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Campinas, SP
2015
INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
Campinas, SP
2015
À minha família, por sempre estar
presente e ser meu suporte em todas
as situações. Em especial aos meus
pais Sandra e Gilvan, minha avó
Lúcia e meus irmãos Sérgio e Felipe.
DEDICO
v
OFEREÇO
Agradecimentos
Agradeço a Deus por todas as coisas que me permitiu vivenciar, por conceder a oportunidade
e a sabedoria para trilhar o caminho de estudos, também por todas as dificuldades que
apareceram no caminho que me fizeram crescer como profissional e como pessoa.
A meu orientador Sérgio Augusto Morais Carbonell, pela competência científica, pelos
ensinamentos, organização, amizade, assim como pelas valiosas discussões, críticas e
sugestões, além da confiança em mim depositada.
À Professora Doutora Siu Mui Tsai, agradeço pela coorientação, ao apoio que foi essencial
para a realização do projeto de pesquisa, além do conhecimento a mim transmitido.
Ao Doutor José Antônio de Fátima Esteves, pela amizade, parceria, paciência e toda ajuda em
relação à execução do projeto, meus sinceros agradecimentos.
"Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si,
levam um pouco de nós."
vi
Antoine de Saint-Exupéry
vii
Mahatma Gandhi
RESUMO
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é um importante constitiunte da dieta diária dos
brasileiros em virtude da sua constituição nutricional. As características químicas do solo são
fatores que atuam significantemente na produtividade da cultura e a deficiência de fósforo é
um dos principais fatores restritivos responsáveis para que a cultura não alcance seu potencial
produtivo. Desta maneira, o trabalho visou além de classificar os genótipos superiores quanto
ao uso eficiente do P, estabelecer uma metodologia de rotina de classificação, compreender os
mecanismos genéticos envolvidos com as respostas fisiológicas observadas em cultivares
mais eficientes na utilização do nutriente, gerando conhecimento a respeito de modelos de
expressão gênica, identificando os perfis dos genes diferencialmente expressos em genótipos
contrastantes. Inicialmente, foi realizado um experimento em hidroponia, em delineamento de
parcelas subdivididas, sendo as parcelas constituídas da aplicação de quatro concentrações de
P, e as subparcelas constituídas por 20 genótipos, com seis repetições. No segundo
experimento, foram avaliados 42 genótipos em relação ao número de verticilos e raízes basais
e quanto a eficiência no uso do P em hidroponia a fim de validar a metodologia de
classificação dos genótipos, utilizando a dose para a indução do estresse estabelecida no
primeiro experimento de 4,00mg L-1 de P. O terceiro experimento foi conduzido em vasos
preenchidos com Latossolo Vermelho Eutrófico, com baixo teor de P. O delineamento
experimental utilizado foi um fatorial 2 x 20, sendo o primeiro fator constituído pelas doses
de P (45 e 90 kg ha-1 de P2O5) e, o segundo fator, pelos 20 genótipos de feijão utilizados no
primeiro experimento, com seis repetições. O quarto experimento foi instalado em hidroponia,
utilizando os genótipos contrastantes IAC Imperador (Eficiente) e DOR 364 (Ineficiente),
submetidos à deficiência do P. Os perfis de expressão gênica foram obtidos das bibliotecas
preparadas com a utilização do kit TruSeq RNA Sample Prepv2 LowThroughput (LT) e o
mapeamento realizado contra o genoma do feijão da base de dados Phytozome v.9.1. As
análises de expressão diferencial foram realizadas utilizando-se a ferramenta o pacote
Cufflinks e a anotação funcional realizada utilizando o programa Blast2Ge. Pelos resultados
inicialmente obtidos, foi possível verificar a existência de diferenças significativas no
desenvolvimento das plantas em relação às doses de P aplicadas, além disso, foi possível
eleger a dose de 4,00 mg L-1 de P como a mais eficiente na indução do estresse e, constatar a
existência de variabilidade entre os 20 genótipos em relação a eficiência de uso do nutriente,
viii
destacando os genótipos IAPAR 81, Carioca Comum, IAC Carioca Tybatã, IAC Imperador e
G2333 como eficientes e responsivos. No segundo experimento, foi possível selecionar os
genótipos G2333, Pérola, IAC-Carioca Taurino, Santa Rosa e PI-310724 por apresentarem os
melhores potenciais produtivos em condição de restrição do P; os genótipos Preto s.3888, G
2333, Pintado Rajado e Cal-143 por apresentarem os maiores comprimento do sistema
radicular. Os resultados também permitiram eleger a produtividade de grãos, número de
vagens cheias, área superficial de raiz, volume de raiz e número de verticilos como as
variávies de maior importância relativa e, finalmente correlacionar os caracteres de raiz
comprimento total, área superficial e volume com os componentes de produção. O terceiro
experimento possibilitou constatar que, assim como em hidroponia, as doses de P utilizadas
foram eficientes na indução do estresse, havendo uma certa representabilidade do
experimento realizado em hidroponia, possibilitando classificar os genótipos IAC Formoso, G
2333, IAC Carioca Tybatã, IAPAR 81, IAC Imperador, Esplendor e IPR Tangará como
Eficientes e responsivos. Por meio dos resultados referentes a expressão diferencial dos
transcritos obtidos pela técnica RNAseq o contraste entre os genótipos em relação à eficiência
de uso do P pôde ser confirmado pela obtenção dos diferentes perfis de expressão, sendo
também possível identificar os genes mais responsivos tanto para diferenciar o fator de
resposta à dose de P aplicada quanto para diferenciar o comportamento do genótipos.
ix
Palavras-chave: Deficiência de P, hidroponia, transcriptoma, RNAseq.
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is an important component of the Brazilian daily
diet in view of nutritional constitution. Soil chemical characteristics are one of the factors that
act significantly in crop yield and phosphorus deficiency is one of the main restrictive factors
responsible for low production potential. Therefore, this research project aimed to classify
superior genotypes for phosphorus use efficiency, validating a classification routine
methodology; understand the genetic mechanisms involved in the physiological responses
observed in the most efficient cultivars for nutrient use, generating knowledge about gene
expression models, identifying the profiles of differentially expressed genes in contrasting
genotypes. Initially, an experiment was conducted in hydroponics, in a split plot design, the
plots consisting of the application of four concentrations of P, and subplots consisted of 20
genotypes, with six replications. In the second experiment 42 genotypes were evaluated for
number of whorls and basal roots and for the efficiency of the use of P in hydroponics, in
order to validate the genotypes classification methodology, using the dose 4,00 mg L-1 of P
established in the first experiment for stress induction. The third experiment was conducted in
pots filled with Rhodic Eutrophic soil with low P content. The experimental design was an 2 x
20 factorial, the first factor consisted in the P doses (45 and 90 kg ha-1 of P2O5) and the
second factor, for the 20 genotypes used in the first experiment, with six replications. The
fourth experiment was conducted in hydroponics, using the contrasting genotypes IAC
Imperador (Efficient) and DOR 364 (Inefficient) subject of P deficiency. Gene expression
profiles were obtained from libraries prepared using the kit TruSeq RNA Sample Prepv2
LowThroughput (LT), the mapping was performed against the commom bean genome of
Phytozome V.9.1 database. The differential expression analyzes were performed using
Cufflinks package and the functional annotation was performed using the Blast2Ge program.
