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Brazilian Journal of Development

Desenvolvimento de estratégias de biorremediação com base na melhoria da


produção de biomassa a partir de cepas isoladas em solos contaminados por
hidrocarbonetos e sua aplicação em tecnologias de biorremediação

Desarrollo de estrategias de biorremediación basadas en la mejora de la


producción de biomasa a partir de cepas aisladas en suelos contaminados con
hidrocarburos y su aplicación en tecnologías de biorremediación

DOI:10.34117/bjdv5n7-211

Recebimento dos originais: 13/07/2019


Aceitação para publicação: 06/08/2019

Debora Conde Molina


Licenciada en Biotecnología
Facultad Regional Delta. Universidad Tecnológica Nacional
San Martín 1171-Campana-Buenos Aires.
e-mail: dym2700@gmail.com

Franco Liporace
Ingeniero Químico
Facultad Regional Delta. Universidad Tecnológica Nacional
San Martín 1171-Campana-Buenos Aires.
e-mail: fliporace@frd.utn.edu.ar

Carla Quevedo
Doctora en Biotecnología de la Universidad de Buenos Aires Facultad Regional Delta. Universidad
Tecnológica Nacional San Martín 1171-Campana-Buenos Aires.
Correspondence Author
e-mail: quevedo.carla@gmail.com

RESUMO

A poluição ambiental gerada pelo petróleo ou seus derivados é frequente, devido ao seu amplo uso em
todo o mundo. A descarga e derramamento acidental desses compostos no meio ambiente acaba sendo
perigosa para o meio ambiente e para os seres vivos. A biorremediação é uma estratégia eficiente para
limpar locais contaminados, sendo não invasiva e econômica. Baseia-se na biodegradação natural,
utilizando microorganismos nativos isolados de áreas contaminadas. O centro industrial de Zárate-
Campana, localizado em Buenos Aires, representa uma das áreas petroquímicas mais importantes da
Argentina, com várias empresas que realizam atividades petroquímicas. Neste estudo, 4 cepas
previamente isoladas de locais contaminados e identificados nos gêneros Pseudomonas sp,
Cellulosimicrobium sp e Ochrobactrum sp. A cepa MT1A3, pertencente ao gênero Pseudomonas, foi
selecionada para os testes de otimização da produção de biomassa a partir do uso de diferentes fontes de
carbono, variando de uma mistura de hidrocarbonetos a co-produtos agroindustriais e fonte de
nitrogênio. O MT1A3 foi capaz de crescer em uma mistura de hidrocarbonetos, obtendo 1,79 g / L de
biomassa a 25 ° C em 7 dias. Ao comparar o uso de diferentes co-produtos agroindustriais de baixo
custo como fonte
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alternativa de carbono, a produção de biomassa foi significativamente maior no óleo de amendoim


bruto em comparação com todos os outros substratos (p <0,05), resultando em uma biomassa de
7,29 g / L após 7 dias de cultivo. A fonte mais eficiente de nitrogênio para obter biomassa de
MT1A3 foi o NaNO3. A partir desses resultados, a eficácia da remediação foi avaliada em sistemas
de microcosmos, monitorando a degradação de hidrocarbonetos nos diferentes tratamentos de
atenuação natural, bioestimulação e bioaugmentação, por 120 dias. O melhor tratamento, que
envolveu bioaugmentação (MT1A3) e bioestimulação, apresentou uma degradação de 40,05% do
total de hidrocarbonetos em relação ao tratamento de atenuação natural utilizado como controle.

Palavras-chave: biorremediação, solos contaminados, hidrocarbonetos, microcosmo

ABSTRACT

Contaminated sites with petroleum compounds are frequently observed, requiring the development of
innovative technologies for its remediation. The problem is caused due to the widespread usage of
petroleum-based products. Their discharge and accidental spillage in the environment prove to be
hazardous both to the surroundings and life forms. Bioremediation is an efficient strategy for cleaning
up sites contaminated with organic pollutants. It is a non-invasive and cost-effective technique that
relies on natural decontamination using microbes of isolated strains from contaminated areas for the
clean-up of these petroleum hydrocarbons. The Zárate-Campana industrial center, located in Buenos
Aires, represents one of the most important petrochemical areas in Argentina, with several companies
carrying out petrochemical activities. In this study, we have investigated the ability of microorganisms
to degrade these hydrocarbons. Samples were collected in the surroundings of the Campana area and
screened for hydrocarbon degrading bacteria. 4 of the 13 strains previously isolated from contaminated
sites were screened and identified as Pseudomonas sp, Cellulosimicrobium sp and Ochrobactrum sp. A
new approach using MT1A3, belonging to Pseudomonas genus in petroleum biodegradation from the
use of different carbon and nitrogen sources, was proposed to provide maximum biomass production
and was evaluated for its degradation characteristics. MT1A3 grew in all carbon sources tested and was
able to grow in a hydrocarbon mixture obtaining 1.79 g/L of biomass production at 25 ºC after 7 days.
When comparing the use of different low-cost agro-industrial co-products as an alternative carbon
source, the biomass production was significantly higher in crude peanut oil in comparison to all other
substrates (p < 0.05), thus resulting in a biomass of 7.29 g/L. The most efficient nitrogen source for
obtaining biomass from MT1A3 was NaNO3. Based on these results, the effectiveness was evaluated by
monitoring total hydrocarbons (THs) and n-alkanes degradation as well as changes in bacterial
population of natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation treatments in microcosm design
over a 120-day period. The best treatment, which involved bioaugmentation (MT1A3) and
biostimulation strategies, showed a degradation of 40.05 % of total hydrocarbons with respect to the
natural attenuation treatment used as control. The highest concentration of THAB and HDB was
10 6
recorded, reaching a value of 2,17x10 CFU and 8,91x10 UFC respectively.

