Interações Entre Cobre e Mycobacterium Tuberculosis GroEL1 - Metalômica - Oxford Academic

16/11/2021 16:34 Interações entre cobre e Mycobacterium tuberculosis GroEL1 † | Metalômica | Oxford Academic
Interações entre cobre e Mycobacterium

tuberculosis GroEL1 †

Dong Yang ,
David P Klebl ,
Sheng Zeng ,
Frank Sobott ,
Martine Prévost ,
Patrice Soumillion ,
Guy Vandenbussche ,
Véronique Fontaine 
Notas do Autor
Metallomics , Volume 12, Issue 8, August 2020, Pages 1267–1277,

https://doi.org/10.1039/d0mt00101e
Publicados:
17 de junho de 2020
Historia do artigo 
Resumo
A recalcitrância do Mycobacterium tuberculosis patogênico ,
o agente da tuberculose, à erradicação se deve a vários
fatores que permitem às bactérias escapar de situações de
estresse. O chaperone micobacteriano GroEL1,
superproduzido após a entrada do macrófago e sob
estresse oxidativo, pode ser um desses jogadores-chave.
Nós relatamos anteriormente que GroEL1 é necessário
para a biossíntese de dimicocerosato de ftiocerol, um
lipídio associado à virulência e para reduzir a
susceptibilidade aos antibióticos. No presente estudo,
mostramos que GroEL1, com uma região rica em histidina
C-terminal única, é necessário para a tolerância ao cobre
durante Mycobacterium bovisCrescimento do biofilme BCG.
A análise de espectrometria de massa demonstrou que
Ver PDF
GroEL1 exibe alta afinidade para íons de cobre,
especialmente em sua região rica em histidina C-terminal.
Além disso, a ligação de cobre protege GroEL1 da
desestabilização e aumenta a atividade ATPase de GroEL1.
Em conjunto, essas descobertas sugerem que GroEL1
poderia neutralizar a toxicidade do cobre, notavelmente
no fagossomo macrófago, e enfatiza ainda que M.
tuberculosis GroEL1 poderia ser um alvo antitubercular
interessante.
https://academic.oup.com/metallomics/article/12/8/1267/5967858 1/31
Resumo Gráfico
A chaperona GroEL1 aumenta a tolerância ao cobre durante a

formação de biofilme do Mycobacterium bovis BCG. A ligação de íons
de cobre à região rica em histidina GroEL1 protege a chaperona da
desestabilização e aumenta sua atividade ATPase.
Seção do problema:
Papel
Significado para metalômica

2+
Nossos resultados relatam que os íons Cu podem inibir
biofilmes micobacterianos e que GroEL1 micobacteriano
pode neutralizar essa inibição. O mecanismo de escape da
2+
toxicidade de Cu por GroEL1 é provavelmente o
2+
Ver PDF
resultado do armazenamento de Cu pela proteína, pois o
2+
Cu se liga com forte afinidade à região rica em histidina
C-terminal de GroEL1. Esta ligação, por sua vez, melhora a
estabilidade de GroEL1 e a atividade ATPase.
Introdução
O Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis ) é o agente

causador da tuberculose (TB), uma das principais doenças
infecciosas que ainda causa cerca de 10 milhões de casos de TB e
1
1,4 milhões de mortes em 2018. Essa infecção bacteriana é
difícil de tratar por vários motivos. Em primeiro lugar, a
bactéria tem uma parede celular impermeável incomum que
reduz o acesso ao medicamento. A parede celular

micobacteriana é composta, de dentro para fora, de
peptidoglicano covalentemente ligado ao arabinogalactano que,
por sua vez, também pode ser covalentemente ligado a ácidos
graxos de cadeia excepcionalmente longa, ácidos micólicos.
Esses são ainda incorporados em uma membrana externa, rica
2,3
em ácidos graxos longos não covalentemente ligados. Entre
os lípidos não covalentemente incorporados, os
dimicocerosatos de ftiocerol (PDIM), lípidos contendo ácidos
gordos ramificados em metilo, são essenciais para resistir ao
3-6
ambiente hostil e aos antibióticos.
Além disso, esse patógeno pode adotar diferentes estratégias

para escapar do estresse bactericida, por exemplo , estresse
oxidativo nos macrófagos e hipóxia no granuloma pulmonar,
entre outros, entrando em um estado de não replicação
7–10
denominado dormência. A chaperonina micobacteriana
GroEL1 demonstrou ser essencial para a adaptação metabólica e
energética sob estresse, conforme refletido in vitro em um
11
modelo de crescimento de biofilme.
M. bovis BCG e M. tuberculosis têm dois genes que codificam

GroEL , groEL 1 ( Rv3417c , BCG_ 3487c ) em um arranjo operônico
com groES ( Rv3418c , BCG_ 3488c ) e groEL 2 ( Rv0440 , BCG_
12
0479 ). Eles codificam duas formas de proteínas chaperonas,
GroEL1 (Cpn60.1, Hsp60.1) e GroEL2 (Cpn60.2, Hsp60.2), que
são idênticas entre M. tuberculosis e M. bovis . GroEL1 Ver PDF
12
compartilha 62% de identidade de sequência com GroEL2 e
53% de identidade de sequência e 70% de similaridade com a
13
bem conhecida E. coli GroEL. A E. coli GroEL pode oligomerizar
em duas estruturas heptaméricas empilhadas costas com costas
para promover o enovelamento de proteínas com a ajuda da
14–18
cochaperonina GroES, de forma dependente de ATP. O
2+ 2+ 2+
cátion bivalente Mg e, em menor extensão, Mn , Co ou Ni
2+
, demonstrou ser necessário para a atividade de E. coli GroEL
19
ATPase. Curiosamente, M. tuberculosisGroEL1 tem uma região
C-terminal rica em histidina distinta, enquanto GroEL2 tem
uma região C-terminal rica em glicina-metionina que é mais
12
típica das chaperonas GroEL. Em M. tuberculosis , ambas as
proteínas GroEL são superproduzidas sob condições de
20
estresse, incluindo choque térmico, resposta ao estresse
21 , 22 23
oxidativo, estresse osmótico e durante a infecção por
24
macrófagos. O mutante nocaute M. bovis BCG groEL 1 mostra
maior sensibilidade ao estresse oxidativo e vancomicina em
5 , 11
comparação com a cepa do tipo selvagem. Além disso, nossa
pesquisa anterior demonstrou que a proteína chaperona GroEL1
é necessária para a biossíntese de PDIM, pois o mutante M. bovis
5
BCG Δ groEL1 é desprovido de PDIM.
Normalmente, sob estresse, as bactérias usam uma virulência

