Resumo do artigo: “Theory of Solid-Phase Microextraction”

Autores do artigo: Janusz Pawliszyn

Informações da publicação: Department of Chemistry,University of Waterloo, Waterloo, ON, N2L 3G1,

Canada. Journal of Chromatographic Science,Vol. 38,July 2000. Páginas 270 a 278.

***

Resumo

O principal objetivo desta contribuição é descrever os conceitos fundamentais associados à microextração em

fase sólida (SPME). A teoria fornece informações ao desenvolver métodos SPME e identifica parâmetros para
controle e otimização rigorosos. Um modelo matemático foi desenvolvido para entender os principais
processos da SPME, aplicando princípios fundamentais básicos da termodinâmica e da teoria da difusão. O
modelo assume condições idealizadas e é limitado ao ar, líquido ou espaço acima da amostragem de líquidos.
A teoria para casos ideais pode ser bastante precisa para concentrações vestigiais em matrizes simples, como
ar ou água potável em condições ambientais, quando fatores secundários, como temperatura de expansão de
polímeros e as alterações nos coeficientes de difusão por causa dos solutos nos polímeros podem ser
negligenciadas. Quando as condições são mais complexas, a teoria para casos ideais ainda estima com
eficiência relações gerais entre parâmetros.

Introdução

A microextração em fase sólida (SPME) foi desenvolvida para atender à necessidade de facilitar a preparação
rápida de amostras, tanto no laboratório quanto no local onde o sistema investigado está localizado (1). Na
técnica, uma pequena quantidade de fase de extração que é dispersa em um suporte sólido é exposta à amostra
por um período de tempo bem definido. Em uma abordagem, é alcançado um equilíbrio de partição entre a
matriz da amostra e a fase de extração. Nesse caso, as condições de convecção não afetam a quantidade
extraída. Em uma segunda abordagem que utiliza extração de pré-equilíbrio por curto período de tempo, se a
convecção ou agitação ou ambas são constantes, a quantidade de analito extraído está relacionada ao tempo. A
quantificação pode então ser realizada com base na acumulação programada de analitos no revestimento. A
Figura 1 ilustra várias implementações do SPME que foram consideradas. Estes incluem principalmente
conceitos de extração em leito aberto, como fibras revestidas, vasos e discos de mecanismo de agitação,
abordagens de tubo butin também são consideradas. Algumas implementações tratam melhor dos problemas
associados à agitação e outras melhoram a facilidade de implementar a introdução de amostras no instrumento
analítico.
Deve-se notar que o SPME foi originalmente nomeado após o primeiro experimento que utilizava um
dispositivo SPME, que envolvia extração em fibras sólidas de sílica fundida. Posteriormente, foi renomeado
para ser uma referência ao aparecimento da fase de extração em relação a uma fase doadora líquida ou gasosa,
embora se reconheça que a fase de extração nem sempre é tecnicamente sólida.

As configurações e operação dos dispositivos SPME são muito simples. Por exemplo, na implementação de
fibra revestida da tecnologia, quem sabe usar uma seringa é capaz de operar um dispositivo SPME. No caso
de extração automatizada dentro do tubo para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), basta encaixar
uma parte do capilar de cromatografia em fase gasosa (GC) no sistema e ligar o amostrador automático para
iniciar sua operação. A tecnologia é projetada para simplificar bastante a preparação da amostra. No entanto,
esse recurso cria uma falsa impressão de que a extração é um processo simples, quase trivial. Esse mal-
entendido frequentemente resulta em decepções. Deve-se enfatizar que os processos fundamentais envolvidos
no SPME são semelhantes às técnicas mais tradicionais e, portanto, os desafios para desenvolver métodos
bem-sucedidos são semelhantes. A natureza dos analitos alvo e a complexidade da matriz da amostra
determinam o nível de dificuldades em realizar uma extração bem-sucedida. A simplicidade, velocidade e
conveniência dos dispositivos de extração afetam principalmente os custos da implementação e automação
práticas dos métodos desenvolvidos (2). O objetivo desta contribuição é enfatizar os princípios fundamentais
da técnica que definem as vantagens e limitações da tecnologia SPME.
Discursão

Princípios do SPME

No SPME, uma pequena quantidade da fase de extração associada a um suporte sólido é colocada em contato
com a matriz de amostra por um período de tempo predeterminado. Se o tempo for longo o suficiente, é
estabelecido um equilíbrio de concentração entre a matriz da amostra e a fase de extração. Quando as
condições de equilíbrio são atingidas, a exposição da fibra por um longo período de tempo não acumula mais
analitos. Existem duas implementações diferentes da técnica SPME amplamente exploradas até hoje. Uma
implementação está associada a um projeto de tubo e a outra está associada a um projeto de fibra. O projeto de
tubo pode usar arranjos muito semelhantes (como SPE); no entanto, a principal diferença (além do volume da
fase de extração) é que o objetivo do SPME nunca é o de uma extração exaustiva. Essa diferença simplifica
substancialmente o design dos sistemas. Por exemplo, na análise de líquidos, o SPME no tubo usa 0,25 mm-
d.d. tubos e aproximadamente 0,1 µL da fase de extração; a preocupação com a inovação não é relevante
porque a extração exaustiva não é um objetivo. De fato, o objetivo do experimento é produzir um avanço
completo o mais rápido possível, porque isso indica que a extração do equilíbrio foi alcançada.