Keywords: bioremediation, contaminated soils, hydrocarbons, microscom.

1- INTRODUÇÃO
Os produtos à base de petróleo são a principal fonte de energia para várias indústrias e também é a
matéria-prima para muitos produtos químicos, como plásticos, tintas e cosméticos.

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A quantidade de petróleo armazenada nos países desenvolvidos é significativamente alta e seu


transporte em todo o mundo é frequente e gerou um grande interesse nas últimas décadas devido às suas
propriedades mutagênicas e cancerígenas e sua recalcitrância no meio ambiente. O petróleo é uma
mistura complexa de diferentes hidrocarbonetos, incluindo compostos alifáticos (lineares ou
ramificados), cicloalcanos, mono e poliaromáticos, asfaltenos e resinas (Philip et al., 2005; Yemashova
et al., 2007). Tradicionalmente, a eliminação de contaminantes orgânicos foi abordada por meio de
tecnologias comprovadas e eficazes que envolvem tratamentos físicos e / ou químicos (Arauna, 2004).
Em nosso país, grandes áreas afetadas por esse tipo de contaminantes, como a Patagônia, aumentaram
como conseqüência das atividades de mineração, metalurgia e deposição atmosférica de usinas de
combustíveis fósseis, resultando no acúmulo sério e prejudicial de hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (HAP). A extensão e importância dessa poluição depende de vários fatores: quantidade de
produto derramado, características do solo (composição, textura), fluxo de água e direção e intensidade
do vento. Por esse motivo, foram desenvolvidas técnicas de remediação para mitigar o impacto dessa
poluição e auxiliar na recuperação desses locais (Riser-Roberts, 1998). Os resultados derivados deste
estudo nos permitirão obter novas idéias sobre a aplicabilidade de estratégias biológicas para lidar com a
remoção de solo poluído por HAP e considerar uma nova opção para limpar o meio ambiente. É por isso
que os métodos de biorremediação amigáveis ao meio ambiente usados como alternativa aos métodos
químicos ou físicos são promissores nos dias de hoje (Boer e Wagelmans, 2016). Tratamentos
biológicos, como técnicas de biorremediação, envolvem o uso de fitorremediação baseada em plantas e
seus microorganismos associados para remover poluentes do ambiente ou torná-los menos prejudiciais
(Salt et al., 1998; Arora, 2018). É por isso que surge a necessidade premente do isolamento e
identificação de micróbios degradantes eficientes e do design de maneiras de acelerar a taxa de
biodegradação dos componentes poluentes do petróleo em ácidos graxos e dióxido de carbono ou
poluentes em substâncias muito menos tóxicas. Esse tipo de processo é ecológico. Portanto, raramente é
necessário um tratamento subsequente, apresentando uma situação que os posicione como uma
alternativa muito interessante quando comparado a outros tratamentos. O petróleo bruto é constituído
por milhares de componentes que são separados em saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos. Os
hidrocarbonetos diferem em sua suscetibilidade ao ataque microbiano e geralmente se degradam na
seguinte ordem de suscetibilidade decrescente: n-alcanos> alcanos ramificados> aromáticos de baixo
peso molecular> alcanos cíclicos> hidrocarbonetos poliaromáticos (Leahy e Colwell, 1990; Salleh et al.
2003 ), embora muitos desses compostos possam ser relativamente facilmente degradados em ambientes
de solo e água doce (Van Hamme et. al., 2003). Para melhorar o desempenho da biorremediação, duas
técnicas podem ser aplicadas para limpar solos contaminados: bioaugmentação (Das e Mukherjee 2007;
Guarino et al. 2017) e bioestimulação (Tyagi et al. 2011). A bioaugmentação é, além da bioestimulação,
uma das possibilidades existentes para aprimorar o processo de descontaminação do solo

