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Forma integrada da equao de Michaelis-

Menten
Integrao da equao de Michaelis-Menten

Existem situaes experimentais em que a estimativa das velocidades


iniciais pouco fivel, sendo necessrio recorrer forma integrada da
equao de Michaelis-Menten para poder extrair parmetros cinticos de
uma curva de progresso de produto.

d [P]
v =
dt
d [P] Vmax ([A]0 [P])
[A] = [A]0 [P] =
dt K m + ([A]0 [P])
Vmax [A]
v =
K m + [A]
Integrao da equao de Michaelis-Menten

Esta equao pode ser integrada por separao das variveis:

K m + [A]0 [P]
[A]0 [P] d [P] = Vmax dt

K m ln([A]0 [P]) + [P] = Vmax t +

Usando a condio inicial [P]=0 quando t=0, fica =-Km , e rearranjando vem:

[A]0
Vmax t = [P] + K m ln
[A]0 [P]
Integrao da equao de Michaelis-Menten

A forma integrada da equao de Michaelis-Menten muitas vezes escrita:

[A]0
V app
max t = [P] + K app
m ln
[A]0 [P]
O uso das grandezas aparentes reala o facto de que esta equao muito
mais geral do que o caso a partir do qual foi deduzida.
Vmax(app) e Km(app) podem diferir muito de Km e Vmax , podendo at ser
negativos!
No entanto, a seguinte relao sempre vlida:

app
Vmax [A]0
v0 = app
K m + [A]0

e permite estimar v0 se os valores de Vmax(app) e Km(app) forem


conhecidos.
Integrao da equao de Michaelis-Menten

A equao integrada,

[A]0
V app
t = [P] + K app
ln

max m
[A]0 [P]

pode ser rearranjada para a seguinte forma:

t 1 [P] K mapp
= app + app
ln ([A]0 / ([A]0 [P]) ) Vmax ln ([A]0 / ([A]0 [P]) ) Vmax
t [P]
Portanto um grfico de em funo de
ln ([A]0 /([A]0 [P]) ) ln ([A]0 /([A]0 [P]) )

app
produz uma recta de declive 1/Vmax e ordenada na origem K mapp / Vmax
app
t
ln ([A]0 /([A]0 [P]) )

[A]0 / v0 app
1/Vmax
K mapp / Vmax
app

K m / Vmax
1/Vmax

[P] [A]0
ln ([A]0 /([A]0 [P]) )
Competio de substratos e especificidade
enzimtica
Competio de substratos e especificidade enzimtica
A eficincia cataltica kA = kcat/Km tambm se designa por constante de especificidade.
A razo torna-se clara se considerarmos uma situao de competio entre dois
substratos A e A, pelo centro activo de um mesmo enzima E:


E + A
k1
EA

k2
E+P
k1



k1
E + A k2
EA E + P
k 1

A partir deste esquema podem deduzir-se o seguinte par de equaes de velocidade:

d [P] k2 [E]0 [A]


v= =
dt K m (1 + [A] K m ) + [A]

d [P] k2[E]0 [A]


v = =
dt K m (1 + [A] K m ) + [A]
Cada um dos substratos se comporta como um inibidor competitivo relativamente ao
outro, sendo a constante de inibio igual ao Km do substrato em competio.
Competio de substratos e especificidade enzimtica
O verdadeiro significado da constante kA emerge se considerarmos o quociente v/v :

k2 [E]0 [A] (k2 / K m )[E]0 [A]


v K m (1 + [A] K m ) + [A] 1 + [A] K m + [A]/K m ( k2 / K m )[E]0 [A]
= = =
v k2[E]0 [A] ( k2 / K m )[E]0 [A] (k2 / K m )[E]0 [A]
K m (1 + [A] K m ) + [A] 1 + [A] K m + [A] / K m

Tendo em conta que kA=k2 / Km e kA = k2 / Km :

v (k / K m )[E]0 [A] k [A] v kA


= 2 = A e quando [A]=[A] =
v ( k2 / K m )[E]0 [A] kA[A] v k A

Numa mistura equimolar de substratos competindo para o mesmo centro activo de um


enzima E, a razo entre as velocidades de catlise de dois substratos igual razo
entre as constantes de especificidade do enzima para cada substrato.
Competio de substratos e especificidade enzimtica
Parmetros cinticos para diferentes substratos da fumarase:

Substrate kcat (s-1) Km(mM) Ki(mM) kcat/Km(s-1mM-1)

Fluorofumarato 2700 0.027 - 100000

Fumarato 800 0.005 - 160000

Clorofumarato 20 0.11 0.10 180

Bromofumarato 2.8 0.11 0.15 25

Iodofumarato 0.043 0.12 0.10 0.36

Mesaconato 0.023 0.51 0.49 0.047

L-tartarato 0.93 1.3 1.0 0.72

Exemplo: numa mistura equimolar dos substratos fumarato e fluorofumarato o enzima


fumarase catalisa a decomposio do fumarato 60% mais rpido:
v kA 160000 O fumarato o substrato
= = = 1.60
v kA 100000 mais especfico
Teste de competio de substratos
Quando se verifica a transformao de dois substratos na presena de um extracto
enzimtico, podem verificar-se duas situaes:
a) O dois substratos competem para o centro activo de um mesmo enzima
b) Os dois substratos so catalizados por enzimas distintos presentes no extracto

Para distinguir entre estas duas situaes podemos recorrer a um teste de


competio.
A soma das velocidades v e v para dois substratos em competio :

(Vmax / K m )[A] + (Vmax / K m )[A]


v tot = v + v =
1 + [A] K m + [A]/K m
Determinando experimentalmente duas concentraes de referncia [A]=[A]0 e
[A]=[A]0 tais que:

Vmax [A]0 V [A]0


= max = v0
K m + [A]0 K m + [A]0

Estas so assim concentraes de [A] e [A] que conduzem a uma mesma velocidade
de catlise observada para cada substrato.
Teste de competio de substratos
Preparando uma srie de solues contendo uma mistura dos dois substratos tais que
as suas concentraes so interpoladas entre zero e [A]0 e [A]0 :

[A] = (1 r )[A]0
r [0,1]
[A] = r[A]0

Exemplo com 5 solues:

[A] = [A]0 [A] = 0.75[A]0 [A] = 0.5[A]0 [A] = 0.25[A]0 [A] = 0


[A] = 0 [A] = 0.25[A]0 [A]=0.5[A]0 [A]=0.75[A]0 [A] = [A]0
r =0 r = 0.25 r = 0.5 r = 0.75 r =1

Para cada uma destas solues, vtot ser a soma das velocidades observadas para a
catlise de A e A .
Teste de competio de substratos
A expresso de vtot assume a seguinte forma:

/ K m ) r[A]0
(Vmax / K m )(1 r )[A]0 + (Vmax
v tot =
1 + (1 r )[A]0 /K m + r[A]0 / K m
v0 [(1 r )(1 + [A]0 / K m ) + r (1 + [A]0 / K m )]
= = v0
(1 r )(1 + [A]0 /K m ) + r (1 + [A]0 / K m )
Concluso: se os dois substratos competirem para o mesmo centro activo, a
velocidade total observada ser a mesma em todas as misturas (vo).

hexocinase hexocinase +
galactocinase