The results initially obtained, it was possible verified significant differences in plant
development relative to P doses, moreover, it was possible to choose the 4.00 mg L-1 P dose
as the most efficient in the stress induction and, verified the variability existence among the
20 genotypes in relation of nutrient use efficiency, highlighting the genotypes IAPAR 81,
Carioca Comum, IAC Carioca Tybatã, IAC Imperador and G 2333 as efficient and
responsive. On the second experiment, it was possible to select the genotypes G 2333, Pérola,
IAC Carioca Taurino, Santa Rosa and PI-310724 for yield potential in P deficiency condition;
x
the genotypes Black s.3888, G 2333, Pintado Rajado and Cal-143 for the greatest length of
the root system. The results allowed electing yield, number of filled pods, root surface area,
root volume and number of whorls as the most relative important variables and, finally
correlating the root traits length, superficial area and volume with yield components. The
third experiment allowed us to note that, as in hydroponics, the P doses used were efficient in
the stress induction, being consistent with the first experiment in hydroponics, also allowing
us to classify the efficient and responsive genotypes IAC Formoso, G 2333, IAC Carioca
Tybatã, IAPAR 81, IAC Imperador, Esplendor e IPR Tangará. Finally, through the results of
the differential expression of the transcripts obtained by RNAseq, the contrast in relation to P
use efficiency between the genotypes was confirmed with the obtaining of different profiles
of expression, it is also possible to identify the most responsive genes to differentiate the
response of the factor P dose applied as to differentiate the genotypes behavior.
xi
Keywords: P deprivation, hydroponics, transcriptome, RNAseq.
Sumário
Introdução................................................................................................................................... 1
Revisão de Literatura ................................................................................................................. 2
A Cultura do feijoeiro ............................................................................................................ 2
O Fósforo................................................................................................................................ 4
Estudo da eficiência da aquisição e uso do P ......................................................................... 6
Referências Bibliográficas ....................................................................................................... 10
Capítulo 1 ................................................................................................................................. 15
Classificação e seleção de genótipos de feijoeiro o comum quanto à eficiência de uso do
fósforo .................................................................................................................................. 15
RESUMO ......................................................................................................................... 15
ABSTRACT ..................................................................................................................... 16
1. Introdução .............................................................................................................. 17
2. Material e Métodos ................................................................................................ 19
3. Resultados e Discussões ........................................................................................ 22
4. Conclusões ............................................................................................................. 40
5. Referências bibliográficas ...................................................................................... 40
Capítulo 2 ................................................................................................................................. 44
Avaliação da resposta de genótipos de feijoeiro à deficiência de P em sistema hidropônico.
.............................................................................................................................................. 44
RESUMO ......................................................................................................................... 44
ABSTRACT ..................................................................................................................... 45
1. Introdução .............................................................................................................. 46
2. Material e Métodos ................................................................................................ 47
3. Resultados e Discussões ........................................................................................ 51
4. Conclusões ............................................................................................................. 65
5. Referências Bibliográficas ..................................................................................... 66
Capítulo 3 ................................................................................................................................. 69
Avaliação de genótipos de feijoeiro quanto à eficiência do uso do P em Latossolo
Vermelho Eutrófico .............................................................................................................. 69
RESUMO ......................................................................................................................... 69
ABSTRACT ..................................................................................................................... 70
1. Introdução .............................................................................................................. 71
2. Material e Métodos ................................................................................................ 72
xii
3. Resultados e discussões ......................................................................................... 75
4. Conclusões ............................................................................................................. 91
5. Referências Bibliográficas ..................................................................................... 91
Capítulo 4 ................................................................................................................................. 94
Análise do Transcriptoma de Plantas de Feijoeiro Comum (Phaseolus vulgaris L) Quanto a
Eficiência do Uso do Fósforo. .............................................................................................. 94
RESUMO ............................................................................................................................. 94
ABSTRACT ..................................................................................................................... 96
1. Introdução .............................................................................................................. 98
2. Material e Métodos .............................................................................................. 100
3. Resultados e discussões ....................................................................................... 105
4. Conclusões ........................................................................................................... 138
5. Referências Bibliográficas ................................................................................... 138
Conclusões Gerais .................................................................................................................. 141
xiii
Introdução
1
esses processos afetados por fatores morfológicos, fisiológicos e pela demanda nutricional.
Nesse contexto, é de extrema importância o estudo das relações gênicas que determinam
a maior eficiência de determinados genótipos à aquisição e uso do nutriente, além das recentes
abordagens em relação ao estudo do perfil de expressão gênica em larga escala, como uma
importante ferramenta para entender como as plantas respondem a estresses bióticos e
abióticos.
Assim, o presente estudo teve como objetivo geral a classificação de genótipos
superiores quanto ao uso eficiente do P, compreender os mecanismos genéticos envolvidos
com as respostas fisiológicas quanto à utilização do nutriente e como objetivos específicos:
Estabelecer uma dose ideal para a indução da deficiência;
Validar uma metodologia de rotina em larga escala para classificação de
genótipos;
Verificar se os resultados da classificação são coerentes com os observados em
solo;
Gerar conhecimento a respeito de modelos de expressão gênica, identificando
os perfis dos genes diferencialmente expressos em genótipos contrastantes para
a resposta ao estresse por P, identificando genes candidatos para futuros estudos
e, possivelmente, ampliando as possibilidades de incorporação dos mesmos em
cultivares elites.
Revisão de Literatura
A Cultura do feijoeiro
2
commodities em nível mundial, havendo aproximadamente 40.000 variedades. O feijoeiro é
produzido e uma vasta gama de ambientes e sistema de cultivo, como a América Latina,
África, Oriente Médio, China, Europa, Estados Unidos da América e Canadá. Os maiores
produtores e consumidores de feijão são Brasil, México, Zona Andina, América Central e
Caribe (FAO, 1999).
O feijoeiro comum é uma espécie anual, diploide (2n=2x=22) e autógama, onde
predomina a autopolinização (95%). A cultura pertence à família Fabaceae, ordem Rosales e
gênero Phaseolus. Seu ciclo pode variar de 60 a 120 dias, podendo apresentar hábitos de
crescimento determinado ou indeterminado AIDAR (2007).
O feijão, originário do continente americano, foi domesticado independentemente em
diversas regiões, dando origem segundo SINGH et al. (1991) a dois pools gênicos distintos
principais, Andinos e Mesoamericanos. Por meio da análise aloenzimática da proteína
faseolina presente na semente de feijão foi possível verificar a existência de diversidade
dentro da espécie, separando geograficamente populações selvagens do norte do México até a
Colômbia (Mesoamericanas) e, das populações do Peru e da Argentina (Andinas), indicando
ter ocorrido fluxo gênico do feijão selvagem ao cultivado e, sugerindo também, a existência
de pelo menos cinco subgrupos dentro pool Mesoamericano e quatro subgrupos dentro do
pool Andino.
Em relação à qualidade nutricional o feijão, segundo BEEBE et al. (2000) tem um
grande potencial para combater a desnutrição e a fome, pois o alimento é rico em proteínas
de qualidade (20-28%), carboidratos (32%), fibras (56%), micronutrientes como o ferro (70
mg kg-¹) e o zinco (33 mg kg-¹), além de vitamina A. Segundo FACHINI et al. (2006), na
alimentação da população brasileira o feijão é considerado um dos principais alimentos e ,
juntamente com o arroz, são a base da alimentação nacional, sendo complementares em
termos de aminoácidos essenciais. Além disso, é um produto de alta expressão econômica,
visto que é uma fonte básica e barata de proteínas e calorias, sendo muitas vezes, a principal
fonte proteica da população menos favorecida.