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aumentando a população microbiana indígena do ecossistema com a adição externa de


microrganismos metabolicamente ativos. Foi relatado por Covino et al. 2016, que a
bioaugmentação, através do uso de fungos de podridão branca, é uma abordagem lucrativa para a
limpeza de solos poluídos. Geralmente, as técnicas de bioaugmentação e bioestimulação devem ser
usadas juntas para que o processo de biorremediação possa ser aplicado com sucesso (Carberry e
Wik 2001). Em todos os casos, é necessária a aplicação de métodos precisos e confiáveis para
avaliação da biodegradação de poluentes através de processos de biorremediação. Um microcosmo
pode ser considerado um modelo em escala laboratorial de um sistema natural que fornece, em
pouco tempo, informações sobre os processos bioquímicos envolvidos. Além das informações
apresentadas acima, a aplicação de resíduos e co-produtos agroindustriais em bioprocessos oferece
uma maneira alternativa de substituir as matérias-primas refinadas e caras. Além disso, o uso em
massa de resíduos agroindustriais ajudará a resolver questões ambientais, apresentará uma
alternativa para reutilização e servirá como fonte de energia para o crescimento microbiano.
(Pandey et al. 2000; Makkar & Cameotra 2002; Fochesato et al. 2018). No presente trabalho, foi
estudada e caracterizada a população de bactérias degradantes por hidrocarbonetos (HDB),
identificação do degradador eficiente, sua caracterização molecular e análise filogenética com base
no seqüenciamento do gene 16s RNA das amostras coletadas. Investigamos a capacidade dos
microrganismos de degradar esses hidrocarbonetos e avaliamos a biorremediação de poluentes no
sistema de microcosmos através do emprego de técnicas de bioaugmentação e bioestimulação. Para
o cumprimento deste objetivo, este trabalho foi realizado no projeto de meios de cultura a partir do
uso de mistura de hidrocarbonetos e co-produtos agroindustriais como fontes de energia.

2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. BACTERIAL STRAIN ISOLATED (ESTRADA BACTERIANA ISOLADA)
Bactérias degradantes de hidrocarbonetos (CO1A1, CO1A2, MT1A3, TK1A2) de solo
contaminado de áreas petroquímicas de Zárate-Campana na província de Buenos Aires,
especificamente em R.H.A.S.A. A refinaria (34 ° 10 ́5,1 ”S, 58 ° 56´23” W) foi isolada de acordo
com Liporace et al. 2018.
2.1.1. Identificação molecular.
As cepas foram identificadas por sequenciamento de RNA 16s. O DNA genômico total foi
extraído usando o kit de purificação de DNA genómico Wizard ® (Promega®) e amplificado usando os
primers universais 27F [5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´] e 1492R [5´-
GGTTACCTTGTTACGCTT-3´]. As condições de PCR foram as seguintes: A ciclagem começou com
uma desnaturação inicial a 94 ºC por 2 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 min,
recozimento a 55 ºC por 1 min, extensão a 72 ºC por 2 min e uma extensão final a 72 ºC por 10 min. O
DNA amplificado por PCR foi purificado usando o Kit de Limpeza AxyPrep PCR (Axygen Bioscience).
DNA

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dados de sequenciamento foram realizados por INTA Castelar, Argentina. As sequências do gene
RNA do 16s foram editadas pelo software Bioedit e comparadas com as seqüências da Ferramenta
de Pesquisa de Alinhamento EzTaxon (Ez BioCloud). As cepas apresentaram mais de 97% de
similaridade na sequência do gene 16s RNA e foram consideradas da mesma espécie.

2.2. CRESCIMENTO E BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONO


2.2.1. Meio bacteriano e condições de cultura: experimentos em frascos de agitação
2.2.1.1. Fontes de carbon
Para avaliar as condições de crescimento, os degradadores de hidrocarbonetos mais eficientes
foram escolhidos para serem testados na produção de biomassa utilizando diferentes fontes de
carbono. Hidrocarbonetos comerciais (da YPF: Yacimientos Petrolíferos Fiscales S. A) como fontes
de carbono foram analisados em uma mistura dessas três fontes (4,5% v / v): gasolina (RON95),
querosene e diesel. Eles foram cultivados em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo meio salino
mínimo (MSM) (Liporace, 2012) e incubados a 25 ºC no agitador rotativo a 135 rpm por 5 dias. A
mistura de HC utilizada foi esterilizada por filtração através do filtro Millipore de 0,45 µ de
diâmetro e armazenada em frascos estéreis.
Considerando esse resultado, a capacidade de crescer sob diferentes concentrações de
misturas de hidrocarbonetos foi avaliada sob diferentes concentrações da mistura: 2, 4,5, 20, 50 e
60% V / V) e incubada a duas temperaturas (20 e 25 ºC). As culturas foram mantidas a 135 rpm
entre 7 e 14 dias, e a eficiência de crescimento isolado usando carbono único para cada um:
gasolina (1,5% v / v), querosene (1,5% v / v), diesel (1, 5% v / v) e mistura HC (4,5% v / v) usada
como amostra de controle. As culturas foram incubadas a 25 ºC, a 135 rpm por 10 dias. O pH do
meio foi ajustado para 7,0.
A viabilidade de um processo biotecnológico inclui a otimização estratégica de um meio de
cultura utilizando resíduos e co-produtos agroindustriais. Diferentes substratos foram analisados
para a produção de biomassa, adicionando fontes de carbono facilmente disponíveis, como glicose e
resíduos biodegradáveis, como alternativas de baixo custo: glicerol, soro de leite bovino, soro de
leite ovino, óleo de girassol refinado, óleo de girassol refinado, óleo oleico de alto teor de óleo, óleo
de amendoim cru, óleo de amendoim frito, óleo de camelina e amendoim prensado moído (2% v / v)
de diferentes indústrias nas áreas circundantes.

