Índice

1. Introdução:...................................................................................................................................... 2
2. Princípios dos métodos: .................................................................................................................. 5
Materiais e reagentes ............................................................................................................................. 6
Procedimentos ........................................................................................................................................ 6
3. Resultados ....................................................................................................................................... 7
4. Discussão de resultados e conclusão: ............................................................................................. 8
Anexo: questionário ................................................................................................................................ 9
Bibliografia ............................................................................................................................................ 12

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 1. Introdução:

O presente relatório visa abordar a determinação da Ureia (um composto toxico para os animais) na
urina, usando o método da Espectrofotometria.

A amônia liberada durante a desaminação dos aminoácidos é removida quase inteiramente através da
sua conversão para ureia de cordo com a seguinte equação da reação:

𝟒−
𝟐𝐍𝐇𝟒+ + 𝑯𝐂𝐎−
𝟑 + 𝟑𝐀𝐓𝐏 +𝐇𝟐 O Ureia + 𝟐𝐀𝐃𝐏 𝟑− + 𝟒𝐏𝐢𝟐− + 𝟐𝐀𝐌𝐏 𝟐− + 𝟐𝐇 +

Essencialmente, toda a ureia formada no corpo humano é sintetizada no fígado. Na ausência do

fígado, ou em graves doenças hepáticas, a amônia se acumula no sangue. Isso é extremamente tóxico,
especialmente para o cérebro, muitas vezes conduzindo a um estado denominado coma hepático.

Os estágios de formação da ureia são os seguintes:

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Após sua formação a ureia se difunde a partir dos hepatócitos para os fluídos corporais, sendo
excretada pelos rins, devido a sua alta difusibilidade e pelo facto de não possuir carga.

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Os mamíferos e alguns anfíbios excretam o nitrogénio de preferência na forma de ureia,
chamando-se portanto, ureotélicos. A ureia é bem solúvel em água, por isso sua eliminação
precisa forçosamente, por causas osmóticas, de quantidades consideráveis de água.

As aplicações dos métodos quantitativos de absorção ultravioleta/visível são utilizadas em

todos os campos nos quais informações químicas quantitativas são necessárias. No campo da
saúde, 95% de todas as determinações quantitativas são feitas por espectrometria de luz
ultravioleta/visível. A espectrofotometria é um método de análise óptico mais usado nas
investigações biológicas e físico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que
permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma
quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas
as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que aparece completamente
transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água
absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas,
visíveis e infravermelhas depende das estruturas das moléculas, e é característica para cada
substância química. Quando a luz travessa uma substância, parte da energia é absorvida: a
energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se
deve a absorção de certos comprimentos de onda da luz branca que incide sobre elas,
deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.
O instrumento usado na espectrometria de luz ultravioleta/visível é chamado
espectrofotômetro. Para se obter informação sobre a absorção de uma amostra, ela é inserida
no caminho óptico do aparelho. Então, a luz ultravioleta e/ou visível em certo comprimento
de onda (ou uma faixa de comprimentos de ondas) é passada pela amostra. A lei de Beer
estabelece que a absorbância de uma substância em solução é directamente proporcional a sua
concentração e a espessura que a luz atravessa.

A utilização da lei de Beer requer o estabelecimento do comprimento de onda à absorção

máxima. Conhecendo-se este comprimento de onda, preparam-se soluções com
concentrações conhecidas e determina-se este comprimento de onda. Fazendo-se um gráfico
da absorbância (eixo dos “Y”) em função da concentração (eixo dos “X”), obtém-se uma reta
que é chamada de curva padrão, a qual poderá ser utilizada para determinar a concentração
de soluções a partir dos valores de absorbância.

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 2. Princípios dos métodos:

Em meio ácido e a temperaturas elevadas a ureia reage com diacetil derivada de

diacetilmonoxima, produzindo 4,5-dimetil-oxo-imidazol, um composto cor-de-rosa púrpura.
A cor é intensificada pela adição de tiosemicarbazida, segundo a seguinte reação:

Ureia + diacetil 4,5-dimetil-oxo-imidazol (cor rosa púrpura)

Tiosemicarbazida
(intensifica a cor rosa púrpura)

Espectrofotometria:
Para a realização da experiência foi usado o método de espectrofotometria, que consiste num
método analítico que se baseia na interação (absorção e /ou emissão) da matéria com a
energia radiante, ou seja, radiação eletromagnética quando os eletrões se movimentam entre
níveis energéticos. A absorção da radiação luminosa acontece nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho no espectro da radiação eletromagnética.

