FICHAMENTO

p53 aggregates penetrate cells and induce the co-aggregation of intracellular

p53

Introdução
- A proteína Prion possui diversas características, como a agregação espontânea,
transmissão da conformação para outras proteínas nativas e transmissão de um
indivíduo para outro.
- Algumas proteínas associadas a essas doenças conformacionais são parte de uma nova
categoria de proteínas, chamada príonóides: proteínas que compartilham algumas, mas
não todas as características associadas a príons, como recrutamento molecular, indução
de proteínas mal enoveladas e transmissão intercelular.
- p53 como uma proteína prionóide: 1) a p53 possui estabilidade estrutural limitada
devido à natureza desestruturada do seu domínio N-terminal; 2) Domínios da p53 como
o de transativação (aminoácidos de 1-92), central (93-312) e o de tetramerização (313-
393) podem apresentar mal enovelamento e formar agregados in vitro, sob determinadas
condições desnaturantes; 3) A baixa estabilidade termodinâmica do domínio central,
alvo de mais de 90% de mutações que inativam a p53 no câncer.
- Muitas patologias humanas degenerativas e não-degenerativas estão relacionadas com
a agregação de proteínas: esses distúrbios constituem uma família de doenças tratadas
como conformacionais. Nessas doenças, agregados insolúveis de proteínas acumulam
dentro e fora das células.
Materiais e Métodos
o Clone da p53GFP, p53 e p53C
o Purificação, agregação e marcação de p53 e p53C: Após a purificação, a
agregação foi induzida a 42°C por 24h. A p53 e p53C foi marcada com Dylight
650.
o Western Blot
o Caracterização in vitro dos agregados de p53: ligação ao ANS (1-anilino-8-
naftalenossulfonato)
o Cultura de células: células de adenocarcinoma humano (HeLa) e células de
fibroblasto de rato (NIH3T3)
o Captação de agregados de p53 extracelulares e microscopia confocal: Células
de HeLa e NIH3T3 foram plaqueadas em placas de 24 poços. Após 24h, as
células foram expostas a 1uM de agregados de p53 marcados com DyLight 650
com ou sem Dextran-488 ON e, então, lavados com Tripsina/EDTA durante 90s
para remoção do excesso de agregados. Então, as células foram fixadas com
formol em PBS. Em seguida, as células foram incubadas por 5min com Hoechst
(marcação do núcleo).
Para analisar a entrada de agregados dependente do tempo, células HeLa foram
plaqueadas em uma placa de 6 poços e os agregados de p53 marcados com
DyLight foram adicionados por 15, 6, 3 ou 1h antes da tripsinização e para cada
ponto do tempo as células foram analisadas por citometria de fluxo.
 o De novo e co-agregação de p53 celular com agregados de p53 recombinante:
Células NIH3T3 foram plaqueadas em uma placa de 24 poços. A transfecção do
constructo p53GFP ou pEGFPN1 (vetor vazio) foi realizada. Depois de 24h, as
células foram expostas a 1uM de agregados de p53 recombinante por 24h e
então, fixadas com paraformaldeído. As células foram então lavadas em PBS e
incubadas por 5min com Hoechst (marcador do núcleo).
Para os experimentos de co-agregação, células HeLa foram plaqueadas em placa
de 24 poços e expostas a 1uM de agregados de p53 recombinante marcados por
DyLight por 24h, tratadas com tripsina/EDTA e re-plaqueadas em lâminas.
Após ON, as células foram tratadas com etoposídeo (inibidor da topoisomerase)
por 2h. Ao fim, as células foram incubadas com Hoechst por 5min.
o Perturbação da endocitose: Células HeLa foram plaqueadas em placas de 6
poços e incubadas com inibidores como genisteína, cloridrato de clorpromazina,
EIPA, citocalasina, MBCD ou veículo em combinação com 1uM de agregados
de p53 marcados com DyLight por 3h. As células foram tripsinizadas e
analisadas por citometria de fluxo. O efeito do mutante dominante negativo
(DN) foi determinado pela transfecção de células HeLa com dinamina K44A
DN 24h antes da exposição aos agregados de p53 marcados.
Resultados
Agregados de p53 WT in vitro
- A proteína p53 WT humana foi expressa em bactéria, purificada e analisada por SDS-
PAGE e Western Blot (FIGURA 1A).
- A agregação foi induzida a 42°C e os agregados formados foram caracterizados por
