia de concentrao de cianobactrias em guas recreativas da
Organizao Mundial de Sade (WHO, 2003). As concentraes detectadas por ELISA
no presente trabalho foram, no Marco a 1-Out, cerca de 10 vezes superior aos legislados
e semelhantes aos referidos pela OMS para guas recreativas.

71

Discusso
Os nveis de microcistina observados podem ter relevncia ecolgica para o rio
Tmega, at porque vrios estudos tm provado que quantidades de microcistina
dissolvida de apenas 1 g/L so suficientes para reduzir o crescimento de espcies
heterotrficas e afectar negativamente a actividade microbiana, alterando a viabilidade
alimentar de protozorios e metazorios, ainda que temporariamente (Moreno et al.
2003). Assim, as consequncias ecolgicas das toxinas das cianobactrias so a
diminuio do crescimento de organismos bacterianos, reduo do potencial crescimento
do zooplncton, incapacidade de espcies mais sensveis se desenvolverem e
acumulao de toxinas ao longo da cadeia trfica (Moreno et al. 2003).
A quantificao de toxinas por ELISA simples e rpida de executar, providenciando
uma estimativa da quantidade de microcistinas com um processamento mnimo de
amostra. Nem todas as toxinas tm a mesma afinidade para os anticorpos assim, a
quantificao por ELISA est dependente da capacidade dos anticorpos reconhecerem
as variantes de microcistina presentes na amostra (McElhiney e Lawton 2005). Os testes
comerciais de ELISA tm demonstrado a ocorrncia de reaces cruzadas, sendo
apenas capazes de determinar a toxina em termos de MC-LR equivalentes, podendo, por
vezes, a quantidade de toxina ser subestimada para algumas variantes (An e Carmichael
1994).
O teste de ELISA mede a concentrao total de toxina numa dada amostra.
Recorrendo a HPLC-DAD possvel discernir entre diferentes isoformas de microcistinas
com base no seu tempo de reteno e nas caractersticas do espectro de absoro UV
(Rapala et al. 2002; Apeldoorn et al. 2007). O comprimento de absoro UV a 238 nm,
caracterstico das microcistinas e nodularinas deve-se ao aminocido ADDA, permitindo a
anlise das toxinas por HPLC (Msagati et al. 2006; Sangolkar et al. 2006). A maioria das
microcistinas tm um mximo de absorvncia a 238 nm, mas algumas variantes com
aminocidos aromticos, como a microcistina-LW, que possui triptofano, tm um mximo
de absorvncia a 222 nm (Msagati et al. 2006; Sangolkar et al. 2006).
No presente trabalho, por HPLC no foi possvel detectar ou quantificar as
microcistinas. Esta ausncia, quando comparada com o ensaio de ELISA, pode-se dever
ao facto de os limites de deteco de microcistinas por HPLC serem relativamente
elevados (1000 vezes superiores aos de ELISA).
Outro inconveniente deste mtodo deve-se necessidade do uso de padres da
toxina, os quais apenas existem para um pequeno nmero de isoformas, alm do preo
elevado e dos volumes reduzidos que so comercializados (Rapala et al. 2002;
Apeldoorn et al. 2007). Assim, devido ausncia de padres das diferentes variantes de
microcistinas, os resultados so expressos em MC-LR equivalente (McElhiney e Lawton
2005; Sangolkar et al. 2006). Este mtodo igualmente tecnicamente bastante exigente,
72

Discusso
pois necessita de vrios passos de processamento e anlise em laboratrio, os quais so
extremamente morosos.
Uma vez que o mtodo de ELISA fcil de executar e os seus limites de deteco se
encontram dentro dos necessrios por lei para quantificao, deve ser encarado como
um possvel mtodo para implementao em monitorizaes de rotina, tanto em guas
recreativas, como nas para captao para consumo humano (Rapala et al. 2002).
Contudo, devido impossibilidade de discernir entre diferentes variantes de microcistina,
este mtodo no pode substituir o mtodo de HPLC-DAD.
Por espectrometria de massa, como MALDI-TOF MS, possvel uma deteco mais
sensvel e uma identificao mais precisa das variantes de microcistina presentes,
mesmo quando a quantidade de microcistina bastante reduzida. Este mtodo
providencia a massa molecular de todos os pptidos da amostra permitindo uma
identificao

das

diferentes

variantes

de

microcistinas

presentes.

principal

desvantagem deste mtodo reside no facto de no ser possvel a quantificao (WHO

1999). Quando aliada a tcnicas como ELISA, o MALDI-TOF MS pode ser bastante
importante, podendo ser usado para confirmar a presena de microcistinas e quais as
variantes presentes.
A anlise de MALDI-TOF MS no estava prevista realizar no incio do trabalho, pelo
que, no momento de mostragem no foi recolhido nenhum volume com este propsito
nem as amostras foram logo liofilizadas com vista a que no ocorresse qualquer
degradao da toxina at posterior anlise. Assim, a amostra liofilizada para MALDI-TOF
MS foi o volume que tinha restado da anlise de ELISA. Estas amostras j tinham cerca
de 6 meses, foram vrias vezes congeladas e descongeladas e mantidas luz durante
longos perodos. Uma vez que se tratava de uma amostra natural, na prpria gua
tambm poderiam surgir constituintes que potenciassem a degradao da toxina.
Segundo Dawson (1998), em condies de laboratrio, amostras ambientais com nveis
de MC-LR de cerca de 10g/L sofrem degradao da toxina em menos de uma semana
(Dawson 1998). Para alm destes factores, a quantidade extremamente reduzida de
amostra liofilizada, pode ter contribudo para os resultados negativos de microcistina na
maioria das amostras. Assim, apesar de s no Marco a 1-Out se ter detectado a presena
de microcistina-LR, no se pode considerar, no presente trabalho, que nas restantes
datas e locais esta toxina, ou outras variantes no pudessem tambm ocorrer. De futuro,
ser aconselhado que seja recolhido um volume de amostra e devidamente
acondicionada com este propsito, mesmo que depois a anlise no seja efectuada.
Em amostras naturais, Vasconcelos e colaboradores (1996), verificaram que a
variante de microcistinas mais comum em cursos de gua portugueses era a
microcistina-LR, variando no contedo total de microcistinas entre 45,5% a 99,8%. Alm
73

Discusso
destas variantes tambm detectaram as variantes YR, -RR, e [D-Asp3]MC-LR. No
Marco, a 1-Out, por MALDI-TOF MS, para alm de MC-LR, tambm foram identificados
aeruginosamida, anabaenopeptina A e F e microviridina. Segundo Saker e colaboradores
(2005b), estirpes que produzem microcistinas no produzem anabaenopeptinas nem
aeruginosamidas. Assim, o facto de estarem todos estes pptidos a serem produzidos na
amostra natural do Marco aponta para que sejam diferentes estirpes a produzi-los.
A espcie Aphanizomenon flos-aquae foi identificada nesta albufeira, j tendo sido
descrita como produtora de cilindrospermopsina (Preuel et al. 2006). Assim, apesar de
no se ter identificado, nem por anlise microscpica, nem por PCR a presena da
espcie C. raciborskii, poderia estar a ser produzida a toxina nesta albufeira. Contudo, a
inexistncia de amplificao dos fragmentos PS e PKS da cilindrospermopsina apontam
para que no esteja a ser produzida esta toxina neste local. A ausncia desta toxina foi
confirmada por ensaio imunolgico ELISA, em que todos os resultados foram negativos,
encontrando-se de acordo com os esperados de acordo com os resultados de PCR
convencional.

