Biologia Molecular Da Transformação Malígna

1.
Departamento de Bioquímica
Curso Prático:
Biologia Molecular da Transformação Maligna
Organizado por:
Profa. Dra Mari Cleide Sogayar
Ana Paula G. Hasegawa

Antero F. A. Macedo
Christian Colin
Cleber Giovane Vedoy
Diana Noronha Nunes
Fernada Festa
Fernanda Ortis
Fernando Henrique Lojudice
Karin Krogh
Katlin Brauer Massirer
Leonardo de O. Rodrigues
Lúcia Helena S. Carvalho
Luciana Oliveira Cruz
Marcos Angelo A. Demasi
Mário Henrique Bengtson
Rita de Cássia Sávio Figueira
Sheila Maria Brochado
Theri Leica Degaki
Wagner Ricardo Montor
APOIO-PARCERIA
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – EMPRESAS
--Departamento de Bioquímica
CICLO DE SEMINÁRIOS –– JUNHO/2002
Biologia Molecular da Transformação Maligna (QBQ 5717)
INSTITUTO DE QUÍMICA DA USP (Anfiteatro-Bloco 6 Superior)
DIA NOME (Filiação) TEMA

7 Dra. Anamaria Camargo A identificação de genes humanos através da
(Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o utilização de seqüências expressas (ESTs).
Câncer-SP)
anamaria@compbio.ludwig.org.br
10 Dra. Luciana Chiarini Neuroproteção mediada pela proteína príon
(Instituto de Biofísica – UFRJ) celular.
chiarini@biof.ufrj.br
11 Dra. Telma Schwindt Precursores neurais e "Stem Cells"
(University of Wisconsin, Madison, EUA)
Profa. Dra. Maria Lucia Zaidan Dagli Regeneração hepática e hepatocarcinogênese
(Fac. Medic. Veter. E Zootecn. – USP) em camundongos transgênicos que
mlzdagli@usp.br expressam um mutante da conexina 32
somente em fígado.
12 Dr. Mário Henrique Bengtson Caracterização celular e molecular dos efeitos
(Instituto de Química-USP) do ácido retinóico sobre as células ST1 de
bengtson@iq.usp.br glioma de rato
14 Ricardo Fontes Estudos pré-clínicos para terapia gênica do
(Gene Transfer Lab- Depto. Biologia Tecidual glioblastoma.
– ICB-USP)
ecostanzi@usp.br
17 Prof. Dr. Sandro Valentini
(FCF-UNESP-Araraquara) EIF5A e o metabolismo de RNA.
valentsr@fcfar.unesp.br
18 Mário Pradal e João Marcos Mercado Teste de seqüenciamento da 21-hidroxilase
(CRIESP) Cristalino – catarata congênita
jmarcos@altavista.com
19 Sheila Maria Brochado Regulação transcricional do gene supressor
(Instituto de Química-USP) de metástase RECK pelo produto do
sheimary@iq.usp.br oncogene c-myc.
21 Beatriz Astolfi Identificação de marcadores moleculares
(Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o para o câncer de tireóide utilizando DNA
Câncer-SP) “microarrays”
biastolf@ludwig.org.br
24 Dr. Alysson Muotri Reparo de DNA e a correção genética de
(Depto. Microbiol. ICB-USP) células deficientes através de adenovirus
armuotri@usp.br recombinantes.
25 Profa. Dra. Ligia da Veiga Pereira
lpereira@usp.br Análise funcional de genes in vivo e
e Luciana dos Reis Vasques lureis@usp.br in vitro.
(Depto. de Biologia IB-USP)
26 Dra. Maria Leonor Oliveira Uso de bactérias para produção de proteínas
(Instituto Butantan) de interesse biotecnológico e vacinas.
leosarno@hotmail.com
Local: Anfiteatro A do Instituto de Química da Universidade de São Paulo

Bloco 6 superior
Horário: 17:00h (a não ser no dia 11, no qual o seminário da Dra. Telma
Schwindt será realizado as 11:30h)
CERTIFICADO DE PARTICIÇÃO: no Ciclo de Seminários será fornecido para

aqueles que tiverem freqüência igual ou maior que 75%
CAPA:
Fotomicrografia, em microscópio de contraste de fase, de células ST1 (derivada da linhagem

C6 de glioma de rato), crescendo em substrato sólido.
CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES:
SEXTA-FEIRA
07/06
• Apresentação dos
membros do
grupo e dos
alunos
• Introdução - MARI
SEGUNDA-FEIRA TERÇA-FEIRA QUARTA-FEIRA QUINTA-FEIRA SEXTA-FEIRA SÁBADO
10/06 11/06 12/06 13/06 14/06 15/06

• Plaqueamento • Infecção viral • Troca do meio • Preparo de • Imunofluorescência • Miniprep
dos Exp. 01, 02, • 1° pto curva de (infecção, bactérias • Cultura celular • 3° pto curva de
03, 04, 06, 07 crescimento transfecção) competentes • Subdivisão da crescimento
• Injetar • Transfecção • Adição de H2O2 • Coleta da transfecção • Gradiente de
camundongo • Cultura celular • Purificação do transfecção • Inóculo de CsCl
• Seminário-Telma inserto e preparo transitória bactéria • Cultura celular
• Digestão de do vetor para • Transferência, • Camundongo
plasmídeo ligação lavagem e
• Lise de RNA e • Cultura celular revelação do
• Coleta do RNA e Western
preparo do
absorbância • Transformação
colchão de CsCl
para • Lise do Western de bactérias e
ultracentrífuga • Aplicação do plaqueamento
(overnight) Western • Cultura celular
• Inóculo para • 2° pto curva de
bactéria crescimento
competente
17/06 18/06 19/06 20/06 21/06 22/06

• Corar eficiência • Band Shift – • IP – beads, • Northern blot e • Adição de fatores • Lavagem das
de plaqueamento marcação de aplicação no gel, Southern blot de crescimento membranas de
• Análise dos sonda, ligação, exposição • Demonstração • Contagem e Northern e
dados gel e exposição • Revelar Band Dot Blot e Array análise da curva Southern
• 4° pto curva de • IP – marcação Shift de crescimento • Lise e contagem
crescimento metabólica, lise e • Camundongo • Cultura celular de timidina
• Cultura celular contagem • RT/PCR • Pré-hibridização • Cariótipo
• Lise e gel para • Camundongo • 5° pto curva de e marcação de • Congelamento de
Band Shift • Incubação Ac-IP crescimento sonda para células
• Leitura de • Seminário- Northern e
luciferase Amersham Southern
• Coleta do Biosciences • Análise do Exp 6
gradiente de e7
CsCl • Seminário de
Bioinformática
• Adição de
timidina
24/06 25/06 26/06 27/06 28/06 29/06

• Revelação de • Resultado do • Clonagem celular • IP – revelação e
Northern e seqüenciamento • Análise dos análise de dados
Southern e Análises de dados - • Seminário dos
• Camundongo dados Transfecção e alunos
• Descongelament • Seminário de Infecção
o de células bioinformática • Seminário dos
• Seqüenciamento • Seminário dos alunos
Automático alunos
Índice
PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 2002..................................................................................................1
AGRADECIMENTOS.......................................................................................................................3
PREFÁCIO (EDIÇÕES DE 1986 E1990)........................................................................................7
ABREVIATURAS..............................................................................................................................8
CONCEITOS BÁSICOS UTILIZADOS.........................................................................................9
TÉCNICAS BÁSICAS INTRODUZIDAS.....................................................................................10
LINKS RECOMENDADOS............................................................................................................17
NORMAS DE PROCEDIMENTO PARA A SALA ESTÉRIL...................................................19
NORMAS MÍNIMAS PARA MANIPULAR DNA RECOMBINANTE (DNAR).....................19
INTRODUÇÃO................................................................................................................................20
EXP. 1 -CURVAS DE CRESCIMENTO.......................................................................................22
EXP. 2 -EFICIÊNCIA DE PLAQUEAMENTO EM SUBSTRATO SÓLIDO..........................24
EXP. 3 -SUBCULTURA..................................................................................................................26
EXP. 4 -TRANSFECÇÃO MEDIADA POR DNA........................................................................28
EXP. 5 -CARIÓTIPO DE BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO (BANDA G).....................35
EXP. 6 -CURVAS DE SOBREVIVÊNCIA....................................................................................39
EXP. 7 -CRESCIMENTO EM SUSPENSÃO DE AGAROSE....................................................40
EXP. 8 -ENSAIO DE ATIVIDADE MITOGÊNICA DE FATORES DE CRESCIMENTO ..42
EXP. 9 -TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS BALB-C/3T3 (CLONE A31) COM VÍRUS DE

SARCOMA MURINO (MSV).........................................................................................................44
ENSAIO DE FOCO DE TRANSFORMAÇÃO.............................................................................44

EXP. 10 -IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA .....................................................................45
EXP. 11 -OBTENÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM

DNA PLASMIDEAL........................................................................................................................49
EXP. 12 -PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDEAL EM PEQUENA ESCALA ("MINI-

PREP")..............................................................................................................................................52
EXP. 13 -PURIFICAÇÃO EM LARGA ESCALA DE DNA PLASMIDEAL EM

GRADIENTE DE CLORETO DE CÉSIO....................................................................................53
EXP. 14 -RESTRIÇÃO E DIAGNÓSTICO DO DNA PLASMIDEAL......................................54
EXP. 15 -SUBCLONAGEM OU CLONAGEM MOLECULAR EM VETORES

PLASMIDIAIS.................................................................................................................................56
EXP. 16 -SEQUENCIAMENTO DE DNA.....................................................................................60
..........................................................................................................................................................68
EXP. 17 - EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA CELULAR. ...............................69
EXP. 18 - FRACIONAMENTO DE DNA CELULAR EM GEL DE AGAROSE (SOUTHERN

BLOT) ...............................................................................................................................................71
EXP. 19 - AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS...........................................................72
EXP. 20 - DOT/SLOT BLOT..........................................................................................................79
EXP. 21 - MACROMATRIZES DE CDNA...................................................................................80
EXP. 22 - FRACIONAMENTO DE RNA EM GEL DE AGAROSE -FORMALDEÍDO

(NORTHERN BLOT)......................................................................................................................83
EXP. 23 - PREPARAÇÃO DE SONDA DE DNA.........................................................................86
EXP. 24 - HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR.................................................................................90
EXP. 25 - IMUNOPRECIPITAÇÃO .............................................................................................93
EXP. 26 - WESTERN-BLOT ........................................................................................................98
EXP. 27 - ENSAIO DE MOBILIDADE ELETROFORÉTICA EM GEL DE

POLIACRILAMIDA (EMSA)......................................................................................................103
APÊNDICE.....................................................................................................................................107

PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 2002
Dezesseis anos já se passaram desde que este curso foi oferecido pela
primeira vez – muitos dos alunos que por ele passaram já tem seus próprios
grupos de pesquisa e alguns já oferecem cursos semelhantes em suas próprias
Instituições de origem, o que é extremamente gratificante.
Quando este curso foi oferecido pela primeira vez (em 1986), mesmo
sem ter um laboratório próprio, nosso grupo, composto, na época, por 4 ou 5
pós-graduandos, se aventurou a compartilhar seus conhecimentos com um
pequeno número de alunos (12), uma experiência que se mostrou válida e
multiplicadora.
Em contraste, em 2002, nossa equipe consiste de mais de 30 pessoas,
distribuídas em 2 laboratórios diferentes: o Laboratório de Biologia Celular e
Molecular e a Unidade de Ilhotas Pancreáticas Humanas. Graças ao tamanho e
à qualidade desta equipe, tornou-se possível propor, pela primeira vez,
ampliar, significativamente, o número de beneficiários deste curso, permitindo
que aceitássemos mais de 50 alunos, entre pós-graduandos e pós-
doutorandos.
Uma parte destes alunos busca o cumprimento de exigências de
créditos em disciplinas de Pós-graduação, mas a grande maioria vem buscar
adestramento conceitual e técnico para se tornarem mais habilitados para a
resolução de problemas em seus ramos de atuação – esperamos poder
instrumentá-los para isto. Apesar de não dispormos de financiamento
específico para viagens e estadía, estaremos recebendo alunos do interior de
São Paulo (Ribeirão Preto) e de outros Estados (Distrito Federal, Rio Grande do
Sul).
Para viabilizar um curso prático para um número tão grande de alunos,
foi fundamental o apoio do Departamento de Bioquímica e da Comissão de
Gerenciamento do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM) do
IQ-USP, que cederam o espaço e os serviços das Técnicas do LBBM (Elaine
Palmezan, Priscilla E. Ávila e Maria Ferreira Lima) para esta finalidade e, ainda,
do apoio financeiro oferecido pela Comissão de Pós-graduação do IQ.
Como sempre, a parceria com o setor empresarial foi extremamente
importante para o curso de 2002, uma vez que inúmeras empresas
fornecedoras de materiais e equipamentos de laboratório, contribuiram, das
mais diversas maneiras, através de doação de materiais e reagentes,
empréstimo de equipamentos e patrocínio de lanchinhos, que são
fundamentais para amenizar o extenso cronograma do curso.
Aos membros do nosso laboratório que se envolveram - de corpo e
alma - nesta iniciativa, dedico meus melhores agradecimentos e
reconhecimento por terem ACREDITADO e embarcado nesta aventura. Coube a
eles revisar todos os protocolos, acrescentar novos experimentos, adequando-
os à realidade atual e aos desafios impostos pela era Genômica, Proteômica e
Pós-genômica.
Biologia Molecular da Transformação Maligna -1-

O trabalho silencioso, competente e entusiasmado do corpo Técnico do
nosso laboratório (Zizi de Mendonça, Sandra Regina de Souza, Irenice de Cairo
Silva, Débora Cristina da Costa, Luciana de Oliveira Cruz, Tatiana Caroline
Corrêa, Katlin Brauer Massirer e Helena Medeiros Fonseca Ribeiro) garantiu
não só o suprimento de todos os materiais, soluções e reagentes que serão
utilizados no curso, mas, também, a disponibilidade de competências
específicas em diversas áreas, que vão desde a Cultura de Células até a
Bioinformática.
A promessa feita no curso de 1998, de disponibilizar este Manual na
Internet, deverá ser cumprida no desenrolar de 2002, esperando-se que os
efeitos multiplicadores deste curso se esparramem pelo Brasil afóra e
contribuam, de alguma maneira, para acelerar o desenvolvimento científico-
tecnológico do nosso país.

AGRADECIMENTOS
Equipe do Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) – particularmente

aos Monitores (listados na página-título) e Técnicos (listados no Prefácio).
Agências Financiadoras: FAPESP, CNPq, FINEP e ICGEB, que garantiram os

Auxílios aos projetos de pesquisa e às iniciativas educacionais do LBCM.
Instituições:
Instituto de Química –Universidade de São Paulo, Departamento de

Bioquímica, Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular.
Pró-Reitorias de Pós-graduação e de Pesquisa da USP.
Empresas fornecedoras de materiais e equipamentos de laboratório, que

apoiaram este curso: Amersham Biosciences, Ambriex, Applied Biosystems,
Baumer, Biobrás, BioResearch, Braslab, Ciambarella, CRIESP, Eppendorf,
Imprint, Labtrade, Láctea, Mobio Laboratories. Inc, Olicopy, SBBq, SELLEX,
Sinapse e Uniscience.

Pela quinta vez, em 12 anos, nosso Laboratório de Biologia Celular e

Molecular está oferecendo o Curso Prático/Workshop de “Biologia Molecular da
Transformação Maiígna” (QBQ 5811).
Pela primeira vez, este treinamento está sendo oferecido a pesquisadores
de todo o país, graças ao apoio do PADCT-SBIOIII-CAPES - um programa do
governo federal (Ministérios da Ciência e Tecnologia e Ministério da Educação)
que visa incentivar a geração de recursos humanos qualificados, através do
financiamento de auxílios, bolsas e cursos.
Em outras ocasiões tivemos a oportunidade de oferecer treinamento a
alguns alunos de outros Estados, financiando passagens e estadía graças ao
apoio do setor empresarial (LabTrade, GIBCO-BRL LifeTechnologies, BIOBRÁS
Bioquímica do Brasil Ltda. e Cultilab Materiais para Cultura de Células Ltda.)
mas é muito gratificante verificar que uma agência federal reconheceu o
alcance desta iniciativa.
Neste ano estamos contando, também, com o apoio do setor privado na
forma de doação de alguns materiais e equipamentos, demonstrações e
palestras, numa parceria importante e essencial para aumentar a inserção do
país no cenário global de Ciência e Tecnologia.
Desde a primeira vez que foi oferecido (1986), este Workshop se
caracteriza pelo fato de ser uma experiência coletiva, que só acontece porque
a equipe compartilha valores e crenças e porque consegue transcender seus
interesses individuais mais imediatos.
O retorno de cursos anteriores tem sido extremamente gratificante –
inúmeros laboratórios foram montados por ex-alunos, na área de Biologia
Celular e Molecular, em diversas Instituições; muitas colaborações foram
montadas entre participantes destes cursos, muitos grupos de pesquisa têm se
beneficiado do Manual do Curso, o qual tem sido atualizado e divulgado
amplamente. Espera-se, daqui para a frente, divulgação e intercâmbio ainda
maiores, graças a disponibilidade da Rede/Internet. Para os interessados, o
Departamento de Bioquímica está em vias de lançar sua Homepage. Quem
sabe, no futuro, se possa colocar o Manual deste curso na rede também.

Este Curso Decenial de “Biologia Molecular da Transformação Malígna”

nasceu, como idéia em 1979, quando tive a oportunidade de participar de um
dos famosos Cold Spring Harbor Summer Courses (The Transformed Cell)
organizado pelo Dr. Richard Hynes, o descobridor da fibronectina (então
denominada de LETS - “large, external, transformation-sensitive protein”) que
era essencialmente um curso bastante abrangente de Cell Biology.
A vivência de oncogenes e toda a tecnologia de DNA recombinante que
permite a introdução de novos genes em células de mamíferos, propiciada por
um estágio no lab. do Dr. Chuck Stiles (Dana Farber Cancer Institute, Boston,
EUA), levou à instalação das técnicas no lab. do Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin
situado no Bloco 12 do IQ-USP e, à partir de 1989, no lab. situado no Bloco 9
superior do IQ, onde este curso acontece.
Com demanda crescente no Brasil para treinamento em Biologia Celular
e Molecular, montou-se um curso compacto (3 semanas) para oferecer
treinamento, em tempo real e modo “mãos na massa”, para indivíduos,
formados ou não, que tivessem grande potencial amplificador, ou seja, que
pudessem não só utilizar mas também transmitir generosamente os
conhecimentos adquiridos.
Ao completar seu primeiro (e ultimo?) decênio, cresce a expectativa de
ver novos cursos deste tipo sendo oferecidos por outros laboratórios. Posso
garantir que o esforço é inteiramente válido e gratificante mas não sei até
quando vai ser possível cooptar o pessoal do lab. para esta empreitada.
Na medida em que nos aproximamos do seqüenciamento do genoma
humano (Projeto Genoma Humano) e da terapia gênica de tumores e outras
doenças genéticas, precisamos estar preparados para o futuro, dispondo de
pessoal qualificado para não só implantar como também desenvolver
tecnologia de ponta que permita ao Brasil enfrentar o desafio de implementar o
desenvolvimento socio-econômico preservando os mais altos valores da
humanidade.

O que compele alguém a trabalhar na composição de um Manual como

este? Mais ainda: em face da existência de livros excelentes sobre técnicas e
conceitos de Biologia Celular e Molecular, para que serve mais um? É válido o
investimento?
A idéia que continua norteando este trabalho é poder dispor de um
volume que contenha as últimas informações necessárias para atacar
problemas biológicos relevantes, mesmo em condições materiais sub-ótimas.
Serve para organizar o trabalho dentro do laboratório. Parece estar sendo útil
para iniciar pesquisadores entusiasmados e comprometidos com a atividade
científica.
Em face da alta demanda por Workshops como este, aqui vai uma
tentativa de aprimorar as versões anteriores (1986 e 1990).
A gratificação por este esforço tem sido generosa e multiforme. O apoio
incondicional oferecido por pessoas (algumas das quais anônimas), Instituições
(em particular a Comissão de Pós-Graduação do Instituto de Química da
Universidade de São Paulo), corpo de funcionários do IQ-USP (em particular o
setor de Importação que garantiu o suprimento de materiais); Agências
financiadoras (FAPESP, CNPq, CAPES, Fundação Banco do Brasil, ICGEB-
UNIDO) e setor privado (principalmente a GIBCO-BRL com sua política explícita
de formação de recursos humanos qualificados) constituiu-se na mola-mestra
que alavancou o Workshop de 1993.
Embarcamos (alunos, monitores e professores) numa excitante aventura
na busca do conhecimento e da harmonia do Universo.

PREFÁCIO (edições de 1986 e1990)
Este é um curso de técnicas de Cultura de Células e DNA recombinante,

organizado com o intuito de ilustrar os potenciais destas metodologias no
ataque a problemas biológicos básicos usando um enfoque duplo: genético e
bioquímico. É também propósito deste curso apresentar técnicas de aplicação
imediata em alguns ramos da indústria, órgãos de controle ambiental e
laboratórios de finalidades várias. A principal preocupação não é centrada em
ser abrangente mas sim de manipular uma série de conceitos e técnicas, de
uso corrente no laboratório, em torno do tema central: Transformação Maligna
ou Neoplásica.
O manual é organizado em duas partes: na primeira encontram-se os
protocolos das experiências com algumas notas conceituais e na segunda parte
(Apêndice) estão reunidos: as receitas restantes e alguns procedimentos.
Referências bibliográficas selecionadas de cada assunto são dadas ao final de
cada tema. Uma lista de livros pertinentes (disponíveis no laboratório) é
também fornecida.
Esperamos poder ser este manual o embrião de um texto de técnicas
quantitativas de cultura e uso de células de mamíferos, de divulgação e
alcance mais amplo - algum dia.
O primeiro curso foi dado em 1986 para um grupo de 12 alunos. O
entusiasmo deste grupo e, em particular, de Alberto Mello Filho (saudoso
amigo que acompanhou, captou e compartilhou todas as nuances do processo)
levaram-me a repetir a experiência, a despeito das adversidades.
"I have a dream"
(Martin Luther King)

ABREVIATURAS
cDNA - DNA cópia (ou complementar)

DMEM - meio de cultura de Dulbecco
EDTA - ácido etilenodiamino tetracético
EGF - "epidermal growth factor"
E.P. - Eficiência de Plaqueamento
FCS - "fetal calf serum"
FGF - "fibroblast growth factor"
HEPES - ácido N-2-hidroxietilpiperazine-N'-S-etanosulfônico
krpm - 1000 rotações por minuto
LB - meio de cultura de Luria e Bertani
PBS - "phosphate buffered saline" solução tamponada contendo Ca2+ e Mg2+
PBSA - PBS sem Ca2+ ou Mg2+
P35, P60, P100, P150 - placas de Petri de 35, 60 100 e 150 de diâmetro
PCR - Reação de Polimerase em Cadeia
PDGF - "platelet-derived growth factor"
RPM - Rotações por minuto.
SDS - Dodecil sulfato de sódio
SSC - solução salina-citrato
SSPE - solução salina-fosfato - EDTA
TBE - tampão Tris-borato - EDTA
TE - tampão 10mM Tris-Cl pH 7,5, 1mM EDTA
TCA - ácido tricloroacético

CONCEITOS BÁSICOS UTILIZADOS
− Cultura primária de células, culturas finitas, linhagens permanentes

(imortais) e clones celulares
− Cariótipo
− Fracionamento celular
− Crescimento exponencial
− Tempo de dobramento (TD) e Tempo de geração (TG)
− Meios quimicamente definidos
− Ciclo celular: fases G1, S, G2, M e estado G0
− Sincronia celular
− Toxicidade e Sobrevivência celular
− Mitogênese e Diferenciação celular
− Inibição de crescimento ou de diferenciação celular
− Transformação celular / Transformação neoplásica
− Fatores peptídicos de crescimento e de sobrevivência
− Receptores de membrana
− Transdução de sinal (proliferativo/diferenciativo)
− Proteínas adaptadoras e efetuadoras do sinal proliferativo
− Mecanismos de controle do crescimento
− Vírus tumorais de RNA e DNA
− Oncogenes virais e proto-oncogenes
− Genes supressores de tumor
− Oncoproteínas (Proteínas transformantes)
− Expressão gênica
− Mutagênese
− DNA recombinante
− Biblioteca de cDNA
− Vetores para Transferência gênica
− Plasmídeos Bacteriófagos e Vírus animais como vetores
− Clonagem gênica
− Amplificação de DNA por PCR
− Regulação da Expressão gênica
− Interrupção gênica (“gene knock-out”) por recombinação homóloga
− Animais transgênicos e “knock-out”
− Terapia gênica

TÉCNICAS BÁSICAS INTRODUZIDAS
− Autoradiografia
− Cariotipagem e bandeamento cromossômico
− Citometria de fluxo (FACS)
− Clonagem celular
− Clonagem molecular
− Congelamento e descongelamento de células
− Detecção de citotoxidade
− Determinação de parâmetros de crescimento:Tempo de dobramento da
população (TD); densidade de saturação (DS) e eficiência de plaqueamento
(EP)
− Dot/Slot Blot
− Ensaio de atividade de fatores de crescimento
− Hibridização de ácidos nucleicos
− Incorporação de precursores radiativos
− Manutenção de estoques de células de mamíferos, bactérias e plasmídeos
− Manutenção de linhagens celulares
− Mapeamento por restrição
− Medida de Atividade Mitogênica
− Medidas da expressão gênica ao nível de mRNA (Northern) e proteínas
(Western blot, imunofluorescência, imunoprecipitação)
− Métodos de detecção não radioativos
− PCR (reação de polimerase em cadeia)
− Preparação de meio de cultura
− Seqüenciamento de DNA
− Sincronização de culturas celulares
− Técnicas de esterilidade
− Técnicas de seleção de células ou populações celulares
− Transfecção mediada por DNA
− Transformação por vírus
Biologia Molecular da Transformação Maligna - 10 -

LIVROS RECOMENDADOS (disponíveis em nosso laboratório)
1. Conceitos Gerais de Biologia Celular e Molecular
− A Célula 2001, H.F. Carvalho & S.M. Recco-Pimentel, 1a Edição, Manole

(2001).
− Molecular Cell Biology - 4th Edition, Media Connected, H. Lodish, A. Berk,
S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell (1999).
− Biologia Molecular Básica. Ed. A. Zaha. Mercado Aberto Ltda. Porto Alegre
(1996).
− Molecular Biology of the Cell. 3rd edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M.
Raff, K. Roberts, J.D. Watson, eds. Garland Publishing Inc. N. York, London
(1994).
− Genes VI. B. Lewin. Oxford Univ. Press (1997).
− Molecular Biology of the Gene vols I & II. J.D. Watson, N.H. Hopkins, J.W.
Roberts, J.A., Steitz & A.M. Weiner, eds. The Benjamin/Cummings Publ. Co.
Inc. 4th Edition (1987).
− Molecular Cell Biology. Lodish, H.; Baltimore, D.; Berk, A.; Zipursky, S. L.;
Matsudaira, P. and Darnell, J.W. H. Freeman and Company.(1995)
− DNA Cloning - a practical approach. vols I, II, III. D.M. Glover, ed. IRL Press
Inc. Oxford, England (1985, 1986 & 1987).
− Endocrinologia Pediatrica. N. Setian, ed. Sarvier Editora de Livros Médicos
Ltda. São Paulo, Brasil. (1989).
− Bioquímica Experimental. Nepomuceno, M. F.Editora Unimep. (1998)
− Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. Rickwood, D. and Hames, B. D. Oxford
University Press.(1990)
− The Biochemistry of the nucleic acids. Adams, R. L. P. ; Knowler, J. T. e
Leader, D. P. Chapman & Hall. (1992)
− Molecular Genetics. Smith- Keary, P. The Macmillan Press Ltd. 1991
− Student Companion for Molecular Cell Biology. Rintoul, D.;Welti, R.; Storrie,
B. and Lederman, M. W. H. Freeman and Company.(1995)
− An eletronic companion to Molecular Cell Biology. Buskirk, R. G. V. and
Liyanage, U. K.Cogito Learning Media. (1997)
− An eletronic companion to Genetics. Anderson, P. and Ganetsky,B. Cogito
Learning Media.(1997)
− Experiments in Molecular Biology: Biochemical Applications. Burton, Z. F. e
Kaguni, J. M. Academic Press.(1997)

− An introduction to Genetic Analysis. Griffiths, A. J. F.; Miller, J. H. ; Suzuki,
D. T.; Lewontin ,R.C. and Gelbart, W.M. W.H.Freeman and Company.
(1996)
2. Manuais de Métodos e Catálogos Sobre Cultura de Células
− Cell Culture. P. M. Coon, Ed. Acad. Press Inc. Hartcourt Brace Jovanovich
Publ. (1990).
− Culture of Animal Cells - a Manual of Basic Techniques. 4th Edition, R. I.
Freshney, Ed. IRL Press, Oxford (2000).
− Tissue Culture - Methods and Applications - Paul F. Kruse Jr. and M.K.
Patterson Jr - Academic Press, (1973).
− Contamination in Tissue Culture - Jorgen Fogh - Academic Press, Inc,
(1973).
− Methods for Serum-Free Culture of Epithelial and Fibroblastics Cells. in: Cell
Culture Methods for Molecular and Cell Biology (David W. Barnes, ed.) Alan
R. Liss, Inc., New York, volume 3, (1984).
− ATCC Cell Lines and Hybridomas. 7th Edition American Type Culture
Collection (1992).
− Animal Cells:culture and media. Darling, D. C. e Morgan, S. J Bios Scientific
publishers Ltd.(1994)
3. Histórico e Publicações Clássicas Sobre Cultura de Células
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4. Vírus Tumorais
− Selected Papers in Tumour Virology (John Tooze & Joseph Sambrook, ed.)
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5. Ciclo Celular
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Laboratory (1979).
− Growth of Cells in Hormonally Defined Media (Gordon H. Sato, Arthur B.
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− The Transformed Cell (Ivan L. Cameron & Thomas B. Pool, ed.) Academic
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− Biologia de Células em Cultura - Volume II - Anais do IX Simpósio Anual da
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Paulo (1985).