Uma abordagem mais tradicional ao SPME envolve fibras revestidas. O transporte de analitos da matriz para o
revestimento começa assim que a fibra revestida é colocada em contato com a amostra. Há uma diferença
substancial no desempenho entre os revestimentos líquido e sólido (Figura 2). Uma comparação com a
extração de equilíbrio adsorvente versus absorção é útil.

Nos dois casos, o processo de extração começa com a adsorção de analitos na interface matriz- fase de
extração e, depois, a difusão dos analitos para a maior parte da fase de extração. Se os coeficientes de difusão
(coeficiente que representa a facilidade com que cada soluto se move em um determinado solvente) dos
analitos na fase de extração forem altos, os analitos particionam completamente entre as duas fases e a
extração por absorção é realizada. Esse processo é auxiliado por revestimentos finos da fase de extração ou
pela convecção da matriz da amostra (se estiver fluindo líquido). No entanto, se o coeficiente de difusão for
baixo, o analito permanecerá na interface, o que resulta na adsorção. A principal vantagem da extração por
absorção (particionamento) é uma isotérmica linear em uma ampla faixa de concentrações de analito e
interferência, porque a propriedade da fase de extração não muda substancialmente até que a quantidade
extraída seja aproximadamente 1% do peso da fase de extração. No entanto, na extração por adsorção, a
isotérmica é altamente não linear para concentrações mais altas quando a cobertura superficial é substancial.
Isso causa um problema particular nos métodos de equilíbrio, porque a resposta da fibra para o analito em
altas concentrações da amostra depende das concentrações dos analitos e das interferências. As vantagens dos
sorventes sólidos incluem maior seletividade e capacidade para analitos polares e voláteis.

Equilíbrio Multifásico

O SPME é um processo de equilíbrio multifásico. Freqüentemente, o sistema de extração é complexo, como

em uma amostra que consiste em uma fase aquosa com partículas sólidas em suspensão com várias interações
de adsorção com analitos, além de um gás no headspace. Em alguns casos, fatores específicos devem ser
considerados, como perdas de analitos por biodegradação ou adsorção nas paredes do vaso de amostragem ou
mecanismo de agitação. Nesta discussão, apenas duas fases são consideradas: (a) o revestimento da fibra e (b)
uma matriz homogênea como água ou ar puro.

Normalmente, o SPME é considerado completo quando a concentração do analito atinge o equilíbrio da

distribuição entre a matriz da amostra e o revestimento da fibra. Na prática, isso significa que, uma vez
alcançado o equilíbrio, a quantidade extraída é constante nos limites do erro experimental e é independente de
aumentos adicionais no tempo de extração. As condições de equilíbrio podem ser descritas como:

n =(Kfs Vf Vs C0) / (Kfs Vf+Vs) Equação 1

onde n é a massa de analito extraído pelo revestimento, Kfs é uma constante de distribuição da matriz de
revestimento de fibra, Vf é o volume de revestimento de fibra, Vs é o volume de amostra e C0 é a
concentração inicial de um determinado analito na amostra (3).

A rigor, essa discussão se limita ao equilíbrio de particionamento que envolve fases poliméricas líquidas,
como o polidimetilsiloxano (PDMS). O método de análise para revestimentos de adsorvente sólido é o mesmo
para a baixa concentração de analito, porque a área total da superfície disponível para adsorção é proporcional
ao volume do revestimento se for assumida porosidade constante do absorvente. Para altas concentrações de
analitos, pode ocorrer saturação da superfície, resultando em isotermas não lineares (como será discutido). Da
mesma forma, a alta concentração de um composto de interferência competitivo pode deslocar o analito alvo
da superfície do sorvente.

A equação 1 (que assume que a matriz da amostra pode ser representada como uma única fase homogênea e
que não existe headspace no sistema) pode ser modificada para levar em consideração a existência de outros
componentes na matriz, considerando os volumes das fases individuais e os constantes de distribuição
apropriadas. A extração pode ser interrompida e a fibra analisada antes do equilíbrio. No entanto, para obter
dados reproduzíveis, são necessárias condições constantes de convecção e tempo cuidadoso da extração.

A simplicidade e a conveniência da operação fazem do SPME uma alternativa superior às técnicas mais
estabelecidas em diversas aplicações. Em alguns casos, a técnica facilita investigações únicas. A equação 1
indica que, após o equilíbrio, existe uma relação proporcional direta entre a concentração da amostra e a
quantidade de analito extraído. Essa é a base para a quantificação do analito. As vantagens mais visíveis do
SPME existem nos extremos dos volumes de amostra. Como a configuração é pequena e conveniente, fibras
revestidas podem ser usadas para extrair analitos de amostras muito pequenas.