3.3.

Amostras ambientais para optimizao do volume de amostragem

Para as amostras do Marco, por PCR convencional, no se verificou qualquer

variao nos resultados, que dependesse do volume amostrado.
No Torro, para o gene mcyE e para o fragmento HEP, a 19-Set, s para o menor
volume amostrado que foi obtida amplificao. Possivelmente estes genes no existiam
em grandes quantidades na amostra inicial e, aliado ao facto de que num maior volume
de uma amostra ambiental, maior o nmero de contaminantes e factores ambientais
que podem interferir com a reaco de PCR, podero explicar porque que a
amplificao s ocorreu para os menores volumes. Esta inibio pode ocorrer a trs
nveis: os inibidores podem impedir a exposio ao DNA alvo, podem causar a
degradao do DNA ou inibir a actividade da polimerase (Baker et al. 2001; Hisbergues et
al. 2003). Os cidos hmicos so os inibidores ambientais mais comummente reportados
nas amostras, tendo-se j verificado que inibem a actividade da Taq polimerase na
reaco de PCR (Baker et al. 2001). Com vista melhoria dos resultados na anlise de
PCR e para diminuir os efeitos ambientais, foi adicionado reaco BSA (bovine serum
albumin), o qual se liga aos inibidores, no possibilitando que estes interfiram na reaco
(Hisbergues et al. 2003; Ouellette et al. 2006). Furukawa refere igualmente que a
existncia de uma grande quantidade de pigmentos fotossintticos pode inibir as
reaces de PCR (Furukawa et al. 2006).

74

Discusso
Na data de 1-Out, tambm no Torro, para o gene mcyE, a amplificao foi
confirmada para o menor e para o maior volume, mas no para o volume de amostragem
intermdio (500mL). As amostras naturais de gua no so homogneas e, colheitas,
ainda que simultneas, no so cpias umas das outras, pelo que pode ter ocorrido que,
para o volume de 500 mL, se tenha retirado uma amostra com menor quantidade de
cianobactrias, no ocorrendo nenhuma estirpe com este gene, ou apenas em nfimas
quantidades, ou a amostra poderia ter uma maior quantidade de contaminantes
ambientais, sendo que as quantidades de BSA adicionadas reaco no foram
suficientes para contrariar os efeitos negativos provocados por estes componentes na
reaco.
Por RT-qPCR foi possvel observar que as amostras do Marco apresentaram maior
nmero de clulas de cianobactrias equivalente por mililitro do que as amostras do
Torro, nas duas datas amostradas. A 1-Out, no Torro, a quantidade de clulas de
cianobactrias j era bastante reduzido, sendo que, o volume amostrado no parece ter
interferido muito nos resultados. Estes resultados apontam para que quanto mais lmpida
a gua, menos interfere o volume de amostragem nos resultados. A escolha de menores
volumes torna-se importante essencialmente quando existe uma grande quantidade de
clulas por mililitro.
O maior volume amostrado no foi necessariamente aquele em que se obteve
menores quantificaes. Por exemplo, a 19-Set no Marco, o nmero de clulas com o
gene mcyA para o volume de 250 mL foi inferior ao da amostra de 500 mL. Para o
mesmo local e data, o gene mcyB foi quantificado para os volumes de 15 mL, 50 mL e
500 mL, mas, no volume de amostragem de 250 mL s foi possvel a deteco. Tal como
na anlise de PCR convencional, factores ambientais podem ter interferido nestes
resultados, at porque na anlise de PCR em tempo real no foi adicionada reaco
BSA.
O limite de deteco na anlise de RT-qPCR foi extremamente baixo, tendo este
mtodo mostrado ser mais sensvel que o PCR convencional para a deteco de genes
envolvidos na produo da toxina. Por exemplo, por RT-qPCR no foi possvel quantificar
o gene mcyB no Torro contudo, ele foi detectado por anlise dos melting peaks, ao
passo de que por PCR convencional no tinha sido detectado o gene em nenhum dos
volumes amostrados, para nenhuma das datas.
Embora a tcnica de PCR em tempo real seja cada vez mais aceite como um
instrumento para analisar a composio de comunidades de cianobactrias, um dos
principais problemas deste mtodo reside na dificuldade de converter as quantidades de
genes em quantidades de clulas que possuem esses genes, podendo conduzir a
resultados errneos de enumerao de quantidades de clulas em amostras naturais.
75

Discusso
Por RT-qPCR foram quantificadas, no Marco, maior nmero de cpias para o fragmento
do 16S rRNA especfico de Microcystis sp., do que para o fragmento do 16S rRNA
comum a todas as cianobactrias. Com base nestes valores, partida, seria de concluir
que havia um maior nmero de clulas de Microcystis do que de cianobactrias.
Resultados semelhantes foram obtidos, igualmente em amostras naturais, para RintaKanto e colaboradores (2009), Kurmayer e Kutzenberger (2003) e Rasmussen e
colaboradores (2008a). Estes resultados podem dever-se ao uso do 16S rRNA como
alvo, tanto para a quantificao de cianobactrias, como de Microcystis, devido ao facto
de poderem existir at 4 cpias deste opero no genoma (Rinta-Kanto et al. 2005; RintaKanto et al. 2009), ou ainda a uma m contagem de clulas dos controlos ou
persistncia de DNA alvo de clulas mortas em amostras naturais (Rasmussen et al.
2008a). Com base na existncia de vrias cpias do gene 16S rRNA, qualquer estimativa
da densidade celular pode inferir erro na anlise de RT-qPCR.

Assim, com vista a

melhorar este tipo de anlise, em trabalhos futuros, deve-se recorrer amplificao de

genes mais conservados, com apenas uma cpia por genoma, como o caso das
regies conservadas ITS (internal transcribed space) entre os genes 16S rRNA e 23S
rRNA (Iteman et al. 2000; Dittmann e Brner 2005) e do mcyD (Rinta-Kanto et al. 2005).
No presente trabalho, observou-se que o limite de deteco para a reaco para
amplificao do fragmento do 16S rRNA especfico de Microcystis sp., foi menor que o
para o fragmento do 16S rRNA partilhado por todas as cianobactrias. Estes valores
indicam que provavelmente a reaco est mais optimizada para o m16S rRNA que para
o 16S rRNA. O facto da reaco no estar to bem optimizada, pode explicar os menores
valores de quantificao.
Por anlise de ELISA, nas duas datas (15-Out e 29-Out), para nenhum dos volumes
amostrados foi detectada a toxina, no sendo possvel inferir sobre a interferncia do
volume nos resultados.

