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04/03/2013

Vetores Virais e vacinas para Introduo


A utilizao de novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas
profilaxia de infeces virais.
tem sido amplamente pesquisada pela comunidade cientfica
mundial.

Doenas infecciosas incurveis como a AIDS, pandemias por


Influenzavrus, epidemias de dengue e doenas crnicas como a
hepatite C so alvo para o desenvolvimento de vacinas.

As vacinas recombinantes so as mais seguras, pois no h risco


de infeco por cepa vacinal.
Andra Mendona Gusmo Cunha
andrea.virologia@gmail.com Novas tecnologias, com o uso de vetores virais tem
revolucionado estudos na rea de imunizao e terapia gnica.

Vetores Virais

Vrus como veculos para o


O que so vetores virais??? transporte de Genes

Genes virais
Genes de interesse
associados a
so adicionados ao
patognese so
vetor
eliminados

Vetores Virais Por que usar vetores virais?


So vrus utilizados para inserir material gentico em clulas.
Vrus so parasitas intracelulares obrigatrios:
Processo de insero pode ser realizado:
Infeco natural X receptores X Penetrao
Em um organismo vivo ('in vivo)
Alta eficincia na transferncias de genes.
Em cultura de clulas ('in vitro).

Transporte de genes: Possuem tropismo.


Mtodos Biolgicos: Vetores virais Permite substituio de genes:
Mtodos Fsicos: eletroporao, microinjeo
Eliminao de genes no essenciais do vrus.
Mtodos Bioqumicos: co-precipitao com fosfato de clcio
Alterao na patogenicidade viral
Infeco viral X Transporte de Genes X Clulas Hospedeira.
Insero de genes exgenos.

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Vetores Virais
Vetores Virais
Viruses are highly evolved
natural vectors RNA DNA
for the transfer of foreign genetic information Retrovrus: HSV
into cells Lentivrus EBV
Vrus da Leucemia
Kay et al 2001 Murina (MLV) CMV
HIV Papillomavirus
Coronavrus Vrus da Vaccinia
Influenzavrus SV-40
Tipos: Togaviridadae Adenovrus
-DNA Afavirus: Ad Associado vetor
-RNA Vrus Sindbis
-Quimera Vrus Semliki Forest

Transferncia do Gene de Interesse


Classificao
Vetor Viral
Integram - Estvel No Integram - Transitria
vetor
Retrovirus: Adenovirus

Alphavirus
Lentivirus
Herpes Simplex Virus
Murine leukemia virus Expresso por integrao
Epissomal vetor
Vaccinia
Adeno-associated virus

(4kbp)

Therapeutico mRNA
Clula Alvo E sntese protica

Propriedades dos Vetores Virais


Vetores Virais
Segurana: Embora os vetores virais possam ser criados a partir de vrus
patognicos, estes so modificados de forma a minimizar o risco de
manipulao. Isso geralmente envolve a supresso de uma parte do
genoma viral, essencial para a replicao viral.
Gene Patognico X Gene Teraputico
Baixa toxicidade: mnimo sobre a fisiologia das clulas que infecta.

Estabilidade: Alguns vrus so geneticamente instveis e podem


rapidamente reorganizar seus genomas. Isso prejudicial para a
previsibilidade e reprodutibilidade dos trabalhos.

Especificidade Celular: a maioria dos vetores virais so projetados para


infectar a maior gama de tipos de clulas possvel. No entanto, por vezes
Vrus selvagem Vetor Viral o oposto prefervel. O receptor viral pode ser modificado para atingir ao
vrus um tipo especfico de clula.

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Vetor Adenovrus (Ad) Adenovrus


Taxonomia:
Pesquisas X Principais vetores. Adenoviridae, Adenovirus
Alta eficincia no transporte gnico. Isolados de aves e vrios mamferos.
Replicao X Diviso celular:
No oncognicos em humanos.
Presente ou ausente.
Adenovrus:
Baixa patogenicidade:
~50 sorotipos
Em humanos: infeces respiratrias, oculares e intestinais brandas.
6 Subgrupos (A-F)
Elevada expresso gnica
Principal sorotipo usados como Vetores Virais:
Usado em pesquisa para terapia do cncer:
Cncer de cabea e pescoo. Ad5 e Ad2

