ROBERTO MARTINS FIGUEIREDO

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 Profa. Dra. Louise Helena de Freitas Ribeiro

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 Profa. Dra. Louise Helena de Freitas Ribeiro
PCR

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 PCR
Profa. Dra. Louise Helena de Freitas Ribeiro

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 Os testes permitem aos governos e profissionais da
saúde terem uma dimensão real da propagação do
vírus na sociedade, acompanhar as cadeias de
transmissão da doença, detectar pacientes
assintomáticos ou aqueles que em algum momento
tiveram a Covid-19 e
não descobriram, além
de identificar a
transmissão do vírus
por áreas geográficas
e faixas etárias, entre
outros parâmetros.

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 DESTAQUES:

– Siglas como PCR, qPCR, RT-PCR e similares estão presentes na

mídia, mas é importante saber o que elas significam;
– A técnica de PCR foi criada em 1983 e rendeu um prêmio Nobel
em 1993;
– Essas técnicas permitem a identificação de qualquer fragmento de
material genético escolhido, a partir da produção de grandes
volumes desse fragmento;
– A qPCR (do inglês Reverse Transcriptase Quantitative PCR)
permite a avaliação da quantidade de material genético sendo
produzida em tempo real, com o uso de sondas fluorescentes;
– A RT-PCR é utilizada quando o material de interesse é o RNA, e
não o DNA;
– Essas técnicas podem ser usadas para o diagnóstico preciso de
doenças como COVID-19.

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 DNA RNA

Proteína

cDNA (DNA
complementar

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Existem dois tipos principais de testes usados na
pandemia do novo coronavírus:
testes sorológicos rápidos – também chamados de
."testes rápidos" porque dão resultados em 20
minutos e servem como primeiro filtro de
detecção
.e testes moleculares, que levam cerca de duas
horas para o resultado.
 Quais são os tipos de testes disponíveis hoje para a Covid-19?

Existe o RT-PCR, ou teste molecular, que pesquisa a presença do Ácido

ribonucleico (RNA) viral, que é o material genético do vírus SARS-CoV-2 e que
dura cerca de duas horas para ser executados em estrutura de laboratório.
Também existem os testes sorológicos rápidos que pesquisam a presença de
anticorpos contra o vírus em 20 minutos em média e sem a necessidade de
estrutura de laboratório, e os testes Elisa e Clia que também avaliam a presença
de anticorpos, mas necessitam de uma estrutura de laboratório, e duram cerca
de quatro horas. No entanto, o processo de coleta, processamento e preparo das
amostras para o início dos testes no laboratório também consomem tempo que é
proporcional ao volume de amostras que a unidade de saúde recebe. Dessa
forma, ensaios de Elisa são normalmente liberados em 24 horas e RT-PCR no
mesmo dia quando a
rotina ainda não atingir
a capacidade instalada
do laboratório.

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 Sobre a detecção de anticorpos: a
sorologia no sangue tem melhor
capacidade de detectar os anticorpos para
Covid19 se comparada aos testes rápidos,
e isso tem a ver com várias questões
técnicas gerais, dentre elas a técnica de
mensuração utilizada: enzyme linked
immunosorbent assays (ELISAs)
ou chemiluminescent immunoassays
(CLIAs) são mais
usados na sorologia
(e têm melhor
acurácia).

TESTE
ROBERTO M. FIGUEIREDO – MICROBIOTÉCNICA – IG @drbacteriaoficial ELISA
 Note que com 5-7 dias de sintomas a taxa de resultados positivos é na melhor das
hipóteses em torno de 60%. A sensibilidade melhora por volta do 14o dia e fica de
fato boa por volta do 21o dia após início dos sintomas. Note também que a
detecção de IgM tem sempre sensibilidade inferior se comparada a detecção de
IgG.

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 O QUE É ELISA?
O ELISA - imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) é um teste sorológico imunoenzimático
cuja metodologia se baseia em reações antígeno-
anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas.