comum e um fator adaptativo para sobreviver, formando
13 , 22 , 25 , 26
biofilmes. Embora biofilmes micobacterianos ainda
não tenham sido observados em pacientes com tuberculose,
patologias envolvendo micobactérias não tuberculosas
mostraram estar associadas a infecções por biofilme. Para
micobactérias patogênicas, o biofilme tem se mostrado um
modelo de crescimento in vitro interessante , pois, no biofilme,
as micobactérias estão entrando em dormência e desenvolvem
mecanismos de escape bactericida adaptativos como em
27
condições de estresse in vivo . Para a formação de biofilme
micobacteriano, uma alta concentração de glicerol (6% do meio
de cultura) é usada e GroEL1 mostrou ser necessário para se
11
adaptar a esta alta concentração de glicerol. Em condições de
estresse in vivo , como no fagossomo macrófago, os bacilos
podem encontrar estresse adicional resultante do aumento das
28–30
concentrações de íons metálicos. Embora o cobre seja
essencial para a viabilidade das micobactérias, a alta
concentração de íons cobre nos compartimentos hospedeiro /
celular é um mecanismo de defesa antibacteriano eficiente, Ver PDF
31-33
especialmente contra o M. tuberculosis suscetível .
Foi previsto que a região rica em histidina C-terminal de GroEL1

12
está envolvida na ligação de metal. Isso foi confirmado no
processo de purificação de M. smegmatis GroEL1 usando matriz
de afinidade de Ni-agarose e, mais recentemente, por
13 , 34
calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Dada a
superprodução de GroEL1 sob estresse, avaliamos o crescimento
do biofilme de M. bovis BCG na presença de íons metálicos e
investigamos o impacto dos íons metálicos nas características
bioquímicas de GroEL1.
Secção experimental
Cepas bacterianas e condição de crescimento

O tipo selvagem (wt) M. bovis BCG, BCG Δ groEL 1 (KO) e BCG
complementado (compl.) Cepas foram descritos anteriormente.
22
M. bovis BCG foi cultivado em meio Middlebrook 7H9 (Difco
Laboratories) contendo 0,05% de Tween 80 suplementado com
10% de complexo de albumina-dextrose. A cepa Δ groEL 1 foi
−1 de
cultivada em um meio com 25 μg mL canamicina e a cepa
−1 de −1 de
complementada com 25 μg mL canamicina e 50 μg mL
higromicina.
Formação de biofilme M. bovis BCG

As culturas de biofilme foram cultivadas em meio de Sauton
modificado contendo 3,5% (v / v) de glicerol na presença ou
2+ 2+ 2+
ausência de Cu , Zn ou Cd . Um litro de meio de Sauton
contém 0,5 g de KH PO , 0,5 g de MgSO , 2,0 g de ácido
2 4 4
cítrico, 0,05 g de citrato de amônio férrico, 35 mL de glicerol,
4,0 g de asparagina, 1,435 mg de ZnSO . O pH do meio foi
4
ajustado para pH 7,2 com NaOH 1M.
Para crescer biofilmes em placas de 24 poços ou placas de Petri

de poliestireno de 6 cm de diâmetro, 20 μL ou 100 μL de pré -
culturas (OD a 0,9-1,0) foram inoculados em 2 mL ou 10 mL
600
de meio de biofilme. Os pratos ou placas foram então cobertos
duas vezes com Parafilm® e incubados a 37 ° C por 21-28 dias Ver PDF
27
sem perturbação.
Construções de plasmídeo
O vetor pET-15b (Novagen) foi modificado com um local de
clivagem para a protease 3C de rinovírus introduzida entre NdeI
e NcoI no lugar do local de clivagem da trombina, deixando uma
35
sequência que codifica um marcador 5 × His.
As sequências codificantes correspondentes aos genes H37Rv

groEL 1, groEL 2 e groES de M. tuberculosis foram amplificadas
por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os primers usados
†
são mostrados em dados suplementares (Tabela S1, ESI ). Os
plasmídeos p MtGroEL1 e p MtGroEL1ΔHis foram obtidos
clonando os produtos de PCR no vetor pET-15b modificado,
usando os sítios de restrição Nde I e Xho I. O p MtGroEL1ΔHis
projetado é desprovido das últimas 30 bases, incluindo o códon

de parada e 27 bases que codificam os últimos 9 resíduos de
aminoácidos do terminal C, em comparação com pMtGroEL1.
Antes da clonagem, o vetor pET-15b modificado foi linearizado
usando as enzimas de restrição NdeI e BamHI . O gene groEL 2 de
M. tuberculosis foi clonado no vetor pET-15b modificado usando
o kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O gene groES de
M. tuberculosis foi clonado no vetor pET-15b modificado
desfosforilado pela fosfatase antártica (Anp), utilizando o sítio
de restrição NdeI . Os plasmídeos foram denominados p
MtGroEL2 e p MtGroES, respectivamente. Todas as construções
de plasmídeo foram verificadas por sequenciação.
Produção e purificação de proteínas

Os plasmídeos construídos foram transformados em E. coli
estirpe BL21 (DE3) para a produção de proteínas. As bactérias
−1 de
foram cultivadas em meio LB contendo 100 μg mL
ampicilina a 37 ° C. A expressão do gene foi induzida com 1 mM
de IPTG quando a densidade óptica atingiu 0,5 a 600 nm. Em
seguida, a incubação foi continuada por 20 horas a 18 ° C (ou 30
° C para GroEL2). As células foram então colhidas por
centrifugação a 5000 × ge ressuspensas em 20 mL de HEPES 20
mM, NaCl 300 mM, MgSO 20 mM , imidazol 10 mM, pH 8,0,
4
coquetel de inibidor de protease livre de EDTA (Carl Roth) e 10
-1
μg mL DNase (Sigma). Ver PDF
36
A purificação da proteína foi sempre realizada a 4 ° C. As
células ressuspensas foram homogeneizadas em um
homogeneizador Potter-Elvehjem e lisadas por quatro
passagens através de um Emulsiflex-C3 (Avestin). O lisado foi
coletado por centrifugação a 10.000 ge carregado em uma
coluna Poly-Prep previamente equilibrada (Bio-Rad) contendo
2 mL de resina Ni – NTA (Thermo Scientific). A suspensão foi
incubada durante 1 h sob agitação suave. Depois de recolher o
fluxo da coluna, a resina foi lavada com imidazol 10 mM e 40
mM, em HEPES 20 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM. As proteínas
foram eluídas com imidazol 250 mM, HEPES 20 mM (pH 8,0),
NaCl 300 mM. Antes da clivagem de 5 × His-tag, o tampão foi
trocado por HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,5) em uma
coluna de dessalinização PD-10 (GE Healthcare). Em seguida, a
proteína foi incubada durante a noite a 4 ° C com protease 3C