No integram:
Localizao nuclear

Estrutura Replicao dos Adenovrus


Adenovrus
Adeso
Vrus DNA fd linear
Penetrao
Tamanho: 70 a 100nm Decapsidao
Genoma: ~36Kb DNA no ncleo
No Envelopado
Biossntese
Capsdeo Icosadrico
Montagem ou
Protenas maiores
- H, P e F
empacotamento
Protenas menores Liberao

Flint et al. Principles of Virology, 2000


X. Zhang, W.T. Godbey / Advanced Drug Delivery Reviews 58 (2006) 515534

Primeira Gerao de Vetores Adenovrus


Genoma do Adenovirus (Replication Defectiva)

Expresso gnica:
Genes Early: (E1A, E1B, E2,E3 e E4)
Duplicao do material gentico
Genes Late: (L1-L5)

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Produo e uso do Vetor Limitaes do uso de Vetores


Adenovrus Virais Ad
Produo de baixos nveis de protenas do vetor
promove uma forte resposta imune cel e humoral:
Lise celular.

Experimento X Morte:
Administrao do Vetor Ad na artria heptica para tratar
deficincia de ornitina transcarbamilase (OTC).

18 anos - Jesse Gelsinger (Deficincia de OTC)

Suspeita: altas ttulos e toxicidade do vetor Ad, elevada


imunogenicidade

Vrus Adeno-Associados humanos


Vetor Adenovrus (VAA)
Foram descobertos em 1965 como contaminao de uma cultura
Vantagens: Desvantagens:
de Adenovrus.
Tropismo por clulas Resposta Imune contra o vetor
So vrus satlites (gnero Dependovrus), Famlia: Parvoviridae
especficas viral

Alta imunogenicidade. Requerem co-infeco com outro vrus para replicarem


Facilidade em modificar o
tropismo tecidual Expresso transitria (DNA Helper.

Infecta clulas replicando ou viral no integra) Adenovrus ou HSV


no. As protenas virais podem ser Extremamente pequeno: 18-26nm
Ttulos virais elevados expressas no hospedeiro aps
Menores vrus DNA no envelopados.
a administrao vetor.
1010-1013
DNA fs (~4.6 Kb)
Altos ttulos podem ser
Transporta ~ 8Kb
txicos. No patognicos p humanos

Adeno-associated Vrus vetor


Produo de AAVr
Recombinante (AAVr)
Infeco X Vrios tipos Celulares.

Prolongada expresso gnica.

Ausncia de citotoxicidade em humanos.

+ 70 protocolos clnicos usam AAVr

ITRs (Inverted Terminal Repeat)

Integrao no cromossomo 19
Menor integrao com AAVr (0,05%)

Terapia gnica X Vetor

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Produo do Vetor Adeno- Vetor Adevrus Associado (VAA)


associado Recombinante Adeno-associated virus vectors (AAV)
Vantagens Desvantagens
Expresso: Dependovrus
persistente. Vrus Helper
No promove mutaes Tamanho do inserto a ser
por insero. expresso limitado:
Especfica: C19 ~4.6 Kb
Infecta clulas: Riscos de mutaes
Diviso ou no. cromossomais.
Seguro No patognico

Vetores RNA Vetor MLV - MMLV


Realizam transcrio reversa
Famlia: Retroviridae
Promovem integrao estvel:
Espcies: Posio aleatria cromossmica
Vrus da Leucemia Murina Moloney Vetor (Pr-vrus) X Clulas filhas
(MLV ou MMLV)
Ativao de oncogenes???
HIV
Pesquisas X Terapia Gnica
Estrutura Bsica
Seleo de prognie viral defectiva
Genoma:
No causam lise na clula hospedeira.
RNA fs+

Produo e uso do Vetor


Vetor Retrovrus - MLV
Retrovrus
Vantagens Desvantagens
Alta eficincia na transduo. Requer clulas infectadas
Inseri at 8Kb em diviso.
Integra do genoma do Ttulos baixos: 106 107
hospedeiro, gerando resposta Integrao aleatria
sustentada. Infecta apenas um tipo
Sistema amplamente celular especfico.
estudado. Linfcitos T Helper
Protenas virais no so
expressas na cel. Hospedeira.

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Aplicaes dos Vetores Virais O que Terapia Gentica????

