FICHAMENTO

Tumor suppressor protein p53 expressed in yeast can remain diffuse, form a
prion, or form unstable liquid-like droplets

Introdução
- Inativação da p53 leva à formação de tumor que pode ser causada não somente pela
mutação na p53 mas também quando forma inclusões pontilhadas (encontradas em
células tumorais).
- A formação de príon necessita que os agregados recém-formados se propaguem e
sejam capazes de infectar outras células. Uma vez formado, agregados prionóides
aumentam em número quando seus fragmentos criam e atraem conformações solúveis
da proteína que rapidamente se transformam em espécies com conformação prionóide.
- Príons foram encontrados em leveduras, onde controlam características endógenas.
Essas proteínas de levedura podem perder ou alterar sua função quando mudam para
uma conformação amilóide agregada.
- Embora a levedura não tenha p53 endógena, foi observado que um alto nível de
expressão de p53 WT reduz o crescimento de algumas cepas sob determinadas
condições. Como os mutantes de p53 com perda de função não tiveram esse efeito, foi
sugerido que a inibição do crescimento é causada pela transcrição aberrante do p53
funcional de genes de levedura endógenos. Assim, concluímos que a inativação de p53
pela formação de príons pode reduzir sua capacidade de inibir o crescimento.
- Assim, a superexpressão transitória de p53 mutante ou de tipo selvagem pode
aumentar a probabilidade de formação e inativação de príon p53 de novo, levando a
uma reação em cadeia de agregação de p53 e replicação de agregados. Isso poderia
explicar por que o p53 de tipo selvagem inativo é encontrado no citoplasma de alguns
tumores e porque as células de melanoma que expressam níveis elevados de p53 de tipo
selvagem estão frequentemente associadas ao p53 inativo.
- O p53 também pode formar gotículas como líquido in vitro. Essas gotículas parecem
se formar por separação de fase líquido-líquido (LLPS). Ao contrário dos agregados
príon amilóide, as gotículas líquidas não são estáveis. Eles costumam aparecer e
desaparecer na célula em resposta a gatilhos de estresse específicos de proteínas.
Embora a relação entre gotículas líquidas e agregados amilóides seja desconhecida, foi
sugerido que a concentração temporária de uma proteína com um domínio não
estruturado em uma gotícula líquida pode aumentar sua chance de formar um agregado
semelhante a um príon mais estável.
Objetivo: O objetivo deste trabalho foi determinar se a p53 pode formar esse príon e,
mais importante, se isso está associado à perda da função do p53, o que provavelmente
causaria câncer.

Materiais e Métodos
Cepas de levedura, plasmídeos e cultivo
- Os procedimentos de meio, cultivo e transformação eram padrão. Leveduras com
mutações ade2 foram mantidas em meio complexo de glicose (YPD) suplementado com
adenina (200 µg / ml) para prevenir o aparecimento de supressores ade2. Meio sintético
de glicose (SD) foi suplementado com os aminoácidos necessários.
- A cepa de levedura usada para testar a atividade de p53 e na qual selecionamos o príon
p53 foi yIG397 com o plasmídeo integrado pLS210 que contém uma expressão do gene
repórter ADE2 de ADE2 foi usado para testar a função de p53 em yIG397, L3671,
L3672 e L3628.
(yIG397 expressando p53 de tipo selvagem = colônias brancas; sem o p53 funcional =
vermelho e com a função p53 limitada = rosa).
- A cepa de controle sem prion, L3671, foi co-transformada com yIG397 com pADH1-
p53 e pGAL1-p53-EYFP. A cepa de príon induzida em L3671 é L3672.

Seleção para p53 prionóide

Após um crescimento robusto de L3671, estes foram revestidos em placas seletivas de

plasmídeo de glicose e galactose, as quais, respectivamente expressam ou não p53-
EYFP. Após 5 dias de incubação a 30 ° C, cada uma dessas placas foi replicada em
meio de adenina seletivo de plasmídeo de glicose para encerrar a superexpressão
transitória de p53-EYFP causada por crescimento anterior em galactose. As placas
foram cultivadas por 3 dias a 30C. Eles foram então transferidos para a temperatura
ambiente por 3 semanas para crescimento adicional e para permitir o desenvolvimento
do diagnóstico de cor vermelha / rosa para células com expressão reduzida de ADE2
esperada de cepas com príon p53.