(proporção de massa de proteína / enzima de 75: 1) para
remoção de His-tag. A proteína foi ainda purificada por
cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando uma
coluna analítica Superdex 200 10/300 GL conectada a um
sistema purificador ÄKTA (GE Healthcare).
As proteínas purificadas foram congeladas rapidamente em

nitrogênio líquido e armazenadas a −80 ° C. As concentrações de
proteínas foram determinadas usando os coeficientes de
37 −1 −1
extinção calculados a 280 nm: 16 960 M cm para GroEL1 e
−1 −1 −1 −1
GroEL1ΔHis, 11 460 M cm para GroES e 15 930 M cm
para GroEL2. A pureza e a integridade das proteínas
recombinantes foram determinadas por SDS-PAGE e
espectrometria de massa desnaturante, respectivamente.
Espectrometria de massa
Os capilares de nanoeletrospray de borosilicato (Thermo
Scientific) foram preparados internamente usando um extrator
de micropipeta P-97 (Sutter Instrument Co.) e revestidos com
ouro / paládio em um revestidor de pulverização catódica
Polaron SC7620 (Quorum Technologies). Os espectrômetros de
massa foram operados no modo de íon positivo.
Para a determinação da massa intacta, as proteínas foram

solubilizadas em uma mistura de 50% de acetonitrila / 1% de Ver PDF
ácido fórmico (v / v) após serem dessalinizadas em ZipTipC4
(Millipore). Os espectros de massa foram adquiridos em um
espectrômetro de massa Q-TOF Ultima, normalmente usando
uma voltagem capilar de 1,8–2,0 kV e voltagem de cone de 50 V.
O analisador TOF foi operado no modo V. As massas
moleculares foram determinadas após a deconvolução MaxEnt1
dos dados m / z brutos (Waters).
Para estudos iniciais de ligação a íons metálicos, a proteína foi

trocada por tampão em acetato de amônio 10 mM, pH 6,9, por
meio de cromatografia de exclusão por tamanho. Os espectros de
massa nativos foram adquiridos em um espectrômetro de
massa Q-TOF Ultima (Waters) usando as configurações
descritas acima. A especificidade de ligação ao metal das
proteínas foi determinada, e cada proteína e íon metálico foram
misturados a uma concentração final de 10 μM. Soluções de íons

metálicos foram preparadas usando sais de CoCl , ZnCl , NiCl
2 2
e CuCl .
2 2
A ligação do cobre foi estudada com mais profundidade usando

um UHMR Orbitrap Q Exactive Plus modificado para alta faixa
de massa (Thermo Scientific). A proteína foi trocada por tampão
via SEC conforme descrito acima ou usando duas colunas de
dessalinização Zeba spin consecutivas (Thermo Scientific) e
usada em uma concentração final de 7,5 μM em acetato de
amônio 500 mM pH 6,9. Verificou-se que este produzia menos
proteína desdobrada e permitia a ligação do cobre. As
configurações típicas do instrumento foram -1,7 kV de tensão
capilar, -50 V na captura da fonte, o HCD estava desligado e o
alvo AGC definido para 106 com um tempo máximo de injeção
de 500 ms. A faixa de massa foi de 2.000 a 20.000 m / z para
permitir a detecção de espécies altamente oligoméricas, se
presentes. Os dados brutos foram analisados e processados
38
usando UniDec. CuCl foi adicionado à amostra para fazer as
2
concentrações finais entre 1,9 e 30 μM. Condições semelhantes
2+
foram usadas para estudar a ligação de Cd a GroEL1.
O efeito do íon cobre na estabilidade térmica

da proteína
O ensaio de deslocamento térmico na presença do corante Ver PDF
laranja SYPRO fluorescente (Invitrogen) foi usado para
39
monitorar a estabilidade da proteína. O ensaio foi conduzido
em placas de 96 poços usando o sistema de PCR em tempo real
CFX96TM (Bio-Rad). Resumidamente, 25 μL da mistura de
reação continha 5 μM de proteína (GroEL1 ou GroEL1ΔHis), 0,3
2+
μL de 5000 × SYPRO Orange, com 10 μM de Cu em 5 mM
HEPES, pH 7,5. Os parâmetros do termociclo foram
configurados da seguinte forma: pausa de 20 minutos a 10 ° C,
seguida por uma curva de fusão registrada de 10 ° C a 95 ° C,
com aumento de 1 ° C a cada minuto, em seguida, pausa a 10 ° C
por 10 minutos. A intensidade de fluorescência foi registrada em
Ex / Em = 465/510 nm. Os dados foram obtidos no software Bio-
Rad Precision Melt Analysis 1.0 e exportados como planilha do
Microsoft Excel.
Ensaio de sensibilidade à digestão de tripsina

Para investigar o efeito dos íons de cobre na suscetibilidade da
digestão da protease, um ensaio de digestão com tripsina foi
realizado como descrito anteriormente com pequenas
40
modificações em GroEL1 ou GroEL1ΔHis na presença ou
2+
ausência de Cu a 37 ° C. Resumidamente, a mistura de reação
continha 5 μg de GroEL1 ou GroEL1ΔHis, 0,0015 μg de tripsina
(uma proporção de massa de proteína para tripsina era de 10
000: 3), na presença ou ausência de CuCl 2. A reação foi
encerrada em vários momentos pela adição de 1,5 μL de PMSF
50 mM e 7,5 μL de tampão SDS-PAGE Laemmli (2 ×) a 6 μL de
alíquotas da mistura de reação, e a solução resultante foi
imediatamente congelada em nitrogênio líquido. As amostras
foram finalmente analisadas por SDS-PAGE em um gel de
poliacrilamida 15%. Além disso, a influência de cobre sobre a
actividade da tripsina foi avaliada utilizando N α-benzoil- DL
cloridrato -arginina 4-nitroanilida (BAPNA, Sigma) como
41
substrato.
Ensaio de atividade ATPase