Por exemplo, os dispositivos SPME são usados para investigar substâncias emitidas por um único bolbo de
flores durante sua vida útil - o uso de fibras com diâmetro submicrométrico permite a investigação de células
únicas. Como o SPME não extrai exaustivamente os analitos alvo, sua presença em um sistema vivo não deve
resultar em um distúrbio significativo. Além disso, a técnica facilita a especiação em sistemas naturais, porque
a presença de uma fibra minúscula que remove pequenas quantidades de analito provavelmente não perturba o
equilíbrio químico no sistema. No entanto, deve-se notar que a fração de analito extraído aumenta quando a
proporção de revestimento para o volume da amostra aumenta. A extração completa pode ser alcançada para
revestimentos espessos e pequenos volumes de amostra quando as constantes de distribuição são
razoavelmente altas. Esta observação pode ser usada como uma vantagem se for necessária uma extração
exaustiva. É muito difícil trabalhar com pequenos volumes de amostra usando técnicas convencionais de
preparação de amostras. Além disso, o SPME permite a rápida extração e transferência de um volume de
amostra para um instrumento analítico. Esses recursos resultam em uma vantagem adicional ao investigar
intermediários no sistema. Por exemplo, o SPME foi usado para estudar as vias de biodegradação de
contaminantes industriais (4). A outra vantagem é que essa técnica pode ser usada para estudos da distribuição
de analitos em um complexo sistema multifásico (5) e para especificar diferentes formas de analitos em uma
amostra (6).

Além disso, quando o volume da amostra é muito grande, a equação 1 pode ser simplificada para:

n = Kfs Vf C0 Equação 2
Esta equação aponta para a utilidade da técnica para aplicações em campo. Nesta equação, a quantidade de
analito extraído é independente do volume da amostra. Na prática, não há necessidade de coletar uma amostra
definida antes da análise, porque a fibra pode ser exposta diretamente ao ar ambiente, água ou fluxo de
produção. A quantidade do analito extraído corresponde diretamente à sua concentração na matriz sem
depender do volume da amostra. Quando a etapa de amostragem é eliminada, todo o processo analítico pode
ser acelerado, assim, os erros associados às perdas do analito por decomposição ou adsorção nas paredes do
recipiente de amostragem podem ser evitados. Essa vantagem do SPME poderia ser aprimorada praticamente
desenvolvendo dispositivos de campo portáteis em escala comercial.

Amostragem Rápida

No caso de sorventes sólidos, o revestimento possui uma estrutura de vidro cristalino bem definida, que (se
densa) reduz substancialmente os coeficientes de difusão dentro da estrutura. Portanto, dentro do tempo
experimental, a extração ocorre apenas na superfície do revestimento. Isso pode ser demonstrado
considerando a extração de proteínas (ilustrada na Figura 3, nao coloquei aqui a imagem). A mistura original
contém 3 compostos: mioglobina, citocromo e lisozima. Durante a extração com fibras de ácido poliacrílico,
compostos com menor afinidade são observados apenas em curtos períodos de extração. Quando o tempo de
extração é maior, ocorre o deslocamento de analitos com afinidades mais baixas. Nesse caso, a lisozima (com
maior afinidade pelo revestimento) substitui os outros 2 compostos durante a extração. Esse efeito está
associado ao fato de haver apenas uma área superficial limitada disponível para adsorção. Se esta área estiver
substancialmente ocupada, ocorrerão os efeitos de deslocamento (7,8) e a quantidade em equilíbrio extraída
pode variar com as concentrações do alvo e de outros analitos. No entanto, na extração de analitos com
revestimentos líquidos, ocorre particionamento entre a matriz da amostra e a fase de extração. Nesse caso, as
quantidades de extração no equilíbrio variam apenas se a propriedade de revestimento for modificada pelos
componentes extraídos, o que ocorre apenas quando a quantidade extraída é uma porção substancial (alguns
por cento) da fase de extração. Isso é muito raramente observado, porque o SPME é normalmente usado para
determinar amostras de contaminação.

A única maneira de superar essa limitação fundamental dos revestimentos porosos é usar um tempo de
extração muito menor que o tempo de equilíbrio, para que a quantidade total de analitos acumulados na fibra
fique substancialmente abaixo do valor de saturação (sugerido pela Figura 3). Ao realizar tais experimentos, é
importante não apenas controlar com precisão os tempos de extração, mas também é importante monitorar as
condições de convecção para garantir que sejam constantes ou possam ser compensadas. Uma maneira de
eliminar a necessidade de compensação da convecção é normalizar ou usar as mesmas condições de agitação.
Por exemplo, os meios de agitação usados em taxas de rotação bem definidas no laboratório ou os
ventiladores usados para o monitoramento do ar em campo garantem uma convecção consistente.
A medição de SPME de exposição a curto prazo descrita tem uma vantagem associada ao fato de que a taxa
de extração é definida pela difusividade dos analitos através da camada limite (boundary layer) da matriz da
amostra e pelos coeficientes de difusão correspondentes, e não pelas constantes de distribuição (Figura 4).

