Métodos de análise

microbiológica de alimentos

Prof. Dr. Alexandre R. Coelho

Análise microbiológica de alimentos:

• Presença ou ausência de micro-organismos

no produto;

• Quantificação de micro-organismos
presentes no produto;

• Identificação e caracterização de espécies.

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 Métodos utilizados em
microbiologia de alimentos

• Métodos tradicionais ou convencionais;

• Métodos rápidos ou alternativos.

Métodos tradicionais ou convencionais

• Foram desenvolvidos há muitos anos e vêm sendo empregados
como métodos oficias na maioria dos laboratórios brasileiros e
outros países;
• Esses métodos estão descritos em publicações consideradas de
referência, internacionalmente aceitas:
1992: - FDA (Food and Drug Administration)
- AOAC (Association of Official Analytical Chemists International)
- APHA (American Public Health Association)

1978: - ICMSF (International Comission on Microbiological Specifications for

Foods)
- ISO (International Organization for Standardization)
- IDF - International Dairy Federation

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 Métodos tradicionais ou convencionais

• Trabalhosos;
• Demorados;
• Muito material de laboratório;
• Requer pessoal treinado;
• Sujeito a falhas humanas.

Métodos tradicionais ou convencionais

• Sensibilidade insuficiente: capacidade de

detectar o que o método propõe;
• Especificidade: detecta só micro-
organismos procurados?
• Repetitividade: se o operador fizer 50 vezes
ele obtém o mesmo resultado?
• Reprodutibilidade: gera resultados
estatisticamente iguais?

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Tópicos importantes para Análise microbiológica
• Amostragem: obtenção correta das amostras
e transporte para o laboratório;

• Preparação da amostra para análise: técnicas

assépticas em todas as etapas,
homogeneização (quando possível), coleta
de unidade analítica, diluições seriadas;

• Métodos de contagem, isolamento e

identificação e micro-organismos.

Métodos tradicionais ou convencionais

• 1. ANÁLISE QUANTITATIVA - MÉTODOS DE CONTAGEM
DE MICRO-ORGANISMOS
A) Por plaqueamento: contagem de colônias em placas de Petri
- Técnica de inoculação por profundidade “pour – plate”
- Técnica de inoculação por superfície
- Técnica de inoculação por sobrecamada
B) Por Determinação do Número Mais Provável (NMP): estimativa

• 2. ANÁLISE QUALITATIVA
- Pesquisa de presença/ausência de micro-organismo
- Confirmação de gênero / espécie (séries bioquímicas)

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 Teste de coagulase para
confirmação de S. aureus
coagulase

http://www.youtube.com/watch?v=1p882Ey-Ri0

Teste de catalase
http://www.youtube.com/watch?feature=pla
yer_embedded&v=NP4jLUPMHbU

Teste Bioquímico: IMVIC

INDOL Vermelho de Metila

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 Teste Bioquímico: IMVIC

Voges Proskauer CITRATO

MÉTODOS RÁPIDOS OU
ALTERNATIVOS

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 Objetivos dos métodos rápidos em
análises microbiológicas

• Melhorar a eficiência dos laboratórios,

simplificando trabalhos, reduzindo o custo;

• Aumentar confiabilidade dos resultados

(kits prontos para uso);

• Aumentar a precisão dos resultados.

Métodos rápidos ou alternativos

1) Método automatizado (plaqueamento em espiral)

2) Métodos rápidos quantitativos

3) Identificação/caracterização de micro-organismo

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 1. Método automatizado
(plaqueamento em espiral)

A) Pesagem ("Diluter");
B) Homogeneização ("stomacher-
homogeneizador");
http://www.interscience.fr/lab-blender-bagmixer
C) Semeadura ("Spiral plater");
D) Plaqueamento (uso de meios cromogênicos).

Semeadura ("Spiral plater")

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 Semeadura ("Spiral plater")

http://www.youtube.com/watch?v=sN-1frYvh90

2. Métodos quantitativos

• Determinação de micro-organismos deteriorantes

/ Indicadores
• Emprego de métodos de contagem direta e
indireta

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 Métodos de contagem direta
Membrana filtrante

Utilizada para líquidos onde grande

quantidade é necessitada para amostra:
utilizada em água, refrigerantes.

Contagem direta - Meios cromogênicos

Ágar RAMBACH

Colônias incolores:
Proteus sp

Colônias vermelhas:
Salmonella sp

Colônias azuis:
E. coli

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 MEIOS
DIFERENCIAIS
BIOLAB MERIEUX

DIREFERENCIAÇÃO DE:

Escherichia coli,
Enterococcus sp,
Proteus sp,
Klebsiella sp.

