Genética - Amplifica o DNA em grande quantidade in vitro;
Métodos de Estudo e Tratamento de Doenças
Genéticas
Exemplo: Tratamento do Nanismo hipofisário.
Como faz esse tratamento? Através do hormônio de
crescimento humano.
A paciente começou a ser tratada com hormônio de
crescimento humano produzido em bactéria.
Como isso acontece? Pega o gene de interesse e
insere na bactéria, pra ela expressar e começar a
produzir o hormônio. Depois esse hormônio é
purificado e utilizado para o tratamento. Uma das
vantagens é a grande quantidade de hormônio que
você consegue produzir, é bem maior do que se você
fosse extrair de seres humano, pois bactérias se
multiplicam muito rápido.
Esse gene é quimérico (porque é um DNA
humano inserido na Bactéria).
Esses métodos são muito importantes porque
facilitam vários procedimentos. Ex: através da
cultura in vitro você consegue produzir uma maior
quantidade de determinado hormônio do que se você
fosse extrair de um organismo vivo.
Cliva o DNA onde tem o gene de interesse, extrai o
DNA, insere no plasmídeo e esse plasmídeo é
inserido na bactéria, e essa bactéria vai começar a
expressar a insulina humana (por exemplo).
Como eu consigo fazer isso? As técnicas de
clonagem molecular e PCR permitem aumentar a
quantidade de DNA que antigamente era restrita.
Se for fazer um teste de paternidade, você
realiza o PCR pra aumentar o número de cópias do
DNA extraído.
Porque essas técnicas são interessantes? Porque
estão baseadas na propriedade de
complementariedade do DNA, que é: Anelamento,
pareamento e hibridização (sinônimos de
complementariedade).
 PCR
- Reação em cadeia da polimerase;
- Serve para testes de paternidade, perícia,
replicação;
- É uma reação que ocorre in vitro, tentando replicar
as mesmas condições que ocorrem in vivo;
 DNA RECOMBINANTE
Molécula de DNA formada pela ligação de duas
moléculas de origens diferentes;
Ex: DNA formado por duas espécies diferentes.
 CLONAGEM MOLECULAR
Transferência de uma sequência de DNA específica
para uma única célula de um micro-organismo.
A clonagem molecular é a mesma que originou a
ovelha Dolly? Não é a mesma, porque na clonagem
molecular vai ter o envolvimento de uma sequência
de DNA específico (que pode ser de qualquer
espécie) pra uma única célula de um micro-
organismo. Geralmente usa a Escherichia coli.
Ai vai ter grandes quantidades do DNA alvo porque
a célula vai se multiplicar e replicar o DNA também.
- Um meio de cultura com grande crescimento
bacteriano ou fúngica fica muito turvo;
- Grandes quantidades da sequência “alvo” podem
ser isoladas em forma pura para análise molecular
mais “detalhada”.
1- Produção dos fragmentos, ou sequências
de DNA.
É preciso produzir ou selecionar a sequência
de DNA alvo.
Como vai obter isso? Pode fazer a extração de
DNA da célula alvo ou um tratamento com enzima
de restrição (também chamadas de endonucleases,
que cortam o DNA no lugar específico).
Como vai isolar um gene no meio de vários
genes? Através de uma enzima de restrição.
Endonucleases são enzimas produzidas por
bactérias;
A bactéria tá sendo infectada por um fago que se
gruda à bactéria, insere o DNA dele. Ai as bactérias
produzem as endonucleases pra clivar o material
genético do vírus pra se defender.
Eles fazem restrição (cliva o material genético do
vírus) e modificação (porque modifica o próprio
DNA pra enzima não reconhecer e clivar o próprio
DNA).
Isso é o que ocorre na natureza. In vivo, a gente pega
a enzima de restrição e utiliza para formar o DNA
recombinante e cortar o nosso DNA em regiões que
são de interesse.
Características das enzimas de restrição
- Essas enzimas reconhecem sequências de 04 à 08
nucleotídeos.
- Reconhecem Sequências Palindrômicas,
sequências que podem ser lidas de forma igual
quando lida em ambas as direções (ex: Frente e trás.
