Protemica

Estudo
Estudo
Estudo
Estudo

em
em
em
em

larga
larga
larga
larga

escala
escala
escala
escala

do DNA (gene) Genmica

do RNA Transcriptmica
da Protena Protemica
dos Metablicos Metabolmica

Protemica: identificar, caracterizar e quantificar todas as protenas

envolvidas em uma cadeia particular, organismo, rgo, tecido, clula ou
organela. O objetivo fornecer dados confiveis para o entendimento de
determinado sistema. importante estudar, pois so o ltimo produto de
toda uma via, da sntese que comea com o DNA. Todas as vias biolgicas
das clulas envolvem protenas: como protenas carreadores, histonas, as
poliubiquitinas, actina, miosina, receptores etc etc. A partir do fentipo da
pessoa, estuda-se o gentipo (polimorfismo, por exemplo) e encontra-se a
melhor droga pra tratar o indivduo, atravs do estudo de como sua protena
ir ser expressa (farmacogentica).
Escolhe-se a funo a ser estudada. Pode ser a fenotpica: efeitos que uma
protena faz no organismo; celular: estudar a rede de interaes de uma
protena na clula, definindo os processos metablicos na qual a protena
altera/age; ou molecular: atividade enzima da protena/ bioqumica. Reao
que a enzima catalisa ou os ligantes que podem mudar as interaes. H
muitas perguntas e dependendo delas decide-se a funo de estudo.
Relacionado pergunta, existem rotas de estudos a seguir. 1) A primeira a
relao estrutural ou de sequncia, que consiste em comparar estrutura e
sequncia de genes e protenas com funes conhecidas. Ser obtido
informaes sobre a funo proteica. 2) Pode-se tambm observar o padro
de expresso que determina quando e onde o gene expresso. Indica a
funo celular do gene. 3) A rota de estudos interao protena-protena
investiga as interaes das protenas com as demais. um estudo muito
demorado. Identifica-se assim a funo celular e molecular. H duas
grandes famlias de protenas: perfil proteico cuja protena conhecida
target. Se no souber nada uma anlise protemica un-target.
1) importante j ter o genoma sequenciado (timo para humanos)
para ter um banco de dados construdo. Esse banco de dados te d as
funes gnicas de determinados genes que codificam as protenas a
serem identificadas. Ser uma genmica comparativa, que nada mais
do que genes relacionados por homologia a uma sequncia
recentemente descoberta. Por analogia ser feita uma correlao, e
sua funo pode ser completa ou parcialmente definida assim. Esses
so genes ortlogos, presentes em diferentes espcies que possuem
relao funcional entre si. Outro tipo de estudo que utiliza
sequencias associadas a motivos (so outras estruturas da mesma
protena). A sequncia de determinados motivos pode identificar o
que a ptn catalisa. Com softwares e comparao com banco de
dados, pode-se associar sequencias a motivos estruturais particulares
(ajuda a definir que uma nova protena possui dobramento estrutural
claramente relacionado ao motivo com funes conhecidas no banco
de dados) e assim conseguir a funo molecular da nova protena.
2) Padro de Expresso: Determina em qual tecido/organela/rgo
aquele gene expresso e em quais circunstncias o produto gnico
produzido. Pode ser feito por MicroArray (chip de DNA) de DNA, Chip
de Protenas e Eletroforese de Gel Bidimensional

 MicroArray de DNA (Chip de DNA)