Contagem direta
Petrifilme

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 Contagem direta - Petrifilme
Técnica para análise de Escherichia coli

Contagem direta - Petrifilme

Técnica para análise de Enterobacteriaceae

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Contagem direta - Petrifilme
Técnica para análise de
Bolores e leveduras

Contagem direta - Petrifilme

Técnica para análise de S. aureus

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 Contagem estimada (NMP)
Técnicas fluorogênicas: baseiam-se na propriedade
do metabolismo microbiano pesquisado emitir
fluorescência, sob luz ultra-violeta.
Exempos: - Fluorocult (Merck)
- LST-MUG
- LMX Plus

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 Aquateste para coliformes

Desenvolvimento da cor Fluorecência quando

Sem desenvolvimento de
amarela submetido a luz UV
cor
366nm

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 Contagem indireta
• 1. Bioluminescência;
• 2. Impedância / Condutância.

BIOLUMINESCÊNCIA

• Princípio: quantidade de ATP detectada a partir

de células metabolicamente ativas (inclusive
micro-organismos).
• Mecanismo: Reação de enzima luciferina-
luciferase;
• ATP - Reage com a enzima produzindo luz,
medida em um luminômetro, espectrofotômetro
ou fluorímetro.

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 BIOLUMINESCÊNCIA
• Aplicação comum: monitoramento de higienização em
plantas processadoras de alimentos e em pontos críticos
de controle;

• Consistem em um swab aplicado na superfície a ser

checada: introduz num tubo com os reagentes
necessários e o coloca no luminômetro que mede a
intensidade da luz.

IMPEDÂNCIA/CONDUTÂNCIA
Princípio: micro-organismos alteram a
impedância/condutância de um meio de cultura devido às
atividades metabólicas na multiplicação. O acúmulo
destes compostos produz alterações mensuráveis.

Ex.: - BACTOMETER-Bio Mérieux – impedância

- Malthus - condutância

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 3. Métodos Qualitativos
Técnicas de isolamento / identificação de micro-organismos

Técnicas Bioquímicas Miniaturizadas (Kits):

- Métodos que a partir de uma cepa obtida por
algum método de detecção, é inoculada em kits
- São observadas para capacidade de realizar
determinadas reações bioquímicas. Ex: Galerias API,
Bio-Mérieux

http://www.youtube.com/watch?v
=ekRPD-eojd4

Técnicas de isolamento / identificação

de micro-organismos
Técnicas Imunológicas: baseiam-se em reações entre antígenos e
anticorpos específicos para esses antígenos.

- Técnica de imunocaptura (isolamento): micro-organismos

aderem à superfície de partículas revestidas de anticorpos
específicos.
Ex: Listeria spp.; Salmonella spp. e toxina de C. perfringens.

- Técnicas de imunoimobilização (triagem): imobilização de

bactérias móveis cultivadas em meio semi-sólido (anticorpos
flagelares específicos).
Exemplo: Salmonella 1-2Test
http://www.youtube.com/watch?v=STV_aaCriYE

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 Técnicas de isolamento / identificação
de micro-organismos
Técnicas Imunológicas:

- Técnicas imunoenzimáticas (triagem): ligação do antígeno com o

anticorpo específico (geralmente com enzimas cromogênicas).

Ex: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay -

Ensaio de imunoabsorção enzimática)

http://www.youtube.com/watch?v=Jmrv137VQIA

http://www.youtube.com/watch?v=GsJHYeQy5SU

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 Técnicas de isolamento / identificação
de micro-organismos
Técnicas genéticas:

- Teste de Hibridização: sondas genéticas (segmentos de DNA de

fita simples), radioativas ou colorimétricas.

- Reação de Polimerase em Cadeia – PCR: multiplicação de

milhões de cópias de um segmento de DNA

http://www.youtube.com/watch?v=JYY8TLu3hjU

http://www.youtube.com/watch?v=FwbUurYvzPU

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Métodos rápidos para análise microbiológica de alimentos – 2015
University of Maryland - Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition

- 3M Molecular Detection System (3M):

http://www.youtube.com/watch?v=BIGmhbcKtPk
- Vidas (bioMerieux)
- iQ-Check Real-Time PCR (BioRad)
- BAX Q7 (Dupont)
- ABI 7500 Fast (Life Technologies)
- Pathatrix Auto Instrument (Life Technologies)-tentative

E-mail: ifstl@jifsan.org

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