A massa do analito extraído pode ser estimada a partir da seguinte equação (9):

onde "n" é a massa do analito extraído no tempo de amostragem (t), "Dg" é o coeficiente de difusão molecular
em fase gasosa (cm2/s), "b" é o raio externo do revestimento de fibra (cm), “L"é o comprimento da haste
revestida (cm), "δ" é a espessura da camada limite que envolve o revestimento de fibra (cm) e "Cg" é a
concentração do analito no ar a granel (ng/mL). A absorção linear dos analitos em relação ao tempo para
exposições curtas é demonstrada na Figura 5.
Um entendimento preciso da definição e espessura da camada limite (boundary layer) nesse sentido é útil. A
espessura da camada limite é determinada pela taxa de convecção (agitação) na amostra e pela difusão do
analito (10). Assim, em uma única amostra, a espessura da camada limite será diferente para vários analitos. A
rigor, a camada limite é uma região na qual o fluxo do analito é progressivamente mais dependente da difusão
do analito e menos da convecção quando a fase de extração é abordada. No entanto, por conveniência,
presume-se que o fluxo de analito no volume da amostra fora da camada limite seja controlado por convecção,
enquanto que o fluxo de analito dentro da camada limite seja controlado por difusão. A espessura da camada
limite é definida como a posição em que essa transição ocorre, ou o ponto em que a convecção na camada
limite é igual à difusão da camada limite. Nesse ponto, o fluxo de analito controlado por difusão da espessura
da camada limite em direção à fase de extração é igual ao fluxo do analito do volume da amostra em direção à
espessura da camada limite, que é controlada por convecção. As diferenças nos coeficientes de difusão entre
os compostos são pequenas comparadas às diferenças nas constantes de distribuição. Isso facilita a calibração
do sistema. Devido às grandes diferenças nas constantes de distribuição entre os analitos, os cromatogramas
resultantes são caracterizados por pequenas áreas de pico para compostos com pequenas constantes de
distribuição e grandes áreas de pico para aqueles com grandes constantes. Com a captação dependente dos
coeficientes de difusão, todos os compostos com massas moleculares semelhantes em um cromatograma terão
áreas de pico semelhantes (desde que tenham respostas similares ao detector). Além disso, é relativamente
simples calcular o coeficiente de difusão para um determinado analito e também corrigir as pequenas
diferenças nele. Deve-se entender que esse sistema é adequado apenas para análise de traços. Quando as
concentrações das amostras se tornam muito altas, ocorre a saturação dos locais ativos e as taxas de captação
não são mais lineares. Tempos de exposição mais curtos nos quais pequenas quantidades são extraídas podem
resolver esse problema. Além disso, nessas concentrações mais altas, as amostras são facilmente extraídas e
analisadas com uma fibra PDMS usando métodos convencionais de extração SPME. Os resultados da extração
pela abordagem do tipo difusão são mostrados na Figura 6.
O acúmulo de componentes voláteis no revestimento sólido em 10 segundos é muito maior em comparação
com a extração de equilíbrio de 10 minutos no PDMS. Essa abordagem de extração não se limita aos
dispositivos que usam a geometria da fibra, mas geralmente é aplicável.

Modos de Extração com SPME de fibra revestida

A amostragem de SPME pode ser realizada de três modos básicos: (a) extração direta, (b) extração do espaço
livre (headspace) e (c) extração com proteção de membrana. A Figura 7 ilustra as diferenças entre esses
modos.

No modo de extração direta (Figura 7A), a fibra revestida é inserida na amostra e os analitos são transportados
diretamente da matriz da amostra para a fase de extração. Para facilitar a extração rápida, é necessário algum
nível de agitação para transportar os analitos do volume da amostra para a vizinhança da fibra. Para amostras
gasosas, o fluxo natural de ar (por exemplo, convecção) é freqüentemente suficiente para facilitar o equilíbrio
rápido de analitos voláteis, mas para matrizes aquosas, técnicas de agitação mais eficientes, como fluxo rápido
de amostra, movimento rápido de fibra ou frasco, agitação ou sonicação são necessários para reduzir o efeito
da zona de depleção produzida perto da fibra como resultado do transporte difuso do analito através da
camada estacionária de líquido ao redor da fibra.

No modo "headspace" (Figura 7B), os analitos são extraídos da fase gasosa equilibrada com a amostra. O
principal motivo dessa modificação é proteger a fibra dos efeitos adversos causados por substâncias não
voláteis e de alto peso molecular presentes na matriz da amostra (por exemplo, ácidos húmicos ou proteínas).
O modo "headspace" também permite modificações na matriz (incluindo ajuste de pH) sem afetar a fibra. Em
um sistema que consiste em uma amostra líquida e seu "headspace", a quantidade de analito extraído pelo
revestimento de fibra não depende da localização da fibra (na fase líquida ou gasosa); portanto, a sensibilidade
da amostragem "headspace" é a mesma da amostragem direta, desde que os volumes das 2 fases sejam os
mesmos nos dois modos de amostragem. Mesmo quando nenhum “headspace” é usado na extração direta,
uma diferença significativa de sensibilidade entre a amostragem direta e o "headspace" pode ocorrer apenas
para analitos muito voláteis. No entanto, a escolha do modo de amostragem tem um impacto muito
significativo na cinética de extração. Quando a fibra está no " headspace ", os analitos são removidos primeiro
do " headspace ", seguidos por extração indireta da matriz. Se a constante de Henry de um determinado
composto for alta, a concentração de analitos no "headspace" será alta, resultando em extração muito rápida,
porque os analitos extraídos se originam principalmente do "headspace" gasoso (Figura 8A).