3.4.

Estirpes isoladas

A purificao e cultura de cianobactrias pode ser difcil e morosa, sendo mais

facilmente cultivadas quando acompanhadas por bactrias heterotrficas (Nubel et al.
1997). Assim, as culturas obtidas no presente trabalho foram puras mas no axnicas.
A quantidade de microcistina produzida por uma determinada populao de
cianobactrias em cultura directamente proporcional taxa de crescimento da cultura,
sendo que a maior produo ocorre na etapa final da fase de crescimento exponencial
(Funari e Testai 2008). Assim, a extraco de amostra para ELISA e MALDI-TOF MS foi
feita durante a fase de crescimento exponencial.
76

Discusso
Microscopicamente no possvel discernir entre estirpes txicas e no txicas
(WHO 1999; Baker et al. 2002; Dittmann e Wiegand 2006). Diferentes estirpes de uma
mesma espcie podem ser morfologicamente idnticas mas diferir na produo da toxina
(Baker et al. 2002). O uso de mtodos moleculares permitiu o desenvolvimento de
mtodos de identificao de cianobactrias potencialmente txicas. Contudo, o facto de
geneticamente serem capazes de produzir a toxina (toxignicas) no significa que a
toxina esteja a ser produzida. Para confirmar que uma espcie de cianobactria
realmente txica essencial que se isole a espcie em cultura pura, podendo
posteriormente detectar-se e quantificar-se as concentraes de toxina (WHO 1999).
Estirpes de cianobactrias produtoras de microcistinas possuem um cluster de genes
de microcistina sintetase (mcy), essencial para a produo da toxina (Rinta-Kanto et al.
2009). Estirpes no produtoras, geralmente no possuem o cluster ou ento contm uma
cpia incompleta deste, no conseguindo produzir a toxina (Rinta-Kanto et al. 2009). Com
o aumento do uso de tcnicas de biologia molecular, a amplificao de fragmentos de
genes por PCR tem provado ser um mtodo simples e sensvel para diferenciar entre
estirpes potencialmente produtoras ou no de microcistinas. Esta tcnica tem vrias
vantagens quando comparada com os mtodos tradicionais de monitorizao da
qualidade da gua para cianobactrias, incluindo a rapidez, simplicidade e o baixo limite
de deteco (Ouellette e Wilhelm 2003).
A anlise foi feita para 22 estirpes, para deteco por PCR dos genes 16S rRNA
(fragmento especfico de todas as cianobactrias),16S rRNA (fragmento especfico de
Microcystis sp.), mcyA, mcyB, mcyE e para o fragmento HEP, o qual amplifica tanto uma
regio do gene mcyE, envolvido na sntese de microcistina, como uma regio do gene
ndaF, envolvido na sntese de nodularina. Destas estirpes, as identificadas como
Limnothrix sp. e M. wesenbergii no possuram qualquer gene envolvido na produo de
microcistina e/ou nodularina. Estes resultados esto de acordo com os obtidos por ViaOrdurika e colaboradores (2004), em 13 cursos de gua de 9 pases Europeus, onde no
foi detectada a amplificao de nenhum gene mcy para estirpes de M. wesenbergii.
No presente trabalho foram identificadas estirpes de Microcystis aeruginosa com os 4
genes envolvidos na produo das toxinas pesquisados (estirpes 9 e 16), outras s com
alguns (estirpes 5, 15, 18 e 19) e outras sem nenhum (estirpes 6, 7, 8 e 17). A
quantificao de microcistina por ELISA foi apenas realizada para as estirpes de M.
aeruginosa 6, 7, 9, 15, 16, 19. Foi ainda realizada para a estirpe 1, Aphanizomenon flosaquae, que tinha apresentado resultados positivos para o gene mcyE por PCR.
Estirpes de M. aeruginosa isoladas no mesmo local e na mesma data, como o caso,
por exemplo, das estirpes 8 e 9, apresentaram grande variao gentica, ocorrendo na
mesma florescncia estirpes potencialmente produtoras e no produtoras de microcistina.
77

Discusso
Num estudo realizado por Moreno e colaboradores (2004) no rio Guadiana foram
igualmente observadas estas variaes entre estirpes da mesma florescncia. Otsuka e
colaboradores (2001) concluram que nas diferentes morfoespcies de Microcystis podem
surgir estirpes produtoras e no produtoras de microcistinas. Estes resultados suportam a
hiptese de que as florescncias naturais de M. aeruginosa so compostas por estirpes
quimicamente e geneticamente diversas, e que o crescimento de diferentes quimio-tipos
pode contribuir para uma grande variao do contedo txico.
No presente trabalho foram isoladas poucas estirpes de M. aeruginosa por data e
local, no sendo suficientes para inferir sobre a percentagem de estirpes produtoras de
microcistinas, versus estirpes no produtoras. Vrios estudos at hoje realizados
apontam para que mais de 50% das estirpes de M. aeruginosa presentes em amostras
naturais serem produtoras de microcistinas (Vasconcelos et al. 1995; Vasconcelos et al.
1996; Via-Ordorika et al. 2004; Saker et al. 2005a; Martins et al. 2009).
Apenas estirpes de M. aeruginosa positivos para os genes mcyA, mcyB, mcyE e para
o fragmento HEP (estirpes 9 e 16) foram positivos para microcistina no ensaio
imunolgico, com valores de toxina acima dos previstos pela legislao (1 g MC-LR
equivalentes/L). Os resultados observados encontram-se de acordo com a bibliografia,
em que apenas estirpes que possuem o cluster de mcy completo que produzem
microcistina (Martins et al. 2009). A estirpe de A. flos-aquae tambm apresentou valores
de 0,28 g MC-LR equivalentes/L por ELISA.
S as estirpes que por ELISA apresentaram a presena da toxina que foram
enviados para MALDI-TOF MS para determinao dos pptidos e variantes de
microcistinas presentes nas amostras. Para as estirpes de M. aeruginosa houve uma
relao entre os resultados obtidos nos vrios ensaios, em que s as estirpes com os 4
genes envolvidos na produo da toxina foram positivos no ensaio imunolgico de ELISA,
confirmando-se posteriormente por MALDI-TOF MS a presena de microcistina nessas
duas estirpes. A microcistina-LR foi a nica variante de microcistina determinada na
estirpe 16. Martins e colaboradores (2009), em amostras do Marco detectaram uma
grande variedade de variantes de microcistinas, sendo as mais comuns MC-LR, -FR, WR e YR. Numa dessas amostras, tal como no presente trabalho, apenas uma variante
de microcistina foi detectado (Martins et al. 2009). Em M. aeruginosa isoladas de cursos
de gua do norte e centro de Portugal, foram detectadas as variantes MC-LR (a mais
comum), -LA, -RR e YR (Vasconcelos 1995). Em muito menores quantidades,
Vasconcelos (1995) tambm identificou a presena de MC-AR e [D-Asp3]MC-LR. ViaOrdorika e colaboradores (2004), em 13 cursos de gua de 9 pases europeus
determinaram que as variantes de microcistina mais comuns em estirpes de Microcystis