Quanto à estrutura produtiva no Brasil, há um enorme contraste quanto aos sistemas de
produção utilizados. De um lado, encontram-se os pequenos produtores que empregam, na
sua maioria, mão-de-obra familiar e baixo nível tecnológico. No extremo oposto, encontram-
se os grandes produtores rurais que cultivam o feijoeiro em grandes áreas utilizando elevado
nível tecnológico como a irrigação, alcançando altas produtividades. No entanto, a cultura do
feijoeiro se caracteriza como uma atividade de pequenos e médios produtores rurais, uma vez
3
que, 75% das lavouras nacionais de feijão são cultivadas em áreas inferiores a 10 hectares
(FUSCALDI e PRADO, 2005).
De acordo com os dados da CONAB - Companhia Nacional de Abastecimento (2014), a
estimativa da safra brasileira de 2013/2014 foi de aproximadamente 3,44 milhões de
toneladas, com uma área plantada de 3,33 milhões de ha e uma produtividade média de 1.033
kg ha-¹. A média nacional de produtividade ainda é considerada baixa, visto que o potencial
produtivo da cultura em condições adequadas pode atingir valores acima de 4.000 kg ha-1.
Essa baixa produtividade pode ser atribuída a diversos fatores, sendo a baixa fertilidade dos
solos um dos fatores mais limitantes ao desenvolvimento da cultura, em especial o
inadequado suprimento de fósforo nos solos brasileiros.
O Fósforo
4
Grande parte dos solos brasileiros são intemperizados e apresentam óxidos de ferro e
alumínio como principais constituintes da fração argila. Em condições de reação ácida, os
óxidos de ferro e alumínio apresentam-se preferencialmente com cargas positivas, sendo
assim capazes de reter predominantemente os íons fosfatos (VALLADARES et al., 2003).
Assim, o fato de parte do nutriente apresentar-se adsorvido ao solo, em formas pouco
disponíveis as plantas, reduz a eficiência no uso dos fertilizantes fosfatados, sendo utilizado
pelas culturas, aproximadamente, de 10 a 20 % do nutriente aplicado (SANTOS et al.,
2011).
Segundo BARBOSA et al. (2005), diversos fatores influenciam o processo de adsorção
do P, como o tipo e a solubilidade do fertilizante fosfatado utilizado, localização e época de
aplicação, umidade do solo, além do desenvolvimento radicular da cultura, o que pode levar
ao aumento ou diminuição quanto as perdas por lixiviação e fixação. Solos com baixa
capacidade de armazenamento de água e, em consequência, pobres em condutividade
hidráulica, também são limitantes para a rápida mobilização e disponibilização do P. As
relações do P com outros elementos no solo como, por exemplo, Al e Fe provocam pouca
disponibilidade do nutriente para as plantas, além de toxidez que podem impedir o
desenvolvimento radicular e a absorção dos nutrientes (SCHAFFERT et. al., 1999).
A maioria das plantas cultivadas contém entre 0,2% e 0,5% de P em sua matéria seca,
sendo que, na agricultura intensiva, muito deste nutriente pode ser aplicado utilizando-se
fertilizantes fosfatados inorgânicos e orgânicos. Nesse contexto, a adubação fosfatada é
utilizada extensivamente a fim de minimizar o risco de deficiência de P no solo e,
consequentemente, aumentar a produtividade das culturas e melhorar a segurança alimentar
(KIRKBY & JOHNSTON, 2008).
Segundo SCHRÖDER et al. (2011), os fertilizantes fosfatados minerais,
intensivamente utilizados na produção de alimentos nos últimos 50 anos, são processados a
partir das reservas fósseis, no entanto, devido a ineficiências na cadeia de produção e
consumo de alimentos, apenas um quinto desse P suprem os alimentos consumidos pela
população global. Frente ao aumento da populacional mundial dos próximos 40 anos e da taxa
de esgotamento de reservas de P para a produção de fertilizantes, previstas para 50-150 anos,
é extremamente necessário que haja o uso eficiente do recurso.
BEEBE et al. (2013), afirmam que os atuais esforços quanto ao aumento da eficiência
de aquisição e utilização de nutrientes em condição de baixa fertilidade natural dos solos,
certamente contribuirão também para melhorar de maneira sustentável, a eficiência do uso de
fertilizantes. Os autores reforçam a importância da recuperação do P aplicado, antes de ser
5
irreversivelmente fixado por óxidos de ferro e de alumínio nos solos tropicais com alta
capacidade de fixação, o que implica na utilização de plantas com um sistema radicular
eficiente que acesse agressivamente os nutrientes do solo.
6
al., 2006; HILL et al., 2006; OCHOA et al., 2006), têm salientado a importância das
adaptações radiculares, especialmente em leguminosas.
BEEBE et al. (1995) e SINGH et al. (2003) verificaram, em avaliações feitas em solos
com baixo nível de P, germoplasma tolerante à esta deficiência, abrindo oportunidades para o
desenvolvimento e seleção de novas variedades. MUCHHAL & RAGHOTHAMA (1999)
demonstraram que as plantas aumentam sua capacidade de absorver Pi durante períodos de
estresse de P, devido à síntese de moléculas transportadoras adicionais.
Os trabalhos de avaliação de cultivares de feijoeiro em condições de campo têm
permitido verificar que existem materiais mais eficientes na absorção e aproveitamento de P.
Estes estudos permitem classificar os cultivares em: eficientes e responsivos; eficientes e não-
responsivos; não-eficientes e responsivos; não-eficientes e não-responsivos (FAGERIA,
1998). MELISSA et. al. (2005), afirmaram que a adaptação das plantas está na habilidade das
mesmas em adquirir recursos no solo sem afetar sua produtividade. Plantas que não são
eficientes precisam de mais fertilizantes, aplicados com maior custo, para o produtor e maior
agressão ao ambiente, sobretudo em virtude dos desequilíbrios químicos e da acidificação das
águas.
OLIVEIRA et. al. (2012), observaram variabilidade genotípica quanto à eficiência do
uso do P em 19 genótipos de feijoeiro cultivados em ambientes de baixo e alto nível de P,
suplementados com respectivamente 20 e 120 kg.ha-1. Assim, os autores selecionaram no
Estado de Tocantins os genótipos IAC Una, IPR-Saracura, IPR-Juriti, IAC Centauro e IPR-
Corujinha como mais eficientes quanto à absorção e responsividade ao P, recomendando os
mesmos para cultivo em baixa, média e alta tecnologia.
PERILLA (2014), avaliando 13 genótipos dos grupos de tegumento preto e carioca
em solução nutritiva, utilizando as doses 6,25 e 25,02 µM L-1, observaram diferenças
estatísticas para as doses e genótipos avaliados, assim como para todos os índices de
eficiência de utilização do P estimados na maturidade fisiológica, destacando os cultivares
que apresentaram maior eficiência IPR Uirapuru, IPR Tuiuiú e BRS Esplendor do grupo preto
e IPR Eldorado do grupo carioca. Após elencar a eficiência dos genótipos foram realizados
sete cruzamentos entre os genótipos mais contrastantes, sendo conduzido até a geração F3 que,
pela avaliação dos parâmetros genéticos o autor verificou tanto a presença de efeitos aditivos,
como de dominância no controle da eficiência de utilização do nutriente.