As atividades ATPase da micobactéria recombinante purificada
GroEL (GroEL1, GroEL1ΔHis, GroEL2) foram quantificadas
42
usando um ensaio colorimétrico ligeiramente modificado.
Resumidamente, 100 μL do tampão de reação contendo 10 mM
Ver PDF
KCl, 2 mM ATP, 10 mM MgCl 2, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl
150 mM e proteínas 10 μM, na ausência ou na presença de GroES
20 μM foram incubados por 1 hora a 37 ° C. As reações
enzimáticas foram encerradas pela adição de 500 μL de SDS a
1%. O desenvolvimento da cor foi medido da seguinte forma:
200 μL de reagente de molibdato de amônio foram adicionados
a cada tubo imediatamente seguido pela adição de 200 μl de
reagente Elon. Após 15 min em temperatura ambiente, a
absorbância da solução final (200 μL de reações em placas de 96
poços) foi medida a 700 nm. Experimentos de controle sem
proteína sempre foram incluídos. A E. coli GroEL recombinante
era da Abcam.
Para investigar o efeito dos íons metálicos na atividade ATPase,

o mesmo experimento foi realizado na presença de 100 μM de
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
íons metálicos (Ni , Cu , Cd , Zn ou Co ).
Modelagem estrutural de GroEL1

Uma pesquisa BLAST realizada nas sequências do Protein Data
Bank (PDB) identificou GroEL2 de M. tuberculosis como um
modelo potencial para a construção de um modelo GroEL1. Dois
modelos 3D de GroEL1 foram construídos por modelagem
43
comparativa com o Modeller; 9v11 usando a estrutura de
44
cristal M. tuberculosis Cpn60.2 (GroEL2) como um modelo eo
alinhamento de sequência realizado com ClustalW. O análogo de
ATP foi posicionado com base na estrutura GroEL sobreposta
45
(PDB ID :; 1SX3 ) para prever o local de ligação de ATP
potencial.
Resultados
GroEL1 aumenta a tolerância ao cobre durante

a formação de biofilme M. bovis BCG
O impacto dos íons metálicos foi avaliado no crescimento do
biofilme de cepas de M. bovis BCG. Como a cepa Δ groEL1 BCG
11
(KO) é mais sensível ao estresse osmótico de glicerol, a
quantidade de glicerol na cultura de biofilme foi reduzida para
3,5% (em vez de 6%) a fim de permitir a produção de biofilme
pela cepa Δ groEL1 . A cepa BCG de tipo selvagem (wt) foi capaz
de formar biofilme maduro (com sulcos e depressões) na Ver PDF
2+ de
presença de concentrações de Cu até 175 μM ( Fig. 1 ). Em
contraste, os biofilmes da cepa Δ groEL 1 já estavam
2+
prejudicados com 100-125 μM de Cu , mostrando que a perda
de GroEL1 aumenta a suscetibilidade micobacteriana ao cobre. A
complementação do gene groEL 1 na cepa KO restaurou
totalmente o crescimento do biofilme na presença de
2+ de
concentrações de Cu até 175 μM, demonstrando que a perda
de GroEL1 é de fato responsável pelo aumento da suscetibilidade
ao cobre durante o crescimento do biofilme ( Fig. 1 ). Este efeito
protetor de GroEL1 foi observado apenas na cultura de biofilme
(meio Sauton) e não na cultura planctônica (meio 7H9). Isso
2+
pode ser devido a uma concentração reduzida de Cu livre na
-1 de
cultura 7H9, já que este meio contém 5 g L albumina,
2+ 46
conhecido por se ligar ao Cu . De fato, a concentração
inibitória mínima (MIC) para CuCl foi idêntica (150-175 μM)

2
para as três cepas no meio 7H9.
Figura 1
2+
Impacto do Cu na formação de biofilme de várias cepas de M. bovis BCG.
Culturas de biofilme de tipo selvagem (wt), Δ groEL1 (KO), KO
complementado (compl.) As cepas de M. bovis BCG foram cultivadas em
meio de Sauton com glicerol 3,5% na ausência ou presença de várias
concentrações de CuCl por três semanas. As fotos mostradas são
2
representativas de pelo menos três experimentos diferentes.
A cepa mutante exibe suscetibilidade a outros íons metálicos?

Para verificar este ponto, o crescimento do biofilme também foi
2+
avaliado na presença de concentrações crescentes de Zn e Cd
2+ †
. Conforme mostrado na Fig. S1 (ESI ), nenhuma diferença
significativa em termos de suscetibilidade a esses íons durante
o crescimento do biofilme foi observada entre as três cepas de
M. bovis BCG. Na verdade, as culturas de biofilme não foram Ver PDF
2+
afetadas pelo Zn em concentrações de até 600 μM, o que já
2+
excede a concentração de Zn dentro dos macrófagos
31
infectados. Os biofilmes das três cepas foram afetados de
2+
forma semelhante em Cd concentrações> 5 μM. Assim, a
proteína GroEL1 não parece proteger os bacilos do excesso de Cd
2+
. O efeito GroEL1 é, portanto, específico do cobre.
A região nativa rica em histidina afeta a

estabilidade de GroEL1
Para estudar o papel da região rica em histidina C-terminal
(HDHHHGHAH) de GroEL1, as proteínas recombinantes M. bovis
BCG GroEL1 e um M. bovis GroEL1 desprovido da região rica em
histidina C-terminal (GroEL1ΔHis) foram purificadas. Estas
proteínas foram superproduzidas na cepa de E. coli BL21 (DE3),
purificada por cromatografia de afinidade de metal imobilizado,

tratada com protease 3C de rinovírus humano para a clivagem
adicional de 5 × His-tag e, em seguida, purificada
adicionalmente por cromatografia de exclusão de tamanho
(SEC). A pureza e a integridade das proteínas recombinantes
foram analisadas por SDS-PAGE e espectrometria de massa,
†
respectivamente (Fig. S2, ESI ). Os dados de espectrometria de
massa indicaram claramente que o N-terminal 5 × His-tag
adicional foi removido em ambas as proteínas.
GroEL1 recombinante foi eluído em SEC como um único pico,

mas migrou como duas bandas na análise SDS-PAGE, ou seja ,
uma banda superior mais forte seguida por uma banda mais
†
fraca (Fig. S2A, ESI ). A análise da sequência de peptídeos por
espectrometria de massa demonstrou que a banda fraca
corresponde a um produto de degradação de GroEL1 sem a
região N-terminal (cerca de 45 resíduos de aminoácidos
ausentes em 543) (dados não mostrados). Esta proteólise não
foi observada para o GroEL1ΔHis, sempre mostrando uma única
†
banda na análise SDS-PAGE (Fig. S2B, ESI ).
Interação GroEL1-cobre analisada por