sua habilidade de ligar a ANS, uma sonda molecular fluorescente usada para determinar
mudanças conformacionais através da exposição de regiões hidrofóbicas da proteína.
Um aumento na intensidade de fluorescência (FIGURA1B) indica ligação do corante às
regiões hidrofóbicas dos agregados.
- A observação dos agregados por microscopia eletrônica revela a natureza amorfa
(FIGURA 1C).
Agregados de p53 entram em células HeLa e NIH3T3
- Assim como outros agregados de outras proteínas, foi investigada a capacidade dos
agregados de entrarem nas células. As células HeLa incubadas com agregados de p53
marcados por diferentes períodos foram tratados com tripsina/EDTA e um ensaio de
FACS foi realizado.
- Na FIGURA 2A, a análise de SDS-PAGE e Western Blot serviram para garantir que
não houvesse agregados no meio extracelular e que, os eventuais agregados que
aparecessem fossem aqueles internalizados.
- Na FIGURA 2B, os agregados de p53 entram nas células HeLa em uma função
dependente do tempo, com a maioria das células internalizadas após 15h.
Agregados de p53 entram em células HeLa via macropinocitose
- Em seguida, foi investigado o mecanismo pelo qual os agregados adentram as células
adicionando Dextran-488 (marcador de endocitose de fase fluida) no meio de cultura ao
longo dos agregados de p53 marcados com DyLight.
- As células foram pré-incubadas com os agregados de p53 por 24h e visualizadas por
microscopia confocal. O experimento revelou uma co-localização parcial do dextran-
488 com os agregados (FIGURA 3A), o que indica que os agregados de p53 podem
entrar na célula via endocitose. Tomando esse dado como referência, foram utilizados
vários inibidores de diferentes vias de endocitose a fim de apontar quais deles
contribuem para a internalização dos agregados.
- Usando citometria de fluxo, foi observado que a clorpromazina não afeta a
internalização dos agregados de p53 marcados (como a função é inibir a endocitose, se
existe um aumento em relação ao controle no que se refere à captação dos agregados de
p53, então esse inibidor não afeta o processo de internalização). Por outro lado, a
exposição das células a EIPA (inibidor de bomba de sódio e potássio) diminui a entrada
de agregados de p53 nas células (FIGURA 3B)
Agregados de p53 recombinante podem induzir agregação da p53 solúvel
- Foi investigado se os agregados de p53 seriam capazes de induzir a agregação da p53
solúvel, assim como acontece com a PrPC induzida pela PrPsc. A agregação de p53GFP
foi observada após a incubação de células NIH3T3 com agregados de p53. Conforme
observado, a agregação é mais frequente em células incubadas com os agregados do que
as que não foram tratadas (FIGURA 4A).
- Para mostrar que os agregados formados eram de p53 (formados somente se a célula
for incubada com a mesma proteína) e não qualquer agregado, algumas células foram
incubadas com oligômeros de AB. Os resultados sugerem que apenas agregados
extracelulares de p53 podem induzir o mau enovelamento e a agregação de p53GFP
solúvel (FIGURA 4B).
- Para mostrar que existe um contato direto entre os agregados de p53 recombinante e a
p53GFP intracelular, foi induzida a expressão da p53 solúvel endógena em células
HeLa usando um etoposídeo (inibidor de topoisomerase – as células tumorais têm alto
índice de divisão, proliferação, replicação. A topoisomerase auxilia na divisão celular
“desenrolando” o DNA para que ele seja duplicado. Portanto, o inibidor bloqueia esse
processo, comprometendo as células em proliferação). As células foram tratadas com o
inibidor por 2h e a incubação ON das células com agregados de p53 marcados com
DyLight (FIGURA 4C).
- As células NIH3T3 foram incubadas com 1uM de agregados de p53C conjugados
marcados por 24h, tratados com tripsina/EDTA e re-plaqueadas para serem incubadas
com o inibidor 2h antes da visualização (FIGURA 4D).
Discussão
- Característica prionóides: agregação proteica, internalização de agregados nas células,
co-agregação com a proteína endógena correspondente e transferência de agregados
célula-célula.