Nesse contexto, é de extrema importância o estudo das relações gênicas que
determinam a maior eficiência de determinados genótipos à aquisição e uso do nutriente.
Segundo GEORGE & RICHARDSON (2008), as plantas possuem uma ampla gama de
7
mecanismos fisiológicos e características que facilitam o aumento da disponibilidade e
aquisição de P do solo. No entanto, aumentar a eficiência de utilização de P pelas plantas
cultivadas têm sido um desafio, em grande parte devido às interações complexas entre o
leque de mecanismos de aquisição e sua eficácia em diferentes ambientes.
É sabido que a restrição do P reduz rapidamente as taxas de crescimento da planta. No
entanto, a demanda de P nos tecidos e as respostas quanto à disponibilidade do elemento
variam muito entre genótipos. A deficiência do P altera a bioquímica celular, a alocação de
biomassa e a morfologia radicular para atender as exigências de P da planta. As respostas
típicas das plantas à restrição do nutriente incluem a remobilização, a redução ou a
substituição do P em compostos celulares não essenciais, a exsudação de metabólitos e
enzimas para a rizosfera, e alterações na morfologia da raiz, podendo ocorrer associações com
microrganismos para aumentar a eficiência de aquisição do P a partir do solo (WHITE &
HAMMOND, 2008).
YAN et al. (2001), obtiveram correlação entre parâmetros de arquitetura de raiz e
eficiência para o uso do P em feijoeiro. A habilidade para produzir fosfatases, induzidas pela
demanda de fósforo na planta, pode mobilizar P desde fontes orgânicas. BOSSE & KOCK
(1998) perceberam que em ausência de fosfatos no solo aumentaram as concentrações de P
nas raízes, assim como aumentaram a concentração de fosfatases, fitases e RNAses.
Deficiências de P originam mudanças na expressão gênica sendo observadas
alterações em genes que codificam fosfatases (PATEL et. al., 1995), RNAses (GREEN,
1994), fitases, e fosfotransportadores (MUCHHAL et. al., 1996), os quais desempenham
diferentes funções quanto a nutrição do P na planta. Estas adaptações repercutem na formação
de estruturas como “clusters” radiculares, incrementam a exsudação de ácidos orgânicos e
aumentam a atividade dos genes ligados à produção de fosfatases ácidas e
fosfotransportadores (VANCE, 2001; VANCE et al., 2003). RAGHOTAMA (1999),
observou que a deficiência de P pode afetar outros genes envolvidos na síntese de PEPcasa,
proteínas de armazenamento vegetativo e piruvatos, evidenciando um complexo sistema de
regulação ligado às respostas e mudanças celulares de acordo com os níveis de P presentes na
planta.
Para compreender a relação entre o genoma e o funcionamento das células, procura-se
estudar os produtos do genoma, as proteínas e RNAs expressos, com o intúito de preencher a
lacuna do entendimento do código genético, das moléculas funcionais presentes nas células e
os diferentes perfis de expressão gênica. Assim, a comparação de transcriptomas de diferentes
tipos de células, tecidos e condições fornece uma compreensão mais profunda do que
8
constitui um tipo específico de célula e, como as mudanças na atividade transcricional pode
refletir ou contribuir para a ativação ou repressão de genes em vários tipos de células e tecidos
(ADAMS, 2008).
RAMIREZ et al. (2005) e GRAHAM et al. (2006) em estudos referentes à análise de
ESTs (Expressed Sequence Tags) identificaram 52 genes candidatos para aumentar a
eficiência à absorção de fósforo através de 247 contigs em raízes de feijão cultivados em
situação de estresse de fósforo. Os genes identificados pertencem a várias categorias
funcionais envolvidos na aquisição, transporte e mobilização de fosfatos, tais como
transportadores de fosfato, aquaporinas, transportadores e fosfatases.
HERNÁNDEZ et al. (2007), estudando a genômica funcional de plantas de feijoeiro
submetidas a uma redução no suplemento de P de 1 mM e 5 µM P e coletadas 3 semanas após
a indução do estresse, obtiveram um perfil de transcrição do sistema radicular do genótipo
Negro Jampa 81 através de análises de macroarranjos. Do total de 2212 unigenes das
bibliotecas de cDNA de raiz sob deficiência, 126 sequências apresentaram expressão
diferencial em resposta ao P. Assim, os autores identificaram uma série de genes candidatos,
com funções diversas na adaptação das plantas de feijão à deficiência de P, contribuindo para
aumentar o rol de informações sobre a regulação e sobre as vias de sinalização durante a
deficiência do nutriente.
SCHMUTZ et al (2014), disponibilizaram a primeira versão V 1.0 da escala
cromossômica de feijoeiro comum na plataforma de dados genômicos de plantas
“Phytozome”, resultado do projeto de cooperação USDA-NIFA "Um mapa seqüência do
genoma para melhoramento do feijão" a fim de facilitar os estudos de genômica comparativa.
Esta versão inclui bibliotecas de cromossomos artificiais bacterianos (BAC), sequências finais
fosmidios e um mapa denso, saturado com 7.015 marcadores. Foram montados 473 Mb do
genoma de 587 Mb e 98% dessas sequências foram ancoradas aos 11 cromossomos da
escala, para tal, foram utilizados o sequenciamento de 60 indivíduos selvagens e 100
variedades crioulas dos conjuntos gênicos mesoamericano e andino. Além disso, o banco de
dados fornece livre acesso ao genoma sequenciado e anotado, facilitando os estudos de
mapeamento da espécie e de anotação funcional.
Segundo HIZ et al. (2014), recentes abordagens em relação ao estudo do perfil de
expressão gênica em larga escala têm se mostrado como uma importante ferramenta para
entender como as plantas respondem a estresses bióticos e abióticos. Os autores relatam que,
apesar do acúmulo de informações de dados de sequenciamento de transcritos de plantas
modelos e de culturas agronomicamente importantes, ainda há poucos estudos com relação a
9
essas espécies sobre a análise de transcriptoma em condições de estresse abióticos, sendo os
estudos mais abordados os de efeitos da seca e estresse salino em perfil de expressão gênica.
Os autores mencionam que, apesar de não haver disponível uma análise do transcriptoma do
feijoeiro em estresse abiótico, as análises de sequências de RNA de nova geração irão
fornecer informações valiosas para a identificação e clonagem de genes de tolerância ao
estresse, a fim de serem utilizadas como ferramenta no melhoramento de variedades com
aprimorados mecanismos de tolerância.
