3453 Estudo Comparativo Dos Efeitos Locais e Sistemicos (Leticia Helena de Carvalho & Juliana Zuliani)

FUNDAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDNIA
Ncleo de Sade
Programa de Ps-graduao em Biologia Experimental
LETCIA HELENA DE CARVALHO
ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS LOCAIS E SISTMICOS DOS

VENENOS DAS SERPENTES Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus
collilineatus e Crotalus durissus cascavella EM CAMUDONGOS SWISS
Porto Velho-RO
2014
FUNDAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDNIA
Ncleo de Sade
Programa de Ps-graduao em Biologia Experimental

Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-graduao em Biologia Experimental
da Fundao Universidade Federal de
Rondnia - UNIR para obteno do ttulo
de mestre em Biologia Experimental.
Orientadora: Dr. Juliana Pavan Zuliani
Porto Velho-RO
2014
FICHA CATALOGRFICA
BIBLIOTECA PROF. ROBERTO DUARTE PIRES
C331e
Carvalho, Letcia Helena
Estudo comparativo dos efeitos locais e sistmicos dos venenos das
serpentes Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus
e Crotalus durissus cascavella em camudongos swiss. / Letcia
Helena de Carvalho. Porto Velho, Rondnia, 2014.
98f.: il.
Orientadora: Prof. Dr. Juliana Pavan Zuliani
Dissertao (Mestrado em Biologia Experimental) Ncleo de Sade

(NUSAU), Programa de Ps-Graduao em Biologia Experimental,
Fundao Universidade Federal de Rondnia, Porto Velho, 2014.
1. Crotalus durissus. 2. Miotoxicidade. 3. Nefrotoxicidade. 4.

Hepatotoxicidade. 5. Efeito sistmico. I. Fundao Universidade Federal
de Rondnia. II. Ttulo.
CDU: 598.115
Bibliotecria responsvel: Eliane Gemaque CRB-11/549
Bibliotecria responsvel: Eliane Gemaque CRB-11/549


COMISSO EXAMINADORA
_____________________________________________
Dra. Juliana Pavan Zuliani
Universidade Federal de Rondni-UNIR e Fundao Oswaldo Cruz-FIOCRUZ-RO
___________________________________________
Dra. Stella Regina Zamuner
Universidade Nove de Julho - UNINOVE
_____________________________________________
Dra. Daniela Priscila Marchi Salvador
Universidade Federal da Paraba-UFPB
Porto Velho, de____ de_________________ 2014.
Resultado:________________________________.
Dedico este trabalho.....
Aos meus pais, Sebastio Antonio Carvalho Filho e

Ana Helena Zenke pelo carinho e dedicao com que me ajudaram, desde
sempre sendo a base para toda essa minha conquista.
Aos meus irmos Heleno de Carvalho e Regiane

Helena de Carvalho pela presena e companheirismo, ajudando sempre que
possvel.
Ao meu marido, Stainer Barbosa Barbosa, por me

apoiar, me compreender nas horas difceis, me auxiliar com carinho que somente
ele possui.
A minha filha querida Sleyner Carvalho Barbosa e

a uma pessoa que h pouco tempo faz parte da minha vida, ao meu filho
querido Nicolas Randley Carvalho Barbosa, fontes de inspirao e motivao
de um futuro melhor.
Jamais considere seus estudos como uma obrigao, mas como uma oportunidade
invejvel para aprender a conhecer a influncia libertadora da beleza do reino de
esprito, para seu prprio prazer pessoal e para o proveito da comunidade a qual
seu futuro trabalho pertence.
(Albert Einstein)
AGRADECIMENTOS
DEUS,
Fonte inspiradora de todas as conquistas e vitrias...
A minha famlia, que me deu condies de chegar ao fim deste trabalho.
A minha orientadora,
Juliana,
Pelo auxlio, disponibilidade de tempo e material, me ajudando nas horas mais

difceis, sempre com uma simpatia e sabedoria contagiante que contriburam para o
meu desenvolvimento profissional.
Pelos ensinamentos que ficaro comigo por toda a vida, suas palavras de incentivo
me ajudaro diante das adversidades.
Ao professor Dr. Andreimar Soares, pela colaborao, ajuda e pelos venenos

utilizados neste estudo sem as quais, no existira este trabalho.
A Dra. Giselle Martins Gonalves pelas sugestes no exame de qualificao.
A Dra. Carla Freire Celednio Fernandes por participar da composio da banca e

pela disponibilidade.
A Aline Schmitz pela amizade e convvio to agradvel, pela disponibilidade de

sempre ajudar.
A todos os meus Professores do PPGBIOEXP/UNIR.
As colegas de laboratrio Adriana Pontes e Sulamita Setbal, pelo apoio,

companheirismo, amizade e pelos conhecimentos transmitidos.
As amigas Jssica Flix, Leda Fabielen, Neiriane Monteiro e Michele Pereira pelo
apoio durante a realizao dos experimentos e deste manuscrito.
Aos amigos Leandro Flores e Onsis Bori pela amizade, companheirismo, e auxlio
na realizao deste manuscrito.
A todos os colegas do CEBio que colaboraram com a realizao desse estudo:

Juliana Sobrinho, Kayano, Rodriguinho, Rafaela, Clepatra, Diana, Ronile,
Ramres, Cladia e Corra.
A todos os funcionrios da FIOCRUZ-RO e colegas de mestrado.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela

concesso da bolsa de mestrado.
Ao CNPQ e FINEP pelo auxlio financeiro

A todos que de forma direta ou indireta vieram a ajudar na realizao deste trabalho.
RESUMO
Os acidentes causados por serpentes do gnero Crotalus causam srias

complicaes e podem ser fatais na ausncia de tratamento adequado. A letalidade
deste envenenamento ocorre devido frequncia com que este evolui para a
insuficincia renal aguda, uma das principais causas de morte. A presena de
isoformas e variaes inter e intraespecficas na composio destes venenos podem
resultar nas diferenas dos sintomas clnicos apresentados pelos indivduos
acometidos por serpentes da mesma espcie, porm, de diferentes regies
geogrficas. Por conseguinte, o presente estudo avaliou, de forma comparativa, os
efeitos locais e sistmicos causados pelo envenenamento por Crotalus durissus
terrificus (Cdt), Crotalus durissus collilineatus (Cdcolli) e Crotalus durissus cascavella
(Cdcasc). Para isso, foi realizada cromatografia (gel filtrao sephadex G-75) dos
venenos e, as fraes destes foram evidenciadas por SDS-PAGE em gel de
poliacrilamida a 12,5/15%. A atividade proteoltica, fosfolipsica e de LAAO tambm
foram realizadas. Os ensaios de miotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e
alteraes na hemostasia da coagulao foram avaliados pelo uso de marcadores
especficos. A induo do edema foi medida com pletismmetro (Ugo Basile). O
fracionamento e a eletroforese SDS PAGE 12,5% e 15% dos venenos evidenciou as
principais toxinas, convulxina (Cvx), giroxina (Grx), crotoxina (Ctx) e crotamina (Ctm)
presentes no veneno de Cdt e Cdcolli. O veneno de Cdcasc mostrou ser crotamino-
negativo. Os venenos Cdt, Cdcollli e Cdcasc (10g) no apresentaram atividade
proteoltica. Apenas os venenos de Cdcasc e Cdt (20g) apresentaram atividade
fosfolipsica. A atividade de LAAO foi verificada nos venenos de Cdcolli e Cdcasc
(20g). Nos ensaios de induo de edema (100g/Kg), Cdcolli causou aumento da
espessura da pata dos camudongos de 36,7% e Cdcasc 13,3% sobre o veneno de
Cdt (em 1h). O veneno de Cdt teve 10% de induo de edema em relao aos
demais venenos (em 3h). Todos os venenos alteraram os nveis de CK-TOTAL, CK-
MB e LDH (indicando leso muscular), alteraram os nveis de ALT, AST, GGT e
Fosfatase alcalina (indicando leso heptica), alteraram tambm os nveis de uria e
creatinina, tanto no plasma como na urina, e ocasionaram extravasamento de
protenas na urina (indicando leso renal). Apenas os venenos de Cdcolli e Cdcasc
aumentaram o tempo de coagulao dos ensaios de TAP e TTPA (evidenciando a
influncia dos venenos nas hemostasia da coagulao). Em concluso, estes
resultados permitem avaliar as diferenas dos efeitos locais e sistmicos
ocasionados pelas subespcies de Crotalus durissus, evidenciando as
caractersticas clnicas e bioqumicas produzidas pelos respectivos venenos.
Palavras chave: Crotalus durissus, miotoxicidade, nefrotoxicidade,

hepatotoxicidade, efeito sistmico.
ABSTRACT
Accidents caused by snakes of the genus Crotalus cause serious complications and
can be fatal in the absence of proper treatment. The lethality of the venom is due to
the frequency with which it progresses to acute renal failure, one of the major causes
of death. The presence of isoforms and inter and intraspecific variation in the
composition of these venoms can result in differences in clinical symptoms presented
by affected individuals by snakes of the same species but from different geographical
regions. Therefore, this study evaluated comparatively, local and systemic effects
caused by envenomation by Crotalus durissus terrificus (Cdt), Crotalus durissus
collilineatus (Cdcolli) and Crotalus durissus cascavella (Cdcasc). The
chromatography (gel filtration Sephadex G-75) of the venoms was performed and the
fractions were observed by SDS-PAGE on 12.5% and 15% polyacrylamide gel. The
proteolytic, phospholipase and LAAO activity were also performed. Tests of
myotoxicity, hepatotoxicity, nephrotoxicity and alterations in coagulation hemostasis
were evaluated by using specific markers. The induction of edema was measured
with plethysmometer (Ugo Basile). Fractionation and SDS-PAGE 12.5% and 15%
venom electrophoresis evidenced the most important toxins, convulxin (Cvx), gyroxin
(Grx), crotoxin (Ctx) and crotamin (Ctm) present in the venom of Cdt and Cdcolli. The
venom Cdcasc crotamin proved negative. The Cdt venom of Cdcollli and Cdcasc
(10g) had no proteolytic activity. Only Cdcasc and Cdt venom (20g) showed
phospholipase activity. The LAAO activity was observed in Cdcolli and Cdcasc
(20g) venoms. For induction of edema (100g/Kg) Cdcolli caused increase in paw
thickness in mice of 36.7%, and Cdcasc 13.3% of Cdt venom (in 1 hour). Cdt venom
had 10% induction of edema compared to other venoms (in 3 hour). All venoms have
altered levels of TOTAL-CK, CK-MB and LDH (indicating muscle injury), altered
levels of ALT, AST, GGT and alkaline phosphatase (indicating liver damage), also
alter the levels of urea and creatinine, in both plasma and urine, occasioned
extravasation of urine protein (indicating kidney damage). Only Cdcolli and Cdcasc
venoms increased the clotting time of APTT and TAP tests (showing the influence of
venoms in hemostasis coagulation). In conclusion, these results allow us to evaluate
the differences of local and systemic effects caused by subspecies of Crotalus
durissus, highlighting the clinical and biochemical characteristics produced by their
respective venoms.
Keywords: Crotalus durissus, myotoxicity, nephrotoxicity, hepatotoxicity,

chromatography.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Exemplar da serpente cascavel (Crotalus durissus) 16
Figura 2. Distribuio das espcies de Crotalus durissus no Brasil 18
Figura 3.Modelo esquemtico da interao da crotoxina com a membrana 20

plasmtica.
Figura 4. Efeito clnico do envenenamento crotlico 23
Figura 5.Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus por 38

excluso molecular.
Figura 6. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de 40

Crotalus durissus terrificus.
Figura 7. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus 41

por excluso molecular.

Crotalus durissus collilineatus.
Figura 9. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus cascavella 42

por excluso molecular.

Crotalus durissus cascavella por excluso molecular
Figura 11. Rendimento das fraes obtidas pela cromatografia dos venenos C. 43
d.terrificus, C. d.collilineatus e C. d. cascavela
Figura 12. Determinao da atividade proteoltica dos venenos Crotalus durissus 44

terrificus, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus cascavella sobre a
Azocasena
Figura 13. Determinao da atividade fosfolipsica dos venenos Crotalus 45

durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus cascavella.
Figura 14. Determinao da atividade de L-aminocido-oxidase dos venenos 46
Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus
cascavella.
Figura 15. Efeito edematogenico induzido pelo veneno das serpentes C. d. 47

terrificus, C. d. collilineatus e C. d. cascavella em camundongos
Figura 16. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 48

C. d. cascavella (100 g/Kg) sobre a atividade Miotxica em camudongos swiss.

C. d. cascavella sobre ao miocrdio em camudongos swiss

C. d. cascavella sobre a funo heptica de camudongos swiss

C. d. cascavella sobre a funo heptica de camudongos swiss

C. d. cascavella sobre a funo renal nos camudongos swiss.

C. d. cascavella sobre a funo renal nos camudongos Swiss. Foram usadas
amostras de plasma

C. d. cascavella sobre a funo renal nos camudongos Swiss

C. d. cascavella sobre a coagulao em camudongos Swiss.
Figura 24. Modelo esquemtico da via intrnseca e extrnseca da cascata de 75

coagulao bem como os locais de ao de algumas serinoproteases (SP) do
veneno de serpentes.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais efeitos do envenenamento crotlico 25

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AST Aspartato amino tranferase

ALT Alanina amino transferase
ANOVA Anlise de varincia
ATP Adenosina trifosfato
Cdt Crotalus durissus terrificus
Cdcolli Crotalus durissus collilineatus
Cdcasc Crotalus durissus cascavella
CK Creatino quinase
D.O. Densidade ptica
FAL Fosfatase Alcalina
GGT Gama Glutamil Transferase
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
L-AAO L-aminocido oxidase
LDH Desidrogenase Lctica
4N3OAB cido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzico
OPD O-phenylenediamine
PAF Fator de ativao de plaquetas
PBS Soluo tampo fosfato salina
RT Reagente de trabalho
TCA cido tricloroactico
TFA - cido trifluoractico
TGO Transaminase Glutmico Oxlica
TGP Transaminase Glutmico Pirvica
TNF Fator de Necrose Tumoral
SUMRIO
1. INTRODUO 14
1.1. Consideraes gerais 14
1.2. Gnero Crotalus (Linnaeus 1758) 16
1.3. Composio dos venenos de serpentes do gnero Crotalus 18
1.4. Efeito do envenenamento crotlico 22
1.5. Prognstico e Tratamento dos acidentes crotlicos 25
2. OBJETIVOS 27
2.1. 27
Objetivo geral
2.2. Objetivos especficos 27
3. 28
MATERIAL E MTODOS
3.1. Animais 28
3.2. Comit de tica 28
3.3. Veneno 28
3.4. Concentrao do veneno utilizada 28
3.5. Caracterizao Bioqumica dos venenos 29
3.5.1. Cromatografia 29
3.5.2. Eletroforese gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% e 15% 29
3.5.3. Determinao quantitativa de protenas 30
3.6. Caracterizao enzimtica dos venenos 30
3.6.1. Atividade Proteoltica 30
3.6.2 Atividade Fosfolipsica 31
3.6.3 Atividade de LAAO 31
3.7. Caracterizao dos efeitos locais e sistmicos Modelo in vivo 31
3.7.1. Induo do edema 31
3.7.2. Modelo experimental dos ensaios de miotoxicidade, hepatotoxicidade 32
e nefrotoxicidade in vivo
3.7.3. Determinao da atividade miotxica 33
3.7.4 Determinao da atividade hepatotxica 33
3.7.5. Determinao da atividade nefrotxica 34
3.8. Avaliao do efeito dos venenos sobre a hemostasia da coagulao 36
in vivo Modelo experimental
3.8.1. Determinao das Provas de coagulao in vivo 37
3.9. Anlise estatstica 37
4. RESULTADOS 38
4.1. Caracterizao Bioqumica dos venenos 38
4.1.1. Perfil cromatogrfico e eletrofortico dos venenos de Crotalus 38
durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus
cascavella
4.1.2. Determinao da quantidade de protena nos venenos 43
4.2. Caracterizao enzimtica dos venenos 44
4.2.1. Atividade Proteoltica 44
4.2.2. Atividade fosfolipsica 45
4.2.3. Atividade de LAAO 46
4.3. Caracterizao dos efeitos locais e sistmicos modelo in vivo 47
4.3.1. Induo do edema 47
4.3.2. Atividade miotxica 48
4.3.3. Atividade hepatotxica 51
4.3.4. Atividade nefrotxica 55
4.3.5. Efeito dos venenos sobre a hemostasia da coagulao 60
5. DISCUSSO 62
6. CONCLUSES 78
REFERNCIAS 79
14
1. Introduo
1.1. Consideraes gerais
A Organizao Mundial da Sade considera acidentes ofdicos um grave

problema de sade pblica, e de grande incidncia nas regies rurais de pases
tropicais e subtropicais situados na frica, Oceania e Amrica Latina (WHO, 2013).
Dados da OMS mostram ainda que cerca 5.000.000 acidentes ofdicos so
registrados anualmente em todo o mundo com pelo menos 125.000 mortes
(WILLIAMS et al., 2010; GUTIRREZ et al., 2013; WHO, 2013). A maior parte
desses acidentes provocada por serpentes da famlia Viperidae, no apenas no
Brasil, como tambm em outros pases (CARDOSO et al., 2009). A dificuldade de
acesso ao servio de sade pelas populaes rurais tem contribudo para o aumento
dos casos de morbidade e mortalidade provocados por mordida de serpentes.
Aqueles que muitas vezes no conseguem chegar ao hospital a tempo, acabam
morrendo sem receber tratamento adequado. As vtimas com idade entre 19 e 49
anos que sobrevivem ao acidente, tm que conviver com as sequelas fsicas
produzidas pelas toxinas do veneno, o que acaba refletindo um impacto econmico
considervel para a famlia das vtimas (WHO, 2011). Dessa forma, os acidentes
ofdicos se enquadram no critrio de doenas negligenciadas. Alm disso, estes
acidentes tm recebido pequena ateno das autoridades da sade, da indstria
farmacutica e mesmo das agncias de fomento nas diversas partes do mundo
(KINDHAUSER, 2003; WARRELL, 2010; GUTIRREZ et al., 2010; BROWN, 2012).
Dentre as principais serpentes de interesse clnico, encontradas no Brasil,
observam-se as espcies que pertencem famlia Viperidae, subfamlia Crotalinae,
com os gneros Bothrops (popularmente conhecida como jararaca ou urutu)
responsvel por 90% dos acidentes ofdicos (com letalidade de 0,31%), Crotalus
(popularmente conhecida como cascavel) com 7,7% dos acidentes ofdicos (com
letalidade de 1,87%) e Lachesis (popularmente conhecida como surucucu) com
1,4% dos acidentes ofdicos (com letalidade de 0,95%) e as espcies pertencentes
famlia Elapidae, subfamlia Elapinae, respresentada pelo gnero Micrurus
(popularmente conhecida como coral verdadeira ou boicor) com 0,4% dos
acidentes (com letalidade de 0,52%) (NOGUEIRA, 2004; SAKATE, 2004;
BERNARDE, 2011).
15
A gravidade dos acidentes por serpentes peonhentas depende de vrios

