Biologia Celular e Molecular

2º Ano da Lic. em Tecnologia Biomédica

2016-2017

Prof. Doutora Helena Caria

helena.caria@ess.ips.pt
Módulo Biologia Molecular
 Aula 14.

Sumário
• Resumo dos processos mais comuns em Biologia Molecular
• Replicação – Transcrição –Tradução como eixo central destes
processos:
– Moléculas envolvidas: DNA, RNA e proteínas
– Comparação entre procariotas e eucariotas
– O fim do dogma da informação genética
– Avanços do século XXI
– Metas ainda por ultrapassar
• Tipos de RNA: a importância farmacológica dos RNAi
• Formação de RNAi
• Formas fisiológicas de cadeias duplas de RNA: o caso do RNAt
• Revisão do conceito de gene
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular

Metas ainda não ultrapassadas

Atenção às doenças priónicas.....

1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
OUTRAS MOLÉCULAS DE RNA

RNA de Interferência (Eucariotas)- RNAi

Sistema que controla quais os genes que estão
activos/transcritos, aumentando ou diminuindo a
efectividade do RNAm

Mecanismos de silenciamento pós-tradução (defesa contra genes estranhos)

miRNA (microRNA) - produtos (pri-miRNA) da transcrição de genes que codificam

para o RNA que no núcleo são processados para ficarem com cerca de 70nt (pre-
miRNA), que podem emparelhar entre si, não são codificados e ajudam na regulação
da expressão génica, essencialmente durante o desenvolvimento.

siRNA (small interfering RNA) - derivados de longas moléculas de RNA em dupla

cadeia, com cerca de 20nt, que depois se convertem em cadeias simples e ligam-se a
um complexo proteico responsavel pela estabilização do RNAm
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular. Cont.

siRNA
pre-miRNA

RISC: RNA-induced silencing

complex

Dicer: ribonuclease que cliva

estruturas secundárias de RNA
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular

pre-microRNA de Brassica oleracea.

Exemplos de estruturas de RNA

em cadeia dupla
1.Moléculas na Biologia Molecular – DNA e RNA
Processos na Biologia Molecular. Cont.

Ao nível da Transcrição ou da Tradução

A enzima Dicer cliva RNA de cadeia dupla, de modo a formar siRNA ou miRNA. Estes RNAs
processados são incorporados no complexo RISC, o qual tem como alvo moléculas de RNA
mensageiro, onde atuam impedindo o processo de tradução.
2. As unidades na Biologia Molecular…..o gene e as proteínas
As unidades na Biologia Molecular…o gene e as proteínas – cont.
As unidades na Biologia Molecular…o gene e as proteínas – cont.
As unidades na Biologia Molecular…o gene e as proteínas – cont.
 Aula 15.

Sumário
• Regulação de proteínas nas células eucariotas : controlo na
ativação e degradação de proteínas
• Processos de regulação fisiológica dos genes: Metilação
• Enzimas de restrição: revisão do seu papel biotecnológico
• Revisão sobre a Técnica de PCR e suas aplicações
• Revisão sobre a construção de plasmídeos híbridos
• Técnica de sequenciação: revisão do processo
• Aplicações dos conhecimentos adquiridos:
– Seres vivos transgénicos
– Terapia génica: o exemplo da insulina do factor VII e de outros
metabolitos como vacinas, antibióticos, etc
•O Caso particular da clonagem humana
1. Metilação
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar
vantagens – cont.

Metilações mais frequentes:

m6A-N6-metiladenina m5C-C5-metilcitosina
m4C-N4-metilcitosina hm5C-C5-hidroxmetilcitosina
2. Restrição
3. Amplificação de fragmentos de DNA
PCR – permite amplificar sequencias especificas de DNA,
estando elas misturadas com todo o DNA genómico
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
https://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E
RT-PCR ou Reverse Transcriptase PCR
É um PCR que permite amplificar RNAm
O produto amplificado é uma cópia do DNA molde e designa-se por cDNA

https://www.youtube.com/watch?v=0MJIbrS4fbQ&t=103s
PCR quantitativo em tempo real / Real Time PCR
(RTq-PCR ou qRT-PCR ou qPCR)

A reação em cadeia de polimerização em tempo real combina a

metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e
quantificação por fluorescência.
A metodologia permite que os processos de amplificação, detecção
e quantificação de DNA sejam realizadas em uma única etapa,
agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de
contaminação da amostra e dando maior precisão.

https://www.youtube.com/watch?v=DNsRiFT3jBs https://www.youtube.com/watch?v=TkCBcL_xUUs&t=3s
CONDIÇÕES de REACÇÃO de uma experiência de PCR em
Tempo Real

Mix da Reação:
Termociclador com sensores de fluorescência
Primers especificos
dNTPs
Solução tampão
DNA polimerase
Solução de Fluoroforos

Os fluoroforos são excitados a um determinado e emitem fluorescência

permitindo determiner a produção de um ou mais produtos em cada ciclo
de PCR

Os dados são quantificados com um software próprio que permite calcular

a expressão génica (ou o número de cópias de RNAm) em várias
amostras.

