Cuticular Hydrocarbons Rather Than Peptides Are Responsible for Nestmate Recognition

in Polistes dominulus

Extração e separação de frações epicuticulares

Cada vespa utilizada para análises químicas e bioensaios foi colocada individualmente em um
frasco de vidro de 2 mL contendo 600 lL de mistura de n-pentano: água (1: 1, v: v) por 15 min.
O corpo era em seguida, removido do frasco e as 2 frações separadas, pentano na parte superior
e água na parte inferior foram retirados com a ajuda de uma micropipeta e uma microsseringa,
respectivamente, e colocadas em 2 frascos diferentes após várias diluições etapas (para o
protocolo de extração completo, consulte Material Suplementar). As 2 alíquotas, fração de
pentano contendo CHCs e fração de água contendo peptídeos cuticulares (CPs), foram
verificados quanto à pureza por meio de cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de
massa (GC-MS) e tempo de voo por ionização de dessorção com laser assistido por matriz
(MALDITOF), respectivamente (para obter detalhes sobre o análises químicas, consulte
Material Suplementar). Essa extração simultânea de cada vespa nos permitiu obter 2 alíquotas:
pentano com CHCs puros e água com CP puro.

Properties of the cuticular proteins of Anopheles gambiae as revealed by serial extraction

of adults

Extração serial de proteínas Três réplicas biológicas de extração de proteína em série (lotes 1–
3) foram realizadas. Congeladas A. gambiae adultos de ambos os sexos (n = 1100–1500) foram
pulverizados em nitrogênio líquido com argamassa e pilão. O pó de tecido foi transferido para
uma centrífuga Beckman autoclavada de 40 mL tubo, primeiro lavamos o pó de tecido três
vezes com tetraborato de potássio a 1% (p / v) solução contendo 1% de ácido ascórbico (pH 7,7)
e 0,5% de Triton X-100. Tetraborato de potássio solução pode dissolver ou amolecer a maior
parte do material não cuticular na cutícula, proteger os difenóis contra a oxidação e, portanto,
tem sido usada para preparar amostras enriquecidas em cutícula de vários insetos (ver H1). A
extração em série começou com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) seguido
por 0,1 M Soluções de ureia EDTA, 2 M, 4 M e 8 M. O antibiótico gentamicina (25 μg / mL)
foi adicionado a as soluções de tetraborato de potássio e PBS para impedir o crescimento
bacteriano. O EDTA e a ureia as soluções foram feitas em PBS. O tamponamento por PBS foi
insuficiente para controlar o pH que era 0,4 unidades maiores na uréia 8M do que na 2M
(Tabela 1). Extrações em série foram realizadas duas vezes para PBS, EDTA e as soluções de
ureia. Os tubos foram agitados vigorosamente com um Orbit Shaker (Lab Line) em uma câmara
fria de 6˚C e, em seguida, centrifugados à temperatura ambiente em uma centrífuga Beckman
J2-21 com um rotor JA-20 (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, Califórnia) a 18K RPM
(39.000 xG) por 10 min. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, uma nova solução
adicionada e o sedimento foi disperso completamente usando um Ultra-turrax (Janke & Kunkel
IKA-WERK) equipado com lâminas. A duração e o volume de cada extrato são mostrados na
Tabela 1. Antes de cada mudança para uma nova solução, o pellet foi rapidamente lavado duas
vezes com a mesma solução, seguindo o mesmo protocolo de dispersão e centrifugação. O
sedimento após tratamento com ureia 8M foi incubado com 5 mL 1% SDS contendo 50 mM
ditiotreitol (DTT) em um banho de água fervente por 20 min (repetido 3 vezes). O pellet final
foi lavado 3 vezes em 3 mL de ddH2O e armazenado a -20˚C, junto com todos os extratos e
lavagens anteriores.