fatores, dentre eles: gnero e espcie da serpente; tamanho do animal; tempo de
atendimento; quantidade de veneno inoculado; local da inoculao e a intensidade
dos sintomas (BARRAVIEIRA, 1990; GUTIRREZ et al., 2006). A composio
bioqumica e as atividades toxicolgicas destes venenos tambm devem ser levados
em considerao visto que os de venenos de serpentes capturadas em diferentes
reas geogrficas podem variar significativamente (FURTADO et al., 1991; DALTRY
et al.,1996; PRASAD et al., 1999).
A ocorrncia dos acidentes ofdicos esta intimamente ligada a pocas do
ano em que h maior atividade agrcola, como colheita e plantio, ou seja, nos meses
de setembro a maro nas regies Sul e Sudeste e de janeiro a maio no Nordeste,
enquanto que, na regio Norte, ocorre principalmente durante os meses mais
chuvosos do ano, de novembro at abril (FUNASA, 2001; MORENO et al., 2005;
SANTOS, 2009; BERNARDES e GOMES, 2012). A elevao dos ndices
pluviomtricos faz com que os leitos de rios, igaraps e audes transbordem,
obrigando as serpentes a procurarem por terra firme, o que facilita e aumenta as
possibilidades de encontro com pessoas, ocasionando e aumentando o nmero de
acidentes. Neste mesmo perodo, as serpentes apresentam maior atividade e a
poca em que ocorre o nascimento de seus filhotes (MARTINS E OLIVEIRA, 1998;
OLIVEIRA e MARTINS, 2002; BERNARDES e ABE, 2006; TURCI et al., 2009).
Os acidentes provocados por serpentes do gnero Crotalus causam srios
problemas e podem ser fatais quando no h tratamento adequado (BARRAVIEIRA
et al., 1989). O aumento do ndice de letalidade ocorre devido freqncia com que
o envenenamento crotlico progride para a insuficincia renal aguda, uma das
principais causas de morte (CUPO et al.,1990; FUNASA, 2001; AZEVEDO-
MARQUES et al. 2009), alm de produzir efeitos neurotxicos, miotxicos e
distrbios na coagulao podendo ocasionar micro hemorragias (MARTINS, 2002;
BRASIL, 2005).
O estudo dos venenos tem ajudado na elucidao de vrios mecanismos
farmacolgicos e biolgicos. Tais estudos servem para despertar nas autoridades
governamentais e no-governamentais, entidades produtoras de anti-venenos e
grupos de pesquisa, o maior interesse pela discusso e busca de solues para
essa temtica (WHO, 2007; WILLIAMS et al., 2010).
16
1.2. Gnero Crotalus (Linnaeus, 1758)
As serpentes do gnero Crotalus, cujo nome derivado do grego Krotalon

que significa chocalho (BERNARDES et al., 2012), so robustas, pouco geis e de
hbitos terrestres. O corpo possui linha vertebral pronunciada com um colorido de
fundo castanho-claro de tonalidades variveis, sobre o qual se destaca uma fileira
de manchas dorsais losangulares marrons, mais ou menos escuras, marginadas de
branco e amarelo (CARDOSO, 2009). Podem medir mais de 1,5m de comprimento e
so responsveis pelo segundo maior nmero de acidentes ofdicos no Brasil
(CAMPBELL e LAMAR 2004; ARAJO et al., 2003; MS, 2001). Em geral, estas
serpentes no possuem o hbito de atacar, entretanto, quando so ameaadas se
enrodilham e denunciam sua presena com o rudo caracterstico, gerado a partir de
impulsos nervosos que faz soar o guizo ou chocalho, entrecochando as escamas
semi-soltas no final da cauda. O chocalho formado de matria crnea (queratina) e
se compe de anis paralelos articulados entre si (ROSENFELD, 1961;
GUIMARES, 1974; LEITO-DE-ARAJO e ALVES, 1976; MUSSE e ALMEIDA,
1986; RIBEIRO e JORGE, 1988; BARRAVIEIRA, 1990; BRASIL, 2001; SAWAYA et
al., 2008) (Figura 1).
Figura 1: Exemplar da serpente cascavel (Crotalus durissus). Destaque para a presena do chocalho na cauda,
caracterstica nesta espcie de serpente (BERNARDES, 2011).
17
No Brasil ocorre a incidncia de apenas uma espcie, a Crotalus durissus.

Esta se encontra subdividida pelas subespcies Crotalus durissus terrificus (Cdt),
Crotalus durissus collilineatus (Cdcolli), Crotalus durissus cascavella (Cdcasc),
Crotalus durissus ruruima (Cdru) e Crotalus durissus marajoensis (Cdm).
A Crotalus durissus terrificus (Cdt) esta distribuda nas zonas altas e secas do
Brasil, estendendo-se pelos estados do Mato Grosso, Amazonas, Par, Rondnia
(regio sul cerrana de Vilhena e Chupinguaia), Minas Gerais, Gois, So Paulo e
Rio Grande do Sul (BERNARDES et al., 2012); Crotalus durissus collilineatus
(Cdcolli) esta distribuda nas zonas secas do Centro-Oeste, desde Mato-Grosso,
Mato Grosso do Sul, Gois, Minas Gerais e na regio norte do estado de So Paulo;
Crotalus durissus cascavella (Cdcasc) uma serpente caracterstica das caatingas
da regio nordeste, possui porte avantajado podendo ultrapassar 1,60m de
comprimento, encontrada desde os estados do Cear, Maranho, at o norte do
estado de Minas Gerais; Crotalus durissus ruruima (Cdru), observada em algumas
regies dos estados Roraima, Amap, Par e Amazonas; e Crotalus durissus
marajoensis (Cdm) encontrada apenas na ilha de Maraj, no Par
(BARRAVIEIRA,1990, 1993; PINHO e PEREIRA, 2001; MARTINS et al., 2003;
MELGAREJO, 2003; CARDOSO, 2009) (Figura 2). Segundo a Sociedade Brasileira
de Herpetologia (SBH-2012) uma nova subespcie foi classificada espcie
durissus, a Crotalus durissus dryinas. Os acidentes envolvendo as serpentes deste
gnero so considerados os mais graves, uma vez que o veneno destas apresenta
letalidade seis vezes superior (1,87%) ao veneno de serpentes do gnero Bothrops
(0,31%) (BRASIL, 1998; BERNARDE, 2011).
18
Crotalus durissus terrificus
Crotalus durissus collilineatus
Crotalus durissus cascavella
Figura 2: Distribuio das espcies de Crotalus durissus no Brasil. Fonte: Adaptado de MELGAREJO, 2003.
Entre os efeitos causados pelo envenenamento crotlico, podem ser citadas

as aes neurotxica, miotxica, nefrotxica, hepatotoxica e alteraes na
hemostasia da coagulao (BARRAVIERA, 1991; 1993; SANO-MARTINS et al.,
2001; AZEVEDO-MARQUES et al., 2009).
1.3. Composio dos venenos de serpentes do gnero Crotalus
O veneno da serpente Crotalus durissus possui uma grande variedade de

compostos inorgnicos e orgnicos. Os compostos inorgnicos (cerca de 10% do
peso seco total) incluem: sdio, clcio, magnsio, ferro, zinco, cobalto e nquel, com
funes importantes na ativao enzimtica. Entre os compostos orgnicos (cerca
de 90%) esto presentes as enzimas hidrolticas (fosfolipase A 2, fosfodiesterases,
fosfomonoesterases), as enzimas no hidrolticas (L-aminocido-oxidase - LAAO),
as enzimas proteolticas (endopeptidases, exopeptidases, colagenases, elastases,
arginina ster-hidrolases, hialuronidases e NAD-nucleosidases), crotalfina e as
toxinas caractersticas como a convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina (BEGHINI,
2001; BARRAVIERA, 1993). No entanto, em algumas espcies de Crotalus durissus
no observado presena de crotamina na composio qumica do veneno, sendo
19
assim, classificadas como crotamino-negativas (BARRIO e BRASIL, 1951). Estes

compostos biolgicos contribuem na imobilizao e digesto da presa, levando a
mesma a bito (QUEIROZ et al., 2008).
No veneno de serpentes do gnero Crotalus, recebem destaque a crotoxina
de ~24 kDa, que corresponde a principal frao do veneno bruto, com cerca de 50 a
60% do veneno bruto (GOMES et al., 2002). uma -neurotoxina heterodimrica
que atua na juno neuromuscular. Possui ao pr-sinptica, inibe a liberao de
acetilcolina, e ao ps-sinptica, que bloqueia a resposta acetilcolina atravs da
estabilizao dos receptores nicotnicos, deixando-os em estado inativo (CORIN,
1993). Esta toxina formada pela associao no-covalente de duas diferentes
subunidades: Crotapotina (subunidade CA) (RUBSAMEN et al., 1971; VITAL
BRASIL, 1982) e a fosfolipase A2 (subunidade CB) (HENDON e FRAENKEL
CONRAT, 1971; VITAL BRASIL, 1982; SOARES et al., 2001; CAMILLO et al., 2001;
MARTINS et al., 2002; MONTEIRO et al., 2001).
A subunidade CA, crotapotina, tem peso molecular 8,9 kDa. formada por
trs cadeias polipeptdicas com 88 aminocidos unidas por sete pontes dissulfeto
(AIRDS e YATES et al., 1990). A funo da crotapotina no esta caracterizada,
porm h evidncias que a molcula atue como carreadora da frao CB (PLA2) e
tem a propriedade de potencializar a ao desta fosfolipase. Isoladamente a
crotapotina desprovida de atividade enzimtica e no txica (HENDON e
FRAENKEL CONRAT, 1971; VITAL BRASIL, 1982; SOARES et al., 2001; CAMILLO
et al., 2001; MARTINS et al., 2002; MONTEIRO et al., 2001). A crotapotina tambm
atua como uma chaperonina que orienta a ligao especfica da subunidade PLA2
(CB) a stios especficos, o que aumenta a sua potncia (HABERMANN e
BREITHAUPT, 1978; BON et al., 1979; HENDON e BIEBER, 1982; HAWGOOD e
BON, 1991; DOLEY e KIN, 2009).
A subunidade CB (PLA2) tem cerca de 14 kDa constituda de uma cadeia
polipeptdica nica contendo 123 resduos de aminocidos unidas entre si por sete
pontes dissulfeto (AIRD e YATES et al., 1990). A subunidade CB confere atividade
fosfolipsica ao veneno crotlico (HENDON e FRAENKEL CONRAT, 1971; VITAL
BRASIL, 1982; SOARES et al., 2001; CAMILLO et al., 2001; MARTINS et al., 2002;
MONTEIRO et al., 2001). Diferentes regies do stio cataltico da PLA2 esto
envolvidas nos efeitos txicos e farmacolgicos produzidos por esta molcula
(SOARES, 2001). Estudos tem demonstrado a ao direta da crotoxina s clulas de
20
msculos esquelticos induzindo miotoxicidade sistmica, caracterizada pela

presena de mioglobinria, mioglobinemia e por aumento dos nveis sricos de
creatino quinase, lactato desidrogenase e aspartato aminotrasferases (AZEVEDO-
MARQUES et al., 1985). Esta exerce seu efeito pela a associao da frao PLA2
nas membranas plasmticas e nas terminaes nervosas. Delot e Bom (1993)
observaram que a subunidade CA, crotapotina, participa temporariamente da etapa
na qual a fosfolipase A2 (subunidade CB) se associa ao seu receptor na membrana
plasmtica, formando um complexo transitrio. A subunidade CA se dissocia do
complexo crotoxina aps a ligao da PLA2 ao seu receptor (figura 3).
Figura 3: Modelo esquemtico da interao da crotoxina com a membrana plasmtica. Fonte:

CELTIC BIOTHEC, 2006 (disponvel em http//:www.celticbiotech.com/bio_pharmaceuticals.php).
Outro componente importante a crotamina, um polipeptdio de baixo peso

molecular, no enzimtico e extremamente bsico, formado por 42 aminocidos e
massa molecular de 4,8 kDa, estruturalmente a crotamina estabilizada por seis
cistenas ligadas entre si por pontes dissulfeto (LAURE, 1975; NICASTRO et al.,
2003; FADEL et al., 2005). uma miotoxina que age nas membranas das fibras
musculares, responsvel por causar mionecrose no tecido muscular e induzir a
21
paralisia espasmdica em msculos esquelticos de origem perifrica por meio da

despolarizao do potencial de membrana das clulas musculares. Esta toxina tem
a propriedade de atuar sobre os canais de sdio e influxo de clcio (LOMONTE et
al., 2003). Em baixas concentraes produz efeito analgsico (MANCIN et al., 1998).
A crotamina possui capacidade de penetrao intracelular por mecanismos de
interao com proteoglicanos (MATSUBARA, 2009).
A convulxina uma glicoprotena de alto peso molecular ~ 72 kDa.
responsvel pela perda de equilbrio, alteraes gastrointestinais, convulses e
alteraes visuais logo aps sua inoculao. Hematologicamente produz agregao
plaquetria ligando-se fortemente aos receptores glicoproticos VI presentes nas
membranas destas, causando distrbios na hemostasia com subsequente isquemia
cerebral, podendo levar a convulses, seguida de bito (PRADO-FRANCESCHI e
BRASIL, 1981; MARLAS et al., 1983; CUNHA e MARTINS, 2012).
A giroxina uma glicoprotena de ~30 kDa, semelhante a trombina com
atividade de trombina-like e com ao fibrinoltica, ou seja, possui a propriedade de
converter o fibrinognio em fibrina e, assim, aumentar o tempo de coagulao do
sangue (SANO-MARTINS et al., 2001; CUNHA e MARTINS, 2012). Estudo realizado
por Fonseca e colaboradores (2006) descreveu a giroxina apresentando duas aes
principais: a atividade de trombina-like e L-aminocido-oxidase (LAAO). A LAAO
encontra-se envolvida na gerao de perxido de hidrognio, alm de induzir a
agregao plaquetria (TOYAMA et al., 2006). A giroxina tambm age sobre o
sistema nervoso central levando a leso do labirinto (SEKI et al., 1980). Descrita em
ratos como Sndrome de Girotoxina, que se apresenta por perodos de
hipoatividade alternados com hiperexcitao (ALEXANDER et al., 1988; PRADO-
FRANCESCHI, 1990; MATSUBARA, 2009).
A crotalfina um componente peptdico com estrutura semelhante ao
componente no-txico crotapotina tambm foi encontrado no veneno de Crotalus
durissus. A crotalfina possui forte ao antinociceptiva mediada pela ativao de
receptores opides tipo (KONNO et al., 2008), superando inclusive algumas
drogas analgsicas padro em modelo de dor neuroptica (GUTIRREZ et al.,
2008).
22
1.4. Efeito do veneno crotlico
O envenenamento crotlico dividido clinicamente em efeitos locais e efeitos

sistmicos. Os efeitos locais no so de grande importncia, uma vez que no h
presena de dor, e quando h, de pequena intensidade (Figura 4A). Parastesias
locais ou regionais esto presentes, e podem persistir por tempo variado,
acompanhado de edema discreto ou eritema no local da picada (KUROKOWA e
HONDA, 1983; AZEVEDO-MARQUES et al., 2009).
Os efeitos sistmicos so caracterizados pelas aes: neurotxicas,
miotxicas, nefrotxicas, hepatotxica e alteraes da hemostasia da coagulao
causadas pelo veneno. Precocemente, so observados sintomas como prostao,
mal-estar, nuseas, vmitos, sudorese, sonolncia ou inquietao e sensao de
boca seca (xerostomia) (BRASIL, 1998; 2001).
Os efeitos neurotxicos envolvem face miastnica evidenciada por ptose
palpebral uni ou bilateral, flacidez da musculatura da face, alteraes do dimetro
pupilar (midrase lateral semiparaltica), incapacidade de movimentao do globo
ocular (oftalmoplegia) e viso turva e/ou dupla (Figura 4B, C, D). Tambm podem
ser observadas alteraes no olfato, paladar, diminuies do reflexo de vmito,
dificuldades de deglutio e, um quadro de paralisia veloplatina pode se instalar
(KUROKOWA e HONDA, 1983; CUPO et al., 1988; BARRAVIERA, 1990; BRASIL,
2001). Alteraes neurolgicas em ratas inoculadas com o veneno de Crotalus
durissus terrificus demonstraram a presena de ptose palpebral e midrase bilateral,
dispneia, insensibilidade e paralisia progressiva (PERES et al., 1997a).
Quanto aos efeitos miotxicos do veneno crotlico, a literatura mostra que o
veneno atua predominantemente sobre as fibras musculares esquelticas tipo I, com
liberao de mioglobina e elevao de enzimas como creatino quinase (CK), lactato
desidrogenase (LDH) e aspartato aminotransferase (AST), que so marcadoras de
leso muscular (AZEVEDO-MARQUES et al., 1982; MAGALHES et al., 1986;
HUDELSON e HUDELSON, 1995; JORGE e RIBEIRO, 1992).
A ao nefrotxica decorrente da mioglobinria secundria a rabdomilise
(figura 4E), que leva a formao de cilindros de mioglobina ocasionando a obstruo
tubular. A leso direta dos tbulos renais provocada pela ao txica do veneno
crotlico. A hipocalcemia, hiperfosfatemia, hipotenso arterial e oligria, podem ser
observadas em pacientes com insuficincia renal aguda, caractersticas que levam a
23
falncia renal seguido de dilise (MAGALHES et al., 1986; SOERENSE, 1990;

AZEVEDO-MARQUES et al., 1985).
A B C
D E
Figura 4: Efeito clnico do envenenamento crotlico. Efeito local do envenenamento crotlico