Microarranjo de DNA. necessrio biblioteca de DNA, PCR e hibridizao de
DNA. Permite a anlise milhares de genes. Analisa tudo ao mesmo tempo.
Utiliza segmentos de DNA de genes conhecidos (se determina os genes
desejados). Faz-se amplificao por PCR e a aparelhos depositam nL de
DNA no chip que sondado (se escolhe se ser sondas de cDNA ou mRNA,
melhor cDNA por ser mais estvel e no degrada com tanta facilidade). Esse
chip gera uma anlise na qual pode-se avaliar quais genes so expressos
em determinadas clulas ou tecidos. Cada cor representa algo. Por exemplo:
verde pode ser os genes expressos no momento do tratamento. Amarelo,
genes que no se alteraram. Em vermelho, genes que se expressaram 3hrs
aps o tratamento.
Chip de Protena
Parecido com o de DNA, mas h um conjunto de anticorpos distribudos em
uma matriz slida em pontos previamente definidos por quem est fazendo
o processo, adiciona-se a amostra protena e ela vai se ligar ao seu
respectivo anticorpo e assim conseguido determinar a aplicao daquela
protena(s).
Eletroforese em Gel Bidimensional
Permite separao e exibio de muitas protenas diferentes. O
aparecimento, ausncia ou desaparecimento de pontos particulares de
protenas ajuda a definir a funo da protena desejada. Pode-se comparar
protenas expresso por uma clula em dois momentos diferentes e atravs
disso analisar o efeito de hormnios, drogas, estado fisiolgico do
desenvolvimento de algumas clulas e condies patolgicas por vrus, etc.
Se usa a espectrometria de Massa em auxlio ao Gel bidimensional, para
sequenciar parcialmente pontos individuais, os quais representam protenas
e atribuir cada uma a um gene. Observado um ponto de protena que sumiu,
pode-se recortar o gel naquele pedao e por no espectrmetro para saber
qual protena sumiu. A 1 um gel em formato de tubo de ensaio com
diferena de ph, do mais cido para o mais bsico onde passa uma corrente
que leva as protenas, do negativo para positivo. A protena teoricamente
no tem carga no ponto isoeltrico, porque est anulada, mas a carga est
ali. Depois que as protenas da amostra se separaram por pH no gradiente
determinado, coloca-se esse gel tubular em cima do gel de poliacrilamida
normal e corre a eletroforese. As protenas separadas por pH agora Tb sero
separadas por peso molecular. A sobreposio, em condies diferentes,
permite identificar diferenas nos padres de bandas. Num mapa proteico,
resultado desse gel, se analisa pontinho por pontinho para qualificar
ausncia e presena, mas tambm pode-se quantificar.
3) Interao protena-protena: definir a funo celular e molecular da
protena. Associa uma PTN de funo desconhecida com uma cuja
funo conhecida. Pode ser estudado atravs da composio do
Genoma ou atravs da purificao dos complexos Complexos.
Protenas individuais agrupam-se conforme suas interaes, formando
uma rede que permite entender detalhes do controle das funes
vitais do organismo.
Comparao da composio do Genoma: utiliza bibliotecas
genmicas existentes e determina quais outros genes esto
relacionadas com o gene que codifica a protena. Se dois
genes sempre aparecem juntos em um genoma, as protenas

codificadas por eles podem estar relacionadas. Podem, porque

as interaes so muito complexas.
Purificao dos Complexos Proteicos: imunoprecipitao de um
produto proteico revela a identificao de protenas associadas
(Dot blot). Protenas que interagem com ela tambm sero
precipitadas. As protenas precipitadas so clivadas e os
complexos so analisados.
Se eu tenho um aumento na transcrio do gene, consequentemente se
tem um aumento no nvel do seu mRNA? Sim (?). Mas o aumento no nvel do
mRNA significa que haver um aumento no nvel da protena que ele
codifica? No. Por qu? Porque os mRNA podem ou NO sintetizar uma
protena, e isso ocorre por causa do Splicing Alternativo: o mesmo mRNA
pode codificar protena diferentes! Assim, um nico gene pode sintetizar
algumas protenas. Essas protenas ainda passam por clivagem,
modificaes ps-traducionais e outros processos que no necessariamente
geram uma protena madura ativa. Ela pode estar inativa, e s se ativar na
presena de um fator. O nmero genes, transcritos e protenas crescente!
Fatores que afetam a protemica da clula: Fisiologia, Interaes
(clula-clula: crescimento que gera contato uma com a outra,
incentivando, diminuindo e parando o crescimento, uma vez que elas se
comunicam. *Pouco confluente: clulas secretando muito fator de
crescimento porque tem espao. Confluente, 80% de confluncia: clulas
crescendo menos, porque j h contato uma com a outra. 100% Confluente:
clulas apertadas, com crescimento parado. Ningum mais cresce),
Temperatura, Estresse (contaminao), Condies de cultivo, Expresso
gnica clula especfica, substncias farmacuticas.
Espectrometria de Massa: auxilia no estudo da protemica. Foi inventado
aps a descoberta do eltron, primeira medida da razo massa/carga de
uma partcula. Aps foi criado mtodos de ionizao branda em
espectrometria de massa, o que s ento permitiu a anlise das protenas.
Faz-se ionizando as protenas desejadas de forma que ela assuma uma
carga desejada (algumas j impe a carga), ento se imprimi uma ionizao
dessas partculas e a partir da relao massa/protena carga/protena se
consegue mensurar as protenas desejadas. tcnica de alta confiabilidade,
permite a fragmentao das protenas em peptdeo para anlise individual
de cada. A fonte de ionizao passa de um estado condensado ao gasoso
para ento ionizar com a carga desejada. O analisador, feito por um
quadrupolo, onde ocorre a separao das protenas desejadas de acordo
com o tamanho-massa/carga. Determina-se quem fica. No detector se
descobre quem so as protenas, atravs de sinais que geram um grfico,
cujo eixo x de abundncia (pr-determinada, como a abundncia dos
ispotos de carbono) e eixo y massa/carga. para ver se os parmetros
foram bem estabelecidos. Cada padro de espectro condiz a um peptdeo
( ex. a actina ter padro x em todo lugar do mundo). A desvantagem so:
fcil contaminao, vidraria precisa ser lavada de modo exclusivo, assim
como as vidrarias utilizadas so exclusivas, utiliza EPIs, utiliza sempre
reagentes grau MS (reagente muito puro e caro), ponteiras exygen novas e
microtubos novos! Isso tudo para evitar qualquer rudo nos resultados.
Target: Extrato proteico (lisa sem desnaturar) > gel bidimensional > recorta
os pontos desejados> espectrmetro > grfico

