UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS E ZOOTECNIA 2019.1

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

E
TÉCNICA SEMEADURA DE ESGOTAMENTO

ARTUR PINHEIRO JÚNIOR, EMILLY BEATRIZ BRAZ DA PAIXAO,

MICAELLE DE MORAES MOREIRA, MONIQUE MARTIM DE OLIVEIRA
GARCIA, ROSANE PEREIRA DE SOUZA E YANDRA KARINA MACEDO
PITANGA

ITAPETINGA – BA

2021
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA-UESB

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS E ZOOTECNIA 2019.1

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

E
TÉCNICA SEMEADURA DE ESGOTAMENTO

TRABALHO APRESENTADO À
DOCENTE LÍGIA MIRANDA MENEZES
MINISTRANTE DA DISCIPLINA DE
MICROBIOLOGIA GERAL DA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO
SUDOESTE DA BAHIA – UESB COMO
REQUISITO AVALIATIVO DA 1ª
UNIDADE.

ITAPETINGA – BA

2021
SUMÁRIO

1. RESUMO 4
2. INTRODUÇÃO 5
3. OBJETIVOS 6
4. MATERIAL E MÉTODOS 6
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 8
6. CONCLUSÃO .......11
7. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................12
1. RESUMO

As bactérias são seres com diferentes morfologias que interagem entre si, e
com outros organismos, formando colônias ou não. Na microbiologia utiliza-se
da técnica de coloração de Gram desenvolvida por Christian Gram, em 1884-
com objetivo de diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas. No
presente relatório, com auxílio da técnica de semeadura por esgotamento para
obtenção de colônias puras isoladas em conjunto com a coloração de Gram,
pode-se observar que Gram positivas se coram do roxo ao violeta e Gram
negativas do vermelho ao rosa, evidenciando a eficiência desta técnica para
identificação e diferenciação destes dois grupos de bactérias.

Palavras chaves: Morfologia bacteriana. Coloração de Gram. Cultivo de

bactérias. Semeadura por esgotamento.
2. INTRODUÇÃO

Bactérias são seres vivos unicelulares classificados como procariontes

— do grego, pro (antes) e karyon (núcleo) — sua única célula é desprovida de
membrana nuclear, portanto o material genético das mesmas se encontra
disperso no citosol. De acordo com Madigan et al. (2016, p.2), “as células
microbianas são compartimentos vivos que interagem com o meio circundante
e com outras células de forma dinâmica”.
As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, o que permite a
diferenciação e reconhecimento de distintos grupos. Segundo Höfling e
Gonçalves (2008, p.29) estes microrganismos podem ser “[...] esféricos
(cocos), retangulares ou na forma de bastonetes (bacilos), encurvados
(espirilos), e na forma de vírgula (vibriões).”. Além dos formatos supracitados,
outros exemplos são as espiroquetas, as bactérias apendiculadas e as
bactérias filamentosas (MADIGAN et. al., 2016).
Após a divisão celular alguns destes seres se agrupam em diferentes
arranjos, por exemplo, bactérias do gênero Staphylococcus são cocos que
formam conjuntos semelhantes a um cacho de uvas — A S. aureus é uma das
bactérias da microbiota humana de maior interesse médico, estando
relacionada com diversas doenças infecciosas que acometem seres humanos
(SANTOS et al., 2007). No entanto, os arranjos não se restringem ao citado
previamente, as bactérias também podem se agrupar em formato de cadeia
(prefixo Strepto), em pares (prefixo diplo) ou em grupos de oito (sarcinas).
Outra maneira de diferenciar bactérias é através de técnicas de
coloração, pois a fresco estas são incolores o que dificulta a visualização de
determinadas estruturas. Uma das técnicas mais utilizadas na microbiologia
para diferenciação de bactérias é a coloração de Gram, desenvolvida pelo
bacteriologista Hans Christian Gram em 1884 (TORTORA; FUNKE; CASE
2017). Após serem submetidas a esta técnica, as bactérias Gram-positivas se
coram de roxo a violeta e as Gram-negativas se coram de vermelho a rosa, isto
se deve a composição da parede celular das mesmas. Bactérias Gram-
positivas possuem uma espessa camada de peptídeoglicano que permanece
corada de violeta durante todo o processo da coloração, em contrapartida as
Gram-negativas possuem uma fina camada que libera o complexo violeta-iodo

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após o tratamento com álcool (MADIGAN et al., 2016). Segundo Malinovski e
Estorillo (2021), os agentes causadores de infecções do trato urinário de seres
humanos são comumente bactérias Gram negativas, especialmente a
Escherichia coli (presente em 82,50% dos casos analisados).
Quando se deseja estudar colônias bacterianas puras, utiliza-se da
técnica de semeadura por esgotamento, cujos objetivos são evitar
contaminação da amostra por outros microrganismos e obtenção de colônias
isoladas. As colônias são semeadas em meio de cultura sólidas (esterilizado
em autoclave) com o auxilio de uma alça de platina estéril em movimentos de
ziguezague formando estrias, sendo que as estrias subseqüentes estão em
ângulo com a primeira. Meios de cultura solidificados com Agar imobilizam as
células microbianas permitindo que estas formem colônias isoladas (MADIGAN
et al. 2016).

