Aula de Bioquímica Avançada

Tema:

Ciclo do Ácido Cítrico

Prof. Dr. Júlio César Borges

Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
 Os destinos do Piruvato

Fermentação
Respiração
Láctica Anaeróbico
Alcoólica Aeróbico Oxidação completa
da glicose

Maioria das células eucarióticas e

bactérias: Combustíveis orgânicos 
CO2 e H2O;

Glicólise é apenas a primeira etapa da

oxidação completa da glicose;

Ocorre em três estágios principais.

Respiração Celular

1º estágio: glicose, ácidos graxos e alguns

aminoácidos

Fragmentos de 2 C  grupo acetil da Acetil-CoA

2º estágio: oxidação dos grupos acetil

 CICLO DO ÁCIDO
CÍTRICO

ENERGIA liberada é conservada nos

transportadores de elétrons reduzidos
NADH e FADH2

3º estágio: Oxidação das coenzimas reduzidas;

Transferência de e- para o O2  Cadeia

transportadora
de elétrons

Conservação de energia  fosforilação oxidativa

 Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs
Ciclo do ácido Tricarboxílico
Recebeu o prêmio Nobel de Fisiologia/Medicina em 1953
pela descoberta do Ciclo do Ácido Cítrico

Hans Krebs: Aparato de Warburg utilizado

para medir o consumo de oxigênio no
metabolismo do tecido muscular.

1937  Ciclo do Ácido Cítrico

1945  Coenzima A
1951  Acetil CoA
 Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs
Ciclo do ácido Tricarboxílico

 Tem papel central no metabolismo

 Destino do Piruvato, aminoácidos e ácidos
graxos no metabolismo aeróbico
- Oxidação de Combustíveis à CO2 e H20
- Ocorre na mitocôndria
- Necessita de O2 molecular para ocorrer
- Porta de entrada do Piruvato  Acetil-CoA
 O Acetil-CoA

entrada da maioria dos combustíveis do ciclo

convertidos
Esqueletos de C dos açúcares e ácidos graxos ao grupo acetil da acetil-CoA

Forma um tioéster com o acetato CARREADOR DE ACILAS

para formar a acetil-CoA

Ligação Ligação
amida fosfoéster
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase

- Complexo multienzimático
 Piruvato desidrogenase (E1) 24 cópias
 Diidrolipoil-transacetilase (E2) 24-60 cópias
 Dihidrolipoil-desidrogenase (E3) 12-cópias
- aumenta a velocidade de reações
 evita a difusão do substrato
- minimiza reações secundárias
- permite controle coordenado
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase bacteriana

 Núcleo da E2
- 24 cópias

 24 cópias de E2  24 cópias de E1  12 cópias de E3

Núcleo da -Verde - Laranja - Vermelho
E2
-Trímeros nos -Dímeros nas -Dímeros nas faces
- 60 vértices do cubo arestas do cubo do cubo
cópias
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase bovina
- 60 cópias de E2

~ 50 nm de
diâmetro
> 5x ribossomo Domínio lipoil de E2

60 moléculas de E2  trímeros
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
 necessita de 5 coenzimas:
Pirofosfato de tiamina, CoA, Lipoamida, FAD, NAD+
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
- Forma Acetil-CoA pela descarboxilação oxidativa do Piruvato  reação irreversível
- Braço da lipoamida canaliza a reação entre os sítios catalíticos do complexo catalítico

1º REAÇÃO  descarboxilação do Piruvato  dependente de TPP

2º REAÇÃO  grupo hidroxietil transferido do TPP para Lipoamida  Transacetilase

- envolve a oxidação da carboxila e redução da lipoamida S–S  H–S + S–Acetil
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
3º REAÇÃO  transesterificação dependente de CoA
- liberação de Acetil-CoA

4º REAÇÃO  regeneração da Lipoamida oxidada  troca dissulfídica  duas Cys

- envolve FAD fortemente ligado a E3

5º REAÇÃO  oxidação do dissulfeto da E3

- envolve FADH como intermediário e NADH como aceptor final da reação
 Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase

5º REAÇÃO  oxidação do dissulfeto da

E3
- envolve FADH como intermediário e
NADH como aceptor final da reação

- Reação não usual devido ao potencial

Redox menor do NADH em relação ao
FADH2

- Potencial Redox do FADH2

- do depende do ambiente e reação
 Síntese de Acetil-CoA
Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
 A canalização do substrato pela E2
 Síntese de Acetil-CoA
- Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
- O longo braço da lipoamida permite o grupo “visitar” diferentes sítios ativos
 Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs ou Ciclo do Ácido Tricarboxílico

 principal sítio de óxido-redução de moléculas

 sítio de oxidação final de carboidratos, aminoácidos e ácidos graxos
 Local: mitocôndria
- o equivalente a 1 grupo Acetil é completamente oxidado a 2 CO2
 entra Acetil CoA (e outros metabólitos) e sai 1 GTP e 8 e’ (3 NADH e 1 FADH2)
1º NADH  isocitrato desidrogenase  sítio de evolução de CO2
2º NADH  α-cetoglutarato desidrogenase  sítio de evolução de CO2
1º FADH2  succinato desidrogenase
3º NADH  Malato desidrogenase
 o oxaloacetato é regenerado no final do ciclo  sistema oxidante de grupos acetil

- 4 pares de elétrons são transportados pela cadeia de transporte de elétrons para a

oxidação de O2
 Ciclo do ácido Cítrico
1)
É a fornalha de oxidação
celular 2)
8)
Grande extração de
energia a partir de
1 Acetil-CoA
7) 2)
 8 reações enzimáticas
1: Citrato Sintase
2: Aconitase
6) 3)
3: Isocitrato desidrogenase
4: α-cetoglutarato desidrogenase 5) 4)
5: Succinil-CoA Sintetase
6: Succinato desidrogenase
7: Fumarase
8: Malato desidrogenase
 Ciclo do ácido Cítrico
1) CITRATO SINTASE
Alimenta a fornalha
Catalisa a condensação de oxaloacetato com Acetil-CoA

Citrato sintase  Homodímero

• 1 º substrato  Oxaloacetato
 induz mudanças conformacionais no domínio flexível
criando um sítio de ligação para o 2 º substrato  acetil-CoA

• Ocorre formação do intermediário: citroil-CoA  alteração

conformacional

•Leva a hidrólise do tioéster, liberando CoA

 Ciclo do ácido Cítrico
1) CITRATO SINTASE
Alimenta a fornalha
Mecanismo de deslocamento sequencial ordenado
- Mecanismo ácido-base forma um intermediário enol

- Enol ataca por SN2 o oxaloacetato  forma o citroil-CoA

- Hidrólise libera a CoA mais Citrato  exergônica
 Ciclo do ácido Cítrico
2) ACONITASE
-forma isocitrato via cis-aconitato

- envolve desidratação e hidratação facilitado por um complexo Fe-4S

 Ciclo do ácido Cítrico
3) ISOCITRATO-DESIDROGENASE
- descarboxilação oxidativa  produz NADH e CO2
- necessita de Mn2+ ou Mg2+ como cofator

Reação em 3 etapas
1º  Redução de NAD+
2º  Descarboxilação  Intermediário enol
3o  Rearranjo em ceto-enol
 Ciclo do ácido Cítrico
4) ALFA-CETOGLUTARATO-DESIDROGENASE
- Forma um complexo multi-enzimático
- Descarboxilação oxidativa  produz NADH e CO2

- Acopla um CoA ao α-
cetoglutarato

NAD+ é o aceptor de
elétrons
CoA é o transportador do
grupo succinil

- Funciona como a PDH sobre

o α-cetoglutarato
- Possui 3 enzimas similares a
E1, E2 e E3 (idêntica) e os
cofatores descritos para a PDH
- Evolução divergente
 Ciclo do ácido Cítrico
5) SUCCINIL-COA-SINTETASE
- acopla a síntese de GTP (ou ATP) com a quebra da ligação de CoA do Succinil-CoA
- envolve a enzima fosforilada para o estado intermediário

1º: formação do Succinil-Pi

2º: enzima fosforilada e
liberação do Succinato
3º: Atividade quinase 
fosforilação ao nível do
substrato

Nucleosídeo-difosfato-quinase
GTP + ADP → GDP + ATP
 Ciclo do ácido Cítrico
5) SUCCINIL-COA-SINTETASE
- acopla a síntese de GTP (ou ATP dependendo da isoenzima) com a quebra da ligação de
CoA do Succinil-CoA

