LABORATRIOS

INTEGRADOS em
BIOTECNOLOGIA

MDULO I
TCNICAS DE CULTURA
DE CLULAS
MICROBIANAS
 AULAS
Aula 1.
Preparao de meios de cultura slido (YPDA e
PDA)
Calibraes
Turbidimetria (abs vs massa seca)
Aula 2.
Transferncia de culturas em meio slido:
Leveduras e fungos filamentosos
Quantificao de densidade celular
Contagem de clulas
Contagem de CFUs
 AULAS

Aula 3
Calibraes
Mtodo DNS
determinao de aucares redutores
Cintica de crescimento de uma
cultura descontnua de S. cerevisiae
Aula 4
Anlise de amostras
Discusso geral de resultados
 1 Aula-Estirpes e meios

Saccharomyces cerevisiae
YPD
Peptona 20 g/L
Extrato de levedura 10 g/L
Glucose 20 g/L
Acertar a pH 5
O meio YPDA YPD +20 g/L agar.

Cada grupo prepara:

10 caixas de petri de YPDA para utilizar na 2 aula
4 para repicar: tcnicas de riscado
6 para espalhamento das diluies para determinao de CFU
4 tubos de ensaio para agar inclinado (cada tudo cerca de 5 a
7 mL)
 1 Aula - Meios

Aspergillus niger

PDA- Agar de batata 39 g/L

Cada grupo prepara 4 caixas de agar

Nota: cada caixa leva cerca de 20 mL

 1 Aula
Quantificao de densidade
celular (leveduras)

Calibrao da absorvncia vs peso seco

Determinao do peso seco da suspenso celular
Pesar 5 membranas vazias

Filtrar 5 mL de suspenso celular (3x)

Adicionar 15 mL de gua

Branco: filtrar 20 mL de gua (2x)

Secar a 80 C as membranas
o

Pesar membranas

Determinar peso seco g/L

Peso seco (g/L) =

=(mamostra-mbranco) g/0.005 L
 1 Aula Calibraes

Turbidimetria
Determinao da absorvncia da amostra inicial a 630 nm
Verificar se o valor menor que 1 (2 se for no ELISA)
Fazer as vrias diluies da suspenso celular
De modo a ter cerca de 10 pontos,
Ler ABS a 630 de cada diluio

Fazer uma curva de calibrao

peso seco (g/l) vs absorvncia

Abs

Nota: Analisar a reta e traze-la na 3 aula

X(g/l)
 2 Aula MTODOS DE
QUANTIFICAO
DE CLULAS

Procedimento experimental Contagem direta

Cmara de Neubauer
Colocar suspenso de
leveduras na cmara
Contar ao microscpio
 2 Aula MTODOS DE
QUANTIFICAO
DE CLULAS

Procedimento experimental Contagem

directa
Cmara de Neubauer
Cel/mL: n total levedurasx5x104
bactrias
leveduras

5 quadrados
(20 cel cada)

1 mm

5*4 = 20
quadrados
h = 0.1 mm
(10 cel cada)
 2 Aula MTODOS DE
QUANTIFICAO
DE CLULAS

Procedimento experimental - Contagem de

colnias efetuar para a cultura com cerca de 24h de tempo de
crescimento
Efetuar diluies a partir da suspenso original

Retirar 100 l de cada tubo e colocar numa placa de

petri
 2 Aula MTODOS DE
QUANTIFICAO
DE CLULAS

Procedimento experimental - Contagem de

colnias
Espalhar

Incubar a 30 oC durante 24h

Contar o nmero de colnias formadas (30-300)
Expressar o resultado em CFU/mL
Nota as caixas sero colocadas no frigorifico aps
incubao para contarem na aula seguinte
 2 Aula Transferncia
de culturas

Passos de transferncia de leveduras

Esterilizar a ansa chama;
Arrefecer;
Recolher colnias e transferir para meio
fresco;
Esterilizar a ansa no final;
Usar a tcnica de riscado que desejar.
 2 Aula Transferncia
de culturas

