ANÁLISE FILOGENÉTICA
Tradicionalmente os estudos filogenéticos eram feitos a
partir de análises morfológicas e fisiológico dos organismos.
Porém com o sequenciamento massivo do DNA, os
caracteres utilizados nessa análise passaram a ser os
nucleotídeos ou os aminoácidos.
As mudanças moleculares ocorridas ao longo da evolução,
ficam registrados no DNA dos organismos, sendo possível
predizer as relações evolutivas a partir do estudo das suas
sequências.
 Uma importante aplicação é na epidemiologia, no
estudo evolutivos de patógenos.
Uma árvore filogenética é um diagrama que representa
relações evolutivas entre organismos.  muito mais precisa as relações entre os organismos.
PARTES DE UMA ARVORE FILOGENÉTICA
As árvores filogenéticas têm dois componentes principais:
relacionamentos de parentesco (que conhecemos como
topologia de árvore) e a quantidade de mudança
acumulada em cada ramo (que conhecemos como
comprimento de ramo). Os nós terminais representam as
espécies, grupos ou sequências em estudo e são todos
contemporâneos.
VANTAGENS DA FILOGENIA MOLECULAR
 Os dados obtidos no estudo de DNA ou proteínas são mais
apropriados que os dados morfológicos ou fisiológicos para
a construção de árvores filogenéticas. Isso ocorre por vários
motivos:
A. DNA e proteínas são entidades herdáveis, o que não é o
caso de todas as características morfológicas.
B. A descrição das características moleculares é inequívoca,
pois elas podem ser "mais ou menos grandes" ou "um
pouco mais altas". Em uma proteína, a posição 23 pode ser
ocupada por uma metionina e em outra proteína por
leucina, e isso não está sujeito a nenhum tipo de
interpretação.
C. As moléculas geralmente evoluem de uma maneira
muito mais regular do que as características morfológicas
ou fisiológicas e isso nos permite deduzir de uma maneira
D. Os dados das biomoléculas são muito mais
matematicamente gerenciáveis e isso facilita a criação de
algoritmos que ajudam a resolver problemas filogenéticos.
E. A detecção de homologia é muito mais fácil a partir de
dados moleculares do que características morfológicas.
F. Os dados moleculares permitem avaliar as relações
evolutivas entre organismos muito distantes entre si, que
não possuem mais apenas características morfológicas que
permitem essa avaliação.
G. Os dados moleculares são muito mais abundantes. Isso
permite o estudo filogenético de grupos como bactérias ou
fungos, que não apresentam características morfológicas
facilmente distinguíveis.
FILOGENIA
Filogenia é uma hipótese acerca das relações de parentesco
entre os seres vivos. ◦ Filogenias são representadas através
de árvores filogenéticas.
1) A raiz da árvore representa a linhagem ancestral, e as
pontas das ramificações representam os descendentes
desse ancestral. Conforme você avança da raiz para as
pontas, você está avançando no tempo.
2) Quando uma linhagem se divide (especiação –
representada por um nó na árvore), é representada como
uma ramificação na filogenia. Quando um evento de
especiação ocorre, uma única linhagem ancestral dá origem
a duas ou mais linhagens filhas.
4) De forma semelhante, cada linhagem tem ancestrais que
são únicos para aquela linhagem e ancestrais que são
partilhados com outras – ancestrais comuns.
TIPOS DE ARVORES FLOGENÉTICAS
Cladograma: Arvore não escalonada. O comprimento dos
ramos não tem nenhum significado evolutivo.
Filograma: Arvore escalonada. O tamanho comprimento
dos ramos é proporcional a diferença evolutiva. São
indicativos geralmente de mudanças acumuladas com o
tempo. Conhecida também como arvore aditiva, já que a
distância entre as espécies se calcula somando o
comprimento dos ramos que as conectam com um
ancestral comum.
Árvore Ultra-métrica: pode ser construída a partir da
anterior. Os nós externos se encontram alinhados. Os
ramos são aditivos seguindo a hipótese do relógio
molecular.
ÁRVORES EQUIVALENTES  Árvores equivalentes mantêm
a mesma topologia (elas são semelhantes) apesar de
rotacionar um ou mais de seus nós internos.
ÁRVORES SEM RAIZ (ÁRVORES NÃO RAITADAS) Uma
árvore sem raiz agrupa e conecta táxons,
independentemente da ordem temporal na qual os grupos
se separam evolutivamente. Ou seja, nos fornece
informações sobre as relações evolutivas entre as várias
sequências ou espécies, mas sem especificar o ancestral
comum de todas elas ou a ordem temporal em que as
várias ramificações ocorreram. O comprimento de cada