(efeito local discreto) (A). Face Miastnica em indivduos que sofreram envenenamento crotlico (B, C
e D). Em (E) urina caractersticas do quadro de insuficincia renal (nota-se a colorao escura da
urina, devido presena de mioglobina). Fonte: FUNASA, 2001.
Os efeitos na hemostasia da coagulao esto relacionados principalmente

s plaquetas e fatores de coagulao. O veneno crotlico causa hemlise in vitro
quando em contato com hemcias de vrias espcies de animais (ROSENFELD et
al., 1960; 1962; KELEN et al., 1960; 1962). No h reduo do nmero de plaquetas
in vivo, mas ocorre a induo da agregao plaquetria in vitro (JORGE e RIBEIRO,
1988). Uma frao tipo-trombina, do veneno, tem a capacidade de converter
fibrinognio em fibrina, causando afibrinogenemia (NAHAS et al., 1964; AMARAL et
al., 1980). O consumo deste pode resultar no aumento no tempo de coagulao e
incoagulabilidade sangunea (AMARAL et al., 1988; BARRAVIERA, 1990;
NOGUEIRA, 2001) (tabela 1). Apesar das alteraes na coagulao, a presena de
sangramento em indivduos acidentados com Crotalus durissus extremamente
baixa (JORGE e RIBEIRO,1992; NOGUEIRA, 2001).
24
O efeito hepatotxico de Crotalus durissus se deve a dois mecanismos: leso

de mitocndrias e efeito de citocinas, principalmente interleucina-6 (IL-6) e
interleucina-8 (IL-8) nos hepatcitos (BARRAVIEIRA, 1989; 1993). O aumento da
bromossulfalena tem correlao com o aumento dos nveis sricos de alanina-
aminotranferase (ALT) e aspartato-aminotransferase (AST) na maioria dos acidentes
(BARRAVIEIRA et al., 1995). O comprometimento do tecido heptico, congesto e
dilatao de grandes vasos sanguneos, presena de hemossiderina (em 24h) e
trombos contidos em pequenas vnulas foram observados em ratos inoculados com
veneno crotlico,sendo um dos efeitos hepatotxicos (PEREZ et al., 1997b).
Contudo, os efeitos clnicos observados no envenamento crotlico esta
intimamente relacionada composio dos venenos. A estrutura bioqumica destes
tambm est inteiramente ligada idade, sexo, cativeiro e at mesmo nas glndulas
individuais dessas serpentes (FURTADO et al., 1991; FRANCISCHETTI et al., 2000;
AGUILAR et al., 2007). As variaes ontognicas e sazonais, tambm so
condies que contribuem diversidade molecular e complexidade dos venenos
(FURTADO et. al., 2003; FERREIRA et al., 2010b).
A presena de isoformas e variaes nos venenos do gnero Crotalus ssp.
so tambm de grande relevncia clnica, devido ao argumento de que o pool de
veneno utilizado para a produo de antiveneno pode ser inadequada, levando
baixa imunogenicidade em animais produtores e resultando em um produto que no
neutralize adequadamente as manifestaes clnicas dos pacientes acometidos por
envenenamento por estas serpentes (FAURE e BON, 1987, 1988; BOLDRINI-
FRANA et al., 2010). Estudos de Calvete e colaboradores (2009) sugerem que a
heterogeneidade inter e intra-especfica dos venenos podem resultar em diferenas
nos sintomas clnicos apresentados pelos indivduos picados por serpentes da
mesma espcie, porm, de diferentes regies geogrficas. Em virtude disso, o
estudo dos efeitos txicos que cada subespcie de serpente de Crotalus ssp. causa
de grande importncia e objeto de estudo no presente trabalho.
25
Tabela 1: Principais efeitos do envenenamento crotlico*

Manifestaes clnicas
Tempo aps a picada Anlise laboratorial**
Locais Sistmicas
TC Normal ou
Precoces Edema /dor ausentes Nuses, vmitos, CK LDH AST
ou discretos sudorese, Mioglobina srica
sonolncia Mioglobinria(urina
vermelha/marron)
Mionecrose
Ptose palpabral
Diploidia
Fceis miastenica Creatinina, Uria
Tardias Ausentes Turvao visual
Oligria e/ou Anria Acido rico, Potssio
Gengivorragia
IRA (NTA)
Complicaes Ausentes Insufucuncia Necrose Tubular Aguda (NTA)
respiratria aguda Hipercatablica
(raramente)
*Fonte: adaptado, AZEVEDO-MARQUES, 2003.

**TC Tempo de Coagulao; CK- Creatinoquinase; LDH Lactato Desidrogenase; AST Aspartato
Aminotranferase; IRA Insuficincia Renal Aguda; NTA Necrose Tubular Aguda.
1.5. Prognstico e Tratamento dos acidentes crotlicos
Os acidentes ofdicos por serpentes do gnero Crotalus so tratados com a

administrao de soroterapia heterloga, como o soro antiofdico antibotrfico-
crotlico (SABC) ou soroterapia especfica anticrotlica (SAC) cujo objetivo
neutralizar a maior quantidade possvel de veneno circulante, o mais rpido possvel
(BRASIL,1987).
Porm, reaes soroterapia podem aparecer, incluindo reaes anafilticas
(reaes de hipersensibilidade imediata sistmica-tipo I com participao de
mediadores inflamatrios liberados de mastcitos e basfilos e IgE), reaes
anafilactides (reao semelhante a anafiltica sem participao de imunoglobulinas
na hipersensibilidade) e reaes pirognicas (CUPO et al., 1991; LOUZADA;
OLIVEIRA e SARTI 2003). Os sinais e sintomas podem ser urticria, prurido,
26
tremores, dispnia, tosse e nuseas (BRASIL, 1998). Algumas das reaes

provocadas pela soroterapia crotlica podem ser prevenidas com a administrao
prvia de antagonistas de receptores H1 e H2 como a dextroclorfeniramina,
prometazina, cimetidina, ranitidina e, corticoesterides, como a hidrocortisona, de 10
a 15 minutos antes da administrao do soro (BRASIL,1990).
O soro imunobiolgico deve ser administrado de acordo com a gravidade do
acidente, sendo este o mais precoce possvel a fim de evitar a complicao mais
temida deste tipo de acidente, a IRA (Insuficincia Renal Aguda) (AZEVEDO-
MARQUES; HERING; CUPO, 2003).
27
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Comparar os efeitos locais e sistmicos induzidos pelos venenos das

serpentes Crotalus durissus collilineatus, Crotalus durissus terrificus e Crotalus
durissus cascavella em camundongos.
2.2. Objetivos especficos
Caracterizar bioquimicamente os venenos: cromatografia lquida de alta

eficincia (CLAE), SDS-PAGE a 12,5% e/ou 15% e determinao quantitativa
de protenas.
Caracterizar enzimaticamente os venenos: determinao da atividade
proteoltica, atividade fosfolipsica e atividade de LAAO.
Caracterizar os efeitos locais e sistmicos dos venenos in vivo tais como:
- Induo do edema.
- Quantificao dos marcadores de atividade miotxica pelo uso de
parmetros bioqumicos como CK total, CKMB e LDH.
- Quantificao dos marcadores de atividade hepatotxica pelo uso de
parmetros bioqumicos como AST, ALT, Fosfatase Alcalina e GGT.
- Quantificao dos marcadores de atividade nefrotxica pelo uso de
parmetros bioqumicos como uria, Creatinina e Proteinria.
- Avaliao da coagulao in vivo pelos ensaios de TAP e TTPA.
28
3. Material e Mtodos
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, de pesos compreendidos

entre 18 a 22 g, mantidos sob temperatura e perodo de luz controlados, com gua e
alimentao ad libitum at o momento dos experimentos.
3.2. Comit de tica
Os estudos foram realizados segundo as normas determinadas pela

Comisso de tica de Utilizao de Animais de Experimentao (CEUA-2012/09) da
FIOCRUZ-RO.
3.3. Veneno
Foi utilizado uma mistura de cada veneno bruto extrado de vrios

exemplares adultos das serpentes Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus
collilineatus e Crotalus durissus cascavela, fornecido pelo Instituto Butantan, So
Paulo-SP e mantido refrigerado (-20C) no Banco de Venenos Amaznicos do
CEBio-UNIR-FIOCRUZ-RO (autorizao: CGEN/CNPq 010627/2011-1 e IBAMA
27131-2).
3.4. Concentrao do veneno utilizada
Para os ensaios de miotoxicidade, nefrotoxicidade, hepatotoxicidade e de

coagulao, os venenos foram diludos a uma concentrao de 100 g/Kg em 30 L
soro fisiolgico 150 mM estril, filtrado em membrana 0,22 m e mantido a 4oC at o
momento do uso.
29
3.5. Caracterizao Bioqumica dos venenos

3.5.1. Cromatografia
O perfil cromatogrfico dos venenos de Crotalus durissus terrificus, Crotalus

durissus collilineatus e Crotalus durissus cascavella foi realizado por meio de
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) em sistema Akta Purifier (GE). A
metodologia foi realizada de acordo com Bercovici e colaboradores (1987), no qual
aproximadamente 35 mg dos venenos foram suspensos em 1 mL de tampo
formiato de amnio 0,05M, pH 3,5 e centrifugados a 2205 xg durante 5 minutos. O
sobrenadante foi submetido ao fracionamento utilizando a tcnica de cromatografia
de excluso molecular, em coluna de gel filtrao Sephadex G-75 GE healthcare
(10 x 60 cm) previamente equilibrada com o mesmo tampo, em 4 volumes de
coluna, sob fluxo de 0,2mL/minuto. A eluio foi monitorada a 280 nm e as fraes
coletadas manualmente em tubos falcon de 50 mL a temperatura ambiente. Os picos
obtidos foram analisados quanto ao peso molecular por SDS-PAGE em gel de
poliacrilamida de 12,5% e/ou 15% e o rendimento das fraes foi realizado pela
dosagem proteica pelo mtodo Bio-Rad DC Protein Assay (BIO-RAD).
3.5.2. Eletroforese gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% e 15%
A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada de acordo com a

metodologia descrita por Laemmli (1970), em que as placas de poliacrilamida
(PAGE) so feitas de modo descontnuo. O gel de concentrao de 5% e o gel de
corrida de 12,5% e 15% de poliacrilamida estoque (30%T, 0,8%C). Para o gel de
concentrao, foi usado o tampo Tris-HCl 0,5M, pH 6,8, enquanto que para o gel
de corrida foi usado o tampo Tris-HCl 1,0M, pH 8,8. Em ambos os gis foram
acrescentados 0,1% (v/v) de SDS 20%. A corrida eletrofortica foi realizada em um
Sistema Electrophoresis Power Supply EPS 301 (AMERSHAM PHARMACIA
BIOTECH). As amostras foram dissolvidos em gua destilada estril, 10L dessa
soluo foram adicionadas a 10 L de tampo para amostra (Tris-HCL 0,5 M, pH
6,5, contendo azul de bromofenol 0,01% e SDS 2%) e submetidas ao aquecimento a
100C durante 5 minutos. A corrida eletrofortica foi realizada usando-se uma
amperagem constante de 40 mA, durante 180 minutos em tampo Tris-Glicina. As
30
bandas foram evidenciadas com soluo de Coomassie Blue G-250 0,08% (m/v),
sulfato de alumnio 8,0% (m/v), cido o-fosfrico 1,6% (m/v) e metanol 20,0% (v/v)
pelo perodo de 1 horas. O excesso de corante foi removido em soluo contendo
etanol 4,0% e cido actico 7,0% (v/v) em gua. Vrias trocas desta soluo foram
realizadas at a obteno de gel de colorao adequada. A imagem dos gis foi
obtida com uso de equipamento Image Scanner (GE Healtheare Lifesc).
3.5.3. Determinao quantitativa de protenas
A dosagem de protenas das fraes coletadas da cromatografia dos

venenos foi realizada segundo mtodo Bio-Rad DC Protein Assay (BIO-RAD). O
ensaio baseado na reao da protena com uma soluo de tartarato de cobre
alcalino e reagente de Folin. O mtodo foi adaptado para microplacas, sendo
utilizados 25 L da soluo A (soluo de tartarato de cobre alcalino), 200 L da
soluo B (soluo diluda do reagente Folin) e 5 L de amostra, incubados a 37C
durante 15 minutos. A leitura foi realizada em espectrofotmetro Econ (Biotek) em
absorbncia de 750 nm.
3.6. Caracterizao enzimtica dos venenos

3.6.1. Atividade Proteoltica
A atividade Proteoltica foi realizada segundo adaptao do mtodo proposto

por Pande e colaboradores (2006) em placas de 96 poos. Neste experimento, 150
L de soluo de Azocasena 2% (substrato) foi adicionada a 7 L de cada veneno
(20 g de Cdt, Cdcolli e Cdcasc) e incubado por 1 hora a 37C. Subsequentemente,
a reao (Azocasena + enzima) foi interrompida pela adio de 150 L de cido
Tricloractico 20% (TCA). Aps 30 minutos, as amostras foram centrifugadas por 10
minutos a 180 xg. Em seguida, 100l do sobrenadante de cada amostra foi
adicionado a placa de 96 poos, no qual foi acrescentado 100L de NaOH 500mM.
A leitura foi realizada em espectrofotmetro Econ (Biotek) com absorbncia de
440nm.
31
3.6.2. Atividade Fosfolipsica
A atividade fosfolipsica foi determinada utilizando mtodo descrito por

Holzer e Mackessy (1996) adaptado para placa de 96 poos. Neste experimento,
190 L de soluo tampo Tris 10mM, CaCl2 10mM, NaCl 100mM (pH 8.0)
contendo o substrato cromgeno cido 4-nitro-(3-octanoiloxi) benzico (4N3OAB) foi
adicionado a 10 L de amostras (20 g de Cdt, Cdcolli e Cdcasc) ou de gua
(controle negativo). A soluo foi incubada a 37C e a leitura foi realizada em
espectrofotmetro Econ (Biotek) a 440nm em intervalos de 30 segundos durante 30
minutos.
3.6.3. Atividade de LAAO
Para a atividade de LAAO nos venenos, seguiu-se o mtodo descrito por

Torii e colaboradores (1997) adaptado para placa de 96 poos. Para o experimento,
200 L de soluo de leucina 2% em tampo de Tris-HCl 20mM contendo NaCl
150mM e CaCl 5mM foi adicionado a 2L de peroxidase (1g) e 5L de soluo de
veneno (20 g Cdt, Cdcolli e Cdcasc). Imediatamente a leitura foi realizada em
espectrofotmetro Econ (Biotech), 450 nm. No ensaio a peroxidase utilizada para
reagir com H2O2 produzido pela ao da LAAO, seguido de uma reao com o O-
phenylenediamine (OPD), gerando um subproduto solvel e colorido.
3.7. Caracterizao dos efeitos locais e sistmicos Modelo in vivo

3.7.1. Induo do edema
Para a determinao da atividade edematognica, grupos de cinco

camudongos Swiss machos foram inoculados via intradrmica (i.d), na regio do
coxim plantar da pata posterior direita, com 30 L de solues com os respectivos
venenos (100g/Kg de Cdt, Cdcolli e Cdcasc diludos em soro fisiolgico 150 mM
estril). A mensurao da espessura da pata foi realizada antes da inoculao das
amostras (basal, tempo oh). Como controle foi utilizado apenas soluo fisiolgica
estril (30L) injetada na pata contra lateral, as quais tambm foram medidos. Em
seguida, a mensurao das patas foi realizada em diferentes intervalos de tempo
aps as administraes, 0,5, 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas. O aumento da espessura da
pata foi medido com o auxlio de um Plestismmetro (Ugo Basile 7041). Para
32
obteno da porcentagem de aumento, foi realizada a diferena das duas patas

usando a seguinte frmula, PT (Pata Teste) - PC (Pata Controle)*100. Os resultados
foram expressos em %.
3.7.2. Modelo experimental dos ensaios de miotoxicidade, hepatotoxicidade e

nefrotoxicidade in vivo
Injeo de 100g/Kg (i.m.) dos venenos

de Crotalus durissus terrificus, Crotalus
durissus collilineatus e Crotalus
durissus cascavella diludos em 30L de
soro fisiolgico 150mM estril no Grupos de 5 camudongos
musculo gastrocnmico direito dos mantidos em gaiolas
camudongos. metablicas por 3, 6, 9,
12 e 24 horas
Coleta de sangue Urina foi coletada e

pelo plexo orbital acondicionada em
e acondicionado recipientes plsticos,
em tubos mantida refrigerada at o
heparinizados momentao das dosagens.
Centrifugao a
2205 xg /5min
Os testes foram realizados Os testes na urina

com reagentes cinticos ou foram realizados com
colorimtricos (Labtest) reagentes cinticos e
Obteno do Plasma para avaliar a miotoxicidade, colorimtricos (Labtest)
hepatotoxicidade e para avaliar a
nefrotoxicidade induzidas nefrotoxicidade.
pelos venenos.
OBS: o grupo Controle recebeu apenas 30L de soro fisiolgico 150mM

inoculados no musculo gastrocnmico direito
33
3.7.3. Determinao da atividade miotxica
A atividade miotxica foi avaliada pela determinao enzimtica de

creatinoquinase srica (CK-Total), creatinoquinase srica frao MB (CK-MB) e
Lactato Desidrogenase (LDH) no soro de animais (grupos de 5) que receberam via
i.m. os venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc (30 L de soro fisiolgico 150 mM estril
contendo 100g/Kg de veneno). Os animais controles receberam apenas 30L de
soro fisiolgico estril, nas mesmas condies experimentais. Aps 3, 6, 9, 12 e 24
horas, o sangue destes foi coletado pelo plexo orbital, depositado em tubos
heparinizados e centrifugados a 2205 xg por 5 minutos.
A atividade creatinoquinase foi determinada com sistema para determinao
quantitativa da Creatinoquinase Total CK-NAC Liquiform (Labtest, Ref.: 117). Em
seguida, 5L de plasma foi incubado durante 3 min a 37C com 250L do reagente
de trabalho (RT). A leitura foi realizada em espectofotmetro, no comprimento de
onda de 340 nm. O resultado foi expresso em U/L conforme orientao do
fabricante. A atividade da frao CK-MB foi realizada com sistema para
determinao da isoenzima MB da Creatino Quinase em mtodo cintico CK-MB
Liquiform (Labtest, Ref.: 118). Foram adicionados 200L de RT a 10L de amostra
(plasma). A leitura foi realizada em espectofotmetro, no comprimento de onda de
340 nm. O resultado foi expresso em U/L conforme orientao do fabricante. A
Desidrogenase Lctica (LDH) foi dosada com sistema para determinao da
Desidrogenase Lctea por mtodo cintico LDH Liquiform (Labtest, Ref.: 86). Foram
adicionados 250L de RT a 5L de amostra (plasma). A leitura foi realizada em
espectofotmetro, no comprimento de onda de 340 nm. O resultado foi expresso em
mg/dL conforme orientao do fabricante.
3.7.4. Determinao da atividade hepatotxica
A atividade hepatotxica foi determinada pela dosagem dos nveis sricos de