Indução e Remoção de Estresse

As células transformadas com pGPD-p53-EYFP (p2517) ou pGAL-p53-R175H-EYFP

(p2518) foram cultivadas para a fase exponencial em meio seletivo de plasmídeo. Para
estresse de etanol, as células foram lavadas duas vezes com água deionizada,
ressuspensas e incubadas com agitação por 30 min em meio seletivo de etanol a 2% de
plasmídeo e ressuspensas em meio de glicose seletivo de plasmídeo para remoção de
estresse. Para o estresse por calor, as células cultivadas em meio de glicose seletivo de
plasmídeo foram incubadas por 10 min em banho-maria a 46˚C antes de serem
retornadas a 30˚C. Para privação de glicose, as células foram lavadas duas vezes com
água deionizada, ressuspensas em meio sintético sem qualquer fonte de carbono e
incubadas por 20 min com agitação. Para remover o estresse de privação de glicose, as
células foram colhidas, ressuspensas em meio seletivo de glicose de plasmídeo e
incubadas por 20 min com agitação.
Análise de Sedimentação e Immuno-blotting

Células L3671 (controle sem prion) e L3672 (prion) cultivadas em meio seletivo de
plasmídeo de dextrose ou galactose foram colhidas e lisadas. Para comparar os níveis de
proteínas no sobrenadante vs. sedimento, lisados de células normalizadas (150 μl de 100
µg de proteína / ml) foram centrifugados e o sobrenadante foi removido e salvo, os
pellets foram lavados com tampão lisado contendo um coquetel de inibidor de protease
e inibidor de protease PMSF, recentrifugado a 80.000 rpm por 10 min e ressuspenso em
150 μl de tampão lisado com inibidores de protease. Proteínas fervidas em volumes
iguais totais (T), frações sobrenadantes (S) e pellet (P) foram resolvidas por PAGE que
foi imunotransferido com anti p53.

Microscopia de fluorescência, coloração com tioflavina T, coloração com DAPI e

tratamento com 1,6-hexanodiol

Para ver agregados de p53 marcados com EYFP em subclones de príons de p53,
citodutantes ou transfectantes, examinamos células retiradas de placas após 5 dias de
crescimento a 30oC em meio de galactose seletivo de plasmídeo (para subclones de
príon com GAL1-p53-EYFP) ou crescimento de 3 dias em seletivo de plasmídeo meio
de glicose (para transfectantes e citodutantes com GPD1-p53-EYFP).
- Visualização de p53 citoplasmática marcado com EYFP ou corado com ThT foi feita
com um microscópio fluorescente equipado com cubos de filtro FITC, YFP, mCH e
CFP. p53-EYFP foi visualizado no canal YFP, e ThT foi visualizado no canal CFP.
- Para visualizar os núcleos, as células foram coradas com 1 µg / ml 40,60-diamidino-2-
fenilindol (DAPI) em 1XPBS por 10 min após a fixação por 1 h com paraformaldeído a
4% e permeabilizadas por 30 min com EtOH a 60%. Para determinar se os focos de p53
nas células tinham a propriedade de ser dissolvido pelo álcool alifático, 1,6-hexanodiol
mostrou se dissolver conjuntos de tipo líquido sobre sólido.
Citodução
[RHO +] cepa de príon p53 L3672 ou [RHO +] controle isogênico não-prion L3671,
respectivamente contendo ou não contendo agregados de prion p53, foram acasalados
com o receptor, L3663 transformado com pGPD-p53-EYFP (CEN, HIS3) ou pGPD-
p53- R175H-EYFP (CEN, HIS3) por cerca de 8 horas até que os zigotos fossem
visíveis. As misturas de acasalamento foram então espalhadas em meio sintético de
glicose sem histidina (SD-His) para selecionar colônias únicas, que foram então
corrigidas em uma placa mestre (SD-His) e replicadas em YPGly (meio completo com
2% de glicerol como única fonte de carbono), meio aonde os receptores que foram
citoduzidos para se tornar [RHO +], ao ganhar o citoplasma do doador, podem crescer.
As colônias colhidas em meio seletivo de glicose de plasmídeo e confirmadas como
MATa Ura-Leu-His + foram classificadas como citodutantes e examinadas sob um
microscópio fluorescente para avaliar a presença ou ausência de focos EYFP.