Desenvolvimento e produo de vacinas

Terapia gnica

Clonagem de genes

Bioproduo

Ferramentas para investigar clulas


hospedeiras.

Terapia Gentica
Princpios genticos X Tratamento

Introduo de material gentico em clulas normais


(In vivo):

Neutralizar o efeito de um gene da doena.

Introduzir uma nova funo.

Aplicaes:

Tratamento do cncer, doenas hereditrias,


imunodeficincias, doenas infecciosas.

Vacinas: Vetores Virais


Expresso intracelular da protena recombinante.
Capacidade natural dos vrus de infectarem clulas.
A protena recombinante expressa no contexto de
uma infeco viral que pode gerar um sinal de
perigo.
Reduz o risco de induo de tolerncia.

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Vacinas X Atualidade Imunizao


Vacinas so compostas por protena, Imunizao Ativa: Induo de resposta
polissacardeo ou cido nuclicos de imunolgica, com produo de clulas de
patgenos empregados para ativar uma memria e imunidade de longa durao.
resposta imune especfica contra
determinado agente infecciosos e ou
Imunizao Passiva: inoculao de
toxinas produzida por estes, com o objetivo
efetores de resposta imune, sem a induo
de induzir a formao de uma memria
de formao de memria imunolgica, nem
imunolgica protetora e de longa durao.
imunidade de longa durao.

Tipos de Vacinas
Inativada:
O patgeno inativado, morto, segura, porm menos imunognicas.
Tipos de Vacinas Virais
Influenza, Rotavrus
Atenuada:
O patgeno atenuado capaz de replicar sem causar doena no indivduo
imunizado. Deleo dos genes de virulncia. Desencadeiam uma resposta imune
celular e humoral, menos seguras, mais imunognicas.
Raiva, Febre Amarela, Sabin, Rotavrus.
Recombinante de Subunidades ou de VLP:
O gene que codifica a protena imunodominante inserido em um plasmdeo e
inoculado em um organismo para sntese da protena de interesse, mais segura e
menos imunognica.
HBV, HPV
Recombinante usando Vetores Virais:
O gene que codifica a protena imunodominantes inserido em um vetor viral que ir
infectar uma clula do indivduo imunizado, induzindo expresso e sntese da
protena alvo. Tem ao semelhante a de uma vacina viva.
Recombitec - Cinomose
Vacina de DNA:
Formulada com vetores (plasmidial ou viral) que carreiam o gene que codifica a
protena imunodominante. Ativam resposta imune celular e humoral.
Em fase de investigao: AIDS, malria, dengue, hepatite C

Resposta Imune induzida por Vetor


Viral Recombinante
Induo da Resposta Imune Celular
Patgenos Intracelulares Principais Vetores Virais
1- Infeco da clula hospedeira utilizados na produo de
2- As protenas do patgeno so
sintetizadas pela clula infectada. Vacinas em Mamferos
3- H expresso de protenas do
patgeno no citoplasma celular,
semelhante a uma infeco natural.
Apresentao pelo MHC e resposta
imune especfica.
4- O vetor viral pode infectar uma
variedade de clulas, inclusive as
clulas apresentadoras de antgenos,
favorecendo a resposta imune celular.

Rocha et al., INT. MICROBIOL. Vol. 7, 2004

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Adenovrus como Vetor Viral Poxvirus como Vetor Viral


Famlia: Adenoviridae Famlia: Poxviridae
Infecta um amplo espectro de linhagens celulares e tecidos. Espcie: Vaccinia virus
A insero de um gene por transduo um procedimento fcil e com
Utilizado como vetor viral em um amplo espectro de
excelentes resultados in vitro.
vertebrados, de pssaros a humanos.
O genoma viral permanece na forma epissomal (no replicativa) e
no so integrados ao genoma da clula hospedeira. No possui reservatrio natural:
No so citolticos (manipulao in vitro) Considerado um vrus de laboratrio.
No causam mutaes que interfiram no ciclo celular. Um dos vetores virais mais utilizados no desenvolvimento
Principalmente usado na terapia gnica e produo de vacinas. de vacinas para animais.
Capacidade de originar resposta imune especfica e eficiente.
Capacidade de fornecer elevadas quantidades de antgenos a tecidos
So vrus DNA df, capazes de incorporar largos
linfides. fragmentos de DNA alvo.
Capacidade de induzir uma rpida expanso e migrao de clulas T no
sistema linftico. Excelente vetor para expresso de genes de interesse.
Capacidade de originar uma resposta prolongada de clulas T. Replicam exclusivamente no citoplasma.
Induzem resposta imune celular e humoral.