alanino-aminotransferase (ALT), da aspartato-aminotransferase (AST), da fosfatase
alcalina e da gama-glutamil-transpeptidase (GGT), no plasma de animais inoculados
via i.m. com os venenos de Cdt, Cdcolli e Ccasc (30 L de soro fisiolgico 150 mM
estril contendo 100g/Kg de veneno). Os animais controles receberam 30L de
soro fisiolgico estril, nas mesmas condies experimentais. Aps 3, 6, 9, 12 e 24
34
horas, o sangue foi coletado pelo plexo orbital, depositado em tubos heparinizados e
centrifugados a 2205 xg por 5 minutos.
As dosagens dos marcadores de leso heptica foram realizadas com o uso
de kits diagnstico LABTEST. A atividade ALT foi dosada com sistema para
determinao da Alanina Aminotransferase ou Trasaminase Glutmica Pirvica em
modo cintico ALT/GPT Liquiform (Labtest, Ref.: 108). Foram adicionados 200L de
RT a 20L de amostra (plasma). A dosagem de AST foi realizada com sistema para
determinao da Aspartato Aminotransferase ou Transaminase Glutmica
Oxalactica em modo cintico AST/GOT Liquiform (Labtest, Ref.: 109). O
procedimento consistiu em adicionar 200L de RT a 20L de amostra (plasma). A
atividade da GGT foi avaliada com sistema para determinao quantitativa da
atividade da -Glutamil Transferase em modo cintico GAMA GT Liquiform (Labtest,
Ref.: 105). Para dosagem, foram adicionados 200L de RT a 10L de amostra
(plasma). A atividade da fosfatase alcalina (FAL) foi feita utilizando-se sistema para
determinao da fosfatase alcalina por mtodo cintico de tempo fixo e medio de
ponto final Fosfatase alcalina (Labtest, Ref.: 40). Para a dosagem, misturou-se 10L
de amostra (plasma) a uma soluo previamente incubada a 37C durante 2 minutos
de substrato (n1) e tampo (n2) e incubou-se por 10 minutos a 37C. Acrescentou-
se 400L do reagente de cor (n3).
A densidade ptica das transaminases (AST/ALT) foi medida em
espectrofotmetro a 340nm, enquanto a GGT e a Fosfatase Alcalina, em 450 nm e
550nm respectivamente. Os resultados foram expressos em U/L (AST, ALT e GGT)
e mg/dL (FAL), conforme orientao do fabricante.
3.7.5. Determinao da atividade nefrotxica
A atividade nefrotxica foi avaliada pela quantificao dos nveis de

creatinina e uria no plasma de animais (grupos de 5) que receberam via i.m. os
venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc (30 L de soro fisiolgico 150 mM estril contendo
100g/Kg de veneno). Os animais controles receberam apenas 30L de soro
fisiolgico estril, nas mesmas condies experimentais. Aps 3, 6, 9, 12 e 24 horas,
o sangue destes foi coletado pelo plexo orbital, depositado em tubos heparinizados e
centrifugados a 2205 xg por 5 minutos. A urina detes animais tambm foi coletada
para as dosagens de uria, creatinina e protena urinrias.
35
A dosagem de creatinina foi feita com kit Creatinina cintica K067 (Bioclin).
Foram adicionados 200L de RT a 20L de amostra (plasma ou urina diluda 1:50).
A leitura foi realizada em espectrofotmetro a 510nm. A dosagem de uria foi
realizada utilizando-se sistema enzimtico-colorimtrico para determinao de uria
por reao de ponto final Urria CE (Labtest). O procedimento experimental
consistiu em adicionar em microtubos 5L de amostra (plasma ou urina diluda 1:50)
mais 500L de RT (urese tamponada). A mistura foi homogeneizada e incubada a
37C durante 5 minutos. Em seguida, 500L de oxidante de uso foram adicionados
mistura inicial e mais 5 minutos de incubao foram aguardados. Aps incubao,
200L das solues foram postos em placa de 96 poos e a leitura da absorbncia
feita em espectrofotmetro a 600nm. A excreo de protenas na urina foi avaliada
com sistema para determinao de protenas na urina por reao de ponto final
Sensiprot (Labtest). Para dosagem foram adicionados 10L de amostra a 200L do
reagente de cor. A mistura foi incubadada durante 5 minutos a 37C e, ento, a
leitura foi feita em espectrofotmetro a 600nm. Os resultados foro expressos em
mg|dL, conforme orientao do fabricante.
36
3.8. Avaliao do efeito dos venenos sobre o sistema de coagulao Modelo

experimental in vivo
Injeo de 100g/Kg (i.m.) dos venenos

de Crotalus durissus terrificus, Crotalus
durissus collilineatus e Crotalus
durissus cascavella diludos em 30L de
soro fisiolgico 150mM estril no
musculo gastrocnmico direito dos
camudongos.
Grupos de 5 camudongos
mantidos por 3 horas de
experimentao
Os camundongos foram
anestesiados e o sangue Centrifugao a
foi coletado pela veia cava 2205 xg /15min
inferior e acondicionados
em tubos citratados.
Obteno do Plasma
Os testes foro realizados com

reagentes da Labtest tais como
Tempo de Protrombina Ativada
(TAP) e Tempo de Tromboplastina
Parcialmente Ativada (TTPA) e, em
seguida medidos pelo uso de um
coagulmetro (Clotimer).
OBS: o grupo Controle recebeu apenas 30L de soro fisiolgico 150mM

inoculados no musculo gastrocnmico direito
37
3.8.1. Determinao das Provas de coagulao in vivo
Para determinar as provas de coagulao, os animais (grupos de 5) foram

inoculados via i.m. com os venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc (30 L de soro
fisiolgico 150 mM estril contendo 100g/Kg de veneno). Os animais controles
receberam apenas 30L de soro fisiolgico estril, nas mesmas condies
experimentais. Aps 3 horas, os animais foram anestesiados e o sangue destes foi
coletado pela veia cava inferior, depositado em tubos citratados e centrifugados a
2205 xg por 15 minutos para obteno de plasma pobre em plaquetas. A atividade
Protrombnica (TAP) e Atividade Protrombnica Parcialmente Ativada (TTPA) foi
realizada com o uso de kits diagnstico LABTEST. Para realizao de TTPA foi
adicionado 50L de Reagente 1 a 50L de plasma citratado (pr-incubado a 37C)
homogeneizado e incubado a 37C por 3-5 minutos. Em seguida adicionou-se 50L
de Reagente 2 (previamente incubado a 37C), neste momento o cronmetro deve
ser disparado. A reao deve ser mantida incubada a 37C por mais 15 a 20
segundos, aguardando a formao do cogulo. Finalizar o cronmetro e verificar o
tempo ocorrido. Para a determinao de TAP, foi adicionado 100L de Reagente 1
(previamente incubado a 37C) a 50L de plasma citratado (previamente incubado a
37C) e em seguida, disparar o cronmetro. A reao foi mantida incubada a 37C
por 9 segundos at a formao do cogulo. Finalizar o cronmetro e verificar o
tempo ocorrido. O tempo de coagulao do plasma de cada dosagem foi medido
com aparelho Coagulmetro da CLOTIME. Os resultados foram expressos em
segundos, conforme orientao do fabricante.
3.9. Anlise estatstica
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente pela Anlise de

Varincia (ANOVA one-way analyses of variance), utilizando o programa
estatstico GraphPad Prism 5.0. Os resultados obtidos foram expressos como mdia
erro padro da mdia (EPM). Foram considerados significativos os valores de p <
0,05.
38
4. Resultados
4.1. Caracterizao Bioqumica dos venenos

4.1.1. Perfil cromatogrfico dos venenos de Crotalus durissus terrificus,
Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus cascavella
O fracionamento dos venenos por cromatografia de excluso molecular em

coluna de gel de filtrao Sephadex G-75 resultou na coleta de trs picos (figura 5),
que foram denominados P I, P II e P III do veneno de Crotalus durissus terrificus
(Cdt), e D I, DII e DIII no fracionamento do veneno de Crotalus durissus collilineatus
(Cdcolli) (figura 7). O fracionamento do veneno de Crotalus durissus cascavella
(Cdcasc) resultou na coleta de dois picos (figura 9), que foram denominados B I e B
II. Todas as fraes, assim como os respectivos venenos foram submetidas a
analise por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 12% e/ou 15%.
P ii
Ctx
P iii
Ctm
PI
Cvx/Grx
Figura 5. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus por excluso molecular.
35 mg do veneno bruto foi submetido a uma coluna Sephadex G-75 (10x60 cm, GE Healthcare), previamente
equilibrada com tampo formiato de amnio 0,05 mM, pH 3,5. O monitoramento de todas as fraes eluentes foi
realizado em absorbncia de 280 nm, com fluxo de 0,2 ml/minuto, temperatura ambiente. Os picos I, II e III
correspondem a Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx), Crotoxina (Ctx) e Crotamina (Ctm), respectivamente.
39
O perfil eletrofortico do veneno de Cdt e de suas fraes, indicam a presena

das toxinas Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx), provavelmente juntas em P I, a crotoxina
(Ctx) em P II e, a crotamina (Ctm) em P III (figura 6). No veneno de Cdcolli, tambm foi
observado a presena de Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx), provavelmente juntas em D I,
a crotoxina (Ctx) em D II e, a crotamina (Ctm), em D III (figura 8). O perfil eletrofortico
do veneno de Cdcasc revelou apenas as toxinas Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx) e
crotoxina (Ctx) indicadas pelas fraes B I e B II (figura 10). Todas as toxinas dos
respectivos venenos, foram comparadas ao padro de peso molecular (PM) para
averiguar a massa molecular aproximada, sendo a Cvx com ~72 kDa, Grx com ~30 kDa,
Ctx com~24 kDa e Ctm com ~4,8 kDa.
40
PM VCdt PI P II P III
A kDa
150
100
Cvx
80
60 Grx
40
Ctx
30
25
15
10
kDa PM VCdt P III

B
150
100
80
60
40
30
25
15
Ctm
10
Figura 6. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus.
A eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 12,5% em (A) e 15% em (B) com agente desnaturante
(SDS-PAGE) foi realizada segundo a tcnica descrita por Laemmli (1970) para a determinao de peso
molecular. O gel realizado com as fraes provenientes da cromatografia do veneno bruto corresponde aos picos
coletados, sendo identificados como PM (peso molecular), VCdt (veneno bruto de Crotalus durissus terrificus), P
I, P II e P III em (A); em (B) PM (peso molecular), VCdt (veneno bruto de Crotalus durissus terrificus) e P III. As
toxinas so evidenciadas pelas setas em P I (convulxina (Cvx) com ~72 kDa e giroxina (Grx) com ~30 kDa), P II
(crotoxina (Ctx) com~24 kDa) e P III (crotamina (Ctm) com ~4,8 kDa).
41
D ii
Ctx
D iii
Ctm
DI
Cvx/Grx
Figura 7. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus por excluso
molecular. 35 mg do veneno bruto foi submetido a uma coluna Sephadex G-75 (10x60 cm, GE Healthcare),
previamente equilibrada com tampo formiato de amnio 0,05 mM, pH 3,5. O monitoramento de todas as fraes
eluentes foi realizado em absorbncia de 280 nm, com fluxo de 0,2 ml/minuto, temperatura ambiente. Os picos
1, 2 e 3 correspondem a D I Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx), D II Crotoxina (Ctx) e D III Crotamina (Ctm)
respectivamente.
kDa PM VCdcolli DI D II D III

150
100
80 Cvx
60
40
Grx Ctx
30
25
15
Ctm
10
Figura 8. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de Crotalus durissus

collilineatus. A eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 15% com agente desnaturante (SDS-
PAGE) foi realizada segundo a tcnica descrita por Laemmli (1970) para a determinao de peso molecular. O
gel realizado com as fraes provenientes da cromatografia do veneno bruto corresponde aos picos coletados,
sendo identificados no gel como PM (peso molecular), VCdcolli (veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus),
D I, D II e D III. As toxinas so evidenciadas pelas setas em D I (Cvx com ~72 kDa e Grx com ~30 kDa), D II (Ctx
com~24 kDa) e D III (Ctm com ~4,8 kDa).
42
B ii
Ctx
BI
Cvx/Grx
Figura 9. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus cascavella por excluso molecular.
35 mg do veneno bruto foi submetido a uma coluna Sephadex G-75 (10x60 cm, GE Healthcare), previamente
equilibrada com tampo formiato de amnio 0,05 mM, pH 3,5. O monitoramento de todas as fraes eluentes foi
realizado em absorbncia de 280 nm, com fluxo de 0,2 mL/minuto, temperatura ambiente. Os picos 1 e 2
correspondem a B I Convulxina (Cvx)/Giroxina (Grx) e B II Crotoxina (Ctx) respectivamente.
kDa PM VCdcasx BI B II
150
100
Cvx
80
60
40 Grx
Ctx
30
25
15
10
Figura 10. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de Crotalus durissus
cascavella por excluso molecular. A eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 15% com
agente desnaturante (SDS-PAGE) foi realizada segundo a tcnica descrita por Laemmli (1970) para a
determinao de peso molecular. O gel realizado com as fraes provenientes da cromatografia do veneno bruto
corresponde aos picos 1 e 2 coletados, sendo identificados no gel como PM (peso molecular ), VCdcasc
(veneno bruto de Crotalus durissus cascavella), B I e B II. As toxinas so evidenciadas pelas setas em B I
(convulxina (Cvx) com ~72 kDa e giroxina (Grx) com ~30 kDa) e B II (crotoxina (Ctx) com~24 kDa).
43
4.1.2. Determinao da quantidade de Protenas nos venenos
A partir do fracionamento dos venenos, feita pela cromatografia de

excluso molecular em coluna de gel de filtrao Sephadex G-75, foi realizada uma
estimativa da concentrao em porcentagem do contedo proteico de cada pico
realizado segundo mtodo Bio-Rad DC Protein Assay (BIO-RAD). Desse modo, a
concentrao estimada de PI, PII e PIII, no veneno de Cdt, foram de 2%, 81% e 16%
respectivamente. Em DI, DII e DIII, no veneno de Cdcolli foram de 6%, 67% e 27%
respectivamente. J em BI e BII no veneno de Cdcasc foram de 18% e 82%
respectivamente. O veneno de Cdcasc, por sua vez, no possue Crotamina,
conforme mostra a figura.
Figura 11. Rendimento das fraes obtida pela cromatografia dos venenos de C. d. terrifius, C.
d. collilineatus e C. d. cascavella. Baseada nas dosagens proteica (DC Protin Assay BIO RAD)
realizadas nas fraes obtidas pela cromatografia de excluso molecular em coluna de gel de filtrao
Sephadex G-75 dos venenos, estim ou-se uma concentrao em porcentagem dos respectivos picos. Cdt
P I 2%, P II 81% e PIII 16%; Cdcolli D I 6%, D II 67 % e D III 27%; Cdcasc BI 18% e BII 82 %
respectivamente.
44
4.2. Caracterizao enzimtica dos venenos
4.2.1. Atividade Proteoltica
Para a anlise da protelise entre os venenos Cdt, Cdcolli e Cdcasc, in vitro, foi
realizado o teste de atividade proteoltica usando como substrato a Azocasena.
Como controle negativo foi utilizado gua destilada e, como controle positivo, o
veneno de Bothrops atrox. Os resultados demonstraram ausncia de reao dos
venenos Cdt, Cdcolli e Cdcasc perante o substrato usado. No houve diferenas
estatsticas quando os venenos foram comparados entre si e com o grupo controle
negativo, porm quando comparados com o veneno de Bothrops atrox (controle
positivo), percebe-se diferenas estatsticas, sendo observadas pelo aumento da
D.O. (figura 11).
0.20
Atividade Proteoltica
0.15 ***
D.O. 440nm
0.10
0.05
0.00
e
us
s
ox
lla
ol
cu
ve
at
tr
tr
fi
.a
ne
on
ca
ri
er
B
as
C
lil
.t
ol
.c
.d
.c
.d
C
.d
C
C
Figura 12. Determinao da atividade proteoltica dos venenos C. d. terrificus, C. d. collilineatus e

C. d. cascavella sobre a Azocasena. Os resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA).
Como controle positivo foi utilizado o veneno de Botrops atrox. Os dados foram expressos como mdia
EPM e representam a D.O. da leitura. Houve significncia estatstica (***p<0,001) do veneno de B. atrox
quando comparado com o grupo controle e com os demais venenos, porm, no houve significncia
estatsticas quando os venenos foram comparados entre si e com o grupo controle.
45
4.2.2. Atividade fosfolipsica
A atividade fosfolipsica direta, utilizando 4N3OAB como substrato,

demostrou que o veneno de Cdcolli no possui atividade fosfolipsica na
concentrao testada (20 g). Em contrapartida, os venenos de Cdcasc e Cdt (20
g) apresentaram atividade de catlise sobre o substrato testado, o que pode ser
observado pelo aumento da D.O. em 425nm (Figura 12), sendo o veneno de Cdcasc
o de maior intensidade.
0.15
Controle
C.d.terrificus
Atividade Fosfolipsica
C.d. collilineatus
0.10
D.O. 425 nm
C.d. cascavella
0.05
0.00
0 10 20 30
Tempo
Figura 13. Determinao da atividade fosfolipsica dos venenos C. d. terrificus, C. d. collilineatus e

C. d. cascavella. Os resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA). Os dados representam a
D.O. da leitura.
46
4.2.3. Atividade de LAAO
O teste de LAAO revelou que os venenos de Cdcolli e Cdcasc (20 g)

possuem atividade significativa demonstrando a reao da peroxidase com H2O2
produzido pela ao da enzima, como pode ser observado pelo aumento da D.O. em
450 nm, conforme a figura 13. Em contrapartida, o veneno de Cdt no possui
atividade de LAAO significativa na concetrao testada (20 g).
0.15
Atividade de LAAO
*** ***
0.10
D.O
0.05
0.00
s
s
e
la
tu
cu
ol
l
ve
tr
ea
fi
on
ca
ri
in
er
as
C
lil
.t
ol
.c
.d
.c
.d
C
.d
C
C
Figura 14. Determinao da atividade de L-aminocido-oxidase dos venenos C. d. terrificus, C. d.