Polimerização in vitro do peptídeo P8

O peptídeo derivado de p53 propenso à agregação, p8 (NH2-PILTIITL-COOH) foi

dissolvido em 0,5 ml de 5,0% de D-manitol e 0,01% de azida de sódio (pH 5,5) a uma
concentração de 1 mM. O peptídeo foi polimerizado à temperatura ambiente com
agitação moderada por 8 horas e a polimerização foi confirmada com um ensaio de
ligação ThT: 2 µl de 1 mM de P8 foram misturados com 2 µl de ThT 1 mM em Tris-
HCl (pH 8,0) e o volume foi ajustado com 5% de D-manitol e 0,01% de azida de sódio
(pH5,5) para dar uma concentração final de peptídeo de 50 μM antes de medir a
fluorescência com um espectrofluorômetro.
Preparação de esferoplastos de levedura para transfecção com lisados celulares ou
polímero P8

A transfecção foi conforme descrito anteriormente. O lisado celular bruto de células

príon (L3672) ou não-príon (L3671) p53, ou polímero P8 feito in vitro, foram co-
transformadas juntamente com pGPD-p53-EYFP (HIS3, CEN), em um receptor sem
p53 (L3628 ) Células p53 príon e não príon foram cultivadas em meio seletivo de
glicose de plasmídeo (SD-Leu-Trp) por 2 dias a 30oC. As células colhidas foram então
ressuspensas em tampão STC (sorbitol 1M, CaCl2 10 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5)
incluindo PMSF 10 mM e um coquetel anti-protease para levedura e lisadas por vórtice
com grânulos de vidro. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação 2X a 4
° C durante 5 min a 8.000 g. Os lisados livres de células ou polímero de P8 foram
sonicados (saída 4) por 30 segundos 3X usando uma micro ponta. Esferoplastos frescos
da cepa receptora L3628 foram obtidos usando liticase e mantidos em tampão STC a 4 °
C e foram misturados com lisados sonicados ou polímero de P8 juntamente com pGPD-
p53-EYFP (HIS3, CEN) (20 µg / ml) e esperma de salmão DNA (100 µg / ml). Após
choque térmico na presença de PEG 3350 a 25%, os esferoplastos foram incubados em
SOS (sorbitol 1M, YPD 0,3, CaCl2 10 mM) a 30oC e adicionados a SD-His com meio
de ágar adenina limitante suplementado com sorbitol 1M. Este foi então sobreposto em
placas SD-His e incubado a 30oC para selecionar transfectantes. Os transfectantes
confirmados como sendo His +, Lys-, Leu- e Trp-, que, portanto, continham o pGPD-
p53-EYFP sem plasmídeos do dador, foram ensaiados quanto à presença de focos p53-
EYFP.

Resultados
Estabelecimento de uma cepa de levedura com focos citoplasmáticos de p53 estáveis

ADE2: fosforibosilaminoimidazol carboxilase é uma enzima envolvida na biossíntese

de nucleotídeos - diagnóstico para atividade de p53 funcional (Quando esta proteína está
na forma “wild-type”, as células expressam ADE2, assim produzindo adenina,
crescendo normalmente em meio de cultivo ausente em adenina. Porém, células
contendo p53 mutante falham para expressar ADE2 e, consequentemente não
conseguem crescer em meio sem adenina)

