Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática:

determinação da energia de activação e do factor de

aceleração da reacção
Universidade de Aveiro, Departamento de Química, 26 de Outubro de 2010.
Ana Jesus nº 41417; Joana Barbosa nº 42925; Vanessa Mateus nº 39895
Biocatalisadores: Trabalho prático n.º 5

RESUMO

A parte inicial deste trabalho (já realizada) consistiu na determinação da diluição do

extracto enzimático ideal para os estudos a realizar para que os resultados se
enquadrassem na gama pretendida.
Após esta determinação, foi estudado o efeito da temperatura na actividade da
invertase, colocando a reacção a decorrer 25, 30, 37 e 45ºC e observando a reacção com
DNS decorrente por medição da absorvência a 540 nm.
Para a comparação da velocidade da reacção com e sem enzima, realizaram-se ainda
testes sem a adição de invertase com diferentes tempos e temperaturas: 70ºC, 90 min;
75ºC, 60 min; 80ºC, 30 min; 85ºC, 15 min, estimando ainda a velocidade da reacção a
30ºC através da equação de Arrhenius.
Os resultados obtidos demonstram que a actividade foi máxima para a reacção
catalisada a 45ºC (2,09 mol/s), tal como esperado, uma vez que a adição da enzima
diminui a energia de activação necessária, tornando a reacção mais rápida e
consequentemente conduzindo a uma maior concentração de açúcares redutores. A
energia de activação no caso da reacção catalisada foi de 9,34 KJ/mol e na não
catalisada 176 KJ/mol; tal como era esperado, a Ea necessária à reacção catalisada foi
menor que a não catalisada. Finalmente, o valor do factor de aceleração foi de 7,10 x
103, o que significa que a reacção de hidrólise da sacarose catalisada pela invertase
decorre a uma velocidade 7,10x103 vezes superior à reacção não catalisada.

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Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

INTRODUÇÃO

A invertase (enzima cujo nome sistemático é β-D-frutofuranósido fruto-hidrolase,

também conhecida como β-D-frutofuranosidase ou ainda sacarase) catalisa a hidrólise
da sacarose nos seus monómeros constituintes: glucose e frutose (1). A mistura
equimolar destes monómeros é também conhecida por “açúcar invertido” e é usada na
indústria alimentar para evitar a cristalização do açúcar em doces. A designação
“invertido” advém do facto de a mistura resultante da hidrólise rodar o plano da luz
polarizada no sentido contrário ao da sacarose que lhe deu origem.
Esta enzima pode ser obtida, enquanto extracto não purificado, através do
sobrenadante resultante da centrifugação de um preparado de Saccharomyces
cerevisiae, vulgo fermento de padeiro, uma vez que é de ocorrência extracelular.
O estudo da actividade da invertase pode ser feito através do uso do ácido 3,5-
dinitrossalicílico (DNS), que é responsável pela oxidação dos açucares redutores
resultantes da hidrólise, permitindo a sua quantificação por determinação da intensidade
da cor vermelha desenvolvida, num espectrofotómetro a 540 nm.
A determinação da diluição adequada do extracto da invertase é essencial para se
garantir que os resultados se encontram dentro da gama de linearidade tanto da
formação de produto da reacção enzimática com o tempo como da curva de calibração a
usar.
O aumento da temperatura favorece a catálise enzimática, conduzindo a um aumento
da velocidade da reacção, até ao ponto em que começa a desnaturar as enzimas. Na
gama de temperaturas para as quais a actividade aumenta, o efeito na temperatura na
actividade enzimática pode ser descrito pela lei de Arrhenius (bem como acontece no
caso de reacções não catalisadas):

Actividade = A exp , em que A é o factor exponencial de Arrhenius, R, a

constante universal dos gases (8,314x10-3 mol kJ-1 K-1), T é a temperatura absoluta (K)
e Ea a energia de activação (kJ mol-1). Por linearização desta equação é possível obter o
valor da energia da activação, Ea, pelo declive -Ea/R da recta de ln (actividade) vs
1/(T), permitindo-nos assim quantificar o efeito da temperatura na velocidade da
reacção. A energia de activação corresponde à energia que é necessário fornecer para se
iniciar uma determinada reacção.

2
Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Torna-se também possível comparar a mesma reacção à mesma temperatura com e

sem o uso de catalisador de forma a comprovar que sem a adição da enzima o processo
seria muito mais lento.
Equações químicas
1)

Figura 1 – Reacção de hidrólise da sacarose catalisada pela invertase.