Referências Bibliográficas
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14
Capítulo 1
Classificação e seleção de genótipos de feijoeiro o comum quanto à eficiência
de uso do fósforo
RESUMO
15
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most important legume in the
Brazilian food consumption, doing part of the daily diet as the main source of protein and
iron. Common bean is frequently grown in weathered soils with low phosphorus (P)
availability, and this is one of the main limitations on its production. This study aimed to
assess 20 common bean genotypes in a hydroponic system to select the best P concentration
for inducing nutritional deficiency and to classify the genotypes in terms of nutrient
utilization efficiency. The experimental design was an split plot with application of four
concentrations of P in the plots (8.00, 4.00, 2.00 and 0.05 mg L-1), the subplots were the 20
genotypes, with six repetitions. At 21 days, in the plot subjected to an application of the most
severe stress, the 0.05mg L–1dose of P, had smaller plant size and early leaf abscission was
observed. All P concentrations resulted in significant differences in plant growth between the
doses, genotypes and interaction dose x genotypes for the most traits evaluated. The 4.00
mgL–1dose of P was the most efficient in inducing stress for discrimination of cultivars in
terms of efficiency of use of P. The following genotypes: IAPAR 81, Carioca Comum, IAC
Carioca Tybatã, IAC Imperador and G 2333 stood out as being efficient and responsive to P,
while the two cultivars DOR 364 and Jalo Precoce were the most inefficient and
unresponsive.
16
1. Introdução
17
uma função importante na transferência energética entre o fósforo consumido e os processos
que demandam energia através das ligações de alta energia nas moléculas de ATP. Respostas
com baixo desempenho, desordens fisiológicas, diminuição do peso seco e redução da área
foliar estão associadas a suplementos inadequados de fósforo para as plantas (ERICSSON &
INGESTAD, 1988).
Varias estratégias de adaptação à deficiência de fósforo no solo têm sido
desenvolvidas pelas plantas, envolvendo diversos mecanismos de absorção, uso e
remobilização de fosfato (VANCE et al., 2003; HAMMOND et al., 2004; LAMBERS et al.,
2006).
ZONTA et al. (2006), enfocaram o tamanho do sistema radicular, principalmente o
comprimento e a superfície total das raízes, como fatores diretamente relacionados com a
eficiência na aquisição de nutrientes pelas plantas. Segundo LYNCH (1995) a presença de
fósforo inorgânico induz o crescimento das raízes superficiais para sua absorção e o
crescimento das raízes capilares aumenta na ausência de altas concentrações de fósforo no
solo, como consequência da necessidade da planta em adquirir mais nutrientes em condições
adversas (GAHOONIA e NIELSEN, 1998).
No que se refere à variabilidade genotípica da resposta à eficiência nutricional de
plantas superiores, MARSCHNER (1995) destacou que as diferenças genotípicas estão
relacionadas com a absorção, transporte e utilização dos nutrientes no interior das plantas, os
quais são processos afetados por fatores morfológicos, fisiológicos e pela demanda
nutricional.
Nos estudos realizados para avaliação de cultivares de feijão em condições de campo,
tem-se verificado que existem materiais mais eficientes quanto à absorção e aproveitamento
do fósforo. Estes estudos permitem classificar os cultivares em: eficientes e responsivos;
eficientes e não-responsivos; não-eficientes e responsivos; não-eficientes e não-responsivos
(FAGERIA, 1998). MELISSA et. al (2005) afirmaram que a adaptação das plantas está na
habilidade das mesmas em adquirir recursos no solo sem afetar sua produtividade. Plantas que
não são eficientes precisam de mais fertilizantes, aplicados com maior custo para o produtor e
maior agressão ao ambiente, sobretudo em virtude dos desequilíbrios químicos e da
acidificação das águas.
Como a absorção, transporte e redistribuição de nutrientes são controlados
geneticamente, existe a possibilidade de melhorar ou selecionar cultivares mais eficientes
quanto ao uso dos nutrientes (GABELMAN e GERLOFF, 1982). BEEBE et al. (1995) e
SINGH et al. (2003) verificaram em avaliações realizadas em solos com baixo teor de fósforo,
18
germoplasma tolerante a esta deficiência, abrindo oportunidades para o desenvolvimento e
seleção de novas variedades.
Segundo PARENTONI et al., (2011) a seleção precoce para a eficiência no uso do P
pelas plantas pode ser realizada no programa de melhoramento genético. Para tanto,
normalmente, são utilizados experimentos com restrição na disponibilidade de P no substrato.
Neste caso, as plantas são avaliadas na fase vegetativa, quanto às características relacionadas
ao desenvolvimento, como o acúmulo de massa seca e conteúdo de P, tanto na parte aérea
como nas raízes. Tem sido observada baixa correlação entre dados obtidos por métodos de
seleção precoce relacionados com desempenho das plantas avaliadas em condições de campo,
portanto apesar de onerosa, os autores afirmam a importância de se conduzir os experimentos
até a fase de produção para a classificação e seleção de materiais superiores quanto à
eficiência na absorção e uso do P.
Assim, os objetivos desse trabalho foram avaliar as respostas morfo-fisiológicas de 20
genótipos de feijoeiro quanto à absorção de P em condição de estresse em diferentes
concentrações do elemento, selecionar a dose ideal para a indução de deficiência nutricional e
classificar os genótipos quanto à eficiência de utilização do elemento, visando à seleção de
genótipos superiores e apoio ao Programa de Melhoramento de Feijão do Instituto
Agronômico (IAC).
2. Material e Métodos
19
Tabela 1. Genótipos utilizados no estudo quanto à eficiência de absorção e uso do fósforo.
Genótipos Ciclo Hábito de Crescimento Tegumento
1. IAC ALVORADA 92 dias Semi-Ereto (tipo III) Carioca
2. IAC CARIOCA TYBATÃ 86 dias Semi-Ereto (tipo III) Carioca
3. IAC DIPLOMATA 92 dias Ereto (tipo II) Carioca
4. IAC FORMOSO 85 dias Semi-Ereto (tipo II) Carioca
5. IAC IMPERADOR 75 dias Semi-Ereto (tipoI) Carioca
6. IPR UIRAPURU 86 dias Ereto (tipo II) Preto
7. BAT 477 77 dias Ereto (tipo I) Creme
8. SEA 5 75 dias Ereto (tipo I) Creme
9. CARIOCA COMUM 92 dias Semi-Ereto (tipo II) Carioca
10. IAPAR 81 92 dias Ereto (tipo II) Carioca
11. BRS PONTAL 85-95 dias Prostrado (tipo III) Carioca
12. BRS ESTILO 85-90 Ereto (tipo II) Carioca
13. PÉROLA 90-100 dias Semi-Ereto (tipo III) Carioca
14. IPR TANGARÁ 87 dias Ereto (tipo II) Carioca
15. DIAMANTE NEGRO 92 dias Ereto (tipo II) Preto
16. JALO PRECOCE 72 dias Ereto (tipo I) Amarelo
17. G4000 83 dias Semi-Ereto (tipo II) Marrom
18. DOR 364 75-85 dias Semi-Ereto (tipo II) Vermelho
19. G2333 95 dias Prostrado (tipo IV) Vermelho
20. BRS ESPLENDOR 85-90 dias Ereto (tipo II) Preto
20
Foram realizadas duas avaliações nas folhas mais velhas quanto ao índice relativo de
clorofila (IRC), utilizando-se o método não destrutivo (SPAD-502Plus – Konica Minolta). A
primeira avaliação foi realizada aos 28 dias após o transplantio (DAT), quando foram
observados os primeiros sintomas visuais de deficiência nas plantas da parcela que recebeu a
menor dose de P e, aos 43 dias, quando apresentavam sintomas severos de deficiência, como a
clorose acentuada, abscisão prematura de folhas, manchas escuras no limbo foliar e menor
desenvolvimento da planta.