7. Controle da Expressão Gênica
− Gene expression and its control. K. E. Davies,& S. M. Tilghman, Eds. vol. 2

Genome analysis. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991).
− Transcription mechanisms and regulation. R. C. Conaway & J. W. Conaway,
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− Antisense RNA and DNA - Current communications in Molecular Biology -
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− Methods of Protein and Nucleic Acid Research. vol 3 Chromatography.
Springer Verlag (1986).
− Transcription factors. Locker, J Bios Scientific Publishers Ltd. (1996)
8. Oncogenes e Anti-Oncogenes
− Tratado de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia. M.B.

Carvalho, Ed. Atheneu (2001).
− The Oncogenes Handbook. R. Hesketh, Ed. Acad. Press Inc. (1994).
− The Oncogenes Facts Book. R. Hesketh, Ed. Acad. Press Ltd. (1995)
− Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer R.A. Weinberg, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989).
− Oncogenes, Genes and Growth factors. G. Guroff, ed. John Wiley & Sons,
New York (1987).
− Oncogenes and Growth Control. P. Kahn & T. Graf, eds. Springer-Verlag
(1986).
− Nuclear Oncogenes. F. Alt., E. Harlow & E.B. Ziff, eds Cold Spring Harbor
Laboratory (1987).
− Oncogenes: selected reviews. P. Vogt, Ed. Springer-Verlag Berlin-Heidelberg
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− Oncogenes. G. M. Cooper. Jonas and Barlett Publ., Boston (1990).
− Recessive Oncogenes and Tumor Suppression. W. Cavenee, N. Hastie & E.
Stanbridge, eds. Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
9. Hibridização /Fusão Celular
− Cell Hybrids - Nils R. Ringertz & Robert E. Savage - Academic Press, Inc.
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10. Citoesqueleto e Motilidade Celular
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− Cell Motility (Book B - Actin, Myosin and Associated Proteins) R. Goldman, T.
Pollard & J. Rosenbaum, ed. - Cold Spring HArbor Conferences on Cell
Proliferation, Volume 3 - Cold Spring Harbor Laboratory (1976).
− Cell Motility (Book C - Microtubules and Related Proteins) R. Goldman, T.
Pollard & J. Rosenbaum, ed. - Cold Spring Harbor Conferences on Cell
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− Cell and Muscle Motility (Robert M. Dowbem & Jerry W. Shay. ed.) Volume 2
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11. Camundongo NUDE, Ensaios de Tumorigenicidade e animais transgênicos
− Thymus & Self - Immunobiology of the Mouse Mutant Nude - Jorge Rygaard,
F.A.D.L. Copenhagen (1973).
− Manipulating the mouse embryo - a laboratory manual. B. Hiogan, F.
Costantini & E. Lacy, eds. Cold Spring Harbor Laboratory (1986).
12. DNA Recombinante
− Recombinant DNA. 2nd edition. J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski & M.

Zoller. Scientific American Books. W. H. Freeman & Co. Distr. New York
(1992).
− Principles of Gene Manipulation - An Introduction to Genetic Engineering -

R.W. Old & S.B. Primrose - Second Edition, University of California Press,
Berkeley (1981).
− Recombinant DNA Techniques: An Introduction - Raymond L. Rodriguez &
Robert C. Tait - The Benjamin/Commings Publishing Company, Inc. (1983).
− Plasmids - a practical approach. K. G. Hardy, ed. IRL Press, Oxford, England
(1987).
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− ATCC/NIH repository Catalog of human and mouse DNA probes and
libraries. 5th edition (1991).

− Vectors. Gacesa, P. and Ramji, D. P..Bios Scientific Publishers Ltd (1994)
13. Manuais de Biologia Molecular
− Current Protocols in Molecular Biology. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E.

Kingston, D.D. Moore, J.O. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl, Massachusetts
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− Flow Cytometry . Ormerod, M. G. Oxford University Press .(1996)
14. Métodos Imunológicos
− Immunological methods in Cell and Molecular Biology. R.J. Mayer & J.H.
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Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil (1984).
15. Manuais Sobre PCR (reação de polimerase em cadeia)
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Erlich, Ed., Stockton Press, Macmillan Publ. Ltd., England (1990).
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Gelfand, J. J. Snisky & T. J. White, Ed. Acad. Press Inc. (1990).
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H.A. Erlich, R. Gibbs & H.H. Kazazian, Jr. - Cold Spring Harbor Laboratory
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16. Bioinformática
− Bioinformatics - A Pratical Guide to the Analysis of Genes and Proteins -

A.D. Baxevanis & B.F.F. Ouellete, 2nd Edition, Wiley-Interscience (2001).
17. Genômica

− Functional Genomics - S.P. Hunt & F.J. Livesey, OXFORD University Press,
2000
− Gene Targeting - A Pratical Approach, A.L. Joyner, 2nd Edition, OXFORD
University Press, 1999

LINKS recomendados
Principais Centros de biotecnologia:
National Center for Biotechnology Information (NCBI)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov : GenBank, PubMed, BLAST, OMIN, LocusLink
European Bioinformatics Institute (EBI) - http://www.ebi.ac.uk
The Sanger Centre - http://www.sanger.ac.uk
ExPASy Molecular Biology Server-Expert Protein Analysis System, Swiss

Institute of Bioinformatics - http://www.expasy.ch
South African National Bioinformatics Institute - http://www.sanbi.ac.za/
Weizmann Institute - http://bioinformatics.weizmann.ac.il/
Alinhamento
blast - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
blast multi contra GID www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ResearchOstell/Spidey
fasta - http://www.bioch.Virginia.edu
SIM - http://www.expasy.ch/tools/sim-prot.html
CLUSTALW - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
Programas de Predição
GENESCAN - http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
FGENEH - http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml
Predição de estrutura
COILS - http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html
UCLA-DOE - http://fold.doe-mbi.ucla.edu/
SWISS-MODEL - http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html
EST
dbEST - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/
EST WU - http://genome.wustl.edu/gsc/est/navest.pl
IMAGE - http://image.llnl.gov/
UniGene - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene
STACK - http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html
TIGR - http://www.tigr.org/tdb/tgi.shtml
Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncicgap
CGAP Digital Differential Display (DDD) -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ddd.cgi?ORG=Hs
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE

SAGE virtual Northern -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/index.cgi?cmd=tagsearch&org
Assembly
CAP3 - http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.html
Staden Package (gap4) - http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/pubseq/
TIGR Assembly - http://www.tigr.org/softlab/
Protein: Motivos, Patterns, Profiles

Pfam - http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/
Hits - http://hits.isb-sib.ch/
emotif - http://dna.stanford.edu/emotif/simple.html
snoRNA - http://rna.wustl.edu/snoRNAdb
Taxonomia
Taxonomy - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html/
PHYLIP - http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
PUZZLEBOOT - http://www.tree-puzzle.de/
TreeView - http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
Nucleic Acids Database (NDB) - http://ndbserver.rutgers.edu/
RasMol - http://www.bernstein-plus-sons.com/software/rasmol/
RCSB - http://www.rcsb.org/pdb/
Mapping
The Genome Database (GDB) - http://www.gdb.org/
Download de softwares e bancos de dados

bancos do blast - ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db
Phred/Phrap - http://www.phrap.org/
Consed - http://www.phrap.org/consed/consed.html
RepeatMasker - http://ftp.genome.washington.edu/RM/RepeatMasker.html
sim4 - http://globin.cse.psu.edu/
CAP3 - http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.html
Submissão de seqüências
Banklt - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Banklt
(para submissão de poucas seqüências de DNA/RNA)
Sequin - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/index.html
FTP: www.ncbi.nlm.nih.gov/sequin
(para submissões mais complexas e variadas, contém ferramentas de anotação
poderosas).
Webin - http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.html
Linguagem PERL
Perl - http://www.perl.org
Perl - http://www.perl.com
Bioperl - http://www.bioperl.org/

NORMAS DE PROCEDIMENTO PARA A SALA ESTÉRIL
1. Manter um pano umedecido com desinfetante na entrada da sala e a porta

sempre fechada (sem correntes de ar); não fumar ou comer na sala; evitar
permanência de pessoas que não estejam diretamente envolvidas no
trabalho naquele momento. Ligar a luz ultravioleta por alguns minutos (2-5)
antes de entrar na sala.
2. Escovar mãos e braços com água e sabão alcalino. Limpar mãos e capela de
fluxo laminar com álcool 70%. Usar 2 recipientes - 1 para pipetas Pasteur e
outro para pipetas comuns - com água e sabão e água sanitária, para
recolher as pipetas sujas.
3. Usar sua melhor técnica de esterilidade evitando debruçar-se sobre a mesa
da capela, ou tocar em outra pipeta a não ser aquela que vai usar.
4. Marcar todas as garrafas (meio, salina, soro tripsina) com seu nome e data.
Guardar, logo após o uso, em geladeira ou congelador.
5. Controlar o bom funcionamento dos aparelhos (fluxo laminar, estufas,
microscópio, ar condicionado, bomba de aspiração, banho Maria) e o
suprimento de materiais.
6. O líquido aspirado das culturas (meio de cultura, salina, etc) deve ser
recolhido em recipiente contendo sabão alcalino e hipoclorito de sódio (água
de lavadeira). Antes de descartar este líquido na pia, adicione mais
hipoclorito e deixe incubar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
7. Ao terminar, limpe, guarde e reponha material utilizado.
8. Ligar a luz UV por 2 min.
NORMAS MÍNIMAS PARA MANIPULAR DNA RECOMBINANTE (DNAr)
1. Usar equipamento protetor: luvas, avental, máscara, óculos, etc.

2. Procurar proteger: a) você do DNA recombinante; b) o DNA recombinante
de você e de outros DNAs recombinantes; c) o meio ambiente.
3. Usar apenas material autoclavado e livre de outros DNAs, (tubos
Eppendorf, ponteiras, pipetas, tubos, Corex, etc.).
4. É PROIBIDO pipetar com a boca, comer, beber ou fumar na área de
trabalho.
5. Manter a área de trabalho limpa e somente o material essencial na
bancada.
6. Lavar as mãos freqüentemente antes e depois de manipular DNAr.
7. Descontaminar todo o material utilizado antes de descartar.
8. Não deixar material contendo DNAr solto na bancada.
9. Rotular adequadamente de maneira completa e precisa.

10. Manter registro de todo DNAr e de doações feitas a outras Instituições.
Doações só devem ser feitas a pesquisadores autorizados e Instituições
credenciadas.
Nota: O NIH (National Institutes of Health dos EUA) regulamentou pela

primeira vez, a manipulação de DNAr. Maiores informações podem ser obtidas
escrevendo para lá

INTRODUÇÃO
PROLIFERAÇÃO CELULAR
Crescimento, no sentido de proliferação celular, pode ser estudado "in

vivo" havendo que se levar em conta, porém, a imensa complexidade das
interrelações metabólicas, humorais e hormonais que garantem a homeostasia
dos sistemas biológicos. A disponibilidade de métodos para cultura de células
(primária, secundária e linhagens estabelecidas) que mimetizam o
comportamento de diferentes tecidos e órgãos, permite focalizar, "in vitro", a
proliferação celular, seu controle e a perda deste controle como resultante do
fenômeno da transformação neoplásica ou maligna que leva à formação de
tumor (câncer).
A linhagem 3T3 de camundongo (Todaro & Green, 1963) é a mais
empregada como paradigma de células ditas normais ou de crescimento
controlado. O mais interessante é que os mesmos agentes conhecidos como
carcinogênicos "in vivo" (radiações ultravioleta e ionizante, substâncias
químicas e vírus tumorais) podem levar à transformação das células 3T3, em
cultura, com conseqüente perda do controle de crescimento.
A transformação maligna é o equivalente "in vitro" (em cultura) da
oncogênese observada "in vivo" (no animal). Transformação da linhagem 3T3
pelo vírus tumoral de DNA SV40, resulta na linhagem SVT2. Este par de
linhagens - 3T3/SVT2 será usado, neste curso, como modelo de estudo dos
parâmetros de crescimento e transformação celular.
Entre os parâmetros de crescimento destacaremos:
a) TD - tempo de dobramento da população (medido em horas).
b) DS - densidade máxima ou de saturação que a cultura atinge (representada
por número de células/cm2).
c) E.P. - eficiência de plaqueamento que mede a porcentagem de células
capazes de crescer e formar colônias macroscópicas em substrato sólido ou
em suspensão (meio semi-sólido de agarose ou metocel).
A transformação é acompanhada de uma série de alterações:
a) mudança morfológica: de células isométricas com tendência à justaposição
e formação de uma camada única de células (monocamada) para células
alongadas (fusiformes) que crescem entrelaçadas e empilhadas, formando
multicamadas.
b) diminuição do TD: no caso de 3T3/SVT2 o TD passa de 18 para 12 horas.
[Não confundir tempo de dobramento de uma população de células com o
tempo de geração que se restringe a uma célula].
c) aumento da DS: de 5 x 104 células/cm2 (3T3) para 5 x 105 células/cm2
(SVT2).
d) aquisição da capacidade de crescer em suspensão de agarose. Este é o
parâmetro da cultura de células que melhor correlaciona com a
tumorigenicidade observada "in vivo".

e) aquisição da capacidade de crescer em baixa concentração de soro ou em
plasma. O soro tem sido usado, na cultura de células, como fonte de
hormônios clássicos e fatores de crescimento (Armelin, 1973). A célula
transformada tende a tornar-se menos dependente dos reguladores
extracelulares, (fatores peptídicos de crescimento e hormônios presentes
no soro) passando a ser muito menos exigente e mais autônoma.
f) desarranjo das estruturas (redes e cabos) do citoesqueleto e da superfície
celular, o qual provavelmente é responsável pelas alterações morfológicas
observadas.
g) aumento da atividade glicolítica. Altas taxas de glicólise são comuns entre
células transformadas. O indicador do meio (vermelho fenol) acusa
claramente a acidificação tornando-se amarelo.
h) aumento da produção de ativador de plasminogênio, uma serina-protease
capaz de atuar no processamento de plasminogênio a plasmina, por sua
vez também uma protease.
Neste Curso, os experimentos foram desenhados de modo a poder ilustrar

os vários parâmetros mencionados acima. Você receberá dos instrutores um
par de células sendo uma normal e outra transformada e acompanhará seu
crescimento e comportamento ao longo do curso.
Referências:
Armelin, H.A.A. (1973) Pitutary extracts and glucocorticoid hormone in the

growth of 3T3 cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 70, 2702.
Armelin, M.C.S. (1989) Fatores peptídicos de crescimento: papel na
proliferação e diferenciação celular. in Endocrinologia Pediátrica (N.
Setian, ed.). Sarvier Editora, São Paulo.
Armelin, H. A. (1990) Peptides growth factors and growth control. Biomed. &
Pharmacother., 44, 103-108.
Armelin, H.A.A. (1990) Peptide growth factors and cell cycle control. Biomed.
Pharmacother. 44, 103-108.
Armelin, M. C. S., Oliveira, M. L. S., Mercado, J. M., Sasahara, R. M., Valentini,
S. R. & Carvalho, L. H. (1996) Molecular genetic approach to cell
proliferation and neoplasia).
Armelin, H.A. & Armelin, M.C.S (1987) The interactions of peptide growth
factors and oncogenes. In: Oncogenes, genes and growth factors.
Guroff., G. ed., John Wiley & Sons, p.331-73

Curvas de crescimento
Exp. 1 - Curvas de crescimento
Antes de começar a trabalhar, aprenda a observar o par de células

quanto a: morfologia, respeito a limites territoriais versus "criss-
crossing"/empilhamento, visibilidade de núcleo e nucléolo, mitose bipolar
(versus poli-polar em células tumorais) limites citoplasmáticos, inclusões,
vacúolos, etc.
Procedimento:
Trabalhando no fluxo laminar, com uma linhagem de cada vez (NUNCA

mais de uma para evitar problemas reais de troca de rótulos e contaminação
cruzada), remover as células da superfície por tripsinização.
Para tanto: lavar (1x) com PBSA, adicionar tripsina (0,5ml/frasco de
25cm ), espalhar a tripsina por toda a superfície, incubar por alguns segundos
2
até os primeiros sinais de ação da tripsina (mudança na opacidade da

monocamada, "areia" de células em suspensão) e imediatamente adicionar
cerca de 1ml PBSA e pipetar com pipeta Pasteur para obter suspensão de
células isoladas. Rapidamente, inativar a tripsina com 0,5ml de meio contendo
10% de soro, homogeneizar e retirar 2 amostras independentes para contar no
hemocitômetro. Determinar a concentração de células nesta suspensão original
(em geral da ordem de 106 células/ml).
Para preparar a Suspensão de Plaqueamento, calcular:
a) o número total de células necessário, que é dado por: no de
células/placa X (no de placas + 2);
b) volume da suspensão original para obter o no total de células
desejado;
c) volume total de meio necessário, que é dado por: ml de meio/placa X
(no de placas + 2).
Preparar a Suspensão de Plaqueamento colocando o número total de
células no volume total de meio.
Homogeneizar e distribuir a Suspensão de Plaqueamento (y ml/placa)
tomando o cuidado de NÃO MOVIMENTAR as placas enquanto as células não
assentarem (para evitar distribuição heterogênea devido a correntes de
turbulência).
Após 10-15 minutos, guardar as placas em câmara úmida e atmosfera de
5% CO2/95% ar e incubar à 37oC.
Para ilustrar os parâmetros de crescimento e transformação, preparar 20
placas de 35mm (P35) para cada linhagem celular e seguir o seguinte
esquema, em dias (d) subseqüentes:
d=0: Plaquear 9 P35 de cada linhagem com 5 x 104 células/pl.; 2ml/pl.
de meio 5% FCS-DMEM.
d=1: Coletar 1 placa de cada linhagem para contagem de células. (Ver
protocolo para Contagem de Células no Apêndice).

Remover o meio das placas restantes e mudar para os diferentes meios,

ou seja: 10% FCS versus 0,5% FCS.
d=3: Coletar 2 placas de cada condição.
Contar todos os pontos.
Nota: O meio das placas deve ser trocado de 3 em 3 dias.
Coleta de células para contagem das curvas de crescimento (método

simplificado de Mari Armelin)
2. Aspirar o meio das placas usando trompa de vácuo.

3. Lavar rapidamente com PBSA.
4. Após remoção do PBSA, adicionar solução de tripsina (0,4ml/P35) e incubar
por alguns segundos (células normais podem requerer incubação por tempo
maior a 37oC).
5. Adicionar PBSA (0,5ml/P35) e pipetar usando pipeta Pasteur de modo a
remover as células da superfície e dissociar as células para obter uma
suspensão homogênea de células bem individualizadas procurando fazer o
mínimo de bolhas.
6. Fixar a suspensão passando o conteúdo da placa (0,9ml) para um tubo de
ensaio (tipo Eppendorf) contendo 0,1ml de 37% formaldeído filtrado.
Depois de misturar, pode-se contar imediatamente ou guardar estas
amostras (bem fechadas) a 4oC, por pelo menos 1 mês.
7. Contar manualmente aplicando amostras diretamente ao hemocitômetro ou
fazer a diluição adequada para usar o contador eletrônico (VER APÊNDICE).
Este contador deve ser previamente calibrado de modo que os impulsos
reflitam exatamente o número de células, bastando agora multiplicar a
contagem pelo fator de diluição para obter células/ml e multiplicar pelo
volume total de suspensão para obter células/placa.
Levando em conta a diluição feita para contagem eletrônica, determinar o
número de células/P35 para cada ponto e traçar um gráfico em papel semi-log.
Determinar TD e DS para cada linhagem em cada condição. Responder:
a) Como variam TD e DS em função da concentração de soro para cada
linhagem? E em relação a plasma?
b) Se tivesse que classificar estas duas linhagens em função de
dependência de soro, como faria?
c) Planeje um experimento que permita ilustrar melhor esta dependência
de fatores de crescimento.

Exp. 2 - Eficiência de Plaqueamento em substrato sólido.
Esta técnica consiste em semear um número reduzido de células por

placa (por exemplo, 200 células/P35) de modo que cada uma fique totalmente
isolada das demais impedindo, assim, que ocorra "cross-feeding" (uma célula
complementando as carências de outra) e "condicionamento do meio"
(acúmulo de substâncias secretadas pelas células propiciando o crescimento
das mesmas). Procura-se determinar quantas das células semeadas são
capazes de crescer e formar colônias macroscópicas. Por ser extremamente
exigente, este método é o melhor e o mais rigoroso indicador de VIABILIDADE
CELULAR. Permite, portanto, fazer ensaios de toxicidade, mutagênese,
mitogênese, etc.
Neste curso vamos usar Eficiência de Plaqueamento para medir a
dependência de soro das células normais, ilustrar a independência de fatores
de crescimento por parte das células transformadas e ainda fazer uma Curva
de Sobrevivência frente a agentes tóxicos.
Procedimento:
1. Obter dos instrutores um par de linhagens sendo uma normal e outra

transformada. Procure usar culturas no melhor estado possível (fase
exponencial, meio não exaurido, pH não muito ácido nem muito alcalino).
2. Tripsinizar a cultura de modo a obter uma suspensão bem homogênea de
células isoladas (este ponto é crítico para garantir que cada colônia veio de
uma única célula).
3. Contar a suspensão original para determinar o número de células/ml e
fazer diluições seriadas, em meio de cultura contendo 10% de soro, para
obter 106, 105, 104, 103, 102 células/ml.
4. Fazer o plaqueamento em meio contendo 10% FCS, usando somente as 2
últimas diluições (102 e 103 células/ml) de modo a distribuir 2 ml/P35 e
obter 2 x 102 e 2 x 103 células/P35, respectivamente.
5. Para cada linhagem, plaquear 8 P35 sendo 4 com 2 x 102 e 4 com 2 x 103
células. No dia seguinte, mudar para os diferentes meios de cultura (10%
FCS versus 0,5% FCS).
6. Renovar o meio periodicamente até que apareçam colônias macroscópicas
(em geral 7-15 dias).
7. Remover o meio, descartando-o para um recipiente contendo hipoclorito.
Adicionar 3,7% formaldeído por 5 min, para fixar (diluir o estoque 37% de
1/10) e corar com violeta cristal. Contar as colônias e determinar a
eficiência de plaqueamento (EP) em porcentagem das células que consegue
formar colônias macroscópicas.
EP (%) = no de colônias x 100

n de células plaqueadas
o

Responder: Como se comportam células normais versus transformadas

quanto a crescimento em baixa densidade? De que maneira a baixa
concentração de soro (ou a substituição de soro por plasma) afeta a eficiência
de plaqueamento destas células? É possível classificar células normais e
transformadas quanto à capacidade de formar colônias em meio rico (10%
soro) versus pobre (0,5% soro)? Que aplicação você faria desta técnica no seu
próprio projeto de pesquisa?