RESULTADOS

Tabela 1 : Tabela relativa às Absorvências dos padrões da curva de calibração pelo método de DNS
Absorvência
540 nm
[Açúcares Redutores]
Padrão Ensaio 1 Ensaio 2 ΔAbs 1 ΔAbs2
Padrão (mmol/L)
Branco - 0,100 0,111 - -
1 0,25 0,171 0,180 0,071 0,069
2 1 0,352 0,382 0,252 0,271
3 1,75 0,611 0,568 0,511 0,457
4 2,5 0,715 0,754 0,615 0,643

0,700
0,600
Absorvência a 540 nm

0,500
0,400 y = 0,2533x + 0,0129
0,300 R² = 0,9882

0,200
0,100
0,000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
[Açúcares redutores]padrão (mmol/L)
Gráfico 1: Curva de Calibração dos açúcares redutores obtida pelo método do DNS.

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Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Tabela 2 : Tabela relativa aos resultados da actividade e respectivas temperaturas.

Temperatura Actividade
IU Katal
ºC
(µmol/min) (mol/s)
25 6,47E-05 1,08
Reacção 30 8,21E-05 1,37
Catalisada 37 6,94E-05 1,16
45 1,25E-04 2,09
70 1,14E-08 1,90E-04
Reacção Não 75 4,03E-08 6,72E-04
Catalisada 80 6,90E-08 1,15E-03
85 1,51E-07 2,51E-03

1/Temperatura (K)
0,00
2,76E-03
-2,00 2,81E-03 2,86E-03 2,91E-03 2,96E-03
Ln(actividade)

-4,00 y = -21216x + 53,3

R² = 0,9995
-6,00
-8,00
Reacção Não Catalisada
-10,00

Gráfico 2 : Linearização da equação de Arrhenius para a reacção não catalisada.

1,400
Ln(Actividade)

1,050

0,700 y = -1123x + 3,8469

R² = 0,9987
0,350 Reacção Catalisada

0,000
3,10E-03 3,15E-03 3,20E-03 3,25E-03 3,30E-03 3,35E-03 3,40E-03
1/Temperatura (K)

Gráfico 3 : Linearização da equação de Arrhenius para a reacção catalisada.

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Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Tabela 3 : Energia de activação das reacções catalisada e não catalisada.

Energia de activação (kJ mol-1)

Reacção Catalisada 9,34
Reacção Não Catalisada 176

DISCUSSÃO

No presente trabalho pretendia-se analisar o efeito da temperatura na reacção de

hidrólise da sacarose, catalisada pela enzima invertase e não catalisada, assim como
determinar a actividade enzimática e energia de activação de ambas as reacções,
recorrendo ao método de DNS. O factor de aceleração da reacção catalisada foi outro
dos parâmetros calculados.
A utilização do método de DNS teve como finalidades a paragem da reacção de
hidrólise da sacarose por adição deste reagente e a quantificação dos açúcares redutores
(frutose/glucose), produtos dessa reacção.
A solução de enzima invertase foi inicialmente diluída de modo a que reacção
catalisada não fosse demasiado rápida e, assim, permitisse a sua análise sem problemas
de excesso de enzima. A diluição escolhida foi a diluição 1:100, pois os valores de
absorvência estavam compreendidos entre 0,2-0,8, permitindo assim a aplicação da Lei
de Lambert-Beer.
Através da equação da recta de calibração do gráfico 1 foram calculadas as
concentrações de açúcares redutores aplicando a Lei de Lambert-Beer (cálculo em
anexo) para ambas a reacções.
Na reacção catalisada foram consideradas as seguintes temperaturas: temperatura
ambiente (25ºC), 30ºC, 37ºC e 45ºC. Já no caso da reacção não catalisada, foram
utilizadas temperaturas mais elevadas: 70,75,80,85ºC, uma vez que seria de esperar que
a reacção de hidrólise fosse muito mais lenta. Não foram realizados testes, no caso da
reacção catalisada, a temperaturas mais elevadas, pois a enzima iria sofrer desnaturação.
Em relação à actividade/velocidade da reacção verifica-se que, na reacção catalisada,
o aumento da temperatura é proporcional ao aumento da actividade/velocidade de
reacção, bem como ao aumento da concentração de açúcares redutores, à excepção da
temperatura 37ºC em que se verifica uma ligeira diminuição da actividade (1,16 mol/s)
em relação à temperatura anterior de 30ºC (1,38 mol/s). Este resultado poderá dever-se