Tipo ARARA). Elas clivam essas sequências.
Como é que sabe a região que tem que cortar?
Cada enzima tem um sítio de clivagem específico.
Vai clivar a sequência exata.
Como você sabe que tem essa sequência ou não
no DNA?
Você tem que saber a sequência do gene que você
quer estudar, pra poder escolher a enzima certa.
Tipos de Clivagem
- Cega/Lisa/Abrupta
- Coesiva/Colante/Aderente
CEGA
COESIVA
Qual dos dois tipos de clivagem tem a chance de dá
mais certo? O coesivo, porque tem um encaixe
melhor.
Concluindo... Extrai o DNA, cliva com enzima e
coloca no gel de agarose.
Coloca o DNA na canaleta com gel de agarose, e por
uma diferença de carga, o DNA vai migrar do polo
negativo para o polo positivo e daí vai ter a
presenças das bandas (pra vê se clivou ou não, se
clivou da forma correta).
Depois de cortar, precisa colar o DNA no plasmídeo.
2- Inserção do fragmento de DNA com o
gene alvo no vetor.
Vetor: tipo mais usado é o plasmídeo de bactérias.
Plasmídeo: genes de resistência para antibióticos
bacteriófagos.
Temos o fragmento do DNA escolhido clivado pela
enzima. Tem o plasmídeo. E tem a DNA Ligase
(liga o fragmento ao plasmídeo).
DNA recombinante: Fragmentos do DNA alvo
clivado, ligação em vetores e DNA ligase.
- Vai haver a replicação o gene inserido.
No fragmento do Plasmídeo é importante ter:
- Enzimas de restrição pra fazer o encaixe;
- Tem que ter um gene pra resistência de antibiótico,
pra poder selecionar as bactérias que receberam o
gene de interesse.
Se eu tenho uma forquilha de replicação e o
gene foi inserido de forma correta, todos os genes
daquele plasmídeo vão ser expressos, e a bactéria
pode ser selecionada, separando bactérias que
receberam DNA alvo das que não receberam. Só as
que receberam que vão se resistentes.
Tem que ter o gene pra selecionar quem recebeu o
DNA recombinante. As que não receberam vão
morrer na presença do antibiótico.
As que receberam vão pro meio de cultura e
continuam vivas.
- Além do gene do antibiótico, pode usar um gene
repórter. O gene Repórter é um gene que vai ser
colocado junto com o gene de interesse, utilizando a
mesma região promotora, só que ele codifica pra
uma proteína fluorescente; O mais utilizado é o
GFP.
Quando o gene de interesse for expresso, o
gene de fluorescência também vai ser expresso.
Então você sabe que seu gene foi expresso!
Resumindo: Vamos ter o fragmento de DNA
plasmidial que se une ao gene de interesse pela
ligase. Vai ser colocado dentro de uma bactéria,
cultiva a bactéria em grande quantidade e daí vai ter
o plasmídeo, esse que se multiplica pelo processo
chamado de “círculo rolante” e vamos ter várias
cópias desse plasmídeo, que está carregando o gene
de interesse. Então pode fazer uma expressão de
DNA pra retirar só o gene de interesse ou produto
metabólico em grande quantidade.
Que tipo de transformação se pode fazer com
essa técnica?
Substituição gênica: faz a substituição de um gene
que tá mutado no organismo por um gene normal;
Nocaute gênico: deleta o gene da sequência de
DNA;
Adição gênica: coloca mais um gene e os dois estão
ativos.
 TERAPIA GÊNICA
- Baseada na construção de um gene normal;
Ex: Uma pessoa tem deficiência em um proteína
devido a um gene mutado; Então você produz no
laboratório um gene normal, coloca ele dentro de
uma partícula viral, retira células do próprio
paciente, coloca o vírus nessa cultura de células do
paciente, esse vírus vai injetar o gene terapêutico nas
células, essas células são reinseridas no paciente e a
partir desse DNA bom várias cópias vão ser
passadas pras outras células.
- PCR: in vitro. Reação em cadeia da polimerase.
Está baseada na utilização de uma DNA
polimerase termoestável.
