Júlia Mendonça Margatho Nº USP: 11217343

Resumo : Experimento 02 – Bioquímica Experimental

REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS.

Nesse experimento tem-se a proposta de realizar uma serie analises a fim de

caracterizar proteínas e aminoácidos, estudar as ligações peptídicas e a solubilidade delas em
meios com diferentes pH’s, solventes, com a adição de sais e outros compostos.
Também será proposta a aferição do ponto isoelétrico da caseína através da medição
da precipitação desta proteína em diversos pH’s cada vez mais ácidos. Além disso, será realizado
para a dosagem de proteínas, o espectro de absorção de uma bateria de soluções em diferentes
concentrações de albumina bovina (BSA) e a determinação da concentração de uma amostra
desconhecida de proteínas.

REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

A1 – Reação com Biureto:

• Selecionar e enumerar 4 Tubos de ensaio.

• Adicionar nessa ordem 2 ml(40 gotas) de cada composto:
1- Água.
2- solução de ovoalbumina a 2%.
3- solução de gelatina a 2%.
4- solução de glicina a 1%.
• Acrescentar a cada tubo uma quantidade igual de NaOH 2M.
• Agitar e adicionar aos poucos uma solução de CuSO4 0,5%.
• Observar se a solução se torna violeta.

A2 – Reação com Acetato de Chumbo:

• Selecionar e enumerar 3 tubos de ensaio.

• Adicionar nessa ordem composto:
1- Ponta de espátula de gelatina em pó.
2- Pequena mecha de cabelos.
3- 2 mL de ovoalbumina 2%.
• Adicionar a cada tubo 2 mL de NaOH 6M + 3 gotas de solução de acetato de chumbo
1%.
• Ferver cuidadosamente por 2/3 minutos e observar.
 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
B1- Efeito de ácidos forte

• Preparar dois tubos de ensaio:

1. Com 40 gotas de HNO3 concentrado.
2. Com 40 gotas de HCl concentrado.
• Adiconando cuidadosamente pelas paredes 2ml de solução de ovoalbumina.
• Observar.

B2- Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas:

• Adicionar num tubo Falcon de 15 Ml , 2 Ml de solução de ovoalbumina.

• Adicionar igual volume de solução saturada de (NH4)2SO4.
• Centrifugar por 5 min.
• Guardar sobrenadante e adicionar (NH4)2SO4 sólido até a saturação completa
(observar).
• Adicionar 2ml de água destilada ao precipitado (observar).

B3 – Precipitação por acetona:

• Preparar 4 tubos de ensaio

• Seguir o protocolo :

• Agitar e observar cada tubo.

C. Determinação do ponto isoelétrico de uma proteína

PARTE 1

• Adicionar 100ml de leite em béquer de 250ml.

• Aquecer leite no banho-maria a à 40oC (de 5 a 10 minutos).
• Gotejar ácido acético diluído e ir agitando.
• Esperar 10 minutos para decantar o precipitado.
• Descartar sobrenadante.
• Adicionar 100ml de água destilada no precipitado.
• Agitar e lavar o precipitado.
• Descartar sobrenadante.
• Repetir procedimento.

PARTE 2
 • Despejar o precipitado de caseína em um vidro de relógio coberto por um pedaço de
papel filtro.
• Colocar para secar na estufa a 80oC e retire após a secagem.
• Pesar 0,5 g de caseína seca, extraída do leite, e coloque em um béquer de 250 mL.
• Adicionar 25 mL de água e 5 mL de NaOH 1 mol.L-1.
• Aquecer em 40°C.
• Neutralizar a solução (pH ~ 7,0) com solução de ácido clorídrico 1 mol.L-1.

PARTE 3

• Separar 7 tubos e enumerar

• Adicionar respectivamente 8 mL de solução tampão com pH:
1. 6,0
2. 5,5
3. 5,0
4. 4,5
5. 4,0
6. 3,5
7. 3,0
• Adicionar a cada tubo 1,0 mL de solução de caseína.
• Agitar e observar imediatamente e após 30min.

METODOS DE DOSAGEM DE PROTEÍNAS

D1- Espectro de absorção da albumina do soro bovino

• Utilizar um espectrofotômetro, que irá traçar automaticamente, na faixa de 220-320

nm a solução 1 mg.mL-1 de albumina bovina (BSA).
• Determinar o coeficiente de extinção molar dessa proteína.

D2 -Determinação da concentração de proteína em uma amostra.

Método de dosagem de proteína descrito por Read & Northcote (Analytical Biochemistry, 1981,
116:53 e Methods in Enzymology, 1983, 91: 119).

• Separar 5 tubos de ensaio + um tubo contendo 1 mL de uma solução de BSA de

concentração desconhecida.
• Adicionar 5 soluções de BSA com concentrações entre 2 e 20 g/mL e volume total de
1,0 mL.
• Preparar um Branco (1,0 mL de água destilada em lugar da solução de proteína).
• Adicionar a cada tubo e agitar o 1,5 mL do Reagente de Coomassie Blue pronto para
uso.
• Deixar a mistura em repouso à temperatura ambiente por 10 min.
• Fazer a leitura da absorbância em 595 nm (obs: As leituras devem ser efetuadas em
até cerca de 30 minutos após a preparação das misturas).
• Observar e anotar na tabela fornecida.