- L3671 (cepa de controle sem prion) mostrou os fenótipos de repórter ADE2 esperados
para p53 WT funcional: as células eram brancas, indicativas de expressão total de
ADE2 resultante da atividade de p53. Esperamos que as células com uma forma de
príon de p53 tenham a função de p53 reduzida devido à agregação, resultando na
redução da expressão de ADE2 levando a um crescimento reduzido e uma cor vermelha
ou rosa em meio limitante de adenina (Figura 1A)
- Algumas pequenas colônias vermelho-escuras foram vistas se as células foram
previamente cultivadas em glicose ou galactose. Essas colônias eram todas [rho-: sem
DNA mitocondrial], que freqüentemente surgem em culturas de leveduras devido à
perda de mitocôndrias funcionais. No entanto, nas placas que foram copiadas de
galactose, mas não de glicose, também havia colônias rosas maiores. As células de 25
dessas colônias foram corrigidas e plaqueadas para replicação em meio de glicose
juntamente com o controle sem príon L3671 que nunca havia sido cultivado em
galactose. Os candidatos a príon p53 têm atividade de p53 reduzida. As células
mostradas estão em meio de glicose seletivo para plasmídeo, limitante de adenina.
(Figura 1B).
- Para determinar se a presença elevada de pontos citoplasmáticos era estável,
subclonamos sequencialmente e corrigimos repetidamente um desses isolados (# 7,
denominado subclone de príon L3672) em meio de glicose seletivo de plasmídeo por
mais de 100 gerações e eles permaneceram rosa, indicativo de retenção de príon
(Figura 1C). Além disso, mesmo na presença de adenina, os subclones do príon
cresceram mais lentamente do que o controle sem príon (Figura 1C)
- O p53 sedimenta mais em lisados de candidatos a príon do que em controles sem
príon. Células de controle não-prion (L3671) e prion (L3672) cultivadas em glicose
seletiva para plasmídeo ou meio de galactose foram lisadas. Os lisados totais (T) foram
separados em Sobrenadante (S) e Pellet (P) por centrifugação. As amostras foram
executadas em SDS-PAGE e os géis foram imunotransferidos com anti-p53, removidos
e reexaminados com anti-PGK para um controle de carregamento. A detecção de
monômero p53-EYFP (~ 70 kD) ou dímero e PGK (44,7 kD) no western blot foi
baseada na migração da proteína (FIGURA 1D)
- Em seguida, cultivamos o L3671 branco (controle sem príon) e L3672 rosa (subclones
de príon) em meio de galactose para induzir p53-EYFP e descobrimos que <1% das
células de controle sem príon tinham pontos citoplasmáticos e > 99% tinham nuclear,
geralmente difusos, p53-EYFP, excluindo células mortas, células que não tinham
fluorescência e células que só tinham fluorescência no vacúolo. Em contraste, cerca de
30% -50% das células nos subclones do príon tinham pontos citoplasmáticos e apenas
cerca de 70% -50% tinham p53-EYFP nuclear (Figura 1E)
- A Figura 1F mostra que os focos citoplasmáticos de p53-EYFP presentes em L3672
são corados por ThT. Isso não é causado por sangramento do p53-EYFP, porque na
ausência de ThT nenhuma fluorescência CFP é visível. Esta coloração sugere que os
agregados citoplasmáticos p53-EYFP são semelhantes a amilóide, uma característica de
muitos príons. Além disso, quando os subclones de príon, que mostraram agregados
fluorescentes de p53-EYFP na galactose, foram transferidos para glicose onde apenas o
p53 não marcado é expresso, a coloração de ThT ainda revelou a presença de focos
citoplasmáticos semelhantes a amiloide. Isso sugere que os agregados de p53-EYFP
eram príons que semearam o p53 não marcado para também formar agregados de príons
semelhantes a amilóide. (FIGURA 1F)

Agregados citoplasmáticos de p53 de tipo selvagem podem ser transferidos por

citodução para p53 de tipo selvagem e mutante R175H

- Antes da citodução, a fluorescência nessas células receptoras era amplamente difusa

nos núcleos, mas pontos citoplasmáticos ocasionais foram vistos com mais frequência
em células p53-R175H-EYFP versus células p53-EYFP.
CITODUÇÃO: transferência do material citoplasmático durante a reprodução das
células; citodutante – célula formada por citodução
- Em seguida, examinamos a fluorescência EYFP em citodutantes (Figura 2B).
A capacidade de citoduzir características indica que elas não são dependentes de genes
nucleares e, portanto, são diagnósticas para príons citoplasmáticos. Assim, a descoberta
de citodução bem-sucedida de agregados estáveis de p53-EYFP apóia fortemente a ideia
de que eles são príons. Além disso, os dados mostram que os príons p53 de tipo
selvagem podem induzir proteínas p53-R175H mutantes a formar um príon como
eficientemente, pois induz o p53 de tipo selvagem a formar um prion.
- células não priônicas com o mutante p53-R175H contêm mais focos citoplasmáticos
do que células com p53 de tipo selvagem. Tomados em conjunto, os resultados mostram
que a maioria das células nas culturas de citodutores de tipo selvagem ou mutantes com
focos contêm o príon, embora vejamos apenas agregados, respectivamente, em 30% e
40% das células do tipo selvagem e mutantes.