ramo é proporcional à distância evolutiva interna.
UTILIDADES DAS ÁRVORES FLOGENÉTICAS
Existem muitos benefícios das árvores filogenéticas, mas
vamos destacar duas delas em que a bioinformática pode
desempenhar um papel fundamental.
Descubra a relação de um organismo de estudo com
outros já conhecidos. Por exemplo, se você estiver
estudando uma nova espécie de fungo unicelular, poderá
sequenciar seu RNA ribossômico e compará-lo com outras
sequências conhecidas de RNA ribossômico fúngico. Isso
nos dará uma boa idéia da posição de nosso organismo
problemático na história evolutiva.
Determine a função de um gene. Se estivermos estudando
um gene com função desconhecida, podemos usar árvores
filogenéticas para localizar outros genes ortólogos bem
caracterizados no nosso, e assim seremos capazes de inferir
a função do nosso gene problemático.
CONSTRUÇÃO DE ÁRVORES FLOGENÉTICAS
Para construir uma árvore filogenética a partir de dados
moleculares, é essencial seguir estas etapas.
1. ESCOLHA O TIPO DE SEQUÊNCIA.
2. FAÇA UM MSA BEM FEITO.
3. ESCOLHA O MODELO DE EVOLUÇÃO OU
SUBSTITUIÇÃO.
4. ESCOLHA O MÉTODO DE CONSTRUÇÃO DA
ÁRVORE.
5. AVALIE A CONFIABILIDADE DA ÁRVORE.
Além disso, é necessário assumir algumas premissas:
As sequências utilizadas devem ser homólogas, ou seja,
devem ter uma origem comum.
Os ramos devem se ramificar apenas em dois ramos filhos
(dicotomia). Multibifurcação ou politomia podem ocorrer
em processos de radiação adaptativa.
Cada nucleotídeo ou aminoácido em uma sequência evolui
independentemente.
TIPO DE SEQUÊNCIA
Podemos usar uma seqüência de DNA ou proteína.
Não é o mesmo, já que o código genético é degenerado, ou
seja, alterações nos nucleotídeos não implicam
necessariamente alterações nos aminoácidos.
Sabe-se que o uso de proteínas tem mais vantagens na
realização do MSA.
Ocasionalmente, sequências nucleotídicas podem ser
usadas em sequências mais relacionadas, onde a maior taxa
de alteração nesse tipo de sequência pode ser uma
vantagem.
ALINHAMENTO MÚLTIPLO (MSA)
É a parte mais importante do processo.
Alinhamentos incorretos provavelmente levarão a árvores
filogenéticas incorretas.
Podemos usar vários programas para o mesmo
alinhamento e comparar os resultados.
As posições ambíguas dos alinhamentos podem ser
eliminadas a critério do pesquisador.
Já vimos o uso de alguns programas para realizar MSAs,
como o T-Coffee.
MODELO DE SUBSTITUIÇÃO OU EVOLUÇÃO
O número observado de substituições pode não
representar os verdadeiros eventos evolutivos que
realmente ocorreram. Quando uma mutação é vista como
A substituída por C, o nucleotídeo pode realmente ter
passado por várias etapas intermediárias para se tornar C,
como A → T → G → C. Da mesma forma, uma mutação
poderia ter ocorrido quando um nucleotídeo mutado se
revertia. para o nucleotídeo original. Isso significa que,
quando o mesmo nucleotídeo é observado, mutações como
G → C → G podem realmente ter ocorrido. Além disso, um
nucleotídeo idêntico no alinhamento pode ser devido a
mutações paralelas quando as duas sequências se mutam
em T, por exemplo. Tais substituições múltiplas e
convergência em posições individuais obscurecem a
estimativa de distâncias evolutivas verdadeiras entre
sequências. Esse efeito é conhecido como HOMOPLASIA,
que, se não for corrigido, pode levar à geração de árvores
incorretas. Para corrigir a homoplasia, são necessários
modelos estatísticos para inferir as verdadeiras distâncias
evolutivas entre as sequências.
O número observado de mutações pode não representar o
número real de alterações que ocorreram.
Para corrigir a homoplasia, existem vários modelos,
chamados evolução ou substituição. Entre os mais
utilizados estão:
 Modelo de Jukes-Cantor: Suponha que todos os
nucleotídeos sejam substituídos com igual
probabilidade. [Assume que todos os nucleotídeos
têm a mesma probabilidade de mudar para
qualquer um dos outros nucleotídeos]
 Modelo de Kimura: Suponha que as transições
ocorram com mais frequência que as transversões,
o que é mais realista.[ Assume taxas diferentes
entre transições (A-G, C-T) e transversões (A-C, A-
T, C-G, G-T).]
ALGORITMOS DE CONSTRUÇÃO DE ÁRVORES
FLOGENÉTICAS
MÉTODOS BASEADOS EM DISTÂNCIA: Eles são baseados na
distância entre sequências. Uma medida simples da
distância ou divergência entre duas sequências é contar o
número de substituições observadas em um alinhamento. A