Aos 54 DAT, foi atingido o estádio de pré-florescimento, sendo realizadas as coletas
de plantas para a avaliação dos seguintes caracteres biométricos: altura de planta (AP);
número de nós por planta (NNP); área foliar (AF); massa fresca de folhas (MFF), ramos
(MFRM) e raiz (MFR); massa seca de folhas (MSF), ramos (MSRM) e raízes (MSR).
Inicialmente, foi realizada a determinação da área foliar total (cm2) utilizando-se um
integrador de área - Modelo LI-3100C – LI-COR. Essas mesmas plantas foram utilizadas para
avaliação das massas totais fresca e seca, sendo separadas em folha e caule e pesadas em
balança de precisão. Para obtenção da massa seca, as amostras da massa fresca foram secas
em estufa de circulação forçada de ar com temperatura de 60 °C. Com relação às raízes, foram
avaliados os caracteres: comprimento total (CR) em cm; a área superficial (AS) em cm2; o
volume total (VR) em cm3 e o diâmetro médio (DR) em mm. As imagens das raízes de cada
planta foram obtidas em scanner LA2400 (EPSON) e as características de raiz foram
calculadas por meio da utilização do software WinRHIZO® (Regent Instruments Inc.,
Quebec, Canada).
Os caracteres avaliados para produtividade foram: número de vagens por planta (NVP);
número de sementes por planta (NSP); número de sementes por vagem (NSV); massa de cem
sementes em gramas (MCS) e produtividade de grãos em g planta-1 (PG).
Para determinar os teores de nutrientes nas folhas, amostras de 1,0 g de tecido foliar,
secas e moídas, foram submetidas à digestão nítricoperclórica para extração de P, K, Ca, Mg e
S. Nos extratos, os teores desses nutrientes foram determinados por espectrofotometria de
absorção atômica. Para determinação do N total, amostras de 0,2 g do tecido foliar foram
submetidas à digestão sulfúrica e o N total foi determinado por destilação (MALAVOLTA et
al., 1989).
Os resultados foram submetidos à análise de variância ANOVA e teste F em
delineamento de parcelas subdivididas. Para quantificação dos efeitos dos tratamentos
compararam-se as médias pelo teste Scott-Knot a 5% de probabilidade.
21
A Classificação dos genótipos para a eficiência de uso do P foi realizada através da
metodologia de PARENTONI et al (2011), por meio de plotagem dos valores em um gráfico
em que, a produtividade das parcelas em estresse é representada no eixo das abscissas (x) e, a
produtividade no ambiente sem estresse, no eixo das ordenadas (y), sendo permitida a
identificação dos genótipos nas categorias ER, ENR, IR e INR (Eficientes e responsivas,
eficientes e não responsivas, ineficientes e responsivas, ineficientes e não responsivas) pelas
duas retas que se cruzam nas médias dos ambientes.
Foi estimado um índice de seleção (IS) para auxiliar a seleção dos genótipos mais
eficientes, segundo a metodologia de PARENTONI et al. (2001), que considera as
produtividades nos dois níveis de disponibilidade de P. Nesse índice, é utilizado um
ponderador que possibilita a seleção de genótipos com tendência a serem mais eficientes no
uso do P que responsivos, sendo:
IS = [(YiE x YiS) / (ME x MS)] x (YiE / ME)
Em que:
YiE : produtividade media do genótipo i no ambiente com estresse;
YiS : produtividade média do genótipo i no ambiente sem estresse;
ME: média geral de produtividade no ambiente com estresse;
MS : média geral de produtividade no ambiente sem estresse.
3. Resultados e Discussões
22
Figura 1. Plantas do cultivar IAC Alvorada submetidas às diferentes doses de fósforo (0,05;
2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1 de P) amostradas nas parcelas PA, PB, PC e PD.
23
44,3 a 18,1 unidades SPAD, possibilitando separar os genótipos em quatro classes distintas de
acordo com o IRC; os cultivares SEA 5, G 2333, IAC Imperador, IPR 81 e IPR Tangará
apresentaram as maiores médias para índice relativo de clorofila, enquanto que, os cultivares
Pérola, BAT 477, BRS Estilo e DOR 364 os menores IRC’s (Tabela 3). ZAFAR et al.
(2011), em estudo sobre a eficiência do uso de P pela cultura do milho obtiveram relações
positivas (r2 = 0.88) entre índice relativo de clorofila nas folhas e absorção de P pela planta, o
índice relativo de clorofila foi significativamente elevado com o aumento da dose de fósforo
fornecida, sendo que, o aumento de clorofila nos tratamentos variou de 41 a 118% comparado
ao controle.
Tabela 3. Médias referentes ao índice relativo de clorofila avaliado nas folhas cotiledonares e
no primeiro trifólio aos 28 e 43 DAT em 20 genótipos de feijoeiro cultivados em hidroponia e
submetidas às diferentes doses de fósforo (0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1 de P).
28 dias 43 dias
Genótipo PA PB PC PD PA PB PC PD
1- IAC Alvorada 30,87 b 42,03 c 41,92 b 43,52 c 35,73 b 44,02 a 42,82 b 43,28 b
2- IAC Carioca Tybatã 40,00 a 41,00 c 47,02 a 44,70 c 25,72 c 45,07 a 47,42 a 45,65 a
3- IAC Diplomata 25,93 b 39,05 d 43,57 b 45,58 b 25,95 c 44,42 a 47,03 a 46,92 a
4- IAC Formoso 35,07 a 39,07 d 39,40 b 43,42 c 31,07 b 44,92 a 41,15 b 41,90 b
5- IAC Imperador 44,63 a 50,05 a 48,77 a 51,88 a 41,78 a 47,98 a 45,53 a 43,22 b
6- Uirapuru 35,43 a 41,38 c 44,53 b 45,38 b 32,72 b 45,12 a 46,60 a 47,07 a
7- Bat 477 29,67 b 37,93 d 42,52 b 43,82 c 19,13 d 44,40 a 40,05 b 41,75 b
8- Sea 5 30,55 b 43,33 c 45,60 a 49,43 a 44,43 a 47,73 a 47,22 a 45,30 a
9- Carioca Comum 37,23 a 41,53 c 46,92 a 47,08 b 33,52 b 48,98 a 46,32 a 46,92 a
10- IAPAR 81 38,55 a 43,08 c 46,22 a 47,03 b 37,62 a 45,82 a 46,80 a 43,23 b
11- BRS Pontal 35,52 a 42,68 c 48,62 a 47,80 a 32,10 b 49,72 a 48,07 a 47,97 a
12- BRS Estilo 32,48 b 38,33 d 42,15 b 45,33 b 22,33 d 36,57 b 42,22 b 40,43 b
13- Pérola 34,23 b 47,35 b 46,97 a 50,97 a 18,82 d 39,48 b 46,77 a 45,73 a
14- IPR Tangará 36,73 a 43,22 c 47,93 a 46,85 b 40,40 a 51,50 a 48,38 a 47,17 a
15- Diamante Negro 37,03 a 42,28 c 44,55 b 45,43 b 33,17 b 41,48 b 45,23 a 45,75 a
16- Jalo Precoce 30,47 b 35,82 d 40,77 b 42,85 c 28,90 c 42,20 b 39,50 b 39,40 b
17- G 4000 33,40 b 46,58 b 49,32 a 50,83 a 30,53 b 47,57 a 46,12 a 45,70 a
18- DOR 364 32,63 b 43,13 c 46,78 a 45,48 b 25,07 c 38,90 b 40,33 b 40,55 b
19- G 2333 38,63 a 40,90 c 42,77 b 43,10 c 43,53 a 50,28 a 45,08 a 46,00 a
20- BRS Esplendor 38,25 a 44,37 b 46,53 a 46,10 b 32,60 b 46,45 a 40,95 b 42,27 b
Médias das Parcelas 34,87 D 42,16 C 45,14 B 46,33 A 31,76 B 45,13 A 44,68 A 44,31 A
Letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste Scott- Knot a 5% de probabilidade para cultivares e letras
maiúsculas diferentes na linha diferem entre si pelo teste Scott-knot a 5% de probabilidade.