Um espectrofotômetro é m aparelho que faz passar um fixe de luz monocromática através de

m solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida e a luz transmitida por essa solução.
Usando um prisma, o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda.
O espectrofotômetro vai permitir saber a quantidade de luz que é absorvida a cada
comprimento de onda.

Quando uma radiação eletromagnética, por exemplo, a luz visível, incide em uma solução, se
os fotões da radiação têm carga energia adequada, a energia associada a essa radiação ore três
diferentes tipos de variações:

 Ser reflectida nas interfaces entre o ar e a parede do frasco contendo a solução

(cubeta);
 Ser dispersa por partículas presentes na solução;
 Ser absorvida pela solução.

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Materiais e reagentes:
Materiais:
 Tubos de ensaio;
 Copos de precipitação;
 Espectrofotómetro em 520 nm;
 “Banho-Maria” a 100ºC;
 Cubetas’
 Pipetas;
 Balões para pipetar;
 Frasco de Erlenmeyer;
 Proveta de 100 ml;

Reagentes:
 Reagente cromogénico seguindo a sequência abaixo;
o Um certo volume de urina diluído em 100 ml de à destilada, usando o factor
100, pelo seguinte cálculo:
Factor F= 100 ml onde, VT é o volume total da proveta
(100 ml) e Vu é o volume total da urina
VT
F= Vu
100
100= Vu

Vu= 1 ml
 Urina;
 Água destilada;
 Reagente de diacetilmonoxima: dissolvidos em 1 L de água destilada, e na sequência
abaixo indicada os seguintes compostos:
o Diacetilmonoxima;
o Tiosemicarbazida;
o Cloreto de sódio.
 Reagente ácido: solução padrão de ureia a 2,4 e 6 mmol/L.

Procedimentos:
1. Depositou-se um pouco de urina num frasco de colheita de amostra limpo;
2. Diluiu-se um certo volume de urina por factor 100;
3. Preparou-se o reagente cromogénico misturando-se num frasco de Erlenmeyer 17,0
ml de reagente de diacetilmonoxima e 15,0 ml de reagente ácido;
4. Adicionou-se aos tubos de ensaio 3 ml da mistura ora preparada, agitou-se bem
colocou-se os tubos em “Banho-Maria” a 100ºC, durante 15 minutos;
5. Leu-se a absorbância a 520 nm contra o branco (tubo 1).

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 O quadro a seguir mostra a disposição final das amostras e soluções nos tubos (volumes
em ml):

Tubos 1 2 3 4 5 6
Ureia 2,0 __ 0,1 __ __ __ __
mmol/l
Ureia, 4.0 __ __ 0,1 __ __ __
mmol/l
Ureia, 6.0 __ __ __ 0,1 __ __
mmol/l
Água 0,1 __ __ __ __
Urina __ __ __ __ 0,1
Estudante A
Urina __ __ __ __ __ 0,1
Estudante B
Reagente 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
cromogénico

3. Resultados
Apos a colocação dos tubos de ensaio em um banho-maria a 100ºC foi possível observar a
mudança em termos de cor nos tubos excepto no tubo 1 (tubo branco) como indica o quadro a
seguir:

№ Do tubo Antes Depois

1 Transparente Transparente
2 Transparente Rosa purpura
3 Transparente Rosa
4 Transparente Rosa purpura
5 Transparente Rosa
6 Transparente Rosa

Apos a retirada dos tubos de ensaio em um banho-maria, os tubos arrefeceram a temperatura

ambiente e seguidamente transportou-se as amostras para cubetas especificas tendo-se
colocado em um espectrofotómetro para medir a absorbância de cada amostra, segundo a
tabela abaixo:

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 № Do tubo Absorbância (nm)
1 0.000
2 0,155
3 0,267
4 0,345
5 0,151
6 0,157

4. Discussão de resultados e conclusão:

Da experiencia ora realizada analisou-se mudança de cor em cada tubo de ensaio (2,3,4,5,e 6)
excepto no tubo 1, pois ele funcionou como o branco para a comparação das absorbâncias.

Realçar que o reagente cromogéneo funcionou como um indicador que acentuou alteração da
coloração das soluções que apresentaram maior concentração de ureia.

 Tubo 2: foi adicionado diacetilmonoxima, reagente acido, ureia a 2mmol/l e o

reagente cromogéneo, onde observou-se, apos o aquecimento no banho-maria, uma
coloração rosa purpura como resultado da reação da diacetilmonoxima com a ureia e
do reagente cromogéneo (que acentua a alteração coloração da solução).

 Tubo 3: foi adicionado um reagente acido, diacetilmonoxima, ureia 4mmol/l e o

reagente cromogéneo, onde ao fim da experiencia verificou-se uma coloração rosa
escura em comparação com o tubo 2, devido a maior concentração da ureia neste tubo
comprado com o tubo 2, dai que teve maior comprimento de onda neste tubo segundo
a medição de absorbância pelo espectrofotómetro.