O que essa DNA polimerase tem de diferente
da nossa? A termoestabilidade. A nossa não precisa
ser termoestável.
In vitro tem apenas a DNA polimerase
termoestável, é uma reação por temperatura. As fitas
do DNA se abrem por temperatura.
Essa Polimerase é a Taq Polimerase,
originada da bactéria Thermus aquaticus. Essa
bactéria vive de 68-78° (temperatura ótima). Mas
processo de replicação vai até 95°, precisa ficar
nessa temperatura pra abrir a fita.
Termociclador:
1° etapa - Desnaturação: o DNA é aquecido a 95°
pra poder separar as fitas.
2° etapa – Anelamento: Anelamento dos primes, pra
poder sinalizar onde vai começar a replicação.
Temperatura diminui até 60° C.
A DNA polimerase junto com o DNTP’s vão fazer a
síntese de novas fitas a partir do DNA molde e dos
primes, isso no terceiro ciclo e assim por diante. A
cada ciclo essas fitas vão se dividindo e dando a
origem a outras duas. É uma Amplificação
Exponencial.
3° etapa – Extensão ou polimerização: temperatura
ótima de 72°C, ótima da DNA polimerase do T.
aquaticus.
Exemplo: Teste de HIV. Se você quer saber se
determinada pessoa é portadora do vírus, você tem
que fazer o teste. HIV é vírus de RNA.
PCR não faz leitura de RNA. Então precisa
fazer uma transcrição reversa para fazer um DNA
complementar pra então fazer o PCR. Depois vai
migrar pra um gel e analisar.
Onde pode usar PCR? Clonagem direta de genes
específicos, estudo diagnósticos de várias doenças,
medicina forense, detectar mutações em genes
específicos, diagnósticos pré-natais, evolução de
espécies, entre outras.
Depois do PCR, como visualiza pra ver se
funcionou? Visualiza por eletroforese.
- Eletroforese: método para análise do DNA/RNA
(fragmento alvo) ou proteínas, onde vai movimentar
as moléculas submetidas a um campo elétrico.
Substratos: agarose ou poliacrilamida.
Proteínas: Se tiver trabalhando com proteínas, vai
visualizar por cargas e peso molecular.
Ácidos nucleicos: visualizar por peso molecular.
Canaletas: são lugares onde vai colocar as amostras
de DNA ou PCR.
Fotodocumentador (tem máquina acoplada) ou
Transiluminador: coloração do DNA.
 SOUTHERN BLOTTING
- Fragmentos de DNA separados em gel de agarose.
- Vão ser clivados por enzimas de restrição e
transferidos para uma membrana por ação capilar
(chamada de membrana de nitrocelulose), pois o gel
de agarose não permite a conclusão do resto da
técnica.
- O DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência para conseguir visualizar os
fragmentos específicos que estão sendo desejados.
Além disso, há uma sonda radioativa ou fluorescente
completar ao DNA.
Eu estou com o DNA total, mas eu quero pegar
mutação num gene específico. Então tenho que ter
uma sonda radioativa ou fluorescente específica pra
esse gene alvo.
- Com isso conseguimos detectar polimorfismo no
DNA ou mutação em algum gene específico.
- Essa técnica é apenas para DNA.
- Transferência por capilaridade:
Temos um frasco com um líquido, esse
líquido vai subindo e carreando o DNA do gel pra
membrana. Tem um papel toalha que vai sugar o
líquido e automaticamente o líquido vai carrear o
DNA pra membrana. Ai o DNA fica preso na
membrana e agora você consegue trabalhar com ele.
Agora vamos ter o DNA fragmentado e vai tratar
com a sonda complementar marcada. No gel de
agarose esse tratamento não seria possível.
Como desenhou uma sonda específica para o
fragmentado alvo, quando ela encontrar o fragmento
ela vai se liga. Se a sonda for radioativa vai ser um
raio x, se for fluorescente vai ser uma máquina que
detecta fluorescência.