3. OBJETIVOS

Semeadura por Esgotamento

Aprender as técnicas de semeadura por esgotamento, que consiste em
obter colônias bacterianas, possibilitando assim a cultura de apenas uma
colônia isolada.

Coloração de Gram
Aprender a técnica do esfregaço de bactérias, identificar e diferenciar
bactérias Gram positivas de Gram negativas permitindo a observação da
morfologia e arranjos.

4. MATERIAL E MÉTODOS

Materiais utilizados
 Bico de Bunsen;
 Alça de platina;
 Pinça de Madeira
 1 placa de Petri com colônia de bactérias Gram positivas;
 1 placa de Petri com colônia de bactérias Gram negativas;
 Lâminas;

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  Lamínulas;
 Corante Cristal Violeta;
 Iodo ou Lugol;
 Álcool etílico;
 Corante fucsina ou safranina;
 Água destilada.

Técnica do semeadura por esgotamento:

O primeiro passo para o método semeadura por esgotamento é esterelizar

a alça de platina, em seguida inserir uma colônia de bacterias retirada do
refrigeramento na placa de petri, esfregar a alça de platina em 3 pontos da
placa, de modo que em cada uma das passagens, esgote os microorganismos
presentes na alça e obtenha-se colônias isoladas para análise.
Para obter a coloração de Gram precisa-se de colônias isoladas e para
obtenção dessas colônias, utiliza-se a técnica de semeadura em placa por
esgotamento.

Técnica de coloração de Gram:

Sobre uma lâmina depositou-se uma gota de água destilada, esterilizou a

alça de platina e pegou-se uma colônia isolada que cresceu sobre a placa de
petri, após espalhou-se a colônia sobre a gota de água, diluindo colônia na
gota depositada na lâmina.
Em seguida, e utilizado a técnica de esfregaço que consiste em pegar a
própria alça de platina e espalhar a gota por toda a superfície da lâmina, é
essencial realizar esse processo próximo ao bico de Bunsen para evitar
contaminações externas, após colocou-se a lamínula e aguardou alguns
minutos para secagem, esse processo e necessário para a fixação do
esfregaço.
Após a secagem, passou-se a lâmina três vezes na chama do bico de
Bunsen para fixar as bactérias e melhorar a visualização, realizou-se a técnica
de coloração, onde se adicionou na lâmina o corante cristal violeta para corar

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ambas as bactérias (Gram positivas e Gram negativas), aguarda-se 1 minuto e
retira-se o excesso lavando suavemente.
O próximo passo é cobrir a lâmina com iodo ( O iodo junto com o cristal
violeta favorece a formação de cristais). Ápos 1, minuto retira-se o excesso do
iodo lavando suavemente e é adicionado o álcool etílico sobre as lâminas,
aguarda-se alguns segundos e retira-se o excesso delicadamente em água
corrente.Adiciona-se o ultimo corante fucsina lâmina para a retirada da
coloração das bactérias Gram negativas. Para finalizar aguarda-se 1 minuto e
retira-se o excesso, lavando a lâmina delicadamente e deixando secar no
ambiente para análise através da microscopia. Segue modelo das etapas na
figura 1.

Figura 1: Esquema de pigmentação bacteriana.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com lente de imersão do microscópio óptico, observam-se a coloração da

camada de peptidioglicanos em bactérias gram positivas e gram negativas e
perceber os diferentes tipos de arranjo e morfologia de bactérias e das
leveduras.

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 Figura 2: Bactéria Gram +, de morfologia cocos e arranjo estafilococos.

Figura 3: Bactéria Gram -, de morfologia bacilo e arranjo único ou isolado.

Figura 4: Bactéria Gram -, de morfologia espirilo e arranjo único ou isolado.

Figura 5: Bactéria Gram +, de morfologia bacilo e arranjo estreptobacilos.

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Figura 6: Bactérias Rizobium fixadoras de nitrogênio Gram -, de morfologia cocos e
arranjo único ou isolado.