taxa de substituição define a distância entre as duas
sequências. Esse valor também é conhecido como número
de Hammer.
P (distância) = n / N
onde n é o número observado de substituições e N é o
comprimento da sequência;
Esse valor geralmente é corrigido usando métodos
diferentes, alguns dos quais vimos no ponto anterior. Com
as distâncias entre pares de sequências já calculadas,
matrizes de distâncias são construídas entre todas as
sequências. Eles usam apenas o modelo evolutivo para
calcular as distâncias e, posteriormente, usam métodos
diferentes para agrupar as sequências. Eles não são
excessivamente precisos, mas são relativamente fáceis de
construir e computacionalmente rápidos.
UPGMA
(Unweigthed Pair Group Method using arithmetic
Averages) Pair Group Method using arithmetic Averages)
UPGMA: A árvore é construída a partir do par de
sequências mais semelhante e adiciona sequências
posteriormente. Suponha que todos os táxons tenham a
mesma taxa de evolução (Relógio Molecular, o que
raramente acontece). Amplamente utilizado na educação.
Vantagens e desvantagens:Quando os dados cumprem a
proposta do algoritmo, o resultado fornece uma árvore
filogenética ótima • É um método rápido • A desvantagem
principal é que para dados reais, raramente se cumpre a
propriedade ultra-métrica.
 Gera uma arvore sem raiz
NEIGHBOUR JOINING
Neighbour Joining (NJ): A árvore é construída da mesma
forma que a anterior, mas a corrige assumindo diferentes
taxas de evolução que calcula através de diferentes
fórmulas matemáticas.
Vantagens e desvantagens:• Método simples e muito
rápido; • Pode ser aplicado em bases de dados muito
extensas. • Não considera os dados originais, apenas as
distancias.
 Gera uma arvore com raiz
FITCH-MARGOLIASH
Fitch-Margoliash (FM): compara todas as topologias
possíveis e escolhe a que melhor se ajusta à matriz de
distância. É mais preciso que os anteriores, mas muito caro
em termos de computação (não é viável em mais de 12
sequências)
MÉTODOS BASEADOS EM Caracteres Eles usam
diretamente o MSA, portanto, levam em consideração as
informações de resíduos específicos. Eles comparam cada
resíduo (aminoácido ou nucleotídeo) em cada coluna do
alinhamento. Eles usam o modelo evolutivo ao longo do
processo. Esses métodos permitem a construção de árvores
muito realistas, mas são exigentes computacionalmente.
MÁXIMA PARSIMONIA (MP)
Máxima Parsimonia (MP): A árvore com o menor número
de alterações evolutivas ou menor comprimento de ramo
em geral é um bom candidato para ser o correto. A
construção da árvore com esse método é realizada através
da pesquisa entre todas as possíveis topologias de árvore,
optando pela que requer o número mínimo de alterações
nas sequências.
•No alinhamento utiliza somente os sítios informativos
•funciona melhor com o relógio molecular •Busca
heurística •busca branch & bound •Busca exaustiva
 Vantagens – Método com premissas simples; – Deve
resultar em dados confiáveis: – Homoplasia e substituições
múltiplas forem raras ou distribuídas aleatoriamente na
topologia. – Amostragem densa.
 Desvantagens – Pode levar a resultados errados se
homoplasia for comum ou concentrada em partes
específicas da árvore. Exemplo: – Desvio de composição de
bases; – Atração de ramos longos. Mais de uma linhagem
acumulando substituições em velocidade diferente das
demais linhagens. – Exige muito esforço computacional
(Tempo).
MÁXIMO VEROSSIMILHANÇA
Máximo verossimilhança (ML): Baseia-se em modelos
probabilísticos. Talvez seja o método mais preciso de todos,
exceto o impossível de usar com um grande número de
táxons.
– O processo de substituição segue um modelo
probabilístico onde a expressão matemática, mas não os
valores dos parâmetros são conhecidos a priori. – Os sítios
evoluem independentemente – Todos os sítios seguem o
mesmo processo de substituição – As probabilidades de
substituição não mudam com o tempo (elas podem variar
entre os ramos)
Vantagens: - Utiliza todos os sítios; - É o melhor modelo de MEGA: Programa muito completo para a análise
um ponto de vista teórico; - Permite considerar modelo filogenética de sequências de DNA e proteínas. Baixe para
evolutivo específico; - Estimativa acurada dos tamanhos de Windows, Mac e Linux.
ramo (substituições/ sítio) mesmo quando ocorre
substituições múltiplas; - Menos sensível a atração de
ramos longos se o modelo for adequado.