Exp. 3 - Subcultura
A manutenção de estoques é a base de um laboratório que usa cultura

de células como ferramenta de trabalho. Nesta tarefa todo cuidado é pouco
para evitar não só os biótipos indesejáveis (bactérias, fungos) como também -
e principalmente - a contaminação cruzada entre linhagens celulares. Inúmeros
são os exemplos na literatura (ver, por exemplo, Harris et al 1981, Nature
289, 229) de erros que se perpetuaram causando sérios problemas.
Como regras gerais: a) manipule apenas uma linhagem de cada vez
procurando usar código de cores, além de nomes, para as diferentes células;
b) nunca volte a pipeta para os frascos de meio, salina e tripsina; c) lave
meticulosamente as mãos e a mesa de trabalho (capela de fluxo laminar).
O regime de cultivo usado para estabelecer linhagens de células em
cultura é muito importante para a definição do produto final. O exemplo
clássico deste fenômeno é dado pelas linhagens 3T3 e 3T6 obtidas de embrião
de camundongos, cujas características são muito diferentes em decorrência da
diferença nos regimes de cultivo pelos quais foram estabelecidas: subcultivo a
cada 3 (3T3) ou 6 (3T6) dias com inóculo inicial de 3 x 105 células/placa de
60mm de diâmetro (ver Todaro & Green (1963) J. Cell Biol. 17, 299). Além
disso, a evolução de linhagens já estabelecidas também depende do regime de
manutenção das culturas (ver Aaronson & Todaro, (1968) Science 162, 1024).
Portanto, é preciso escolher o melhor regime (no caso de células normais,
evitando favorecer o aparecimento de transformantes espontâneos que, ao
contrário das células normais, crescem bem em meio exaurido) e ater-se
rigorosamente a este.
Como esquema de segurança convém manter sempre pelo menos dois
frascos (com número x e 3x de células) de modo que sempre se subcultiva o
frasco inoculado com 3x de células ficando o outro (inoculado com x células)
de reserva caso algum incidente leve à perda daquela subcultura.
Procedimento:
1. A cultura a ser propagada deve estar subconfluente (numa cultura

confluente as células podem estar morrendo ou em mau estado).
2. Colocar 4,5 ml meio 5 ou 10% FCS (dependendo do tipo de célula e da
finalidade do experimento) em cada um de 2 frascos de 25cm2
devidamente rotulados (nome da célula, data da subcultura, número de
células, etc).
3. Aspirar o meio velho com pipeta Pasteur ligada à bomba de vácuo com
frasco coletor contendo hipoclorito.
4. Lavar com PBSA (2-4 ml) virando o frasco ligeiramente (cuidado para não
despregar as células mitóticas).
5. Adicionar solução de Tripsina: 0,5ml/frasco de 25cm2. Para células
transformadas, a tripsina deve ser diluída em PBSA, de 1/2 a 1/10 para
evitar a formação de grumos.

6. Agitar o frasco ligeiramente para que as células desgrudem da superfície.

Quando começarem a se despregar dê uma boa sacudida e adicione 1-2 ml
de PBSA. Pipetar com pipeta Pasteur de ponta fina "varrendo" a parede do
frasco para acabar de separar as células. Adicionar 0,5ml de meio contendo
5-10% soro para inativar a tripsina e pipetar de cima para baixo para obter
uma suspensão homogênea de células. Se necessário, diluir a suspensão
de células acrescentando mais PBSA.
7. Adicionar uma amostra (0,2-0,5ml) da suspensão de células a frasco
contendo meio fresco e pipetar para homogeneizar.
8. Injetar gás (5% CO2/95% ar comprimido) usando pipeta Pasteur com
algodão e incubar a 37oC. Caso tenha disponível uma estufa de CO2, basta
incubar a 37oC

Exp. 4 - Transfecção mediada por DNA
Tanto o genótipo como o fenótipo de células pode ser alterado pela

transferência de DNA exógeno. Diversos métodos têm sido utilizados para isto:
a) microinjeção; b) eletroporação (alteração da membrana celular por
descarga elétrica, na presença do DNA exógeno); c) transfecção mediada por
cálcio ou lipossomos.
Transfecção consiste em transferir DNA exógeno para dentro da célula
após tratamento com agentes que interferem com a composição/estrutura da
membrana plasmática. Diversos agentes tem sido utilizados para esta
finalidade: policátions, poliânions, solventes orgânicos (glicerol,
dimetilsulfóxido) e, mais recentemente, lipossomos (bicamadas lipídicas
artificiais).
Existem dois tipos de transfecção que são rotineiramente utilizados em
sistemas de células de mamíferos: transitória ou estável. Na transfecção
transitória, a transcrição ou replicação do gene transfectado pode ser analisada
entre 1 ou 4 dias após a introdução do DNA. De forma alternativa, muitos
experimentos requerem a geração de linhagens celulares que contenham o
gene integrado no DNA cromossomal, resultado de uma transfecção
permanente ou estável. Os métodos descritos podem ser utilizados tanto para
transfecções transitórias (utilizada para otimização de protocolos assim como
para ensaios de atividade de promotores) como também para produzir
linhagens celulares contendo o DNA de interesse integrado estavelmente.
Os métodos mais usados atualmente para transfectar células de
mamíferos são: a) co-precipitação do DNA exógeno com fosfato de cálcio; b)
lipofecção; c) eletroporação. Vamos utilizar apenas os 2 primeiros.
A técnica de transformação de células por DNA co-precipitado com
fosfato de cálcio, foi desenvolvida por Graham & Van der Eb em 1973, para
estudar a infectividade do DNA de adenovirus. Empiricamente, verifica-se que
o microprecipitado de DNA-fosfato de cálcio é tomado pelas células
(endocitose?) passa ao citoplasma e, uma pequena proporção, atinge o núcleo.
A recombinação do DNA ou dos genes exógenos com o genoma celular,
resulta na integração estável destes genes e, conseqüentemente, na geração
de mutantes celulares com genótipo alterado e, às vezes, com alterações de
fenótipo facilmente detectáveis.
O emprego desta técnica para estudo da atividade gênica em geral e da
atividade transformante em particular, tem sido extenso. Genes isolados tem
sido clonados em vetores adequados para permitir sua expressão em células
de mamíferos. Os vetores freqüentemente carregam marcas genéticas que
permitem fácil seleção dos recombinantes (por exemplo resistência a
geneticina G418; ácido micofenólico e metotrexato). Os genes exógenos
podem ser inseridos nestes vetores e transfectados diretamente ou podem ser
inseridos em outro vetor qualquer (sem marca genética) e co-transfectados
com os plasmídeos marcadores. Tanto quanto se saiba, o DNA exógeno forma
concatâmeros e é inserido como tal, em bloco, no genoma celular, ao acaso.

No experimento que se segue vamos fazer transfecção estável (apenas

com o plasmídeo do marcador genético e co-transfecção utilizando marcador
genético + DNA plasmideal contendo o oncogene EJ-ras), e transfecção
transitória utilizando um gene repórter Luciferase.
Na transfecção estável, o uso de marcador genético em experimentos de
co-transfecção tem a grande vantagem de permitir uma seleção neutra, ao
contrário do clássico ensaio de foco que só detecta o fenótipo extremo
(transformado). É importante ressaltar que é possível manipular a razão DNA
marcador genético/DNA de interesse (no caso EJ-ras) de modo a assegurar
que praticamente todas as colônias resistentes ao antibiótico contenham
também o gene de interesse. Em nossas mãos, uma razão de 1/10 até 1/40
garante isto (normalmente usa-se 1µg DNA marcador e 20µg DNA de
oncogene clonado).
A literatura mostra que a entrada de DNA nas células é dependente de:
a) conformação do DNA (para células de mamíferos o "supercoiled" é integrado
mais eficientemente que o linear); concentração (diretamente proporcional até
20-50µg/placa; acima disto passa a ser inibitório).
Os 2 métodos comumente empregados para introduzir DNA em células
de mamíferos em cultura são:
A. Método do co-precipitado DNA/Fosfato de cálcio.
Dia 0:
1. Plaquear as células NIH-3T3 em placas de 12 poços, cerca de 12h antes da

transfecção, numa densidade que corresponda à 50-70% da confluência
(3x104 células/poço) em 1,5ml de 10% FCS-DMEM. O soro deve ser
INATIVADO (56°C, 1h) para remover DNases.
2. Fazer os cálculos para determinar volumes necessários de cada solução de
DNA.

Dia 1:
1. Numerar os tubos de 1 a n e distribuir o DNA marcador e outro(s) DNA(s) a

cada tubo de modo que o volume total não ultrapasse 135µl/tubo.
2. Adicionar com H2O estéril (se necessário) de modo a completar o volume
de cada tubo para 135µl.
3. Adicionar 15µl de CaCl2 2,5M estéril em cada tubo. Misturar.
4. Adicionar 150µl de tampão BBS 2X, tomando o cuidado de borbulhar cada
tubo com o auxílio de uma pipeta Pasteur.
5. Deixar 15min. a temperatura ambiente.
6. Retirar as placas da estufa e acrescentar o conteúdo de cada tubo a cada
placa devidamente rotulada com o mesmo número, tomando o cuidado de
gotejar o precipitado no meio. Aguardar alguns minutos (de modo a
decantar o precipitado) e transferir as placas para câmara úmida (37°C).
Dia 2: Após 18-20 horas à 37°C , remover o meio (lavar com PBSA caso as
células estejam cobertas com o precipitado) e acrescentar meio fresco, 10%
FCS-DMEM. Incubar novamente por mais 1 dia.
Dia 3: No nosso experimento utilizaremos esse método de transfecção na

condição transitória. Caso fosse ser utilizado para uma transfecção estável
seguir o protocolo do Dia 3 do método de lipossomo, apresentado a seguir.
Transfecção transitória: deve ser realizada a lise celular.
1. Lavar cada placa com PBSA (2X).

2. Acrescentar o 250µl/well de tampão de lise PLB (1X) (Promega) (placa de
12 poços).
3. Agitar por 30min., temperatura ambiente.
4. Coletar o conteúdo de cada poço. Realizar a medida do gene repórter
imediatamente ou estocar o lisado celular à –20°C por até 1 mês.
5. No nosso experimento, estamos utilizando um vetor contendo o gene
repórter luciferase (Promega). A medida de atividade de luciferase será
realizada utilizando um luminômetro de placa (98 poços), seguindo o
protocolo abaixo:
a) Adicionar 100µl do substrato da luciferase (Promega) em cada pocinho.

b) Adicionar 20µl do lisado.
c) Pipetar 3X
d) A luz emitida é monitorada por 10-20s (MEDIDA 1).
6. Como controle interno da transfecção transitória utilizamos outro gene

repórter: da Renilla Luciferase (Promega). A medida de atividade da Renilla
Luciferase será realizada imediatamente após a medida da Luciferase,
utilizando a MESMA amostra de lisado:

a) Adicionar 100µl do substrato da Renilla Luciferase (Promega) NO

MESMO pocinho anterior.
b) Pipetar 10X
c) A luz emitida é monitorada por 10-20s (MEDIDA 2).
B. Método de lipofecção (transfecção com lipossomos)
Baseado no uso do lipídeo carregado DOTMA (N[1-(2,3-dioleyloxi)

propyl] N,N,N-trimethylammonium chloride) que forma lipossomos e interage
com ácidos nucléicos formando complexos estáveis (Felgner & Holm, 1989).
Há vários produtos comerciais disponíveis. Vamos utilizar Lipofectamina
(Invitrogen) que, dependendo da linhagem celular, permite eficiência de
transferência do DNA de até 10 vezes maior que o fosfato de cálcio.
O procedimento é muito simples:
Dia 0:
1. Plaquear as células NIH-3T3, cerca de 12h antes da transfecção, numa

densidade que corresponda à 50-70% da confluência (5x105 células/P60)
em 4ml de 10% FCS-DMEM. O soro deve ser INATIVADO (56°C, 1h) para
remover DNases.
2. Fazer os cálculos para determinar volumes necessários de cada solução de
DNA.
Dia 1: Remover o meio de cultura das placas, lavar (2x) com meio sem soro,
adicionar 2ml/P60 de meio SEM soro. Proceder da seguinte maneira:
1. misturar o(s) DNA(s) com 250µl de meio de cultura DMEM sem soro
(tubo1).
2. adicionar 8µl do reagente PLUS ao conteúdo do tubo 1. Homogeneizar.
3. Incubar 15min., temperatura ambiente.
4. misturar 12µl do reagente Lipofectamina com 250µl de meio de cultura
DMEM sem soro (tubo 2).
5. misturar devagar e cuidadosamente os conteúdos dos 2 tubos e incubar à
temperatura ambiente por 15 min.
6. adicionar os 500µl da mistura DNA/Lipofectamina e incubar por 3-6h à 37°
C em câmara úmida e 5% CO2/ar.
7. adicionar 2,5ml de 20% FCS para concentração final 10% e incubar por
24h.
Dia 2: Trocar o meio de cada placa (mantendo DMEM- 10% FCS).
Dia 3: No nosso experimento utilizaremos esse método de transfecção na

condição estável. Da mesma forma, esse protocolo poderia ser utilizado para
uma transfecção transitória (ver protocolo do Dia 3 do método de precipitação
com fosfato de cálcio).

Transfecção estável: deve ser realizada a subdivisão das culturas.
1. Tripsinizar cada P60 e transferir seu conteúdo para um tubo numerado.

Depois de remover o meio e lavar a placa com PBSA, acrescentar 0,5ml de
tripsina (incubar algum tempo para descolar as células da superfície) + 1ml
PBSA + 1ml 10% FCS-DMEM. A transferência das células deve ser
quantitativa. Agora o conteúdo de cada P60 está em 2,5ml. H2O
Misturar bem a suspensão de células (cuidado para não formar bolhas) e

distribuir:
1,2ml/P60 para subdividir 1:2
Pode-se fazer também algumas placas P60 em meio comum (para ver, por
exemplo, o desenvolvimento de focos de transformação). Neste último caso,
algumas células como a NIH-3T3 requerem a adição de hidrocortisona ao meio
(100ng/ml) para uma monocamada mais típica, evitando, assim,
empilhamento e facilitando a visualização dos verdadeiros focos de
transformação.
2. Mudar o meio periodicamente (a cada 3 ou 4 dias) mantendo o agente

seletivo até o aparecimento de colônias resistentes ou de focos de
transformação (de 2 a 3 semanas).
Focos de transformação ou colônias resistentes ao agente seletivo podem ser

isolados por clonagem celular (ver apêndice).
Soluções:
Tampão 2X BBS (BES-buffered saline):

50mM BES (N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethanesulfonic acid)
280mM NaCl
1,5mM Na2HPO4. 2H2O
Acertar pH para exatamente 6,96. Esterilizar por filtração em membranas
Millipore GS (0,2µm).
2,5 M CaCl2:
11g CaCl2. 6H2O em 20ml H2O destilada.
Esterilizar por filtração.
Sugestão de experimento:
Transfecção transitória:

Poços No. pGL3-promotor pBPuro-MycER pRL-TK Tamoxifen

(0,05µg/µl) (0,05µg/µl) (0,05µg/µl) (200nM)
1(2) 40 16 10 -
3(4) 40 16 10 +
Obs: valores da tabela em microlitros (µl)
Transfecção estável:
Placa No. pX343 pEJ-Ras pGL3-basico
(0,13µg/µl) (0,4µg/µl) (0,5µg/µl)
1 - - -
2 1,5 (0,2µg) - 4 (2µg)
3 1,5 (0,2µg) 5 (2µg) -
Obs: valores da tabela em microlitros (µl)
Ao final do experimento, responder: Detectou algum foco de

transformação no ensaio de foco? Em que placa? Pode atribuir atividade
transformante ao oncogene transfectado? Das colônias resistentes
selecionadas, encontra variação na morfologia de uma placa para outra? A que
se pode atribuir isto? Se a atividade de alguns oncogenes está associada a
crescimento mas não à transformação maligna, como faria para detectar esta
atividade? Como se comparam os 2 métodos de transfecção utilizados?

Referências
Armelin, H., Armelin, M.C.S., Kelly, K., Stewart, T., Leder, P., Cochran, B. &
Stiles, C. (1984). Functional role for c-myc in mitogenic response to
PDGF. Nature 310, 655.
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Davies, J. & Smith, D.I. (1978) Plasmid-determined resistance to antimicrobial
agents. Ann. Rev. Microbiol. 32, 469.
Felgner, P.L. & Holm, M. (1989) Cationic liposome-mediated transfection.
Focus 11(2) 21-27.
Graham, F.L. & Van der Eb, A.J. (1973) A new technique for the assay of
infectivity of human adenovirus-5 DNA. Virology 52, 456.
Land, H., Parada, L. & Weinberg, R. (1983) Tumorigenic conversion of primary
embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. Nature
304, 596.
Loyter, A., Scangos, G. & Ruddle, F.H. (1982) Mechanism of DNA uptake by
mammalian cells: fate of exogenously added DNA monitored by the use
of fluorescent dyes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 422.
Pellicer, A., Robins, D., Wold, B., Sweet, R., Jackson, J., Lowry, I., Roberts, J.,
Sin, G. Silverstein, S. & Axel, R. (1980) Altering genotype and phenotype
by DNA-mediated gene transfer. Science 209, 1414.
Southern, P. & Berg, P. (1982) Transformation of mammalian cells to antibiotic
resitance with a bacterial gene under control of the SV40 early region
promoter. J. Mol. Appl. Genet. 1, 327.
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.;
Smith, J. A. & Struhl, K. (1997) Current Protocols in Molecular Biology.
Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Boston,
USA.

Exp. 5 - Cariótipo de bandeamento cromossômico (Banda G)
O número, a morfologia e o arranjo dos cromossomos são característicos

da espécie. Além de permitir a identificação da linhagem, a análise fina do
cariótipo pode trazer informações importantes que permitem mapear genes em
determinados cromossomos ou correlacionar estados patológicos com
desarranjos cromossômicos. Técnicas refinadas de bandeamento permitem,
ainda, o estudo da replicação e da atividade gênica.
Procedimento:
1. Partir de cultura em fase exponencial. Fazer um certo número de placas ou

frascos contendo no mínimo 106 células.
2. Adicionar colchicina para concentração final 0,1µg/ml e incubar por 1h a
37oC (manipular os frascos ou placas com cuidado para não despregar as
mitoses). A colchicina causa despolimerização de microtúbulos e,
conseqüentemente, acúmulo das células em mitose.
3. Tripsinizar e diluir com PBSA e passar para tubo cônico.
4. Centrifugar (2.000 rpm, 3-5 min. a temperatura ambiente em centrífuga de
mesa) e ressuspender o sedimento em PBSA para lavar.
5. Centrifugar (3-5 min.) e remover o sobrenadante deixando pequeno
volume (0,1ml) para ressuspender o sedimento (por agitação suave
batendo o tubo levemente na mão.
6. Adicionar 5ml de solução hipotônica (0,56% KCl) homogeneizando a
suspensão com extremo cuidado para não lisar as células.
7. Deixar 15 min a temperatura ambiente (20-22oC).
8. Adicionar fixador recém preparado (3 partes de metanol e 1 parte de ácido
acético glacial) gota a gota, agitando suavemente com a própria pipeta
contendo o fixador até completar 1ml.
9. Centrifugar e remover o sobrenadante deixando pequeno volume (0,1ml)
para ressuspender o sedimento por leve agitação.
10. Adicionar 5ml de fixador, homogeneizar a suspensão com cuidado e
centrifugar, deixando sempre um pequeno volume do sobrenadante para
ressuspender o sedimento antes de adicionar a solução.
11. Repetir a etapa 10 mais uma ou duas vezes.
12. Finalmente ressuspender o sedimento em pequeno volume (0,2-0,5ml de
fixador obtendo uma suspensão de células bem concentrada.
13. Colocar lâminas limpas (lavadas em detergente, 95% álcool e secas com
papel absorvente) em plano inclinado (45oC).
14. Pingar a suspensão de células nas lâminas, deixar escorrer e secar ao ar.
Dependendo da quantidade de material na suspensão, mais gotas podem
ser pingadas na mesma lâmina.
15. Corar com orceina acética ou Giemsa.

16. Tornar a preparação permanente, montar com lamínulas e observar em

imersão.
17. Fotografar, ampliar as fotos e fazer montagem do cariótipo.
18. Para fazer cariótipo sem tripsinizar ou suspender as células (ver PNAS 75,
no 4, p. 1830-1833, 1978). Após tratamento com colchicina, a camada de
células (em lamínulas ou em placa) é submetida à solução hipotônica por
15 minutos a 37oC. As células são então fixadas "in situ" com
metanol/ácido acético (3:1) por 30 min, lavadas, montadas e examinadas.
Bandeamento Cromossômico:
As lâminas de cariótipo podem ser utilizadas para diversos tipos de

bandeamento (banda C, bandaG, banda NOR etc.). Os protocolos estão
descritos no Apêndice. Modernamente, as técnicas de DNA recombinante
abriram amplas perspectivas de análise citogenética ("pintura" cromossômica,
hibridização “in-situ" etc.).
Referências:
Bloom, S.E. & Goodpasture, C. (1976) An improved technique for selective

silver staining of nucleolar organizer regions in human chromosomes.
Hum. Gent. 34, 199.
Seabright, M. (1972) The use of proteolytic enzymes for the mapping of
structural rearrangements in the chromosomes of man. Chromosoma 36,
204.
Summer, A.T., Evans, H.J. & Buckland, R.A. (1971) A new technique for
distinguishing between human chromosomes. Nature N.B. 232, 31.
Tjio, J.H. & Puck, T.T. (1958) The somatic chromosome of man. Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 44, 1229.
Yunis, J.J. (1983) The chromosomal basis of human neoplasia. Science 221,
227.

Soluções:
Tampão HEBS:
4g NaCl
0,19g KCl
0,05g Na2 HPO4 (anidro)
0,5g glicose
2,5g HEPES
Acertar pH para exatamente 7,1; esterilizar por filtração em membranas
Millipore GS (0,2µm).
1,25 M CaCl2:
919 mg CaCl2 . 2 H2O em 5ml H2O
Esterilizar por filtração.
DNA carregador de salmão, timo de boi ou de linhagens celulares. Fazer uma

solução 1mg/ml (acertar concentração pela A260 nm usando a relação: 1A260 =
50µg/ml) quebrar o DNA passando exaustivamente por seringa com agulha
grossa e depois bem fina (seringa de insulina). Desnaturar (20 min, 100oC) e
guardar à –20oC.
Sugestão:
Placa No. DNA Plasmídeo Outro DNA Método

carregador Marcador
1 + - - Cálcio
2 + + (EJ-ras) Cálcio
3 + + - Lipossomo
4 + + (EJ-ras) Lipossomo
Ao final do experimento, responder: Detectou algum foco de

transformação no ensaio de foco? Em que placa? Pode atribuir atividade
transformante ao oncogene transfectado? Das colônias resistentes
selecionadas, encontra variação na morfologia de uma placa para outra? A que
se pode atribuir isto? Se a atividade de alguns oncogenes está associada a
crescimento mas não à transformação, como faria para detectar esta
atividade? Como se comparam os 2 métodos de transfecção utilizados?

Referências
Armelin, H., Armelin, M.C.S., Kelly, K., Stewart, T., Leder, P., Cochran, B. &
Stiles, C. (1984). Functional role for c-myc in mitogenic response to
PDGF. Nature 310, 655.
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Davies, J. & Smith, D.I. (1978) Plasmid-determined resistance to antimicrobial
agents. Ann. Rev. Microbiol. 32, 469.
Felgner, P.L. & Holm, M. (1989) Cationic liposome-mediated transfection.
Focus 11(2) 21-27.
Graham, F.L. & Van der Eb, A.J. (1973) A new technique for the assay of
infectivity of human adenovirus-5 DNA. Virology 52, 456.
Land, H., Parada, L. & Weinberg, R. (1983) Tumorigenic conversion of primary
embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. Nature
304, 596.
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mammalian cells: fate of exogenously added DNA monitored by the use
of fluorescent dyes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 422.
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by DNA-mediated gene transfer. Science 209, 1414.
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resitance with a bacterial gene under control of the SV40 early region
promoter. J. Mol. Appl. Genet. 1, 327.
Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.;
Smith, J. A. & Struhl, K. (1997) Current Protocols in Molecular Biology.
Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Boston,
USA.

Exp. 6 - Curvas de sobrevivência
A curva de sobrevivência é utilizada para determinar o potencial de um

determinado agente em promover a morte ou a proliferação celular. O método
consiste no plaqueamento de células em substrato sólidos, como o realizado no
Experimento 2, numa densidade adequada para a obtenção de colônias bem
isoladas. O agente é adicionado em diferentes doses, normalmente com
variação logarítmica da concentração, em duplicatas ou triplicatas. Outras
alternativas de protocolo podem ser desenhadas.
No presente experimento testaremos a toxicidade do peróxido de
hidrogênio (H2O2) no par de células: 3T3 (normal) e SVT2 (transformada).
Procedimento:
Para cada uma das 2 linhagens, plaquear 10 p35 com 5x102 células/placa
em DMEM suplementado com 10% de FCS. Dois dias após o plaqueamento,
adicionar peróxido de hidrogênio às duplicatas, seguindo o esquema:
--------------------------------------------------------
Células [H2O2] x 10-5M
--------------------------------------------------------
3T3 0 0,25 0,5 1 2
SVT2 0 0,5 1 2 4
--------------------------------------------------------
O meio de cultura deve ser trocado periodicamente, até o aparecimento

de colônias macroscópicas. As células são então fixadas com formaldeído 3,6%
por 5 minutos e coradas com cristal violeta. O número de colônias obtidas em
cada uma das placas é contado e, baseado nesta contagem, é traçada uma
curva dose-efeito do número de colônias/placa em função da concentração de
H2O2.
Responder: Qual a dose de H2O2 que causa redução de 50% na
viabilidade (DL50)? Esta dose foi diferente para cada linhagem celular? Discuta
possíveis causas.

Exp. 7 - Crescimento em suspensão de agarose
De todos os parâmetros de transformação, o que melhor correlaciona

com oncogenicidade (capacidade de induzir o desenvolvimento de tumor
quando injetada em animal) é a aquisição da capacidade de crescer em meio
semi-sólido (agar, agarose ou metilcelulose).
Utilizando o protocolo descrito a seguir, comparar as linhagens celulares
quanto à capacidade de crescer em suspensão. Plaquear as células 3T3 e SVT2
em duplicata e em 2 densidades diferentes: 3x103 e 3x104 células/poço de
1,8cm2 de área (bandeja de 24 poços). Renovar o meio líquido,
periodicamente, até o desenvolvimento de colônias macroscópicas (10-20
dias).
CUIDADO: caprichar na técnica para evitar contaminação com bactérias e
fungos indesejáveis.
Procedimento: (método simplificado de Hugo Armelin e Mari Sogayar)
1. Preparar: a) DMEM 2x concentrado, esterilizado por filtração em membrana

Millipore tipo GS (0,2µm); b) agarose 1,2 % em H2O bidestilada; c)
agarose 0,6% em H2O bidestilada. Antes de autoclavar agarose, marque o
nível do líquido para completar, se necessário, após autoclavagem, com
água estéril.
2. Derreter as soluções de agarose (1,2 e 0,6%), homogeneizar com pipeta
estéril e manter em banho de 45oC juntamente com o DMEM (2x) e FCS.
3. Na capela, usando um béquer com água à 45oC, aquecer primeiro um
frasco estéril e misturar aí o DMEM (2x), o soro e a agarose 1,2% de modo
a obter a chamada agarose dura (0,6% agarose em 10% FCS-DMEM).
Misturar rapidamente e distribuir para bandeja de 24 poços
(aproximadamente 0,5ml/poço). Depois de gelificado, a bandeja pode ser
usada ou guardada na geladeira por semanas.
4. Usando cultura no melhor estado possível, preparar uma suspensão
homogênea de células isoladas (este ponto é crítico para garantir que cada
colônia provenha de uma única célula). Determinar células/ml.
5. Fazer diluições seriadas da suspensão em meio 10% FCS líquido de modo a
ter: 106, 105, 104 e 103 células/ml.
6. Preparar o meio de agarose semi sólida (0,3% agarose em 10% FCS-
DMEM) a partir de DMEM (2x), soro e agarose 0,6% e deixar no banho
Maria a 45oC.
7. Distribuir alíquotas (de 0,1ml) de cada diluição seriada para os poços de
modo a ter 103 e 104 células/poço em duplicatas.
8. Pipetar 1 ml de agarose semi sólida (40-45oC) para cada poço
(temperatura ambiente) e deixar solidificar.
9. Depois de completa gelificação (15-30 min), incubar a bandeja em câmara
úmida, 5% CO2/ar e 37oC.