78

Discusso
eram MC-LR, -RR e YR. Saker e colaboradores (2005a), alm destas trs variantes,
tambm detectou na albufeira do Torro a variante MC-WR.
Welker e colaboradores (2006) investigaram a diversidade de pptidos em colnias
individuais de Microcystis por MALDI-TOF MS e demonstraram a presena de
microcistinas, aeruginosinas, microgininas, anabaenopeptinas e cianopeptolinas.
Trabalhos realizados por Fastner e colaboradores (2001), Saker e colaboradores
(2005a) e Martins e colaboradores (2009), verificaram que determinados pptidos, como
aeruginosinas esto ausentes quando microcistinas so produzidas. No presente trabalho
verificou-se, para a estirpe de Microcystis aeruginosa n 16 a produo simultnea de
aeruginosinas e MC-LR. Na estirpe 9 no foi possvel, por MALDI-TOF MS determinar
com certeza se estava a ocorrer a produo de microcistina ou de cianopeptolina. A
confirmao s seria possvel por fragmentao PSD (post-source decay). Para esta
mesma estirpe tambm foi identificada a presena de microviridina. Os resultados de
ELISA apontam para a presena de microcistina mas, Welker e colaboradores (2004)
reportaram que a produo de microviridina ocorre simultaneamente com a produo de
cianopeptolina.
Para a estirpe de A. flos-aquae tinha sido detectada a toxina por ELISA mas, por
MALDI-TOF MS no se detectou qualquer variante de microcistina. Uma vez que as
estirpes isoladas produzem uma grande variedade de outros metabolitos secundrios,
outros componentes, para alm das microcistinas, podem ter contribudo para os
resultados positivos obtidos por ELISA. Reaces cruzadas em ensaios de ELISA tm
sido reportados, j existindo kits de ELISA com anticorpos de regies mais conservadas
da toxina, como para o aminocido ADDA (Metcalf e Codd 2003).
Martins e colaboradores (2009) obtiveram resultados semelhantes aos do presente
trabalho. De 47 estirpes isoladas, 28 (60%) foram positivas para os genes mcyA e mcyB,
por anlise de PCR, indicando a presena de genes envolvidos na produo de
microcistinas (Martins et al. 2009). Estes resultados estavam de acordo com os obtidos
por ELISA e MALDI-TOF MS, uma vez que as amostras com os genes mcyA e mcyB
mostraram ter quantidades detectveis de microcistinas por ensaio imunolgico e pelo
menos uma variante de microcistina por anlise MALDI-TOF MS (Martins et al. 2009). As
nicas excepes foram em duas amostras do Marco, que apesar da presena de genes
envolvidos na biossntese da toxina e da confirmao da presena da toxina por ELISA,
no apresentaram microcistina por anlise MALDI-TOF MS (Martins et al. 2009). Por
outro lado, nenhuma amostra negativa para os genes mcyA e mcyB por PCR apresentou
a produo da toxina (Martins et al. 2009).
Este estudo demonstra que as tcnicas moleculares so teis para a pesquisa em
laboratrio de genes codificantes das microcistinas, tendo estes resultados uma boa
79

Discusso
correlao com os obtidos por MALDI-TOF MS, que se trata de uma tcnica muito mais
dispendiosa.

80

Concluso

4. Concluso

Na albufeira do Torro verificou-se a ocorrncia de cianobactrias, assim como a

produo de microcistinas. A concentrao, tanto de cianobactrias como de
microcistinas, foi sempre superior no Marco, quando comparada com o Torro,
apontando para um efeito de dissoluo ao longo do rio Tmega. A espcie M.
aeruginosa foi dominante durante as duas primeiras datas de amostragem, comeando a
sua ocorrncia a diminuir no final do Vero, e aumentando a ocorrncia de A. flos-aquae,
espcie dominante na ltima data de amostragem. Contudo, a espcie M. aeruginosa
parece ser a com maior importncia a nvel desta albufeira, devido tanto sua
dominncia, como por aparentar ser a principal produtora de microcistinas.
A espcie Cylindrospermopsis raciborskii, apesar de j ter sido identificada como uma
invasora em climas temperados, inclusive no centro e sul de Portugal, no foi encontrada
na Albufeira do Torro. A cilindrospermopsina, que tambm pode ser produzida pela
espcie Aphanizomenon flos-aquae, a qual foi identificada na albufeira do Torro, no foi
detectada neste local.
Tendo em conta que as cianotoxinas representam um srio problema em guas
usadas para consumo humano ou para fins recreativos, como o caso da Albufeira do
Torro, maiores conhecimentos sobre a ocorrncia desta espcie e suas toxinas so
importantes. Alm do mais, o local de amostragem do Marco encontra-se prximo de um
ponto de captao de gua para abastecimento pblico e, os tratamentos usualmente
utilizados nas Estaes de Tratamento de gua (ETA) no so eficazes na remoo de
cianotoxinas, pelo que existe o risco delas estarem presentes na gua destinada a
consumo humano.
A identificao das cianobactrias, realizada por microscopia ptica, numa primeira
fase, mostrou ser essencial, pois permitiu determinar qual a melhor abordagem a seguir.
Devido enorme variao e complexidade da distribuio das cianobactrias, a
deteco por PCR de clusters de genes demonstrou ser uma forma fcil para identificar a
possvel presena de compostos secundrios como as microcistinas. Estas tcnicas
foram facilmente empregues tanto em culturas, como em amostras ambientais.
Este trabalho demonstrou a importncia dos mtodos moleculares na implementao
de uma monitorizao de rotina. Em cursos de gua dominados por M. aeruginosa, ser
de interesse a implementao de um mtodo que procure pelo menos dois genes do
cluster, pertencentes a operes diferentes, como o caso do mcyA e do mcyE. A
presena dos genes mcy, no presente estudo, pode ser correlacionada com a formao
de microcistinas. S espcies com todos os genes do cluster de microcistina pesquisados