Desvantagens: - Valores dos parâmetros são estimados e

fixados a partir dos dados e podem não refletir
adequadamente as taxas naturais de substituição e
frequências se a amostragem não for significativa; -
Praticamente impossível avaliar todas as possíveis árvores,
é feita uma exploração parcial das árvores. - Exige muito
esforço computacional (Tempo).

USANDO SOFTWARE
AVALIAÇÃO DA CONFIABILIDADE
Após a construção da árvore filogenética, o último passo é MEGA
avaliar sua confiabilidade. Existem várias técnicas SITE: https://www.megasoftware.net/show_eua
estatísticas para realizar essa avaliação, e uma delas é
chamada BOOTSTRAPPING. Essa técnica produz Vamos usar o programa MEGA X;
repetidamente novas árvores a partir dos dados originais,
mas adicionando pequenos erros aleatoriamente. O O primeiro passo é obter um arquivo que pode ser
método baseia-se no fato de que, se a topologia da nossa principalmente Fasta com todas as sequências que serão
árvore original for forte o suficiente, ela poderá utilizado. Então essas sequências serão submetidas a um
permanecer constante, apesar das pequenas alterações alinhamento múltiplo de sequências.
inferidas nos dados; se for menos confiável, as
modificações introduzidas podem gerar árvores diferentes,
variando as partes menos confiáveis. O modelo cria uma
árvore de consenso com todas as árvores obtidas,
indicando a confiabilidade de cada um dos ramos.

 O valor de bootstrap representa número de vezes

que o agrupamento ocorreu nas replicações.

O ideal é fazer 1000 ou mais replicatas

Um agrupamento tem um bom suporte se ocorreu em

mais de 80% das árvores (idealmente em mais de 95%)

Pode ser chamado de nível de confiança da ocorrência para

um determinado clado (agrupamento)

Não avalia a exatidão de uma árvore, somente indica a 1) Clica em Align, e em Edit/build alingnment, e
consistência e estabilidade de clados individuais. adiciona o arquivo FASTA clicando na figura da
pastinha.
SOFTWARE
SIMPLE PHYLOGENY: Ferramenta gratuita e online.
Pertence ao EBI.

PHYLEMON 2: Kit de ferramentas da Web para evolução

molecular e filogenia.

PHYLIP: É um pacote gratuito de programas para inferir

filogenias. Baixe para Windows, Mac e Linux.
 Clicando na nessa primeira opção, tradicional e retangular,
podemos ver a distância evolutivas entre as sequências.

Para efetuar o alinhamento, clicar na figura do muque

(MUSCLE ALIGN) Clicando em percentagem

Vemos então o alinhamento e as coincidência entre os

aminoácidos alinhados representados por um * e pelas
cores características.

OBS: (poderia também ter usado CLUSTAL W, apertando no

W) Nessa opção podemos avaliar a quantidade de diferenças
acumuladas com o passar do tempo, em cada ramo da
 Agora precisamos salvar o alinhamento que arvore.
fizemos, em formato MEGA. Para isto, clicamos
Data, seguido de Export Alignment, e seleciona o
formato MEGA. (Então fechamos esta aba que já
está salva).

2) Para começar vamos abrir o alinhamento que

salvamos, clicando em DATA, seguido de open file.

Desmarcando esta opção selecionada, podemos avalizar a

distancias entre os ramos da arvore.

 Vamos até PHYLOGENY para executar o arvore
filogenética, e selecionar contruct/Test maximum
parsimony tree.
----------------------------------------x---------------------------------
USANDO SOFTWARE
CLUSTAL OMEGA  SIMPLE PHYLOGENY

SITE: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

Programa: Clustal ômega  Simple Phylogeny

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
 Em result sumary podemos acessar a matriz de distância
(Distance Matrix)

Em option vamos selecionar: Distance matrix, UPGMA e

(PIM-- ON) e distance correction --ON

Fornece primeiro esta arvore com raiz(ou seja um Percent identity matriz, podendo comprar a similaridade
cladograma) entre as sequências

Nas duas matrizes a leitura consistem em: Cada linha

corresponde a uma sequência, assim como cada coluna
corresponde as mesmas sequenciais listas em cada linha.
Cruzando linha e coluna descobrimos o valor
correspondente, seja de distância ou de identidade.

Na opção Real vemos um filograma, os diferentes

comprimentos dos ramos, e ao final de carda espécie,
aparece a distância do ramo terminal