A técnica de CLIA – quimiluminescência

(chemiluminescent immunoassays) e ECLIA
(eletroquimiluminescência) são as mais sensíveis. Se
você puder checar se o teste a ser feito é por meio da
técnica de CLIA ou ECLIA, você vai ter um resultado
mais confiável.

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 A diferença chave entre CLIA e ECLIA é que CLIA
usa um método químico para gerar
quimioluminescência enquanto ECLIA usa um
método eletroquímico para gerar sinais de
quimioluminescência na técnica de imunoensaio.
Os imunoensaios são amplamente utilizados na
identificação e quantificação de proteínas
associadas a doenças ou infecções. Portanto, eles
se baseiam principalmente no conceito de ligação
anticorpo-antígeno. Existem muitos tipos de
imunoensaios, e os imunoensaios
quimioluminescentes são uma dessas técnicas de
desenvolvimento emergentes. Tanto o CLIA quanto
o ECLIA usam indicadores quimioluminescentes.

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 Foram avaliados os testes de IgM e de IgG baseados nos vários
testes serological, incluindo o ensaio Enzima-ligado da
imunoabsorção (ELISA), os Immunoassays da enzima da
quimioluminescência (CLIA), os Immunoassays da fluorescência
(FIA), e os Immunoassays laterais do fluxo (LFIA).

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 Existe algum tipo de fiscalização dos testes
disponíveis hoje?

Sim, todos os testes são

registrados na Anvisa e têm
que ser liberados previamente
para a comercialização e uso para diagnóstico. São
exigidos documentos da empresa, como Autorização de
Funcionamento de Empresa (AFE) e Certificação de Boas
Práticas de Fabricação (CBPF). Além disso, devem ser
apresentados documentos sobre o produto a ser
registrado, tais como ensaios clínicos, fluxo de
produção, estudo de estabilidade, segurança, qualidade
e eficácia. A Fiocruz realiza algumas dessas avaliações
no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde (INCQS).
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 Quando uma pessoa deve procurar fazer o teste?

Se estamos falando de teste molecular para detecção do vírus através de

amostras de secreção nasal ou da garganta do paciente, a partir do terceiro
até o sétimo dia de sintomas pode fazer o teste. Já existem evidências que
períodos anteriores e posteriores a esses, podem apresentar ainda resultados
positivos para a Covid-19, no entanto, aumenta bastante a chance de um teste
falso negativo, ou seja, a pessoa está infectada, mas não é detectado pelo
teste.
No caso dos testes para detecção de anticorpos, as informações são ainda mais
controversas, mas de maneira geral, acredita-se que após sete dias de
sintomas, inicia-se a detecção no sangue de anticorpos na fase aguda da
doença (IgM), indicando contato recente com o vírus. Após 11 dias de
sintomas, anticorpos associados à fase convalescente da doença (IgG)
começam a ser detectados no soro e permanecem por um período maior no
nosso organismo e indicam desenvolvimento de imunidade mas não garantem a
proteção. No entanto, essa dinâmica de geração de anticorpos ainda não está
totalmente confirmada, além que muitos fabricantes apresentam diferente
performance dos testes, tornando as interpretações e conclusões sobre a fase
da doença e certeza diagnóstica ainda mais complexas.

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 Quais são as diferenças entre os testes rápidos e os testes moleculares?

Os testes rápidos sorológicos, por imunoensaio enzimático (teste Elisa) e por

imunoensaio quimioluminescente (teste Clia) têm o objetivo de detectar
anticorpos específicos contra a Covid-19 que o nosso organismo produz em
resposta à infecção viral, visando controlar e eliminar tanto o vírus como
células infectadas. Esses testes são indicados a partir do sétimo dia de doença e
os resultados negativos não descartam o contato prévio com o vírus, que devem
ser repetidos após uma semana para confirmação.

Já o teste molecular detecta o material genético do vírus, que nesse caso é

uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) convertida a ácido
desoxirribonucleico (DNA) no laboratório, para facilitar o teste molecular por
reação em cadeia da polimerase (PCR). Esse teste molecular deve ser realizado
entre o terceiro e sétimo dia de sintomas para aumentar a chance de detecção
RNA viral e um teste negativo não descarta
a infecção, apenas indica que naquele
momento sua carga viral é indetectável.