No entanto, se as constantes de Henry forem baixas, a extração será longa porque os analitos precisam se
difundir da fase condensada antes de atingirem a fibra (Figura 8B). Portanto, no caso da extração de amostras
aquosas, os analitos voláteis e não polares são extraídos muito mais rapidamente que os semivoláteis ou
voláteis polares. A temperatura tem um efeito significativo na cinética do processo, porque determina a
pressão de vapor dos analitos acima da fase condensada. Em geral, os tempos de equilíbrio para os compostos
voláteis são mais curtos para o SPME "headspace" do que para a extração direta sob condições de agitação
semelhantes devido às três razões a seguir: (a) uma porção substancial dos analitos está presente no
"headspace" antes do início do processo de extração, (b) normalmente existe uma grande interface entre a
matriz da amostra e o "headspace"; e (c) os coeficientes de difusão na fase gasosa são tipicamente mais altos
em 4 ordens de grandeza do que nos líquidos. A concentração de compostos semivoláteis na fase gasosa à
temperatura ambiente é pequena e as taxas de extração de "headspace" para esses compostos são
substancialmente mais baixas. Estes compostos podem ser melhorados usando agitação muito eficiente ou
aumentando a temperatura de extração. A Figura 9 ilustra os perfis de tempo de equilíbrio obtidos para a
extração de metanfetamina de uma amostra de urina a várias temperaturas. A 22°C e 40°C, o equilíbrio é
muito demorado - excedendo 100 minutos, conforme indicado neste gráfico.

Ele cai para aproximadamente 20 minutos quando a temperatura de extração é de 60°C e apenas alguns
minutos quando a temperatura é de 73°C. A mudança dramática com o tempo de equilíbrio está associada ao
fato de que um aumento na temperatura resulta em um aumento da constante de Henry do analito, um
aumento no coeficiente de difusão e uma diminuição da quantidade extraída em equilíbrio. Essa diminuição
está associada ao fato de que a constante de distribuição diminui quando a temperatura aumenta. Portanto, é
importante otimizar cuidadosamente a temperatura de extração para os menores tempos de equilíbrio e para
sensibilidades aceitáveis. Na maioria das aplicações SPME, a extração no equilíbrio é realizada. No entanto,
frequentemente quando os tempos de equilíbrio são longos, a quantificação pré-equilíbrio pode ser
considerada. É importante nessas experiências garantir condições de agitação constantes e tempos de extração
aceitáveis para obter boa precisão.

No terceiro modo (SPME com proteção de membrana, Figura 7C), a fibra é separada da amostra com uma
membrana seletiva, que permite que os analitos passem bloqueando as interferências. O principal objetivo do
uso da barreira da membrana é proteger a fibra contra efeitos adversos causados por compostos de alto peso
molecular quando amostras muito sujas são analisadas. Embora a extração no "headspace" tenha o mesmo
objetivo, a proteção por membrana permite a análise de compostos menos voláteis. O processo de extração é
substancialmente mais lento que a extração direta, porque os analitos precisam se difundir através da
membrana antes que possam atingir o revestimento. O uso de membranas finas e um aumento na temperatura
de extração resultam em tempos de extração mais curtos.

Modos de Extração SPME dentro do tubo

Existem 2 abordagens fundamentais para o SPME no tubo: (a) ativo ou dinâmico (quando os analitos passam
pelo tubo) e (b) passivo ou estático (quando os analitos são transferidos para o sorvente por difusão). Em
qualquer uma dessas abordagens, o revestimento pode ser suportado em uma haste de sílica fundida ou
revestido no interior de um tubo ou capilar. Os aspectos teóricos dos processos de extração que utilizam esses
arranjos geométricos serão brevemente discutidos.
SPME dinâmico dentro do tubo

Neste sistema, assumimos (a) um pedaço de capilar de sílica fundida revestido internamente com uma fina
película de fase de extração (um pedaço de coluna capilar GC aberta tubular) é usado ou (b) o capilar é
embalado com uma fase de extração dispersa em um material de suporte inerte (um pedaço de coluna capilar
de cromatografia de micro-líquido). Durante a introdução da amostra, a frente do analito migra através do
capilar com uma velocidade proporcional à velocidade linear da amostra e inversamente relacionada à razão
de partição (11,12). Para capilares curtos com uma pequena dispersão, pode-se presumir que o tempo de
extração seja semelhante ao tempo necessário para que o centro da banda atinja o final do capilar. O tempo de
extração é proporcional ao comprimento do capilar e inversamente proporcional à vazão linear do fluido. O
tempo de extração também aumenta com o aumento da constante de distribuição de revestimento-amostra e
com o aumento da espessura da fase de extração, mas diminui com o aumento do volume vazio do capilar.
Um aumento na constante de distribuição da amostra do revestimento produz um aumento na quantidade
absoluta extraída. Observou-se que aumentos nas quantidades extraídas podem ser alcançados em muitos
casos pré-condicionando o capilar com metanol ou algum outro solvente apropriado antes da extração. O
aprimoramento foi observado mesmo quando um tampão (plugue) de metanol foi aspirado no capilar antes da
coleta da amostra e a amostra seguiu o tampão enquanto estava no capilar durante o aspirado de extração -
etapas de dispersão. Isso é semelhante ao pré-condicionamento de solvente usado no SPE para aprimorar a
extração. Na prática, o SPME no tubo é implementado substituindo uma seção da tubulação em um
amostrador automático disponível comercialmente e depois programando o amostrador automático para passar
a amostra para dentro e para fora do capilar de extração até que seja alcançado o equilíbrio ou um nível de
extração adequado.