Figura 7: Leveduras Gram +, morfologia unicelular

Foi iniciada a técnica de coloração de gram, a combinação entre o corante

primário (cristal violeta) de cor roxa e o corante secundário (iodo) adicionado à
lâmina promove a formação de cristais.
A bactéria Gram positiva apresenta uma grande camada de peptídeoglicano
em sua parede celular, formado vários cristais. Já a bactéria Gram negativo,
possui uma fina camada de peptídeoglicano, formando poucos cristais.
Após a formação dos cristais, cada bactéria de Gram em seu teor, sofrerá
ação de outro corante, iodo, que tem como função pigmentar de vermelho a
camada de peptídioglicano que foi menos cristalizada na reação anterior. Isso
significa que as bactérias Gram negativa irão se corar de vermelho por causa
da pouca formação de cristais e a Gram positiva não serão alterada e
permaneceram roxa do começo ao fim do processo de pigmentação.
O álcool tem a função de extrair à coloração da camada de peptidioglicano
que apresentam cristais pouco aderidos. Nas células gram positivas continua o
corante cristal violeta, pois o álcool tornou a membrana impermeável ao cristal,
fazendo com que fique retido na célula. Por outro lado o álcool nas células
gram negativa faz com que o cristal violeta e o iodo difundiam- se com o meio

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externo, se tornando incolor. Com isso, é possível diferenciar as bactérias gram
positivas de gram negativas.
Para concluir o corante fucsina, permite analisar que bactérias gram
negativas, através da dissolução dos lipídeos que têm a permeabilidade da
parede celular aumentada, evitando que o corante seja retido. Tanto a
presença do cristal - iodo, quanto à parede celular das células gram positiva
impediram a fucsina adentrarem essas células. Na bactéria Gram positiva, foi
possível observar sua estrutura na forma de cocos e seu arranjo estafilococos,
morfologia bacilo e arranjo estreptobacilos como mostra as figuras 2 e 5. As
grans negativas, apresentada na figura 3 e caracterizada pela morfologia bacilo
e o arranjo único ou isolado e na figura 4 a morfologia espirilo e arranjo único
ou isolado.
As demais estruturas também puderam ser observadas e apresentadas
conforme as figuras 6 (Bactérias Rizobium fixadoras de nitrogênio Gram
negativas, de morfologia cocos e arranjo único ou isolado) e 7 (Leveduras
Gram positivas, morfologia unicelular).
De acordo Moreira (2015), que demonstra a técnica de coloração de Gram
para corar as bactérias e realizar a visualização das características das cores
das bactérias Gram negativas que foi rosada e das Gram positivas que são
violetas. Sendo assim podemos observar que os resultados obtidos através da
prática realizada no laboratório de microbiologia são iguais a literatura citada.

6. CONCLUSÃO

Conforme as análises feitas por meio dos caracteres das bactérias,

verificamos e diferenciamos as classificações das bactérias em relação a sua
composição e propriedades. Os resultados feitos por experimentos revelaram-
se uma confirmação com o objetivo exposto. Pelas particularidades de cada
microrganismo, adquirimos o conhecimento de identificar as leveduras, fungos
que são consumidos no processo de fermentação alimentício e, as bactérias
fixadoras de nitrogênio.

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7. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS

HOFLING, J. F.; GONÇALVES, R. B. Microscopia de luz em microbiologia:

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Disponível em: https://books.google.com.br/books?hl=pt-
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%C3%A9rias&ots=D36fNAXp5O&sig=6MX-
wF19WzEcKOzgsgsz_BwevTM#v=onepage&q=morfologia%20das%20bact
%C3%A9rias&f=false acesso em: 07 de ago de 2021.

MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14ª ed. Porto Alegre: Artmed,

2016. 960 p. Disponível em: https://drive.google.com/file/d/1GRJFY6hBbiS-
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MALINOVSKI, E.; ESTERILLO, A. L. A. Bactérias mais frequentes em

infecções do trato urinário. Revista Saúde e Meio Ambiente – RESMA, Três
Lagoas, v. 12, n. 1, p.121-134, janeiro/julho. 2021. Disponível em:
https://periodicos.ufms.br/index.php/sameamb/article/view/12241/8892 acesso
em: 07 de ago de 2021.

Moreira, J. L. B., Carvalho, C. B. M. D., & Frota, C. C. (2015). Visualização

bacteriana e colorações. Disponível em:
http://repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/16672/1/2015_liv_jlbmoreira.pdf acesso
em: 07 de ago de 2021.

SANTOS, A. L. et al. Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de

importância hospitalar. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial
[online]. 2007, v.43, n.6, p. 413-423. Epub 06 de mar de 2008. Disponível em:
https://www.scielo.br/j/jbpml/a/gHvPXyhgbzWt69YKxGqPFHk/?lang=pt# acesso
em: 07 de ago de 2021.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12ª ed. Porto

Alegre: ARTMED, 2017. Disponível em:
https://drive.google.com/file/d/1XDaSn0pEHGUesj47E5l5pgGIzxELJLpQ/view
acesso em: 08 de ago de 2021.

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