collilineatus e C. d. cascavella. Os resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA). Os
dados foram expressos como mdia EPM e representam a D.O. da leitura. Houve significncia
estatstica (***p<0,001) nos venenos de Cdcolli e Cdcasc quando comparados com o controle.
47
4.3. Caracterizao dos efeitos locais e sistmicos modelo in vivo
4.3.1. Induo do edema
A inoculao de Cdt, Cdcolli e Cdcasc no coxin intraplantar induzem a

formao de edema na pata dos camundongos. Os venenos de Cdcolli e Cdcasc
apresentaram um pico de atividade edematognica a partir de 1 hora, sendo o
primeiro com 76,7% e o segundo, com 40% de aumento. Ambos os venenos
diminuram a atividade aps 3 horas de experimento mantendo-se reduzido at a
24h. Em contrapartida, o veneno de Cdt teve atividade com 3 horas de experimento,
revelando aumento de 33,3%, diminuindo aps 6 h de experimento. Este tambm se
manteve reduzido at a 24h. Comparando os venenos entre si, verifica-se que em 1
hora, o veneno de Cdcolli possui diferena estatstica de 36,7% em relao ao
veneno de Cdcasc, e 50% de aumento em relao ao veneno Cdt. O veneno de
Cdcasc possui diferena estatstica de 13,3% em relao ao veneno de Cdt.
Avaliando o tempo de 3 h, o veneno de Cdt teve significncia estatstica de 10% em
relao ao veneno de Cdcolli e 13,3% em relao ao veneno de Cdcasc (figura 14).
150
C. d. terrificus
Atividade edematognica
C. d. collilineatus
100 C. d. cascavella
***
(%)
50 *
*
0
12
24
0
9
5
0,
horas
Figura 15. Efeito edematogenico induzido pelo veneno das serpentes C. d. terrificus, C. d.
collilineatus e C. d. cascavella em camundongos. O grfico mostra o decurso temporal da
atividade edematognica induzida pelos venenos das serpentes (100 g/Kg). Os dados foram
expressos como mdia EPM (***p<0,001 e *p<0,05) do aumento percentual do volume da pata teste
em relao pata controle (n=5). Houve significncia estatstica quando os venenos foram
comparados entre si.
48
4.3.2. Atividade miotxica
A figura 15 mostra os nveis de creatino-quinase (CK) presente no sangue

dos animais aps a injeo i.m. de 100g/Kg de veneno bruto em camundongos
Swiss. Quando comparados ao grupo controle (480,4 U/L), que recebeu apenas
injeo i.m 30 L de soro fisiolgico estril 150mM, o veneno de Cdcolli apresentou
extravasamento mdio de 2791 U/L, Cdcasc de 1511,64 U/L e Cdt de 669,98 U/L em
3h de experimentao. Ainda comparando com o grupo controle (182,3 U/L), o
veneno de Cdcolli revelou extravazamento mdio de 2007,08 U/L, Cdcasc com
1597,21 U/L e Cdt com 910,72 U/L em 6 h de experimento. Em 9 h, o grupo controle
teve extravasamento mdio de CK de 388,2 U/L, enquanto que o veneno de Cdcolli
teve 2281,39 U/L, Cdcasc com 1669,81 U/L e Cdt com 1666,37 U/L, todos
estatisticamente diferentes do grupo controle. No tempo de 12 h, observaram-se
picos de elevaes nos nveis sricos de CK causados pelos venenos de Cdcasc e
Cdcolli de 3004,86U/L e 2740,9 U/L, respectivamente. O veneno de Cdt apresentou
nveis de 2057,33U/L, estatisticamente diferentemente do grupo controle (239,2U/L).
4000
#
*** Controles
#
3000 C. d.terrificus
*** # C. d.collilineatus
CK-TOTAL
# *** ***
*** C. d.cascavella
(U/L)
2000
***
*** ***
1000 **
0
12
24
3
horas
Figura 16. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e C. d. cascavella
(100 g/Kg) sobre a atividade Miotxica em camudongos swiss. 100g/Kg de veneno diludo em 30
l de soro fisiolgico estril foi inoculado no msculo gastrocnmico direito dos camudongos. Aps 3, 6,
9, 12 e 24 horas a atividade de CK-total foi determinada usando kit cintico CK-NAC (Labtest). Os
resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Os dados foram
expressos como mdia EPM. Houve significncia estatstica nos tempos de 3, 6, 9 e 12 horas
(**p<0,01 e ***p<0,001), quando comparados entre si (#) e com o grupo controle (*).
49
As alteraes do miorcrdio foram avaliadas pelas dosagens de CK-MB (enzima

especfica do msculo cardaco) e LDH sricos. Conforme ilustrado na figura 16A, os
nveis de CK-MB (Creatino-quinase frao MB) mostraram-se alterados aps 3 h de
experimento pelos venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc, com extravasamento mdio da
enzima de 878,3 U/L, 856,7 U/L e 697 U/L respectivamente. Todos estatisticamentes
diferentes do grupo controle que apresentou nveis mdios de 375,3 U/L. No perodo
de 6h e 9h, os venenos de Cdt (406,2 U/L, 136,6 U/L), Cdcolli (216,7 U/L, 130,8 U/L)
e Cdcasc (120,4 U/L, 116,4 U/L) no apresentaram significncia estatstica em
comparao com o controle (266,6 U/L, 120 U/L). Em 12h, os nveis de CK-MB
revelaram extravasamento mdio de 608,1 U/L pelo veneno de Cdcolli e 416,7 U/L
pelo veneno de Cdt, ambos diferentes do grupo controle 191,4 U/L. Em 24h de
experimento, os venenos de Cdcolli (263,2 U/L), Cdcasc (239,3 U/L) e Cdt (153,5
U/L) no apresentaram diferenas estatsticas com o grupo controle (187,9 U/L).
Os nveis de LDH tambm se mostraram elevados em 3h de experimento com
extravasamento mdio de 335,7 mg/dL pelo grupo controle, 1333,6 mg/dL pelo
veneno de Cdt, 1159,1 mg/dL pelo veneno de Cdcolli e 691,4 mg/dL pelo veneno de
Cdcasc, todos estatisticamente diferente do grupo controle. Em 6h, os venenos de
Cdcolli e Cdt tiveram extravasamento mdio de 1132,8 mg/dL e 1056,5 mg/dL
respectivamente, enquanto que o veneno de Cdcasc teve 760,1 mg/dL de alterao
nos nveis sricos de LDH, ambos estatisticamente diferentes do grupo controle
269,6 mg/dL. Os resultados obtidos dos venenos de Cdcasc (571,1 mg/dL), Cdt (548
mg/dL) e Cdcolli (705,1 mg/dL) no tempo de 9h de experimento em comparao com
o grupo controle (233,6 mg/dL) tambm apresentaram diferenas estatsticas. Em
12h de experimento, os venenos de Cdcolli, Cdt e Cdcasc tiveram aumento mdio
de 732,1 mg/dL, 702,1 mg/dL e 477,4 mg/dL respectivamente, ambos diferentes do
grupo controle 306,4 mg/dL como mostra a figura 16B. Em 24h, observa-se reduo
dos nveis de LDH, sendo o veneno Cdt com 442,6 mg/dL, Cdcasc 419,8 mg/dL e
Cdcolli com 393,9 mg/dL. Ambos no apresentaram diferenas estatsticas quando
comparados com o grupo controle (297,5 mg/dL).
50
1000 #
***
Controle
800 C. d.terrificus
C. d.collilineatus
*** C. d.cascavella
600 #
CK-MB
(U/L)
*** ***
400
200
12
24
3
horas
B
2000
Controle
#
C. d. terrificus
***
1500 # C. d. collilineatus
*** C. d. cascavella
(mg/dl)
*** #
LDH
1000
*** *** *** ***
500 *
0
12
24
3
horas
Figura 17. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e C. d.

cascavella sobre ao miocrdio em camudongos swiss. Amostras de plasma heparinizadas foram
coletadas de camudongos aps 3, 6, 9, 12 e 24 h da inoculao i.m. de 100g/Kg dos venenos e soro
fisiolgico estril i.m. no grupo controle. As atividades de CK-MB (A) e de LDH (B) foram
determinadas usando kit cintico CK-MB Liquiform (Labtest) e kit colorimtrico LDH Liquiform
(Labtest). Os resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo.
Os dados foram expressos como mdia EPM. Houve significncia estatstica nos tempos de 3 e 12
horas (a), e 3, 6 e 12 horas (b) (*p<0,05 e ***p<0,001), quando comparados entre si (#) e com o grupo
controle (*).
51
4.3.3. Atividade hepatotxica
A anlise da funo heptica nos camudongos foi realizada pelas dosagens

das enzimas hepticas ALT, AST, GGT e FAL. A figura 17A indica os nveis de
alanina aminotransferase (ALT), tambm chamada de transaminase glutmica
pirvica (GTP ou TGP), enzima presente nos hepatcitos. Em 3h de experimento, os
venenos Cdt (40,4 U/L), Cdcolli (30,2 U/L) e Cdcasc (29,6 U/L) no apresentaram
diferena estatstica quando comparados com o controle (32,4 U/L). Em
contrapartida, a injeo i.m. de soro fisiolgico (controle), em 6h, causou um
extravasamento mdio de ALT/TGP para a circulao sangunea de 34,4 U/L,
estatisticamente diferente do veneno de Cdcasc que teve extravamento mdio de
46,8 U/L. Os demais venenos Cdt (43,9 U/L) e Cdcolli (38,7 U/L) no apresentaram
diferenas estatsticas neste perodo quando comparados com o grupo controle. Em
9h, apenas o veneno de Cdcolli apresentou elevao dos nveis de ALT/TGP com
72,5 U/L, estatisticamente diferente do grupo controle, que apresentou nveis de 32
U/L da enzima. Os demais venenos Cdcasc (23,1 U/L) e Cdt (33,2 U/L) no
apresentaram relevncia estatstica neste perodo. Apenas os venenos Cdcolli e Cdt
mostraram-se elevados com 42,3 U/L e 37,5 U/L respectivamente em 12h. Em
comparao com o controle, 24,1 U/L, estes apresentaram diferenas estatsticas.
J, o veneno de Cdcasc (26,7 U/L) no teve significncia estatstica quando
comparando ao controle. Em 24h, os venenos de Cdcolli, com 43,1 U/L, Cdcasc,
com 55,3 U/L e Cdt (51,5 U/L) se mostraram estatisticamente diferentes do grupo
controle, com 30 U/L.
A figura 17B indica os nveis de aspartato aminotrasnferase (AST), tambm
chamada de transaminase glutmica oxalactica (GOT ou TGO), enzima presente
nas mitocndrias dos hepatcitos e do miocrdio. A injeo i.m. de soro fisiolgico
causou um extravasamento mdio, de AST/TGO, para a circulao sangunea de 64
U/L, estatisticamente diferente dos venenos de Cdcasc, Cdcolli e Cdt que causaram
extravasamento mdio de 222,8 U/L, 153,7 U/L e 132,2 U/L respectivamente, em 3h
de experimento. Em 6h, Cdcasc Cdcolli, e Cdt induziram aumento de AST/TGO
estatisticamente diferentes do controle (48,2 U/L) com 158,2 U/L, 154,8 U/L e 120,8
U/L, respectivamente. Quando comparados com o controle (46 U/L) os venenos
Cdcolli, Cdcasc e Cdt revelaram diferenas estatsticas com extravasamento mdio
de AST/TGO para a circulao de 213,4 U/L, 161,8 U/L e 143 U/L respectivamente,
52
no tempo de 9h. Em 12h, apenas os venenos de Cdcasc e Cdt apresentaram

elevao de 236,3 U/L e 140,8 U/L, respectivamente. O veneno de Cdcolli (92,1 U/L)
no apresentou diferena estatstica se comparado ao grupo controle. Todos os
venenos alteraram os nveis sricos de AST/TGO, o Cdcasc com extravasamento
mdio de 218,3 U/L, Cdt com 212,4 U/L e Cdcolli com 153,3 U/L aps 24h de
experimento, estatisticamente diferente do grupo controle (63,1 U/L).
A
100
Controle
#
C. d. terrificus
80 ***
C. d. collilineatus
#
C. d. cascavella
60 # ***
(U/L)
*
ALT
*
40
20
0
12
24
3
horas
B
300
#
# #
# ***
*** ** Controle
***
200 C. d. terrificus
*** *** ** C. d. collilineatus
(U/L)
**
AST
*** C. d. cascavella
** **
100
0
12
24
3
horas
sobre a funo heptica de camudongos Swiss. Foram usadas amostras de plasma coletadas de
grupo de 5 camudongos aps 3,6,9,12 e 24 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg diludo em 30l de soro
fisiolgico estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). A atividade de TGP e TGO foi
dosada com kit comercial ALT/GPT Liquiform (Labtest) (A) e AST/GOT Liquiform (Labtest) (B). Os
resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve significncia
estatstica nos tempos 6, 9, 12 e 24 horas (A) e 3, 6, 9, 12 e 24 horas (B) (*p<0,05, **p<0,01,***p<0,001)
quando comparados entre si (#) e com o grupo controle (*).
53
A figura 18A mostra os nveis de fosfatase alcalina, enzima encontrada nas

clulas que delineam os ductos biliares do fgado. Em 3h de experimento os
venenos Cdt (102,4 mg/dL), Cdcasc (87,9 mg/dL) e Cdcolli (77,4 mg/dL) no tiveram
significncia estatstica em relao ao controle (91,2 mg/dL). Em contrapartida, a
injeo i.m. de soro fisiolgico (controle) causou um extravasamento mdio de
fosfatase alcalina para a circulao sangunea de 87 mg/dL. De maneira similar a
injeo i.m. de 100 g/Kg de veneno de Cdt causou um extravasamento mdio de
fosfatase alcalina de 119,9 mg/dL, diferindo do controle e dos demais venenos,
Cdcolli (98,3 mg/dL) e Cdcasc (81,5 mg/dL) no apresentaram significncia
estatstica em 6h de expererimento. O veneno de Cdcolli alterou os nveis de
fosfatase alcalina em 9h, 12h e 24h com extravasamento mdio de 97,9 mg/dL,
146,1 mg/dL e 117,6 mg/dL respectivamente, diferente do grupo controle (54,3
mg/dL, 64,9 mg/dL e 64,4 mg/dL). Os demais venenos Cdt (61,1 mg/dL, 60,9 mg/dL
e 40,4 mg/dL) e Cdcasc (31,8 mg/dL, 46,3 mg/dL e 43,2 mg/dL) no tiveram
diferenas estatisticas quando comparados ao grupo controle.
A gama-glutamil-transferase (GGT) uma enzima que tambm est presente
nos hepatcitos e nos canalculos biliares. A figura 18B mostra os nveis de GGT
presente no sangue dos camudongos. A injeo i.m. de soro fisiolgico (controle)
causou um extravasamento mdio de GGT para a circulao sangunea de 29 U/L.
De maneira similar a injeo i.m. de 100 g/Kg dos venenos de Cdcolli e Cdcasc
causaram um extravasamento mdio de GGT de 52,1 U/L e 42,2 U/L,
respectivamente, diferindo estatisticamente do controle e do veneno de Cdt (32,3
U/L ) em 3h de expererimento. Em 6h, o veneno de Cdt causou um extravasamento
mdio de 60,6 U/L, estatisticamente diferente do grupo controle com 31 U/L e dos
demais venenos Cdcasc (46,3 U/L) e Cdcolli (44,6 U/L) que no apresentaram
significncia estatstica quando comparados com o controle. Apenas os venenos de
Cdcolli e Cdcasc alterarm os valores de GGT com 51,1 U/L e 51 U/L
respectivamente em 9h. Os dois foram estatisticamente diferentes do controle (31,8
U/L). J o veneno de Cdt (37,6 Cdcasc 46,3 U/L, Cdcolli 44,6 U/L) no diferiu do
grupo controle. No houve significncia estatstica entre os venenos de Cdt (27,3
U/L, 29,8 U/L), Cdcolli (28,5 U/L, 27,3 U/L) e Cdcasc (40,2 U/L,26,7 U/L) em
comparao com o controle (32,5 U/L, 25,5 U/L) respectivamente, no perodo de 12
a 24 horas.
54
A
200
Controle
# C. d. terrificus
***
Fosfatase Alcalina
150 # C. d. collilineatus
#
*** # C. d. cascavella
**
(mg/dl)
100 ***
50
0
12
24
3
horas
80
Controle
#
C. d. terrificus
# *** #
60 *** C. d. collilineatus
* **
C. d. cascavella
(U/L)
GGT
40
20
0
12
24
3
horas
sobre a funo heptica de camudongos Swiss. Foram usadas amostras de plasma coletadas de
grupo de 5 camudongos aps 3, 6, 9, 12, e 24 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg diludo em 30l de
soro fisiolgico estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). As atividades de Fosfatase
Alcalina e GGT foram dosadas com kit comercial Fosfatase Alcalina (Labtest) e Gama GT Liquiform
(Labtest). Os resultados foram analisados no programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve
significncia estatstica nos tempos 3, 6, 9, 12 e 24 horas (A) e 3, 6, 9 e 12 horas (B) (*p<0,05,
**p<0,01,***p<0,001) quando comparados entre si (#) e com o grupo controle (*).
55
4.3.4. Atividade nefrotxica
A avaliao dos parmetros renais foi realizada pela medio dos

marcadores renais uria (urina e plasma), creatinina (urina e plasma) e protenas
totais na urina (proteinria). A figura 19A mostra os nveis de uria no plasma de
camundongos. A injeo i.m. de soro fisiolgico (controle) causou um acmulo
mdio de uria na circulao sangunea de 32,36 mg/dL. J, a injeo i.m. de 100
g/Kg dos venenos Cdcasc e Cdcolli causou um acmulo mdio de uria de 48,49
mgdL e 47,94 mg/dL respectivamente, em 3h de experimento, ambos
significativamente diferentes do controle. O veneno de Cdt (31,84 mg/dL) no teve
diferenas estatstica em comparao com o grupo controle. Em contrapartida,
apenas o veneno de Cdcolli apresentou diferena estatstica, em comparao com o
grupo controle (33,57 mg/dL), de 40,04 mg/dL em 6h. Os demais venenos Cdt
(23,63 mg/dL) e Cdcasc (29,95 mg/dL) no tiveram significncia estatstica. No
tempo de 9h, tanto o veneno de Cdt (96,53 mg/dL) quanto o veneno de Cdcolli
(62,33 mg/dL) apresentaram diferena estatstica em comparao com o grupo
controle (34,5 mg/dL). O veneno de Cdcasc (32,9 mg/dL) no apresentou diferena
em relao ao controle. Todos os venenos Cdt (42,48 mg/dL, 35,8 mg/dL), Cdcolli
(42,33 mg/dL, 41,17 mg/dL) e Cdcasc (38,14 mg/dL, 53,3 mg/dL) no apresentaram
diferenas estatsticas quando comparados com o grupo controle (38,6 mg/dL, 49,4
mg/dL) em 12h e 24h respectivamente.
Ainda na figura 19B, observa-se que em 3h e 6h de experimento, os valores
de uria urinria no demonstraram significncia estatstica pelos venenos de Cdt
(3283,07 mg/dL, 2137,65 mg/dL), Cdcolli (4422,83 mg/dL, 3580,47 mg/dL) e Cdcasc
(3902,3 mg/dL, 2825,04 mg/dL) em comparao com o grupo controle (3295,6
mg/dL,3425 mg/dL) respectivamente. Apenas o veneno de Cdcolli apresentou
diminuio nos valores de uria urinria com 2496,3 mg/dL diferente do grupo
controle com 4038,2 mg/dL em 9h de experimento, diferentemente dos demais
venenos Cdt (4275,9 mg/dL) e Cdcasc (4752,2 mg/dL). Tambm em 12h e 24h de
experimento, os valores de uria urinria no demonstraram significncia estatstica
pelos venenos de Cdt (4005,37 mg/dL, 10818,7 mg/dL), Cdcolli (5447,7 mg/dL,
9000,3 mg/dL) e Cdcasc (5631,5 mg/dL, 10571,3 mg/dL) em comparao com o
grupo controle (4835 mg/dL,10853 mg/dL) respectivamente.
56
A
150
Controle
# C. d. terrificus
*** C. d. collilineatus
Uria plamtica
100 C. d. cascavella
#
mg/dl
*** ***
*
50
12
24
3
horas
15000 Controle
C.d.terrificus
C.d.collilineatus
C.d. cascavella
Uria Urinria
10000
(mg/dl)
**
5000
0
12
24
3
horas

cascavella sobre a funo renal nos camudongos Swiss. Foram usadas amostras de plasma
coletadas de grupo de 5 camudongos aps 3, 6, 9, 12, e 24 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg
diludo em 30l de soro fisiolgico estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). A
Uria foi dosada com kit comercial Ureia CE (Labtest). Os resultados foram analisados no programa
prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve significncia estatstica nos tempos 3, 6, 9 e 24
horas (A) e 9 horas (B) (**p<0,01,***p<0,001, *p<0,05) quando comparados entre si (#) e com o grupo
controle (*).
57
A figura 20A mostra os nveis de creatinina no plasma de camundongos.