10. No dia seguinte e a cada 3-4 dias, adicionar a cada poço 0,5 ml de 10%
FCS-DMEM, tomando CUIDADO para não danificar a agarose. Para remover
o meio líquido, apontar a pipeta Pasteur para a parede do poço.
11. Ao final de 2 a 4 semanas, contar as colônias com lupa ou a olho nu.
Quantificar crescimento pela contagem do número de colônias
desenvolvidas em relação ao número de células plaqueadas ou EFICIÊNCIA
DE PLAQUEAMENTO (EP) EM SUSPENSÃO:
EP (%):= Número de colônias/ Número de células plaqueadas x 100.
Responder: Encontrou diferenças entre as linhagens celulares testadas?

Sabendo a origem e história de cada linhagem, os resultados permitem traçar
algum paralelismo entre capacidade de desenvolver colônias em agarose,
transformação neoplásica e oncogênese?
Referências:
Freedman, V.H. & Shin, S. (1974) Cellular tumorigenicity in nude mice:

correlation with cell growth in semi-solid medium Cell 3, 355.
Peehl, D. & Stanbridge, E.J. (1981) Anchorage-independent growth of normal
human fibroblasts. Proc. Nac. Acad. Sci. USA 78, 3053.
Roberts, A.B., Frolik, C., Anzano, M. & Sporn, M.B. (1983) Transforming
growth factors from neoplastic and non neoplastic tissues. Fed. Proc. 42,
2621.
Sporn, M.B. & Roberts, A.B. (1985) Autocrine growth factors and cancer.
Nature, 313, 745.

Exp. 8 - Ensaio de atividade mitogênica de fatores de crescimento
Um esquema simples e prático para medir a atividade de fatores de

crescimento foi proposto por Armelin em 1973 (Armelin et al, 1973). O ensaio
consiste em submeter às células a condições (em geral carência de soro) nas
quais não crescem, ficando bloqueadas em G0 (células que não estão
ciclando). A atividade de hormônios e fatores de crescimento é medida, então,
pela capacidade de desencadear a saída das células de G0, entrada em S e,
finalmente, divisão celular. Medidas de síntese de DNA podem ser obtidas
através da utilização de precursores de nucleotídeos marcados com isótopos
radioativos ou de bases modificadas que são reconhecidas por anticorpos
específicos. No primeiro caso, a adição de 3H-timidina ao meio permite
medirmos a incorporação deste precursor ao DNA ou a percentagem de
núcleos radiativamente marcados, por autoradiografia. Usando este ensaio
básico, diversos fatores de crescimento foram isolados e purificados,
permitindo, assim, o estudo do papel fisiológico destes fatores e seus
mecanismos de ação.
Diversas variações do esquema básico podem ser desenhadas. Vamos
adotar aqui trabalhar com células G0 de cultura esparsa carenciada para soro.
Procedimento:
1. Plaquear células A31 (Balb-3T3) em bandejas de 48 poços (104

células/poço) usando 0,5ml/poço de meio 5% FCS.
2. No dia seguinte, lavar (1x) com PBS e mudar o meio para 0,2% soro (ou
5% plasma).
3. Após 2 dias neste meio "pobre" em fatores de crescimento, fazer as
adições conforme esquema abaixo (pela manhã) e de 3H-timidina no final
do dia (concentração final da solução de timidina por poço: 0,25µCi/ml de
timidina radioativa e 10-7M de timidina fria)
4. Cerca de 24 horas após a reestimulação das células, remover o meio
(radioativo!) e lavar os poços com 5% TCA gelado (2x). Acrescentar 0,2ml
de 0,5M NaOH por poço. Após incubação por cerca de 1h a 37oC para lisar
completamente as células. Introduzir um filtro de papel grosso (1x1,5cm)
em cada poço. Passar os filtros para um béquer contendo cerca de 200ml
de 5% TCA e lavá-los sucessivamente em 5% TCA (1x), etanol (2x) e
acetona (1x). Secar os filtros a 37oC, colocá-los em vials com 3ml de
líquido de cintilação e proceder à contagem da radioatividade em contador
β. Para autoradiografia, cobrir com emulsão ou "stripping film" Kodak ou
Ilford conforme descrito no Apêndice.
Sugestão 1:
Poço no Adições ao meio 0,2% soro

1, 2 (controle negativo)
3, 4 FCS 10% (controle positivo)
5, 6 PDFG (10ng/ml)
7, 8 EGF (10ng/ml)
9, 10 EGF (10ng/ml) + PDGF 10ng/ml)
Sugestão 2:
Poço no Adições ao meio 0,2% soro
1, 2 (controle negativo)
3, 4 FCS 0,25%
5, 6 FCS 1%
7, 8 FCS 5%
9, 10 FCS 10%
Coletar as células dos poços 1 a 10 para medir incorporação e de 11 a 14 para

autoradiografia.
Discutir os resultados.
Obs: O número de células a serem plaqueadas bem como o tempo para o

carenciamento necessário pode variar entre as diferentes linhagens celulares.
Referências:
Armelin, H.A. (1973) Pitutary extracts and steroid hormone in the control of
3T3 cell growth. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 2702.
Armelin, H.A. & Armelin, M.C.S. (1975) Regulation of fibroblast growth in
culture. Biochem. Biophys. Res. Comm. 62, 260.
Barnes, D. & Sato, G. (1980) Serum-free cell culture an unifying approach. Cell
22, 649.
Cohen, S. & Carpenter, G. (1975) Human EGF: isolation and chemical and
biological properties. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 1317.
Kohler, N. & Lipton, A. (1974) Platelets as a source of fibroblast growth-
promoting activity. Exp. Cell. Res. 87, 297.
Ross, R., Glomset, J., Kariya, B. & Harker, L. (1974) A platelet-dependent
serum factor that stimulates the proliferation of arteria smooth muscle
cells in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 1207.

Exp. 9 - Transformação de células BALB-C/3T3 (Clone A31) com Vírus de

Sarcoma Murino (MSV)
Ensaio de Foco de Transformação
Como fonte de MSV usaremos meio condicionado (sobrenadante da

cultura) de células MSV-124-6-NIH-3T3 (produtoras de partículas virais
infectantes). Filtrar o meio condicionado em membrana de nitrocelulose (tipo
HA de 0,45µm) para eliminar células inteiras (que poderiam interferir com o
ensaio).
Procedimento:
Plaquear 10 P35 com 105 células/placa em 1,5ml de 10% FCS-DMEM. No

dia seguinte, 1,5h antes de infectar a cultura, adicione polibreno ao meio de
cultura para concentração final 10µg/ml. Como mostrado por Toyoshima &
Vogt, 1969 (Virology 38, 414) policátions como polibreno, aumentam de 10 a
30 vezes a eficiência de infecção. Para infectar, remova o meio de cultura e
adicione 0,1ml de PBS (para o controle MOCK) ou 0,1ml de meio condicionado
por MSV: sem diluir (original) ou diluído em PBS: 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 em
0,8ml de 10% FCS-DMEM. Duplicatas em todos os pontos.
Incubar com a suspensão de vírus por 1,5h a 37oC agitando aos 45 min
com todo o cuidado, para melhor distribuição. Ao fim deste período de
adsorção, adicionar 1ml de PBS/placa, remover por aspiração e adicionar meio
fresco 10% FCS (2ml/placa). Renovar periodicamente o meio até o
aparecimento de focos (regiões de células empilhadas, de aspecto claramente
transformado), usualmente leva de 7 a 15 dias.
Observar cuidadosamente ao microscópio antes de fixar corar e
quantificar o número de focos/placa para obter a eficiência de transformação
em termos de FFU/ml ("focus forming units").
Referências:
Temin, H.M. & Rubin, H. (1958) Characteristics of an assay for Rous Sarcoma
Virus and Rous Sarcoma Cells in tissue culture. Virology 6, 669.
Todaro, G.J. & Green, H. (1964) An assay for cellular transformation by SV40.
Virology, 23,117-119.

Exp. 10 - Imunofluorescência Indireta
Imunocitoquímica ou imunohistoquímica é uma técnica para a

identificação de um constituinte do tecido (proteína, lipopolissacarídeo, etc.),
“in situ” por meio de uma reação antígeno/anticorpo associado a um marcador
visível.
O antígeno é a proteína ou o alvo de interesse. Um anticorpo é a
estrutura produzida pelo sistema imune para localizar e se ligar a um antígeno
específico. Um antígeno é composto de muitos segmentos denominados
epitopos, onde ocorrerá a ligação do anticorpo.
Em função da relação especial entre antígeno e anticorpo, cuidados
devem ser tomados para assegurar que não ocorra alterações no
reconhecimento entre seus componentes e ao mesmo tempo manter a
integridade do tecido ou célula no qual está o antígeno de interesse.
Tipos de imunomarcação:
O método de imunomarcação direta requer somente um passo no qual o
anticorpo específico é conjugado diretamente a um marcador visível. A
marcação indireta é um método de dois passos no qual é utilizado um
anticorpo específico para o antígeno e um anticorpo secundário conjugado a
um marcador visível. Esta técnica é a mais empregada, não só pela sua
praticidade como - e principalmente - pela sua maior eficiência devido ao
efeito amplificador da fluorescência do segundo antisoro (chamado de
conjugado por estar ligado covalentemente ao fluorocromo). Já a múltipla
marcação (também chamada dupla ou tripla marcação, etc.) refere-se a
localização simultânea de dois ou mais anticorpos diferentes. Neste caso
devem ser utilizados diferentes marcadores para cada anticorpo.

A B
Desenho esquemático da marcação direta (A) e indireta (B).
Marcadores específicos:
A. Sondas Fluorescentes podem ser utilizadas para obter a localização de
um antígeno a nível da luz. Com o surgimento da microscopia confocal,
essa técnica se tornou especialmente poderosa, e relativamente simples.
Compostos como o Isotiocianato de de fluoresceína (FITC), rodamina,
Texas red, etc, são comumente utilizados como fluorocromos.
B. Partículas de ouro são os mais populares “tags” para a imunomarcação
eletrônica. Elas possuem vários tamanhos para serem usados em dupla
marcação.
C. Na reação de Peroxidase é utilizado um “tag” enzimático associado à
uma imunoglobulina com a intenção de utilizar as propriedades
catalíticas da enzima para formar um produto insolúvel.
D. Outros marcadores enzimáticos são a fosfatase alcalina, beta
galactosidase e óxidos de glicose. Essas enzimas, como a peroxidase,
requerem o cromógeno (normalmente diaminobenzidina, DAB ou 3-
amino-9-etilcarbazole, AEC).
No experimento proposto abaixo, deseja-se comparar células normais A31
e transformadas SVT2 quanto a presença, topologia e arquitetura de proteínas
de superfície e de citoesqueleto.
Procedimento:
1. Lavar as lamínulas em etanol 90% e flambá-las rapidamente em um bico

de bunsen.
2. Distribuir as lamínulas em placas de plástico para cultura de células,
adicionar meio de cultura e arranjar de modo que fiquem bem aderidas
(pressionar as lamínulas gentilmente com uma pinça de modo a retirar a
camada de ar que fica entre lamínula e superfície da placa o que ocasiona o
deslizamento das lamínulas uma sobre as outras).
3. Plaquear as células de interesse. Realimentar as culturas periodicamente.

4. Remover o meio e fixar imediatamente com paraformaldeído 2%, Triton X-

100 0,3% em tampão PBS por 10 minutos a 370 C. Lavar duas vezes com
tampão PBS.
5. Para o bloqueio de sítios inespecíficos, incubar as células por 30 minutos, à
temperatura ambiente, em BSA (albumina de soro bovino) 2% em PBS.
6. Em parafilme, aplicar uma gota (30 µl) do 1o anticorpo diluído na solução
de bloqueio e colocar a lamínula por cima da gota, com as células voltadas
para baixo. Incubar em câmara úmida a 370 C, por 45 minutos. Neste
passo deve-se tomar cuidado para que não ocorra evaporação do
anticorpo.
7. Voltar as lamínulas para as plaquinhas e lavar 10 vezes com PBS,
rapidamente. Na última lavagem, acrescentar um pouco da solução de
bloqueio (isto irá facilitar o espalhamento do 20 antisoro).
8. Aplicar o segundo antisoro (diluído em solução de bloqueio), da mesma
maneira como foi feito com o primeiro. Incubá-las em ambiente úmido, a
370 C, por 30 minutos.
9. Lavar exatamente como o passo 7.
10. Aplicar 30 µl da solução de DAPI (marcador de DNA) e deixar durante 15
minutos á temperatura ambiente.
11. Lavar novamente como o passo 7.
12. Limpar uma lâmina com álcool absoluto. Pingar uma gota (10 µl
aproximadamente) de Prolong Antifade (Molecular Probes) e colocar a
lamínula, com a face contendo as células para baixo, sobre a gota. Deixar
secar 30 minutos à temperatura ambiente (no escuro) e guardá-la a
temperatura ambiente. Já está pronta para ser pronta ser observada ao
microscópio de fluorescência.
Notas:
a) A permeabilização só é crítica para o caso de proteínas internas como as de

citoesqueleto; proteínas de superfície dispensam a permeabilização;
b) Além do Triton X-100, inúmeros outros esquemas de permeabilização
podem ser adotados como o metanol (fixa e permeabiliza) e os detergentes,
saponina, NP-40, etc.
c) Outros fixadores podem ser utilizados, como o metanol, acetona,
glutaraldeído, etc. O metanol é um excelente fixador para proteínas de
microtúbulos.
d) Para evitar "fading" (rápido desaparecimento da fluorescência) pode ser
utizado no procedimento de montagem das lâminas, além do Prolong
Antifade, uma solução de 1% de para-fenilenodiamina dihidrocloreto
(Sigma) em glicerol.
Sugestão:
Lamínula no Célula 1o Antisoro 2o Antisoro

1 3T3 --------------- cabra anti IgG

camundongo-FITC
2 3T3 camundongo anti- |
vimentina
3 3T3 coelho anti-FGF |
|
4 SVT2 --------------- |
|
5 SVT2 camundongo anti- |
vimentina
6 SVT2 coelho anti-FGF |
↓
Referências:
Guttman, RD, et.al. 1987. Immunology. Upjohn Kalamazoo, MI 49001.

Hawkes, R. et al. 1982. A Dot-Immunobinding Assay for monoclonaland other
antibodies. Analytical Biochemistry 119, 142-147.
Elias, J. Immunohistopathology, A Practical Approach to Diagnosis, pp164.
Lazarides, E. & Weber, K. (1974) Actin antibody allows the specific
visualization of actin filaments in non-muscle cells. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 71, 2268.
Weber, K., Pollack, R. & Bibring, T. (1975) Antibody against tubulin: the
specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells.
Proc. Nat. Acad. Sci. Usa 72, 459.
Fuker, G., Brinkley, B. & Boughter, J. (1975) Immunofluorescence of mitotic
spindles by using monospecific antibody against bovine brain tubulin.
Science 187, 948.
Osborn, M., Born, T., Koitsch, H. & Weber, K. (1978) Stereo
immunofluorescence microscopy. I. three-dimensional arrangement of
microfilaments, microtubules and tonofilaments.
Armelin, M.C.S. & Armelin, H.A. (1983) Glucocorticoid hormone modulation of
both cell surface and cytoskeleton related to growth control of rat glioma
cells. J. Cell. Biol. 97, 459.

Exp. 11 - Obtenção de bactérias competentes e transformação com DNA

plasmideal
As cepas de E. coli mais comumente empregadas para construção e

propagação de plasmídeos comuns em biologia molecular são DH5α, DH10B e
XL1-blue MRF', mas várias outras linhagens podem ser usadas e podem ter
características específicas para fins especiais. Ver listagens de bactérias nos
livros do Maniatis (Apêndice A3 pag. A3.6-A3.10). É importante partir de
culturas recém plaqueadas e colônias bem isoladas e vigorosas. O protocolo
que permite a preparação de bactérias aptas para serem transformadas com
DNA plasmideal com alta eficiência, é chamado competência. Basicamente, as
bactérias podem ser feitas competentes para serem transformadas por
tratamentos químicos (quimiocompetência) ou por descargas elétricas
(eletrocompetência). Os dois protocolos tem em comum a necessidade de
obtenção de culturas bacterianas em crescimento exponencial e a partir deste
ponto os protocolos diferem de acordo com o método de competência.
Importante:
• Para obtenção de altas eficiências de transformação, a preparação de

bactérias competentes deve ser feita com tudo rigorosamente gelado,
desde a retirada do shaker na densidade óptica de 0,8 até o momento da
transformação. Somente após a transformação e a adição de meio de
cultura fresco as bactérias poderão ficar à temperatura ambiente ou à 37oC.
• O meio de cultura adicionado após a transformação por qualquer método
deve ser sempre um meio mais rico do que LB, como 2YT, Terrific Broth,
SOC ou, preferencialmente, Super Broth, visando aumentar a eficiência de
transformação.
• Para transformar reações de ligação deve-se previamente inativar a ligase
por calor (65oC por 15 minutos), uma vez que a presença de ligase ativa
diminui o número de transformantes em até duas ordens de grandeza.
Além disso, para a transformação por eletroporação, é recomendado a
utilização de pequenos volumes e/ou a diluição 1:3 da reação de ligação
com água Milli-Q, para evitar curto-circuitos que acabam por matar todas as
bactérias. Idealmente, pode-se purificar a reação de ligação para
eletroporação utilizando-se microdiálise ou cromatografia em microcolunas.
A. Obtenção de bactérias em fase exponencial do crescimento:

1. Inocular 5ml de meio LB com uma colônia e incubar à 37oC até o dia
seguinte sob forte agitação para aeração (200-250 rpm). Caso a cepa de
bactéria escolhida já possua uma marca de seleção, este meio deve conter
o antibiótico na concentração adequada (DH5α →Ndxr ;DH10B →Strr ; XL1
Blue MRF' →Tetr).
2. No dia seguinte diluir a pré-cultura 1:100 em 20ml de meio LB, incubar à
37oC sob agitação até OD600nm = 0,5 - 0,8 (fase exponencial).

B. Protocolo para obtenção de bactérias quimiocompetentes e transformação

com DNA plasmideal:
1. Quimiocompetência: Transferir os 20 mL da cultura exponencial para o gelo

e coletar as células por centrifugação (4 Krpm, 5 min). Descartar o
sobrenadante gentilmente e ressuspender o "pellet" de bactérias em 1,5 ml
de solução de CaCl2 0,1M estéril e gelado, preparado no dia.
2. Após 1 hora no gelo estas bactérias quimiocompetentes podem ser
transformadas ou adicionadas de glicerol (concentração final 10%) e
congeladas à -80oC.
3. Transformação: distribuir 0,1 ml/tubo de bactérias competentes. Adicionar
DNA transformante (100 a 500ng) a cada tubo menos um que será o tubo
controle (só bactérias).
4. Incubar em gelo por 20 min antes de dar o choque térmico (42oC, 2 min.
exatos).
5. Adicionar 1 ml/tubo de meio LB e incubar a 37oC em agitador (200-250
rpm).
6. Diluir 1/10 e 1/100 em LB e plaquear 100µl do original e de cada diluição
em placas de agar LB e LB-A (contendo amplicilina 150 µg/ml). Incubar as
placas até o dia seguinte e fazer a avaliação dos resultados (espera-se 50 a
100 colônias de transformantes na diluição 1/100).
7. As bactérias do tubo controle (não transformadas com DNA plasmideal)
devem crescer apenas nas placas LB enquanto os transformantes devem
crescer também no meio seletivo (LB-A).
8. Escolher a placa LB-A adequada que produziu colônias bem isoladas de
transformantes, replaquear uma ou mais colônias em placas LB-A para
purificação dos transformantes.
9. Com alça de platina (ou palito de madeira) tocar o centro de uma colônia
"purificada" de transformante, inocular em 3 ml de meio LB-A líquido e
deixar crescer até a fase estacionária.
10. Para obtenção de estoques: Fazer estoques glicerinados misturando 0,6 ml
da cultura estacionária com 0,4 ml de glicerol autoclavado, misturar e
armazenar à -80oC. Estoques do tipo "stabs" podem e devem ser mantidos:
usando alça de platina introduzir o inóculo em tubos contendo LB-A sólido
(agar), deixar crescer à 37oC fechar bem (selar) e guardar na geladeira (ou
à temperatura ambiente).
Nota: Marcar cuidadosamente cada estoque e manter um registro de

transformantes estocados com data, nome, origem, operador, etc.

C. Protocolo para a obtenção de bactérias eletrocompetentes e transformação

de com DNA-plasmideal:
1. Eletrocompetência: Após obtenção de 20 mL de cultura bacteriana em fase

exponencial, descartar gentilmente o sobrenadante e ressuspender o
"pellet" com um volume de água Milli-Q gelada. Centrifugar novamente e
repetir este processo num total de 3 vezes para a remoção do excesso de
sal.
2. Ressuspender o "pellet" em 400 µL solução 10% glicerol, desta maneira as
bactérias se tornaram eletrocompetentes, e podem ser congeladas a –80°C.
3. Transformação: colocar misturar 40 µL das bactérias eletrocompetentes
com 2 a 10 ng de DNA recombinante num pequeno volume (de 1-2 µL, ou
então o mesmo volume de ligação previamente inativada) e dispensar esta
mistura dentro de cubetas de eletroporação (1 a 2 mm de "gap" entre os
eletrodos) previamente incubadas no gelo. Submetê-las à um pulso elétrico
no eletroporador (EC-100, EC Apparatus Corporation) com tensão de 1800
a 2500 kV, 25 µF, 200 Ω.
4. Imediatamente após o choque adicionar 1 ml de meio Superbroth e incubar
as bactérias à 37°C sob agitação por 1 hora.
5. Plaquear de 50 a 100 ul de bactérias transformadas em placas de LB-Ágar
e LB-Agar-ampicilina (150 µg/ml) em diferentes diluições como na
transformação de bactérias quimiocompetentes e incubar à 37°C
"overnight".

Exp. 12 - Preparação de DNA plasmideal em pequena escala ("Mini-Prep")
Utilizar bactérias transformadas, obtidas conforme descrito no ítem

"Transformação de bactérias" deste Apêndice.
1. Inocular 3ml de meio LB-A líquido (150µg/ml ampicilina) com uma colônia
de bactéria transformada (o estoque glicerinado também pode ser usado) e
incubar a 37oC até o dia seguinte com agitação forte (200-250 rpm).
2. Centrifugar as bactérias (4000 g, 5 minutos), descartar o sobrenadante e
ressuspender em 0,2ml de tampão GET.
3. À suspensão de bactérias, adicionar 0,2 ml de solução de lise. A solução de
lise deve ser adicionada à temperatura ambiente (SDS precipita à frio) e o
tubo deve ser invertido lentamente 5 vezes. Incubar a solução à
temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Adicionar 0,2ml de solução de neutralização. Misturar por inversão
lentamente 5 vezes. Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
5. Centrifugar à velocidade máxima por 5 minutos para separar o
sobrenadante dos "debris" celulares.
6. Transferir o sobrenadante para um tubo novo.
7. Adicionar 350 µl de isopropanol e 0,1 volume de NaAc (5M, pH 4.5).
Homogeneizar e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
Centrifugar à velocidade máxima por 10 minutos. Descartar o
sobrenadante e lavar com 1 ml etanol 70% por 5 minutos à velocidade
máxima.
8. Secar à temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos.
9. Ressuspender o "pellet" em 50µl de água Milli-Q estéril. Neste ponto, pode-
se fazer um gel de agarose 0.8% corado por brometo de etídeo para ter
uma idéia da concentração do DNA plasmideal (aplicar 5µl).
Soluções:
Tampão GET
50mM glicose
25mM Tris-Cl pH 8,5
10mM EDTA pH 8
Solução de lise
0,2M NaOH
1% SDS
Solução de Neutralização - 3 M KAc pH 4,8

29,44g KAc (PM 98,14) dissolvidos em 30ml H2O. Acertar o pH para 4,8 por
adição de ácido acético glacial (30ml) e para volume final 100ml.

Exp. 13 - Purificação em larga escala de DNA plasmideal em gradiente de

cloreto de césio.
1. Aos 3,0 ml da preparação de DNA plasmideal, adicionar exatamente 3,0 g

CsCl (o volume passa a 3,8 ml).
2. Preparar solução de CsCl na base de 1g de sal para 1ml de TE autoclavado.
3. Aos 3,8 mL de DNA plasmideal, acrescentar 3,1 ml de solução de CsCl e
0,8 ml de EtBr 10mg/ml em H2O. Misturar bem, verificar a densidade, que
deve ser de 1,55g/ml (η= 1,3860) e transferir para tubo de polialômero do
rotor Type 50 (Beckman). Completar com Nujol, fechar, calibrar os tubos e
centrifugar a 38 Krpm, 40 horas, 20oC.
4. Coletar a banda inferior (DNA plasmideal circular fechado). A banda
superior é de DNA plasmideal linear e circular "nicked". A coleta pode ser
feita com uma seringa (abrir o tubo primeiro) ou com pipeta Pasteur (que
não inutiliza o tubo). Neste método o RNA fica no fundo do tubo e a
proteína complexada forma flocos que ficam na parte de cima ou aderidos
à parede do tubo.
Notas:
a) Inúmeros protocolos alternativos podem ser usados. Este foi adaptado às
nossas condições (econômicas) mostrando bom rendimento (de 0,5 a 2,5
mg/50ml de cultura).
b) Cloranfenicol pode ser substituído pelo produto comercial (Quemicetina
Succinato, injetável) porém com o dobro da concentração (350 µg/ml).

Exp. 14 - Restrição e diagnóstico do DNA plasmideal.
Preparações de DNA plasmideal, purificadas em CsCl, devem ser testadas

antes de usar, para certificação e diagnóstico. A escolha da(s) enzima(s) de
restrição deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou optar
pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a poder caracterizar o
plasmídeo em questão.
Basicamente, as enzimas de restrição classificam-se em 3 grupos quanto
à força iônica ótima para atividade (alta, média e baixa ou A, M, B). Preparar
estoques 10X concentrados seguindo a tabela:
Tampão de Restrição 10X Concentrado
Força iônica
Baixa Média Alta
1M Tris-Cl pH 7,5 0,1 0,1 0,5
1M MgCl2 0,1 0,1 0,1
0,1M DTT 0,1 0,1 0,1
5M NaCl - 0,1 0,2

H2O para 1ml 0,7 0,6 0,1
TODAS AS SOLUÇÕES (exceto DTT ou ditiotrietol) devem ser ESTÉREIS.

Aliquotar e manter à -20oC.
Nota: As enzimas de restrição comercialmente disponíveis costumam vir

acompanhadas do tampão correspondente e instruções para montar a reação.
Procedimento:
1. Montar a digestão em 10µl, por exemplo:
H2O 7µl
DNA 2µl (2µg)
Tampão M (10X) 1µl
0,1M DTT 0,5µl
Enz. Restrição 0,5µl (2 unidades)
2. Incubar na temperatura adequada (em geral 37oC) por 1h e parar a reação

por adição de EDTA (não é obrigatório).

3. Preparar as amostras para 10% glicerol; 0,025% azul de bromofenol;

0,025% xileno cianol; 0,5XTBE.
4. Aplicar amostras (1-2µg) de DNA plasmideal não digerido e digerido com
enzima de restrição ao gel de agarose 0,7% em tampão 0,5X TBE.
Acrescentar um padrão de peso molecular (fago lambda digerido com Hind
III).
5. Fazer eletroforese em voltagem constante (0,5X TBE) até o azul de
bromofenol chegar ao final do gel.
6. Corar com EtBr (0,5ug/ml) fotografar e analisar os resultados.

Exp. 15 - Subclonagem ou clonagem molecular em vetores plasmidiais
Digestão do DNA plasmideal para preparação de vetor e fragmento de cDNA:
Proceder conforme descrito para Restrição de DNA e Diagnóstico de

plasmídeos, utilizando, para o vetor, a(s) enzima(s) que abre(m) a dupla fita
circular de DNA plasmideal no(s) sítio(s) desejado(s) e, para o plasmídeo
portador do inserto, a(s) enzima(s) da restrição que permite(m) remover o
fragmento de cDNA ou de DNA genômico (inserto).
Após a digestão, vetor e inserto são preparados para a ligação:
Defosforilação do vetor: é feita através de uma reação enzimática com

fosfatase de intestino de vitela (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP).
Esta etapa é importante para evitar a religação do próprio DNA do vetor ao
invés de ligação do vetor com o inserto de cDNA e desta maneira aumentar a
freqüência de clones recombinantes.
Procedimento
1. Após a digestão, extrair com fenol-clorofórmio (1X) e clorofórmio-álcool

isoamílico (1) e precipitar com 0,3 M acetato de sódio e 2 volumes de
etanol. Centrifugar (12 Krpm, 10 min., à frio), LAVAR BEM o "pellet" de
DNA com 70% etanol e ressuspender em 10µl TE pH 8,0.
2. Incubar (37oC, 30 min) 10-20 µg DNA do vetor já linearizado por digestão
com a(s) enzima(s) de restrição adequada(s), com cerca de 10-20
unidades de fosfatase (CIAP) na presença do tampão de fosfatase ou do
tampão de restrição, e, após este período, adicionar a mesma quantidade
de fosfatase e incubar por 30 minutos adicionais a 55oC.
3. Adicionar NaAc para concentração final 0,3M e precipitar o DNA com 2-3
volumes de etanol. Lavar (2X) o "pellet" de DNA com 70% etanol, secar e
redissolver o DNA em pequeno volume de H2O estéril ou TE. Nesta etapa o
DNA plasmideal digerido e defosforilado também pode ser purificado por
colunas de matriz de fibra de vidro (ex: Kit GFX, Amersham Pharmacia
Biotech).
4. Inativar a fosfatase adicionando 2 volumes de 0,5% SDS, 5mM EDTA em
TE. Misturar bem.
5. Acrescentar Proteinase K para concentração final 100 µg/ml e incubar
(55oC, 30min)
6. Extrair com fenol/clorofórmio (2X) e com clorofórmio/álcool isoamílico
(1X). Precipitar com 0,3M NaAc e 2 volumes de etanol.
7. Centrifugar (12Krpm, 10 min. à frio) Lavar o "pellet" de DNA com 70%
etanol, secar e ressuspender em pequeno volume (5-10µl) de TE.

Preparação do inserto de DNA (cDNA ou fragmento subgenômico)
1. Após digestão com a(s) enzima(s) que removem o inserto da construção

plasmideal, preparar um mini-gel para analisar os produtos da reação,
utilizando DNA de fago lambda digerido com HindIII como marcador de
peso molecular.
2. Uma vez confirmada a digestão, preparar um gel de agarose do tipo
preparativo (11 x 14cm, por exemplo) contendo EtBr (10 µg/50ml de gel).
3. Adicionar tampão de amostra (50% glicerol + corantes) ao DNA digerido de
modo a obter concentração final de 10% glicerol.
4. Dividir a amostra de DNA digerido em 3 ou 4 poços e submeter à
eletroforese (80-100 volts) até que o azul de bromofenol atinja 1-2 cm do
final do gel.
5. Identificar a banda de interesse e remover o inserto usando um dos
métodos comumente empregados.
- kit de purificação com microcolunas de sílica (GFX, Amesham):
1. Recortar a banda de interesse com a menor quantidade possível de

agarose, utilizando uma lâmina nova e limpa (para evitar contaminação
cruzada de DNA).
2. Adicionar, ao tubo contendo o fragmento de agarose (no máximo 300 mg
de agarose), adicionar 1 µl de "Capture Buffer" por mg de agarose (300 µl
no máximo).
3. Aquecer a 60oC até solubilizar por completo o fragmento de agarose.
Transferir este soluto para a microcoluna previamente colocada dentro de
um tubo para microcentrífuga de 2 mL, sem a tampa.
4. Centrifugar por 1 minuto à velocidade máxima e descartar o líquido que
passou pela coluna. O DNA estará contido na sílica presente dentro da
coluna.
5. Pipetar 500 µl de "Wash Buffer" (que contém etanol) dentro da microcoluna.
Novamente centrifugar 1 minuto à velocidade máxima e descartar o líquido
que passou pela coluna. Recentrifugar por mais um minuto para secar bem
a microcoluna.
6. Passar a microcoluna para um outro tubo tipo "eppendorff" que conterá o
DNA a ser eluído da coluna. Pipetar 50 µl de água Milli-Q aquecida na
coluna, aguardar 1 minuto e centrifugar por 2 minutos à velocidade máxima
para coletar o DNA eluído no fundo do tubo. Este protocolo purifica o DNA
de interesse de enzimas e outras proteínas, sal, e demais outras moléculas
pequenas que ocasionalmente estejam presentes, como por exemplo,
oligonucleotídios, no caso de se estar purificando produtos de PCR. Além
disso, kits similares a estes se prestam também para a purificação eficiente
de DNA em solução, como por exemplo, produtos de PCR, produtos de
digestão ou DNA tratado enzimaticamente com outros tipos de enzimas
modificadoras, bastando para isto a solubilização da amostra (de até 100 µl)

em 500 µl de "Capture Buffer", seguido das demais etapas como para

purificação de DNA em gel.
- por eletroeluição:
1. Recortar a banda de interesse com a menor quantidade possível de

agarose, utilizando uma lâmina nova e limpa (para evitar contaminação
cruzada de DNA).
2. Introduzir o fragmento de agarose contendo o DNA de interesse, num
saquinho de diálise previamente lavado e tratado com TE.
3. Adicionar pequeno volume (100-200 µl) de TE, fechar o saquinho e
submeter à eletroforese (80V, 1h).
4. Abrir o saquinho, pipetar o líquido, contendo o DNA, para um tubo
eppendorf de 1.5 ml.
5. Extrair o EtBr com 2 volumes de butanol. Agitar, centrifugar (5Krpm, 2min.)
e desprezar a fase superior (butanol + EtBr). O DNA está na fase inferior
(aquosa).
6. Precipitar o DNA com 0,3M NaAC e 2-3 volumes de etanol. Centrifugar,
lavar o "pellet" com 70% etanol e redissolver em pequeno volume (5-20µl)
de H2O estéril ou TE.
- por membrana de DEAE-celulose:
1. Após identificar a banda de interesse, fazer um corte no gel 0,2-0,5cm

abaixo da banda, de tamanho pouco maior que a banda.
2. Com auxílio de pinça estéril, introduzir no corte um pedaço de membrana
de DEAE-celulose devidamente ativada, conforme recomendado pelo
fabricante.
3. Voltar o gel para a cuba de eletroforese e submeter à corrente elétrica (80
volts) por 20-30 minutos, até que o DNA corado com EtBr passe da agarose
para a membrana.
4. Remover a membrana de DEAE-celulose, contendo o DNA corado com EtBr,
introduzindo-a em 200µl de tampão de eluição. Monitorar a eluição com
lâmpada UV. Incubar (65oC, 15min.) até completa eluição.
5. Remover a membrana e precipitar o DNA com 0,3M NaAc e 2-3 volumes de
etanol. Coletar por centrifugação, lavar o pellet com 70% etanol, secar e
ressuspender em pequeno volume (5-20µl) H2O estéril ou TE.
Ligação de DNA
1. Preparar vetor e inserto conforme recomendado acima.

2. Utilizar uma proporção de inserto para vetor de 3:1 para otimizar o
processo.
3. Montar a reação de ligação (volume total de 20 µl) usando 1 parte de vetor
(por exemplo, 200ng) e 3 partes de inserto (600ng). Acrescentar 2µl de

tampão de ligase com ATP (10X conc.) 1 µl de Ligase (5 unidades Weiss) e

H2O estéril para completar 20µl.
4. Incubar (15oC, 2-24h)
5. Após a ligação, o DNA deve estar pronto para ser utilizado na
transformação de bactérias competentes.
Nota: Além do DNA recombinante (ligado) é recomendável incluir os seguintes

controles na transformação de bactérias:
a) Vetor inteiro (não digerido).

b) Vetor digerido, não-tratado com fosfatase nem com ligase.
c) Vetor digerido, não tratado com fosfatase, incubado com ligase.
d) Vetor digerido e defosforilado incubado com ligase.
e) Note que o ítem a funciona como controle da transformação, b e c da ligase
e d da fosfatase.
Isolamento e purificação de recombinantes
Usar alça de platina (ou palito de madeira) para pegar apenas a parte
central da colônia. Re-inocular em meio seletivo fazendo esgotamento para
obter colônias isoladas.
Inocular material de colônias re-selecionadas, em meio seletivo, incubar
até fase estacionária do crescimento, fazer estoques glicerinados (em 40%
glicerol) e armazenar à -80oC.

Exp. 16 - Sequenciamento de DNA
A determinação da seqüência de nucleotídeos no DNA é baseada na

síntese/terminação de cadeias polinucleotídicas complementares ao DNA que
se deseja seqüenciar. O método, desenvolvido por Sanger e colaboradores,
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463, 1977) envolve a utilização de 4 tipos de
2', 3' -dideoxinucleosídeos trifosfatos, que aprsentam o grupo 3' - hidroxila
ausente em suas estruturas (Fig 1).
Fig. 1 : Estrutura dos ribonucleosídeos trifosfatos (NTP), deoxirribonuclesídeo

trifosfatos (dNTP) e dideoxirribonucleosídeo trifosfato (ddNTP). Fonte :
Molecular Cell Biology
Neste método, uma molécula de DNA serve como molde , sendo que,
um oligodeoxinucleotídeo é utilizado como "primer" para a síntese in vitro da
cadeia complementar pela DNA polimerase, estendendo-se até que um ddNTP
seja incorporado, interrompendo a replicação (a falta do grupo OH na
extremidade 3' do ddNTP previne a incorporação do próximo nucleotídeo).
Existem duas formas de visualização dos produtos da síntese por
marcação radioativa ou não-radioativa:
• Utilizando o primer marcado na sua extremidade 5' (Fig.2).
• Ou utilizando os deoxiribonuclesídeos marcados.
Os produtos de um conjunto de 4 reações separadas (com ddA, ddT, ddC
e ddG) são fracionados por tamanho em gel de poliacrilamida de alta resolução
e detectados por exposição do gel (seco) a filme de raio X (Fig.2).

G A T C
c)
Fig. 2. (Figure 7-29- from Molecular Cell Biology). Sanger (dideoxy) method for
sequencing DNA fragments. (a) A single strand of the DNA to be sequenced
(blue line) is hybridized to a 5′-end-labeled synthetic deoxyribonucleotide
primer. The primer is elongated in four separate reaction mixtures containing
the four normal deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) plus one of the
four dideoxyribonucleoside triphosphates (ddNTPs) in a ratio of 100 to 1. A
ddNTP molecule can add at the position of the corresponding normal dNTP, but

when this occurs, chain elongation stops because the ddNTP lacks a 3′
hydroxyl. In time, each reaction mixture will contain a mixture of prematurely
terminated chains ending at every occurrence of the ddNTP (yellow). (b) Three
of the labeled chains that would be generated in the presence of ddGTP from
the specific DNA sequence shown in blue. c) Resultado de sequenciamento
automático e autorradiografia de um gel de sequenciamento manual feito com
isótopo radioativo
(http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/seq_anal.htm).
Os nucleotídeos marcados mais utilizados para seqüenciamento de DNA

são: 9-32P-dATP e α-35S-dATP. Recentemente, foi introduzido o radionuclídeo 9-
33
P-dATP com grande vantagem em termos de segurança para o usuário devido
ao seu menor potencial de penetração.
É possível também, sequenciar o DNA por outra técnica chamada Cycle
Sequencing, semelhante à PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) mas
utilizando apenas um primer específico, marcado radioativamente com 132P ou
com 1-33P-ATP, através da T4 polinucleotídeo quinase.
Kits comerciais contendo todos os ingredientes necessários (menos o
dNTP radiativamente marcado) encontram-se disponíveis no mercado,
oferecidos por diversas empresas (GIBCO/BRL, Pharmacia, etc).
O seqüenciamento automático se baseia no mesmo princípio que o
manual, no entanto, as reações são feitas em um único tubo com os 4 ddNTPS
marcados com substâncias fluorescentes que, ao ser excitadas por um "laser",
emite luz em diferentes comprimentos de onda, permitindo que a reação seja
submetida a eletroforese em um único poço. Por essa razão os seqüenciadores
automáticos permitem o seqüenciamento de várias amostras ao mesmo
tempo, o que implica em uma maior demanda de amostras ou múltiplos
usuários. A última geração de sequenciadores automáticos já não contam mais
com géis de poliacrilamida, e sim com capilares muito finos que contém uma
resina, através da qual os fragmentos fluorescentes vão passando e sendo
lidos pelo laser. Os dados do sequenciamento são armazenados em um
computador e podem ser visualizados na forma de um eletroferograma (Fig.3)
e também como um arquivo texto.
Fig.3: (Figure 12-24 from An Introduction to Genetic Analysis.) Printout from

an automatic sequencer that uses fluorescent dyes. N represents a base that
cannot be assigned.

Procedimento:
Uso do “DYEnamicTM ET terminator cycle sequencing premix kit” (Amersham

Pharmacia Biotech)
1. Para cada template a ser sequenciado colocar :
2 µl Sequencing reagent premix

0.5 µl Primer 100 µM
------ DNA de interesse (preparação plasmideal em pequena
escala ou produto de PCR)
qsp para 10µl Água
_________
10 µl Volume total final
Misturar bem
2. Colocar os tubos (ou placa de 96 wells) no termociclador e ciclar 30 vezes

com o seguinte programa :
• 95° C, 20 segundos
• 50° C, 15 segundos
• 60° C, 1 minuto
3. Adicionar 2 µl de Buffer Acetato de Sódo/EDTA e 80 µl de etanol absoluto.

Misturar bem e incubar em gelo por 20 minutos.
4. Centrifugar a velocidade máxima por 30 minutos. Descartar o
sobrenadante.
5. Lavar com 150 µl de etanol 75%. Centrifugar por 10 minutos
6. Descartar o sobranadante e deixar secar por alguns minutos.
7. Ressuspender o pellet em 2 µl de loading dye.
8. Aplicar as amostras no gel de sequenciamento.

Preparação do gel :
O gel utilizado é comercial (pronto para uso) e sua preparação é feita

segundo as indicações do fabricante.
As placas de vidro são exaustivamente lavadas e checadas antes de
montar o gel, pois, qualquer vestígio de fluorescência intereferiria na
eletroforese do sequenciamento.
A eletroforese é realizada em tampão TBE 1 1X (tampão
Tris/Borato/EDTA), por aproximadamente 7 horas (Aparelho ABI 377).
Ferramentas de Bioinformática utilizadas para análise dos dados
A enorme quantidade de dados biológicos disponíveis hoje em dia, em

virtude do seqüenciamento completo de grandes genomas e da aplicação e
desenvolvimento de diversas outras técnicas "high-throughput", culminou no
desenvolvimento de recursos computacionais sofisticados para análise e
integração desta quantidade maciça de informação e no surgimento da
Bioinformática como um ramo da tecnologia da informação dedicada à
compilação e geração de dados biológicos ("data mining"). Este ramo da
ciência da computação tem sido de vital importância por disponibilizar
ferramentas que permitem, dentre inúmeras outras coisas, o alinhamento
múltiplo de seqüências para compor a seqüência final de um genoma ou para
identificar genes e proteínas homólogas, a compilação de dados de expressão
de milhares de genes simultaneamente, a predição de novos genes em regiões
genômicas previamente desconhecidas, etc.
Alinhamento múltiplo e montagem de resultados de seqüenciamento

automático ("finishing")
Pacote PHRED/PHRAP/CONSED
Pacote desenvolvido na Universidade de Washington e distribuído
gratuitamente.
Phred: converte as intensidades de fluorescência da reação de seqüenciamento
em uma seqüência de quatro letras (A, C, G, T) e calcula os valores de
qualidade associados a cada base da seqüência. O arquivo de entrada é o
cromatograma e como saída, é obtido um arquivo do tipo <nome do
arquivo>.phd que contêm tanto a seqüência quanto os valores de qualidade.
Phd2fasta: é um script intermediário que transforma o arquivo do tipo phd
gerado pelo programa Phred em um arquivo em formato fasta para que seja
posteriormente utilizado por outros programas como Blast, Phrap, e outros.

Cross_match: é um outro script intermediário que, dado um arquivo em

formato fasta, faz o mascaramento de regiões de baixa complexidade e a
remoção de possíveis vetores existentes na seqüência.
Phrap: faz a montagem dos fragmentos de seqüências. Para isso, ele utiliza os
resultados dos valores de qualidade produzidos anteriormente pelo Phred.
Consed: é um bom editor de seqüências para finishing e montagem final do
"contig". Possui uma interface gráfica de fácil acesso que minimiza o esforço do
usuário, aumentando a eficiência.
Diagrama do PHRED/PHRAP/CONSED

SAÍDA CONSED E VISUALIZAÇÃO FINISHING

CAP3
Foi desenvolvido na Universidade de Michigan e consiste na Terceira
geração dos programas de montagem de seqüências CAP. Este programa tem
a capacidade de remover as regiões 5´ e 3´de baixa qualidade das reads.
Utiliza valores de qualidade das bases para computar as regiões de
sobreposição entre as reads, construção de alinhamentos múltiplos de reads e
geração de seqüências consenso.
Testes realizados em conjuntos de dados BAC para se comparar os
programas Phrap e CAP3 mostraram que PHRAP geralmente produz contigs
mais longos que o CAP3 enquanto o CAP3 produz seqüências consensos com
menos erros (Huang et al, 1999).
BLAST
Programa de pesquisa por similaridade em bancos de dados públicos.
Dada uma seqüência, é feita uma busca para se verificar se esta seqüência
encontra similaridade com seqüências já depositadas. Para o usuário, é
retornado além do alinhamento, uma pontuação e um valor probabilístico de
erro que indicam o grau de qualidade do alinhamento. Existem várias
possibilidade de comparação nos bancos do blast, por exemplo BLASTP,
BLASTN, BLASTX, TBLASTN e TBLASTX. Há também opções específicas para
comparação com o genoma humano e ESTs humanas, muito útil em projetos
envolvendo o genoma e trascriptoma humano.
Referências
Gibas, C., Jambeck, P. Developing Bioinformatics Computer Skills, O´REILLY,

1. ed, cap.1, p. 3-21, 2001.
Baxevanis, D. Andréas; Ouellette, Francis F.B. Bioinformatics. A Practical Guide
to the Analysis of Genes and Proteins; Inc. and John Wiley & Sons. p.
109-203, 2001.
Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. Base-calling of automated sequencer
traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res Mar;8(3):175-
85, 1998.
Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II.
Error probabilities. Genome Res Mar;8(3):186-94, 1998.
Gordon D, Abajian C, Green P. Consed: a graphical tool for sequence
finishing.Genome Res. Mar;8(3):195-202, 1998.
Huang X, Madan A. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res 9
(9):868-77, 1999.

Verificação da integração e da expressão de genes introduzidos em

células de cultura por transfecção mediada por DNA
O protocolo para obtenção dos transfectantes está descrito no Exp. 4.

Cada clone transfectante precisará ser expandido para preparação de DNA e
RNA correspondentes.
Integração do gene exógeno poderá ser verificada por: a) hibridização
tipo Southern; b) reação de polimerase em cadeia (PCR); c) hibridização em
"dot-blot"ou "slot-blot".
Para confirmar a expressão do gene exógeno a nível de mRNA, pode-se
usar: a) hibridização tipo Northern; b) ensaio de "run-on transcription"; c)
hibridização em "dot/slot-blot". Expressão do gene exógeno a nível de proteína
pode ser analisada por: a) imunofluorescência (descrita noExp.10); b) Western
"blots"; c) imunoprecipitação; d) imunoprecipitação seguida de um ensaio de
atividade como, por exemplo, ensaio enzimático para Src e "middle T antigen"
de Polyoma que seria feito por imunoprecipitação com anti-Src ou anti-Py
seguido de ensaio de quinase no imunoprecipitado; e) atividade biológica
(ensaio enzimático, ensaio de atividade de "binding" de proteínas a DNA ou
"band-shift", etc.); f) "dot/slot-blot"; g) ensaio de ELISA.
Estes procedimentos são descritos à seguir.

Exp. 17 - Extração e purificação de DNA e RNA celular.
Toda manipulação de RNA deve ser feita usando luvas, vidrarias

esterilizada e soluções autoclavadas para evitar RNases contaminantes.
1. Plaquear 0,5-1x106 células/placa de 150mm de diâmetro (P150).

Realimentar as culturas periodicamente, submeter ao tratamento adequado
(carência de soro, reestimulação com fatores de crescimento, etc).
2. Remover o meio de cultura, lavar rapidamente as placas com PBS, drenar
bem e deixar as placas escorrendo sobre papel toalha molhado (para evitar
secagem).
3. Adicionar 2 ml de mistura de lise (4M isotiocianato de guanidina; 25 mM
citrato de sódio pH 7,0; 0,1M beta-mercaptoetanol) espalhar rapidamente
e raspar com policial (espécie de rodinho consistindo de 1 lâmina de
borracha inerte ligada a uma haste). Transferir o conteúdo (viscoso) desta
placa para a próxima placa e adicionar mais 1ml da mistura de lise à
primeira placa para remoção quantitativa. Com 3 ml pode-se extrair até 10
placas (P150) ou cerca de 60 milhões de células (diminuir um pouco o
volume de mistura conforme o número de placas). Este homogenato pode
ser armazenado à -20°C por meses antes de aplicar ao CsCl.
4. Pipetar 1,5ml da solução de CsCl (5,7M CsCl) em 25mM NaAc pH 5,0) para
cada tubo de nitrocelulose do rotor SW 50.1.
5. Cuidadosamente, aplicar o homogenato (3ml) sobre o colchão de CsCl.
6. Centrifugar SW50.1; 17 h; 37 Krpm; 20°C.
7. Coletar: remover o sobrenadante com pipeta Pasteur até alcançar a banda
de DNA (claramente visível à olho nú). Coletar a banda de DNA, no menor
volume possível, para um tubo separado e guardar na geladeira até o
momento de purificar este DNA. Decantar o resto do sobrenadante,
emborcar o tubo sobre papel limpo. Secar bem o tubo e dissolver o "pellet"
de RNA em 0,1 a 0,3ml de H2O bidestilada estéril. Diluir 1/100 em TE e
medir A260 e A280 para determinar concentração de RNA e grau de pureza
(A260/A280 = 2 para pureza máxima).
8. Dializar o DNA contra TE para remover o CsCl (3 trocas de 1-2x103
volumes num período de 24 h). Tratar com RNase (50µg/ml) à 55°C por
pelo menos 2 h e, em seguida, com proteinase K (50µg/ml) também a 55°
C por pelo menos 2 h. Aumentar o volume para 2ml, adicionar NaCl para
0,5 M e extrair com fenol (2ml da mistura fenol-clorofórmio 1:1 (2 vezes) e
1 x clorofórmio). Precipitar a fase aquosa com etanol (3 volumes) à -20°C
"overnight". Coletar o pellet, redissolver em 0,1X SSC, diluir 1/100 para
determinar a concentração por Absorbância usando a relação 1A260nm =
50µg/ml.
Nota: Às vezes o DNA de alto peso molecular fica preso na interface. Convém
adicionar TE à fase fenólica e reextrair.

Soluções:
Mistura de Lise
4M isotiocianato de guanidina.
25mM citrato de sódio; pH 7,0 (acertando o pH com NaOH)
Nota: Beta-mercaptoetanol é adicionado, imediatamente antes de usar, à

solução autoclavada na base de 7µl/ml.
Solução de CsCl
5,7M CsCl
25mM NaOAc pH 5,0 ( pH acertado para 5,0 com NaOH).
Marcar o nível do líquido antes de autoclavar para acertar o volume com água
estéril depois.