Deve-se enfatizar que isso é válido apenas para extração direta quando a matriz da amostra passa pelo capilar.
Essa abordagem é limitada a amostras de gás e água limpa sem partículas. A abordagem SPME "headspace"
pode ampliar a aplicação de SPME no tubo. Nesses casos, deve-se considerar cuidadosamente a transferência
de massa entre a amostra e o "headspace" para descrever o processo corretamente. Além disso, se a taxa de
fluxo está produzindo rapidamente um comportamento turbulento e a constante de distribuição amostra-
revestimento não é muito alta, condições perfeitas de agitação são atendidas e a equação 4 pode ser usada para
estimar os tempos de equilíbrio. Nesse caso, presume-se que o tempo de equilíbrio (t e) seja alcançado quando
95% da quantidade de equilíbrio do analito é extraída da amostra:
Nesta equação, "b" - a refere-se à espessura do material absorvente e "D f" refere-se à difusão do analito no
absorvente.

A remoção de analitos de um tubo é um problema de eluição semelhante à cromatografia frontal e foi

discutida em detalhes (12). Em geral, se a temperatura de dessorção de um GC for alta e revestimentos finos
forem usados, todos os analitos estarão na fase gasosa assim que o revestimento for colocado no injetor e o
tempo de dessorção corresponder à eluição de 2 volumes vazios do capilar. Para dessorção líquida, o volume
de dessorção pode ser ainda menor porque os analitos podem ser focados na frente do solvente de dessorção
(13).

SPME estático no tubo com amostragem média ponderada no tempo

Além da medição da concentração de analito encontrada em um local bem definido no espaço e no tempo
(obtida usando as abordagens discutidas anteriormente), é possível uma amostragem integrada com um
simples Sistema SPME. Isso é particularmente importante nas medições em campo, quando as mudanças na
concentração do analito ao longo do tempo e nas variações do local devem ser levadas em consideração com
frequência. Quando a fase de extração não é exposta diretamente à amostra, mas contém um tubo de proteção
(agulha) sem nenhum fluxo da amostra atraves dele (Figura 10A), a extração ocorre através da fase estática
de gás presente na agulha. O sistema integrado pode consistir na fase de extração que reveste o interior da
tubulação ou pode ser uma fibra revestida externamente e inserida na agulha. Esses arranjos geométricos
representam um método muito poderoso, capaz de gerar uma resposta proporcional à integral da concentração
do analito ao longo do tempo e do espaço, quando a agulha é movida pelo espaço (14). Nesses casos, o único
mecanismo para o transporte de analitos para a fase de extração é a difusão através da fase gasosa contida na
tubulação. Durante esse processo, um perfil de concentração linear (mostrado na Figura 10) é estabelecido no
tubo entre a pequena abertura da agulha - caracterizada pela área de superfície (A) e a distância (Z) entre a
abertura da agulha - e a posição da fase de extração .
A quantidade de analito extraído (dn) durante o intervalo de tempo (dt) pode ser calculada considerando a
primeira lei de difusão de Fick (15):

Onde ∅C (t) / Z é um valor do gradiente estabelecido na agulha entre a abertura da agulha e a posição da fase
de extração (Z). A função ∅C (t) é equivalente a C (t) -Cz, onde C (t) é uma concentração dependente do
tempo do analito na amostra próxima à abertura da agulha e Cz é a concentração do analito na fase gasosa
próxima ao revestimento. Se "Cz" for próximo de zero para um revestimento alto - capacidade constante de
distribuição de gás, então ∅C (t) é equivalente a C (t).

A concentração do analito na posição de revestimento da agulha (Cz) aumentará com o tempo de integração,
mas será mantida baixa em comparação com a concentração da amostra devido à presença do revestimento
absorvente. Portanto, a quantidade acumulada ao longo do tempo pode ser calculada como:

Como esperado, a quantidade extraída de analito é proporcional à integral da concentração da amostra ao

longo do tempo e o coeficiente de difusão de analitos na fase gasosa (Dg) na área da abertura da agulha (A), e
é inversamente proporcional à distância da posição do revestimento em relação à abertura da agulha (Z).
Deve-se enfatizar que a equação 5 é válida apenas em uma situação em que a quantidade de analito extraído
no sorvente é uma pequena fração (abaixo do RSD da medição, tipicamente 5%) da quantidade de equilíbrio
em relação à menor concentração na amostra. Para prolongar os tempos de integração, o revestimento pode
ser colocado ainda mais na agulha (resultando em um Z maior), a abertura da agulha pode ser reduzida pela
introdução de um orifício adicional (um A menor) ou um absorvente de maior capacidade. As duas primeiras
soluções resultam em uma baixa sensibilidade de medição. Um aumento da capacidade de adsorvente
apresenta uma oportunidade mais atraente. Isso pode ser conseguido através do aumento do volume do
revestimento ou de sua afinidade com o analito. Um aumento no volume do revestimento exigirá um aumento
no tamanho do dispositivo. A abordagem ideal para aumentar o tempo de integração é usar sorventes
caracterizados por grandes constantes de distribuição de gás de revestimento.