2.2.1.2. Fontes de nitrogênio


Por outro lado, foram testados os efeitos de três fontes diferentes de nitrogênio nos meios de
cultura para melhorar a produção de biomassa: NaNO3 (4,00 g / L), NH4Cl (2,50 g / L) e uréia
(1,39 g / L) (Santa Ana et al. 2002; Abouseoud et al. 2008; Liporace, 2018) usando óleo de
amendoim bruto (2% v / v) como fonte de carbono em cada ensaio e incubados a 25 ºC, a 135 rpm
por 5 dias.

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2.2.3. Medições de biomassa e pH


O crescimento bacteriano foi estimado pelo método do peso seco das células. Para isso, uma
alíquota de 18 mL de caldo de cultura foi coletada a cada 24 horas. Cada amostra foi centrifugada a
4ºC e 13500 rpm por 15 minutos. O sedimento foi seco a 100ºC em forno de ar quente até peso
constante. O pH do caldo de cultura foi medido com medidor de pH digital (Adwa).

2.3. DESIGN DO MICROCOSMO


Os solos contaminados com hidrocarbonetos utilizados no projeto do microcosmo foram
amostrados nas áreas da refinaria RHASA (Liporace et. Al., 2012). Esta área continha solos
contaminados com hidrocarbonetos produzidos por derramamentos durante as operações rotineiras da
planta (Fig. 1). As amostras coletadas foram reunidas e transferidas para sacos plásticos pré-
esterilizados, rotulados e auto-selados e transportadas para o laboratório e preservadas a 4 ° C durante as
experiências. A amostra de solo homogeneizada e peneirada foi distribuída em frascos de vidro
cilíndricos (60 mm de diâmetro e 360 ml de capacidade de volume), cada um contendo 200 g de solo.
Diferentes tratamentos foram realizados para cada sistema. A atenuação natural como teste de controle e
as estratégias de bioestimulação / bioaugmentação foram aplicadas de acordo com a Tabela 1. Utilizou-
se 5.000 mg / kg de nitrato de amônio no solo (NH4NO3, Biopack, qualidade analítica), enquanto uma
solução de 1000 mg / kg de di-hidrogenofosfato de sódio no solo (NaH2PO4.12H2O) (qualidade
analítica Biopack) foi usada como fonte. a fonte P (Márquez-Rocha et. al. 2001; Ruberto et al. 2003;
Ruberto el al. 2009). Os microrganismos utilizados no processo de bioaugmentação foram cultivados em
MSM e o óleo de amendoim bruto (2% v / v) como meio de cultura de fonte de carbono foi incubado
por 5 dias a 135 rpm e a 25 ºC. Os frascos foram mantidos à temperatura ambiente (entre 20-25 ° C de
acordo com as condições ambientais) durante o período experimental (120 dias). As amostras foram
colhidas uma vez a cada 30 dias. O conteúdo de cada frasco foi misturado assepticamente três vezes por
semana para garantir uma distribuição homogênea de nutrientes e contaminantes, bem como uma
aeração adequada do solo, e o processo foi controlado pela adição de água, quando necessário.

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Figura 1: Piscinas de coleta de solo contaminado com hidrocarbonetos para disposição final

2.4. ATIVIDADE BIOLÓGICA


Hidrocarbonetos derramados de petróleo nos solos representam um recurso direto para
bactérias degradantes de hidrocarbonetos (HDB). A determinação da atividade microbiana e sua
comparação entre os tratamentos é uma ferramenta útil para acompanhar os processos biológicos
que ocorrem nesses tipos de áreas. 1 g da amostra foi transferida assepticamente para 100 ml de
NaCl a 0,9% e transferida em uma série de oito diluições em série de 10 vezes. O HDB e a
população foram enumerados inoculando alíquota de 0,1 ml dessas diluições em placas de ágar
estéril contendo meio MSM espalhado com 100 µl de uma mistura de HC em duplicatas (Dias et.
Al. 2012; Jiang et al. 2016).
Além disso, a população de THAB (Bactérias Aeróbicas Heterotróficas Totais) foi enumerada
usando 1 ml da alíquota de cada uma das diluições e foi inoculada pelo método de derramamento
em placa sobre ágar nutriente (NA) em duplicatas. As placas foram incubadas a 25 ° C por 7 dias. O
número total de colônias é referido como Total Viable Count (TVC) e foi realizado de acordo com
Brock & Madigan 2015.
Tabela 1. Condições aplicadas aos diferentes microcosmos

System Condition
C Natural attenuation control
B Biostimulation with N and P
MT1A3 Biostimulation with MT1A3
Mix Biostimulation with strains mixture*
MT1A3 + BBioenrichment with MT1A3 + Biostimulation with N and P
Mix + B Biostimulation with strains mixture* + Biostimulation with N and P
* Strains mixture MT1A3, CO1A1, CO1A2, TK1A2.