81

Concluso
que foram txicas. Por outro lado, foi possvel verificar que a presena destes genes
no se reflecte necessariamente na produo das toxinas.
Por PCR em tempo real, verificou-se, em algumas datas, que a presena de genes
envolvidos na produo da toxina poderiam corresponder existncia de outras espcies
potencialmente produtoras, que no M. aeruginosa. Assim, em trabalhos posteriores seria
interessante a focagem na pesquisa de outras espcies e determinao das suas toxinas
nesta albufeira.
A tcnica de RT-qPCR, no presente trabalho, mostrou ser mais sensvel para
deteco de genes que a tcnica de PCR convencional, tendo sido ainda capaz de
quantificar o nmero de genes. Esta quantificao, de futuro, poder ser essencial em
monitorizaes de rotina, devido rapidez com que se obtm os resultados, evitando
assim a quantificao de cianobactrias por microscopia. Os genes escolhidos na
amplificao de PCR em tempo real, nomeadamente os para identificao de
cianobactrias e do gnero Microcystis, no foram os mais adequados, pois podem surgir
vrias cpias destes genes por genoma, resultando em quantificaes que no
correspondem s reais. Assim, dever ser tido em considerao a escolha de regies do
genoma mais conservadas, onde s surja uma cpia de cada gene. Igualmente, deve ser
feita uma optimizao da reaco para que os resultados obtidos possam ser os mais
prximos da realidade.
No presente trabalho verificou-se, que numa amostra natural ocorrem, dentro da
mesma espcie, estirpes potencialmente produtoras de microcistinas e outras no
produtoras. Assim, as populaes naturais de Microcystis so constitudas por
organismos geneticamente diferentes, cada qual com diferentes tolerncias a factores
ambientais e diferentes potenciais txicos. Esta variedade pode explicar as oscilaes de
microcistinas em ambientes naturais. Das estirpes isoladas, correspondendo s espcies
de M. aeruginosa, M. wesenbergii, A. flos-aquae e Limnothrix sp., s as estirpes de M.
aeruginosa que apresentaram ser toxignicas e produtoras da toxina.
O conhecimento dos factores ambientais que afectam a produo da toxina
indispensvel para a compreenso da ecologia de cianobactrias txicas, sendo que a
monitorizao da expresso gnica da toxina e a abundncia desta, em resposta a uma
variedade de factores fsicos, qumicos e biticos essencial.
Para a quantificao de microcistinas, os mtodos imunolgicos de ELISA mostraram
ser mais adequados que os de cromatografia (HPLC), uma vez que o limite de deteco
por este mtodo inferior ao imposto pela legislao em vigor. A quantificao por
ELISA, para monitorizao da qualidade das guas deve sempre contemplar a anlise de
microcistinas totais, ou seja, tanto endo como exotoxinas. O facto de por HPLC no ter
sido detectada a presena da toxina, no significa que este mtodo no se adeque e uma
82

Concluso
monitorizao de rotina. Este mtodo tem grandes vantagens, quando comparado com a
tcnica de ELISA, pois permite distinguir entre variantes de microcistina.
As tcnicas moleculares, quando usadas em combinao com outras, como a de
ELISA, demonstraram ser bastante teis, devido rapidez, sensibilidade e a capacidade
de se poder adequar a uma monitorizao de rotina.
Por MALDI-TOF MS foi possvel verificar que nas amostras naturais e nas estirpes
isoladas surgem diferentes tipos de compostos produzidos por cianobactrias, para alm
das microcistinas. A variante microcistina-LR foi a nica microcistina identificada. Para a
obteno de melhores resultados, em trabalhos futuros, um maior volume de amostra
deve ser preparado para a anlise de espectrometria. Uma vez que inmeros factores
podem interferir com a degradao de cianotoxinas, as amostras devem ser o mais
brevemente preparadas para este tipo de anlise.
Normalmente, os volumes de amostragem so relativamente elevados, podendo
dificultar o transporte e o seu rpido processamento em laboratrio. Neste trabalho,
verificou-se, que de uma maneira geral, volumes to pequenos como de 50 mL parecem
ser suficientes para a obteno de bons resultados. Contudo, este volume de
amostragem no pode ser generalizado. Para cada local de amostragem, a quantidade
de cianobactrias presentes no local, assim como a quantidade de sedimentos e de
inibidores naturais vo interferir na escolha deste volume. Quanto maior a quantidade de
cianobactrias, de sedimentos e de inibidores naturais, menor dever ser o volume
amostrado. Em trabalhos futuros, ser de interesse fazer uma correlao entre volumes
de amostragem, turbidez das guas, e quantidades de DNA presentes nas amostras.
Atravs do uso de tcnicas de microscopia, moleculares, de HPLC e de ELISA, foi
possvel, no presente trabalho, demonstrar a presena de cianobactrias txicas na
albufeira do Torro. Esta ocorrncia no se restringiu apenas aos meses mais quentes,
sendo que as maiores concentraes de toxina foram determinados no incio do ms de
Outubro. A aplicao de todos estes mtodos permitiu detectar, diferenciar, quantificar e
monitorizar cianobactrias txicas e cianotoxinas. Diferentes mtodos providenciam
diferentes informaes, por vezes complementares, sendo que este tipo de anlise
multidisciplinar necessria porque nenhum mtodo suficientemente completo para se
poder obter toda a informao necessria.
Atravs dos resultados verificou-se que uma anlise multidisciplinar parece ser a mais
acertada para inferir sobre a ocorrncia das florescncias e produo da toxina: (1) por
exame microscpico obtm-se informao sobre a densidade, diversidade e composio
das espcies, sugerindo a existncia de espcies txicas; (2) por PCR possvel a
pesquisa nas amostras ambientais de genes envolvidos na produo da toxina e das
principais espcies produtoras, inferindo sobre a possvel produo de toxina; (3) por
83

Concluso
ELISA possvel a quantificao da toxina, uma vez que um mtodo sensvel,
especfico e fcil de realizar; (4) nos casos em que a produo da toxina for confirmada, o
isolamento e cultura das possveis estirpes txicas, essencial para compreenso das
dinmicas de produo de toxina; (5) por ltimo, para as amostras positivas para a toxina,
por ELISA, para anlise qualitativa e quantitativa devem ser empregues mtodos como o
de HPLC e o de MALDI-TOF MS.
A elevada e rpida variao da densidade de fitoplncton tornam difcil de definir
estratgias de amostragem. Variaes txicas observadas tanto inter como intra estirpes
de cianobactrias amostradas, reflectem a natureza imprevisvel das florescncias, no
que respeita a produo da toxina e a ocorrncia. A deteco precoce de estirpes de
cianobactrias txicas em amostras de gua indispensvel para a preveno de
problemas de sade pblica, uma vez que permite a aplicao de medidas correctivas
antecipadamente. O uso de tcnicas moleculares em combinao com a quantificao da
toxina providencia uma informao completa para proteco da populao de riscos para
a sade.