A exploração de restringir o acesso ao meio absorvente permite a implementação de SPME para amostragem
de média ponderada no tempo (TWA). Sempre que a difusão na superfície do sorvente é limitada, o sorvente
pode atuar como uma espécie de "zerosink", no qual a extração está muito longe do equilíbrio em condições
normais de amostragem. Portanto, na prática, todos os analitos que atingem a superfície sorvente são
essencialmente absorvidos exaustivamente. No entanto, a taxa de difusão ainda depende da concentração da
amostra; portanto, a quantidade total absorvida pelo revestimento é proporcional à média das concentrações de
analitos ao longo do tempo, portanto, é obtida a amostragem de TWA. Isso foi implementado até o momento
com o conjunto de fibra convencional, retraindo a fibra a uma distância conhecida dentro da agulha (Figura
10B). O tamanho pequeno do orifício da agulha limita a difusão à superfície do sorvente, e a taxa de difusão
final é uma função da distância da ponta da fibra ao final da agulha. Dependendo da volatilidade e
concentração do analito de interesse, a fibra pode ser posicionada mais próxima do final da agulha ou mais
afastada dela, a fim de atingir o grau desejado de extração sem equilibrio e sensibilidade. Também seria
possível implementar esse tipo de amostragem com o sorvente revestido na parede interior de um capilar. No
entanto, até o momento, a implementação da agulha retrátil ganhou mais atenção devido à sua facilidade de
uso e ajustabilidade para o analito e a amostra fornecida.

Previsão de constante de distribuição

Em muitos casos, as constantes de distribuição apresentadas nas equações 1 e 2 (que determinam a

sensibilidade do SPME) podem ser estimadas a partir de dados físico-químicos e parâmetros cromatográficos.
Essa abordagem elimina a necessidade de calibração. Por exemplo, constantes de distribuição entre um
revestimento de fibra e uma matriz gasosa (por exemplo, ar) podem ser estimadas usando tempos de retenção
isotérmicos de GC em uma coluna com uma fase estacionária idêntica ao material de revestimento de fibra
(16). Isso é possível porque o processo de particionamento no GC é semelhante ao processo de
particionamento no SPME e existe uma relação bem definida entre a constante de distribuição e o tempo de
retenção. A natureza da fase gasosa não afeta a constante de distribuição, a menos que os componentes do gás
(como a umidade) inchem o polímero, alterando suas propriedades. Um método mais útil para determinar
constantes de distribuição de revestimento para gás usa o sistema de índice de retenção programado por
temperatura linear (LTPRI), que indexa o tempo de retenção de um composto em relação aos tempos de
retenção de n-alcanos. Este sistema é aplicável aos tempos de retenção da cromatografia gás-líquido
programada em temperatura. O logaritmo das constantes de distribuição de revestimento para o ar de n-
alcanos pode ser expresso como uma função linear de seus valores de LTPRI. Para PDMS, esse
relacionamento é log Kfg = 0,00415 × LTPRI – 0,188 (17). Assim, o sistema LTPRI permite a interpolação
dos valores de Kfg do gráfico do log Kfg versus o índice de retenção. Os valores de LTPRI para muitos
compostos estão disponíveis na literatura; portanto, esse método permite estimar valores de Kfg sem
experimentação. Se o valor LTPRI de um composto não estiver disponível em fontes publicadas, ele poderá
ser determinado a partir de uma execução de GC. Deve-se notar que a coluna GC usada para determinar o
valor de LTPRI deve ser revestida com o mesmo material que o revestimento de fibra.

A estimativa da constante de distribuição de água de revestimento pode ser realizada usando a equação 3. A
constante de distribuição de revestimento de gás pode ser encontrada aplicando as técnicas discutidas
anteriormente, e a constante de distribuição de gás-água (constante de Henry) pode ser obtida de tabelas
físico-químicas ou estimado pelo método de contribuição unitária estrutural (18).

Algumas correlações podem ser usadas para antecipar tendências nas constantes de distribuição de água de
revestimento SPME para analitos. Por exemplo, vários pesquisadores relataram a correlação entre as
constantes de distribuição de água e octanol, Kow e Kfw. Isso é esperado porque Kow é uma medida muito
geral da afinidade dos compostos com a fase orgânica. No entanto, deve-se lembrar que as tendências são
válidas apenas para compostos dentro de uma série homóloga, como hidrocarbonetos alifáticos,
hidrocarbonetos aromáticos ou fenóis. Eles não devem ser usados para fazer comparações entre diferentes
classes de compostos devido a diferentes coeficientes de atividade do analito no polímero.