2.5. EXTRAÇÃO E QUANTITAÇÃO DE HIDROCARBONO

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Para quantificação de hidrocarbonetos, amostras de solo (5 g) foram extraídas com 10 mL de


diclorometano em tubos de vidro de 20 mL. As amostras foram agitadas em vórtex por 5 minutos e
agitadas (135 rpm) durante a noite a 25 ° C. Posteriormente, a fração da fase orgânica foi
recuperada.

A análise cromatográfica foi realizada em um cromatógrafo a gás Shimadzu GC-2010 Plus


(Shimadzu, Corp., Japão) equipado com um detector de ionização de chama (FID) e um dispositivo
de 100 m de comprimento e 0,25 mm i.d. Coluna capilar de sílica fundida (espessura de filme de 0,5
µm) (Petrocol DH Sepulco). A temperatura do forno foi mantida a 45 ° C, depois aumentada para 8
° C / min a 150 ° C, 4 ° C / min a 250 ° C e 8 ° C / min a 300 e mantida a esta temperatura durante
48 min. A temperatura do injetor era de 300 ° C e a temperatura do detector era de 320 ° C. O fluxo
de gás de arraste (H2) foi de 2 ml / min. Os dados foram coletados no software GC-Solution
(Universidad Tecnológica Nacional-Argentina). A área total de todos os picos variando de C8 a
C40 nas amostras foi comparada com a dos padrões adequados 50.16.512 padrão gravimétrico
DHA classic (PAC) e alcanos misturados C8-C40 (Accustandard) (Ramirez et al. 2012; Jiang et al.
2016). Para fins de quantificação, as curvas de calibração inicial foram realizadas usando um solo
não contaminado com diferentes concentrações de uma mistura de HC na faixa de 1000 a 20000
ppm. Este procedimento permitiu traçar uma correlação linear entre a área do pico e a concentração
total de HC utilizada. A remoção de hidrocarbonetos foi então calculada usando a seguinte equação:

3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
Optamos por estudar 4 das 13 cepas anteriormente isoladas da refinaria RHASA, descritas por
Liporace, 2018. As cepas foram escolhidas com base em seus perfis de degradação de derivados de
petróleo (Tabela 2), produção de biomassa e manutenção em condições de laboratório. A
identificação genética das cepas bacterianas foi realizada no Instituto de Nanobiotecnologia Conicet
da Universidade de Buenos Aires por uma análise comparativa da sequência do gene 16S rRNA. As
seqüências genéticas obtidas foram processadas com o software BioEdit® e comparadas com as
existentes nas bases de dados: EZ Taxon, RDP e SILVA. O seqüenciamento parcial do 16srDNA
das cepas revelou que os isolados são (Tabela 2) Pseudomonas (MT1A3 e TK1A2),
Cellulosimicrobium (CO1A1) e Ochrobactrum (CO1A2).

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Tabela 2. Identificação genética de cepas por sua sequência parcial do gene 16S rRNA.

Sequence length (nt) Related to Identity (%)

CO1A Cellulosimicrobium cellulans


1373 99.9
1 LMG 16121 (T)
CO1A Ochrobactrum anthropi
1338 100
2 ATCC49188 (T)
MT1A Pseudomonas kunmingensis
1402 99.4
3 HL22-2 (T) JQ246444
TK1A Pseudomonas panipatensis
1380 100
2 Esp-1 (T) EF424401

Após isolamento e identificação, foi estudada a capacidade de degradação de hidrocarbonetos


dos isolados bacterianos selecionados. As bactérias foram capazes de usar uma mistura de
hidrocarbonetos a 4,5% v / v como única fonte de carbono. Todas as cepas testadas apresentaram
boa produção de biomassa (Tabela 3 e figura 2), resultando em valores variando de 0,11 a 1,86 g /
L, respectivamente. Nesse caso, a cepa de crescimento mais rápido foi o MT1A3 e, após 5 dias de
incubação, a biomassa obtida foi significativamente maior que o restante das estirpes, até 93,01%
(1, 86 g / L). Em relação aos valores de pH, o MT1A3 registrou o pH mais alto e isso se
correlaciona com o fato de apresentar também o maior desenvolvimento de biomassa.
Provavelmente, esse efeito se deve a uma maior atividade metabólica, uma vez que se sabe que o
pH do meio de cultura microbiano é modificado pelos produtos terminais do metabolismo.