84

Bibliografia

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Anexo I

Anexo I

As imagens presentes neste anexo referem-se aos resultados da amplificao dos genes por
PCR.
As figuras 1 a 6 correspondem aos resultados de PCR para as as amostras ambientais. As
figuras 7 a 13 aos resultados das amostras ambientais para optimizao dos volumes e as figuras
14 a 19 s estirpes isoladas. O marcador 100bp EZ Load Molecular Ruler (BioRad) foi o utilizado
para a figura 2. O marcador utilizado para as figuras figuras foi marcador 1Kb plus (Invitrogen)
(fragmentos de 100bp a 12kb).

Amostras ambientais
Legenda:
1
2
3

Marco 19-9
Marco 1-10
Marco 15-10

4
5
6

Marco 29-10
Torro 19-9
Torro 1-10

7
8

Torro 15-10
Torro 29-10

+
B

Controlo Positivo M6
Branco

Figura 3 Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina sintetase (mcyA).

Figura 1 Produto da amplificao do gene 16S

rRNA.

Figura 4 Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina sintetase B (mcyB).

Figura 5 Produto da amplificao do

genecodificante da microcistina poliquetdio sintase
(mcyE).

Figura 2 (a,b,c) Produto da amplificao do gene

16S rRNA especfico de Microcystis.

Figura 6 Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina/nodularina sintetase
(mcyE/ndaF) (fragmento HEP).

Anexo I

Amostras ambientais para optimizao do volume

Legenda:
1
2
3
4

Marco 15 ml 19/9
Marco 50 ml 19/9
Marco 250 ml 19/9
Marco 500 ml 19/9

5
6
7
8

Marco 250 ml 1/10

Marco 500 ml 1/10
Marco 1000 ml 1/10
Torro 50 ml 19/9

9
10
11
12

Torro 250 ml 19/9

Torro 500 ml 19/9
Torro 1000 ml 19/9
Torro 250 ml 1/10

13
14
+
B

Torro 500 ml 1/10

Torro 1000 ml 1/10
Controlo positivo
Branco

Figura 7 - Produto da amplificao do gene 16S

rRNA.

Figura 10 - Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina sintetase (mcyA).

Figura 11 - Produto da amplificao do gene

Figura 8 Produto da amplificao por multiplex

codificante da microcistina sintetase B (mcyB).

PCR para os genes 16S rRNA especfico de

Microcystis, codificantes de microcistina sintetase
(mcyA) e microcistina sintetase B (mcyB).

Figura 12 - Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina poliquetdio sintase
(mcyE).
Figura 9 - Produto da amplificao do gene 16S
rRNA especfico de Microcystis.

Figura 13 - Produto da amplificao do gene

codificante da microcistina/nodularina sintetase
(fragmento HEP).

II

Anexo I

Estirpes isoladas
Legenda:
1
2
b3
4
5
6
7
8

Aphanizomenon flos-aquae
Limnothrix sp.
Limnothrix sp.
Limnothrix sp.
Microcystis aeruginosa
M. aeruginosa
M. aeruginosa
M. aeruginosa

9
10
11
12
13
14
15

M. aeruginosa
M. wesenbergii
M. wesenbergii
M. wesenbergii
M. wesenbergii
Limnothrix sp.
M. aeruginosa

16
17
18
19
20
21
22

M. aeruginosa
M.aeruginosa
M.aeruginosa
M.aeruginosa
M.wesenbergii
M.wesenbergii
M.wesenbergii

Figura 14 (a, b) - Produtos da amplificao do

gene 16S rRNA.

Figura 16 (a, b, c, d) - Produtos da amplificao

do gene codificante da microcistina sintetase
(mcyA).

Figura 15 (a, b, c) - Produtos da amplificao do

gene 16S rRNA especfico de Microcystis.

III

Anexo I

Figura 18 (a, b, c) - Produtos da amplificao do

gene codificante da microcistina poliquetdio
sintase (mcyE).

Figura 17 (a, b, c, d) - Produtos da amplificao

do gene codificante da microcistina sintetase B
(mcyB).

Figura 19 (a, b, c) - Produtos da amplificao do

gene codificante da microcistina/nodularina
sintetase (fragmento HEP).

IV

Anexo II

Anexo II
As sequncias que se seguem referem-se s sequncias amplificadas, atravs do
gene 16S rRNA, para determinao das espcies das estirpes em cultura. Todas as
sequncias encontram-se no sentido 53. Os caracteres a vermelho e negrito
correspondem a nucletidos introduzidos s sequncias originais, por comparao da
sequncia inversa e complementar.

Estirpe 1 Aphanizomenon flos-aquae

TTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGTATGCTTAACACATGCAAGTCGACGGTCTTTTAGGAGACAGTGGC
GGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTACCTTCAGGTTGGGGACAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGAATGTGC
CGAGAGGTGAAAGGCTTGCTGCCTGAAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTAGTGTAAGAGACTACCAAGGC
GACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
CAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAA
ACCTCTTTTCTCAGGGAAGAACAGAATGACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGTAAGTCTGCTGTTAAA
GAGTTTGGCTCAACCAAATAAGAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTGTGGTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTA
GCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGAC
GAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTAGCTCGTAT
CGACCCGAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGAAACTCAAAGGA
ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACA
TGTCACGAATCCTGTGGAAACATGGGAGTGCCTTCGGGAGCGTGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCAGCATTAGGTTGGGCACTCTAG
AGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACA
CGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCGAATCTCGTAAACCGTAGCTCAGTTCAGAT
CGAAGGCTGCAACTCGCCTTCGTGAAGGAGGAATCGCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTTCCCG
GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTGGTCACGCCCGAAGTCGTTACCCCAACCTATGGAGGGGGAT
GCCTAAGG

Estirpe 2 Limnothrix sp.

TGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGTATGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGGTTCTTCGGAACCTAGTG
GCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGTCGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCCGATGT
GCCGCAAGGTGAAAGGTTAACTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGTGTAAGAGACCCCCAAG
GCGACGATCGGTAGCTGGTTTGAGAGGACAATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC
AGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGCCTGTGGGTTGT
AAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAGCTCTGACGGTACCTGAGGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGTTTCGTAAGTCTGTCTTTAA
AGAGTGGAGCTTAACTCCATAAAGGGGATGGAAACTGCGAGACTAGAGGTAGGTAGGGGTAGAAGGAATTCCCAGTGT
AGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCAGCAGCGAAGGCGTTCTACTGGACCAAACCTGACGCTCATGGAC
GAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGACACTAGGTGTTGCACGTAT
CGACCCGTGCAGTGCCGTAGCCAACGCGTTAAGTGTCCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGA
ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACA
TCCTGCGAATCCTGGCGAAAGTCGGGAGTGCCTTCGGGAGCGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGGACTCTAG
GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACA
CGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAGCTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCGAAAACCCGGCCCCAGTTCAGA
TTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCC
GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTGCCCGAAGTCATTACCCTAACCGCTTGCGGAGGG
GGATGCCTAAGGCA

Estirpe 3 Limnothrix sp.