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 O que buscam os testes?

No caso de testes moleculares, buscamos detectar o material genético do vírus

em uma sequência específica de uma das proteínas virais. Dessa forma, o PCR
tem o objetivo de escolher um "pedaço" dessa sequência e multiplicá-la no
laboratório até o momento que sua "visualização" é possível. Essa "visualização"
é feita através de equipamentos específicos que detectam um sinal luminoso
gerado a cada cópia do material genético do vírus durante o PCR. Quando essa
luz gerada ultrapassa um valor mínimo o teste é considerado positivo.
No caso dos testes sorológicos, desejamos detectar a presença de anticorpos
na fase aguda e na fase convalescente da doença (do tipo IgM e IgG) presentes
no sangue e que reconheçam apenas proteínas da Covid-19. O teste consiste
em deixar o soro em contato direto com essas proteínas por um tempo. Em
seguida, um segundo anticorpo reagente que reconhece IgM ou IgG é
adicionado, e mudará a coloração do ensaio indicando a presença deles.
Conforme a intensidade dessa coloração,
sabemos a proporção de anticorpos
presentes.

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 RESUMINDO
Para identificar as infecções causadas pelo novo
coronavírus, dois tipos de testes são mais usados: os que
identificam se o corpo já teve contato e produziu defesas
contra o vírus e o que determina se a pessoa está
infectada naquele
momento pelo
microrganismo.

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 Testes rápidos ou sorológicos

Os primeiros são os chamados testes rápidos, capazes de dar uma resposta

quase imediata se a pessoa já teve a doença. A partir da coleta de sangue,
que permitirá verificar a presença de anticorpos no soro ou no plasma do
paciente, esses exames podem apresentar o resultado em até 30 minutos.
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), é preciso, no
entanto, que o corpo tenha tido tempo de produzir as defesas contra o vírus
para que o exame dê um resultado positivo. O tempo estimado é de pelo
menos oito dias após o início dos sintomas para que seja possível indicar se
a pessoa teve contato com o vírus.
O resultado é dado por meio de uma substância reagente, que muda de cor
ao entrar em contato com as imunoglobulinas (anticorpos produzidos pelo
corpo contra infecções). Os testes rápidos para covid- 19 são os que
identificam as imunoglobulinas G e M (IgG/IgM). Caso a pessoa já tenha tido
contato com o vírus, ela pode ter imunidade temporária ou resistência à
doença.
Como são baseadas na resposta imunológica do paciente, que pode variar
de pessoa para pessoa, a Anvisa alerta que esses testes não confirmam de
forma definitiva se a pessoa tem ou não a doença. A principal função desses
exames é avaliar a disseminação do vírus em determinadas populações, de
forma a embasar ações de saúde pública.

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 Teste molecular
Os testes RT- PCR, por outro lado, identificam a presença de material
genético do vírus no corpo do paciente. A sigla em inglês significa: Reação em
Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa. De acordo com os critérios
da Organização Mundial da Saúde (OMS), são esses testes que determinam
de forma mais confiável se a pessoa tem ou não covid-19.
Para fazer o exame, são coletadas amostras de secreções do nariz ou da
garganta do paciente. Em geral, esses testes são feitos, sob prescrição
médica, quando a pessoa apresenta sintomas da doença. Ele não mostra se
a pessoa já teve a doença, como os sorológicos, mas se há vírus vivos no
corpo da pessoa naquele momento. Esse teste deve ser feito pouco tempo
depois de a pessoa apresentar os sintomas. Caso seja feito muito tempo
depois, em um estágio final da infecção, pode não haver mais traços
suficientes do vírus para um diagnóstico preciso.
Os resultados não são imediatos. Os laudos podem demorar alguns dias para
serem finalizados. O laboratório vai buscar fragmentos do material genético
do vírus (RNA) nas amostras colhidas do paciente. Caso esse material seja
encontrado, as moléculas serão analisadas para determinar se pertencem ou
não ao vírus causador da covid-19.