Tabela 3. Biomassa e pH das culturas obtidas em MSM + HC (4,5%), aos 5 dias de incubação

Biomass (g/L) pH
CO1A1 0,13 ± 0,01 7,55 ± 0,07
CO1A2 0,66 ± 0,06 7,63 ± 0,09
MT1A3 1,86 ± 0,07 8,34 ± 0,15
TK1A2 0,47 ± 0,01 7,77 ± 0,10

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Figura 2. Crescimento celular de cepas em MSM + HC (4,5%), após 5 dias de incubação

Em termos de tolerância à biomassa MT1A3 e capacidade de produção, observou-se que o


MT1A3 foi capaz de crescer em concentrações de até 50% (v / v) no HC (0,90 g / L a 20 ºC e 1,17
g / L a 25 ºC ) após 14 dias (figura 2). Isso representa uma alta tolerância aos hidrocarbonetos
testados, correlacionada com estudos em que microorganismos com alta tolerância a compostos
como tolueno, xileno, estireno e fenol foram relatados (Heipieper et al. 1994; Rabodonirina et al.
2018). Não houve crescimento a 60% (v / v) do HC. Isso apresenta condições favoráveis para
estratégias de biorremediação de locais contaminados com hidrocarbonetos. A linhagem MT1A3
apresentou o maior perfil de produção de biomassa a 4,5% (v / v) HC, obtendo 1,36 g / L a 20 ºC e
1,79 g / L a 25 ºC em 7 dias, conforme discutido acima (Tabela 4 e 5).¨

Figura 2. Crescimento celular de MT1A3 cultivado em meio com 2, 4,5, 20 e 50% de HC, incubado a 20 ºC (A) e
25 ºC (B).

Tabela 4. Biomassa, pH e tempo para atingir a fase estacionária das culturas MT1A3 em meio com 2, 4,5, 20 e
50% de HC, incubadas a 20 ºC.

Biomass Time
HC (g/L) pH (days)
2% 7.46 ±
0.47 ± 0.07 0.06 7
8.02 ±
4.5 % 1.32 ± 0.11 0.09 8

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7.86 ±
20 % 1.19 ± 0.10 0.10 10
7.66 ±
50 % 0.90 ± 0.07 0.12 14

Table 5. Biomass, pH and time to reach stationary phase of MT1A3 cultures in medium with 2, 4.5, 20 and 50 %
HC, incubated at 25 ºC.

Biomass Time
HC (g/L) pH (days)
7.75 ±
2% 0.60 ± 0.03 0.10 7
8.13 ±
4.5 % 1.79 ± 0.09 0.06 7
8.05 ±
20 % 1.64 ± 0.01 0.08 8
7.94 ±
50 % 1.17 ± 0.07 0.11 14

Quando o MT1A3 foi cultivado nas três frações de hidrocarbonetos separadamente, foi
obtido um crescimento diferencial de biomassa, sendo 1,49 g / L em meio de cultura diesel, 0,69 g /
L em gasolina e 0,15 g / L em querosene após 10 dias de incubação em comparação ao HC cultura
de mistura (1,76 g / L). Esses estudos indicam que o MT1A3 tem maior capacidade de usar o diesel
como primeiro substrato, depois a gasolina e o querosene.

Pela técnica de cromatografia gasosa, a quantidade de hidrocarbonetos totais (HT) presente


em todos os ensaios foi determinada aos 0, 5 e 10 dias de incubação. HT foi definido como a
concentração total de hidrocarbonetos expressa em ppm. No caso de MT1A3, a cultura cultivada
em HC mostrou uma degradação de HT de 43,53% obtida após 5 dias; onde a concentração
diminuiu de 31023 ppm (controle HC, 5 dias) para 17928 ppm (MT1A3 no HC, 5 dias) (Tabela 6).
Da mesma forma, a quantidade de HT degradada pela ação do MT1A3 foi mantida, entre 5 e 10
dias (p> 0,05).

Tabela 6. Concentração (ppm) de hidrocarbonetos totais (TH) em controles e culturas MT1A3,


em meio com HC, diesel, querosene ou gasolina; aos 0, 5 e 10 dias de incubação.