Efeitos dos parâmetros de extração

A teoria termodinâmica prevê os efeitos da modificação de certas condições de extração no particionamento e

indica os parâmetros para controlar a reprodutibilidade. Essa teoria pode ser usada para otimizar as condições
de extração com um número mínimo de experimentos e corrigir variações nas condições de extração sem a
necessidade de repetir os testes de calibração sob as novas condições. Por exemplo, a análise SPME do ar
externo pode ser feita a temperaturas ambientes que podem variar significativamente. A relação que prediz o
efeito da temperatura na quantidade de analito extraído permite a calibração sem a necessidade de extensas
experiências (19). As condições de extração que afetam Kfs (const. De distruibuição) incluem temperatura,
salga, pH e a quantidade de conteúdo de solvente orgânico na água.

Um aumento da temperatura de extração causa um aumento na taxa de extração e, simultaneamente, uma

diminuição na constante de distribuição. Em geral, se a taxa de extração for uma grande preocupação, deve-se
usar a temperatura mais alta que ainda fornece sensibilidade satisfatória.

O ajuste do pH da amostra pode melhorar a sensibilidade do método para analitos básicos e ácidos. Isso está
relacionado ao fato de que, a menos que revestimentos de troca iônica sejam utilizados, o SPME pode extrair
apenas espécies não iônicas neutras da água. Ajustando adequadamente o pH, os ácidos e bases fracos podem
ser convertidos em suas formas neutras; nesse caso, podem ser extraídos pela fibra SPME. Para garantir que
pelo menos 99% do composto ácido esteja na forma neutra, o pH deve ser pelo menos 2 unidades menor que o
pKa do analito. Para os analitos básicos, o pH deve ser maior que o pKa em 2 unidades.

O volume da amostra deve ser selecionado com base na constante de distribuição estimada Kfs (8). A
constante de distribuição pode ser estimada usando valores da literatura para o analito alvo ou um composto
relacionado com o revestimento selecionado. A constante de distribuição também pode ser calculada ou
determinada experimentalmente equilibrando a amostra com a fibra e determinando a quantidade de analito
extraído pelo revestimento. Deve-se tomar cuidado para evitar perdas do analito por adsorção, evaporação ou
degradação microbiana quando são necessários tempos de extração muito longos para alcançar o equilíbrio.

A sensibilidade do método SPME é proporcional ao número de mols do analito (n) extraído da amostra e (para
extração direta) é dada pela equação 1. Quando o volume da amostra (Vs) aumenta, a quantidade de analito
extraído também aumenta até que o volume da amostra se torne significativamente maior que o produto da
constante de distribuição e o volume do revestimento (capacidade da fibra Kfs << Vs).

Conclusão

Vários paralelos podem ser traçados entre os desenvolvimentos e aplicações do SPME com métodos
eletroquímicos. A técnica coulométrica corresponde ao método de extração total. Embora essa técnica seja a
mais precisa, ela não é usada com frequência devido ao tempo necessário para concluí-la. O SPME é capaz de
produzir extração exaustiva quando o volume da fase de extração é grande o suficiente para combinar com
constantes de alta distribuição. Na geometria da fibra, o volume maior se traduz em revestimentos mais
espessos, o que resulta em longos tempos de extração. A abordagem alternativa é dispersar todo o volume da
fase de extração em uma área de superfície maior, resultando em um revestimento mais fino e em tempos de
equilíbrio mais rápidos. Por exemplo, o material de suporte sólido pode incluir material particulado, como
mecanismo de agitação, ou as paredes de um vaso (Figura 1). No entanto, nesse caso, haveria mais
manipulação necessária para introduzir convenientemente a fase de extração no sistema de introdução de
amostras (GC ou HPLC). Pode ser necessário o uso de um solvente orgânico para absorver os analitos da fase
de extração. Técnicas de métricas de íons potentes de equilíbrio são usadas com mais frequência (eletrodo de
pH), particularmente quando a amostra é uma mistura simples ou a seletividade da membrana é suficiente para
quantificar o analito alvo em matrizes complexas. O método SPME de equilíbrio tem algumas vantagens
nesse sentido, porque a técnica é normalmente acoplada aos métodos de separação ou detecção de MS ou
ambos, o que permite simultaneamente a identificação e quantificação de muitos componentes. A vantagem
do uso de métodos eletroquímicos é o tempo de resposta resultante das baixas capacidades dos eletrodos.
Vários métodos eletroquímicos (por exemplo, amparometria) são baseados no transporte de massa através das
"camadas limite", como SPME pré-equilíbrio. Da mesma forma, no SPME, a calibração com base nos
coeficientes de difusão pode ser realizada quando as condições de agitação são constantes, os tempos de
extração são curtos e o revestimento possui uma alta afinidade para os analitos. A Figura 21(¿) ilustra os
resultados relacionados aos tempos de extração de 10 s usando revestimento sólido. Em algumas
implementações da tecnologia, a taxa de transferência de massa para a fase de extração pode ser
propositalmente restringida, colocando-a na agulha, atingindo as medições de concentração de TWA em um
período de tempo específico.

As economias potenciais em tempo de análise, uso reduzido de solvente e a aparente simplicidade das técnicas
de SPME continuarão a atrair interesse entre os químicos analíticos em busca de métodos de análise
aprimorados. Enquanto os analistas tiverem uma boa compreensão da teoria e dos princípios por trás dessa
técnica, seguirão boa exatidão e precisão.