Observa-se que em 3h e 6h de experimento, os valores de creatinina plasmtica no
demonstraram significncia estatstica pelos venenos de Cdt (0,17 mg/dL, 0,27
mg/dL), Cdcolli (0,19 mg/dL, 0,27 mg/dL) e Cdcasc (0,26 mg/dL, 0,32 mg/dL) em
comparao com o grupo controle (0,33 mg/dL, 0,26 mg/dL) respectivamente. Em 9h
de experimento, apenas os venenos de Cdcolli e Cdt tiveram acmulo mdio, de
creatinina na circulao sangunea de 2,21 mg/dL e 1,40 respectivamente. Ambos
diferentes do controle de 0,36 mg/dL. O veneno de Cdcasc (0,2 mg/dL) no
apresentou significncia estatstica. Todos os venenos, Cdt (0,27 mg/dL, 0,23
mg/dL), Cdcolli (0,21 mg/dL, 0,3 mg/dL) e Cdcasc (0,21 mg/dL, 0,3 mg/dL), no
apresentaram significncia estatsca em 12h e 24h de experimento quando
comparandos com o grupo controle (0,21 mg/dL, 0,23 mg/dL) respectivamente.
A figura 20B mostra que no perodo de 3h os venenos, Cdt (30,8 mg/dL),
Cdcolli (17,2 mg/dL) e Cdcasc (15,9 mg/dL) no apresentaram acmulo de
creatinina urinria quando comparados com o grupo controle (23 mg/dL)
respectivamente. Em contrapartida, em 6h o veneno de Cdcasc mostrou acumlo de
creatinina urinria de 40,3 mg/dL, estatisticamente diferente do controle de 27,6
mg/dL. Os venenos de Cdt (36,6 mg/dL) e Cdcolli (34,1 mg/dL) no apresentaram
significncia estatstica quando comparados com o grupo controle (27,6 mg/dL). No
tempo de 9h o veneno de Cdcolli (19,8 mg/dL) e Cdt (19,5 mg/dL) causaram reduo
do acumlo de creatinina na urina. Ambos estatisticamente diferentes do controle
(32,8 mg/dL). Em 12h e 24h os venenos de Cdcolli (38,2 mg/dL, 45 mg/dL), Cdcasc
(40,7 mg/dL, 46 mg/dL) e Cdt (37,4 mg/dL, 43,3 mg/dL) no apresentaram
diferenas estatsticas quando comparados com o controle (34,3 mg/dL, 36 mg/dL)
respectivamente.
58
2.5
#
***
2.0 Controle
Creatinina plasmtica
C. d. terrificus
1.5 *** C. d. collilineatus
mg/dl
C. d. cascavella
1.0
0.5
0.0
12
24
3
horas
B
60
# Controle
*
Creatinina urinria
40 C. d. terrificus
C. d. collilineatus
mg/dl
C. d. cascavella
*
20
0
12
24
3
horas

cascavella sobre a funo renal nos camudongos Swiss. Foram usadas amostras de sangue
heparinizadas (plasma) e urina aps 3, 6, 9, 12, e 24 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg diludo
em 30l de soro fisiolgico estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). A
Creatinina foi dosada com kit comercial Creatinina K (Labtest). Os resultados foram analisados no
programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve significncia estatstica no tempo 9
horas (A) e 9 horas (B). (**p<0,01,***p<0,001, *p<0,05) quando comparados entre si (#) e com o
grupo controle (*).
59
A figura 21 mostra os nveis de protena na urina de camudongos. Todos os

venenos causaram proteinria indicando leso renal. A injeo i.m. de soro
fisiolgico causou um acmulo mdio de protena na urina de 61,9 mg/dL em 3h de
experimento. J, a injeo i.m. de 100 g/Kg dos venenos de Cdcolli, Cdt e Cdcasc
causou um acmulo mdio de protena de 214,1 mg/dL, 209,6 mg/dL e 193,1 mg/dL
respectivamente. Em 6h, Cdcasc com 167,4 mg/dL, Cdcolli com 158 mg/dL e Cdt
com 153,1 mg/dL. Todos significativamente diferentes do grupo controle de 50,5
mg/dL. Em 9h e 12h, Cdolli (169,4 mg/dL, 133,5 mg/dL), Cdcasc (153,1 mg/dL,
134,7 mg/dL) e Cdt (156 mg/dL, 109,6 mg/dL) foram estatisticamente diferente do
grupo controle (60,6 mg/dL, 57,2 mg/dL), respectivamente. Em comparao com o
grupo controle (78 mg/dL) os venenos Cdt (98 mg/dL), Cdcolli (88,4 mg/dL) e
Cdcasc (86,4 mg/dL) no apresentaram diferenas estatsticas em 24h de
experimento.
300
Controle
C. d.terrificus
*** C. d. collilineatus
200
Proteinria
*** *** C. d. cascavella

(mg/dl)
***
100
0
12
24
3
Horas

cascavella sobre a funo renal nos camudongos Swiss. Foram usadas amostras de urina aps
3, 6, 9, 12, e 24 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg de veneno diludo em 30l de soro fisiolgico
estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). A urina foi centrifugada e a proteinria
foi dosada com kit comercial Sensiprot (Labtest). Os resultados foram analisados no programa prisma
(ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve significncia estatstica nos tempos 3, 6, 9 e 12 horas
(***p<0,001) quando comparados entre si (#) e com o grupo controle (*).
60
4.3.5. Efeito dos venenos sobre a hemostasia da coagulao
A hemostasia da coagulao foi verificada pela avaliao da atividade

Protrombnica (TAP) e Atividade Protrombnica Parcialmente Ativada (TTPA). A
figura 22A mostra que o veneno de Cdcolli causou aumento mdio no tempo de
coagulao de 120 segundos, estatisticamente diferente do grupo controle de 28
segundos. Os venenos de Cdt (24,5 segundos) e Cdcasc (41 segundos) no
apresentaram diferenas estatsticas em comparao com o controle. Ainda na
figura 22B ambos os venenos de Cdcolli e Cdcasc tiveram umento mdio do tempo
de coagulao de 240 segundos, estatisticamente diferente do grupo controle que
teve 92,5 segundos.
61
A
150
#
***
TAP (segundos)
100
50
us
us
lla
e
ol
ve
at
c
tr
ifi
e
on
ca
in
rr
as
C
.te
lil
ol
.c
.d
.c
.d
C
.d
C
C
B 300
# #
*** ***
200
(segundos)
TTPA
100
0
a
s
e
tu
l
ol
cu
ve
tr
ea
fi
ca
on
ri
in
er
as
C
lil
.t
.c
ol
.d
.c
.d
C
.d
C
C

cascavella sobre a coagulao em camudongos swiss. Foram usadas amostras de plasma
citratadas coletadas aps 3 horas da inoculao i.m. de 100g/Kg diludo em 30l de soro fisiolgico
estril (grupo teste) e somente soro fisiolgico (grupo controle). A atividade de TAP e TTPA foi
dosada com kit comercial TAP (Labtest) (A) e TTPA (Labtest) (B). Os resultados foram analisados no
programa prisma (ANOVA) n = 5 animais por grupo. Houve significncia estatstica em C.d.
collilineatus (TAP) em (A) quando comparado entre si (#) e com o grupo controle; Em (B) C.d.
collilineatus e C.d. cascavella (TTPA) apresentaram significncia estatstica quando comparados
entre si (#) e com o grupo controle (*) (***p<0,001).
62
5. Discusso
Os componentes dos venenos de serpentes apresentam toxicidade em

tempos variados e possuem um conjunto de aes tanto sobre presas quanto sobre
vtimas humanas. Algumas diferenas nas manifestaes clnicas destes venenos
so decorrentes de suas propriedades especficas (concentrao de toxinas) e nas
diferenas da velocidade de absoro e na habilidade de penetrar nas membranas e
tecidos (CHIPPAUX et al., 1991; GIRISH et al., 2004).
Vrios componentes do veneno de Crotalus durissus j foram isolados e
estudos pelo fracionamento por excluso molecular evidenciam quatro toxinas
principais: convulxina (PRADO-FRANCESCHI e VITAL-BRASIL, 1981), giroxina
(BARRABIN et al.,1978), crotoxina (SLOTTA e FRAENKEL-CONRAT, 1938) e
crotamina (GONALVES e VIEIRA, 1950). No entanto, o veneno de Crotalus
durissus possui composio muito varivel, onde a crotamina pode ou no estar
presente (BARRIO e BRASIL, 1951).
O fracionamento dos venenos em gel de filtrao sephadex G-75, no
presente estudo, permitiu verificar as principais toxinas presentes. O cromatograma
dos venenos Crotalus durissus terrificus (Cdt) e Crotalus durissus collilineatus
(Cdcolli) evidenciou trs picos denominados P I, PII e P III para Cdt e D I, D II e D III
para Cdcolli. A eletroforese do fracionamento destes venenos permitiu observar que
em P I e D I encontravam-se as toxinas convulxina (Cvx) com ~72 kDa e Giroxina
(Grx) com ~30 kDa. Em P II e D II, a crotoxina (Ctx) com ~24 kDa. Em P III e D III
observa-se a presena de crotamina (Ctm) com ~4,8 kDa. O fracionamento do
veneno de Crotalus durissus cascavella (Cdcasc) evidenciou apenas 2 picos. B I e B
II. Em B I encontravam-se as toxinas convulxina (Cvx) com ~72 kDa e Giroxina (Grx)
com ~30 kDa e em B II observa-se a presena de crotoxina (Ctx) ~24 kDa. No
observado a presena de crotamina (Ctm) neste veneno, classificando-o como
crotamino-negativo.
A partir do fracionamento dos venenos foi realizada uma estimativa da
concentrao em porcentagem do contedo proteico de cada pico. Desse modo, a
concentrao estimada de P I, D I e B I nos venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc so
de 2%, 6% e 18% respectivamente. A concentrao estimada de P II, DII e B II de
81%, 67% e 82%. J P III e D III possuem concentrao estimada de 16% e 27%
que corresponde aos venenos de Cdt e Cdcolli.
63
Vrios autores relataram variaes no contedo proteico do veneno de

Crotalus durissus. Loureno (2013) avaliou em seu estudo um grande nmero de
espcimes de C. durissus adulto (macho e fmea) e filhotes tanto de espcimes em
cativeiro quanto espcimes selvagens e verificou uma grande variao em seus
venenos. A anlise deste estudo mostrou que 39,7% dos venenos eram crotamino-
positivo, resultado semelhante ao de Francischetti e colaboradores (2000) que ao
verificar cromatografias de espcimes de Cdt verificou diferenas no contedo
proteico, assim como os estudos de C. durissus da Venezuela e Colmbia.
A composio destes venenos est inteiramente ligada idade, sexo,
cativeiro e at mesmo nas glndulas individuais dessas serpentes (FURTADO et al.,
1991; FRANCISCHETTI et al., 2000; AGUILAR et al., 2007). As variaes
ontognicas e sazonais, tambm so condies que contribuem diversidade
molecular e complexidade dos venenos (FURTADO et. al., 2003; FERREIRA et al.,
2010b). A presena tambm de isoformas e variaes nos venenos do gnero
Crotalus so de grande relevncia clnica (FAURE e BON, 1987, 1988), pois o pool
de veneno utilizado para a produo de antiveneno pode ser inadequado para
garantir imunogenicidade em animais produtores, resultando em um imunobiolgico
que no neutralize adequadamente as manifestaes clnicas dos pacientes
acometidos por envenenamento por estas serpentes (BOLDRINI-FRANA et al.,
2010).
Alm de evidenciar a heterogeneidade dos venenos em relao crotamina,
Loureno e colaboradores (2013) verificaram a atividade proteoltica, esta mostrou
que o veneno de Crotalus durissus no apresentou diferenas estatsticas em
relao com os resultados obtidos no presente estudo .
O edema pode ser definido como aumento da permeabilidade microvascular,
levando ao extravasamento de exsudato para o interstcio (ROBBINS, 2000). Vrios
componentes do veneno de Crotalus durissus podem ser responsveis pela induo
do edema. Stbeli e colaboradores (2004) mostraram que a LAAO de Bothrops
alternatus (Balt-LAAO-I) induz edema na pata do camundongo 1 hora aps a sua
administrao. Em 2007 Stbeli et al. tambm demonstrou que a LAAO de Bothrops
moojeni (BmooLAAO-I) tambm induz edema. Assim o edema causado por Cdcolli e
Cdcasc (Figura 14) pode estar relacionado com a presena de atividade enzimtica
da LAAO (Figura 13). Outro detalhe importante, que a presena de svVEGF(fator
de crescimento endotelial vascular) nos respectivos venenos podem promover a
64
formao de novos capilares (angiognse) e contribuir pelo acentuado aumento da

permeabilidade vascular, resultando da deposio aumentada de protenas
plasmticas na matriz extracelular (MEC) (ROBBINS, 2000). A presena de citocinas
inflamatrias tambm contribui para induo de edema. Segundo Boldrini-Frana et
al., (2010) o veneno de Cdcolli possui cerca de 2,1% e Cdcasc 1,1%, de svVEGF e
cerca de 0,5% de LAAO em Cdcolli e 0,1% em Cdcasc. Tal variao protemica
pode explicar a diferena estatstica causada pelos venenos em estudo. A variao
do edema causado pelo veneno de Cdt pode ser explicada pela no atividade de
LAAO e/ou o sinergismo de um ou mais componentes do veneno de C. durissus
terrificus, logo dosagens de citocinas pr e anti-inflamatrias devem ser verificadas
para melhor esclarecimento destas alteraes.
As fosfolipases A2 tambm podem ser responsveis pela induo do edema,
pois esto diretamente relacionadas fisiopatologia do envenenamento, sendo
responsveis por diversos distrbios locais e sistmicos (ZULIANI et al., 2005;
GUTIRREZ et l., 2008; PONCE-SOTO e MARTINS-DE-SOUZA, 2010; TOYAMA et
al., 2011; MARANGONI et al., 2013). A Figura 12 indica que o veneno de Cdcasc
apresenta maior atividade fosfolipsica em relao aos demais venenos. O veneno
de Cdt tambm, em menor intensidade, apresentou atividade. Porm o veneno de
Cdcolli no apresentou atividade enzimtica sobre o 4N3OAB na concentrao de
20g.
Tais resultados podem ser explicados com base nas propriedades de
algumas PLA2 em reconhecerem e atuarem em alvos especficos. Alm disso, muitas
PLA2 enzimaticamente inativas, excercem seus efeitos de maneira diferente
daquelas enzimaticamente ativas (GUTIRREZ e LOMONTE, 2013).
Alm de estarem relacionados com a induo de edema, estudos enfatizam a
participao das PLA2 na miotoxicidade causada pelo envenenamento crotlico.
Grande parte desta ao proveniente de pelo menos dois componentes, a
crotamina e a crotoxina (CAMERON e TU, 1978; GOPALAKRISHNAKONE et al.,
1984; KOUYOUMDJIAN et al., 1986; MEBS e OWNBY, 1990). A miotoxicidade
induzida pela crotoxina causada pela subunidade CB, a frao PLA2
(GOPALAKRISHNAKONE et. al., 1984).
Basicamente, existem dois padres clnicos para a miotoxicidade: a
miotoxicidade local e a miotoxicidade sistmica, no caso, a rabdomilise, que
consiste na destruio muscular generalizada com liberao de seus componentes
65
celulares na circulao, assim, grandes incrementos na atividade de protenas e

enzimas derivadas de msculos, tais como a CK e mioglobina quando so liberadas
na circulao estas protenas acabam sendo filtradas nos glomrulos e podem levar
a disfuno renal, que uma das caractersticas do envenenamento crotlico
(AZEVEDO-MARQUES et al., 1987; GUTIERREZ e OWNBY, 2003).
O mecanismo de ao da fisiopatogenia da miotoxicidade consiste da
interao das PLA2 miotxicas a stios especficos do tecido muscular. A anlise da
leso tecidual muscular por microscopia eletrnica de varredura, em estudos de
Gutirrez e Lomonte (2013) evidenciou danos ao sarcolema associado a pequenas
leses com reas de hipercontrao s fibras musculares. Tais leses provocam um
influxo de Ca+ que, por sua vez, induz a hipercontrao dos miofilamentos. A
hipercontrao destes filamentos e o influxo de Ca+ provocam ainda mais a
contrao mecnica ampliando a intensidade aos danos celulares.
A leso muscular ocasionada pelos venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc, no
presente estudo, foi avaliada pelas dosagens dos nveis sricos de CK-total, CK-MB
e LDH. A CK uma enzima responsvel pela fosforilao reversvel de creatina pela
adenosina trifosfato (ATP) com a formao de creatina fosfato, que funciona
basicamente como um reservatrio energtico, usada durante a contrao muscular
(APPLE et al., 1984; ARENAS et al., 1988). Est amplamente distribuda nos
tecidos, com atividades elevadas no msculo esqueltico, crebro e tecido cardaco.
O fgado e os eritrcitos no possuem essa enzima (LANG e WURZBURG, 1982;
JONES e SWAMINATHAN, 1990).
A CK-MB uma isoenzima da Creatinoquinase (CK-TOTAL), encontrada
no citosol ou associada a estruturas miofibrilares especificamente no msculo
cardaco, logo, leses de carter muscular levam a liberao da mesma na corrente
sangunea, sendo diagnosticada pela dosagem enzimtica no sangue (LANG e
WURZBURG, 1982; JONES e SWAMINATHAN, 1990).
A Lactato Desidrogenase (LDH) uma enzima que catalisa a oxidao
reversvel do lactato a piruvato, em presena da coenzima NAD + que atua como
doador ou aceptor de hidrognio. Esta se encontra localizada no citoplasma de
todas as clulas do organismo e faz parte da via glicoltica. A LDH bem distribuda
pelo organismo, sendo rica no miocrdio, fgado, msculo esqueltico, rim e
eritrcitos. encontrada cerca de 500 vezes mais concentrada nos tecidos do que
66
na corrente sangunea, portanto, seu aumento srico um indcio de leso tecidual