 Envolve a enzima
fosforilada para o estado
intermediário
1º: formação do Succinil-Pi
2º: enzima fosforilada e
liberação do Succinato
3º: Atividade quinase 
fosforilação ao nível do
substrato

Nucleosídeo-difosfato-quinase
GTP + ADP → GDP + ATP
 Ciclo do ácido Cítrico
6) SUCCINATO-DESIDROGENASE
- conta com um FAD covalentemente ligado à enzima
- faz parte do complexo II da cadeia transportadora de elétrons  sítio de oxidação do
próprio FADH2 formado
- forma fumarato  alcano a alceno

 Em eucariotos: ligada a MMI da mitocôndria

 Bactérias: ligada a membrana plasmática
 Contém grupos Fe-S e conta com um FAD
covalentemente ligado à enzima
 Ciclo do ácido Cítrico
7) FUMARASE
- hidratação da ligação dupla do fumarato  forma malato
- envolve um íon OH- para atacar a ligação dupla do fumarato
 Ciclo do ácido Cítrico
8) MALATO-DESIDROGENASE
- oxidação da OH do Malato  regenera oxaloacetato
- dependente de NAD+  similar à lactato desidrogenase
- reação endergônica  reação dirigida pela retirado do produto
- [oxaloacetato] é mínima  retirado pela citrato sintase e outros  ΔG < 0  exergônica
 Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
1: Isocitrato desidrogenase

2: α-cetoglutarato desidrogenase

3: Succinato desidrogenase
4: Malato desidrogenase

1
4

3
 Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
 Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
 Controle do Ciclo do ácido Cítrico

A entrada é regulada:

 Piruvato desidrogenase

 Citrato sintase

O Ciclo de Krebs também é regulado:

Reação da isocitrato-desidrogenase

 Reação da α-cetoglutarato-desidrogenase

Pontos de controle

Relacionados aos principais metabólitos

 Acetil-CoA, oxaloacetato e NADH

3 fatores controlam a velocidade do ciclo:

 Disponibilidade de substrato
 Inibição pelos produtos acumulados
 Inibição alostérica por
retroalimentação das enzimas de catalisam as
etapas iniciais do ciclo
Controle do Ciclo do ácido Cítrico
Vários pontos de controle
- Acetil-CoA e oxaloacetato não saturam a Citrato
sintase
- Falta de NADH aumenta a formação de oxaloacetato
e Acetil-CoA
- NADH e FADH2 são oxidados somente se ADP é
simultaneamente fosforilado a ATP

ATP  inibe a Citrato sintase, isocitrato

desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase
- Resulta em acumulo de Citrato
- Logo, a necessidade/disponibilidade de ATP
garantem o funcionamento do ciclo de Krebs

NADH  inibe a Piruvato-desidrogenase, citrato

sintase, isocitrato desidrogenase e α-
cetoglutarato desidrogenase

Succinil CoA  inibe a citrato sintase  ocupa

sítio da Acetil-CoA
- ADP e Ca2+ ativam a isocitrato desidrogenase
- Ca2+ ativa a fosfatase da Piruvato-desidrogenase
ativando-a
 Ciclo do ácido Cítrico
O papel em outras vias
- é uma via anabólica ou anfibólica  oxaloacetato para a gliconeogênese e esqueletos de
carbono para aminoácidos
 Ciclo do ácido Cítrico
O papel em outras vias 
Fornece blocos de construção para outras vias  bactérias anaeróbicas

Não possuem a α-
cetoglutarato-desidrogenase 
não conseguem realizar a via
completa das reações do Ciclo
de Krebs
Inversão do
sentido
oxidativo
(normal) da via NADH produzido
Reciclado a
pela oxidação do
NAD+ pela isocitrato
redução do
oxaloacetato a
succinato
 Ciclo do ácido Cítrico
REAÇÕES ANAPLERÓTICAS
Produção de intermediários do ciclo de Krebs por outras vias com compostos comuns
 reações anapleróticas
 Contribuem para manter a concentração dos intermediários em níveis adequados

REAÇÃO ANAPLERÓTICAS MAIS IMPORTANTE

Fígado e rins de mamíferos: carboxilação reversível do piruvato pelo CO2 para a

formação de oxaloacetato
Piruvato-carboxilase
Acetil-CoA  modulador alostérico positivo
 Ciclo do ácido Cítrico
Metabolons
Complexos proteicos de canalização de substratos em vias reacionais