Júlia Mendonça Margatho Nº USP: 11217343

Resumo : Experimento 04 – Bioquímica Experimental

Cinética Enzimática: Efeito do tempo e da concentração de enzima.

Nesse experimento será abordado na prática os conceitos de cinética enzimática, efetuando

um experimento para determinar a velocidade de formação de produtos (p-nitrofenol)
utilizando a técnica espectroscópica, em função da variação da concentração da enzima
empregada e em função do tempo de incubação dela, para assim, observar como a velocidade
varia em função das variáveis empregadas.

A. Efeito da concentração da enzima sobre a velocidade da reação

• Preparação de uma fileira de 7 tubos onde se manterá constantes a concentração do

substrato e do tampão, e se variará a concentração da enzima.
- SOLUÇÕES DE PARTIDA:
• Tampão - Citrato de sódio 1 mol/L, pH 5.5.
• Substrato - pNFF (p-nitrofenilfosfato) 20 mmol/L.
• Fosfatase ácida (40 ng/mL).
• Deve-se separar os 7 tubos com volumes especificados de e tampão, substrato, água e
enzima.
-VOLUME FINAL: 1,0ml – CONCENTRAÇÕES DE CADA COMPONENTE:
• Citrato de sódio 100 mmol/L.
• PNFF 2 mmol/L.
• A massa da enzima deve ir de 0 (branco) a 10ng.
• O protocolo deve ser montado na tabela a seguir.

• Manter os tubos em temperatura ambiente.

 • Adicionar em intervalos de 1 min a quantidade de enzima do protocolo.
• Homogeneizar o conteúdo.
• Deixar a reação processar por 30min.
• Interromper a reação com 1,0 mL de NaOH 1,0 mol/L a cada tubo, com o mesmo
intervalo de 1 min entre os tubos.
• Efetuar a leitura de absorbância em 410nm, e usar tubo 1 como branco.

Resolver os questionamentos do roteiro após calcular a quantidade de p-nitrofenolato

formado (em moles/min) em cada tubo.

B. Efeito do tempo de incubação da enzima com o substrato

• Preparar nova fileira.

• Manter constate a concentração do tampão, substrato e enzima.
- CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS:
• Tampão citrato de sódio 100 mmol/L, pH 5,5, contendo pNFF 2 mmol/L e fosfatase ácida
10 ng/tubo.
- SOLUÇÕES DE PARTIDA:
• MR = Tampão citrato de sódio 200 mmol/L, pH 5.5, contendo PNFF 4 mmol/L.
• Fosfatase ácida (40 ng/mL).
• Realizar protocolo variando o tempo da reação de 0 a 30 min.
• Especificar os volumes de MR e enzimas pipetados e o tempo total de reação.

• Pipetar a enzima nos tubos com 1 min de intervalo.

• Homogeneizar.
• Interromper a reação adicionando 1,0 mL de NaOH 1,0 mol/L.
• Efetuar a leitura de absorbância em 410nm (usar branco como o tubo de água em
substituição à enzima e 1,0 mL de NaOH 1,0 mol/L).

Resolver os questionamentos do roteiro após calcular a quantidade de p-nitrofenolato

formado (em moles/min) em cada tubo e fazer um gráfico desses valores em função do
tempo de reação, e outro gráfico de moles de p-nitrofenolato formado/min em função do
tempo de reação.