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Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

ao facto de o banho termostatizado a 37ºC ter sido sujeito a variações de temperatura,

condicionando assim a eficácia da reacção. Outro resultado a ter em conta é o facto de à
temperatura de 45ºC, a actividade calculada (2,09 mol/s) ser o dobro da actividade à
temperatura ambiente (25ºC) (1,08 mol/s). A esta temperatura a actividade/velocidade
da reacção poderá ser máxima, podendo esta temperatura estar próxima da temperatura
óptima de actuação desta enzima (50-60ºC).
Na reacção não catalisada, com o aumento da temperatura de 70ºC para 85ºC,
registou-se um aumento da velocidade da reacção (1,90 x10-4 <2,51 x 10-3) e
consequentemente um aumento da formação de produto (0,257mmol/L <0,565
mmol/L).
Relativamente a energia de activação, esta foi determinada para ambas as reacções
através da linearização da equação de Arrhenius considerando os declives das rectas dos
gráficos 2 e 3 (ver cálculos em anexo). Na reacção catalisada, tal como esperado, a Ea
obtida foi menor, 9,34 kJ/mol, comparativamente à reacção não catalisada, 176 kJ/mol.
Isto deve-se à capacidade que a enzima tem de diminuir a Ea necessária para ocorrer a
reacção, facilitando a transformação dos reagentes em produtos.
Outro dos parâmetros a determinar neste trabalho foi o factor de aceleração da
reacção catalisada, calculado através da razão entre a velocidade da reacção catalisada
(1,37 mol/s) e não catalisada considerando a temperatura de 30ºC (1,94 x 10-4 mol/s). A
velocidade da reacção não catalisada a 30ºC foi estimada a partir da equação da recta do
gráfico 2, tendo em conta a linearização da equação de Arrhenius, já explicada
anteriormente. O valor do factor de aceleração obtido foi de 7,10 x 103, ou seja, a
reacção de hidrólise da sacarose catalisada pela invertase decorre a uma velocidade
7,10x103 vezes superior a reacção não catalisada.

RESPOSTA ÀS QUESTÕES DO PROTOCOLO

1. A adição de sacarose aos padrões deve-se à necessidade de manter as mesmas

condições de trabalho quer nos padrões quer nas amostras, uma vez que após a reacção
de hidrólise ainda permanece sacarose em solução, garantindo-se desta forma que os
valores não vêm afectados pela concentração de sacarose na solução.
2. RESPOSTA NA DISCUSSÃO.
3. A reacção não catalisada não foi colocada a decorrer a baixas temperaturas pois sem
o efeito da temperatura a reacção seria ainda mais lenta do que o verificado. Tal como

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Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

pode ser comprovado pela equação de Arrhenius, uma diminuição da temperatura

conduz ao aumento da Ea necessária e, consequentemente, à diminuição da velocidade
da reacção.

CONCLUSÃO
O objectivo deste trabalho foi determinar o efeito da temperatura na reacção de
hidrólise da sacarose, não catalisada e catalisada pela enzima invertase, bem como
determinar a actividade enzimática e a energia de activação de ambas as reacções
recorrendo ao método do DNS, e ainda o factor de aceleração da reacção catalisada.
Assim, relativamente ao efeito da temperatura na reacção, verifica-se que um
aumento da temperatura conduz a um aumento da actividade/velocidade de reacção e
consequentemente da concentração de açúcares redutores em solução, excepção feita à
reacção a 37ºC pelas razões a cima mencionadas. No caso da reacção catalisada pela
invertase, a actividade foi superior aos 45ºC (2,09 mol/s, aproximadamente o dobro que
à temperatura ambiente) uma vez que esta se encontra mais próxima da temperatura
óptima da enzima. No que se refere à quantidade de açúcares redutores formada,
verifica-se então que, na reacção catalisada, o aumento é muito mais elevado
comparativamente ao observado na reacção não catalisada, uma vez que a reacção
decorre de forma muito mais rápida; o aumento de concentração de produto é muito
mais significativo à temperatura de 45ºC, em detrimento de todas as outras utilizadas
neste trabalho.
Relativamente à energia de activação Ea, na reacção catalisada obteve-se 9,34 kJ/mol
e na não catalisada 176 kJ/mol; tal como era esperado, a Ea necessária à reacção
catalisada foi menor que a não catalisada.
Finalmente, no que diz respeito ao valor do factor de aceleração o resultado obtido foi
de 7,10 x 103, o que significa que a reacção de hidrólise da sacarose catalisada pela
invertase decorre a uma velocidade 7,10x103 vezes superior à reacção não catalisada.

COMENTÁRIOS CRÍTICOS

As diluições para determinação da absorvência das amostras, para que os valores se

encontrassem dentro da gama de linearidade do aparelho, deveriam ser efectuadas antes
da adição do DNS para se garantir diluição directa do produto de reacção.

7
Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Ainda a apontar o facto de ao usarmos os mesmos banhos termostatizados para

realização de testes a várias temperaturas, tornou o processo bastante moroso e
conduziu a algumas confusões relativamente a tempos e temperaturas.