(COPUR et al., 1989; STURK e SANDERS, 1990; CASSDY et al., 1994).
Existem cinco isoenzimas de LDH. Cada isoenzima constituda de um
tetrmero formado por quatro subunidades H (cardaca) e M (msculo esqueltico).
As isoenzimas encontradas na corrente sangunea so: LDH-1 (HHHH) e LDH-2
(HHHM) encontradas no miocrdio e eritrcitos, LDH-3 (HHMM) presente no pulmo,
linfcitos, bao e pncreas, LDH-4 (HMMM) e LDH-5 (MMMM) predominantes no
fgado e msculo esqueltico (COPUR et. al., 1989; STURK e SANDERS, 1990;
CASSDY et al., 1994).
Com base nestas informaes, as dosagens de CK-TOTAL (Figura 15)
demonstraram extravasamento significativo da enzima na circulao sangunea
causa pelos venenos em estudo. Observa-se que, os venenos de Cdcolli e Cdcasc
causaram aumento dos nveis sricos da enzima nas primeiras 3h de experimento.
Permanecendo estes elevados at a 12h, retornando aos nveis basais em 24 h. O
veneno de Cdcolli apresentou 2 picos de atividade, uma em 3h e a outra em 12h. Tal
fenmeno pode ser sugerido pela ao inicial da crotamina, presente em grande
quantidade neste veneno (cerca de 27%) e a ao tardia pela crotoxina. Visto que a
crotamina possui baixo peso molecular (~4,8 kDa), tem ao rpida nas fibras
musculares tipo I causando as alteraes observadas. J a crotoxina possui peso
molecular maior (~24kDa) agindo tardiamente sobre o msculo, assim estudos
adicionais precisam ser realizados. Outra hiptese sobre este fenmeno pode ser
advindo da leso inicial (em 3h) e extravasamento de componentes celulares e
fatores biolgicos que contribuem para a leso posterior, como o caso do influxo
de Ca+ que resulta no aumento da permeabilidade da membrana plasmtica e
ativao de enzimas com efeitos celulares deletrios (ROBBINS, 2000).
A diferena das alteraes causadas pelos venenos de Cdcasc e Cdt nos
nveis de CK-TOTAL pode ser explicada pela a atividade fosfolipsica elevada do
veneno de Cdcasc. Comparando Cdcolli aos demais venenos, sugere qua a ao
intensa deste veneno sobre o sistema muscular pode estar relacionado ao
sinergismo das duas toxinas envolvidas na miotoxicidade, crotamina e crotoxina
(devido elevada concentrao da crotamina neste veneno) pode contribuir para
este efeito. Logo estudos para avaliar a ao destas sobre o perfil muscular
necessitam de esclarecimentos.
67
Gutirrez e colaboradores (2008) enfatizaram a ao da crotoxina sobre a

atividade miotxica tanto local quanto sistmica. Tambm demonstraram a
ocorrncia de stios especficos para a ao da crotoxina. Em seu estudo
comparativo entre o complexo crotoxina, a frao crotoxina B e uma PLA2 Lys49
(miotoxina de B. alternatus), observou que a PLA2 Lys-49 possui elevada atividade
miotxica local quando aplicada no tecido muscular, porm, quando aplicada via
intravenosa no foi observado o mesmo efeito. J as toxinas de Crotalus durissus
produziram alteraes miotxicas tanto locais quanto sistmicas, e os nveis de CK
permaneceram elevados por mais tempo que a PLA2 Lys-49 (que teve ao local e
de curta durao), tais resultados, corroboram estudos anteriores de outros autores
como Rangel-Santos (2004), e o modelo murino realizado por Salvini e
colaboradores, (2001). O fato de que algumas variantes PLA2 Lys49 no serem
capazes de induzir danos maiores por via intravenosa, provavelmente devido a
ausncia de receptores especficos. Tal estudo refora a idia que condiz com a
hiptese de que PLA2 miotxicas sistmicas esto diretamente relacionada
especificidade para receptores de clulas musculares esquelticas (GUTIRREZ e
OWNBY, 2003; KINI e EVANS, 1989).
As dosagens de CK-MB e LDH evidenciam o papel das toxinas de
Crotalus durissus sobre o msculo cardaco. Os venenos Cdt e Cdcolli causaram
picos com aumento significativo de CK-MB na circulao (Figura 16) em 3h e 12h de
experimento. Tal fenmeno pode ser explicado pela mesma hiptese da ocorrncia
a stios especficos das PLA2 ao miocrdio e ocorrncia de leses iniciais com
liberaes de fatores biolgicos que contribuem para a leso tardia. A verifcao dos
fatores biolgicos envolvidos na leso tecidual de grande importncia para avaliar
o efeito de citocinas, proteases, fosfolipases, ATPases entre outras, para confirmar a
participao destas na leso muscular tardia.
Cupo e colaboradores (1990) apontam a cardiotoxicidade como um
problema observado em um grande nmero de acidentes ofdicos, e as fosfolipases
A2 tem sido responsveis por tal ao (SIQUEIRA et al., 1990). A toxicidade do
veneno de C. durissus no msculo cardaco pouco compreendido e apresenta
controvrsias. Vrios autores sugerem a interferncia da crotoxina na funo
cardaca. Pacientes que sofreram envenenamento por Cdt tiveram alteraes no
eletrocardiograma (CUPO et al., 2003) e variaes nos nveis enzimticos dos
marcadores de leso muscular, assemelhando-se ao padro encontrado no infarto
68
agudo do miocardio, alteraes na urina (escura) com teste de benzedina positivo

para mioglobina tambm foi encontrado (CUPO et al., 1990). Tanto os valores
enzimticos de CK-TOTAL e CK-MB dos referidos trabalhos apresentaram
comportamento homogneo com aumento precoce nas primeiras 2 a 3 horas do
envenenamento. Dados que esto em harmonia com os resultados de CK-TOTAL e
CK-MB obtidos neste estudo.
As dosagens de LDH tambm apresentaram dois picos (em 3h e 12 horas e
em 6h e 12 horas) de extravasamento da enzima na circulao sangunea pelos
venenos de Cdt e Cdcolli respectivamente. Tal fato tambm explicado pela
participao das toxinas envolvidas e a ao de fatores biolgicos a leso tecidual.
A diferena nas alteraes provocadas pelos respectivos venenos pode ser
explicada pela presena de stios de ligao especficos das PLA2 aos tecidos
acometidos, tempo de ao do veneno aos tecidos ocasionando danos
mitocondriais, influxo de Ca+, acmulo de radicais livres derivados do oxignio e
defeitos na permeabilidade da membrana levando a perda do equilbrio osmtico e
perda de contedos celulares (KUMAR et. al., 2010).
Cupo e colaboradores (1990, 2003) evidenciaram que as dosagens de LDH1
(Frao cardaca), em pacientes que sofreram envenenamento por Cdt, tiveram
resultados mais elevadas que as outras isoformas de LDH (CUPO et al., 1990).
Estudos de Rowlands (1969) verificaram que autpsias de vtimas de
envenenamento por Pseudechis australis mostraram rabdomilise, com focos de
necrose no miocardio, envolvendo, principalmente o ventrculo esquerdo e septo
interventricular. No Brasil, Siqueira e colaboradores (1990) relataram dano ao
miocrdio aps envenenamento por Cdt. Os dados da autpsia revelaram edema e
miocitlise difusa e a presena de focos raros de micro-infartos.
Em relao leso heptica foram avaliados marcadores bioqumicos de
leso tais como AST, ALT, GGT e FAL. As aminotransferases ou transaminases,
AST (aspartato aminotransferase) e ALT (alanina aminotransferase) catalisam a
transferncia reversvel dos grupos amino de um aminocido para o -cetoglutarato,
formando cetocido e cido glutmico. Essas reaes exercem papis centrais tanto
na sntese como na degradao dos aminocidos. Tambm atuam como uma ponte
entre o metabolismo dos aminocidos e carboidratos. Esto amplamente distribudas
nos tecidos humanos. A AST pode ser encontrada no miocrdio, fgado, msculo
esqueltico, e em pequenas quantidades nos rins, pncreas, bao, crebro, pulmes
69
e eritrcitos. O aumento destas enzimas est intimamente relacionado leso

heptica, visto que a enzima ALT encontrada abundantemente no citosol dos
hepatcitos enquanto que AST encontrada na mitocndria, logo, leses onde h
destruio de clulas hepticas h liberao destas enzimas na corrente sangunea.
A localizao enzimtica tem favorecido o diagnstico e prognstico de doenas
hepticas, pois em um dano hepatocelular leve a forma predominante no soro
citoplasmtica, enquanto que em leses graves h liberao da enzima mitocondrial
(COHEN et al. 1979; KIM et al., 1977; SINGER et al., 1995; JONHSON et al., 1995;
SHETH et al., 1998).
A enzima gama-glutamiltranspeptidase (GGT) catalisa a transferncia de um
grupo gama-glutamil de um peptdeo para outro peptdeo ou para um aminocido
produzindo aminocido gama-glutamil e cistenilglicina. Esta enzima est envolvida
no transporte de peptdeos e aminocidos atravs das membranas celulares e
tambm participa na sntese protica. A GGT pode ser encontrada em vrios
tecidos, principalmente no retculo endoplasmtico liso ou ligadas membrana
plasmtica de clulas do fgado, vias biliares, e em menor quantidade no rim,
intestino, prstata, pncreas, pulmes, crebro e corao. Quando a enzima esta
presente no soro, basicamente de origem do sistema hepatobiliar. A liberao de
GGT no soro reflete os efeitos txicos que determinadas substncias podem causar
sobre as estruturas microssomais das clulas hepticas (BERTELLI et al., 1997;
LONDON et al. 1982; ROSALKI, 1975). J a enzima Fosfatase Alcalina (FAL) faz
parte de um grupo de enzimas que catalisam a hidrlise de vrios fosfomonosteres
em pH alcalino. A FAL esta amplamente distribuda nos tecidos humanos, tais como:
mucosa intestinal, fgado, tbulos renais, bao, ossos (osteoblastos), leuccitos e
placenta. A forma predominante no soro de origem heptica (BELFIELD e
GOLDBERG, 1968; KOAY e WALMSLEY, 1996; POSEN e DOHERTY, 1981). A
FAL esta localizada nas membranas celulares de revestimento dos canalculos
biliares, logo esta elevada nas desordens hepatobiliares e leses expansivas do
fgado (BELFIELD e GOLDBERG, 1968; KOAY e WALMSLEY, 1996; POSEN e
DOHERTY, 1981).
Na avaliao de leso heptica (Figura 17), tanto ALT quanto AST tiveram
alteraes significativas. A avaliao dos nveis de ALT mostraram-se tardiamente
alterados em comparao com os nveis de AST (em 6h de experimento). Como a
enzima ALT encontrada especificamente nos hepatcitos, sujere-se leso heptica
70
inicial em 6 horas pelo veneno de Cdcasc, seguido das alteraes causadas por
Cdcolli em 9h e Cdt em 12 horas de experimento. Os nveis enzimticos de AST
tambm sofreram alteraes constantes pelos trs venenos em estudo. A partir de 3
horas de experimento, houve extravasamento de AST na circulao sangunea dos
camundongos ocasionado pelos venenos de Cdcasc, Cdcolli e Cdt respectivamente.
Analisando os dados em questo, AST tambm encontrada no miocrdio, fgado e
msculo esqueltico, logo as alteraes de AST que antecedem ALT podem ser em
decorrncia da miotoxicidade e cardiotoxicidade generalizada. Observa-se tambm
que o veneneno de Cdcasc alterou precocemente os valores de ALT e AST. Visto
que ALT uma enzima especfica do fgado, concentraes significativas da mesma
indica leso heptica, logo, veneno de Cdcasc causou leso heptica em 3h e em
24 horas. Porm o veneno de Cdcolli ocasionou leso em 9h e 12 horas de
experimento, enquanto que o veneno de Cdt em 12h e 24 horas de experimento.
Tais diferenas nas aes dos respectivos venenos tambm podem ser atribudas
s aes da crotoxina e sua subunidade fosfolipsica a stios especficos presentes
na membrana dos hepatcitos.
As interaes das fosfolipases A2 sobre a hidrlise dos fosfolipdeos de
membrana podem causar a perda da permeabilidade da membrana celular heptica
com consequente liberao dos nveis de ALT, que constiui uma das caractersticas
iniciais da leso celular. Tal fenmeno pode ser observado nos venenos de Cdcasc
e Cdt, que apresentaram atividade fosfolipsica significativa sobre o 4N3OAB. Como
o veneno de Cdcolli no apresentou atividade sugere-se que o mecanismo de ao
deste difere-se dos demais venenos. Tal ao pode ser atribuda caractersticas
que as fosfolipases A2 enzimaticamente inativas tm de internalizar-se e interagir
com enzimas intracelulares causando a ativao das fosfolipases internas que
afetam a integridade da membrana mitocndrial. Tal interao resulta na liberao
de AST para a circulao sangunea. As mitocndrias so alvos importantes de
muitos estmulos nocivos, dentre eles a hipxia, elevaes do Ca+ citoslico, estress
oxidativo, degradao de fosfolipdios e outros (ROBBINS, 2000, GUTIRREZ e
LOMONTE, 2013). Alm disso, a presena de 2 picos de elevao de ALT e AST
tambm pode ser atribuido ao efeito secundrio causados pelos fatores biolgicos
liberados pela leso tecidual.
As enzimas FAL e GGT tambm tiveram seus nveis alterados (Figura 18),
reforando o envolvimento heptico na toxicidade induzida pelos venenos. Em 6 h
71
observam-se alteraes nos nveis sricos de FAL pelo veneno de Cdt. J o veneno
de Cdcasc no elevou os nveis de FAL, ao contrrio, gerou um quadro de
hipofosfatasemia, que, clinicamente no possui significncia. Os nveis de GGT
sofreram alterao precoce pelos venenos de Cdcolli e Cdcasc (em 3 horas de
experimento). O veneno de Cdt no causou aumento significativo dos nveis de
GGT, e com 12 horas de experimento, tanto Cdt quanto Cdcolli causaram episdio
de hipogamagenemia, tambm sem relevncia clnica.
Os mecanismos envolvidos na leso heptica ainda no esto esclarecidos.
O extravasamento de enzimas hepticas na corrente sangunea est intimamente
relacionado com a ao das PLA2 a liberao dos fragmentos de membrana, como
discutido anteriormente. Muitos trabalhos observaram que alm das alteraes
bioqumicas (aumento srico de ALT, AST) presentes (BARRAVIERA et al., 1989;
BARRAVIERA et al., 1995), achados histolgicos revelaram a presena de
indicativos de leso tecidual como necrose, alteraes nucleares (cariopicnose),
citoplasmticas (vacuolizao citoplasmtica) dos hepatcitos, congesto dos vasos
sanguneos, trombose da veia porta, amiloidose e atrofia dos hepatcitos (JARRAR,
2011; SHASHIDHARAMURTY et al., 2010; SILVA, 2012 et al., 2012).
Silva (2011) mostrou em seu trabalho, aumento precoce e considervel nos
nveis de AST e ALT, bem como a participao do estress oxidativo na participao
da leso heptica. Tais resultados esto em harmonia com os dados obtidos por
Frana e colaboradores (2009), que tambm demonstraram alteraes das enzimas
hepticas. Bancher, Rosa e Furlaneto (1973), mostraram que em ratos, o veneno
pode ser detectado no tecido heptico e por microscopia eletrnica observou danos
mitocondriais e citoplasmticos nos hepatcitos, indicando leso do fgado. Tais
resultados embasam as alteraes encontradas no presente estudo.
A toxicidade renal causada pelos venenos Cdt, Cdcolli e Cdcasc foram
avaliados pelas dosagens dos nveis sricos e urinrios de uria e creatinina e
tambm a excreo de protenas na urina. A Uria um produto de degradao da
amnia oriunda da desaminao dos aminocidos provindos do catabolismo protico
no fgado. No rim, filtrada pelos glomrulos e excretada na urina, mas
reabsorvida pelos tbulos renais por difuso passiva (cerca de 40-70%). Logo, a
concentrao plasmtica da uria afetada principalmente, pela funo renal, o que
a classifica (juntamente com a creatinina) como um indicador preditivo de
insuficincia renal. Assim, nveis reduzidos de uremia esto associados a danos
72
renais enquanto que nveis aumentados indicam disfunes hepticas (DEEN et al.,
1979; BERK e STAMP, 1999; BURGGES, 1999). A Creatinina produto da
desidratao no-enzimtica da creatinina muscular. No msculo atua como
reservatrio de energia, formando o composto creatina-fosfato. No rim, removida
(por filtrao glomerular) quase que inteiramente e em velocidade relativamente
constante, por este motivo, um excelente marcador para avaliar a funo renal. A
hipercreatinemia indica a deteriorao da funo renal, enquanto que a
hipocreatinemia no apresenta significncia clnica (BOWERS e WONG, 1980;
FINN, 1990; GASPAI et al., 1997; MICHEL e KELLY, 1998). A presena de protenas
na urina so os primeiros indcios de leso tubular proximal e leso glomerular
(SHIHABI et al., 1991; SCHUREK, 1994).
O perfil renal (Figura 19) mostrou estravazamento significativo dos nveis
plasmticos de uria na corrente sangunea pelos venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc.
Houve excreo de uria urinria aumentada pelo veneno de Cdcolli. A creatinina
plasmtica tambm se mostrou alterada pelos venenos Cdt e Cdcolli. No entanto,
houve diminuio da excreo de creatinina urinria pelos respectivos venenos,
provavelmente devido reteno de creatinina na circulao sangunea. Todos os
venenos levaram a excreo precoce de protenas na urina, retornando aos nveis
basais na 24 hora.
Tais resultados reforam o efeito nefrotxico causado por todos os venenos
em estudo, mesmo o veneno de Cdcasc no ter ocasionado alteraes nos nveis
enzimticos creatinina e ter apenas alterado (em 3h) os nveis de uria (indicando
efeito heptico ou aumento da degradao proteica resultante da ao de PLA2), a
proteinria causada pelos venenos, indicam leso glomerular, pois a principal
protena indicativa de leso, albumina, possui alto peso molecular e em condies
fisiolgicas, no atravessa a membrana glomerular, logo sua presena na urina um
importante indicativo de leso renal.
A insuficincia renal aguda (IRA) a principal complicao do
envenenamento crotlico (AMARAL et al., 1986; RIBEIRO et al., 1998; BRASIL,
2001; MONTEIRO et al., 2001; AZEVEDO - MARQUES et al., 2003; PINHO et al.,
2005). caracterizada, basicamente, pela a diminuio ou perda das funes renais
(NEEDHAM, 2005). Esta condio pode ser atribuda a manifestaes sistmicas,
desidratao e principalmente a miotoxicidade causada pelo veneno (AMARAL et
al., 1986; MONTEIRO et al., 2001; AZEVEDO - MARQUES et al., 2003), tal condio
73
induz um quadro de isquemia renal grave (NEEDHAM, 2005), levando a perda da