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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico laboratorial pode ser realizado tanto por testes de biologia

molecular, sorologia ou testes rápidos.

Biologia molecular: permite identificar a presença do material genético (RNA)

do material genético (RNA) do vírus SARS-CoV-2 em amostras de secreção
respiratória, por meio das metodologias de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR)
e amplificação isotérmica mediada por loop com transcriptase reversa (reverse
transcriptase loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP).

Sorologia: detecta anticorpos IgM, IgA e/ou IgG produzidos pela resposta
imunológica do indivíduo em relação ao vírus SARS-CoV-2, podendo
diagnosticar doença ativa ou pregressa. As principais metodologias são:
Ensaio Imunoenzimático (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – Elisa),
Imunoensaio por Quimioluminescência (Clia) e Imunoensaio por
Eletroquimioluminescência (Eclia).

Testes rápidos: Estão disponíveis dois tipos de testes rápidos, de antígeno e

de anticorpo, por meio da metodologia de imunocromatografia. O teste rápido
de antígeno detecta proteína do vírus em amostras coletadas de
naso/orofaringe, devendo ser realizado na infecção ativa (fase aguda) e o
teste rápido de anticorpos detecta IgM e IgG (fase convalescente), em
amostras de sangue total, soro ou plasma.
 O que é RT-LAMP?
Conheça a técnica RT-LAMP, uma modalidade de exames que está
revolucionando o diagnóstico molecular da COVID-19 por oferecer
resultados em até 60 minutos

O que é RT-LAMP e como funciona

LAMP é a sigla para amplificação isotérmica mediada por loop. Assim como a RT-PCR, o RT-LAMP
é um teste de amplificação de ácido nucleico, do inglês NAAT – Nucleic Acid Amplification Test.
Ambas as técnicas induzem reações para realização de transcrição reversa (RT) e uma fase de
amplificação.
No entanto, no RT-LAMP o processo é realizado em um ambiente isotérmico, sem as alterações na
temperatura normalmente exigidas para a PCR. O LAMP portanto realiza a amplificação do DNA em
uma única temperatura, utilizando uma enzima DNA polimerase com atividade de descolamento
de tira, e primers desenhados de modo a formar grampos na fita de DNA (loops). A vantagem
desta técnica reside no fato de que novos pontos de iniciação são criados para a amplificação
dentro dos grampos, o que aumenta exponencialmente o número de sítios de ligação da
polimerase e reduz o tempo da reação em relação à PCR.
Este sistema pode ser acoplado a um indicador de pH presente no mix de reação, o que permite a
leitura da reação de amplificação por mudança na cor da solução.

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 TIPOS DE TESTES LABORATORIAIS PARA VÍRUS RESPIRATÓRIOS
TESTE MOLECULAR: RT-PCR EM TEMPO REAL (RT-qPCR)

Desde o início da epidemia de covid-19, a OMS recomenda que o diagnóstico laboratorial seja
realizado utilizando testes moleculares, que visam a detecção do RNA do SARS-CoV-2 em
amostras do trato respiratório por RT-PCR em tempo real (reação em cadeia da polimerase em
tempo real precedida de transcrição reversa – RT-qPCR). Até o momento, este permanece sendo o
teste laboratorial de escolha para o diagnóstico da covid-19.
O Ministério da Saúde, seguindo as recomendações da OMS, implantou o diagnóstico molecular de
covid-19 no país, em 31 de janeiro de 2020.

Segundo a OMS, a detecção do vírus por RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase com
transcrição reversa em tempo real) permanece sendo o teste laboratorial de escolha para o
diagnóstico de pacientes sintomáticos na fase aguda. Esse exame permite identificar a presença do
vírus SARSCoV-2 em amostras coletadas da
nasofaringe até o 8º dia de início dos sintomas.
Em casos graves hospitalizados, a amostra pode
ser coletada até o 14º dia do início dos sintomas.

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