 NORTHERN BLOTTING
- Se for RNA Total ou mensageiro;
- Também vai ter separação por gel de agarose,
eletroforese, transferência pra membrana por ação
capilar, sondas de RNA ou DNA pra hibridizar com
aquela molécula de RNA alvo.
 WESTERN BLOTTING
- Trabalho com Proteínas;
- Não é mais gel de agarose. Agora é gel de
poliacrilamida.
- Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida pra
separação e caracterização de proteínas.
- Adição do reagente SDS (Sódio do Dodecil
Sulfato) que vai desnaturar as proteínas.
- A transferência é por força elétrica. Vai emitir uma
força elétrica que vai ser emitido também o gel de
poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose;
- Proteína é identificada por anticorpo mono ou
policlonal. Não é mais a sonda, agora é uma proteína
que vai se ligar a um anticorpo monoclonal e um
anticorpo secundário pra reconhecer esse primário e
está ligado a uma fluorescência.
- Revelação do sistema com anticorpo secundário
fluorescente ou radioativo.
- Com isso vai ter a informação de tamanho e
quantidade de proteínas;
 MICROARRANJO DE DNA
- Serve para ver transcrição de genes;
- Você precisa ter o genoma da espécie que você
vai trabalhar;
- Analisa a expressão gênica;
 FISH (HIBRIDIZAÇÂO IN SITU COM
FLUORESCÊNCIA)
- Analisar genes específicos;
- Detecta genes localizados dentro dos
cromossomos;
 SEQUENCIAMENTO DE DNA
- Tem por finalidade determinar com fidelidade a
sequência dos nucleotídeos que compõem um
determinado DNA;
- Pra ter o aumento da fita nova, a duplicação da
fita e aumento exponencial do número de cópias;
esses DNTP vão sendo incorporados quando a
polimerase tá polimerizando a fita. A inserção dos
nucleotídeos vai acontecendo e permitindo que
novos nucleotídeos sejam incorporados ali, então a
cadeia não termina.
- Esse equipamento permite colocar uma molécula
de DNA, que vai passar por uma estrutura chamada
de capilar, e toda vez que passar um nucleotídeo
ele vai emitir uma fluorescência.
- Antes disso é feito um PCR pra marcar os
nucleotídeos; Nesse PCR não tem o aumento do
número de cópias.
- Ao invés de nucleotídeos que proporcionam o
aumento da cadeia, tem nucleotídeos modificados
chamados DDNTP.
- Depois disso, o equipamento traduz em um monte
de pico, depois lê e visualiza.
- Qual a diferença entre DNTP e DDNTP? Quando
tem DNTP e ele vai migrar, fica uma hidroxila
livre pra aumentar a cadeia.
O DDNTP não tem a hidroxila livre, então não
permite o aumento da cadeia. Mas tem que usar ele
por causa da fluorescência.
- Faz uma PCR linear, onde não há aumento do
número de cópias.
- Quais são as aplicações desse procedimento?
Analisar polimorfismo de um nucleotídeo só,
identificar micro-organismo, tripagem de fungos e
vírus, detectar mutações, analise de metilação de
DNA, sequências múltiplas, verificação de clones,
sequenciamento do genoma humano, diagnosticar
câncer.
  METAGENÔMICA
- É o estudo de metagenomas – material genético
recuperado diretamente a partir de amostras
ambientais (amostras da boca, fezes, água, etc.).
- O DNA amostrado provém de vários organismos,
tudo misturado. Consegue trabalhar com vários
DNA’s ao mesmo tempo.
- Não há necessidade de cultura.
- Consegue dizer quem está na amostra, as funções
que estão presentes, qual a abundância das bactérias
dessa amostra, consegue fazer metagenômica
comparativa, etc.
- Abordagem descritiva: composição dos micro-
organismos presentes no local, o potencial genético,
etc.
- Abordagem funcional: as funções das bactérias, o
que elas estão fazendo naquele local (ex: boca do
paciente).
- Extrai a amostra, faz um PCR, faz sequenciamento,
análise no computador.
- Por esse método foi feito o microbioma humano.
Temos mais DNA de micro-organismos do que
nosso em nosso corpo.
- Tem diferentes bactérias em diferentes partes do
nosso corpo.