Avipoxvirus como Vetor Viral Influeza virus como Vetor Viral


Famlia: Poxviridae Famlia: Orthomyxoviridae
Gnero: Avipoxvirus
Espcies: Canarypox (Cepa ALVAC) e Fowlpox (cepa TROVAC) Gnero: Influenzavirus, RNA fs (-)
Caractersticas similares aos Poxvirus Candidato promissor como vetor viral em
So vrus DNA df, capazes de incorporar largos fragmentos de vacinas.
DNA alvo.
Replicam exclusivamente no citoplasma. No integra no genoma da clula hospedeira.
Induzem resposta imune celular e humoral. No permanece por longos perodos no
patognico para aves - no replicam naturalmente em
mamferos.
organismo infectado.
Vetor seguro para uso em mamferos. Reduzido risco de causar neoplasia.
Cepas atenuadas atravs de passagens em ovos de galinha
embrionados..
Existem cepas atenuadas para utilizao como
Excelente vetor viral X Alta expresso de genes X Vacinas. vetor viral em vacinas.

Construo de um Vetor Viral Construo de um Vetor Viral


Recombinante Recombinante
Sequncia para

Identificao do gene que codifica a recombinao


Genoma Vacinia
virus
-Preparao de um plasmdeo
contendo o gene de interesse, um
protena imunodominante de interesse. Sequncia de
interesse
Plasmdeo de
transferncia Genoma Adenovrus
gene promotor do vetor viral, um
gene revelador.
Amplificao do gene selecionado. (plamdeo)

- A clula transfectada: recebe o

Plasmdeo + Recombinao viral. plasmdeo e o vetor viral para


recombinao.
Recombinao
O Vrus recombinante cultivado em Homloga
-Recombinao homloga.
cultura celular. Vrus -Isolamento do Vetor Viral:
Recombinante
Purificao do vrus recombinante. resistncia a drogas, deteco de
marcador de expresso colorido.

Recombinao homloga

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Vacinas: Vetor Viral Utilizao do vetor viral Adenovirus


em Vacinas vivas
Adenovirus Recombinante
Protocolos em fase de pesquisa.
Vacinas em pesquisa para preveno: Demonstrado a capacidade de induo da resposta imune celular de
linfcitos T CD4+ e CD8+.
Sarampo:
Considerados timos candidatos para expresso de genes na sntese
Protenas do envelope do Vrus do sarampo.
de vacinas vivas para doenas infecciosas.
Gripe:
Usada em experimentos humanos para doenas como AIDS e
Gene que codifica a H do Influenzavrus. Malria.
Hepatite B: Uma limitao do uso desse vetor em humanos alta prevalncia na
Gene que codifica o Hbs do HBV populao humana de imunidade pr-existente ao vetor Adenovrus.
AIDS: Sorotipos X Vetor Adenovrus para uso em humanos.
Gene que codifica Gp-120 e Gp-41 do HIV. Sorotipos humanos 2, 5 e 7 so bons candidatos
Malria: Ausncia de exposio prvia em humanos
Adenovrus isolados de ces e chimpanz
Gene que codifica protenas de vrias espcies de Plamodium.
Outra limitao das vacinas vivas que dependem da
Riva: capacidade de resposta imune do indivduo vacinado o que pode
gerar discrepncias.
Gene que codifica a proyena G.

Vacinas: Vetor Viral Poxvirus Utilizao do vetor viral Poxvirus em


Vacinas vivas
Recombinante
Protocolos em fase de pesquisa.
Vacinas em pesquisa para preveno:
Objetivo:
Hepatite B: induo da resposta imune celular de linfcitos T CD4+ e CD8+.
Gene que codifica o Hbs do HBV Considerados timos candidatos para expresso de genes
Gripe: na sntese de vacinas vivas para doenas infecciosas
Gene que codifica a H do Influenzavrus. causadas por patgenos intracelulares.
Vetor viral atenuado do Vrus da vaccinia (cepa MVA):
AIDS:
Usado em experimentos humanos: AIDS e Malria.
Gene que codifica Gp-120 e Gp-41 do HIV.
Uma limitao do uso desse vetor a capacidade do Vrus
Malria: da vaccinia induzir resposta imune contra protenas
Gene que codifica protenas de vrias espcies de heterlogas:
Plamodium. indivduos previamente imunizado com Vaccinia virus.