espectrometria de massa nativa
2+
Para investigar melhor a interação entre GroEL1 e Cu ,a
especificidade de ligação ao metal das proteínas GroEL de M.
Ver PDF
tuberculosis foi monitorada por espectrometria de massa nativa
( Fig. 2 ). Os espectros de massa nativos foram registrados após
2+
a incubação das proteínas com ou sem Cu . É importante
2+
ressaltar que a adição de um equivalente molar de Cu induziu
um deslocamento do pico GroEL1 para um valor m / z mais alto
correspondente à ligação de um átomo de cobre à proteína ( Fig.
2B) O desaparecimento quase completo do pico apo após a
adição de cobre reflete uma ligação eficaz deste íon metálico a
GroEL1. Em contraste, praticamente nenhuma conversão da apo
para a forma holo foi observada após a adição de um
2+
equivalente molar de Cu a GroEL1ΔHis ( Fig. 2C ). Esta
2+
observação sugere que o Cu está principalmente ligado à
região rica em histidina de GroEL1.
Figura 2
Espectros nano-ESI nativos da variante GroEL1 e GroEL1ΔHis mostrando

2+
diferentes afinidades para Cu . A concentração de proteína foi de 7,5 μM
em acetato de amônio 500 mM. (A) O espectro de massa nativa completo de
apo GroEL1 mostra uma distribuição de estado de carga estreita com o
14+ 2+
estado de carga principal [M + 14H] destacado em vermelho. (B) Cu
14+
ligando-se a GroEL1 mostrado para o estado de carga GroEL1 . Um
deslocamento de pico pode ser observado após a adição de uma
2+
quantidade equimolar de Cu , o pico para GroEL1 ligado a cobre é
14+
destacado com um asterisco. (C) GroEL1ΔHis na presença e ausência de
2+
um equivalente molar de Cu , não apresentando ligação.
2+
Além disso, a capacidade de outros íons metálicos ( ou seja, Zn
2+ 2+ 2+
, Ni , Cd e Co ) para se ligar a GroEL1 também foi avaliada
† 2+ 2+
(Fig. S3 e S4, ESI ). A ligação de Zn e Ni a GroEL1 também
2+
foi observada, mas com uma eficiência menor do que para Cu
†
(Fig. S3, ESI ). A uma razão metal / proteína de 1: 1, quase não
2+ †
houve ligação de Cd a GroEL1 (Fig. S4, ESI ). Para estudar
mais a ligação do cobre à proteína, GroEL1 foi titulado com Ver PDF
2+
quantidades crescentes de Cu e analisado por espectrometria
2+
de massa nativa (Fig. 3 ). A adição sequencial de Cu levou ao
aparecimento da forma holo GroEL1 · Cu que foi a principal
2+
população observada na razão molar GroEL1 / Cu 1: 1,
conforme descrito no experimento anterior. Em razões molares
mais altas, as populações de GroEL1 · 2Cu e GroEL1 · 3Cu foram
detectadas com uma diminuição concomitante da abundância
de GroEL1 · Cu. Ao contrário, na mesma faixa de concentrações
2+
de Cu , a forma apo de GroEL1ΔHis não desapareceu
totalmente e a maior estequiometria para o complexo proteína /
metal observada na presença de quatro equivalentes molares de
cobre foi GroEL1ΔHis · 2Cu. Para fins de comparação, o GroEL2
†
recombinante também foi purificado (Fig. S2, ESI ) e a ligação
de cobre a GroEL2 também foi investigada. A ligação do cobre ao
GroEL2 deu resultados semelhantes aos da ligação do cobre ao

GroEL1ΔHis ( Fig. 3 ).
Ver PDF
Fig. 3
Ver PDF
Abundância relativa dos diferentes adutos de proteína-Cu, conforme

determinado por espectrometria de massa nativa. (A) GroEL1; (B)
GroEL1ΔHis; (C) GroEL2. Os espectros foram registrados em uma
concentração final de proteína de 7,5 μM em acetato de amônio 500 mM. As
áreas cinza, azul, vermelha e roxa indicam a abundância de apo-proteína,
2+
complexo 1: 1, complexo 2: 1 e complexo 3: 1 de proteína e Cu ,
respectivamente. A titulação com CuCl foi realizada em razões molares de
2
2+
Cu para proteína de 0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1, 2: 1 e 4: 1, correspondendo a 1,9–
30 μM de CuCl . Populações com <5% de intensidade não são mostradas.
2
O efeito do cobre no estado oligomérico da proteína GroEL1 de

M. tuberculosis também foi investigado por espectrometria de
†
massa nativa (Fig. S5, ESI ). O GroEL1 recombinante é
principalmente monomérico com pequenas quantidades de
47
proteína dimérica, de acordo com um relatório anterior. As
mesmas observações foram obtidas para GroEL1ΔHis e GroEL2
2+
(dados não mostrados). Além disso, ao adicionar Cu ,o
espectro geral para GroEL1 e GroEL1ΔHis não mudou
significativamente na faixa de 0 a 30 μM CuCl 2 , indicando que
oligômeros mais elevados não puderam ser observados nessas
condições.
O efeito do cobre na estabilidade térmica do

GroEL1
Ensaios de deslocamento térmico foram realizados para avaliar Ver PDF
2+
o efeito do Cu na estabilidade da proteína. O uso do corante
fluorescente laranja SYPRO e de um termociclador em tempo
real para acompanhar a desnaturação térmica em diferentes
condições possibilitou o monitoramento da estabilidade de
2+ 2+
GroEL1 e GroEL1ΔHis na presença de Cu . Na presença de Cu
(10 a 50 μM), os valores de Tm para GroEL1 foram maiores do
que para GroEL1ΔHis ( Fig. 4 ). Embora altas concentrações de
2+
Cu sejam deletérias para ambas as proteínas, a diferença nos
valores de Tm sugere que a ligação do cobre à região rica em
histidina poderia ter um efeito protetor, pois a ligação dos íons
metálicos é mais eficiente em GroEL1 do que em GroEL1ΔHis.
Fig. 4
Ensaio de deslocamento térmico para analisar o efeito do cobre na

desestabilização da proteína GroEL1. A reação (25 μL) continha 5 μM de
proteína (GroEL1 ou GroEL1ΔHis), 0,3 μL de 5000 × SYPRO Orange, com
várias concentrações de CuCl em 5 mM HEPES, pH 7,5. Os dados
2
correspondem a média e desvio padrão e foram obtidos a partir de três
experimentos independentes.
Ensaio de susceptibilidade à protease