Meio slido
Placa Tubo inclinado

colnia
 2 Aula Transferncia
de culturas

Transferncia meio slido

 2 Aula Transferncia
de culturas

Passos de transferncia de fungos

filamentosos
Esterilizar uma pina chama; humedecer;
Recolher miclio de uma colnia e transferir
para um tubo de ensaio com 9 mL de
gua/tween 80 (0.05% v/v);
Retirar 20 mL da suspenso de esporos (106
espros/mL) asseticamente;
Colocar na superfcie de agar
Incubar e monitorizar crescimento
 2 Aula Transferncia
de culturas

Passos de transferncia de fungos

filamentosos
Retirar uma poro de agar de uma colnia com
ajuda de um furador de rolhas. Colocar o
fragmento, com a colnia voltada para baixo, no
centro de uma placa com o agar.

Colocar as placas na estufa de incubao a 25C.

Ao fim de 2 dias medir o dimetro da colnia em 2
dimetros perpendiculares.
 2 Aula Transferncia
de culturas

Passos de transferncia de fungos

filamentosos
 3 Aula CINTICA DE
CRESCIMENTO

Curva de crescimento

Multiplicao e
morte celular

morte celular >

clulas a crescer

Adaptao clulas dX m
mX X = Xo et td
dt ln 2
 3 Aula CINTICA DE
CRESCIMENTO

Procedimento experimental
Inocular 200 mL de meio YPD com 20 mL de uma subcultura de
S. cerevisiae
Retirar assepticamente 3 mL de amostra no tempo 0
Incubar a 30 oC em agitador orbital
Retirar novas amostras de cerca de hora a hora
Analisar as amostras (em caso de impossibilidade de
anlise, colocar a amostra no frigorfico ou congelador)
Anlise das amostras
Ler pH da suspenso
Ler absorvncia a 630 nm
Centrifugar a amostra e congelar sobrenadante para determinao
dos acares redutores mtodo DNS (a realizar na 4 aula).
 3 Aula Calibraes

Curva calibrao mtodo DNS (cido 3,5-dinitrossaliclico)

Doseamento de acares com poder redutor para utilizar

na monitorizao do consumo de substrato
Preparao solues padro de glucose (at 3 g/L)
Reao de DNS
100 L de DNS
100 L da amostra
Colocar num banho a 100 oC durante 5 min
Juntar 1mL de gua destilada
Arrefecer
Ler absorvncia a 540 nm
Traar a reta de calibrao Abs540 vs glucose (g/L)
Nota: Analisar a reta e traze-la na 3 aula
 Tratamento de resultados

Cintica de crescimento da levedura

Construir a curva de crescimento com os dados
de concentrao celular em g/L e em clulas/mL
em funo do tempo de incubao e comparar.
Determinar a taxa especfica de crescimento
exponencial e o tempo de duplicao das
clulas.
Construir a curva de variao da concentrao
de substrato ao longo do tempo e calcular os
rendimentos de substrato em biomassa.
Comparar a cintica obtida com dados da
literatura.
 4 aula
Anlises de amostras
Tratamento de resultados

Analisar amostras finais (se necessrio)

Comparar e criticar os mtodos de quantificao

de densidade celular usados para a levedura.

Avaliar a eficincia da repicagem de leveduras

em meio slido.

Avaliar e comentar o crescimento das colnias

de Aspergillus niger.
 Relatrio

Documento escrito em pdf (max 24 pag

excluindo anexos)
Sumrio (1 pag)
ndice geral
Introduo terica
Materiais e mtodos
Resultados e discusso
Concluses (1 pag)
Anexos

Entregar ficheiro excel com clculos

 Relatrio

Resumo calendarizao

Data Trabalhos a executar

21 set Preparao de meios slidos PDA e YPDA, esterilizao e
preparao de caixas de agar. calibrao peso peso vs
absorvncia.
28 set Transferncia de culturas. Mtodos de quantificao de clulas;
Plaqueamento e contagem de CFU; contagem de clulas ao
microscpio
12 out Cintica de crescimento.
Calibrao do mtodo de determinao de acares- DNS
19 out Anlise de amostras: aucares redutores; Discusso de
resultados.
2 nov Envio por email de relatrio (pdf) e excel
Teste individual