24
reduzindo assim o potencial de fotodano, em condições em que a energia da luz absorvida não
pode ser usada para o crescimento.
Além da abscisão prematura, foi observada a presença de manchas escuras no limbo
foliar (Figura 2). O desenvolvimento de folhagem verde escura está entre os primeiros
sintomas de deficiência de P, acrescidos do desenvolvimento de pigmentos nas folhas com
coloração vermelha, roxa ou marrom, principalmente ao longo das nervuras. Isto é uma
consequência de produção de antocianina, que é induzida pela acumulação crescente de
sacarose nas folhas, a fim de proteger os ácidos nucleicos contra a incidência de luz UV e
limitação da fotossíntese (WHITE & HAMMOND, 2008).
25
Tabela 4. Resumo da análise de variância dos componentes de parte aérea em 20 genótipos
de feijoeiro cultivados em hidroponia e submetidas às diferentes doses de fósforo (0,05; 2,00;
4,00 e 8,00 mg L-1 de P).
Quadrado Médio
FV GL 1 2 3
AP NNP AF MFF4 MSF5 MFRM6 MSRM7
Doses P 3 1,5 e+5** 394,6** 3,3e+8** 1,1e+5** 1469,10** 63378,47** 751,53**
Erro (a) 6 436,27 2,78 89194,23 59,57 1,37 18,99 0.81
Erro (b) 154 493,29 1,95 229892,51 110,03 2,59 146,36 2,27
Total 239
CV (a) % 21,92 15,26 10,4 14,3 16,27 10.28 17,42
26
Alvorada, Diamante negro e IPR Tangará se destacaram por apresentar maior área foliar,
enquanto, os cultivares G 2333, DOR 364 e BRS Esplendor tiveram as menores médias para
esta característica. Na parcela PA, na condição de maior estresse de P, os genótipos com
maior área foliar foram IPR Tangará, IAC Alvorada e Jalo precoce e os cultivares DOR 364,
BAT 477 e Pérola as menores (Tabela 5).
PA PB
PC PD
27
suprimento de P e utilização de vias respiratórias alternativas. A maior eficiência é atribuída
principalmente à eficiente retranslocação e reutilização do P armazenado nas plantas
(CAVATTE et al., 2011).
Genótipo PA PB PC PD
1- IAC Alvorada 403,00 a 1971,33 a 4884,00 a 6476,33 a
2- IAC Carioca Tybatã 266,33 b 1390,67 b 4151,33 b 6726,67 a
3- IAC Diplomata 237,50 b 1150,33 b 3365,00 b 5460,00 b
4- IAC Formoso 318,33 a 2322,50 a 3465,67 b 4335,50 d
5- IAC Imperador 323,00 a 1711,00 a 3642,67 b 6128,67 a
6- IPR Uirapuru 335,00 a 1645,33 a 3692,00 b 4777,00 c
7- Bat 477 227,00 b 1768,67 a 5378,33 a 6854,33 a
8- Sea 5 312,67 a 1688,33 a 3616,67 b 5447,00 b
9- Carioca Comum 277,67 b 1859,67 a 5245,67 a 6632,00 a
10- IAPAR 81 376,00 a 2302,33 a 4471,67 a 5350,33 b
11- BRS Pontal 303,67 b 1716,00 a 4153,33 b 5097,33 c
12- BRS Estilo 240,00 b 1444,00 b 4037,00 b 5761,67 b
13- Pérola 230,67 b 1122,67 b 3459,33 b 5531,33 b
14- IPR Tangará 436,67 a 1788,67 a 4645,00 a 5727,33 b
15- Diamante Negro 260,67 b 2134,67 a 5156,00 a 5551,67 b
16- Jalo Precoce 387,33 a 1879,00 a 3718,33 b 5729,67 b
17- G 4000 261,00 b 1356,67 b 4654,33 a 5297,67 b
18- DOR 364 223,33 b 1346,00 b 3876,00 b 3607,00 d
19- G 2333 303,00 b 979,00 b 2386,00 b 4341,67 d
20- BRS Esplendor 242,67 b 1257,33 b 2874,33 b 5181,00 c
Médias das Parcelas 298,28 D 1656,43 C 4043,63 B 5514,36 A
Letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste Scott- Knot a 5% de probabilidade para cultivares e letras
maiúsculas diferentes na linha diferem entre si pelo teste Scott-knot a 5% de probabilidade,
Tabela 6. Níveis dos macronutrientes no tecido foliar (g kg-1) submetidos às diferentes doses
de fósforo nas parcelas PA, PB, PC e PD, respectivamente, 0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1 de P.
Tratamento N P K Ca Mg S
g kg-1
Adequado* 30-50 2,5-4,0 20-24 10-25 2,5-5,0 2-3
PA 41,82 1,01 31,20 15,19 2,58 2,19
PB 40,75 1,26 37,06 21,15 2,71 2,02
PC 43,12 1,74 38,25 27,86 3,31 1,76
PD 47,38 3,58 33,62 34,21 3,89 1,65
*Faixas de teores considerados adequados para os macronutrientes em folhas de feijoeiro amostradas no florescimento, nas
terceira folhas como pecíolo, tomadas no terço médio de 30 plantas (AMBROSANO, 1997).
Com relação ao desenvolvimento das raízes, foi observado que a redução nas doses de
fósforo resultou em maior desenvolvimento, no entanto, na menor dose, o desenvolvimento
das raízes é comprometido uma vez que o elemento é essencial para fornecer energia para a
planta. A parcela PC, que recebeu metade da maior dose de P, foi a que proporcionou maior e
29
melhor desenvolvimento das raízes, aumentando em 80% a produção de massa seca (Tabela
8).
O tamanho do sistema radicular é considerado uma característica importante em
plantas tolerantes à deficiência de P. No entanto, a deficiência severa de P além de limitar o
crescimento total da planta, limita também o crescimento da raiz. Para manter as taxas de
crescimento radicular satisfatórias, apesar da deficiência de P, é de extrema importância a
capacidade do desenvolvimento de um sistema radicular com grandes dimensões.
Alternativamente, a tolerância ao estresse pode ser conseguida por um aumento na eficiência
de absorção de P externo, definido pela absorção de P por unidade de comprimento de raiz
(área de superfície de raiz) (WISSUWA, 2003).
Nas avaliações do sistema radicular os genótipos que se destacaram pelo maior
desenvolvimento de raiz foram SEA-5, BAT 477, IAC Alvorada, IAPAR 81, IPR Tangará e
Diamante Negro, enquanto, os genótipos DOR 364, Pérola, IAC-Formoso e Jalo precoce
apresentaram os menores valores (Tabela 8).