O p53-EYFP não agregado em células receptoras torna-se agregado quando transfectado

com lisados de cepas com agregados de p53 hereditários ou com o peptídeo de proteína
semelhante a amiloide p53
- O lisado celular de levedura de prião p53, ou polímero P8 feito in vitro, promove o
aparecimento de focos citoplasmáticos de p53 em transfectantes. Lisados de células
purificadas de príon p53 (L3672) ou células não príon de controle (L3671) ou polímero
P8 do peptídeo p53 ou controle vazio foram co-transformados com pGPD-p53-EYFP
em cepas repórter ADE2 p53 L3628 ou L3719 sem p53. A transfecção bem-sucedida foi
avaliada pelo aparecimento de focos fluorescentes citoplasmáticos. A retenção de focos
foi pontuada após
> 100 gerações. (FIGURA 3)
- Assim, a semente amilóide feita de um peptídeo p53 é suficiente para induzir a
agregação p53-EYFP in vivo. A indução da agregação hereditária de p53-EYFP por
transformação com um agregado de peptídeo p53 é uma forte evidência de herança de
príon.
- Para averiguar se os transfectantes seriam capazes de manter as características
prionoides, foram propagados três transfectantes de L3719 obtidos de lisados príon ou
não-prions e três obtidos do polímero P8 ou somente plasmídeo por > gerações.
- Ao contrário da transfecção com os lisados contendo agregados de uma única variante
do príon hereditário, a transfecção com o polímero P8 estaria induzindo a formação de
novo de diferentes tipos (variantes) de agregados do tipo príon, e estes são
frequentemente instáveis
A interrupção transitória da expressão de p53 causa perda do príon p53
- Transmissão prionóide requer a continuidade da semeadura de espécies prionóides.
Então, um teste para príon está relacionado à inibição da expressão da proteína príon,
que causa perda de todas as sementes impede a replantação da proteína príon quando ela
é reexpressa.
- Realizando esse teste para o príon p53, nós cultivamos o príon contendo o isolado
L3672 e seu controle isogênico não príon L3671, ambos carregando pADH p53 (LEU2)
e pGAL-p53-EYFP (TRP1), em meio de glicose não seletivo para plasmídeo por muitas
gerações. Em seguida, plaqueamos para células individuais e obtivemos cinco colônias
de L3672 que perderam pADH-p53 (eram Leu), mas retiveram pGAL-p53-EYFP (eram
Trp +). Estas células não expressaram p53 quando cultivadas em glicose. Quando
retornou à galactose, todos eles falharam em formar focos fluorescentes, indicando que
o p53-EYFP não foi semeado para formar um príon (Figura 4A).
- Assim, como esperado para um príon, a interrupção transitória da expressão de p53
pela perda do plasmídeo pADH-p53 em uma cepa de príon e seu crescimento em
glicose onde pGAL p53-EYFP não poderia expressar p53-YFP, causou perda
permanente do príon quando células foram devolvidas para galactose onde p53-EYFP
foi expresso.

OBS.: como a célula não expressa p53, a troca de galactose para glicose e depois
retorno para galactose é justamente para garantir que não havia p53 agregada de forma
alguma.
p53 forma focos citoplasmáticos reversíveis que não se coram com ThT em resposta a
vários estresses

- As células yLG397 foram transformadas com pGPD-p53-EYFP e crescidas em

plasmídeo seletivo para glicose. Após a transferência delas para um meio com 2% de
etanol ao invés de glicose, focos citoplasmáticos foram observados. No entanto, ao
remover os estresses provocados (etanol, privação de glicose e calor), retornando as
células para o meio com glicose, esses focos desapareciam. Esses focos de p53
induzidos por estresse são uma reminiscência de gotículas semelhantes a líquido
instáveis formadas pela separação de fase líquido-líquido de uma variedade de proteínas
com regiões intrinsecamente desordenadas, muitas vezes em resposta ao estresse
(FIGURA 5A)

1,6-hexanodiol (álcool de cadeia alifática): uma baixa exposição tem sido descrita
como capaz de dissolver gotículas semelhantes a líquido, mas não conjuntos de
proteínas sólidas.