 Tubo 4: foi adicionado o reagente ácido, diacetilmonoxima, ureia 6.0mmol/l e o

reagente cromogéneo. Apresentou coloração mais carregada – rosa escuro, este
facto foi devido a maior concentração de urina neste tubo comparado com os tubos
anteriores. Observou-se também maior absorbância num elevado comprimento de
onda, devido a concentração de ureia neste tubo comparado com os restantes tubos.

 Tubo 5: foi adicionado o reagente ácido, diacetilmonoxima, a ureia e o reagente

cromogéneo, apos retirada do banho-maria a 100°C observou-se que adquiriu uma
coloração rosa relativamente claro devido a baixa concentração da urina visto que ela
passou por uma diluição;

 Tubo 6: foi adicionado o reagente ácido, diacetilmonoxima, a ureia e o reagente

cromogéneo a solução deste tubo apresentou-se com a mesma coloração do tubo 5

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 uma vez que contem os mesmos reagentes. As absorbâncias foram diferentes porque
as amostras de urina eram de estudantes diferentes.

Anexo: questionário

1. Que outros métodos de análise de ureia existem?

Urease. Os primeiros métodos empregados na determinação baseavam-se na transformação da

uréia em amônia e dióxido de carbono, pela acção catalítica da enzima urease. A amônia
formada nesta reação era determinada colorimetricamente pelo reagente de Nessler ou pela
reação de Berthelot.

Urease
Uréia + H2O 2 NH3 + CO2

Urease/glutamato desidrogenase. A amônia obtida pela reação da urease também pode ser
medida espectrofotometricamente pela reação acoplada urease/glutamato desidrogenase
(GLDH) com o emprego de a-cetoglutarato para oxidar o NADH a NAD+. O modo cinético
de análise elimina interferências causadas por desidrogenases e amônia na amostra. Este é o
método mais usado em equipamentos automáticos.

GLDH
2 Cetoglutarato + NH3 + NADH L-Glutamato + NAD

Corante indicador. A medida da amônia obtida pela ação da urease também é conseguida pelo
emprego de corante indicador de pH para produzir cor. O princípio do corante indicador é
empregado na tecnologia de química seca.

Conductimetria. Outro método comum para a quantificação da ureia é baseado na alteração na

condutividade de uma amostra que ocorre após a ação da urease sobre a ureia. O CO2 e a
amônia produzidas pela ação enzimática reagem para formar carbonato de amônio.

2. Apresente a sua curva – padrão e os resultados da sua urina e da do seu colega.

№ Do tubo Absorbancia (nm)

1 0.000
2 0,155
3 0,267
4 0,345
5 0,151
6 0,157

9
 Absorbancia (nm)

0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6

Tubos de ensaio contendo amostras

3. Calcule o seu consumo de proteínas nas últimas 24 horas, a partir dos resultados
de ureia. Assuma que a concentração de ureia determinada na sua urina é
representativa de um dia e corresponde a um valor urinário diário de 1,5 L.
assuma também que cada 100g de proteínas fornecem 18g de nitrogénio.

Cureia = 204, 6 mmol/ l 1,5 litros de urina____________ 100 %

V ureia _______________80 %
V ureia = 1, 2 litros

n= C * V 1 mol de ureia (NH2)2CO ________28 g

nitrogénio
n= 204,6 * 1,2 0, 246 mol de ureia_________ x
n= 245,52mmol = 0,246 mol x = 6,9 g

100g (proteínas) ________ 18g (nitrogénio)

X________ 6,9 g (nitrogénio)

X= 38,3 g de proteínas

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 R: O consumo de proteínas foi de 38,3 g nas últimas 24 horas.

4- Que tipos de dieta podem levar a uma excreção mínima de nitrogénio na urina?

1- Uma dieta com baixo valor proteico, ou seja, no caso de um individuo estar em jejum
por 2 ou 3 dias induziria a uma diminuição na quantidade de ureia na urina, devido ao
défice do catabolismo proteico, visto que, não há proteínas da dieta e o organismo ainda
não começou a mobilizar as proteínas para sua degradação, e só os triacilglicerois.
2- Dieta com alto valor glicídico, pois se houver glicose suficiente no organismo não
haverá necessidade do uso de proteína.

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Bibliografia
 Lehninger, Albert. Princípios de Bioquímica. 4ª Edição 2004
 www.wikipedia.com/wiki/detrminacao de ureia na urina
 Roteiro da aula prática (Determinação da Ureia)

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