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Anal. Chem.2002, 74, 4763-4773
Antígeno de sondagem-Processos de ligação de anticorpos por
medições de impedância em dispositivos de transistor de
efeito de campo sensíveis a íons e
Análises de ressonância de plasma de superfície complementar:
Desenvolvimento de sensores de toxina de cólera
Maya Zayats, Oleg A. Raitman, Vladimir I. Chegel,† Andrei B. Kharitonov e Itamar Willner *
Instituto de Química, Universidade Hebraica de Jerusalém, Jerusalém 91904, Israel
As medições de impedância em dispositivos ISFET são
Baixado via INST FED EDU CIENCIA TEC DA PARAIBA em 27 de setembro de 2021 às 19:53:10 (UTC).
empregadas para desenvolver novos imunossensores. A análise
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das curvas de transcondutância registradas em frequências
variáveis, na formação do antígeno-complexos de anticorpos
nos dispositivos ISFET, permite a determinação da espessura do
filme do biomaterial. Medições de ressonância de plasmon de
superfície complementar de sistemas de biossensores
análogos, usando lâminas de vidro revestidas com Au como
suporte, revelam espessuras de filme semelhantes dos
biomateriais e limites de detecção comparáveis. Uma camada
de antígeno dinitrofenil é imobilizada na porta ISFET como uma
interface de detecção para o anticorpo anti-dinitrofenil (anti-
DNP-Ab). O anti-DNP-Ab é analisado com uma sensibilidade que
corresponde a 0,1µg mL-1. A montagem das camadas de anti-
anti-DNP-Ab e avidina biotiniladas na camada de base anti-DNP-
Ab é caracterizada por medições de impedância. O
desenvolvimento de um sensor baseado em ISFET para a toxina
da cólera é descrito. O anticorpo anti-toxina da cólera é
imobilizado no dispositivo ISFET. A associação da toxina da
cólera (CT) ao anticorpo é monitorada pelas medições de
impedância. O limite de detecção para analisar CT é 1,0× 10-11 M.
A transdução óptica e eletrônica da formação de complexos antígeno-
anticorpo em superfícies é de interesse fundamental para o desenvolvimento
de biossensores.1 Espectroscopia de interferência refletométrica e
ressonância de plasma de superfície2,3 (SPR) representam dois meios ópticos
sensíveis para a detecção de antígeno-anticorpo
* Para quem a correspondência deve ser endereçada. Tel: 972-2-6585272. Fax:
972-2-6527715. E-mail: willnea@vms.huji.ac.il.
† De licença do Instituto de Física de Semicondutores, Academia Nacional
de Ciências da Ucrânia, Kiev, Ucrânia.
(1) (a) Willner, I .; Katz, E.Angew. Chem., Int. Ed.2000, 39, 1180-1218. (b) Willner, I .;
Katz, E .; Willner, B. InAtualizações de sensor; Balted, H., Göpel, W., Hesse, J.,
Eds .; Wiley-VCH: Weinheim, Alemanha, 1999; Vol. 5, pp 45-102.
(c) Göpel, W. Biosens. Bioelétron. 1995, 10, 35-59. (d) Willner, I .; Willner,
B. Trends Biotechnol. 2001, 19, 222-230.
(2) (a) Brecht, A .; Ingenhoff, J .; Gauglitz, G.Sens. Atuadores, B 1992, 6, 96-
100. (b) Striebel, C .; Brecht, A .; Gauglitz, G.Biosens. Bioelétron.1994, 9,
139-146. (c) Lang, G .; Brecht, A .; Gauglitz, G.Fresenius 'J. Anal. Chem.
1996, 68, 857-860.
(3) (a) Knoll, W. Annu. Rev. Phys. Chem.1998, 49, 569-638. (b) Badia, A .;
Arnold, S .; Scheumann, V .; Zizlsperger, M .; Mack, J .; Jung, G .; Knoll, W.
Sens. Atuadores, B 1999, 54, 145-165. (c) Kruchinin, AA; Vlasov, YG
Sens. Atuadores, B 1996, 30, 77-80.
10.1021 / ac020312f CCC: $ 22,00 © 2002 American Chemical Society
publicado na Web em 17/08/2002
processos de ligação em superfícies. A transdução eletrônica das
interações antígeno-anticorpo nas superfícies foi realizada por métodos
eletroquímicos ou de ondas acústicas. A detecção amperométrica de
eventos de reconhecimento imunológico foi realizada pelo uso de
conjugados enzima-anticorpo que geram produtos eletroativos,4 pelo
uso de antígenos marcados com redox ou anticorpos para ensaio
competitivo,5 ou pelo uso de enzimas marcadas com redox6 ou
componentes eletroativos7 como sondas eletroquímicas. A análise
eletroquímica de eventos de ligação antígeno-anticorpo em sistemas
"sem laboratório" foi realizada por capacitância8 ou medições de
impedância.9 Medições microgravimétricas de microbalança de cristal de
quartzo foram amplamente empregadas para a detecção de complexos
antígeno-anticorpo em cristais piezoelétricos.10
Os transistores de efeito de campo sensíveis a íons (ISFETs) encontram um
interesse crescente no campo de rápido desenvolvimento da bioeletrônica.11
O controle do potencial de porta do dispositivo ISFET por transformações
biocatalisadas leva a dispositivos FET baseados em enzimas (ENFETs).12
Da mesma forma, antígenos ou anticorpos marcados com enzima foram empregados como
conjugados para controlar o potencial de porta como resultado do
(4) (a) Hadas, E .; Soussan, L .; Rosen-Margalit, I .; Farkash, A .; Rishpon, J.J.
Immunoassay 1992, 13, 231-252. (b) Ivnitski, D .; Rishpon, J.Biosens.
Bioelétron.1996, 11, 409-417. (c) Rishpon, J .; Ivnitski, D.Ann. NY Acad. Sci.
1996, 799, 508-513. (d) Stoytcheva, M.Eletroanálise 1995, 7, 660-
662. (e) Wijayawardhana, CA; Halsall, HB; Heineman, R.Anal. Chim. Acta
1999, 399, 3-11.
(5) Aizawa, M. In Sensores eletroquímicos em análise imunológica; Ngo, T.
T., Ed .; Plenum Press: New York, 1987; pp 269-291.
(6) (a) Blonder, R .; Katz, E .; Cohen, Y .; Itzhak, N .; Riklin, A .; Willner, I.Anal.
Chem.1996, 68, 3151-3157. (b) Ho, WO; Athey, D .; McNeil, CJBiosens.
Bioelétron. 1995, 10, 683-691.
(7) Katz, E .; Willner, I.J. Electroanal. Chem.1996, 418, 67-72.
(8) (a) Bresler, HS; Lenkevich, MJ; Murdock, JF, Jr .; Newman, AL; Robbin, RO In
Projeto e aplicação de biossensores; Mathewson, PR, Finley,
JW, Eds .; ACS Symposium Series 511; American Chemical Society:
Washington, DC, 1992; Capítulo 9, pp 89-104. (b) Mirsky, VM; Riepel,
M .; Wolfbeis, DSBiosens. Bioelétron.1997, 12, 977-989. (c) Berney,
H .; Alderman, J .; Lane, W .; Collins, JKSens. Atuadores, B 1999, 57, 238-
248.
(9) (a) Patolsky, F .; Filanovsky, B .; Katz, E .; Willner, I.J. Phys. Chem. B1998,
102, 10359-10367. (b) Alfonta, L .; Bardea, A .; Khersonsky, O .; Katz, E .;
Willner, I.Biosens. Bioelétron.2001, 16, 645-687.
(10) (a) Bardea, A .; Katz, E .; Willner, I.Eletroanálise 2000, 12, 1097-1106.
(b) Blonder, R .; Ben Dov, I .; Dagan, A .; Willner, I .; Zisman, E.Biosens.
Bioelétron.1997, 12, 627-644. (c) Suleiman, AA; Guilbault, GGAnalista
1994, 119, 2279-2282. (d) Pavey, KD; Ali, Z .; Olliff, CJ; Paul, F.J. Pharm.
Biomed. Anal.1999, 20, 241-245. (e) Abad, JM; Pariente, F .; Hernandez, L .;
Lorenzo, E.Anal. Chim. Acta1998, 368, 183-189.
Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 20024763
formação dos complexos antígeno-anticorpo.13 Na maioria desses
estudos, o biomaterial foi encapsulado em membranas poliméricas
associadas à interface da porta. Em uma série de estudos,14
relatamos a imobilização covalente de monocamadas de biomateriais na
superfície do portão para formar interfaces de biossensor ativo. A
configuração de monocamada como interface de detecção tem uma
clara vantagem, pois a associação do analito carece de limitações de
difusão e, portanto, os tempos de resposta de detecção dos sistemas
são rápidos.
Recentemente, introduzimos a espectroscopia de impedância como
um método para caracterizar a composição e estrutura de dispositivos
ISFET modificados por proteínas.15 Mostramos que as medições de
impedância nos dispositivos ISFET podem seguir o acúmulo e a
espessura das camadas de proteína na superfície da porta, por exemplo,
camadas de biotina-avidina ou glicose oxidase. Essas medições nos Figura 1. (A) Circuito equivalente de um dispositivo ISFET modificado por um filme
de membrana na interface do portão. (B) Circuito equivalente simplificado
permitiram estimar a cobertura da superfície das proteínas na superfície
correspondendo a um dispositivo ISFET funcionalizado por membrana.Rsi, Rmem,
do portão. No presente estudo, demonstramos que as medidas de
Rct, e RSol correspondem às resistências da camada de Si, a interface de
impedância no dispositivo ISFET podem ser usadas para detectar detecção química, a carga espacial e a solução, respectivamente. Csc,
interações antígeno-anticorpo na superfície da porta. Realizamos Cboi, Cmem, e Cdl correspondem à capacitância de carga espacial e à
experimentos de SPR complementares e descobrimos que as medições capacitância da camada isolante de óxido, da membrana e da
de SPR e impedância revelam sensibilidades comparáveis. Os dois
camada dupla, respectivamente. C representa a impedância de
Warburg.
métodos são aplicados para o desenvolvimento de imunossensores para
a toxina da cólera16 e DNPantibody.17

propriedades faciais da membrana, composta pela capacitância de

BASES TEÓRICAS
A impedância da membrana associada ao ISFET15,18
pode ser representado pelo circuito equivalente mostrado na Figura 1A.
Consiste no elemento de entrada do dispositivo ISFET que consiste na
resistência de silício,RSi, a capacitância de carga espacial, Csc, e a
capacitância do isolador de óxido, Cboi, que está ligado em série ao
segundo elemento que corresponde à membrana conectada em série
ao terceiro elemento composto pela resistência da solução,
RSol. O elemento de impedância da membrana é dividido em duas partes
ligadas em série. Uma parte inclui as propriedades da membrana em
massa, por exemplo, sua capacitância em massa,Cmem, em paralelo com
a resistência da membrana, Rmem. A segunda parte inclui o
(11) (a) Bergveld, P .; Sibbald, A. InQuímica Analítica Abrangente; Svehla,
G., Ed .; Elsevier: Amsterdam, 1988; Vol. XXIII. (b) Eijkel, JCT; Olthuis,
C.; Bergveld, P.Biosens. Bioelétron.1997, 12, 991-1001. (c) Ottenbacher,
D .; Kindervater, R .; Gimmel, P .; Klee, B .; Jnig, F .; Göpel, W.Sens.
Atuadores, B 1992, 6, 192-196. (d) Koch, S .; Woias, P .; Meixner, LK; Drost,
S .; Wolf, H.Biosens. Bioelétron.1999,14, 413-421. (e) Jinghong,
H .; Dafu, C .; Yating, L .; Hao, Y .; Xingxia, C .; Hong, Z.Sens. Atuadores, B
1996, 35-36, 422-426.
(12) (a) Kharitonov, AB; Zayats, M .; Lichtenstein, A .; Katz, E .; Willner, I.Sens.
Atuadores, B 2000, 70, 222-231. (b) Volotovsky, V .; Kim, N.Anal. Chim. Acta
1998, 359, 143-148. (c) Simonian, AL; Grimsley, JK; Linguados,
AW; Schoeniger, JS; Cheng, T.-C .; DeFrank, JJ; Wild, JRAnal. Chim. Acta2001
, 442, 15-23. (d) Puig-Lleixá, C .; Jiménez, C .; Alonso, J .; Bartroli,
J. Anal. Chim. Acta1999, 389, 179-188. (e) Jiménez, C .; Bartroli, J .; de Rooij,
NF; Koudelka-Hep, M.Anal. Chim. Acta1997, 351, 169-176. (f) Soldatkin,
AP; Volotovsky, V .; Elskaya, AV; Jaffrezic-Renault, N .; Martelet,
C. Anal. Chim. Acta2000, 403, 25-29.
(13) (a) Sekiguchi, T .; Nakamura, M .; Kato, M .; Nishikawa, K .; Hokari, K .;
Sugiyama, T .; Asaka, M.Sens. Atuadores, B 2000, 67, 265-269. (b)
Collapicchioni, C .; Barbaro, A .; Porcelli, F .; Giannini, I.Sens. Atuadores, B
1991, 4, 245-250. (c) Koncki, R .; Owczarek, A .; Dzwolak, W .; Glab, S.
Sens. Atuadores, B 1998, 47, 246-250.
(14) (a) Kharitonov, AB; Zayats, M .; Alfonta, L .; Katz, E .; Willner, I.Sens.
Atuadores, B 2001, 76, 203-210. (b) Zayats, M .; Kharitonov, AB; Katz, E .;
Willner, I.Analista 2001, 126, 652-657. (c) Zayats, M .; Kharitonov, AB; Katz,
E .; Bückmann, AF; Willner, I.Biosens. Bioelétron. 2000, 15, 671-
680.
(15) Kharitonov, AB; Wasserman, J .; Katz, E .; Willner, I.J. Phys. Chem. B2001,
105, 4205-4213.
dupla camada, Cdl, em paralelo à soma da resistência de transferência
de carga interfacial, Ret, e a impedância de Warburg, C, originando-se da
difusão de íons para a interface da membrana. Este circuito complexo
pode ser simplificado em termos do circuito representado na Figura 1B
sob certas condições. Desde que o semicondutor opere na região de
inversão,Csc é substancialmente menor que Cboi e pode ser
negligenciado. Da mesma forma, a resistência ao silício e a resistência
da solução,RSi e RSol, respectivamente, são significativamente menores
do que a resistência da membrana e, portanto, podem ser desprezados.
As propriedades interfaciais da membrana dão uma contribuição
importante para o circuito em baixas frequências (e5 Hz),19 mas em
frequências mais altas (g5 Hz), as características interfaciais da
membrana contribuem pouco para as propriedades de impedância do
sistema. Isso leva, nas respectivas condições, ao esquema de circuito
equivalente simplificado delineado na Figura 1B, onde a capacitância da
camada de óxido está em série com o elemento que consiste na
capacitância da membrana em paralelo à resistência da membrana. A
Figura 2 mostra o circuito eletrônico usado para elucidar os recursos de
impedância do ISFET. A tensão aplicada entre o contra-eletrodo e a fonte,
VGS, leva à corrente da fonte de drenagem, euD. Após a aplicação da
pequena perturbação de tensão sinusoidal no contra-eletrodo,δVGS,
pequenas variações em
(16) (a) Terrattaz, S .; Stora, T .; Duschl, C .; Vogel, H.Langmuir 1993, 9, 1361-
1369. (b) Charych, DH; Nagy, JD; Spevak, W .; Bednarsky, MDCiência
1993, 261, 585-588. (c) Pan, JJ; Charych, D.Langmuir 1997, 13, 1365-
1367.
(17) (a) Philips, JR; Brouwer, W .; Edwards, M .; Mahler, S .; Ruhno, J .; Collins,
SOU Immunol. Cell Biol.1999, 77, 121-126. (b) Willner, I .; Willner, B.
Biotechnol. Prog.1999, 15, 991-1002. (c) Mammen, M .; Gomez, FA;
Whitesides, GMAnal. Chem.1995, 67, 3526-3535.
(18) (a) Antonisse, MMG; Snellink-Ruël, BHM; Lugtenberg, RJW; Engbersen, JFJ;
van den Berg, A .; Reinhoudt, DNAnal. Chem.2000,
72, 343-348. (b) Lugtenberg, RJW; Egberink, RJM; van den Berg,
UMA.; Engbersen, JFJ; Reinhoudt, DNJ. Electroanal. Chem.1998, 452,
69-86. (c) Chovelon, JM; Jaffrezic-Renault, N .; Gros, Y .; Fombon, JJ;
Pedone, D.Sens. Atuadores, B 1991, 3, 43-50.
(19) Armstrong, RD; Horvai, G.Electrochim. Acta1990, 35, 1-7.

4764 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002

Figura 2. Circuito eletrônico para a determinação da transcondutância de um dispositivo ISFET modificado por filme.

a corrente de drenagem ocorre, δeud. A transcondutância definida comogm

) δeud/δVGS é dependente da frequência.20 Quando uma camada de
membrana está associada à camada de porta de óxido, o potencial VGS divide-
se sobre a membrana e a camada de óxido e, portanto, a diferença de
potencial efetiva entre a porta e a fonte é menor do que o valor aplicado VGS.
Consequentemente, uma função de transferência dependente da frequência,H
(jω), definido pela eq 1, é introduzido para relacionar o aplicado

1 + jωRmem Cmem
H(jω)) (1)
1 + jωRmem(Cmem + Cboi)

VFora ) RgmH(jω)VGS (2)

tensão para a tensão de saída (eq 2). Esta função de transferência (ou
transcondutância) expressa basicamente o fator de compensação necessário
para alterar o potencial de saída como resultado de mudanças no potencial da
porta para reter a corrente fixa dreno-fonte. Como a modificação química da
porta altera as características de impedância da interface, a função de
transcondutância incluirá uma transcondutância real (controlada pela
resistência da porta) e uma transcondutância imaginária (controlada pela
capacitância da porta). Verificamos, no entanto, que as frequências aplicadas
influenciam principalmente a transcondutância imaginária,15 e, portanto,
essas funções são usadas para elucidar eventos químicos que ocorrem no
portão.
O teórico18a, b forma da curva de transcondutância imaginária e
os métodos para extrair os valores τ1 e τ2 definidos pela eq 3 e eq 4
são mostrados na Figura 3. A interseção dos dois
(20) Bergveld, P .; van den Berg, A .; van der Wal, PD; Skowronska-Ptasinska,
M .; Sudhölter, EJR; Reinhoudt, DNSens. Atuadores, B 1989, 18, 309-
327
Figura 3. Função de transferência teórica e método para a extração
do τ1 e τ2 valores. (A função de transferênciaHEu estou é adimensional
e é definido na eq 1).
τ1 ) Rmem(Cmem + Cboi) ≈ RmemCboi (3)
τ2 ) RmemCmem (4)
segmentos lineares em baixas frequências produzem o τ1 valor. Uma vez
que em baixas frequências, a capacitância da camada de óxido é
substancialmente maior do que a da membrana aderida, o termoCmem
pode ser negligenciado na expressão formulada na eq 3. Em contraste,
em altas frequências, a capacitância da membrana, Cmem, e resistência à
membrana em massa, Rmem, domina as propriedades de impedância

Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002 4765

da interface de porta e, portanto, a capacitância da camada de
óxido, Cboi, pode ser negligenciado18 (eq 4). oτ2 o valor formulado na
eq 4 é extraído da interseção dos dois segmentos lineares da curva
de transcondutância em altas frequências (Figura 3). Conhecendo
os valores deτ1 e τ2, e sabendo a capacitância da camada de óxido, C
boi, o respectivo Rmem e Cmem os valores são elucidados. A
capacitância da membrana é dada pela eq 5, ondeεo e εmem
Cmem ) εoεmemUMA/δmem
são a constante dielétrica do vácuo e da membrana ligada à
camada de óxido, respectivamente (εo ) 8,85 × 10-12 F m1-),
UMA é a área geométrica da membrana em camadas no portão, e δ
é a espessura da membrana.
No presente estudo, imobilizamos estruturas em camadas
de complexos antígeno-anticorpo em dispositivos ISFET e
aplicamos medições de impedância para derivar as curvas de
transcondutância dos respectivos sistemas. Usamos os
experimentos para caracterizar a espessura das camadas sobre
o acúmulo das estruturas das proteínas. Os valores de
espessura são usados para caracterizar a cobertura da
superfície das proteínas na porta. Além disso, as medições de
impedância são usadas para sondar a detecção de anticorpos
ou antígenos pela interface do portão funcional. Comparamos
os valores de espessura das camadas de proteína derivadas
dos estudos de impedância com a espessura das estruturas de
antígeno-anticorpo relacionadas elucidadas por medições de
ressonância plasmônica de superfície. Descobrimos que os
métodos de impedância e SPR revelam sensibilidades
comparáveis.
SECÇÃO EXPERIMENTAL
Produtos químicos e reagentes. Avidina, biotina, N-2,4-dinitrofenil-
ε-amino-n-ácido capróico (DNP-antígeno), anti-N-2,4-dinitrofenil-ε-
amino-n-ácido capróico de cabra (anti-DNP-Ab), anti-IgG de cabra
(molécula inteira) biotina (anti-anti-DNP-Ab), proteína G de
Streptococcus sp., toxina da cólera (CT) de Vibrio cholerae, e N,N-di-
(2,4-DNP) -eu-cistina foram adquiridos da Sigma, e dímero de biotinil
hexaetilenoglicol (dibiotina) foi adquirido da Pierce e usado como
fornecido. O dicloridrato de cistamina era da Fluka e dialdeído
glutárico (GDA; solução aquosa a 50% p / p), (3-aminopropil)
trietoxissilano e os outros materiais foram adquiridos da Aldrich e
usados conforme fornecidos, sem purificação adicional. A
subunidade IgG1-anti-B monoclonal de camundongo da toxina da
cólera (CT-Ab) foi adquirida na Biodesign international (Kennebunk,
ME). Água ultrapura de uma fonte Elgastat (UHQ) foi usada em
todos os experimentos. Uma solução aquosa de cloreto de sódio de
baixa força iônica, 0,01 M, foi usada como solução eletrolítica de
fundo em todos os experimentos.
Modificação dos Dispositivos ISFET. A modificação primária do
Al2O3 porta do ISFET foi realizada posicionando um 0,2-µGota de L
de solução de (3-aminopropil) trietoxissilano (10% v / v em tolueno)
que incluiu 0,1 mL de água. Antes da deposição da mistura no
ISFET, a mistura foi deixada em repouso durante a noite para
induzir polimerização parcial. A solução na porta foi ainda
polimerizada em 115°C por 4 h no forno (Eurotherm). Os chips
sililados foram completamente enxaguados com tolueno seguido
por água bidestilada e secos ao ar em
4766 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002
temperatura ambiente por 3 h. Para preparar um sensor para detecção
de anti-DNP-Ab, o antígeno DNP foi covalentemente ligado à interface
de porta sililada pelo tratamento do chip na solução de DNP (2 mg mL-1,
HEPES 0,1 M, pH) 7,4) na presença de EDC por 2 h, seguido por enxágue
com H destilado2O. A interface DNPantígeno-modificada resultante foi
reagida com várias concentrações do anti-DNP-Ab (em HEPES 0,1 M, pH)
7,4) por 30 min para produzir o complexo antígeno-anticorpo primário.
A interface funcionalizada resultante foi então interagida com o anti-
(5) anticorpo conjugado com biotina (biotina IgG anti-cabra) (10 mg mL-1 em
PBS, pH) 7,4) durante 30 min. Em seguida, os ISFETs modificados com
biotina foram imersos em uma solução de avidina (1 mg mL-1 em
solução tampão de fosfato / salina 0,1 M (PBS), pH 7,4) por 30 min e bem
lavada com o tampão de fosfato. Uma segunda camada de avidina no
dispositivo ISFET foi montada pela interação da primeira camada de
avidina com uma solução de dibiotina (1 mg mL-1, PBS 0,1 M, pH
) 7,4) por 30 min seguido pela reação com avidina (1 mg mL-1,
0,1 PBS, pH) 7,4, 30 min).
Os ISFETs modificados com proteína G foram preparados tratando a
interface de porta funcionalizada com aminossiloxano com solução de
dialdeído glutárico (10% em PBS 0,1 M, pH) 7,4) por 20 min, seguido pela
reação da interface resultante com uma solução de tampão de fosfato
(0,1 M, pH) 7,4) que incluiu a proteína G (100 µg mL-1 em PBS 0,1 M, pH)
7,4) durante 10 min. Os ISFETs resultantes foram tratados com o
anticorpo anti-toxina da cólera (anti-CT-Ab) (100µg mL-1 em 0,1 M PBS,
pH) 7,4) durante 10 min para produzir a interface de detecção. A reação
entre o Al2O3/ aminossiloxano / GDA / proteína G / interface de detecção
de anticorpo anti-toxina da cólera e o analito da toxina da cólera foi
conduzido mergulhando o chip modificado em solução de PBS (0,1 M,
pH) 7,4) que incluiu várias concentrações de toxina da cólera por 20 min.
Todos os eletrodos foram submetidos à análise de impedância
imediatamente após o preparo.
Modificação dos Eletrodos de Ouro para Medições SPR.
Lâminas de vidro cobertas com Au para medição de SPR foram
preparadas da mesma maneira que Al2O3 Dispositivos ISFET, exceto
que as placas de ouro foram modificadas com N,N-di (2,4-DNP) -
eu-cistina, que permitiu a funcionalização direta dos eletrodos com o
antígeno DNP. Para preparar o sensor para a detecção de SPR da toxina
da cólera, as lâminas de vidro revestidas com Au foram primeiro
tratadas com solução de dicloridrato de cistamina (20 mM em H
destilado2O) por 2 h. As superfícies funcionalizadas em monocamada
resultantes foram então modificadas com a proteína G e o anti-CT-Ab
por procedimentos semelhantes aos descritos para as modificações de
ISFET.
Procedimentos para medições de impedância como ISFETs. Os
transistores de efeito de campo funcionalizados (IMT, Neuchâtel, Suíça),
com um Al2O3 portão (20 × 700 µm2) e um fio Pt (d ) 0,8
mm) atuando como um contraeletrodo e posicionados a 2 mm da
superfície da porta, foram montados em uma célula contendo 0,8 mL de
solução eletrolítica. As curvas características ISFET (eud contra
Vds para o apropriado Vgs valores) foram registrados usando um
analisador de parâmetro de semicondutor HP 4155 B.
O sistema descrito anteriormente para realizar as medições de
impedância nos dispositivos ISFET15 foi atualizado por sua operação
computadorizada usando LabView.
As medições de impedância dinâmica foram feitas usando um modelo de
amplificador lock-in Stanford Research SR 830 DSP controlado por
LabView (National Instruments Co.). A Figura 2 mostra o esquema pelo
qual o ISFET é conectado ao amplificador lock-in. As saídas auxiliares de
bloqueio fornecem tensão de fonte de drenagem,VDS, polarização de
gatesource, VGS, e as tensões de alimentação do amplificador
operacional. O sinal de referência (Sine Out) do lock-in modula a porta
para dar o sinal CAVgs através de um 100-µCapacitor de acoplamento F,
que também atua para remover o acoplamento CC de volta ao
amplificador lock-in. Esta modulação ac da corrente de estado
estacionário,euDS, torna-se eugs, que é convertida em voltagem pelo
circuito amplificador operacional, cuja saída é conectada à porta de
entrada A do amplificador lock-in. O amplificador operacional fornece
conversão de corrente em tensão estável e sem distorção em uma faixa
de frequência de 100 Hz a 100 kHz. Um multímetro SKL MAS830L
monitora a corrente de drenagem e um osciloscópio Tektronix modelo
TDS 220 é usado para monitorar a forma de onda.
Em condições de operação, a corrente dreno-fonte, euDS, está configurado para
20 µA ajustando primeiro VDS. O valor da tensão depende do ISFET
específico sendo examinado. Usando uma tensão de sinal,Vgs, mais
ajustes são feitos com VGS em um valor junto com VDS, de modo que
nenhuma distorção seja observada na onda modulada e na euDS
valor de 20 µA é mantido. Modulando sinais,Vgs, da ordem de 50
mV. Usando o controle LabView, a tensão do gate é varrida pelo
lock-in de 100 Hz a 100 kHz. O resultanteno- os componentes de
fase e quadratura da saída são exibidos pelo amplificador lock-in e
armazenados em um disco.
Para determinar as funções de transferência de transcondutância, os
potenciais de saída, VFora, em frequências variáveis foram relacionadas à
impedância imaginária, ZEu estou. Os valores dos potenciais de saída, que
correspondem aZEu estou, foram normalizados para os respectivos valores em
100 Hz para dar as respectivas funções de transferência HEu estou. A função de
transferência de impedância imaginária é dada pela eq 6. Os erros
log |HEu estou| )VFora (f, Hz) /VFora (100 Hz)
Eu estou Eu estou
(6)
nas dimensões calculadas dos substratos foram estimados em ∼
10%.
Procedimento para medições SPR. O espectrômetro do tipo SPR
Kretschmann (Biosuplar-2, Analítico-µSistema) (fonte de luz de diodo
emissor de luz λ ) 670 nm) foi usado neste trabalho. Um alto índice de
refração do prisma (N ) 1,61) e uma ampla faixa dinâmica (até 19° no ar)
do instrumento SPR permitiu análises SPR da superfície modificada sem
mudança no ângulo inicial. Esta é uma condição importante para
fornecer o ajuste computadorizado correto dos dados experimentais a
uma curva teórica. Os dados do SPR foram processados no software
Biosuplar-2 (versão 2.2.30) em um computador PC. Os espectros SPR
experimentais das camadas modificadas foram ajustados por curvas
teóricas, aplicando cálculo de Fresnel de cinco fases usando o algoritmo
de minimização de Nelder-Mead.21
O uso de uma célula aberta (230 µL) permitiu a eliminação fácil de
o conteúdo da célula e, portanto, rápida remoção e troca de solução,
quando necessário. Suportes de vidro (vidro TF-1, 20× 20 mm) coberto
com uma subcamada fina de cromo (∼5 nm) e uma camada de ouro
policristalino (∼50 nm) foram fornecidos pela Analytical-µ Sistema e
usado para as medições SPR.
(21) Beketov, GV; Shirshov, YM; Shynkarenko, OV; Chegel, VISens. Atuadores, B
1998, 48, 432-438.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O esquema 1A representa a configuração do sistema modelo antígeno-anticorpo para a análise
de anti-DNP-Ab por medições de impedância no dispositivo ISFET funcionalizado. O Al2O3 A interface
de porta do ISFET é funcionalizada com um filme fino de aminopropilsiloxano. O antígenoN-2,4-
dinitrofenil-ε-amino-nácido -capróico (1) foi covalentemente ligado à porta modificada. A interface de
antígeno resultante é reagida com o anti-DNP-Ab para produzir o complexo antígeno-anticorpo
primário. A interface funcionalizada resultante é então interagida com o anti-anti-DNP-Ab e com a
avidina para produzir o conjunto de proteína de três camadas. A reação subsequente da interface
com a avidina gera uma camada adicional de avidina na superfície. A arquitetura específica das
proteínas em camadas na interface do portão do dispositivo ISFET é projetada para usar a técnica de
impedância como uma ferramenta para acompanhar o acúmulo das camadas de proteína como
resultado da formação do complexo primário antígeno-anticorpo-anti-anticorpo no superfície do
portão. Além disso, o acúmulo secundário do conjugado avidina-dibiotina fornece um caminho de
amplificação para a geração primária do complexo antígeno-anticorpo. Em baixa cobertura do
complexo antígeno-anticorpo, as características de impedância do portão podem ser apenas
ligeiramente perturbadas, proibindo assim a detecção sensível do complexo imunológico. O acúmulo
secundário das camadas de avidina-dibiotina se acumularia apenas se o complexo antígeno-anticorpo
inicial fosse gerado na superfície do portão. A perturbação das propriedades de impedância do
portão pelas camadas secundárias de proteína amplificaria então a formação inicial do complexo
antígeno-anticorpo. O acúmulo secundário das camadas de avidina-dibiotina se acumularia apenas se
o complexo antígeno-anticorpo inicial fosse gerado na superfície do portão. A perturbação das
propriedades de impedância do portão pelas camadas secundárias de proteína amplificaria então a
formação inicial do complexo antígeno-anticorpo. O acúmulo secundário das camadas de avidina-
dibiotina se acumularia apenas se o complexo antígeno-anticorpo inicial fosse gerado na superfície
do portão. A perturbação das propriedades de impedância do portão pelas camadas secundárias de
proteína amplificaria então a formação inicial do complexo antígeno-anticorpo.
A Figura 4 mostra as curvas de transcondutância em frequências
variáveis para o sistema ISFET simples, curva a, após a funcionalização
da superfície do óxido de porta com o filme de aminopropilsiloxano,
curva b, sua modificação com o antígeno dinitrofenil, (1), curva c, e após
a montagem em etapas das camadas de proteína de acordo com o
Esquema 1A, curvas dg. Neste experimento, a porta funcionalizada com
antígeno é interagida com uma alta concentração do anti-DNP-Ab, 10µg
mL-1. Isso resulta em uma camada quase saturada do complexo
antígeno-anti-DNP-Ab na superfície da porta. A partir da curva de
transcondutância que corresponde à camada funcionalizada com
aminossiloxano e sua constante dielétrica, calculamos a espessura do
filme como sendo 245 (20UMA. Uma vez que as constantes dielétricas do
filme de aminopropilsiloxano e as camadas de proteína são quase
idênticas (os índices de refração para o aminossiloxano e a proteína
correspondem a n ) 1,43 e
1,45, respectivamente), podemos assumir uma constante dielétrica
constante da membrana funcional sobre o seu acúmulo na
interface de óxido ISFET. A ligação covalente do antígeno
dinitrofenil à membrana de aminossiloxano não altera a curva de
transcondutância da membrana funcional, uma vez que sua
espessura é muito baixa para observar mudanças de capacitância /
resistência da membrana. As curvas d e e da Figura 4 mostram as
curvas de transcondutância observadas na associação do Ab anti-
DNP à membrana funcionalizada com antígeno e do anticorpo anti-
Fc biotinilado que se liga ao Ab anti-DNP, respectivamente. oτ2 os
valores variam de 15,7 a 19,0 e 22,4 µs, respectivamente, enquanto
o τ1 os valores são quase inalterados, 1,26 (0,02 ms. Assim, a
associação do anti-DNP-Ab e do anti-anticorpo à interface funcional
altera principalmente a capacitância da membrana. Usando as eqs
3-5, estimamos a espessura do camada anti-DNP-Ab a ser ∼87 (
Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002 4767
Esquema 1. Montagem em etapas da interface de detecção (A) para a análise de impedância amplificada do anticorpo
antidinitrofenil nos dispositivos ISFET e (B) para analisar o anticorpo antidinitrofenil usando espectroscopia SPR

8 UMA, e a espessura da camada de proteína aumenta em 42 (4 UMA
como resultado da associação do anti-anti-DNP-Ab biotinilado. Deve-se
notar que o filme de aminossiloxano representa uma membrana rugosa
porosiva. O anti-DNP-Ab pode se ligar aos poros da membrana interna
que não aumentam o valor da espessura geométrica da camada de
proteína. O anti-DNP-Ab exibe uma geometria não simétrica com
dimensões de∼50 × 70 × 100 UMA naquela
se traduz em uma cobertura de superfície do anti-DNP-Ab de ∼4,1 ×
10-12 mol cm-2. O aumento na espessura das camadas de proteína
após a ligação do anticorpo anti-Fc biotinilado é apenas∼20% da
cobertura do anti-DNP-Ab (o anti-DNP-Ab e o antianti-DNP-Ab
apresentam dimensões semelhantes), o que corresponde a uma
cobertura de superfície do anti-anti-DNP-Ab de ∼8,2 × 10-13 mol cm-2
. Isso pode ser atribuído a duas razões: (i) Cada anti-Fc-

4768 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002


Figura 4. Transcondutância, HEu estou, curvas nas seguintes frequências
variáveis: (a) dispositivo ISFET simples, (b) ISFET funcionalizado com
aminopropilsiloxano, (c) após modificação da interface de óxido de porta com
o antígeno dinitrofenil, (d) após a montagem do antidinitrofenil anticorpo (10 µ
g mL-1), (e) após a imobilização do anticorpo antianti-dinitrofenil, (f) e (g) após
o acoplamento da interface de detecção com uma e duas camadas de avidina,
respectivamente. A inserção mostra mudanças graduais de espessura da
membrana após a construção do conjunto em camadas na interface de porta
ISFET: (a) e (b) correspondem ao ISFET nua e interface de porta funcionalizada
com aminossiloxano, respectivamente; (c), (d) e (e) correspondem à ligação de
0,1,
1.0 e 10.0 µg mL-1 anti-DNP-Ab, respectivamente; (f) corresponde à
ligação do anti-anti-DNP-Ab biotinilado; (g) e (h) correspondem à
associação da primeira e da segunda camadas de avidina à
interface, respectivamente.
o anticorpo inclui dois locais de ligação para o fragmento Fc do anti-DNP-
Ab e, portanto, a cobertura teórica da superfície do anti-anti-DNP-Ab
deve ser 50% de uma camada saturada do anti-DNP-Ab. (ii) O filme de
aminopropilsiloxano funcionalizado com o complexo antígeno-anticorpo
representa uma interface áspera. Assim, a ligação do anti-anti-DNP-Ab à
superfície rugosa pode ser estericamente proibida. As curvas feg da
Figura 4 mostram as curvas de transcondutância da membrana
funcionalizada após a ligação da primeira camada de avidina e após a
associação da segunda camada de avidina com as unidades de
reticulação de dibiotina. Como antes, a associação das camadas de
avidina induz mudanças principalmente no
τ2 valores para 32,3 e 47,8 µs, implicando que a associação das proteínas
resulta na alteração da capacitância da membrana. Usando as eqs 3-5,
as mudanças nas curvas de transcondutância após a ligação da avidina
se traduzem em uma espessura de 30 (3UMA da primeira camada de
avidina e um aumento adicional na espessura da membrana de 31 (3
UMA como resultado da associação da segunda camada de avidina. O
diâmetro da avidina é 62 (4UMA (Protein Data Bank, Brookhaven
National Laboratory22) Assim, a cobertura da superfície da membrana
por uma camada de avidina é∼3,5 × 10-12 mol cm-2. Este carregamento
parece estar ligeiramente superestimado. Isso pode ser atribuído à
contribuição das unidades de reticulação de dibiotina para a espessura
do filme e à eventual contribuição do
(22) http: // www.rcsb.org/pdb.
Figura 5. Transcondutância, HEu estou, curvas em frequências variáveis
correspondentes ao seguinte: (a) o dispositivo ISFET funcionalizado com
antígeno DNP, e após a interação do dispositivo de detecção com (b)
0,1, (c) 1,0 e (d) 10,0 µg mL-1 do anti-DNP-Ab. Inserção: mudança
gradual da espessura da membrana após o tratamento do
dispositivo ISFET DNPantígeno funcionalizado com várias
concentrações do anti-DNP-Ab.
constante dielétrica da proteína à constante dielétrica na membrana
resultante. Observe que um aumento na permeabilidade da membrana
resultaria em um valor mais alto da espessura da membrana. A inserção
da Figura 4 mostra a mudança gradual da espessura da membrana após
a formação das camadas de acordo com o Esquema 1A.
Experimentos de controle revelam que as mudanças nas curvas de
transcondutância se originam de eventos de biorreconhecimento
específicos que ocorrem na interface funcionalizada com antígeno. A
exclusão do anti-DNP-Ab ou do anti-anti-DNP-Ab biotinilado dos
sistemas impede a associação dos biomateriais subsequentes à interface
da membrana e não são observadas alterações nas curvas de
transcondutância. Isso implica que a adsorção não específica dos
biocomponentes à interface da membrana é insignificante para alterar
as características de impedância da porta. Assim, as mudanças
observadas nas curvas de transcondutância se originam de eventos de
biorreconhecimento específicos nas construções de proteínas em
camadas. Na verdade, as alterações de impedância da membrana ISFET
como resultado da associação do anti-DNP-Ab podem ser usadas para
detectar o anticorpo. A Figura 5 mostra as curvas de transcondutância
registradas no tratamento da membrana funcionalizada com antígeno
DNP com várias concentrações do Ab anti-DNP. Pode-se ver que, à
medida que a concentração de anti-DNP-Ab é elevada, aumentam as
mudanças noτ2 valores (capacitâncias da membrana) são observados.
Esses valores resultam nas variações da espessura da membrana
representadas na inserção da Figura 5.
A análise análoga do anti-DNP-Ab e a subsequente associação
do anticorpo anti-Fc biotinilado e as camadas de avidindibiotina foi
conduzida usando SPR como o sinal de leitura. Neste experimento,
um suporte de vidro coberto de ouro atua como o transdutor. oN,N
-di (2,4-DNP) -eu-cistina (2), foi acoplado covalentemente à superfície
de ouro por meio de funcionalidades S. A Figura 6 mostra os
espectros SPR do eletrodo funcionalizado com antígeno antes do
Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002 4769

Figura 6. Espectros de SPR do seguinte: (a) a superfície de Au
funcionalizada com antígeno DNP e após seu tratamento com (b) 0,1, (c)
1,0 e (d) 10,0 µg mL-1 anti-DNP-Ab; (e) após a montagem da camada anti-
anti-DNP-Ab biotinilada, e (f) e (g) após a associação de uma e duas
camadas de avidina, respectivamente. Inserção: mudanças graduais de
espessura da membrana sobre o acúmulo do conjunto em camadas na
placa SPR revestida com Au de vidro.
interação com o anti-DNP-Ab, curva a, e aqueles obtidos após o
tratamento da superfície com várias concentrações do anti-DNP-Ab,
curvas bd; cf. Esquema 1B. Claramente, conforme a concentração
em massa do anti-DNP-Ab aumenta, o ângulo de refletividade
mínimo é deslocado para valores mais altos. O ajuste teórico dos
espectros SPR experimentais revelou espessuras de filme da
monocamada anti-DNP-Ab que correspondem a 48 (3, 82 (6 e 116 (8)
UMA em concentrações de massa do anti-DNP-Ab de 0,1, 1,0 e 10,0
µg mL-1, respectivamente. Na espectroscopia SPR, as camadas adsorvidas são
amplamente caracterizadas em termos de espessura efetiva,δ, e índice de
refração eficaz, ne. No caso de monocamadas densamente compactadas, essa
suposição é correta para a adsorção biomolecular ordenada. Neste trabalho,
aplicamos uma abordagem adicional considerada em detalhes em outro lugar
23,24 para caracterizar camadas de proteína usando SPR. De acordo com esta
abordagem, a cobertura da superfície da proteína,Ns, e sua polarizabilidade,
UMAm, são determinados em vez de sua espessura efetiva e o índice de
refração.
Para uma camada isotrópica de moléculas de proteína, uma expressão
para um coeficiente de reflexão é definida pela eq 7,24 Onde Rp é o integral
Rp ) R0p + 2πiNsUMAm[(umagxx - fzz) (1 + R 2 0p ) -
2 (umagxx + fzz)R0p] / [(1 + 2πiNsUMAm) (uma + 2πiNsUMAmfzz) -
2πiNsUMAm(umagxx - fzz)R0p] (7)
Coeficiente de reflexão de Fresnel do sistema para p-polarização,
(23) Baryakhtar, IV; Demidenko, YV; Kriuchenko, SV; Lozovskii, VZSurf. Sci.1995,
323, 142-150.
(24) Shirshov, YM; Chegel, VI; Subbota, YV; Matsas, EP; Rachcov, AE; Sergeeva,
TASPIE Proc. 1995, 2648, 118-123.
4770 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002
Tabela 1. Comparação das espessuras das camadas da
membrana na detecção do anticorpo anti-DNP usando
medições de impedância em dispositivos ISFET e análises
SPR
espessura estimada, nm
superfície modificada ISFET SPR
aminossiloxano 24,5
anti-DNP-Ab (µg mL-1)
0,1 6,0 4,8
1.0 7,1 8,2
10,0 8,7 11,6
anti-anti-DNP-Ab 4,2 3,7
avidin1 3,0 4,4
avidin 2 3,1 1,5
R0p é o coeficiente de reflexão de Fresnel integral do sistema
para p-polarização na ausência da camada molecular adsorvida,
2 , Onde nm é o
uma é uma constante expressa como uma ) 1 + 4πAm/n m
índice de refração do meio a granel, e gxx e fzz são combinações dos
vetores de onda.23 A polarizabilidade da molécula, UMAm, pode ser
expresso na forma de eq 8, onde np é o índice de refração
UMAm ) 3M(n p2 - 1) / 4πFNuma(n p2 + 2) (8)
de proteínas condensadas, M é o peso molecular da proteína,
F é a densidade da proteína, e Numa representa o número de Avogadro.
O valor de uma cobertura de superfície de uma monocamada
biomolecular pode ser calculado usando as eqs 7 e 8, uma vez que os índices
de refração das proteínas variam em uma faixa estreita (np ) 1,42-1,48) e,
portanto, o índice de refração da proteína pode ser considerado constante e
corresponde a np ) 1,45. Em nosso caso, essa abordagem resultou em uma
cobertura de superfície do anti-DNP-Ab (10,0µg mL-1) de 4,15 ×
10-12 mol cm-2 que concorda perfeitamente com o estimado usando
medições de impedância ISFET.
A Tabela 1 compara as espessuras da interface anti-DNP-Ab
observada após o tratamento do Al funcionalizado com antígeno2O3
portão ou as superfícies da placa cobertas de Au. Mesmo que as
configurações da interface do antígeno de base no conjunto de filme
fino de siloxano ou monocamada tiolada difiram nos dois sistemas,
valores de espessura comparáveis das camadas anti-DNP-Ab
associadas são detectados pelos dois métodos. A Figura 6, curva e,
mostra o espectro SPR obtido após o tratamento da camada de
complexo antígeno-DNP-Ab (gerado a uma concentração de 10,0µg mL-1
anti-DNP-Ab) com o anti-Fc-Ab biotinilado. O ajuste teórico do espectro
indica que a espessura do filme anti-anti-DNP-Ab associado é 37 (3UMA,
um valor que é muito semelhante ao observado para a etapa análoga no
dispositivo ISFET funcional (42 (4 UMA). As curvas f e g da Figura 6
mostram os espectros SPR do sistema após a montagem em etapas das
camadas de avidina usando a dibiotina (3) reticulador na interface
anticorpo / anti-anticorpo. O ajuste teórico dessas curvas indica que as
espessuras da primeira e da segunda camadas de avidina
correspondem a 44 (3 e 15 (1UMA,
respectivamente. A inserção da Figura 6 descreve a mudança gradual da
espessura da membrana com a formação das camadas de acordo com o
Esquema 1B.
A análise de impedância das interações antígeno-anticorpo usando o
transdutor ISFET foi aplicada para desenvolver um dispositivo de detecção
para a toxina da cólera. Para este sistema também, a impedância

Figura 7. Transcondutância, HEu estou, curvas nas seguintes frequências variáveis: (a)
dispositivo ISFET vazio; (b) dispositivo ISFET modificado com proteína G; (c) após a
montagem da camada de anticorpo anti-toxina da cólera, e (d) após a ligação da
camada de antígeno da toxina da cólera (1.0× 10-7
M).
as medições no dispositivo ISFET foram acompanhadas por análises
SPR da toxina da cólera, usando a configuração de detecção
análoga. Esquema 2A descreve o caminho de detecção da toxina da
cólera nos dispositivos ISFET. A camada de óxido da porta é
modificada com um filme de aminopropilsiloxano. A proteína G está
covalentemente ligada à superfície usando dialdeído glutárico
como reagente de acoplamento, e o anticorpo anti-toxina da cólera
(anti-CT-Ab) está associado à interface da proteína G e atua como
interface de detecção. Prevê-se que a ligação do CT ao anticorpo
altere as características de impedância da interface do gate. A
Figura 7 mostra as curvas de transcondutância que resultam do
acúmulo da interface da proteína G, curva b, a associação do anti-
CT-Ab, curva c, e a ligação do antígeno CT à interface de detecção,
curva d.-7 M. As curvas de transcondutância revelam que o acúmulo
das camadas de proteína resulta em mudanças significativas na τ2
valores de 79,4 µs para o chip vazio a 0,24 ms para o chip
modificado com 10-7 M CT, enquanto o τ1 os valores são quase
inalterados, ∼1,26 (0,02 ms. Assim, a montagem das camadas de
proteína no ISFET resulta principalmente em alterações de
capacitância da membrana. Usando as eqs 3-5, podemos estimar as
alterações de espessura da membrana como resultado do acúmulo
das camadas de proteína (Tabela 2). Descobrimos que a interface
da proteína G exibe uma espessura de 22 (2 UMA que se traduz em
uma cobertura de superfície de ∼6,5 × 10-13 mol cm-2. Devido à
interface rugosa do filme de aminossiloxano, espera-se que a
proteína G se ligue a domínios porosos microscópicos e, portanto,
sua cobertura de superfície real não é totalmente refletida no
parâmetro de espessura calculado. A associação do anti-CT-Ab à
proteína G produz um aumento adicional na espessura da
membrana que corresponde a 36 (4UMA ou uma cobertura de
superfície de ∼1,2 × 10-12
mol cm-2. Ao analisar o CT, a espessura da membrana de detecção
aumenta em 152 (15UMA na concentração de CT de 10-7 M. A partir
do tamanho respectivo do antígeno CT, estimamos que sua
cobertura de superfície seja ∼1,2 × 10-12 mol cm-2, que está em
Tabela 2. Comparação das Espessuras das Camadas da
Membrana na Análise da Toxina do Cólera por Dispositivos
ISFET e Medições SPR
espessura estimada, nm
superfície modificada ISFET SPR
aminossiloxano 29,8
proteína G 2,2 5,6
Toxina Ab-cólera 3,6 3,0
toxina da cólera (M)
10-11 5,9 3,9
10-9 9,7 9,6
10-7 15,2 11,4
Figura 8. Transcondutância, HEu estou, curvas do seguinte: (a) dispositivo ISFET
funcionalizado com anticorpo de toxina anticólera mediante detecção de
(b) 1,0 × 10-11, (c) 1,0 × 10-9, e (d) 1,0 × 10-7 Antígeno da toxina da cólera M.
Inserção: mudança gradual na espessura da membrana após o tratamento do
dispositivo ISFET funcionalizado com anticorpo anti-toxina da cólera com
várias concentrações do antígeno da toxina da cólera.
boa concordância com a cobertura de superfície estimada do anti-
CT-Ab.
A Figura 8 mostra as curvas de transcondutância correspondentes à
análise de diferentes concentrações do antígeno CT pela porta ISFET
funcionalizada com anticorpo. À medida que a concentração do CT é
elevada, as curvas de transcondutância são deslocadas para diminuirτ2
valores, enquanto o τ1 os valores são quase inalterados. É evidente que
uma concentração de CT correspondente a 10-11 M pode ser detectado
pelo método e este valor pode ser considerado como o limite de
detecção inferior. A concentração letal25 de CT é 0,1 µg mL-1, e assim,
somos capazes de detectar a toxina em níveis que são
∼104 inferior ao valor letal. A partir das respectivas curvas de
transcondutância, é calculada a espessura do antígeno CT ligado ao
anticorpo. À medida que a concentração em massa de CT aumenta, o
conteúdo da toxina associada à superfície é mais alto (ver inserção na
Figura 8). Conhecer as dimensões do CT e aproximar uma pegada de∼1
× 10-16 UMA2, estimamos a cobertura de superfície de
(25) Jawetz, E .; Melnick, JL; Adelberg, EARevisão da Microbiologia Médica, 15ª
ed .; Lange Medical Publications: Los Altos, CA, 1982; Capítulo 18, p
227.
Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002 4771
Esquema 2. Montagem da interface de detecção e do caminho de detecção para analisar a toxina do cólera (A) por
meio de medições de impedância em dispositivos ISFET e (B) por meio de espectroscopia SPR
a toxina a ser 4,6 × 10-13, 7,6 × 10-13e 1,2 × 10-12 mol cm-2, em
concentrações de massa de 1,0 × 10-11, 1.0 × 10-9, e 1.0 × 10-7
M, respectivamente.
Esquema 2B mostra uma configuração análoga para a análise do CT
em uma superfície Au por SPR. A proteína G está covalentemente ligada
a uma monocamada de cistamina, e o anti-CT-Ab está adicionalmente
ligado à camada de proteína G para produzir a interface de detecção. A
Figura 9 mostra os espectros de SPR da monocamada de cistamina
modificada Ausurface, curva a, após a ligação covalente da proteína G à
monocamada, curva b, e após a associação do anti-CT-Ab, curva c. O
ângulo mínimo de refletividade é deslocado para ângulos mais altos à
medida que as camadas de proteína G e o anti-CT-Ab estão ligadas à
superfície. O ajuste teórico dos espectros SPR experimentais mostrados
nas curvas b e c indica que a espessura da camada de proteína G e a
camada de anti-CT-Ab são 56 (4 e 30 (2UMA,
respectivamente. Curiosamente, a espessura da camada anti-CT-Ab
na superfície de Au é comparável à espessura do análogo
4772 Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002
camada na membrana ISFET. Por outro lado, a espessura da
camada de proteína G no suporte de ouro é substancialmente
maior do que a espessura da respectiva camada no ISFET (Tabela
2). Isso provavelmente se deve ao fato de que a proteína G se liga a uma
superfície de Au relativamente lisa, enquanto a ligação da proteína G à
camada de óxido do ISFET ocorre em uma superfície porosa rugosa. A
ligação da proteína G em poros da interface de óxido não é refletida nos
valores de espessura resultantes. A ligação secundária do anti-CT-Ab às
unidades de proteína G ligadas à superfície da membrana e aos poros
leva às unidades de proteína que são expostas na superfície da
membrana ISFET. Como resultado, a espessura da camada anti-CT-Ab no
ISFET é muito semelhante à espessura da camada de anticorpo análogo
no suporte de ouro liso. O tratamento da superfície funcionalizada com
anticorpos com várias concentrações de resultados de CT nos espectros
de SPR mostrados nas curvas df. À medida que a concentração em
massa do CT aumenta, o ângulo mínimo de refletividade é deslocado
para valores mais altos. Por encaixe

Figura 9. Espectros SPR do seguinte: (a) superfície de vidro Aucoated
modificada com cistamina; (b) após a imobilização da proteína G; (c) após a
associação do anticorpo anti-toxina da cólera, após o tratamento do eletrodo
de vidro revestido com Au funcionalizado com anticorpo anti-toxina da cólera
com (d) 1,0× 10-11, (e) 1,0 × 10-9, e (f) 1,0 × 10-7 M do antígeno da toxina da
cólera. Inserção: mudança gradual na espessura da membrana após o
tratamento do eletrodo de vidro revestido com Au funcionalizado com
anticorpo anti-toxina da cólera com várias concentrações do antígeno da
toxina da cólera.
as curvas experimentais, as espessuras das camadas CT são 39
( 2, 96 (7 e 114 (8 UMA para concentrações de massa correspondentes a
1,0 × 10-11, 1.0 × 10-9, e 1.0 × 10-7 M, respectivamente. Vemos que,
embora a camada de base da membrana da proteína G no ISFET difira
substancialmente da interface da proteína G gerada na monocamada de
cistamina, a camada de detecção anti-CT-Ab ligada à superfície revela
cobertura de superfície comparável nos dois sistemas. Além disso, as
espessuras das camadas de CT formadas nas interfaces de detecção de
anticorpos revelam magnitudes comparáveis nas
aplicação dos métodos de SPR e impedância. O mesmo também é
verdadeiro para uma cobertura de superfície do antígeno da toxina
da cólera adsorvido nas superfícies funcionalizadas com anti-CT-Ab
dos dispositivos ISFET e eletrodos SPR (4.6× 10-13, 7,6 × 10-13e 1,2 ×
10-12 mol cm-2 obtidos usando medições de impedância nos
dispositivos ISFET e 5.1 × 10-13, 8,6 × 10-13, e 1,4 × 10-12 mol cm-2
obtido usando medições de SPR nas concentrações em massa de
CT de 1,0 × 10-11, 1.0 × 10-9, e 1.0 × 10-7 M, respectivamente).
CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou a aplicação de
medições de resistência nos dispositivos ISFET como um meio de
analisar as interações antígeno-anticorpo. A análise das características
de impedância da interface de detecção nos permitiu identificar a
composição e estrutura das camadas de antígeno-anticorpo na
superfície do portão. Realizamos medições SPR complementares em
sistemas análogos que foram estudados por medições de impedância
nos dispositivos ISFET. Nosso estudo implica que os dois métodos
produzem informações muito semelhantes. A ressonância plasmônica
de superfície já é uma técnica bem estabelecida para a sondagem de
processos de reconhecimento de proteína-proteína ou antígeno-
anticorpo, e vários biossensores são baseados neste método. Sugerimos
que as medições de impedância em um dispositivo ISFET podem ser
uma rota alternativa para desenvolver biossensores e para sondar
eventos de biorreconhecimento. Para este propósito, não é necessário
registrar a curva de transcondutância em uma ampla região de
frequências, mas sim registrar a transcondutância em uma frequência
específica. Assim, além das informações fundamentais que podem ser
extraídas das medidas de impedância na estrutura de proteínas na
superfície, o método pode ser considerado como um meio de
transdução geral de processos de biossensor.
RECONHECIMENTO
Esta pesquisa é apoiada pelo Prêmio Max Planck para
Cooperação Internacional (Alemanha). Os autores agradecem ao Sr.
Julian Wasserman por sua ajuda na construção da configuração
para realizar as medições de impedância em ISFETs.
Recebido para revisão em 8 de maio de 2002. Aceito em 26 de junho de 2002.
AC020312F
Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 18, 15 de setembro de 2002 4773