2+ Ver PDF
Para investigar se o Cu poderia aumentar a estabilidade da
proteína GroEL1, uma digestão suave com tripsina foi realizada
2+
na ausência ou na presença de Cu . O GroEL1 apresentou maior
2+
tolerância à digestão com tripsina na presença de Cu ( Fig. 5 ).
Além disso, o grau de tolerância aumentou com a concentração
† 2+
de cobre (Fig. S6, ESI ). A ligação do Cu à proteína GroEL1
melhorou, assim, sua estabilidade. Um resultado semelhante
também foi observado com GroEL1ΔHis ( Fig. 5 ). Um controlo
foi realizada utilizando N α-benzoil- DL -arginina 4-
nitroanilida cloridrato (BAPNA) como substrato e demonstrou
2+
que a atividade da tripsina não foi afetada pela presença de Cu
e que a protease ainda apresentou um pequeno aumento de
atividade na faixa de concentrações de cobre utilizadas no
experimento (dados não mostrado), conforme relatado
48
anteriormente. O fato de que a suscetibilidade à tripsina
2+
também foi diminuída para GroEL1ΔHis na presença de Cu ,
sugere que mudanças conformacionais também podem ocorrer

2+
na proteína após a ligação do Cu aos outros locais de
coordenação.
Fig. 5
Digestão limitada por tripsina de GroEL1 (A) e GroEL1ΔHis (B) na ausência

2+
ou presença de Cu . A reação foi interrompida em tempos diferentes (10,
15, 20, 30 min) pela adição de PMSF. Os produtos da reação foram
analisados por SDS-PAGE 15%. Pista M: padrões de massa molecular; pista
1–9: 5 μg (∼9 μM) de GroEL1 (ou GroEL1ΔHis); pistas 2 a 5: digestão por 10,
2+
15, 20, 30 min, respectivamente, na ausência de Cu ; pistas 6 a 9: digestão
2+
por 10, 15, 20, 30 min, respectivamente, na presença de 18 μM Cu . A
figura é representativa de três experimentos independentes.
O cobre aumenta a atividade da GroEL1 ATPase

A hidrólise de ATP pelas proteínas GroEL de M. tuberculosis
recombinantes foi investigada na presença ou ausência de íons
Ver PDF
metálicos. M. tuberculosis GroEL1 e GroEL2 exibiram atividade

ATPase fraca, com uma atividade mais alta para GroEL2 do que
para GroEL1 ( Fig. 6 ). Surpreendentemente, o GroEL1ΔHis
mostrou uma atividade ATPase aumentada em duas vezes em
comparação com o GroEL1. GroEL1ΔHis e GroEL2 tiveram quase
a mesma atividade ( Fig. 6 ). A presença de GroES, também
†
produzida e purificada para este estudo (Fig. S2, ESI ), não teve
impacto nas atividades ATPase in vitro de GroEL1 e GroEL2 , de
47 , 49
acordo com estudos anteriores. A atividade de GroEL1
2+
ATPase foi aumentada cerca de oito vezes na presença de Cu (
Fig. 7 ). Este efeito não foi observado para GroEL1ΔHis e GroEL2.
2+ 2+ 2+ 2+
Os outros íons metálicos testados (Ni , Co , Cd ou Zn )
não influenciaram a atividade da proteína GroEL1, embora a
2+ tenha
presença de Co aumentado ligeiramente as atividades de
2+ 2+
GroEL1ΔHis e GroEL2 ATPase. O efeito de Cu e Co na
atividade recombinante de E. coli GroEL ATPase também foi

avaliado e mostrou que esses íons metálicos não tiveram efeito
†
em sua atividade ATPase (Fig. S7, ESI ).
Fig. 6
Atividade da proteína ATPase do M. tuberculosis GroEL. As reações

enzimáticas foram incubadas com 10 μM de GroEL e 20 μM de proteínas
GroES a 37 ° C por 1 h e a absorbância foi registrada a 700 nm. A membrana
plasmática ATPase (PMA) foi usada como controle. A média de pelo menos
três experimentos independentes para conjuntos de dados individuais foi
calculada e plotada junto com o desvio padrão.
Fig. 7
Ver PDF
Atividade ATPase de 10 μM de proteínas GroEL de M. tuberculosis na

presença de 100 μM de íons metálicos. (A) GroEL1, (B) GroEL1ΔHis e (C)
GroEL2. A média de pelo menos três experimentos independentes para
conjuntos de dados individuais foi calculada e plotada junto com o desvio
padrão, considerando a atividade medida na ausência de íons metálicos
como 100%.
Modelo tridimensional GroEL1

Para entender melhor o impacto da região C-terminal rica em
histidina na estabilidade da região N-terminal, um modelo de
estrutura tridimensional GroEL1 foi construído usando a
estrutura cristalina de M. tuberculosis GroEL2 (PDB ID :; 3RTK )
44
como modelo . Ambas as proteínas compartilham 62% de
identidade de sequência (86% de similaridade de sequência) em
527 resíduos de sobreposição. É interessante notar que na
estrutura cristalina de GroEL2, a conformação dos 60 primeiros
resíduos N-terminal e dos 26 últimos resíduos C-terminal não
foi resolvida, muito provavelmente devido à flexibilidade desses
domínios. Os resíduos do terminal C também estão ausentes nas
estruturas publicadas de E. coli GroEL ( por exemplo, PDB ID :;
50 , 51
1GRL ,;1OEL ). O modelo de GroEL1 no presente estudo
sugere que os domínios N- e C-terminais da proteína podem
estar próximos um do outro no domínio equatorial da proteína (
Fig. 8 ).
Fig. 8
Ver PDF
Modelo 3D de GroEL1 representado como um desenho animado prateado

sem (A) ou com ATP análogo (B). A localização de um análogo de ATP
(ATPγS) resulta da sobreposição do modelo 3D com a estrutura cristalina de
E. coli GroEL (PDB ID :; 1SX3 ). O Cα do primeiro (resíduo número 61) e do
último (resíduo 518) do modelo são mostrados como esferas de van der
Waals verdes e azuis, respectivamente.
Discussão
A proteína GroEL1 desempenha papéis importantes na

adaptação micobacteriana ao ambiente, como resistência a
11 , 22 , 52 O
antibióticos e outras várias condições estressantes.
cobre é por um lado um cofator crítico para várias enzimas

