Disciplina de Bioquímica Estrutural

Curso de Biologia

Enzimas – Introdução
e Cinética
Prof. Marcos Túlio de Oliveira
marcos.t.oliveira@unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
 Enzimas
GRANDE maioria formada por proteínas
(algumas enzimas são formadas por RNA)
 Enzimas
Função: Catalizadores de reações químicas (aceleração das
reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em
diversas condições de temperatura e pH)

Composto B (produto)

Reação
catalisada
pela enzima
Composto A (substrato)

Centro ativo ou sítio

catalítico de uma Observe que não há
enzima é a porção da
molécula onde ocorre a
consumo ou modificação
atividade catalítica. permanente da enzima
 Enzimas

+ +
 Enzimas
metal
Parte Não
proteica .
(cofator)
coenzima
Enzima
holozima

Apoenzima
parte proteica

apoenzima holoenzima
 grupo prostético

Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos

químicos para a reação
Enzimas
 Classificação das Enzimas
Transferência de elétrons
Normalmente se adiciona o sufixo ase 1. Óxido-redutases
Se uma molécula se
( Reações de óxido-
ao nome do substrato ou à atividade reduz, há outra que se
redução).
oxida.
realizada:
•grupos aldeído
2. Transferases
•gupos acila
(Transferência de grupos
Urease – hidrolisa a uréia funcionais)
•grupos glucosil
•grupos fosfatos (quinases)
DNA-polimerase – polimeriza DNA
•Transformam polímeros em monômeros.
Atuam sobre:
Agora…. 3. Hidrolases •Ligações éster
Nomenclatura oficial das enzimas é (Reações de hidrólise) •Ligações glicosídicas
•Ligações peptídicas
dada pela Enzyme Comission da •Ligações C-N
International Union for Biochemistry
4. Liases •Entre C e C
and Molecular Biology (IUBMB) : (Adição a ligações •Entre C e O
duplas) •Entre C e N

Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3

- é uma hidrolase.........................3 5. Isomerases
(Reações de
- atua num anidrido......................3.6 isomerização)
- o anidrido contém fosfato..........3.6.1
6. Ligases •Entre C e O
- esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3 (Formação de ligações •Entre C e S
covalentes com gasto de •Entre C e N
ATP) •Entre C e C
Como as enzimas funcionam...

sítio ativo
(catalítico)

substrato

enzima
Como as enzimas funcionam...
 Como as enzimas funcionam...

mudança de
energia durante
a reação

como a reação progride

Como as enzimas funcionam...

energias de
ativação

variação de energia livre

padrão (bioquímica)
Como as enzimas funcionam...

É aqui que as enzimas

agem!!!

... e não aqui!

Como as enzimas funcionam...

energia de
ativação SEM
catalizador

energia de
ativação COM
catalizador
Como as enzimas funcionam...

intermediários da
reação
Como as enzimas funcionam...

passo limitante
da reação
 Enzimas

A energia de ativação é monstruosa!!!

+ +
 Enzimas acelaram reações várias
ordens de grandeza
Compare esses números !
Velocidade na Velocidade da
ausência de enzima reação catalisada Poder
Enzima catalítico
“Reações/segundo” “Reações/segundo”

Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106 7.7 X 106

Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300 1.0 X 109

Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578 1.9X 1011

AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60 6.0 X 1012

Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95 5.6 X 1014

Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa
o ciclo da reação em um segundo
Número moles de S catalisado por segundo
de = moles de enzima
turnover
 Como as Enzimas Funcionam...

sítio ativo
(catalítico)

formação de substrato
ligações
covalentes
transientes
com o enzima
substrato!
Como as Enzimas Funcionam...

Intermediário
ES
(E e S ligados
covalentemente)
Como as enzimas funcionam...

energia de
ligação

Maior fonte
de energia
livre usada
por enzimas
para abaixar
as energias de
ativação das
reações
 Como as Enzimas Funcionam...

sítio de ligação

sítio ativo
(catalítico) formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!

enzima substrato
Como as Enzimas Funcionam...
Como as Enzimas Funcionam...

formação de
várias ligações
fracas dão
especificidade
para ES!
Como as Enzimas Funcionam...
Modelo Chave-Fechadura

Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

o sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.

Modelo de encaixe induzido Nesse

Modelo de encaixe induzido modelo, o contacto com a molécula do
substrato induz mudanças
conformacio-nais na enzima, que
otimizam as intera-ções com os resíduos
do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje
em dia.
Exemplo do modelo de encaixe induzido
(Carbopeptidase)
A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr248 (em amarelo) e de
Glu270 (azul claro), e um átomo de Zn2+ (cinza).

A B

A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança
conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
Exemplo do modelo de encaixe induzido
(Carbopeptidase)
A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr248 (em amarelo) e de
Glu270 (azul claro), e um átomo de Zn2+ (cinza).

A B

A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança
conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
Como as Enzimas Funcionam...
 Cinética Enzimática
Uma abordagem à compressão do mecanismo

Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a

mudanças nos parâmetros experimentais – abordagem central para estudar o
mecanismo de reações catalisadas por enzimas.
 Cinética Enzimática
Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar
como a concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação .

Equação de Michaelis-Menten:

V0 = Vmax [S]
Km + [S]
Para se chegar à equação da hipérbole do gráfico V x S…

V0 = Vmax [S]
Km + [S]
 Cinética Enzimática
[S] muda com o passar do tempo em uma reação
enzimática in vitro. E daí?
[S]

1 2 3 4 5 6
tempo
 Cinética Enzimática

[S] [E]

Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é

mínima durante o estágio inicial da reação.
[S]

15 30 45 60
tempo
 Cinética Enzimática
É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)
 Cinética Enzimática
Praticamente linear; ou Saturação! Não adianta
seja, quanto mais adicionar substrato, a V0 não
substrato, maior a V0 muda significativamente.
 Cinética Enzimática

[E],
[S] [S] [E],
portanto portanto
[ES] é [E] é
favorecido favorecido
 Cinética Enzimática

[E],
[S] [S] [E],
portanto portanto
[ES] é [E] é
favorecido favorecido
Cinética Enzimática
 Cinética Enzimática

equação
y = m.x + b de reta
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática
 Cinética Enzimática

Km = k-1 = Kd
k1
Nesta condição, Km mede a afinidade da
enzima pelo substrato
 Interação Proteína-Ligante

concentração do ligante
porcentagem dos sítios de ligação ocupados
concentração constante da proteína
 Cinética Enzimática
kcat

descreve a taxa do passo limitante da reação

equivalente ao número de moléculas de

substrato convertidas a produto em uma
unidade de tempo em uma molécula de enzima,
quando a enzima está saturada com substrato
Cinética Enzimática

Número moles de S catalisado por segundo

de = moles de enzima
turnover
 Eficiência catalítica
Kcat/Km - Parâmetro mais adequado para
comparações cinéticas
Fatores que afetam a atividade enzimática
Condições do meio que afetam estabilidade protéica
• pH
• temperatura
% atividade enzimática máxima

O pH ótimo de uma enzima reflete

variações no estado de ionização de
resíduos de aminoácidos do sítio
ativo.

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

Fatores que afetam a atividade enzimática

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo
• Variações de temperatura: temperatura ótima

Desnaturação
% atividade enzimática máxima

100- térmica da
Temperatura proteína
ótima

Pouca energia
50- para a reação
acontecer Ao contrário da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimática versus
pH, a enzima só está
0-
desnaturada em temperaturas
acima da temperatura ótima.
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