TH (ppm)
0 5 10
Control Control MT1A3 Control MT1A3
36582 ± 17928 ± 26051 ± 14702 ±
HC 409 31023 ± 251 309 305 210

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12881 ±
Diesel 223 10081 ± 154 7510 ± 103 8780 ± 301 4724 ± 166
11664 ±
Kerosene 352 10382 ± 232 9943 ± 214 9555 ± 195 6194 ± 233
11520 ±
Gasoline 275 6020 ± 201 4962 ± 239 5422 ± 122 3412 ± 169

Quando analisado o nível de degradação de cada componente da mistura de HC, observou-se


que o maior valor foi o correspondente à cultura do diesel, sendo 46,24% (Tabela 6). Esse resultado
se correlaciona com os valores previamente obtidos em termos de produção de biomassa (Figura
2). Dessa forma, o MT1A3 provou ser uma cepa indígena com alto potencial para ser usada em
processos de biorremediação em locais contaminados por hidrocarbonetos. De acordo com o
desenvolvimento de tecnologias sustentáveis, foi estudado o crescimento do MT1A3 usando
diferentes fontes alternativas de carbono, incluindo co-produtos agroindustriais de baixo custo.
Substratos de carbono como mistura HC, glicerol e glicose (fontes facilmente assimiláveis de
carbono), soro de leite bovino, soro de leite de ovelha, óleo de girassol refinado, óleo de girassol
oleico alto, óleo de amendoim bruto, óleo de amendoim frito, óleo de camelina, amendoim
prensado como co-produtos agroindustriais de baixo custo foram utilizados. O MT1A3 cresceu em
todas as fontes de carbono testadas, mas o crescimento foi significativamente maior no óleo de
amendoim bruto em comparação com todos os outros substratos (p <0,05), resultando em uma
biomassa de 7,29 g / L (Tabela 7).
Tabela 7. Biomassa e pH das culturas MT1A3, em diferentes fontes de carbono.
Biomass
Carbon source pH
(g/L)
HC (4.5%) 1.74 ± 0.11 8.12 ± 0.09
Glucose (2%) 4.01 ± 0.14 7.15 ± 0.05
Glycerol (2%) 2.69 ± 0.13 8.25 ± 0.12
Bovine milk serum (2%) 2.21 ± 0.09 6.86 ± 0.08
Ovine milk serum (2%) 1.94 ± 0.06 6.67 ± 0.09
Refined sunflower oil
(2%) 3.98 ± 0.12 7.35 ± 0.13
High oleic sunflower oil
(2%) 2.78 ± 0.15 7.49 ± 0.10
Crude peanut oil (2%) 7.29 ± 0.49 7.61 ± 0.11

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Fried peanut oil (2%) 2.08 ± 0.11 7.27 ± 0.07


Camelina oil (2%) 1.23 ± 0.19 7.02 ± 0.05
Milled pressed peanut
(2%) 4.42 ± 0.25 7.25 ± 0.13

Com base nos resultados de biomassa obtidos com o uso de várias fontes de carbono (Tabela
7), as fontes de nitrogênio foram testadas usando óleo de amendoim bruto como substrato de
carbono. As fontes de nitrogênio foram: NaNO3, NH4Cl e uréia. A fonte de nitrogênio mais
eficiente para a obtenção de biomassa a partir do MT1A3 foi o NaNO3, com um valor de 7,14 g /
L. Os valores de NH4Cl e uréia foram significativamente menores, sendo 1,71 e 0,62 g / L,
respectivamente (Tabela 8). É importante notar que, no caso do NH4Cl, a cultura teve uma queda
de pH para 5,35, e é provável que a acidificação do meio produz inibição do crescimento da cepa,
uma vez que o cloreto de amônio aumenta a acidez aumentando a concentração de H + livre.
Portanto, a baixa biomassa registrada para NH4Cl é provavelmente influenciada por mudanças na
composição química do meio.

Tabela 8. Efeito da fonte de nitrogênio na biomassa e pH final em culturas de MT1A3 aos 5 dias.

Nitrogen source Biomass (g/L) pH

NaNO3 7.14 ± 0.35 8.15 ± 0.10


NH4Cl 0.62 ± 0.12 5.36 ± 0.11
Urea 1.71 ± 0.18 7.08 ± 0.05

Foram realizados cinco tratamentos diferentes de biorremediação em microcosmos para avaliar a


eficiência da degradação de hidrocarbonetos em solos contaminados. Foram avaliados os seguintes
tratamentos: (a) atenuação natural monitorada (C); (b) bioestimulação (B); (c) bioaugmentação
(MT1A3); (d) bioaugmentação (Mix); (e) bioaugmentação + bioestimulação (MT1A3 + B); (f)
bioaugmentação + bioestimulação (Mix + B) (Tabela 1). A umidade média em todos os ensaios foi
registrada em 31,67 ± 4,45. Os valores de pH apresentaram um ligeiro aumento da ordem do pH 7 até 8,
exceto o tratamento C que diminuiu para pH 6, 88 durante os 120 dias. O efeito dos diferentes
tratamentos nas contagens bacterianas aeróbicas heterotróficas totais (THAB) é mostrado na Figura 3.
Todos os tratamentos evidenciaram uma estimulação precoce das contagens durante os primeiros 30
dias. Da mesma forma, no sistema MT1A3 + B, foi registrada a maior concentração de THAB,
atingindo o valor de 2,17x1010 UFC em 120 dias. Depois disso, todos os sistemas tenderam a estabilizar
os níveis de THAB até o final do estudo. O número de

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bactérias degradadoras de hidrocarbonetos (HDB) demonstraram um comportamento semelhante ao


do THAB no final do teste (120 d). Em comparação ao tratamento C, os maiores valores de HDB
foram observados no MT1A3 + B, mostrando 8,91x106 UFC no final do ensaio. O restante dos
valores em todos os sistemas tratados não apresentou diferenças significativas quando comparado
ao sistema de controle, revelando que eles não foram influenciados pelos tratamentos de
biorremediação.