- Foi examinado o efeito do hexanodiol nos focos citoplasmáticos de p53-EYFP quando

comparados com focos estáveis de príon p53-EYFP. 5 minutos de exposição causaram o
desaparecimento de mais de 90% dos focos induzidos pelo estresse, mas não tiveram
efeito nos focos de príon (FIGURA 5C).
- Outra diferença observada entre os focos de príon e os focos instáveis causados pelo
estresse induzido é que somente um dos dois era marcado por ThT. Isso sugere que o
foco de príon é amiloide, mas o foco do estresse não (FIGURA 5B).
- Além disso, descobrimos que os focos de estresse tinham o alto nível de circularidade
esperado de uma gota de líquido, ao contrário dos focos de príon que eram menos
circulares (Figura 5D).

Os focos citoplasmáticos induzidos por estresse de P53 co-localizam com corpos-P

P-bodies: (processing bodies) grânulos de ribonucleoproteína citoplasmática (RNP)

compostos por mRNA reprimidos traducionalmente e proteínas relacionadas ao seu
decaimento.

- Células yLG397 foi co-transformada com pGPD-p53-EYFP para permitir a detecção

de focos de estresse de p53-EYFP e pEdc3-mCH ou pDcp2-RFP para permitir a
detecção de p-bodies. As células foram submetidas à etanol, calor ou privação de
glicose para induzir a aparição dos focos (FIGURA 6).

Discussão
- Nesse trabalho foi mostrado que p53 WT expressa em levedura não apenas possui a
habilidade de se propagar como um prionoide (com surgimento de focos
citoplasmáticos estáveis e redução na atividade de p53) como também pode formar
focos instáveis em resposta ao estresse.
- Os dados do trabalho mostraram que em leveduras, p53 forma agregados estáveis,
passíveis de marcação com ThT (sugestivo para amiloides) e citoplasmáticos. Embora
focos já tenham sido observados em núcleos, nunca foi observada marcação nuclear
com ThT.
- Seguindo a centrifugação de lisados celulares, agregados de p53 foram encontrados
em frações de pellets conforme visto para príons. Também, como para outros príons, o
citoplasma da cepa de príon-p53 infectou outras células via citodução. Além disso,
também o príon p53 foi transferido para receptores por transfecção deles com lisados de
células príon ou com fibras amilóides de peptídeo derivado de p53 (p8) in vitro.
- Assumindo que a inibição é causada pela atividade excessiva do fator de transcrição de
p53, espera-se que a atividade reduzida associada com a formação de príon possa
resgatar células da inibição de crescimento. De fato, essa hipótese é suportada pela
descoberta de que, seguindo a superexpressão de p53, colônias rosa com p53 inativa e
agregados de p53-EYFP aparecem no fundo de células com p53 ativa após alguns dias
de incubação à temperatura ambiente.
- Os agregados citoplasmáticos de p53 possuem características de príons: eles não
apenas se propagam, mas continuam replicando essas “sementes”, fazendo com que
essa característica permaneça estável por mais de 100 gerações. Além disso, a
superexpressão de p53 com reduzida atividade transcricional sugere que um aumento
nos níveis de p53 pode desencadear formação de príons e inativação concomitante de
p53, levando ao câncer em células animais.
- Aqui, mostramos que o p53 humano de tipo selvagem expresso em levedura e
normalmente difuso no núcleo pode ser induzido a formar focos citoplasmáticos de dois
tipos. A superexpressão transitória de p53 resultou no aparecimento de príons
transmissíveis estáveis com estrutura semelhante a amiloide, enquanto as tensões de
etanol, calor, ou falta de glicose causou o aparecimento de focos não amiloides
instáveis.
- Este trabalho mostra que o fato de transcrição de p53 forma focos instáveis em
levedura em resposta à estresses, abrindo a hipótese de que a atividade de p53 é
regulada pela transição de fases. Por outro lado, mutações em p53 podem prevenir a
formação de focos por estresses.