As quantificações são feitas no fim de cada ciclo de PCR daí o nome da

técnica
Real Time PCR movie
 APLICAÇÕES DO PCR

Amplificação de fagmentos especificos de DNA para:

a) Pesquisa de mutações após sequenciação

b) Pesquisa de mutações após restrição enzimática
c) Pesquisa de mutações por análise de gel de eletroforese
d) Distinção entre alelos (VNTR por exemplo)
e) Estudos filogenéticos
f) Obtenção de fragmentos de genes para clonagem de DNA
g)Obtenção de anti-genes (RNA antisense ou RNAi)
4. a. 1) Detecção de VNTR (Variable Number Tandem Repeat –
local no genoma onde uma pequena sequência de nt se repete X
vezes de forma variavel em cada indivíduo) por PCR
4. a. 2) Deteção de VNTR por PCR-Multiplex (PCR com vários pares de
primers)
4. a. 3) Bloqueio da tradução por introdução de um anti-gene (RNAi)
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar
vantagens – cont.

4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

 As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.

4. a. 2) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA - cont

Um dos principais objectivos da Tecnologia Recombinante de

DNA é clonar um gene ou um fragmento específico de DNA,
cuja sequencia seja conhecida e que permita atingir um
objectivo especifico

As ferramentas necessárias à clonagem são:

•Enzimas de restrição
•Vector de DNA
•DNAligase
•Célula hospedeira
Etapa 1. Construção de uma molécula de DNA recombinante – clonagem de um gene

https://www.youtube.com/watch?v=a52sRdYdYJ0 https://www.youtube.com/watch?v=cVKsVnE3rYU
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 1. Construção de uma molécula de DNA

recombinante
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA
Etapa 1. Construção de uma molécula de DNA recombinante – cont.
Características dos VECTORES
•São os componentes centrais das experiências de clonagem

•Existem dois tipos de ocorrência natural: plasmídeos e

bacteriófagos

•Propriedades:
Auto-replicação
Locais específicos para restrição enzimática
Possuírem marcadores seleccionáveis
Serem fáceis de recuperar
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 1. Construção de uma molécula de DNA recombinante – cont.

Características dos Vectores -

Exemplos
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA
Etapa 2. Mecanismos de Transferência de genes para bactérias e Recombinação
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 2 em detalhe
Transformação bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria O processo natural…..
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA
Etapa 2 em detalhe
Transformação bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria

As células/bactérias
transformadas são isoladas
em meio de cultura
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 2 em detalhe
Transformação bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria

Diferentes meios de cultura permitem selecionar diferentes

transformandos
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA
Etapa 2 em detalhe
Transdução bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria com o auxílio de vírus (fagos)
O processo natural…..
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 2 em detalhe
Transdução bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria com o auxílio de vírus (fagos)
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 2 em detalhe
Transdução bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria com o auxílio de vírus (fagos)
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 2 em detalhe
Transdução bacteriana – introdução de moléculas de DNA recombinante numa
bactéria com o auxílio de vírus (fagos)
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar
vantagens – cont.
4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA

Etapa 3. Selecção de Recombinantes por selecção de marcadores dos vectores

As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.

4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA - cont

Etapa 4. Obter clones de um plasmídeo recombinante
As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar vantagens – cont.

4. a. 4) Isolamento e clonagem de um fragmento de DNA - cont

Etapa 4. Obter clones de um plasmídeo recombinante – cont.

As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de que podemos tirar
vantagens – cont.

4. Aplicações das Técnicas

4. a. 5) Construir Livrarias de DNA

“Livrarias” de DNA
São colecções de clones construídos a partir de DNA original
Existem “livrarias” de DNA genómico e de cDNA

cDNA é uma molécula de DNA complementar produzida a

partir da informação do RNAm e usando uma transcriptase
reversa
4. a. 5) Construir Livrarias de DNA
4. a. 5) Construir Livrarias de DNA
Formação de cDNA
3. As alterações das moléculas e produtos da Biologia Molecular…..de
que podemos tirar vantagens
4. Aplicações das Técnicas
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA

Ferramentas Necessárias:
•Cadeia de DNA molde
•Primers específicos
•dNTPs
•Polimerase de DNA
•ddNTPs (dideoxyribonucleotidos)
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.
4.b. Aplicações e Técnicas: Sequenciação de DNA – cont.