micobacterianas, incluindo aquelas que ajudam a resistir ao
estresse oxidativo, ou seja , reações de transferência de
elétrons, citocromo c oxidase e Cu / Cu superóxido dismutase,
mas por outro lado, altas concentrações de cobre são
53 , 54
bactericida.
2+
Nossos resultados indicam que altas concentrações de Cu
podem reduzir a maturação do biofilme M. bovis BCG e que
2+
GroEL1 é necessário para resistir à concentração tóxica de Cu
sob esta condição de estresse. Como GroEL1 foi incapaz de
2+
proteger as bactérias contra o Cd tóxicoconcentração, seu
efeito é específico do cobre. As análises de espectrometria de
massa nativa demonstraram a ligação específica de íons de
cobre a GroEL1, com uma maior afinidade para o domínio C-
terminal rico em histidina. Até dois outros locais de ligação com
uma afinidade mais baixa estão provavelmente presentes na
proteína, como deduzido da comparação dos perfis de ligação
de cobre de GroEL1 e GroEL1ΔHis. A presença de sítios de ligação
com diferentes afinidades para íons de cobre também foi
observada para GroEL1 por análise de calorimetria de titulação
34
isotérmica (ITC).
Ansari et al. observaram resultados semelhantes usando cepas

de M. tuberculosis , porém em condições de crescimento normal.
34
Eles não investigaram o papel de GroEL1 sob condições de
34
estresse. O fato de eles terem observado um envolvimento de Ver PDF
2+
GroEL1 para mitigar a toxicidade de Cu em condições de
crescimento planctônico, o que não foi detectado por nosso
grupo, pode ser devido ao uso de uma espécie de micobactéria
diferente ou às nossas condições ótimas de crescimento
planctônico para M .Bovis BCG ( ou seja, qualidade de albumina
otimizada), levando a menos produção de GroEL1 ou aumento
2+
da captura de Cu por nossa albumina nas culturas de 7H9
46
planctônicas.
2+
A presença de sítios de ligação de Cu em GroEL1, mas também
o papel protetor de GroEL1 contra altas concentrações de cobre
tóxico, sugere fortemente que esta proteína poderia segregar in
vivo os íons de cobre presentes nos fagossomas de macrófagos
32
e, portanto, diminuindo a concentração de íons livres,
protegem as bactérias do efeito tóxico bactericida desse íon
metálico. Normalmente, os mecanismos de resistência do cobre

envolvem chaperones específicos de cobre, proteínas de
55
armazenamento e sistemas de efluxo. Em M. tuberculosis ,
várias ATPases do tipo P, geralmente induzidas em condições
estressantes, foram relatadas como possíveis transportadores
56
de cátions de metais pesados. Por exemplo, CtpV e CtpC são
+ 2+
induzidos pelas concentrações intrafagossômicas de Cu e Zn
57 , 58
. Curiosamente, embora o gene cop A de E. coli (ortólogo de
ctp V) codifique duas proteínas com terminal N idêntico, uma
59
chaperona de cobre e um transportador de cobre, nem
pesquisa de literatura, nem alinhamento de sequência clustal
CtpV / CopA aa permitido para identificar um chaperone de
cobre semelhante para M. tuberculosis . Além disso, a
manutenção micobacteriana de baixas concentrações
intracelulares de Cu também necessita de MctB, uma suposta
60
proteína de transporte de cobre na membrana externa. A
metalotioneína MymT, proteína rica em cisteína, capaz de se
+
ligar a até seis Cu , parcialmente envolvida na resistência à
toxicidade do cobre, poderia desempenhar o papel de proteína
61
armazenadora. Além disso, um operon de M. tuberculosis
induzível por cobre , incluindo lpqS (que codifica uma
lipoproteína putativa), mmcO (que codifica uma oxidase
multicobacteriana multicobre), Rv2963 (que codifica uma
possível permease), mymT (que codifica a metalotioneína
descrita acima), socAB (pequena ORF induzido por Cu A e B) e
genes ricR (codificando um repressor deste operon), parece
Ver PDF
fornecer componentes-chave de um sistema adicional
30
envolvido na desintoxicação do cobre. Todos esses
mecanismos previamente relatados poderiam ajudar o M.
30 , 62
tuberculosis a manter a homeostase do cobre. No entanto,
eles parecem não ter um componente chave: um chaperone de
cobre que poderia transportar cobre para as proteínas de ligação
30
de cobre mencionadas acima e bombas de efluxo. Nossa
hipótese é que GroEL1 poderia funcionar como um chaperone de
transporte de cobre, já que GroEL1 pode ser secretado no
22
filtrado da cultura.
Como o GroEL1ΔHis recombinante é menos sujeito à degradação

†
proteolítica N-terminal durante a purificação (Fig. S2, ESI ),
hipotetizamos que a região rica em histidina em GroEL1
aumenta de alguma forma a acessibilidade deste último às
enzimas proteolíticas. Embora esta região rica em histidina C-
terminal esteja envolvida na desestabilização de GroEL1, a

estabilidade desta proteína parece melhorada na presença de
2+
ligação de Cu . Além deste papel protetor contra maior
concentração de cobre bactericida, a ligação de íons de cobre a
GroEL1 também poderia ter uma função adicional para
melhorar a estabilidade da região N-terminal de GroEL1.
2+ 2+
Brasil et al. relataram que os cátions divalentes (Ca , Mg ,
2+ 2+
Mn , Zn ) induzem a exposição das superfícies hidrofóbicas
GroEL de E. coli e fortalecem as interações de ligação
63
hidrofóbica GroEL. Isso foi atribuído a uma mudança na
64
conformação de GroEL ao se ligar aos cátions divalentes. Com
base em nosso modelo 3D GroEL1, é possível que os domínios
N- e C-terminais da proteína possam estar próximos um do
outro e que a ligação de íons de cobre ao domínio rico em
histidina possa afetar a interação do segmento C-terminal com
o domínio N-terminal, reduzindo assim a exposição deste
último a proteases. No entanto, a ligação de cobre não está
induzindo uma modificação do estado oligomérico GroEL1,
conforme demonstrado pela análise de espectrometria de
massa nativa.
Curiosamente, Ansari et al. , também construiu um modelo 3D

GroEL1 com base em seus dados de espalhamento de raios-X de
pequeno ângulo (SAXS) obtidos na presença de várias razões
2+ 34
GroEL1 / Cu . A análise SAXS sugeriu que a proteína adota
2+
uma estrutura mais aberta na presença de Cu e se torna mais Ver PDF
flexível. Essas mudanças conformacionais podem ser
responsáveis pelo aumento da atividade da GroEL1 ATPase
observada em nosso estudo na presença de íons cobre. Como a
proteína está prevista para ser mais estendida e flexível na
2+
presença de Cu , seria de se esperar que GroEL1 fosse mais
suscetível à atividade de protease. No entanto, isso não foi o que
foi observado, pois nosso ensaio de digestão de tripsina
limitado sugeriu que GroEL1, especialmente a região N-
2+
terminal, é menos acessível à protease na presença de Cu .
É importante ressaltar que a atividade da GroEL1 ATPase é