Untarget: Extrato proteico > espectrmetro de massa > banco de dados >
resustados
Amostra com protena j extrada > coluna de cromatografia > ionizao >
fragmentao > anlise de massa > anlise de dados
Ou
Amostra > eletroforese 2D > espectrmetro > anlise de dados
A extrao geralmente feito com tampo que deve conter ureia, tiouria,
trizima-base (alta afinidade com a protena e se solubilizam ali), detergente
(para formar micelas e extrair as protenas do meio e solubilizar lipdeos de
membrana), coquetel e inibidor de proteases (para as protenas no
desnaturarem).
Se recortar do gel, primeiro identifica no mapa, recorta aquele ponto da
matriz, descora o Coomasse, adiciona agentes redutores pra desnaturar a
protena, alquilantes para expor stios de clivagem para clivar com eficcia,
e tripsina que digere enzimaticamente cortando as protenas e as
fragmenta, tudo para melhor deteco no espectrmetro.*MS: no foram
fragmentados e as protenas detectadas so inteiras, e MS/MS: protenas
fragmentadas, anlise de peptdeos.
Ionizao: A ionizao ocorre por eletrospray na maioria dos aparelhos:
nebulizao da gotgulas da amostra em soluo em um campo eltrico
intenso, gerando gotculas altamente carregadas. Quando o solvente
evapora, formam-se ons, de acordo com o campo eltrico aplicado.
Separao: Elas entram no quadrupolo, carregadas do jeito requerido. O
quadrupolo identifica e separa os peptdeos de acordo com a relao
massa/carga. Os que no so requeridos batem na parede e saem.
Deteco: Tempo de voo: dependendo do tempo, chega quem maior ou
menor. Da gera os resultados. Anlise dos Resultados: O grfico gera uma
tabela, com a identificao da protena, intervalo de confiana (2 o ideal),
expresso etc. Gera-se um grfico com as protenas que participaram do
processo da expresso. Vatagens: detecta modificaes ps-transcricionais,
tem alta confiabilidade, boa resoluo para a protena, permite comparao
quantitativas. Desvantagens: alto custo, requer database com sequencia de
peptdeos, protenas hidrofbicas so um problema (porque tudo est no
meio aquoso?), e a anlise e quantificao difcil. Limitaes
experimentais: difcil anlise das protenas por serem frgeis e ter
isoformas. Limitaes da Anlise dos dados: rudos difceis de separar e
confundem, o que aumenta o tempo de anlise. Limitaes biomdicas:
difcil de traar progresso de doenas (porque resultado do momento) e
anlise de apenas um momento do perfil proteico.