BIBLIOGRAFIA

Schinner, F. and W. von Mersi (1990). "Xylanase-, CM-cellulase- and invertase activity
in soil: An improved method." Soil Biology and Biochemistry 22(4): 511-515.

8
 ANEXOS

Cálculo da concentração de açúcares redutores

Segue-se a demonstração do cálculo das concentrações das amostras calculadas

conforme a curva de calibração do gráfico 1, obtida pelo método de DNS:

Equação da curva de calibração: y = 0,2533x + 0,0129

y = Absorvância a 540 nm; x = Concentração em mmoL/L

Para a amostra a 30ºC na reacção catalisada

Abs540nm (Branco) = 0,106 e Abs540nm (amostra)=0,532 temos:

Absamostra Absbranco b (0,532 0,106) 0,0129

Cdiluida (mmol L-1 ) 1,54mmol / L
declive 0,2533

A amostra em questão foi diluída segundo um factor de diluição de 2. Logo:

Cdiluida x fdiluição= Creal 1,54mmol / L 2 3,08mmol / L

Para as amostras da reacção não catalisada, não foi realizado a análise do branco
visto que nenhuma das amostras contém enzima. Desta forma, a concentração de
açúcares redutores foi determinada pela seguinte fórmula:

Abs540nm b
C real (mmol L-1 )
declive

Procedeu-se de igual forma para calcular a concentração em todas as restantes

amostras, tendo em atenção a necessidade de factores de diluição para ambas as
amostras.

i
Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Determinação de actividade/velocidade da reacção

c real (mmolL 1 ) v solução ( L) f enzima 10 3

mol 1
velocidade ( IU )
1mmol t (min)
Reacção catalisada

Factor de diluição da enzima (fenzima) – 100

Volume de Solução – 4 x10-3L (1mL enzima + 1 mL sacarose

+ 2 mL tampão acetato)

Tempo de reacção (t) – 15 min - aplicado às temperaturas 25,

30, 37 e 45ºC

1
3,08mmolL 4 10 3 ( L) 100 10 3
mol 1
velocidade ( IU ) 8,21 10 5 IU
1mmol 15 min

8,21 10 3 mol 1 min 1mol

velocidade (katal) =1,37 katal
min 60 s 10 6 mol

Reacção não catalisada

Neste caso a velocidade da reacção tem em conta vários tempos de reacção da hidrólise
da sacarose. A mesma fórmula é aplicada na determinação do cálculo da actividade em
IU e katal.

ii
Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Determinação da Energia de activação nas reacções:

Ea
RT LINEARIZAÇÃO Ea 1
Actividade Ae Ln(actividade) Ln( A) ; R - 8,314 x
R T (K )
10-3 mol kJ-1K-1

o Reacção não catalisada

1
Pela equação da recta do gráfico 2 : Ln(actividade ) 21216 53,3
T

Ea
declive Ea 176 kJ mol-1
R

Tabela 4 : Tabela relativa aos dados utilizados para a determinação da equação da recta na reacção não
catalisada.
Temperatura
ºC K 1/Temperatura Actividade (mol/s) Ln(actividade)
70 343 2,92E-03 1,90E-04 -8,57
75 348 2,87E-03 6,72E-04 -7,31
80 353 2,83E-03 1,15E-03 -6,77
85 358 2,79E-03 2,51E-03 -5,99

o Reacção catalisada:

1
Pela equação da recta do gráfico 3: Ln (actividade ) 1123 3,847
T
Ea
declive E a =9,34 kJ mol-1
R

Tabela 5 : Tabela relativa aos dados utilizados para a determinação da equação da recta na reacção
catalisada.

Temperatura
ºC K 1/Temperatura Actividade (mol/s) Ln(Actividade)
25 298 3,36E-03 1,08 0,0747
30 303 3,30E-03 1,37 0,314
37 310 3,23E-03 1,16 0,146
45 318 3,14E-03 2,09 0,737

iii
 Hidrólise da sacarose com e sem catálise enzimática: determinação da energia de activação e do
factor de aceleração da reacção

Determinação do factor de aceleração

O factor de aceleração da reacção catalisada foi determinado para a temperatura de

30ºC.

A velocidade determinada para a reacção catalisada foi de 1,37 mol s-1.

Para a reacção não catalisada, a velocidade/actividade da reacção à temperatura de 30ºC

(303K) foi estimada tendo em conta a equação da recta do gráfico 2, pelo que:

1 8, 55
Ln(actividade ) 21216 53,3 Ln(actividade ) 8,55 actividade e 1,93 10 4 mol s 1

303 K

velocidade R.catalisada 1,37 mol s 1

Factor de aceleração 7,10 10 3
velocidade R. NãoCatalisada 1,93 10 4 mol s -1

iv