2+
drástica e especificamente aumentada na presença de Cu ,
ligando-se principalmente à região rica em histidina. Isso é
observado apenas para GroEL1 e não para GroEL1ΔHis, GroEL2 e
E. coli GroEL, sugerindo que a ligação de íons de cobre à região
C-terminal rica em histidina GroEL1 induz uma mudança

conformacional permitindo aumentar sua atividade ATPase.
Isso pode ser devido à melhoria da estabilidade de GroEL1 na
2+ 2+
presença de Cu . Portanto, na ausência de Cu , GroEL1ΔHis e
GroEL2, ambos sem a região rica em histidina, exibiram maior
atividade ATPase do que GroEL1, possivelmente devido à sua
maior estabilidade de proteína. No entanto, na presença de Cu
2+
, GroEL1 e GroEL2 mostram atividade ATPase semelhante.
Conclusões
Aqui, propomos um novo papel para o M. tuberculosis GroEL1.

Esta proteína pode estar envolvida na resistência ao cobre
durante a formação de biofilme micobacteriano,
potencialmente atuando como uma proteína de
armazenamento de metal. Portanto, quando as micobactérias
encontram altas concentrações de cobre, como no macrófago,
GroEL1, ao se ligar ao cobre, poderia ajudar as bactérias a
tolerar altas concentrações de cobre e, conseqüentemente, esse
estresse bactericida.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses com o Ver PDF

conteúdo deste artigo.
Reconhecimentos
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo China

Scholarship Council (CSC) (No. 201408210159). FS e DPK
gostariam de agradecer a James Ault e Rachel George por sua
ajuda na operação do Orbitrap UHMR. O Orbitrap UHMR foi
financiado pela concessão de equipamentos multiusuário da
Wellcome Trust 208385 / Z / 17 / Z.
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Footnotes
† Electronic supplementary information (ESI) available. See DOI:

10.1039/d0mt00101e
Author notes
Guy Vandenbussche and Véronique Fontaine equally contributed.
© The Royal Society of Chemistry 2020
Este artigo é publicado e distribuído sob os termos da Oxford University

Press, Standard Journals Publication Model
(https://academic.oup.com/journals/pages/open_access/funder_policies/c
horus/standard_publication_model)
Dados suplementares
d0mt00101e1 - arquivo pdf

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16/11/2021 16:34 Interações entre cobre e Mycobacterium tuberculosis GroEL1 † | Metalômica | Oxford Academic

Interações entre cobre e Mycobacterium

Metallomics , Volume 12, Issue 8, August 2020, Pages 1267–1277,

A chaperona GroEL1 aumenta a tolerância ao cobre durante a

Significado para metalômica

O Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis ) é o agente

reduz o acesso ao medicamento. A parede celular

Além disso, esse patógeno pode adotar diferentes estratégias

M. bovis BCG e M. tuberculosis têm dois genes que codificam

Normalmente, sob estresse, as bactérias usam uma virulência

Foi previsto que a região rica em histidina C-terminal de GroEL1

Cepas bacterianas e condição de crescimento

Formação de biofilme M. bovis BCG

Para crescer biofilmes em placas de 24 poços ou placas de Petri

As sequências codificantes correspondentes aos genes H37Rv

projetado é desprovido das últimas 30 bases, incluindo o códon

Produção e purificação de proteínas

proteína foi incubada durante a noite a 4 ° C com protease 3C

As proteínas purificadas foram congeladas rapidamente em

Para a determinação da massa intacta, as proteínas foram

Para estudos iniciais de ligação a íons metálicos, a proteína foi

misturados a uma concentração final de 10 μM. Soluções de íons

A ligação do cobre foi estudada com mais profundidade usando

O efeito do íon cobre na estabilidade térmica

Ensaio de sensibilidade à digestão de tripsina

Ensaio de atividade ATPase

Para investigar o efeito dos íons metálicos na atividade ATPase,

Modelagem estrutural de GroEL1

GroEL1 aumenta a tolerância ao cobre durante

inibitória mínima (MIC) para CuCl foi idêntica (150-175 μM)

A cepa mutante exibe suscetibilidade a outros íons metálicos?

A região nativa rica em histidina afeta a

purificada por cromatografia de afinidade de metal imobilizado,

GroEL1 recombinante foi eluído em SEC como um único pico,

Interação GroEL1-cobre analisada por

Espectros nano-ESI nativos da variante GroEL1 e GroEL1ΔHis mostrando

GroEL2 deu resultados semelhantes aos da ligação do cobre ao

Abundância relativa dos diferentes adutos de proteína-Cu, conforme

O efeito do cobre no estado oligomérico da proteína GroEL1 de

O efeito do cobre na estabilidade térmica do

Ensaio de deslocamento térmico para analisar o efeito do cobre na

Ensaio de susceptibilidade à protease

sugere que mudanças conformacionais também podem ocorrer

Digestão limitada por tripsina de GroEL1 (A) e GroEL1ΔHis (B) na ausência

O cobre aumenta a atividade da GroEL1 ATPase

metálicos. M. tuberculosis GroEL1 e GroEL2 exibiram atividade

atividade recombinante de E. coli GroEL ATPase também foi

Atividade da proteína ATPase do M. tuberculosis GroEL. As reações

Atividade ATPase de 10 μM de proteínas GroEL de M. tuberculosis na

Modelo tridimensional GroEL1

Modelo 3D de GroEL1 representado como um desenho animado prateado

A proteína GroEL1 desempenha papéis importantes na

cobre é por um lado um cofator crítico para várias enzimas

Ansari et al. observaram resultados semelhantes usando cepas

metálico. Normalmente, os mecanismos de resistência do cobre

Como o GroEL1ΔHis recombinante é menos sujeito à degradação

terminal esteja envolvida na desestabilização de GroEL1, a

Curiosamente, Ansari et al. , também construiu um modelo 3D

É importante ressaltar que a atividade da GroEL1 ATPase é

C-terminal rica em histidina GroEL1 induz uma mudança

Aqui, propomos um novo papel para o M. tuberculosis GroEL1.

Os autores declaram não haver conflito de interesses com o Ver PDF

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo China