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AULA PRÁTICA

Enzimas (β-glicosidade)

A β – glicosidade tem sido frequentemente detectada em microrganismos, plantas e


animais. Esta enzima está envolvida na degradação microbiana de celulose em glicose.
A mensuração da atividade da β – glicosidade é baseada na leitura em espectrofotômetro
do p – nitrofenol resultante da atividade enzimática da β – glicosidade.

Atividade da β – glicosidade:

Princípio do método: o método é baseado na determinação p-nitrofenol liberado após a


incubação do solo com p-nitrofenil glicosídeo (PNG) por 1 hora a 37 °C.

1. Equipamentos:
Balança analítica
pHmetro
Banho-maria
Espectrofotômetro

2. Reagentes:
Ácido cítrico
Ácido maléico
Ácido bórico
Tris (hidroximetil aminometano)
Cloreto de cálcio
p-nitrofenil fosfato

3. Preparo das soluções

Tampão universal (MUB) - solução estoque: dissolver 12,1 g tris; 11,6 g de ácido
maléico; 14 g de ácido cítrico e 6,3 g de ácido bórico em 500 mL de NaOH (1 mol L-1) e
diluir a solução para 1000 mL com água destilada. Armazenar a solução em geladeira a
4°C.

Tampão universal (MUB), pH 6,0: pipetar 200 mL da solução estoque MUB em um


beaker de 500 mL e titular a solução com HCl (0,1 mol L-1) até atingir pH 6,0. Transferir
para um balão volumétrico 1000 mL e completar o volume com água destilada.

CaCl2 (0,5 mol L-1): dissolver 73,5 g de CaCl2.2H2O em 700 mL de água destilada,
completar o volume para 1000 mL com água destilada.

Tampão Tris (0,1 mol L-1), pH 12: dissolver 12,1 g de Tris em 700 mL de água destilada
e titular a solução com NaoH até atingir pH 12. Transferir para um balão volumétrico
1000 mL e completar o volume com água destilada.
Solução PNG (p-nitrofenil β-D –glicopiranosídeo 25mM): dissolver 0,377 g de PNG
em 40 mL de MUB (pH 6,0), após a dissolução, completar a solução para 50 mL com o
mesmo tampão. Estocar a solução em geladeira.

Solução padrão de PNF (p – nitrofenol): dissolver 0,1 g de p-nitrofenol em 70 mL de


água destilada e completar a solução para 100 mL com água destilada. Armazenar a
solução em frasco escuro e em geladeira.

Procedimento:

Preparação das amostras

1. Pesar 0,5 g de solo em tubo Falcon de 15 mL;


2. Adicionar 2 mL de MUB (pH 6,0) e 0,5 mL de solução PNG, agitar o frasco por
alguns segundos até misturar o conteúdo;
3. Fechar o frasco e incubar em banho Maria por 1 hora a 37 °C;
4. Adicionar 0,5 mL de solução CaCl2 e 2,0 mL de tampão Tris, pH 12, agitar por
alguns segundos até misturar;
5. Filtrar a solução e medir a absorbância em espectrofotômetro a 410 nm.

Preparação do branco (controle):

1. Pesar 0,5 g de solo (amostra composta) em tubo Falcon de 15 mL;


2. Adicionar 2 mL de MUB (pH 6,0) e agitar o frasco por alguns segundos até
misturar o conteúdo;
3. Fechar o frasco e incubar em banho Maria por 1 hora a 37 °C;
4. Adicionar 0,5 mL de solução PNG;
5. Adicionar 0,5 mL de solução CaCl2 e 2,0 mL de tampão Tris, pH 12, agitar por
alguns segundos até misturar, em seguida filtrar a solução e medir a absorbância
a 410 nm.