funo renal. Para Azevedo-Marques e colaboradores (1987) a toxicidade renal
pode ser definida como a deteriorao da funo renal que se manifesta por
elevao de uria e creatinina srica, distrbios eletrolticos, alteraes na
homeostase cido-base e reteno de resduos de produtos nitrogenados,
ocorrendo em horas, dias e / ou at semanas (LOMONTE et al., 1993; MARTINS et
al., 2003). A rabdomilise com a posterior liberao de mioglobina tambm tem sido
descrita como causadora de nefrotoxicidade, levando necrose tubular aguda
(BUCARETCHI et al., 2002; SITPRIJA, 2006). A necrose tubular aguda
caracterizada, morfologicamente pela destruio das clulas epiteliais tubulares e,
clinicamente, pela supresso aguda da funo renal (ROBBINS, 2000). A leso das
clulas renais se d pelos mecanismos discutidos anteriormente ao das PLA2 a
membrana celular.
O efeito renal causado pelo veneno de C. durissus no esta bem
compreendido e multifatorial. Monteiro e colaboradores (2001), utilizando modelo
de perfuso renal com o veneno de Cdt, verfificaram a presena de protenas na
estrutura glomerular, aumento na taxa de filtrao glomerular, reduo no transporte
de sdio e diminuio na presso de perfuso. Martins e colaboradores (2002)
utilizando o mesmo modelo, demonstraram que a crotoxina de Cdcasc causou
aumento na taxa de filtrao glomerular e no volume urinrio, reduo no transporte
de sdio, cloro e potssio, aumento na presso de perfuso e resistncia vascular
renal. Amora (2006) mostrou que o veneno de Cdcolli promoveu diminuio da
presso de perfuso, da resistncia vascular renal e diminuio do fluxo urinrio e
diminuio da taxa de filtrao glomerular foi ocasionada tanto pelo veneno bruto
como pela crotoxina.
Ambos os trabalhos indicaram que a crotoxina era responsvel pelas
alteraes, e que tais modelos sugerem uma ao diferente de cada veneno sobre a
funo renal, embora os venenos testados sejam de serpentes da mesma espcie.
A liberao de mediadores, por exemplo, prostaglandinas e histamina por tecidos
renais tambm est relacionado com o aumento da permeabilidade capilar, reduo
da presso arterial e choque hipovolmico (DER MEIDE e SCHELLEKENS, 1996;
MONTEIRO et. al., 2001; PETRICEVICH, 2004; ROSA et al., 2005). Cruz e
colaboradores (2011) tambm observaram a presena de protenas na urina de
camundongos tratados com diferentes doses de veneno de Cdt, e a presena de
74
citocinas pr e anti-inflamatrias na urina tambm foi observado. Tais resultados

sugerem o importante papel renal na remoo de citocinas do plasma. Contudo, a
anlise histolgica renal de ratos tratados com o veneno de Cdt mostrou ruptura e
descamao do lmen do epitlio tubular renal (CRUZ et al., 2011), isso explica a
presena de proteinria existente no presente trabalho e as alteraes renais
causadas pelos venenos respectivos venenos em estudo.
As alteraes na hemostasia da coagulao do envenenamento crotlico
foram avaliadas pela realizao dos testes de coagulometria Tempo de Protrombina
Ativada (TAP) e Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (TTPA). A
Protrombina uma glicoprotena de vida mdia de 100 horas e com 70.000 kDa.
Sua forma ativa a trombina com peso molecular de 38.000 kDa. A transformao
de protrombina em trombina envolve reaes enzimticas que se processam em
cadeias (LORENZI, 2006). O TAP avalia a via extrinseca da cascata de coagulao,
pelo mecanismo gerado da leso tecidual, ou seja, o fator tissular, fator III (a
Tromboplastina) desencadeia o processo de coagulao formando, juntamente com
o fator VII, um complexo dependente de clcio. O fator VII ativado, transformando
em fator VIIa que atua sobre o fator X gerando o fator Xa e este juntamente com os
fosfolipdeos, oriundos do fator tissular Va e clcio, formam o complexo ativador da
Protrombina ou protrombinase, que transforma Protrombina em Trombina. Esta por
sua vez, atua sobre o fibrinognio gerando fibrina. A formao de fibrina
macroscpicamente demonstrada pelo aparecimento de cogulo, logo o TAP o
tempo necessrio para a formao de fibrina aps a mistura de tromboplastina,
plasma citratado e clcio. Tal ensaio avalia os fatores do complexo protrombnico
(fatores II,V, VII,X) da cascata de coagulao. O prolongamento de TAP est ligado
s deficincias dos fatores II, V, VII e X. Tais deficincias podem estar associadas
presena de substncias anticoagulantes, fibrinlise, doena hemorrgica,
coagulao intravascular e insuficincia heptica (LIMA et al., 2001).
A tromboplastina (fator tissular ou fator III) formada por um complexo de
lipoprotenas. Certos rgos como crebro, pulmo, placenta e os moncitos so
ricos em fator tissular (LORENZI, 2006). O TTPA avalia a via intrnseca da cascata
de coagulao, pela ativao do fator XII (Hageman). O fator XII ativado atua sobre
o fator XI gerando o fator XIa que na presena de fosfolipdeos de membrana e
clcio transforma o fator IX em uma enzima ativa (fator IXa), que ativa o fator VIII,
formando um complexo IXa-fosfolpedes-VIIIa que a tiva o fator X. Esse fator ativado
75
transforma a protrombina em trombina que atua no fibrinognio gerando fibrina. A

formao de fibrina, neste ensaio, tambm macroscpicamente demonstrada pelo
aparecimento de cogulo. O prolongamento de TTPA esta ligada a deficincia dos
fatores VIII e IX que pode ser desencadeada pela deficincia ou a inibio de tais
fatores da via intrinseca ou comum (LIMA et al., 2001).
Figura 24. Modelo esquemtico da via intrnseca e extrnseca da cascata de

coagulao bem como os locais de ao de algumas serinoproteases (SP) do
veneno de serpentes (SERRANO, 2013). FDP: produtos da degradao de fibrina;
Thrombin-like enzymes: Crotalus durissus terrificus.
Apenas o veneno de Cdcolli causou aumento tanto no tempo de protrombina

ativada (TAP) quanto no Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (TTPA),
enquanto que o veneno de Cdcasc alterou apenas TTPA. O veneno de Cdt no
apresentou alteraes nas respectivas provas de coagulao. Analisando os dados
obtidos, Lima et al., (2001) descreve as causas oriundas das alteraes nas provas
76
de coagulao. TAP normal e TTPA prolongado so indicativos de presena de

inibidores dos fatores VIII, IX e X, o prolongamento de ambos indicativo de
deficincias de X, V, Protrombina e Fibrinognio (afibrinogenemia,
hipofibrinogenemia ou disfibrinogenemia) ou a presena de substncias
anticoagulantes. Um detalhe importante que as protenas da cascata de
coagulao so produzidas pelo fgado, logo, alteraes na funo hepatica
(hepatite, insuficincia heptica) acabam interferindo na quantidade e na qualidade
das mesmas.
Os distrbios na hemostasia da coagulao so, tambm, resultados de uma
manifestao sistmica caractersticos do envenenamento crotlico (BUCARETCHI
et al., 2013). A composio do veneno destas serpentes constitui de uma mistura
complexa, constituda de enzimas, toxinas e peptdeos. Dentre estes, podemos
destacar as serinoproteases e metaloproteinases. Estas formam um grupo de
toxinas que afetam prinicipalmente o sistema homeosttico. Elas agem nos
componentes da cascata de coagulao, plaquetas e sobre os sistemas fibrinolticos
provocando desequilbrio na cascata de coagulao. Existem vrias SVSPs
(serinoproteases de venenos de serpentes) descritas na literatura, como a
batroxobina de B. moojeni, que funciona como um desfibrante (Defibrase ), ou
seja, forma fibrina I a partir de fibrinognio e ativa o plasminognio tecidual (PA-t). A
fibrina I um potente ativador de PA-t e aps a ativao deste, rapidamente
degradada por fibrinlise e excretada na urina. Por este processo, a batroxobina leva
o prolongamento da coagulao sangunea. Existem outras SVSPs que promovem a
agregao plaquetria e contribui para a coagulao sangunea, encontradas em
venenos elapdicos Australianos (ROSING e TANS, 1991, 1992; SERRANO, 2013)
que causam coagulao intravascular disseminada (CID), porm a base molecular a
partir das principais funes pr e anti-coagulantes no esto bem estabelecidas.
Alm disso, em algumas serpentes, as mudanas de alguns aminocidos
provenientes do mesmo RNA mensageiro geram formas proteicas (isoformas de
SVSPs) com funo modificada (SERRANO e MAROUN, 2005). Tal observao
pode explicar o fato de haver diferenas nos resultados das provas de coagulao
realizadas com os venenos de Cdt, Cdcolli e Cdcasc.
O fracionamento realizado nos venenos do presente estudo d uma
estimativa da variao na composio destes venenos. Assim podemos observar
que em P I (Cdt) possui cerca de 2%, D I (Cdcolli) com 6% e B II (Cdcasc) com 18%.
77
Tais diferenas de concentrao podem influnciar nos processos envolvido na

hemostasia da coagulao. Assim, a no alterao de TAP e TTPA pelo veneno de
Cdt pode ser atribudo reduo da concentrao das toxinas Convulxina e Giroxina
presentes em P I. J as alteraes provenientes do veneno de Cdcolli podem estar
ligadas a presena de um ou mais componentes, estes podem atuar de maneira
isolada ou associada causando aumento no tempo de coagulao. No veneno de
Cdcasc, que teve apenas alterao em TTPA, pode estar relacionado a
concentrao de B I no respectivo veneno ou a presena de outros fatores que
influenciam a cascata de coagulao.
Assim Markland e Swenson (2013) relatam as protenas que tem ao como
trombina-smile. Estas possuiam afinidade pelo fibrinognio plasmtico, mas no
ativavam o fator VIII (fator estabilizador de fibrina), ento clivam o fibrinognio em
fibrinopeptdeos A e B, e a clivagem destes, gera uma fibrina instvel, reticulada e,
portanto, facilmente degradada pelo sistema fibrinoltico e retirada da circulao pelo
sistema retculoendotelial causando assim, os efeitos desfibrinantes agudos e
prolongamento da coagulao (BELL, 1997). A presena de Fibrinogegenases,
ativadores de plasminognio, ativadores de protena C e D, 5-nucleotidases
presentes no veneno de serpentes da famlia Viperdae podem contribuir para as
alteraes da hemostasia de coagulao (SERRANO, 2013).
Oliveira e colaboradores (2009) verificaram a presena de enzimas que
possuem afinidade pelo fibrinognio, no veneno Cdt e Cdcolli. Atividade fibrinoltica
destas enzimas ocorria preferencialmente pela subunidade B do fibrinognio
seguido da subunidade A, caracterstica das serinoproteases, presente nestes
venenos. Logo, a incoagulabilidade sangunea observada em casos graves de
pacientes picados por Crotalus durissus pode ser decorrente do consumo de
fibrinognio causado por este mecanismo (BUCARETCHI et al., 2001). Em estudo
comparativo de agentes pro e anticoagulantes realizado por Suntravat e
colaboradores (2010) indicou que Crotalus atrox possui componentes fibrinolticos
tais como: ativador de plasminognio, -atroxase, fibrinogenase cadeia . Tais
toxinas atuam em fibrina/fibrinognio, ou agem como ativador do plasminognio,
causando a lise de cogulos (BAJWA et al.,1980, 1981 a,b; WILLIS e TU, 1988;
MARKLAND, 1998). No entanto, mais estudos precisam ser realizados para
determinar quais molculas e mecanismos de interao, possuem o papel central no
processo de inibio da cascata de coagulao nos venenos de cascavis.
78
6. Concluses
O estudo comparativo dos efeitos locais e sistmicos dos venenos das

serpentes Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus
durissus cascavela em camudongos swiss permite concluir que:
A cromatografia de gel filtrao sephadex G-75 e a eletroforese SDS-PAGE
em gel poliacrilamida 12,5% e 15% evidenciaram as toxinas presentes nos
venenos C. d. terrificus, C. d. collilineatus (Cvx, Gvx, Ctx e Ctm) e C. d.
cascavella (Cvx, Gvx e Ctx), classificando este ltimo como crotamino-
negativo.
Os venenos C. d. terrificus, C. d. collilineatus e C. d. cascavella no possuem
atividade proteoltica.
Os venenos C. d. collilineatus e C. d. cascavella possuem atividade de LAAO.
Os venenos C. d. terrificus e C. d. cascavella possuem atividade fosfolipsica.
Os trs venenos apresentaram atividade edematognica.
Todos os venenos apresentaram nveis elevados de CK caracterizando
quadro de miotoxicidade.
Todos os venenos induziram efeito cardiotxicos pela elevao de CK-MB
LDH.
A funo heptica foi afetada pelos venenos (promovendo o aumento nos
nveis de GGT, AST, ALT e Fosfatase Alcalina), sujerindo leso heptica.
A funo renal (Uria e Creatinina plasmtica aumentada com excreo
urinria diminuda e proteinria) foi afetada pelos venenos C. d. collilineatus e
C. d. terrificus, enquanto que C. d. cascavella apresentou proteinria,
indicando leso renal.
Os venenos C. d. collilineatus e C. d. cascavella causaram alteraes na
hemostasia da coagulao.
Tomados em conjunto, os dados obtidos permitem uma viso da variao
intraespecfica dos efeitos locais e sistmicos causados pelos venenos Cdt, Cdcolli e
Cdcasc. Com base nestas evidncias, e devido s alteraes provocadas no
sistema heptico, renal, muscular e na hemostasia da coagulao alm da variao
da composio proteica e enzimtica destes venenos, conclui-se que dentre os trs
venenos, o de Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus cascavella
mostraram maior intensidade nos sintomas observados.
79
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3453 Estudo Comparativo Dos Efeitos Locais e Sistemicos (Leticia Helena de Carvalho &amp; Juliana Zuliani)

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3453 Estudo Comparativo Dos Efeitos Locais e Sistemicos (Leticia Helena de Carvalho &amp; Juliana Zuliani)

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FUNDAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDNIA

LETCIA HELENA DE CARVALHO

ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS LOCAIS E SISTMICOS DOS

ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS LOCAIS E SISTMICOS DOS

LETCIA HELENA DE CARVALHO

Dissertao apresentada ao Programa de

Orientadora: Dr. Juliana Pavan Zuliani

Orientadora: Prof. Dr. Juliana Pavan Zuliani

Dissertao (Mestrado em Biologia Experimental) Ncleo de Sade

1. Crotalus durissus. 2. Miotoxicidade. 3. Nefrotoxicidade. 4.

Bibliotecria responsvel: Eliane Gemaque CRB-11/549

ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS LOCAIS E SISTMICOS DOS

Porto Velho, de____ de_________________ 2014.

Aos meus pais, Sebastio Antonio Carvalho Filho e

Aos meus irmos Heleno de Carvalho e Regiane

Ao meu marido, Stainer Barbosa Barbosa, por me

A minha filha querida Sleyner Carvalho Barbosa e

A minha famlia, que me deu condies de chegar ao fim deste trabalho.

Pelo auxlio, disponibilidade de tempo e material, me ajudando nas horas mais

Ao professor Dr. Andreimar Soares, pela colaborao, ajuda e pelos venenos

A Dra. Giselle Martins Gonalves pelas sugestes no exame de qualificao.

A Dra. Carla Freire Celednio Fernandes por participar da composio da banca e

A Aline Schmitz pela amizade e convvio to agradvel, pela disponibilidade de

A todos os meus Professores do PPGBIOEXP/UNIR.

As colegas de laboratrio Adriana Pontes e Sulamita Setbal, pelo apoio,

A todos os colegas do CEBio que colaboraram com a realizao desse estudo:

A todos os funcionrios da FIOCRUZ-RO e colegas de mestrado.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela

Ao CNPQ e FINEP pelo auxlio financeiro

Os acidentes causados por serpentes do gnero Crotalus causam srias

Palavras chave: Crotalus durissus, miotoxicidade, nefrotoxicidade,

Keywords: Crotalus durissus, myotoxicity, nephrotoxicity, hepatotoxicity,

Figura 1. Exemplar da serpente cascavel (Crotalus durissus) 16

Figura 2. Distribuio das espcies de Crotalus durissus no Brasil 18

Figura 3.Modelo esquemtico da interao da crotoxina com a membrana 20

Figura 4. Efeito clnico do envenenamento crotlico 23

Figura 5.Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus por 38

Figura 6. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de 40

Figura 7. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus 41

Figura 8. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de 41

Figura 9. Perfil cromatogrfico do veneno bruto de Crotalus durissus cascavella 42

Figura 10. Perfil eletrofortico referente ao fracionamento do veneno bruto de 42

Figura 12. Determinao da atividade proteoltica dos venenos Crotalus durissus 44

Figura 13. Determinao da atividade fosfolipsica dos venenos Crotalus 45

Figura 15. Efeito edematogenico induzido pelo veneno das serpentes C. d. 47

Figura 16. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 48

Figura 17. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 50

Figura 18. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 52

Figura 19. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 54

Figura 20. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 56

Figura 21. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 58

Figura 22. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 59

Figura 23. Efeito dos venenos das serpentes C. d. terrificus, C. d. collilineatus e 61

Figura 24. Modelo esquemtico da via intrnseca e extrnseca da cascata de 75

Tabela 1: Principais efeitos do envenenamento crotlico 25

AST Aspartato amino tranferase

1.1. Consideraes gerais

A Organizao Mundial da Sade considera acidentes ofdicos um grave

A gravidade dos acidentes por serpentes peonhentas depende de vrios

1.2. Gnero Crotalus (Linnaeus, 1758)

As serpentes do gnero Crotalus, cujo nome derivado do grego Krotalon

No Brasil ocorre a incidncia de apenas uma espcie, a Crotalus durissus.

Crotalus durissus terrificus

Crotalus durissus collilineatus

3453 Estudo Comparativo Dos Efeitos Locais e Sistemicos (Leticia Helena de Carvalho & Juliana Zuliani)

3453 Estudo Comparativo Dos Efeitos Locais e Sistemicos (Leticia Helena de Carvalho & Juliana Zuliani)

Porto Velho, de de_____________ 2014.