CODIS database -
Combined DNA Index
System (CODIS) do FBI
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM

•Resistência a insectos
•Resistência a geadas
•Crescimento mais rápido
•Maior taxa de floração
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM – cont.

Produção de plantas de interesse económico:

melhor adaptadas ao ambiente, de crescimento
mais rápido .......
Milho, soja, algodão, arroz
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM – cont.

Contém um gene
não codificante que
produz um RNAm
antisense

Resistente ao amadurecimento e transporte, tem

também um sabor mais agradável
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM – cont.
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM – cont.
6. Exemplos de aplicação destes conhecimentos de BCM ao Homem
6. Exemplos de aplicação destes conhecimentos de BCM ao Homem
Produção de metabolitos com papel na saúde humana:
vacinas, antibióticos, hormonas, factores de
coagulação, etc
5. Animais e Plantas Transgénicos
exemplos de aplicação dos conhecimentos de BCM – cont.
6. Exemplos de aplicação destes conhecimentos de BCM ao Homem
Genes de expressão exclusiva nas Gene para o activador de
glândulas mamárias plasminogénio (tPA)

Gene
híbrido

Microinjecção num ovo Selecção de ovos

fertilizado fertilizados

Transferência dos ovos fertilizados, por

microinjecção, para mães hospedeiras

Selecção de filhos
trangénicos (cor)

Cruzamento entre
trangénicos

Selecção de fêmeas transgénicas

homozigóticas

Leite transgénico

Teste do leite transgénico para

tPA
7. Clonagem Humana: um caso particular

+
7. Clonagem de Indivíduos: um caso particular

Relógios Biológicos
Os Relógios Biológicos explicam (ou tentam) a fisiologia do Envelhecimento
Mecanismos de Envelhecimento Biológico – Três principais

Nucleus
DNA

Genetic Regulators
Mitochondria Longevity Genes
Energy AGE Proteins
1) As proteinas fibrosas (estrutura secundária) que suportam
a pele e os vasos sanguíneos – Colagénio e outras
responsáveis pela sustentação e flexibilidade
Com a idade as proteinas fibrosas perdem a sua elasticidade
Estas alterações explicam-se pelas reações de Oxidação- Redução
(redox) tão comuns no nosso metabolismo e que permitem a formação
de Espécies Reactivas de Oxigénio ou radicais Livres (ROS)

Efeitos visiveís da Oxidação de metal e de fruta

A Oxidação também nos ajuda a Envelhecer

ROS

Efeito dos ROS na pele

 Antioxidantes
Nutrientes essenciais com propriedades antioxidants, opu
seja, que conseguem neutralizer o efeito dos ROS, como:
Vitamina C
Vitamina E
Carotenoides
Flavonoides
Co-Q 10

Presentes em vegetais e frutas, e…

Cremes…empresas de cosmética!!!!
 A ação de Antioxidantes equilibra o efeito das espécies reativas de
Oxigénio (ROS) mas estas defesas não são eficazes a 100% durante toda a
nossa vida
 Os sitemas de Reparação das lesões no DNA também combatem o efeito
lesivo das espécies reativas de Oxigénio (ROS) mas também estas defesas
não são eficazes a 100% durante toda a nossa vida
2) Encurtamento dos Telómeros ao longo das mitoses
O encurtamento dos telómeros está associado a outras lesões de DNAcom efeitos
descritos nas células
3) Com a idade o nosso Sistema de produção de energia falha

Sistemas da Catalase e SOD (Super-

oxido-dismutase) na regulação da
produção de ROS pelas mitocôndrias

Metabolismo mitocondrial
e produção de ROS
 Com a idade os sistemas da SOD e da Catalase perdem eficácia permitindo a acumulação
temporária de ROS pelo tempo suficiente para lesar o DNA mitochondrial – é o ciclo vicioso das
disfunções mitocondriais
CONCLUSÃO:

1) Clonagem de seres vivos só é teoricamente possivel

2) Clonagem de genes é eficaz atualmente e muito usada terapêuticamente nas
áreas da saúde
3) Clonagem de órgãos (pele – a partir de fibroblastos; ou de células estaminais)
são também apostas terapêuticas com viabilidade a curto prazo

Graças às técnicas e ferramentas de Biologia Molecular