Vacina recombinante Esquema de produo da


vacina RECOMBITEK
Cinomose.

Cinomose com vetor viral


Patgeno: seleo de genes
do Vrus da cinomose canina.

Famlia: Paramyxoviridae

Vetor Viral: Vrus da bouba do


canrio ou Canarypox virus

Vetor viral recombinante:


Genes de interesse + Vrus da
bouba do canrio.

Induo da Resposta Imune

Vacina licenciada.

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Purevax FeLV Vacina RABORAL V-RG


(Vrus da leucose felina) Vacinas produzida por engenharia gentica usando vetor
viral.
Vrus canarypox, recombinante, FeLV-A. Proteo contra a raiva, Rhabdovirus.
A estirpe vacinal um vrus canarypox Famlia Rhabdoviridae, gnero: Lyssavirus
recombinante, que exprime os genes env e gag Vetor viral: Vaccinia virus (estirpe de Copenhaga com
do FeLV- A. o fentipo tk-do vrus da vaccinia).
Patgeno: Vrus da leucose felina (FeLV-A) O gene do Vrus da raiva que codifica a protena
imunodominante
Imunizao ativa contra a leucose felina.
Glicoprotena G
Data da primeira autorizao: 18/04/2005 Inserido num vetor, um vrus vetor atenuado.
Data da ltima renovao: 22/03/2010 Vaccinia virus
Produo: MERIAL, Frana. USO: Animais silvestre (Europa e EUA)

Benefcios das Vacinas


Vacina: RECOMBITEK WNV Recombinantes com Vetores Virais
Vacinas produzida por engenharia gentica: Eliminao de adjuvantes em vacinas.

Vetor viral. Eliminao do risco de reverso a virulncia ou contaminao


Vetor viral: Canarypox virus ambiental.
Proteo contra a infeco pelo Equine West Nile Maior segurana em espcies suscetveis.
Virus (Arbovrus).
Encefalite equina Rotas alternativas de administrao

Famlia: Flaviviridae Melhor eficcia (imunidade celular e humoral) e durao de


imunidade quando comparadas com vacinas inativadas.

Utilizao de antgenos puros, reduzindo reaes adversas.

Capacidade de diferenciar vacinados de infectados (DIVA).

Projetos de Pesquisa no Brasil


Vacinas X Vetores Virais Vetores Virais - CNPq
Vacinas de vetores virais combinam a vantagem da SEQUENCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTIGENO TS DE TRYPANOSSOMA CRUZI,
PROTEINA RECOMBINANTE TS E VIRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM O
expresso intracelular da protena recombinante com a ANTIGENO TS RECOMBINANTE.
capacidade natural dos vrus de infectarem clulas do
VETORES VIRAIS RECOMBINANTES, COMPOSIAO VACINAL PARA LEISHMANIOSE E METODO
hospedeiro. DE VACINAAO PARA LEISHMANIOSE.

SEQUENCIA GENETICAMRNTE MODIFICADA DO ANTIGENO ASP-2 DE TRYPANOSSOMA CRUZI,


A protena recombinante expressa no contexto de uma PROTEINA RECOMBINANTE ASP-2 E VIRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM
O ANTIGENO ASP-2 RECOMBINANTE.
infeco viral que pode gerar um sinal de perigo e
SEQNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTGENO AMA-1 DE PLASMODIUM VIVAX,
assim evitar a resposta de tolerncia. PROTENA RECOMBINANTE AMA-1 E ADENOVRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE
EXPRESSA O ANTGENO AMA-1 RECOMBINANTE.

Tipo de vacina promissora na medicina, com vrias Produo de vetores virais para terapia celular/reprogramao celular .

pesquisas em andamento. Produo de vetores virais para terapia celular/reprogramao celular

Vetores Virais em Terapia Gnica, Imunizao e Biologia Molecular

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