GGCTCAGGATGAACGCTGGCGTATGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATTCTTCGGAATCTAGTGGCGGACG
GGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGTCGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCCGATGTGCCGCAA
GGTGAAAGGTTAACTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGTGTAAAGGACTACCAAGGCGACGA
TCGGTAGCTGGTTTGAGAGGACAATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG
GGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGCCTGTGGGTTGTAAACCTC
TTTTCTCAGGGAAGAAGCTCTGACGGTACCTGAGGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACG

Anexo II
GAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGTTTCGTAAGTCTGTCTTTAAAGAGTGG
AGCTTAACTCCATAAAGGGGATGGAAACTGCGAGACTAGAGGTAGGTAGGGGTAGAAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTG
AAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCAGCAGCGAAGGCGTTCTACTGGACCAAACCTGACGCTCANGGACGAAAGCT
AGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGACACTAGGTGTTGCACGTATCGACCCG
TGCAGTGCCGTAGCCAACGCGTTAAGTGTCCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCCTACG
AATCCTGGCGAAAGTCGGGAGTGCCTTCGGGAGCGTAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAGGGAGACT
GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTAC
AATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAGCTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCGAAAACCCGGCCCCAGTTCAGATTGCAGGC
TGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG
TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTGCCCGAAGTCATTACCCTAACCGCTTGCGGAGGGGGATGCCTA
AGGCA

Estirpe 4 Limnothrix sp.

TTACCACATGCAAGTCGAACGGTGTCTTCGGACATAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAACCTGCCTAC
AGGCTGGGGACAACGACTGGAAACGGTCGCTAATACCCAATGAACCGAGAGGTAAAAGATTAATCGCCTGAAGATGGG
CTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGATGATCGGTAGCTGGTTTGAGAGGACAATCAG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCT
GACGGAGCAATACCGCGTGGGGGACGAAGGTCTGTGGATTGTAAACCCCTTTTCTCTAGGAAGAACACAATGACGGTA
CTAGAGGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATT
GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTTAAACAAGTCTACCCTTAAAGAGTGGAGCTTAACTCCATAAAGGGGGTGGAAAC
TGTATAACTAGAGGTCGGTAGAGGTAAGAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCA
GCAGCGAAGGCGTCTTACTGGACCGAATCTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCC
TGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGACACTAGGTGTTGCACGTATCGACCCGTGCAGTGCCGTAGCCAACGCGTTAAGT
GTCCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGT
GGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGTTTGACATCCTGCGAATCTTCTTGAAAGGGAAGAGTGCCTTC
GGGAGCGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGTG
GATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACATCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGTTGGGACAAAGGGCAGCGAGCC
TGCGAAGGCAAGCTAATCTCGTAAACCCAGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGCGGAATC
GCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGT
TGGTTTTGCCCGAAGTCATTACCCTAACCTTTCGAGGAGGGGGATGCCGAAGGCA

Estirpe 6 Microcystis aeruginosa

TGGCGGCGTGCCTAAACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAA
GAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGG
CCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGA
GAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAAT
GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAA
GTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTT
ATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAA
AGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT
TGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAG
GGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAG
CTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAA
GCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC
CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGAC
AAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCC
TGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC
CGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCAGGGCTAG

Estirpe 7 Microcystis aeruginosa

GCGTGCCTACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATC
TAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGG
AGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGA
TGAACAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCG
AAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTG
ACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGG
AATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGG
TGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAA

VI

Anexo II
GAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGAATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTA
GATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACG
CGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
GAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGG
GGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG
CAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG
AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGG
CAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATG
AAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCA

Estirpe 8 Microcystis aeruginosa

CTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTAGGATTCTAGTGGCGGACGG
GTGAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAG
GTGAAACCTAATTGGCCTGAAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAACGAT
CAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG
GGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTC
TTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
GGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGG
TTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAG
CTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGAC
CCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTG
ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTC
GCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCG
TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAG
ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTA
CTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTG
CAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGG
GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGAT
GCCTAAGGCAGGGCTAGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAC

Estirpe 9 Microcystis aeruginosa

GCGTGCCTACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCT
AACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGAA
GAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGAT
GAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCG
AAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTG
ACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGG
AATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGG
TGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAA
GAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTA
GATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACG
CGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
GAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGG
GGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG
CAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG
AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGG
CAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATG
AAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCAGGGCTAGTGACT
GGGGTGAAGTCGTAACAAGGT

Estirpe 10 Microcystis wesenbergii

GGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAGCTT
GCGTTTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGA
CGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTT
GAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG
GCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTG
GCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGG
TGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCT
GTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTA

VII

Anexo II
TCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTG
GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCCTTC
GGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
CAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG
GATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACT
CGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAA
TCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAA
GCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATG

Estirpe 11 Microcystis wesenbergii

GATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTG
GCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGT
GCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAG
GCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG
CAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTG
TAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTC
AAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGT
GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGG
GACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTGGGCGTGGCTT
GCATCTACCCGAGCACGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAA
AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGACTT
GACATGTCGAGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGC
TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTGGGGGACT
CTAATGAGACAGCCGGTGACGAACCGGAGGAAAGTGGGGATGACATCTAGTCATCTTGCGGCTTACATCGTGGGCGA
CACACGTACTACACTGGGCTGGACACAGGGGAGCGAACTCGGGAGAGCGAGCGAATCCCAGCAAACCCGGACTCAAT
TCA

Estirpe 12 Microcystis wesenbergii

AACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCA
GGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAG
CTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCT
GACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTAC
TTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT
GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAA
CTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACAT
CGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACC
CCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAA
GTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTAT
GTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCC
TTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG
GGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGA
ACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAG
GAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATG
GAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCAG

Estirpe 13 Microcystis wesenbergii

ATTCTAGTGGCGGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTG
CTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGT
AAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGA
AGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGT
GCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGC
CAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGC
AGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTAT
CTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACT
AGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGT
GTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCT
TACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGG
CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTA
AGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTAC

VIII

Anexo II
GTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAAC
CCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACG
GCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTC
AACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCAG

Estirpe 14 Limnothrix sp.

AGTGGCGGAACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGTCGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATA
CCCGATGTGCCGCAAGGTGAAAGGTTAACTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGTGTAAAGGA
CTACCAAGGCGATGATCGGTAGCTGGTTTGAGAGGACAATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGACGAAGGCCT
GTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAGCTCTGACGGTACCTGAGGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAG
CAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGCGGTTTCGTAAGT
CTGTCTTTAAAGAGTGGAGCTTAACTCCATAAAGGGGATGGAAACTGCGAGACTAGAGGTAGGTAGGGGTAGAAGGAA
TTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCAGCAGCGAAGGCGTTCTACTGGACCAAACCTGAC
GCTCATGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGACACTAGGTG
TTGCACGTATCGACCCGTGCAGTGCCGTAGCCAACGCGTTAAGTGTCCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAA
ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCA
AGGCTTGACATCCTACGAATCCTGGCGAAAGTTGGGAGTGCCTTCGGGAGCGTAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTC
GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTG
GGGACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCTT
GGGCTACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAGCTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCGAAAACCCGGCC
CCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGA
ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTGCCCGAAGTCATTAC

Estirpe 15 Microcystis aeruginosa

GCGTGCCTACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCT
AACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGA
GAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGAT
GAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCG
AAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTG
ACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGG
AATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGG
TGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAA
GAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTA
GATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACG
CGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG
GAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGG
GGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG
CAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG
AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGG
CAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATG
AAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA
CACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCA

Estirpe 16 Microcystis aeruginosa

TAGAGTTTGATCTTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGAT
TCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATAC
CCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCC
TACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTT
TGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCT
GCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATT
CCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACA
CTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGT
GGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAA
CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAA
GACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCG
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGG
GGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTG
GGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGC
CTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTG

IX

Anexo II
AATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGC
AAGGAGGGGGATG

Estirpe 17 Microcystis aeruginosa

CTGGCGGCGTGCCTACACATGCAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAA
GAATCTAACTTTAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATATGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGG
CCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGA
GAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAAT
GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAA
GTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTT
ATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAA
AGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT
TGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAG
GGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAG
CTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAA
GCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC
CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGAC
AAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCC
TGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC
CGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCA

Estirpe 18 Microcystis aeruginosa

GCGTGCCTACACATGCAGTCGAACGGGAATCTTAGGATTCTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAGAATCTA
ACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGAAG
AAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATG
AGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAA
AGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGAC
GGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAA
TTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTG
GAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAA
CATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGAT
ACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGT
TAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG
TATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGT
GCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA
CGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG
GTGGGGACGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAG
CGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAG
GAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC
CATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAAGGCAG

Estirpe 19 Microcystis aeruginosa

TCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCTTAGGATTCTAGTGGCGGACGGGT
GAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGT
GAAACCTAATTGGCCTGAAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAACGATCA
GTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG
GAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTT
TCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGG
GGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTG
CTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAA
ATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTA
GGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGA
GCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGA
ACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG
ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTG
CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTAC
AATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGG
CTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTT
GTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTA
AGGCA

Anexo II

Estirpe 21 Microcystis wesenbergii

CAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGAATCTTCGGATTCTAGTGGCGGACGGGT
GAGTAACGCGTAAGAATCTAACTTCAGGACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGT
GAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGAGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCA
GTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG
GAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTT
TCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGG
GGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTG
CTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGA
AATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTA
GGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGA
GCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGA
ACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG
ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTG
CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTAC
AATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGG
CTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTT
GTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGA

Estirpe 22 Microcystis wesenbergii

ACGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATGTGCCGCAAGGTGAAACCTAATTGGCCTGGAGAAGA
GCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCA
GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCC
TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTA
CTTGAGGAATCAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT
GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAA
CTGGCAGACTAGAGAGCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACAT
CGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACC
CCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAA
GTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTAT
GTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTGGGGGTGCC
TTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA
GCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG
GGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGA
ACTCGCGAGAGCCAGCGAATCCCAGCAAACCCGGCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGAG
GAATCGCTAGTAATCGCCGGTCAGCATACGGCGGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATG
GAAGCTGGTCACGCCCGAAGTCATTACCTCAACCGCAAGGAGGGGGATGCCTAANGCAGGGCTAGTGACTGGGGTGA
AGTCGTAAC

XI

Anexo III

Anexo III

As imagens seguintes referem-se aos espectros obtidos por MALDI-TOF MS para as amostras ambientais (figuras 1 a 10) e para as
estirpes cultivadas (figuras 11 a 17).

Figura 20 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco a

19 de Setembro

Figura 21 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco a 1

de Outubro

XII

Anexo III

Figura 22 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco a 1

Figura 24 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco a

de Outubro

29 de Outubro

Figura 23 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Marco a

Figura 25 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Torro a

19 de Setembro

15 de Outubro

XIII

Anexo III

Figura 26 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Torro a 1

de Outubro

Figura 27 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do Torro a

15 de Outubro

Figura 28 - Espectro de MALDI-TOF MS para a amostra ambiental do

Torro a 29 de Outubro

Figura 29 - Espectro de MALDI-TOF MS para a estirpe 1 (Aphanizomenon

flos-aquae)

XIV

Anexo III

Figura 30 - Espectro de MALDI-TOF MS para a estirpe 9 (Microcystis

aeruginosa)

Figura 32 - Espectro de MALDI-TOF MS para a estirpe 16 (Microcystis

aeruginosa)

Figura 31 - Espectro de MALDI-TOF MS para a estirpe 9 (Microcystis

aeruginosa)

XV

Anexo IV

Anexo IV

As imagens seguintes referem-se s curvas dos melting peaks obtidos nas diferentes reaces de PCR em tempo real.

As figuras 1 a 4 referem-se aos resultados obtidos para as amostras padro. As figuras 5 a 8 referem-se aos resultados para as
amostras ambientais e amostras ambientais para optimizao dos volumes.

Figura 33 Melting Peaks da reaco de PCR em

Figura 34 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Figura 35 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Tempo Real para as amostras padro, para

Tempo Real para as amostras padro, para

Tempo Real para as amostras padro, para

amplificao de um fragmento do gene 16S rRNA.

amplificao de um fragmento do gene 16S rRNA

amplificao de um fragmento do gene da microcistina

Melting temperature de 870,5C.

especfico de Microcystis. Melting temperature de

sintetase (mcyA). Melting temperature de 821C.

870,5C.

XVI

Anexo IV

Figura 36 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Figura 38 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Figura 40 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Tempo Real para as amostras padro, para

Tempo Real para as amostras ambientais e amostras

Tempo Real para as amostras ambientais e amostras

amplificao de um fragmento do gene da microcistina

ambientais para optimizao dos volumes, para

ambientais para optimizao do volume, para

sintetase B (mcyB). Melting temperature de 820,5C.

amplificao de um fragmento do gene 16S rRNA

amplificao de um fragmento do gene da microcistina

especfico de Microcystis.

sintetase especfico de Microcystis (mcyB).

Figura 37 - Melting Peaks da reaco de PCR em

Tempo Real para as amostras ambientais e amostras

Figura 39 - Melting Peaks da reaco de PCR em

ambientais para optimizao do volume, para

Tempo Real para as amostras ambientais e amostras

amplificao de um fragmento do gene 16S rRNA.

ambientais para optimizao do volume, para

amplificao de um fragmento do gene da microcistina
sintetase (mcyA).

XVII