Figura 3: Influência dos diferentes tratamentos na umidade, pH, número de bactérias aeróbicas heterotróficas
(THAB) e bactérias degradadoras de hidrocarbonetos (HDB) e concentração de hidrocarbonetos durante o ensaio de
microcosmos.

No final do teste, aos 120 dias, a degradação do hidrocarboneto em tratamentos bioaugurados


mostrou uma remoção significativamente superior à taxa de C (atenuação natural) entre 25,12 e

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40,05%. Enquanto isso, no tratamento B (bioestimulação), o potencial de redução de poluentes não foi
influenciado pela estimulação com fontes de N e P adicionadas nas concentrações mencionadas acima
em relação ao sistema C. Uma possível razão para nossos resultados é o grande requerimento energético
da microflora específica, responsável pela degradação de hidrocarbonetos e, também, se N e P estão
menos disponíveis para o crescimento microbiano, pode ser necessário adicionar maiores quantidades
desses nutrientes do que os níveis utilizados. Apesar disso, também pode ocorrer que tais resultados não
estejam relacionados às atividades de hidrocarbonetos aeróbicos utilizando microorganismos como
imobilização em matrizes de solo, lixiviação ou nitrificação. Inicialmente, foi registrada uma
concentração de TH de 3960,24 ppm no solo. As porcentagens de remoção de hidrocarbonetos obtidas
nos tratamentos C, B, MT1A3, Mix, MT1A3 + B e Mix+ B, foram 63,64; 68,52; 72,47; 76,35; 77,95;
77,53%. A atenuação natural do solo permite a biodegradação de compostos recalcitrantes por
comunidades microbianas autóctones, que geralmente é considerado o principal mecanismo para a
remoção natural de contaminantes (Declercq et al., 2012). Considerando o nível inicial de
hidrocarboneto medido em contaminados neste estudo, o sistema C (atenuação natural) apresentou uma
redução de 63,64%, provavelmente como resultado de processos abióticos e como resultado da
atividade biológica da microbiota do solo já adaptada. Considerando que o solo estudado continha um
alto nível inicial de contaminantes e estava cronicamente contaminado, uma fração removida, que é de
77,95% do nível inicial, utilizando estratégias de bioaugmentação e bioestimulação, pode ser
considerada como tecnologia promissora (Figura 4). No entanto, mais pesquisas serão necessárias para
continuar estudando o processo de biorremediação adequado exigido pelas estratégias ótimas de
biodegradação em solos contaminados por hidrocarbonetos.

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Figure 4. Chromatograms of microcosms: time zero and treatments after 120 days for control of natural
attenuation (C), biostimulación (B), bioaugmentación with MT1A3 (MT1A3), bioaugmentation with mix (Mix),
bioaugmentation with MT1A3 + biostimulation (MT1A3 + B), bioaugmentation with Mix + biostimulation (Mix + B).

4. CONCLUSÃO
As linhagens estudadas foram identificadas filogeneticamente nos gêneros Pseudomonas,
Cellulosimicrobium e Ochrobactrum, cujos gêneros apresentam antecedentes que os relacionam
com a

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metabolismo dos hidrocarbonetos, posicionando-os como potenciais microrganismos a serem


utilizados nas estratégias de biorremediação. O estudo baseado em microcosmos apresentado neste
artigo revelou vários fatos relevantes. Um desses fatos é representado pela magnitude detectada nas
estratégias de bioaugmentação / bioestimulação aplicadas ao usar o tratamento MT1A3 + B, que
reduziu 77,95% da concentração inicial de hidrocarbonetos. Isso resultou na aplicação de
microrganismos autóctones utilizados neste trabalho. Esses microrganismos prometem ser tratados
como estratégias de biorremediação.

RECONHECIMENTOS

Esta pesquisa foi realizada sob um acordo entre a RHASA e o Delta Regional da Facultad,
Campana, Buenos Aires, Argentina. Este trabalho foi financiado pelas doações PID-UTN: 3710 /
IPUTNDE0003640 e IPUTNDE0004532 da Universidad Tecnológica Nacional e fundos de
"Proyectos de Donaciones" do The Techint Group. C.V.Q. é pesquisador do CONICET (Conselho
Nacional de Investigações Científicas e Técnicas, Argentina). D.C.M e F.L são bolsistas da
Universidad Tecnológica Nacional. Os autores agradecem à Dra. Susana Vazquez (Universidade
Nacional de Buenos Aires) pelo fornecimento das técnicas moleculares.

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