Histologia

(Enfermagem)

Métodos de estudo e Técnicas:

como estudar as células

P rof a Dr a . Iêda Guedes

Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

•A Célula
•Processamento do material biológico
•Métodos histológicos e histoquímicos
•Poder de Resolução e Limite de Resolução
•Microscópio óptico
•Microscópio eletrônico
Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

•A Célula
•Processamento do material biológico
•Técnicas histológicas e histoquímicas
•Poder de Resolução e Limite de Resolução
•Microscópio óptico
•Microscópio eletrônico
• Escolha do anim al
• Escolha do M aterial (órgão)
• Fix ação
• Desidratação
• Diafinazação congelação
• I nclusão
• M icrotom ia
• Desparafinização
• Hidratação
• Coloração
• Desidratação
• M ontagem
 Tipos de Corantes
Naturais: - de origem Animal (Carmim)
- de origem Vegetal (Hematoxilina)

Artificiais
Básicos - Coram estrutura ácida (azul de metileno,
verde de metila, Pironina G).
Corante  Estrutura
Básico Ácida
Acidófilo Basófila
Artificiais Tipos de Corantes
Ácidos - Coram estruturas básicas (eosina, fucsina ácida, orange
G, azul de anila).
Corante  Estrutura
Ácido Básica
Basófilo Acidófila

Neutros - São misturas de corantes geralmente usados em

esfregassos sangüíneos.
Ex. azul de metileno + eosina

I ndiferentes - São corantes dissolvidos em solventes orgânicos

(Xilol/Bensol) usados para observação lipídios.
Ex. Sudam Black, Sudam I, II, III e IV
 Tipos de Corantes
Sim ples - usa-se apenas 1 tipo de corante. Ex. Células da bochecha –
azul de metileno
Com binada - usamos 2 ou mais tipos de corantes. Ex. H.E.
(Hematoxilina e Eosina)
Difusa - todo o material é corado. Ex. Medula espinal (H.E.) cora-se
tanto a substância Branca como a substância Cinzenta.

Eletiva - escolhemos a estrutura a ser corada e usamos um corante

específico. Ex. DNA – Reação de Feulgen
Direta - a estrutura tem afinidade pelo corante. Ex. Corante ácido
corando em estrutura básica.
I ndireta - a estrutura não tem afinidade pelo corante e usamos uma
solução para torná-la afim dele. A essa substância dá-se o nome de
MORDENTE. Ex. Coloração de Gran  corar bactérias. Usa-se Lugol como
mordente. Hematoxilina Férrica de Regaud  corar mitocôndrio. Usa-se
Alúmem de Ferro como mordente
 Tipos de Corantes
Ortocrom ática - a estrutura adquire a cor do corante.
M etacrom ática - a estrutura muda de cor, não fica com a cor do corante.
Ex. Mastócito - Azul de metileno. Ao microscópio óptico, aparece roxo.

P rogressiva - cora-se lentamente até atingir a cor desejada.

Regressiva - faz-se uma hipercoloração e depois descora-se lentamente até
atingir a cor desejada.

N egativa - destruímos a estrutura a ser observada e depois coramos o

restante
do material.
Ex. RNA destruí-lo com RNAse. Depois cora-se com Galocianina.
• Escolha do anim al
• Escolha do M aterial (órgão)
• Fix ação
• Desidratação
• Diafinazação congelação
• I nclusão
• M icrotom ia
• Desparafinização
• Hidratação
• Coloração
• Desidratação
• M ontagem
Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

•A Célula
•Processamento do material biológico
•Técnicas histológicas e histoquímicas
•Poder de Resolução e Limite de Resolução
•Microscópio óptico
•Microscópio eletrônico
Poder de resolução – é a capacidade de se enxergar dois pontos
distintos com a menor limite de resolução.

Limite de resolução - é a menor distância entre dois pontos que

ainda permite que sejam visualizados individualmente.
O limite de resolução (LR) depende, sobretudo:
- Abertura Numérica (AN) da objetiva
- comprimento de onda da luz utilizada.

-L  Limite de Resolução.
LR= k x λ -k Constante cujo valor é 0,61
AN -λ Comprimento de onda da luz utilizada
-AN Abertura Numérica da Objetiva.

Portanto, quanto m enor o lim ite de resolução,

m aior será o poder se resolução.
Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

•A Célula
•Processamento do material biológico
•Métodos histológicos e histoquímicos
•Poder de Resolução e Limite de Resolução
•Microscópio óptico
•Microscópio eletrônico
 Com ponentes M ecânicos
- Parafuso do Condensador
- Parafuso Macrométrico
- Parafuso Micrométrico
- Mesa ou Platina
- Charriot
- Presilha
- Braço
- Base
 Com ponentes Ópticos
- Fonte de Luz
- Condensador
- Canhão
- Ocular
- Revolver ou Porta Objetivas
- Objetivas:
- Panorâmica (4x)
- Pequeno Aumento (10x)
- Médio Aumento (40x)
- Imersão (100x)
Por que usamos óleo de Imersão ? Índice de refração do ar = 1
AN = n . senα Índice de refração do óleo = 1,5
LR = k . λ AN = n . senα (ar) AN = n . senα (óleo)
AN AN = 1 . sen30º AN = 1,5 . sen60º

AN  abertura numérica da AN = 1 . 0,5 AN = 1,5 . 0,866

objetiva. AN = 0,5 AN ~1,3
n  índice de refração do meio.
α  ângulo do raio de luz.
LR  Limite de resolução.
K  Constante cujo valoe é 0,61.
λ  Comprimento de onda da uz
utilizada.

P ortanto, quanto m enor o lim ite de resolução, m aior será o

poder se resolução.
Microscópio de Contraste de Fase
 Microscópio de Contraste de Fase
Contraste de fase
Comum Normaski

Contraste de fase Contraste de fase

Fase positiva Fase negativa
Microscópio de Contraste de Fase
 Microscópio de Polarização
Comum – acrescido discos polaróides: polarizador - analisador

Substâncias Cristalinas
Birrefringente-
anisotrópica

Substâncias Amorfas
isotrópicas
Microscópio de Fluorescência
Microscópio de Confocal
Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

•A Célula
•Processamento do material biológico
•Métodos histológicos e histoquímicos
•Poder de Resolução e Limite de Resolução
•Microscópio óptico
•Microscópio eletrônico
Microscópio Eletrônico
Microscópio Eletrônico de Varredura
 Microscópio Eletrônico X Óptico
Microsc. Optico Microsc. Eletrômico
Obtenção da Imagem Feixe Luminoso Feixe de Eletrons
Lentes Vidro Bobina Eletromagnética
Limite de Resolução 0,5 µm 0,0001 µm
1º Lente Condensador Bobina Condensadora
2º Lente Objetiva Objetiva Projetora
3º Lente Ocular Bobina Projetora
Tamanho de Ampliação 1000 à 1500 vezes 2.000.000 vezes
Material Pode ser vivo Nunca pode ser vivo
Fixação Bouin, Formol 10% Glutaraldeído (4ºC), T. de Ósmio
Desidratação Alcool Acetona
Inclusão Parafina Resina Epóxi, Araldite
Microtomia Micrótomo Ultra-micrótomo
Material da Navalha Metal Vidro ou Diamante
Distenção dos Corte Lâmina de Vidro Esteira Eletromagnética
Coloração Usa-se corante Não se usa corante