Exp. 18 - Fracionamento de DNA celular em gel de agarose (SOUTHERN

BLOT)
(Segundo Maniatis, com modificações)
1. Manter o DNA genômico com o tampão da enzima de restrição escolhida a

4°C por 2 horas, homogeneizando de tempo em tempo.
2. Adicionar a enzima de restrição, homogeneizar e manter a 4°C de 2 a 3
minutos. Colocar a enzima de restrição na temperatura adequada para o
seu funcionamento. Para DNA de células de mamíferos usamos 10
unidades de enzima para 10µg DNA e digestão prolongada (overnight).
3. Preparar a solução de precipitação, 20µl NaAc 3M (para concentração final
de 0,3M) e 500µl de etanol absoluto mantido à 0°C (2 ou 2,5X o volume de
reação). Precipitar overnight a –20°C.
4. Centrifugar por 10 minutos à 0°C. Lavar o pellet 1X com etanol 70%.
Dissolver o pellet em 20µl de TE.
5. Preparar o gel de 0,8% agarose em 1X TAE e as amostras (10µg DNA
digerido em 10% glicerol; 0,025% azul de bromofenol; 0,125% xileno
cianol).
6. Colocar o gel na cuba com tampão de corrida (1X TAE), aplicar as amostras
(incluindo um marcador de peso molecular como 1Kb ladder Gibco-BRL) e
fazer eletroforese (40-60 volts) até o azul de bromofenol atingir o final do
gel.
7. Retirar o gel da cuba, corar com EtBr (0,75µg/ml) por 30 min e fotografar
(com régua).
8. Preparar o gel para a transferência:
a) lavar com H2O por 20 min;

b) embeber em 0,2M HCl, por 5 min (depurinação);
c) lavar com H2O por 20 min;
d) embeber em 0,5M NaOH/1,5M NaCl por 20min 2X;
e) neutralizar com 1,5M NaCl / 0,5M Tris-Cl pH 8 por 20 min 2X;
f) embeber em 10X SSC por pelo menos 20 min antes de montar para
transferir.
9. Transferir para membrana de nylon usando 300-500ml de 10X SSC por

20h. Após a transferência, lavar rapidamente a membrana em 3X SSC,
secar ao ar e assar a membrana por 2h à 80°C. A membrana está pronta
para ser hibridizada.

Exp. 19 - Amplificação de Ácidos Nucléicos
A) Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
Esta reação, que representa um dos grandes avanços tecnológicos dos

anos 90, permite a síntese e conseqüente detecção de quantidades muito
pequenas de DNA (até uma única molécula) e RNA na amostra. Por isso
mesmo passou a ser uma ferramenta poderosíssima não só na pesquisa
científica mas tambem na medicina (diagnóstico, prognóstico,
acompanhamento terapêutico), pecuária, agricultura, medicina forense
(paternidade, criminalística) etc.
Pode ser utilizada para amplificar seqüências conhecidas de DNA ou RNA,
que, no caso, consiste no RT-PCR, onde uma reação catalizada pela
transcriptase reversa precede a amplificação do DNA afim de que seqüências
transcritas possam ser amplificadas. Isto permite, dentre outras coisas,
detectar e quantificar a expressão de genes específicos com grande
sensibilidade, amplificar seqüências codificadoras de genes humanos que tanto
podem ter interesse biotecnológico, visando a produção de proteínas
recombinantes, como científico, para estudar o papel biológico da proteína
codificada por um gene de interesse.
A reação consiste em se utilizar um molde (“template”) de DNA,
segmentos de DNA iniciadores específicos (“primers”) e desoxi-
ribonucleotídeos para a produção de uma nova fita de DNA, numa reação
catalizada pela Taq polimerase, uma DNA polimerase termo-estável (extraída
de Thermus acquaticus) ou por outras DNA polimerases termo-estáveis
extraídas de outros microrganismos termofílicos. A reação é incubada, a
diferentes temperaturas sucessivamente, de modo a permitir ciclos sequenciais
de pareamento ("annealing") dos "primers" com o DNA-molde (40-70°C, de
acordo com os "primers" utilizados), polimerização (60-75°C, de acordo com a
polimerase utilizada) e desnaturação das fitas resultantes (90-96°C). São
críticos neste processo, o desenho dos "primers" e a determinação das
condições de reação, como o número de ciclos, a temperatura de cada etapa, o
tempo em que a amostra é submetida em cada uma das etapas, a
concentração de cada um dos componentes da reação, etc.
Aparelhos termocicladores automáticos estão disponíveis no mercado,
mas a reação foi feita originalmente por transferência manual dos tubos
através de um conjunto de banhos-Maria ajustados para as diferentes
temperaturas.
Modernamente, existe também uma variedade de modalidades diferentes
de tanto de PCR quanto de RT-PCR com finalidades específicas, assim como
reativos e enzimas adequados para cada caso. Assim, para a amplificação de
longos fragmentos (≥ 4-5 kb) de DNA ou de cDNA e/ou a amplificação com
alta fidelidade ("long-distance-PCR", "long-distance-RT-PCR" ou ainda "long-
and-accurate-PCR"), são necessários protocolos e enzimas especiais; a
amplificação das extremidades de um cDNA correspondente a um gene novo

do qual se conhece apenas uma pequena região central, é utilizado um

protocolo de RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends); a amplificação de
"templates" com alto conteúdo de CG é problemática, e requer a utilização de
reagentes e programas de PCR específicos; a amplificação prefencial de
seqüências de genes diferencialmente expressos ("Suppressive Subtractive
Hybridization" - SSH, "Representational Difference Analysis" - RDA, etc.). Estas
são apenas algumas possibilidades dentre diversas outras aplicações que são
criadas constantemente envolvendo a técnica de PCR, que tem, como
excelência, grande reprodutibilidade, especificidade e extrema sensibilidade.
Procedimento:
1. Escolher o par de "primers" a ser utilizado para amplificar determinado

segmento de DNA.
2. Isolar o DNA por qualquer método (extração com fenol-clorofórmio seguida
de digestão com proteinase K, resinas comercialmente disponíveis, etc.).
Ressuspender ou diluir o DNA em solução sem EDTA, contendo baixa
concentração de sal (< 50mM).
3. Montar a reação (volume total de 20µl) em um tubo eppendorf de 0,2 ml,
acrescentando os seguintes reagentes:
estoque usar [final]

*PCR buffer concentrado 10X 2,0 µl 1X
(Pharmacia, Promega, etc)
**Cloreto de Magnésio 50 mM 0,6 µl 1,5mM
Mix de “primers” 10µM 0,4 µl 0,2µM
(10 pmol)
Mix de dNTPs 10mM 0,4 µl 200,0µM
Taq polimerase (Pharmacia) 5 U/µl 0,2 µl 1U
"Template"@ - <10,0µl <100 ng
Água estéril - qsp 20,0µl -
Óleo mineral (Nujol)# - 35,0µl -
* Composição aproximada dos tampões 10X:

Tris HCl (100mM pH 8,3 a 9,0)
Cloreto de potássio 500mM
Tween 20 0,5% (ou 1,0%Triton X-100)
Gelatina 0,01% (ou 0,05% BSA)
** O tampão de PCR 10X da Pharmacia já contém 15mM de cloreto de
magnésio.
#
Para evitar evaporação. Só é necessário se o termociclador que for utilizado
não possuir tampa aquecida.
@
"Template":

• No caso de um RT-PCR (amplificação de uma cópia em DNA de uma

seqüência de RNA), o "template" é uma pequena alíquota diluída da reação
de transcrição reversa (RT) feita previamente a partir do RNA da amostra
de interesse. A quantidade e a diluição a ser utilizada deve ser determinada
empiricamente de acordo com a abundância do transcrito a ser amplificado
e da origem do RNA utilizado na reação. A utilização de RNA que não sofreu
transcrição reversa é um bom controle de contaminação de RNA com DNA
genômico, problema freqüente na purificação de RNA.
• Para a amplificação de um fragmento de DNA presente no DNA genômico, o
template é o próprio DNA genômico extraído da célula/tecido ou do
paciente. Quando se tem disponibilidade de material, a quantidade ideal de
"template" genômico está na faixa de 10-100 ng.
• PCR ainda pode ser utilizado para a amplificação de uma região de um
plasmídio ou fago diretamente da colônia ou placa de lise, sem necessitar
da purificação prévia do vetor correspondente, bastando para isto adicionar-
se 1 µL de uma cultura líquida estacionária da bactéria portadora do
plasmídio de interesse, ou da respectiva placa de lise (PCR de colônia). Este
procedimento é extremamente útil e versátil em vários protocolos de
biologia molecular, uma vez que permite visualizar, rápida e
simultaneamente, a presença, o tamanho e a orientação de fragmentos de
DNA/cDNA clonados, através da combinação de "primers" específicos para o
vetor ou para o inserto clonado, por exemplo. O produto de PCR de colônia
pode ainda ser utilizado diretamente para subclonagem, para
seqüenciamento ou para a geração de sondas marcadas para hibridização.
4. Amplificar o segmento de DNA escolhido, incubando os tubos em aparelho

de PCR (ciclador/Thermocycler) nas seguintes condições:
1. desnaturação inicial 95oC

2. “annealing” 55oC
3. polimerização 72oC
4. desnaturação 94oC
5.repetição (30x) dos passos 2 a 4.
6. extensão final 72oC
5. Submeter uma alíquota (3 a 5µl) da reação a eletroforese em mini gel

(1,5-2% agarose em 0,5X TBE, ou de acordo com o tamanho do fragmento
amplificado esperado) para analisar os produtos de amplificação. A
identidade dos segmentos amplificados pode ser confirmada através de
digestão com enzimas de restrição ou hibridização (dot-blot ou Southern
blot) ou por seqüenciamento do produto, tanto diretamente a partir do PCR
ou a partir de vetor com o produto de PCR clonado.
Uma vez confirmada a amplificação do DNA, as amostras podem ser

submetidas à digestão com enzimas de restrição que identificam sítios
polimórficos no gene de interesse, permitindo fazer análise de ligação

(“linkage”) em familiares (de indivíduos afetados por uma determinada doença,

por exemplo) e aconselhamento genético. É possível observar também perda
de heterozigose no DNA proveniente de tumores. Ver, por exemplo Constanzi
et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 1993, 26, 1031-1036. A grande sensibilidade do
PCR permite também o diagnóstico muito sensível de diversas doenças
infecciosas (HIV, Doença de Chagas, tuberculose, etc.) e da avaliação
terapêutica de pacientes submetidos a terapia anti-HIV e quimioterapia anti-
tumoral (determinação de carga viral sangüínea e detecção de doença residual
mínima). Além disto, o PCR pode também ser utilizado para a verificação da
integração do vetor no genoma da célula transfectada (PCR de DNA genômico),
para a detecção e quantificação de genes específicos, tanto endógenos quanto
exógenos à celula (RT-PCR) e para a amplificação de ORFs ("open reading
frames") completas de genes expressos por uma determinada célula ou tecido.
B) Transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR)
De acordo ao “dogma central” da biologia molecular o fluxo da

informação genética, geralmente, segue o sentido DNA para RNA para
proteína. Há, entretanto, exceções a esta regra, a mais proeminente é o ciclo
de vida dos retrovírus. Estes vírus codificam sua informação genética em RNA,
e não em DNA como a maioria dos organismos. Quando invadem a célula
hospedeira, dirigem a síntese de uma molécula de DNA intermediária que é
complementar ao RNA genômico. A enzima que executa esta tarefa,
transcriptase reversa, é uma DNA polimerase que usa RNA como molde para
formar uma cópia de DNA complementar (cDNA). A atividade desta enzima
pode aproveitada para fazer cDNAs de qualquer RNA disponível “in vitro” e,
desta maneira, transformá-lo num "template" adequado para a amplificação
por PCR, já que a Taq polimerase é uma DNA polimerase exclusivamente DNA-
dependente, e não é capaz de utilizar moléculas de RNA como "template".
O RT-PCR é a mais sensível técnica para a detecção e quantificação dos
mRNAs disponíveis em uma dada amostra. Também pode ser usado para
clonagem, construção de bibliotecas de cDNA, síntese de sonda, “differential
display”, dentre outras aplicações. A técnica consiste de duas partes: síntese
do cDNA a partir do mRNA (transcrição reversa – RT) e amplificação de um
específico cDNA por PCR. Como a reação de PCR amplifica o gene de interesse
de maneira exponencial, este PCR pode ser cuidadosamente otimizado quando
usado para análises quantitativas.
A primeira consideração a ser feita quando se usa RT-PCR para a análise
de mRNA é o isolamento do RNA, este deve ser de alta qualidade e livre de
contaminação com DNA genômico. A reação de RT usa RNA molde (tipicamente
amostras de RNA total ou RNA poli A+), um primer (random, oligo dT ou
primer específico), dNTPs, buffer e enzima.
A reação é incubada por 1 hora por 42°C e gera uma molécula de DNA de
fita simples. O RNA que serviu como molde para a transcrição reversa pode
entao ser degradado pela adição de RNAse ou pelo tratamento do cDNA com
álcali. Este cDNA serve como molde em uma posterior reação de PCR para um

ou mais genes específicos. A opção de "primer" utilizado na reação de

transcrição reversa depende da finalidade do RT-PCR a ser feito. A utilização
de "random primers", ou hexâmeros randômicos, que são uma mistura de
todas as seqüências possíveis de hexanucleotídios, dirigirá a transcrição, em
cDNA, de todas as regiões (tanto 5' como 3') de todos os RNAs (mensageiro,
ribossomal e outros) utilizados como "template", que é bastante utilizado para
RT-PCR quantitativo quando é necessário amplificar apenas um pequeno
fragmento e também quando é importante obter fragmentos de cDNA que
representem todas as regiões dos RNAs presentes. O uso de oligo-dT como
"primer" para a transcrição reversa permitirá a transcrição reversa preferencial
dos RNAs mensageiros somente, uma vez que a maioria destes possuem uma
cauda 3' poliadenilada, para a qual o "primer" é complementar. Já a utilização
de um primer gene específico na transcrição revesa, promoverá, a princípio,
apenas a transcrição reversa dos transcritos complementares à seqüência do
primer. Quanto mais específico for o primer utilizado para a transcriçao
reversa, mais específica será também a reação de PCR subsequente (por
simplificação do "template") e também mais sensível será a amplificação.
Eventualmente pode-se adicionar uma combinação de primers para promover
a transcrição reversa. Com oligo-dT, a maioria dos cDNAs sintetizados
conterão, na sua maior parte, a região 3' dos RNAs mensageiros, e uma
parcela destes produtos crresponderá na transcrição completa (de 5' a 3') dos
RNAs mensageiros presentes, assim, é a melhor opção quando se pretende
fazer posteriormente um PCR para amplificar cDNAs completos ("full-lengths")
ou grandes fragmentos de cDNAs. O uso de primers gene específicos na
transcrição reversa é mais indicado quando se pretende amplificar e/ou
detectar com máxima sensibilidade e seletividade um transcrito específico.
Uma importante aplicação da síntese de cDNA é análise da expressão
gênica em um tecido ou linhagem celular de interesse.


Procedimento :
1. Em um tubo eppendorf colocar 1µg de RNA total e 9 µl de Mix de DNAse I .
Mix de DNAse I :
5x First strand buffer 2 µl

RNAseOUT inhibitor 0.5 µl
DNAse I 0.5 µl
água q.s.p 9 µl
2. Incubar a 37°C por 10 minutos. Após este período, incubar a 75°C por 5
minutos para inativar a DNAse.
3. Adicionar a cada tubo
1 µl de oligo dT (500µg/ml)
1 µl de dNTPs (10µM)
4. Incubar a 75°C por 10 minutos. Após a incubação colocar os tubos

imediatamente em gelo.
5. Adicionar a cada tubo 7µl de Mix SuperScript.
Mix SuperScript :
5x First strand buffer 2 µl

DTT 0.1M 2 µl
DNAseOUT inhibitor 0.5 µl
Água q.s.p 7 µl
6. Incubar a 42°C por 2 minutos. Adicionar 1µl de SuperScript II, misturar

cuidadosamente. Incubar por 60 minutos a 42°C. Inativar a reação
incubando os tubos a 70°C por 15 minutos.
7. O cDNA pode então ser submetido a amplificação por PCR do gene de
interesse.

Exp. 20 - Dot/Slot Blot
Pode ser usado para quantificar: a) DNA; b) RNA; c) proteína. No caso de

RNA, ATENÇÃO: USAR LUVAS durante toda a manipulação.
A idéia consiste em fazer diluições seriadas de cada amostra, sendo que a
comparação dos resultados permite uma estimativa da quantidade relativa de
material nas várias amostras. Podem ser usados padrões (quantidades
conhecidas) para obter valores absolutos.
1. Usar uma bandeja de 96 poços (de preferência NOVA) para fazer as

diluições. Planejar de modo que as diluições sejam feitas no sentido de A a
H ou de 1 a 12 (o que permite, respectivamente, 8 e 12 concentrações
diferentes).
2. No primeiro poço de cada amostra colocar:
• 70µl de RNA (20µg) + H20 estéril
• 50µl formaldeído
• 125µl 20X SSC estéril
• 5µl 0,1% vermelho fenol estéril (autoclavado)
Nos demais poços distribuir 125µl de 15X SSC estéril contendo vermelho
fenol suficiente para dar cor rosada.
3. Embrulhar a bandeja em filme plástico transparente e incubar (o embrulho
todo) em banho Maria a 65°C por 15 min. A bandeja bóia.
4. Retirar do banho Maria e passar imediatamente para banho de gelo.
5. Fazer as diluições, com pipetador Gilson, passando 125µl do primeiro poço
para o segundo e daí por diante até o último poço. Para diluições diferentes
de 1:2, adequar os volumes. O último poço vai ficar com 250µl. Manter a
bandeja no banho de gelo até a aplicação das amostras.
6. Cortar a membrana de nitrocelulose (Hybond N+, Pharmacia) e um pedaço
de papel 3MM (Whatman) de tamanho adequado para cobrir todos os
buracos do aparelho de dot-blot.
7. Montar o aparelho colocando primeiro a folha de papel 3MM embebida em
15X SSC e, sobre este, a membrana (embebida primeiro em água estéril e
depois em 15X SSC estéril). Apertar os parafusos por igual para
uniformizar a pressão.
8. Ligar o aparelho em trompa de vácuo com pressão fraca.
9. Aplicar as amostras (125µl/poço) e filtrar devagar para maior adsorsão do
material à membrana. Pipetar sempre a partir da solução mais diluída para
a mais concentrada e trocar as ponteiras entre amostras.
10. Desmontar o aparelho, retirar a membrana, deixar secando ao ar.
11. Colocar a membrana seca entre 2 pedaços de papel 3MM e assar por 2h a
80°C para fixar o material na membrana. A membrana está pronta para
ser hibridizada.
12. Desmontar o aparelho, enxaguar em H2O destilada e mergulhar em solução
0,5N NaOH. No dia seguinte, sempre USANDO LUVAS, enxaguar bem em

água destilada e 1X em água bidestilada. Secar, embrulhar em plástico

limpo e guardar.

Exp. 21 - Macromatrizes de cDNA
Nos últimos anos, vêem sendo desenvolvidas metodologias que

permitem a análise de expressão gênica em larga escala tais como SAGE
("Serial Analysis of Gene Expression"), construção de bibliotecas de subtração
e matrizes de cDNA (micromatrizes e macromatrizes). Esta ultima tecnologia
tem acelerado intensamente a identificação de genes diferencialmente
expressos entre duas situações biológicas estudadas. Nela, cDNAs
correspondentes aos genes que se quer estudar são aplicados de forma
organizada sobre nylon (macromatrizes) ou sobre vidro (micromatrizes).
cDNAs, correspondentes ao mRNA das duas situações que se quer comparar,
são marcados e hibridizados com os cDNAs aplicados. A comparação entre o
sinal gerado pelas hibridizações das duas diferentes populações de cDNAs
revela diferenças de expressão de cada gene aplicado, em cada situação
comparada. As micromatrizes são mais sensíveis, além de possuírem um maior
número de cDNAs aplicados do que as macromatrizes. Apesar disto, as
macromatrizes ainda são muito utilizadas devido ao baixo custo relativo de sua
produção, associado a um nível de detecção de expressão razoável (são
detectados RNAs que representam 0,01% da população total, correspondentes
a genes de média-baixa expressão).
A- Confecção das macromatrizes de cDNA:
1. Preparar os materiais:
• Água sanitária 10%

• NaOH 0,6N (Deve ser preparada no dia de uso)
• Tris-HCl 0,5M pH 7,5
• Membrana de nylon Hybond N+ (Amersham) e Papel 3MM (Whatman):
• 2 retângulos de 11,5cm x 8,2cm para cada set de até 1536 amostras.
• 4 retângulos de 3MM que cubram o fundo de um pires de vidro.
2. Concentrar as amostras, por evaporação, até o volume de ~4µl. Isto pode

ser feito usando um aparelho de PCR para placas, deixando a tampa aberta
e as amostras a 70-80°C por alguns minutos. Certificar que a placa
escolhida para aplicação seja rasa o suficiente para que o aplicador chegue
até seu fundo.
3. Centrifugar as placas para as amostras irem para o fundo de cada pocinho.
4. Prender os papéis 3MM na base de acrílico do sistema de aplicação, usando
cola bastão.
5. Prender as membranas de nylon com clips pequenos em papéis 3M, usando
pinça de ponta cega. Não tocar as membranas com as mãos ou luvas.
Colar o 3MM sobre o 3MM preso no acrílico, usando cola bastão.

6. Lavar o aplicador na solução de água sanitária, enxaguar em água

destilada, flambar em seguida por 2×.
7. Mergulhar o aplicador nas amostras. Encaixá-lo no primeiro buraco no guia
de aplicação. Tocar levemente sobre a membrana, com cuidado para não
danificá-la. Aplicar 2× a mesma amostra para cada spot para certificar-se
que pelo menos uma aplicação ocorreu. Repetir este procedimento para se
fazer a membrana duplicata.
8. Caso queira fazer duplicatas de cada amostra na mesma membrana,
mergulhar o aplicador na mesma placa e aplicar, usando o segundo buraco
do guia de aplicação.
9. Lavar o aplicador em água sanitária, enxaguar em água e flambar 2×.
10. Repetir o passo 7-9, usando novas amostras e os próximos buracos do guia
de aplicação.
11. Após o término das aplicações, desnaturar as amostras aplicadas,
molhando cuidadosamente a membrana de nylon em um papel 3MM
embebido com a solução de NaOH 0,6N. Incubar por 5 min nesta solução.
12. Neutralizar a membrana, molhando-a cuidadosamente em papel 3MM
embebido com a solução de Tris-HCl 0,5M pH7,5, por 10 min.
13. Fixar os cDNAs na membrana de nylon por calor (80°C por 2h). Guardar as
membranas entre folhas de papel 3MM.
B - Marcação e purificação das sondas (Höfte et al, 1998)
RNA mensageiro das duas condições que se quer comparar deve ser
extraído usando coluna de oligo(dT). A marcação é realizada simultaneamente
com a transcrição reversa.
Assim, 1µg de RNA poli-A é misturado com 500ng de oligo (dT12-18) e 8µg
de oligo(dT25) em um volume final de 10 µl. Após desnaturação de 10 min a
70°C, 5µl de tampão da Superscript (Gibco), 1µl de dNTPs (20mm cada, com
exceção de dCTP que deve estar na concentração de 125 µM), e 5µl de dCTP
(10µCi µ-1L) são adicionados. A mistura é incubada 42°C por 5 min antes de ser
adicionado 1µl de Superscript II (200U ml-1). Após a adição, a reação é
incubada a 42°C por 1h e inativada a 70°C por 15min. Na próxima etapa é
adicionado 1 µl de RNAse H (2Uµl-1) seguida de incubação a 37°C, por 30 min. A
sonda é purificada por precipitação com etanol (alternativamente pode ser
purificada em colunas NucleoSpin® Extraction Spin Columns da Clontech).
C- Hibridização
Os protocolos de hibridização são os mesmos usados para as membranas

Northern de RNA.
Cada umas das membranas em duplicata, deve ser hibridizada com
sonda proveniente de uma das condições a ser comparada. Nesta hibridização,
as sondas purificadas devem ser quantificadas em cintilador e a mesma

quantidade de CPM deve ser usada para as duas membranas. Após lavagem,
filmes de raios X ou telas de PhosphoImager devem ser expostos às
membranas.
D – Referências
BALDWIN, D., CRANE, V. & RICE, D. A comparison of gel-based, nylon filter

and microarray techniques to detect differential RNA expression in
plants. Curr Opin Plant Biol, 2(2): 96-103., 1999.
DESPREZ, T., AMSELEM, J., CABOCHE, M. & HOFTE, H. Differential gene
expression in Arabidopsis monitored using cDNA arrays. Plant J, 14(5):
643-52., 1998.
NGUYEN, C., ROCHA, D., GRANJEAUD, S., BALDIT, M., BERNARD, K., NAQUET,
P. & JORDAN, B.R. Differential gene expression in the murine thymus
assayed by quantitative hybridization of arrayed cDNA clones. Genomics,
29(1): 207-16., 1995.
SCHUMMER, M., NG, W., NELSON, P.S., BUMGARNER, R.E. & HOOD, L.
Inexpensive handheld device for the construction of high-density nucleic
acid arrays. Biotechniques, 23(6): 1087-92., 1997.

Exp. 22 - Fracionamento de RNA em gel de agarose -formaldeído (NORTHERN

BLOT).
Esta técnica permite não só detectar e quantificar a expressão gênica, a

nível de RNA, mas tambem determinar o tamanho/pêso molecular dos
transcritos. Recomenda-se utilizar sempre um controle interno da quantidade
total de RNA aplicada (ver abaixo).
1. Preparar o gel 1% agarose da seguinte maneira: 1g agarose + 62,5ml

H2O. Derreter a agarose e manter a 55°C. Adicionar 20ml MOPS (5X
concentrado) e 18ml formol, ambos pré-aquecidos a 55°C. Misturar bem e
despejar na placa de vidro com o pente devidamente acertado para a
formação dos poços.
2. Preparar as amostras: 10 a 20µg RNA total (em H2O) ou 1 a 5µg de RNA
mensageiro, previamente liofilizado, redissolvido em 4,5µl H2O estéril + 2µl
tampão MOPS (5X) + 3,5µl formol + 10µl formamida deionizada. Incubar
15 min à 65°C, passar para banho de gelo (0oC) e adicionar 2µl de tampão
de amostra autoclavado (50% glicerol; 1mM EDTA; 0,125% azul de
bromofenol; 0,125% xileno cianol) a cada tubo antes de aplicar ao gel.
3. Colocar o gel na cuba de eletroforese, cobrir com o tampão de corrida (1X
MOPS), aplicar as amostras e fazer eletroforese à voltagem constante (60-
80 V) até o azul de bromofenol atingir o final do gel, tomando o cuidado de
reciclar o tampão para evitar distorções. Se não tiver bomba peristáltica,
use uma pipeta de 25ml para transferir o tampão de um polo para o outro
a cada 15-30 min.
4. Após a corrida, retirar o gel da cuba (cuidado, gel de formaldeído é
extremamente quebradiço) lavar várias vezes em água para remover o
formol, corar com EtBr 0,75µg/ml em H2O, descorar e fotografar.
5. Preparar para a transferência: Lavar extensivamente o gel em H2O sob
agitação branda (5 trocas de 5-10 min. usando agua MilliQ NÃO estéril).
Embeber em 10X SSC por 20 min. antes de montar para transferir.
6. Transferir para membrana de nylon, usando cerca de 300ml de10X SSC
por 10-20 h. Confirmar a transferência total do RNA, observando a
membrana e o gel no transiluminador. Assar a membrana por 2 h à 80°C.
Alguns tipos de membrana podem também ser expostos à luz ultravioleta
para melhor fixação do RNA. Verifique as especificações da marca.
7. Dois métodos são comumente usados para transferência: a) "ponte" de
papel Whatman 3MM (segundo Maniatis) b) pano-esponja (método
simplificado que funciona muito bem). Este último envolve utilizar 2
camadas de pano-esponja (comprado em supermercados) embebido em
10X SSC, sobre o qual coloca-se, nesta ordem, um filtro de papel Whatman
3MM recortado exatamente do tamanho do gel, depois o gel, a membrana
de nitrocelulose ou nylon, outro pedaço de papel Whatman 3MM recortado

exatamente do tamanho do gel, 1 pacote de guardanapos (de tamanho

pouco maior que o gel), placa de vidro e peso (livros) de aproximadamente
500g.
Soluções:
MOPS 5X concentrado
0,2M MOPS;
50mM acetato de sódio;
5mM EDTA
Acertar pH para 7 com NaOH. Marcar o volume antes de autoclavar para

acertar depois com água estéril.
Nota: A autoclavagem causa coloração amarelada, que não interfere com o
funcionamento do tampão.
8. Preparar as soluções de pré-hibridização e hibridização. (Ver Hibridização

Molecular)
Pré- Hibridização
hibridização (ml)
(ml)
H2O 1,3 1,3
20X SSPE 2,5 2,5
Formamida 5 5
50X Denhardt 1 1
10% SDS 0,1 0,3
Sulfato de Dextrana  1,5g
(opcional)
DNA salmão (5 mg/ml) 0,1 0,1
p/ 10ml p/ 10ml
• Deixar as soluções preparadas. O sulfato de dextrana demora para dissolver,

portanto, adicione o pó à solução de hibridização com algumas horas de
antecedência, deixando no banho à 37oC, com agitação periódica, até completa
dissolução.
• O DNA de salmão deve ser adicionado às soluções apenas imediatamente
antes de serem utilizadas. É importante desnaturar (5 min em água fervente )
o DNA de salmão antes de adicioná-lo às soluções.
9. Preparação de sondas de DNA (ver adiante).
10. Hibridização (ver ítem Hibridização Molecular adiante).
Desnaturar as sondas (5 min em água fervente).

Remover a solução de pré-hibridização e colocar a solução de hibridização.

Injetar a sonda e homogeneizar. Colocar as garrafas no forno 42oC (ou os
sacos plásticos no banho Maria) e deixar “overnight”.
11. Lavagem das membranas.
• Lavar 2 vezes (20 min. sob agitação suave, a temperatura ambiente) com
a seguinte solução: 2X SSC; 0,1% SDS
• Lavar 2 vezes (30 min., sob agitação suave, a 56oC) com a seguinte
solução: 0,2X (ou 1X, dependendo da estringência desejada) SSC; 0,1%
SDS.
12. Exposição.
• Embrulhar as membranas em filme plástico, sem deixar bolhas, prendê-las

em um pedaço de papel 3 MM e colocar em um cassete. Marcar as
membranas com tinta fluorescente indicando a posição dos RNAs
marcadores de 18 e 28s. Ajustar um filme de raio X sobre as membranas,
fechar o cassete e expor em freezer à -70°C. Alternativamente, expor em
cassetes de PhosphorImage.
• Isótopos radiativos (principalmente de 32P) são amplamente utilizados
para preparar sondas radiativas de alta atividade específica e alto poder
de detecção de pequenas quantidades de DNA ou RNA. Mais
recentemente, foram desenvolvidos diversos protocolos para preparação
de sondas NÃO-radiativas. Os "kits" comerciais são baseados no uso de
sistemas de luminescência, fluorescência ou ensaios enzimáticos. O poder
de detecção de alguns destes "kits" é comparável ao de sondas radioativas
mas ainda se utiliza muito a marcação radiativa.
Revelação dos Resultados de Northern Blot - "Phosphorimaging"
A revelação dos resultados de hibridização do Northern Blot, assim como

de outras metodologias como Western e Southern, depende do método de
marcação da sonda utilizada. Assim, os protocolos de revelação diferem
quando a sonda de interesse é marcada com radioatividade, fluorescência ou
quimioluminescência.
Classicamente, a revelação da membrana de Northern hibridizada com
sonda radioativa é feita por exposição da mesma a filmes fotográficos sensíveis
a raio-X. Este método de revelação, porém, possui várias limitações, como a
baixa sensibilidade, a dificuldade na quantificação dos resultados e a estreita
faixa de linearidade dos filmes fotográficos, o que requer a utilização de sondas
muito intensamente marcadas, tempos longos de exposição e a necessidade da
utilização de vários tempos de exposição.
Recentemente, a nova tecnologia de "phosphorimaging" tem sido
implementada com grande popularidade devido à grande sensibilidade, à

facilidade de quantificação e à ampla faixa de linearidade do método,

permitindo a detecção de sinais de hibridização muito menos intensos em
tempo menor e também a rápida quantificação dos resultados dentro da faixa
linear. Esta metodologia tem por princípio a exposição das membranas
hibridizadas a um cassete que contém uma tela sensível à radiação, que
posteriormente é revelada em um "scanner" especial a laser (Storm Gel and
Blot Imaging System™ - Molecular Dynamics) acoplado a um
microcomputador. A radiação ionizante produz excitação quântica dos sais de
európio presentes no cassete e, sob a incidência de raio laser, libera energia na
forma de luz azul e estes íons em seguida retornam ao estado fundamental. A
intensidade de luz azul, que reflete a intensidade da radiação em cada ponto
da tela para quantidade de amostra, é quantificada e utilizada para a geração
de uma imagem latente. Esta imagem obtida pode então ser utilizada para
quantificação, editada e armazenada digitalmente pela utilização de
"softwares" específicos, e a tela sensível pode ser descarregada e reutilizada.
O software utilizado para as análises das imagens scaneadas é o
ImageQuant™, com o qual é possível realizar medida quantitativas de
autorradiografia, quimioluminescência e fluorescência direta em análises de
géis de proteínas e nucleotídeos.

Exp. 23 - Preparação de sonda de DNA
Sonda Radioativa:
Dois métodos são usados mais frequentemente para preparação de

sondas radioativas: a) "Nick-translation" b) "Oligolabeling" ou "primer-
extension". “Nick translation” já não é mais utilizado porque a atividade
específica máxima atingida (108 dpm/µg DNA) é relativamente baixa, quando
comparada com o segundo método que permite atingir atividade 10 vezes
maior (109 dpm/µg DNA).
A) Nick-Translation
O DNA molde ("template") é dupla fita. A reação consiste em introduzir

quebras em uma das fitas ("nicks") com DNase e adicionar DNA polimerase I
de E. coli que, ao mesmo tempo, digere uma das fitas no sentido 5'-3' a partir
do "nick" (graças à sua atividade exonucleásica 5'-3') e polimeriza no mesmo
sentido 5'-3' usando a outra fita como molde. A adição dos 4
desoxirribonucleosídeos trifosfato, pelo menos um dos quais marcados (α-32P)
resulta no deslocamento do "nick" e na síntese de DNA dupla fita radiativa.
Para usar como sonda em hibridizações DNA-RNA ou DNA-DNA é preciso
desnaturar esta sonda (100oC; 10 min). A atividade específica obtida é da
ordem de 108 dpm/µg DNA.
Mistura de Reação: Volume = 30µl
DNA (0,1-0,5µg) em H2O 23µl

Tampão NT (10X conc.) 2µl
dNTPs frios (C,G,T) 500µM 2µl
0,1mM DTT (ditiotrietol) 0,5µl
DNase (0,5µg/ml) 0,5µl
α-32P-dATP (100µCi/µl) 1µl
DNA polimerase I (5-10 U/µl) 1µl
Incubar por 2 h à 15oC.
Tampão NT (10X concentrado): 0,5M Tris-Cl pH 7,2; 0,1M MgSO4; 1mM DTT;
500µg/ml soroalbumina bovina (fração V).

B) "Oligo-Labeling" ou "Primer Extension" (segundo Feinberg, A.P. &

Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13).
O DNA molde é de fita simples. Requer "primer" e uma DNA polimerase

especial (enzima de Klenow que corresponde ao fragmento maior da DNA
polimerase I) que tem apenas atividade polimerásica (5'→ 3') e não
exonucleásica.
As soluções são preparadas com antecedência (receitas no final deste
item) e guardadas à -18oC (congelador comum). "Kits" comerciais podem ser
adquiridos de diversas fontes (Gibco/BRL, Pharmacia, etc.).
A sonda preparada por este método é muito superior àquela de "nick-
translation" nos seguintes aspectos: a) alta atividade específica (da ordem de
109dpm/µg DNA, ou seja, 10 vezes maior ); b) pequena quantidade necessária
de DNA template (10-50ng versus 300-1000ng da "nick-translation"); c) alto
poder de detecção mesmo de genes que estão representados em cópia única
no genoma.
Reação de “Random primer extension”
H2O *
DNA *
Tris-Cl pH 8,0 4µl de 250mM p/ final 25mM.
MgCl2 2µl de 50mM p/ final 2,5mM
dNTPs frios (1) 2µl de 1mM p/ final 50uM
(2) 2µl de 1mM p/ final 50 uM
(3) 2µl de 1mM p/ final 50 uM
pd(N)6 oligo 2µl de 54U/ml p/ final 2,7U/ml
Hepes pH 6,6 2µl de 2M p/ final 0,1M
DTT (ditiotreitol) 0,5µl de 100mM p/ final 1,2mM
BSA (albumina) 0,5µl de 10mg/ml p/ final 0,125mg/ml
9 32P dNTP (4) (50-100µCi) *
Enzima de Klenow 1µl de 10-50 U/ml
* Nota: Os volumes de H2O, DNA e 32P dNTP devem somar 22µl. Depois de
calcular o decaimento do nucleotídeo radiativo, determinar o volume
necessário para obter 50-100µCi. Subtrair este volume de 22µl para obter o
volume de H2O + DNA.
Ferver DNA + Oligo + H2O por 5 min. Passar para banho de gelo (0oC).
Adicionar os demais componentes (na ordem indicada) e incubar, à
temperatura ambiente, por algumas horas. O tempo depende da quantidade de
DNA (maior que 2 h para 10-20ng; 1 a 2 h para 50-100ng). Pode-se também
deixar a noite toda. Purificar a sonda, conforme descrito à seguir.
Soluções:

2M Hepes
4,77g Hepes (tampão orgânico) em 4ml H2O bidestilada. Acertar o pH com
NaOH. Completar o volume para 10 ml. Autoclavar.
Oligo pd(N)6
Mistura de hexadesoxiribonucleotídeos da Pharmacia (No. catálogo 27-2166-
01). Dissolvendo o conteúdo do tubo (50 unidades de A260nm) em 0,93ml de TE
estéril obtém-se a solução 54 unidades/ml.
Utilizando o kit comercial DNA Labelling Kit (-dCTP) Ready-To-Go da

Pharmacia, proceder como descrito abaixo:.
1. Desnaturar 50ng DNA dissolvidos em H2O MilliQ (para um total de 25µl)

num tubo eppendorf por 5 min em água fervente e colocar no gelo
imediatamente.
2. Reconstituir tubos de Reaction Mix do Kit por adição de 20µl de H2O
destilada em cada. Não misturar.
3. Adicionar a cada tubo:
• DNA desnaturado (25µl)
• 51l (~ 501Ci) [9-32P] dCTP, 3000 Ci/mmol, 101Ci/1l
4. Misturar gentilmente.
5. Incubar a 37oC
6. Purificar as sondas adicionando a reação de marcação em colunas
MicroSpin S-300 HR (Pharmacia) ou seguir o protocolo descrito em
Purificação de sonda radioativa.
7. Medir a marcação em um contador de cintilação líquida: aplicar 11l da
sonda em 1cm2 de papel filtro (Whatmann 3MM) e colocá-lo em um tubo de
cintilação. Medir a radioatividade incorporada.
Purificação da sonda radioativa
Após a reação de marcação do DNA ("nick-translation" ou "oligo-labeling") os

nucleotídeos não incorporados em DNA podem ser eliminados por
cromatografia em Sephadex G50.
1. Embeber algumas gramas da resina em TE ("overnight").

2. Colocar um "plug" de lã de vidro siliconizada numa seringa de plástico nova
de 1 ml e encher com G50 inchada até a marca de 0,9ml (4 riscos abaixo
da marca 80).
3. Lavar e equilibrar a coluna com 0,1M NaCl em TE (0,5ml de 5M NaCl em
25ml TE)
4. Centrifugar à 1.600 rpm por 3 minutos (rotor SS34 Sorvall) para "secar" a
coluna. O volume da resina vai para 0,6ml.

5. Trabalhando com PROTEÇÃO (anteparo acrílico), aplicar a sonda dissolvida

em 100-200µl da solução acima (0,1M NaCl em TE, ou seja, 2µl de 5M
NaCl para 100µl DNA) na coluna.
6. Cortar a tampa de um tubo eppendorf de 1,5ml e colocar no fundo de um
tubo Corex de 15ml para recolher a sonda. Colocar a seringa no tubo Corex
e centrifugar (1.800 rpm por 4 min rotor SS34 da Sorvall). O líquido
coletado no tubo eppendorf contém a sonda (DNA) enquanto os
nucleotídeos livres ficam retidos na coluna.
7. Aumentar o volume da sonda para 300µl, retirar 2 alíquotas de 0,5µl e
aplicar em pedaços de papel Whatmann 3MM. Determinar a radioatividade
(dpm) antes e depois de lavar os papéis com 5% TCA e etanol (colocando
2 filtros brancos para descontar o "background"). O material TCA
precipitável é DNA.
8. DESNATURAR a sonda antes de usar (ferver 10 min).
Sonda Não-radioativa
Alguns "kits" estão comercialmente disponíveis (como o de Digoxigenina da

Boehringer e o da Amersham-Pharmacia Biotechnology). O nível de detecção
precisa ser testado para cada gene porque varía com a abundância relativa do
mensageiro correspondente.

Exp. 24 - Hibridização Molecular

RNA ou DNA previamente fracionados em géis de agarose e transferidos

para filtros de nylon (ver receitas de Southern e Northern acima) ou aplicados
a membranas em "dot/slot blots" são hibridizados em duas etapas.
Primeiramente, a membrana é incubada com a mistura de pré-hibridização por
pelo menos 1h e depois com a mistura de hibridização por pelo menos 16h. A
mistura de hibridização consiste de: 5X SSPE; 0,1% SDS; 50% formamida; 5X
Denhardt; 50ng/ml DNA sonicado e desnaturado (de salmão, timo, etc). Na
mistura de hibridização adiciona-se também 5% dextrana sulfato e a sonda
radiativa (pelo menos 5x 105cpm/ml) desnaturada.
A hibridização da membrana pode ser feita de 2 maneiras: em saco
plástico mergulhado em banho Maria ou, idealmente, em garrafas especiais
para Forno de Hibridização. Quando o forno não estiver disponível, introduzir a
membrana em saco plástico resistente, selando 3 dos 4 bordos a 0,5 cm da
membrana exceto um dos lados que deve ser mantido aberto e com borda de
pelo menos 10 cm acima da membrana. Após introdução da solução de pré-
hibridização, eliminar as bolhas e selar a extremidade do saco plástico
mantendo um bordo grande, para a etapa seguinte de hibridização e mergulhar
no banho Maria a 42oC. No caso de dispor do forno, envolver as membranas
em “mesh” (pano sintético poroso que permite enrolar duas ou mais
membranas impedindo o contato direto) ambas embebidas em 2X SSC, tirar as
bolhas e colocar o conjunto enrolado na garrafa. Acrescentar a solução de pré-
hibridização aquecida, vedar com a tampa e colocar as garrafas no forno
mantido a 42oC. Incubar por um mínimo de 0,5 h (idealmente 2-4 h).
O seguinte esquema pode ser usado para o preparo das soluções:
(10ml) (10ml)
Pré-hibridização Hibridização
(ml) (ml)
H2O 1,3 0,8
20X SSPE 2,5 2,5
Formamida deionizada 5,0 5,0
50X Denhardt 1,0 1,0
10% SDS 0,1 0,1
DNA denaturado (5 mg/ml) 0,1 0,1
Sonda desnaturada (106 cpm/ml) --
0,2

Soluções:
50X Denhardt
1g Ficoll
1g polivinilpirolidona
1g albumina bovina fração V
H2O para 100ml
20X SSPE:
3M NaCl
200mM NaH2PO4.H2O
19,88mM EDTA
pH ajustado para 7,4 com NaOH

Receita alternativa para hibridização
Substituir as soluções de Denhardt e DNA por leite em pó desnatado.

Para 25 ml
(ml)
H2O bidest. estéril 4,50
Formamida 12,50
20X SSC 3,75
0,5M EDTA pH 8,0 0,50
1M Sorensen pH 6,2 1,50
Leite Molico (desnatado) 1,25g
10% SDS 1,00
Nota: A solução de Sorensen consiste de uma solução 1M KH2PO4 (fosfato
monobásico de potássio) pH 6,4 (acertado com KOH).
Soluções:
TE
10mM Tris-Cl pH 7,5;
1mM EDTA
5X TBE
89mM Tris-borato;
89mM ácido bórico;
2mMEDTA
20X SSC
3M NaCl
0,3M citrato trissódico 2 hidrato
O pH fica 7,0
20X SSPE
3M NaCl
0,2M NaH2PO4.H2O
19,88mM EDTA
Acertar pH para 7,0 com NaOH.

Exp. 25 - Imunoprecipitação
(adaptado de Ausubel et al, 1999)
Imunoprecipitação é uma técnica na qual um antígeno (no caso a

proteína de interesse) é isolado através de sua ligação a um anticorpo
específico, imobilizado em uma matriz sedimentável. Os diferentes estágios da
técnica estão esquematizados na figura abaixo.
Num primeiro estágio, o antígeno deve ser solubilizado através de uma
das diversas técnicas de lise celular possíveis, a qual deve ser escolhida
levando em conta a localização intracelular do antígeno e suas interações com
outras moléculas celulares. Desta forma, a lise celular (1) pode se dar em
condições desnaturantes ou não desnaturantes, na presença de detergentes
iônicos ou não-iônicos, ou até por ruptura mecânica da membrana, na ausência
de detergentes.
No segundo estágio, o antígeno solúvel será incubado com o anticorpo
específico, o qual está ligado a uma matriz sólida sedimentável (2), o que
permite a separação do complexo antígeno-anticorpo por centrifugação em
baixa velocidade (3). A imobilização da anticorpo pode se dar, por exemplo,
por ligação não covalente a beads de proteína A ou G- agarose (ou sefarose).
A análise do antígeno imunoprecipitado pode ser feita através de
separação eletroforética mono ou bidimensional. Dependendo da abundância
relativa da proteína de interesse, esta pode ser buscada através de Western
blotting após a imunoprecipitação. Se o sinal for indetectável por esta técnica,
pode ser feita uma imunoprecipitação radiativa, fornecendo às células, antes
da lise, 35S metionina (Amersham Cat. no SJ1015), para a marcação
metabólica destas. A emissão dos isótopos radioativos incorporados no
antígeno será detectada pela sua impressão em filme de raio-X.

Representação esquemática dos estágios seguidos no protocolo de

imunoprecipitação.
Plaqueamento
As linhagens (A31 e B115) foram plaqueadas em bandejas de 24 poços

em 10% FCS-DMEM. Após atingirem a subconfluência, o meio da linhagem A31
foi trocado para 0,5% FCS-DMEM e as células foram mantidas nestas
condições por 48h. A linhagem B115 foi mantida em 10% FCS-DMEM até o dia
da marcação metabólica.

Marcação Metabólica
1. Trocar o meio para DMEM sem metionina (Gibco-BRL) e incubar por 30 min
na estufa úmida a 37oC.
2. Adicionar os componentes desejados (soro, fatores de crescimento,
hormônios, etc.) e 250µCi/ml de metionina radioativa.
3. Incubar em estufa úmida a 37oC pelo tempo desejado.
No nosso caso foram adicionados:
B115 Hy B115 A31Q A31S Tempo de

incubação
Hy 100ng/ml - - - 5h
Soro - - - 10% 1,5h
4. Após os tempos de incubação as células são lisadas.
Lise Desnaturante (Cuidado, material radioativo!)
1. Colocar a placa em gelo e retirar o meio de cultura.

2. Lavar 2x com PBSA frio.
3. Adicionar 200µl do tampão de lise desnaturante e com a ajuda de uma
pipeta, transferir o lisado (viscoso) para um tubo eppendorf.
4. Ferver as amostras por 10 min.
5. Adicionar 800µl do tampão RIPA- (tampão RIPA sem SDS).
6. Centrifugar as amostras a 14000 g por 20 min a 4oC para separar os debris
celulares.
7. Transferir o sobrenadante para o tubo limpo e aplicar uma alíquota de 2µl
num filtro para a contagem de cpm.

Reação de Imunoprecipitação
Às amostras normalizadas pela contagem de cpm adicionar os seguintes

anticorpos:
Célula Anticorpo
1 A31 Q 15µl de anti c-Fos
2 A31 Q 30µl de soro não imune
3 A31 S 15µl de anti c-Fos
4 A31 S 30µl de soro não imune
5 A31 Q 30µl anti JunB
6 A31 Q 30µl de soro não imune
7 A31 S 30µl anti JunB
8 A31 S 30µl de soro não imune
9 B115 15µl de anti c-Fos
10 B115 15µl de soro não imune
11 B115 Hy 15µl de anti c-Fos
12 B115 Hy 15µl de soro não imune
1. Incubar as amostras por pelo menos 2h a 4oC (será deixado "overnight").

As quantidades e tempos de incubação devem ser normalizados para cada
anticorpo.
2. Adicionar 50µl de uma solução 1:1 de proteína A agarose (beads) e manter
a 4oC, com agitação por 1h.
3. Centrifugar o complexo bead-anticorpo-proteína por 10 s a 14000 g.
4. (O sobrenadante pode ser utilizado para outra imunoprecipitação).
5. Lavar o precipitado: 2x com o tampão A
2x com o tampão B
1x com o tampão C
• As lavagens são feitas a frio, suspendendo as beads em 800µl de
tampão, vortexando rapidamente e centrifugando por 10 s a 14000 g.
• Os sobrenadantes podem ser descartados na pia.
6. Acrescentar o tampão de amostras (1X).
7. Submeter as amostras a SDS-PAGE em gel 10%, overnight, 10mA.
Tampão de lise desnaturante

0,5% SDS
70mM betamercaptoetanol (adicionado na hora)
50mM Tris-HCl pH 7,5
Tampão RIPA-
10mM Tris-Cl pH 7,5
1% desoxicolato de sódio (DOC)
1% NP40 (ou Triton X 100)
150mM NaCl

Inibidores de Proteases: 2µg/ml aprotinina, 2µg/ml pepstatina, 1mM PMSF.

*Os inibidores de protease devem ser adicionados imediatamente antes do
uso.
Tampões de lavagem para 100ml
A B C
H2O 95,4 ml 88,4ml 99ml
1M Tris-HCl pH 7,5 1ml 1ml 1ml
5M NaCl 3ml 10ml
0,5M EDTA 0,4ml 0,4ml
NP40 0,2ml 0,2ml
O gel é incubado por 30 min em solução amplificadora Amplify

(Amershan) e fixado em 20% metanol e 7% ácido acético, por 30 min.
Secar por 2h a 80oC, a vácuo.
Expor em filme de Raio-X até a obtenção do sinal adequado.

Exp. 26 - Western-Blot
(segundo Burnette W.N. (1981) Anal. Biochem. 112 -195)
Fracionamento de Proteínas
1. Crescer as células em placas P150, nas condições desejadas.

2. Remover o meio, lavar (2x) com PBSA à frio, colocar as placas sobre o gelo
antes de lisar.
3. Adicionar 1ml/placa do tampão RIPA+ e incubar por 15 min a 4oC, com
agitação.
4. Clarificar o lisado por centrifugação (15.000 rpm, 10 min, 4oC).
5. Aliquotar o sobrenadante que pode ser utilizado imediatamente ou
estocado a -80oC.
6. Quantificar as proteínas do lisado utilizando o Kit da Bio-Rad (200µl do
reagente Bio-Rad + 800µl H2O + 2-20µl de amostra).
7. Misturar alíquotas do lisado, contendo 50-200µg de proteína, com tampão
de amostra para concentração final 1X.
8. As amostras são fervidas por 5 min e submetidas a SDS-PAGE.
Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose
Dois métodos são comumente utilizados para transferência de proteínas

do gel de acrilamida para membranas: a) eletro-transferência tradicional (em
cuba de eletroforese); b) eletro-transferência semi-seca em aparelho especial
(Bio-Rad Semi-Dry).
A) Eletro-Transferência tradicional
1. Preparar o tampão de transferência 1X. Recortar membrana de

nitrocelulose (Schleicher & Schuell BA85 ou BA83) e papéis Whatmann
3MM do mesmo tamanho do gel.
2. Embeber espumas, membrana e papéis 3MM no tampão de transferência.
(A membrana deve ser previamente molhada em água estéril).
3. Fazer a montagem no cassete aberto, colocando, na ordem: espuma
embebida, 3 folhas de papel 3MM, gel, membrana, 3 folhas de papel 3MM,
espuma, tomando o cuidado de eliminar bolhas de ar. Fechar o cassete e
colocá-lo na cuba com a membrana voltada para o pólo positivo
(vermelho).
4. Encher a cuba com o tampão de transferência, fechar e ligar os elétrodos
(30V overnight).
5. Retirar a membrana, corar com 0,1% Ponceau em 10% ácido acético por
alguns minutos. Descorar rapidamente em TBST.
6. Corar o gel com Coomassie para monitorar a eficiência de transferência.

B) Eletro-transferência semi-seca
1. Usando o mesmo tampão de transferência acima, proceder conforme

recomendado pelo fabricante (Bio-Rad ou equivalente). Para transferência
completa, utilizar 0,5A por 45min (o tempo varia de acordo com o tamanho
da proteína e a concentração do gel).
2. Após a transferência, corar a membrana com 0,1% Ponceau em 10% ácido
acético, alguns minutos. Descorar rapidamente em TBST.
3. Para utilizar imediatamente, incubar a membrana na solução de bloqueio
(ver Imunoreação). Para guardar a membrana, embrulhar em plástico e
manter na geladeira.
Imunoreação
1. Bloquear os sítios inespecíficos incubando a membrana com 5% leite Molico

desnatado em TBST, por 1 a 2h à temperatura ambiente, sob agitação.
2. Remover a solução de bloqueio, lavando a membrana em TBST
3. Adicionar a solução contendo o antisoro de interesse diluído em TBST (a
diluição e o tempo de incubação variam de acordo com o anticorpo
utilizado) e manter à temperatura ambiente sob agitação.
4. Lavar 3x (10 min cada) com TBST, para remover anticorpo não absorvido,
sob agitação e à temperatura ambiente.
5. A revelação pode se feita por dois métodos diferentes:
Revelação usando conjugado IgG-Fosfatase Alcalina
1. Incubar a membrana com o 2o anticorpo conjugado com fosfatase alcalina

(diluição e tempo de incubação variam com o anticorpo utilizado).
3. Adicionar Tampão para Fosfatase Alcalina contendo 6,6µl/ml 50mg/ml NBT
(nitro-blue tetrazolium-chloride) e 3,3µl/ml 50mg/ml BCIP (5-Bromo-4-
chloro-3-indolylphosphate).
4. Assim que o sinal aparecer, bloquear a reação pela de adição de PBS
contendo 0,5M EDTA
5. Fotografar.
Revelação usando conjugado IgG-Peroxidase
1. Incubar a membrana com o 2o anticorpo conjugado com peroxidase

(diluição e tempo de incubação variam com o anticorpo utilizado).
3. Revelar com o kit ECLTM segundo as instruções do fabricante (Amershan).
4. Expor a filme de Raio X até a obtenção do sinal adequado.

Soluções:
Gel 10% acrilamida com SDS (10 x 16 cm)
Gel de Gel de
separação empilhamento
10% (total 40 5% (total 10
ml) ml)
H2O 15,9 6,80
Acrilamida/Bisacrilamida 30:1 13,3 1,70
Tampão de separação 10,0 -
Tampão de Empilhamento (4X conc.) - 1,25
10% SDS 0,4 0,10
10% persulfato de amônio 0,4 0,10
Temed 0,016 0,01
Deaerar antes de adicionar o persulfato de amônio e Temed. Fazer o gel

de separação, cobrir com álcool isobutílico (ou água), deixar polimerizar, lavar
a superfície com água e despejar o gel de empilhamento. Posicionar o pente,
cobrir as bordas com álcool isobutílico e deixar polimerizar. Antes de remover o
pente, colocar H2O destilada para facilitar a remoção do pente e manutenção
da integridade dos pocinhos. Usar uma seringa de 10ml e tampão de corrida
para lavar bem cada pocinho antes da aplicação das amostras.

Soluções:
Acrilamida/Bisacrilamida 30:1
29g de acrilamida
1g bisacrilamida
H2O para 100 ml
Filtrar e manter à 4oC e no escuro.
Tampão de Empilhamento (4X concentrado)

1M Tris-Base
Ajustar para pH 6,8 com HCl e armazenar à 4oC.
Tampão de separação (4x concentrado)

1,5M Tris-Base
Ajustar pH para 8,8 com HCl e armazenar à 4oC.
Tampão de Amostra 2X 3X
Tris-HCl pH6,8 100mM 150mM
SDS 4% 6%
Glicerol 20% 30%
β-mercaptoetanol 10% 15%
Azul de Bromofenol 0,2% 0,3%
Tampão de Corrida 10X concentrado

250mM Tris-Base
2,5M glicina
1% SDS
Tampão de Transferência, pH 8,3:

48mM Tris-Base
39mM Glicina
0,037% SDS
20% Metanol
NBT (nitroblue tetrazolium):

50mg/ml em 70% dimetilformamida/30%H2O. Aliquotar e congelar.
BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato):

50mg/ml em H2O. Aliquotar e congelar
TBST
150mM NaCl
50mM Tris-HCl, pH 7,5
0,1% Tween-20

Tampão para Fosfatase Alcalina

100mM NaCl
5mM MgCl2
100mM Tris-HCl, pH 9,5
Tampão RIPA+
10mM Tris-HCl pH 7,5
1% desoxicolato de sódio (DOC)
1% NP40 (ou Triton X 100)
150mM NaCl
0,1% SDS
Inibidores de Proteases: 2µg/ml aprotinina, 2µg/ml pepstatina, 1mM PMSF.
*Os inibidores de protease devem ser adicionados imediatamente antes do
uso.

Exp. 27 - Ensaio de mobilidade eletroforética em gel de poliacrilamida

(EMSA)
A. Extração de proteínas nucleares
As linhagens celulares são plaqueadas em placas de Petri de 150mm de

diâmetro. Os lisados são preparados a partir de culturas sub-confluentes,
conforme protocolo abaixo:
Obs.: Usar todas as soluções geladas.

1. Lavar as células 2 vezes com PBSA, raspar em 5mL de PBSA com o auxílio
de um rodo de borracha ("cell scraper") e transferir para um tubo cônico.
2. Centrifugar as células a 236xg, 5min, 4oC.
3. Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 1mL de tampão
hipotônico e transferir para tubo de microcentrífuga.
4. Sedimentar as células por centrifugação (16.000xg, 15seg).
5. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular ("pellet") em
400µL de tampão hipotônico e deixar no gelo por 10min.
6. Adicionar 40µL de Nonidet P-40 (1% em H2O), para lisar as células e
agitar em vortex por 30 segundos (velocidade máxima).
7. Centrifugar (16.000xg, 30seg), obtendo-se assim a fração nuclear
(sedimento) e a fração citoplasmática (sobrenadante).
8. Descartar a fração citoplasmática e adicionar, com cuidado, 100µL de
tampão hipotônico, para lavar o sedimento de núcleos sem que seja
quebrado. Retirar o tampão com o auxílio de uma micropipeta.
9. Ressuspender os núcleos em 100µL de tampão de extração nuclear e
incubar por 30min em gelo.
10. Centrifugar (17.500xg, 30min, 4oC). O sobrenadante é o extrato nuclear.
11. Aliquotar o extrato nuclear e estocar a -80oC (4 alíquotas de 20µL cada, e
uma de 5µl para dosagem de proteína).

B. Quantificação do extrato protéico
Alíquotas do extrato nuclear são submetidas a quantificação de proteínas

pelo método de Bradford (kit Bio-Rad Protein Assay).
Amostras BSA (1mg/ml) H2O Coomassie H2O

Branco 100 200µl 700µl
2µl 98  
4µl 96  
6µl 94  
8µl 92  
10µl 90  
2µl - 98 ↓ ↓
C. Prepararo do gel 4% poliacrilamida (30 acrilamida:1 bisacrilamida)
Poliacrilamida 30:1 6,7mL

5X TBE 4,0mL
H2O 39,3mL
APS 10% (persulfato de amônio) 300µL
TEMED 42,5µL
Obs.: Deixar o gel já montado na cuba com o tampão de corrida (0,4X TBE).
D. Reação de marcação radioativa do oligunucleotídeo
O oligonucleotídeo é marcado com [γ 32P]-ATP na extremidade 5' através

de uma reação de troca do fosfato terminal, catalisada pela enzima T4
Polinucleotídeo Quinase.
1. Preparar a reação (p/ 10 reações de ligação):
Sol. estoque p/ 20µL

10pmol de oligonucleotídeo (dupla fita) 2pmol/µL 5µL
15pmol de γ32P ATP 3000Ci/mmol 4,5µL
10µCi/µL
10U T4 Polinucleotídeo Quinase (PNK) 10U/µL 1µL
1X tampão de PNK 5X 4µL
H2O - 5,5µL

2. Incubar a reação a 37oC por 1 hora.

3. Adicionar 80µL de TE/0,1M NaCl, para parar a reação.
4. Fazer uma extração com 100µL fenol/clorofórmio.
5. Purificar a fração aquosa em MicroSpin S-300 HR Columns (Pharmacia).
E. Reação de ligação proteína-DNA
1. Preparar as reações de ligação em gelo, contendo:

5µg de proteína do extrato nuclear;
6µg de DNA competidor (de timo ou de esperma de salmão);
1pmol de oligonucleotídeo marcado com 32P (oligo quente);
5µL de tampão de amostra.
2. A seguir, incubar as reações a 30°C por 15min.
Obs.: veja tabela modelo a seguir para montagem das reações de ligação DNA-
proteína.
Extrato nuclear Tampão Oligo quente DNA competidor Oligo frio

(5mg/mL) (25pmol/µL)
* 5µg 5µL 10µL 1,2µL 
*     
** ↓    2µL
***  ↓ ↓ ↓ 
* Condições (n) contendo extrato protéico e oligonucleotídeo marcado, para

analisar a atividade de ligação de uma proteína a uma sequência específica de
DNA.
** Condição controle contendo, também, oligonucleotídeo não marcado (oligo
frio) numa concentração 50X maior, para avaliar a especificidade da ligação
proteína-DNA.
*** Condição não contento extrato protéico, para analisar a corrida do oligo
quente.
F. Eletroforese em gel de polipoliacrilamida
1. Adicionar 2µL de uma solução de azul de bromofenol em TE/50% glicerol,

a cada reação.
2. Aplicar as amostras em gel 4% poliacrilamida/0,4X TBE (pré-corrido a
100V por 2 horas) e submeter a eletroforese a 170V.
3. Após a corrida, secar o gel a vácuo a 80°C por 2 horas.
4. Expor um filme de raioX sobre o gel a -70°C até obtenção do sinal
adequado.

G. Soluções
PBSA (Tampão Salina Fosfato sem Ca2+ e Mg2+), pH 7,2

137mM NaCl; 2,7mM KCl; 8,0mM Na2HPO4; 1,4mM KH2PO4
Tampão de Extração Nuclear

20mM Hepes, pH 7,9; 0,4M NaCl; 1,0mM EDTA; 1,0mM EGTA
+ inibidores de proteases, que devem ser adicionados no momento de uso:
1,0mM DTT; 1,0mM PMSF; 2µg/ml aprotinina; 2µg/ml leupeptina.
Tampão Hipotônico
10mM Hepes, pH 7,9; 10mM KCl; 0,1mM EDTA; 0,1mM EGTA
+ inibidores de proteases, que devem ser adicionados no momento de uso:
1,0mM DTT; 1,0mM PMSF; 2µg/ml aprotinina; 2µg/ml leupeptina.
Tampão de ligação DNA-proteína

20mM HEPES, pH 7,9; 20% glicerol; 100mM KCl; 0,2mM EDTA; 1,0mM PMSF;
0,5mM DTT
TBE (Tampão Tris-Borato-EDTA) - 5 vezes concentrado

446mM Tris-base; 445mM ácido bórico; 10mM EDTA; pH8,0

Apêndice -
Apêndice
Contagem de células em Hemocitômetro
(Câmara de Neubauer)
A. Hemocitômetro - possui duas redes quadriculadas, permitindo a contagem

de duas amostras na mesma lâmina.
Cada rede é formada por 9 quadrados grandes (separados por traços), os

quais por sua vez estão subdivididos em 16 quadrados menores. O volume de
cada quadrado grande é igual a 10-4ml.
B. Contagem:
1. Tripsinizar as células de modo a obter uma suspensão homogênea de
células, isto é, de células isoladas, sem grumos.
2. Com uma pipeta Pasteur de ponta fina, homogeneizar a suspensão
pipetando algumas vezes para cima e para baixo.
3. Retirar duas amostras independentes e aplicar, aos locais indicados pelas
setas, procurando manter a pipeta na posição horizontal (paralelo à
lâmina) de maneira que o líquido escorra por capilaridade entre a lâmina e
a lamínula.
4. Esperar alguns segundos, focalizar, verificar se a distribuição das células
em todos os quadrados está homogênea.
5. Contar todas as células do quadrado grande central (16 quadrados
menores) com aumento 100x.
Se o número de células contado ficar entre 100 e 200 basta contar 1
quadrado grande. O cálculo da concentração de células na suspensão é dado
por:

Apêndice -
No de células contadas x 104 = No de células/ml
Se o No de células em cada quadrado grande for menor que 100 conte dois ou
mais quadrados dependendo do número de células.
Neste caso a concentração será dada por:
No de células contadas x 104 = No de células/ml

o
N de quadrados grandes contados
Obs: É impossível obter contagem precisa quando as células formam grumos.

Grumos ocasionais devem ser contados como uma única célula (como é feito
pelo contador eletrônico). Células transformadas são pouco aderidas à
superfície, portanto, o tratamento proteolítico deve ser muito brando. Reduzir
o tempo ou diluir a solução de tripsina com PBSA ajudam a minimizar a
formação de grumos.
Clonagem Celular
1. Proceder como para medida de eficiência de plaqueamento em substrato

sólido até o desenvolvimento de colônias macroscópicas.
2. Com auxílio de um marcador (Pilot de retroprojetor) fazer marcas de cores
diferentes nas colônias escolhidas. Use, para isto, tanto o microscópio
como olho nu.
3. Na capela de fluxo laminar: remover o meio da placa, lavar com PBSA,
remover o PBSA.
4. Trabalhando rápido para a placa não secar, depositar um anel de
clonagem, previamente autoclavado com graxa de silicone (Dow Corning)
na base, sobre cada uma das colônias marcadas tomando o cuidado de
pressionar o anel contra a placa para vedar bem.
5. Usando pipeta Pasteur de ponta fina, introduzir gotas de solução de tripsina
no anel, tomando o cuidado de não formar bolha de ar entre a placa e a
solução de tripsina. O melhor é encostar a ponta da pipeta na placa e só
então deixar sair algumas gotas de tripsina. Lembre-se: É FUNDAMENTAL
QUE SE USE UMA PIPETA PARA CADA ANEL (para garantir a origem das
células de uma única colônia).
6. Assim que todos os anéis estiverem preenchidos com tripsina, pingar uma
ou duas gotas de PBSA na placa para esta não secar.
7. Acompanhar a tripsinização das colônias ao microscópio. Quando as células
arredondarem, levar a placa à capela.
8. Usando UMA PIPETA PARA CADA ANEL, pipetar (com pipeta Pasteur, de
ponta fina) para cima e para baixo algumas vezes para remover as células.
9. Transferir todo o material de um anel para uma placa de 35mm (P35)
contendo meio de cultura com 10%FCS. Misturar e incubar.

Apêndice -
10. No dia seguinte, remover o meio das placas e colocar meio fresco (restos
de graxa podem impedir o bom desenvolvimento das células).
11. Pode ser necessário RECLONAR. Neste caso, quando a cultura proveniente
de um dos anéis estiver bem crescida, pode-se tripsiniza-la, fazer diluições
e plaquear conforme descrito acima.
Congelamento de células
(Método simplificado de Hugo Armelin e Mari Sogayar)
1. Tripsinisar a cultura, suspender as células em meio 10% soro e centrifugar,

para eliminar a tripsina (2.000 rpm, por 2-3 min).
2. Remover o sobrenadante e ressuspender as células para uma concentração
de 1-2x106 células/ml em meio 10% soro contendo 5-10%DMSO
(dimetilsulfóxido) previamente passado em filtro Seitz para esterilizar.
3. Colocar 1 ml de suspensão por ampola ou tubo plástico especial com tampa
de rosca (NUNC) devidamente marcado (nome da célula, data de
congelamento, seu nome, etc), com caneta Pilot de retroprojetor.
4. Colocar na geladeira por 30 min.
5. Retirar da geladeira e colocar em "freezer" de -70oC (ultra-freezer) por 24
horas. NUNCA passar por congelador comum: temperaturas de -18 a -24oC
são críticas para células (matam!).
6. Retirar do "ultra-freezer" e mergulhar em tanque de nitrogênio líquido.
Para esse passo é aconselhável que se utilize um isopor contendo N2 líquido
(para transporte das células do "ultra-freezer" para o tanque e porque
pode haver necessidade de fazer arrumações no tanque).
7. Anotar no caderno de registro, ou computador, especificando:
• Linhagem de célula (caso se trate de um clone, especificar de que
experiência se origina, nome, etc).
• Data de congelamento.
• Nome do operador
• Data do descongelamento
• Viabilidade em %
• Outras observações que se façam necessárias
Nota - O método de congelamento convencional manda abaixar 1oC por min.

Improvisações podem ser feitas no sentido de se aproximar o máximo possível
disso.
Descongelamento de Células
Atenção: O descongelamento tem que ser rápido. Tenha sempre à mão um

isopor com nitrogênio líquido pois rearranjos ou arrumações do tanque podem
ser necessários.

Apêndice -
1. Tirar a ampola do nitrogênio líquido e colocar em banho a 37oC (dentro de

um béquer pequeno, calçando com papel alumínio). Alternativamente, a
ampola pode ser embrulhada num pano de flanela e aquecida na própria
mão.
2. Logo que o conteúdo da ampola ficar líquido, levar para a capela,
homogeneizar cuidadosamente, pipetar bem devagar 1 ou 2 vezes e
transferir para frascos ou placas contendo meio fresco 10% FCS. Cuidado
no manuseio pois as células nesse estágio estão muito frágeis. O
descongelamento será mais eficiente (i.e. com maior viabilidade) se os
seguintes cuidados forem observados: a) Aquecer previamente o meio
10% FCS e colocá-lo nos frascos de cultura marcados; b) Injetar a mistura
CO2/ar nos frascos; c) Incubar a 37oC até a hora de colocar as células.
3. Algumas horas após o descongelamento ou assim que as células tiverem
aderido à superfície, estimar a viabilidade (% de células aderidas e
espraiadas em relação ao total) e trocar o meio pois as células não devem
permanecer muito tempo no DMSO.
Autoradiografia
1. Para coletar as células: remover o meio de cultura, extrair 2x por 10 min

com 10% TCA à frio e 2x com 95% álcool. Secar ao ar, marcar as placas
na lateral ou colar as lamínulas em lâminas gelatinizadas com as células
para o lado de fora, é claro.
2. Para cobrir com filme, corte a película com bisturi, coloque os pedaços de
filme sobre a superfície H2O. Após a hidratação do filme (leva 1 min) pescar
o filme com a lâmina ou aplicá-lo sobre a superfície da placa de Petri.
Estender as dobras com pincel delicado e escorrer o execesso de água.
Para cobrir com emulsão, use uma diluição de 1:1 (na base de peso, ou
seja, pesar 1 parte de H2O e 1 parte de emulsão na câmara escura usando
a luz de segurança vermelha). Expor lâminas ou placas em lata bem
vedada contendo dessecante silica azul).
3. Para revelar: 5 min em D19b (ver abaixo), remover o revelador e,
imediatamente, colocar em fixador Kodak comum (sem lavar) por 3-5 min.
Lavar rapidamente em H2O, corar com Giemsa e determinar a porcentagem
de núcleos marcados ao microscópio comum.
Revelador D19b
Aquecer 700ml H2O destilada até 80oC. Adicionar, na ordem e sob
agitação.
2,2g metol
72,0g sulfito de sódio anidro
8,8g hidroquinona
48,0g carbonato de sódio anidro
4,0g brometo de potássio

Apêndice -
Completar para 1l, estocar em vidro escuro bem vedado. Usar sem diluir.
Gelatinização de lâminas para autoradiografia
Aquecer H2O até 60oC. Dissolver gelatina para 0,7% e alumen de crômio
e potássio (CrK4(SO4).12H2O) para 0,01%. Mergular as lâminas na solução
morna, deixar secar ao ar e guardar a seco e temperatura ambiente, livre de
poeira.
Bandeamento de Cromossomos
Fazer as lâminas para cariótipo pelo processo descrito na Exp. 5.
Banda C
1. Colocar as lâminas em 5% Ba(OH2) por 8-20 minutos dependendo da

lâmina. Por exemplo: para lâminas entre 14 e 15 dias (depois de feito o
cariótipo) deixar 12 minutos.
2. Lavar da seguinte maneira: 2 x em H20; 1x ácido acético 2% e 3x em H2O.
3. Incubar 1 hora em 2X SSC (17,532g NaCl + 8,82 g citrato trisódico para 1 l
de H2O) a 60oC
4. Corar 1 hora em 2% Giemsa (solução Azul de Metileno 2o. Giemsa da
Merck) preparado em 0,075M tampão fosfato pH 6,8 (5,938g Na2HPO4 +
4,539g KH2PO4 para 1l de H2O).
5. Lavar em água corrente. Secar ao ar e examinar.
Banda G
1. Colocar as lâminas em solução de tripsina 0,2% (em tampão fosfato pH

6,8) mantida à temperatura de 4-8oC (recém retirada da geladeira). O
tempo de permanência na solução de tripsina é crítico e varia de acordo
com o tempo entre o bandeamento e o preparo das lâminas de cariótipo.
Por ex.: para lâminas de 0-7 dias deixar 20 segundos. Este tempo deverá
ser maior para lâminas mais antigas.
2. Lavar em H2O destilada.
3. Corar com 3% Giemsa (em tampão fosfato pH 6,8) também à temperatura
de 4-8oC durante 4 minutos.
4. Lavar em H2O corrente.
Nota: O tratamento com tripsina é a parte mais crítica da banda G. Diferentes

lotes de tripsina e outras concentrações podem ser experimentados.
Banda NOR
Usar lâminas recentes.

1. Preparar, na hora, solução 50% AgNo3 em H2O destilada. Para 1ml de
solução adicionar 2 gotas de 40% formaldeído logo em seguida.

Apêndice -
2. Pingar 3 gotas desta solução sobre a lâmina, cobrir com uma lamínula
grande e incubar em câmara úmida (placa de Petri forrada com papel de
filtro embebido em H2O) por cerca de 10 min a 65oC (até a lâmina ficar
amarelada).
3. Lavar com H2O destilada, após remover a lâmina, jogando H2O sobre a
lâmina inclinada.
Examinar e fotografar o mais rápido possível.

Apêndice -
Ferramentas Básicas de Avaliação Gênica
1. Alinhamento de seqüências
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) –

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
2. Resultado de um alinhamento utilizando BLAST

Apêndice -

Apêndice -
3. Características de genes com diversos links
Locus Link – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/

Apêndice -
4. Ferramentas de Busca Bibliográfica e evidências experimental
Pubmed – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fgi
OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=OMIM

Apêndice -
5. Busca de domínios protéicos
Pfam - http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
Hits - http://hits.isb-sib.ch/

Apêndice -
6. Alinhamento contra o genoma humano
BLAT- UCSC Human Genome Working Draft - http://genome.ucsc.edu/

Apêndice -
7. Análise de expressão diferencial por SAGE
SAGE VIRTUAL - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/

Apêndice -
8. Análise de proteínas
ExPASy (Expert Protein Analysis System) - http://expasy.ch/

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1.

Profa. Dra Mari Cleide Sogayar

Ana Paula G. Hasegawa

INSTITUTO DE QUÍMICA DA USP (Anfiteatro-Bloco 6 Superior)

DIA NOME (Filiação) TEMA

Local: Anfiteatro A do Instituto de Química da Universidade de São Paulo

CERTIFICADO DE PARTICIÇÃO: no Ciclo de Seminários será fornecido para

Fotomicrografia, em microscópio de contraste de fase, de células ST1 (derivada da linhagem

CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES:

10/06 11/06 12/06 13/06 14/06 15/06

17/06 18/06 19/06 20/06 21/06 22/06

24/06 25/06 26/06 27/06 28/06 29/06

PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 2002..................................................................................................1

PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 1998..................................................................................................4

PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 1996..................................................................................................5

PREFÁCIO DA EDIÇÃO DE 1993..................................................................................................6

PREFÁCIO (EDIÇÕES DE 1986 E1990)........................................................................................7

CONCEITOS BÁSICOS UTILIZADOS.........................................................................................9

TÉCNICAS BÁSICAS INTRODUZIDAS.....................................................................................10

NORMAS DE PROCEDIMENTO PARA A SALA ESTÉRIL...................................................19

NORMAS MÍNIMAS PARA MANIPULAR DNA RECOMBINANTE (DNAR).....................19

EXP. 1 -CURVAS DE CRESCIMENTO.......................................................................................22

EXP. 2 -EFICIÊNCIA DE PLAQUEAMENTO EM SUBSTRATO SÓLIDO..........................24

EXP. 4 -TRANSFECÇÃO MEDIADA POR DNA........................................................................28

EXP. 5 -CARIÓTIPO DE BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO (BANDA G).....................35

EXP. 6 -CURVAS DE SOBREVIVÊNCIA....................................................................................39

EXP. 7 -CRESCIMENTO EM SUSPENSÃO DE AGAROSE....................................................40

EXP. 8 -ENSAIO DE ATIVIDADE MITOGÊNICA DE FATORES DE CRESCIMENTO ..42

EXP. 9 -TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS BALB-C/3T3 (CLONE A31) COM VÍRUS DE

ENSAIO DE FOCO DE TRANSFORMAÇÃO.............................................................................44

Biologia Molecular da Transformação Maligna

EXP. 11 -OBTENÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM

EXP. 12 -PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDEAL EM PEQUENA ESCALA ("MINI-

EXP. 13 -PURIFICAÇÃO EM LARGA ESCALA DE DNA PLASMIDEAL EM

EXP. 14 -RESTRIÇÃO E DIAGNÓSTICO DO DNA PLASMIDEAL......................................54

EXP. 15 -SUBCLONAGEM OU CLONAGEM MOLECULAR EM VETORES

EXP. 16 -SEQUENCIAMENTO DE DNA.....................................................................................60

EXP. 17 - EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA E RNA CELULAR. ...............................69

EXP. 18 - FRACIONAMENTO DE DNA CELULAR EM GEL DE AGAROSE (SOUTHERN

EXP. 19 - AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS...........................................................72

EXP. 20 - DOT/SLOT BLOT..........................................................................................................79

EXP. 21 - MACROMATRIZES DE CDNA...................................................................................80

EXP. 22 - FRACIONAMENTO DE RNA EM GEL DE AGAROSE -FORMALDEÍDO

EXP. 23 - PREPARAÇÃO DE SONDA DE DNA.........................................................................86

EXP. 24 - HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR.................................................................................90

EXP. 25 - IMUNOPRECIPITAÇÃO .............................................................................................93

EXP. 26 - WESTERN-BLOT ........................................................................................................98

EXP. 27 - ENSAIO DE MOBILIDADE ELETROFORÉTICA EM GEL DE

Biologia Molecular da Transformação Maligna

Biologia Molecular da Transformação Maligna -1-

Biologia Molecular da Transformação Maligna -2-

Equipe do Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) – particularmente

Agências Financiadoras: FAPESP, CNPq, FINEP e ICGEB, que garantiram os

Instituto de Química –Universidade de São Paulo, Departamento de

Pró-Reitorias de Pós-graduação e de Pesquisa da USP.

Empresas fornecedoras de materiais e equipamentos de laboratório, que

Biologia Molecular da Transformação Maligna -3-

Pela quinta vez, em 12 anos, nosso Laboratório de Biologia Celular e

Biologia Molecular da Transformação Maligna -4-

Este Curso Decenial de “Biologia Molecular da Transformação Malígna”

Biologia Molecular da Transformação Maligna -5-

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