30
Tabela 8. Desempenho de 20 genótipos de feijoeiro cultivados em hidroponia e submetidos às diferentes doses de fósforo nas parcelas PA, PB, PC
e PD, respectivamente, 0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1 de P quanto ao Comprimento total de raiz (cm) e Área superficial de raiz (cm²).
Tabela 10. Relação Raiz x Parte aérea em relação à massa seca de 20 genótipos de feijoeiro
cultivados em hidroponia e submetidos às diferentes doses de fósforo nas parcelas PA, PB, PC
e PD, respectivamente, 0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1.
Genótipo PA PB PC PD
1- IAC Alvorada 0,306 0,271 0,210 0,103
2- IAC Carioca Tybatã 0,331 0,359 0,227 0,064
3- IAC Diplomata 0,236 0,329 0,184 0,105
4- IAC Formoso 0,289 0,270 0,183 0,099
5- IAC Imperador 0,297 0,220 0,174 0,079
6- IPR Uirapuru 0,307 0,296 0,289 0,097
7- Bat 477 0,340 0,339 0,286 0,098
8- Sea 5 0,369 0,356 0,281 0,113
9- Carioca Comum 0,282 0,212 0,182 0,106
10- IAPAR 81 0,288 0,342 0,332 0,103
11- BRS Pontal 0,270 0,184 0,200 0,085
12- BRS Estilo 0,311 0,268 0,218 0,119
13- Pérola 0,205 0,190 0,179 0,099
14- IPR Tangará 0,457 0,337 0,156 0,112
15- Diamante Negro 0,297 0,336 0,215 0,104
16- Jalo Precoce 0,257 0,183 0,156 0,086
17- G 4000 0,431 0,349 0,222 0,081
18- DOR 364 0,291 0,178 0,204 0,100
19- G 2333 0,131 0,124 0,117 0,088
20- BRS Esplendor 0,310 0,314 0,361 0,102
Média das Parcelas 0,300 0,273 0,219 0,097
Uma resposta comum das plantas para deficiência de P é aumentar a sua raiz em
relação à parte aérea. Uma parte dessa aparente mudança de massa de matéria seca da parte
aérea para formação de raiz é alométrica, ou seja, relações de formação de parte aérea
normalmente diminuem com o crescimento de raízes, uma vez que, plantas supridas com
baixo P crescem mais lentamente, para que sua raiz possa atingir índices maiores. Alguns
genótipos apresentam um maior coeficiente de alometria em baixas concentrações de P. Baixa
disponibilidade de P reduz o aparecimento de folhas, expansão foliar e ramificação (LYNCH
& BROWN, 2008).
As análises de variância referentes aos componentes de produção apresentaram
diferenças significativas (P>0,01) de probabilidade pelo teste F para todas as características
avaliadas para doses de P e genótipos e, para a interação doses de P e genótipos (P x G)
apenas a característica produtividade de grãos não apresentou efeito significativo (Tabela 11),
demonstrando a estabilidade produtiva dos genótipos avaliados.
33
(respectivamente 26,08; 25,08; 24.58 e 24,25 vagens por planta), ao passo que, os genótipos
IPR Tangará, SEA 5, DOR 364 e Jalo precoce tiveram os mais baixos valores para a
característica (em média 15,83; 12,91; 12,0 e 10,83 vagens por planta).
Na avaliação de números de sementes por planta, os cultivares Carioca Comum,
IAPAR 81, IAC Imperador, e IAC Carioca Tybatã apresentaram melhor desempenho, com
médias de respectivamente 118,58; 116,66; 105,5 e 105,79 sementes por planta comparados
aos genótipos IAC Alvorada, SEA 5, DOR 364 e Jalo Precoce, com menor desempenho
médio, sendo respectivamente de 77,58; 71,41; 66,16 e 42,5 sementes por planta.
Para número de sementes por vagem os genótipos SEA 5, BRS Esplendor, BRS Pontal
e IAC Formoso apresentaram médias de 5,31; 5,24; 5,16; e 5,00 sementes por vagem e os
genótipos G4000, BAT 477, Jalo Precoce e Pérola com menores médias de respectivamente
4,10; 3,96; 3,81 e 3,71 sementes por vagem.
Os cultivar Jalo Precoce foi o genótipo que apresentou maior massa de cem sementes
(38,8g), seguido pelos cultivares Pérola (29,05g), IAC Alvorada (28,81) e IAC Carioca
Tybatã (28,69g), já os genótipos que apresentaram médias menores foram BRS Esplendor
(21,23g), BAT 477 (19,72), G4000 (19,00g) e IAC Diplomata (18,79). As diferentes doses de
fósforo influenciaram significativamente para a redução da massa das sementes com a
redução nas doses, no entanto a diferença entre genótipos deve-se principalmente às
diferenças morfológicas existentes entre os genótipos.
Em relação à produtividade de grãos, destacaram-se como os mais produtivos os
genótipos IAPAR 81, IAC Carioca Tybatã, Carioca comum e IAC Imperador, com médias de
respectivamente 31,06; 29,05; 28,99 e 27,76 gramas por planta e, os genótipos menos
produtivos foram DOR 364, Jalo Precoce e IAC Diplomata, com médias produtivas de
respectivamente 17,02; 17,22 e 17,65 gramas por planta (Tabela 13).
34
Tabela 13. Produtividade média por planta (g) dos 20 genótipos de feijoeiro cultivados em
hidroponia e submetidos às diferentes doses de fósforo nas parcelas PA, PB, PC e PD,
respectivamente, 0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1.
Genótipo PA PB PC PD Média
1- IAC Alvorada 4,475 a 8,930 a 27,435 a 53,794 a 23,659 b
2- IAC Carioca Tybatã 4,097 a 17,804 a 34,214 a 60,113 a 29,057 a
3- IAC Diplomata 2,327 c 10,009 a 19,472 a 42,950 b 18,690 b
4- IAC Formoso 3,043 b 16,075 a 29,067 a 42,600 b 22,696 b
5- IAC Imperador 3,170 b 11,520 a 37,929 a 53,899 a 26,630 a
6- IPR Uirapuru 3,761 a 15,189 a 28,514 a 48,903 a 24,092 b
7- Bat 477 1,319 c 11,597 a 22,359 a 41,752 b 19,257 b
8- Sea 5 3,111 b 14,086 a 28,603 a 43,899 b 22,425 b
9- Carioca Comum 2,725 b 16,509 a 35,495 a 63,677 a 29,602 a
10- IAPAR 81 4,620 a 12,049 a 41,120 a 62,012 a 29,950 a
11- BRS Pontal 2,764 b 13,227 a 25,839 a 49,528 a 22,839 b
12- BRS Estilo 2,888 b 13,461 a 28,343 a 43,634 b 22,082 b
13- Pérola 1,826 c 12,349 a 24,617 a 53,642 a 23,108 b
14- IPR Tangará 5,115 a 15,226 a 32,643 a 42,210 b 23,799 b
15- Diamante Negro 3,992 a 9,690 a 31,028 a 45,920 b 22,657 b
16- Jalo Precoce 3,591 a 11,909 a 25,676 a 29,926 b 17,775 b
17- G 4000 3,603 a 7,559 a 25,948 a 36,589 b 18,425 b
18- DOR 364 1,897 c 14,053 a 21,172 a 37,474 b 18,649 b
19- G 2333 3,117 b 9,862 a 29,271 a 54,005 a 24,064 b
20- BRS Esplendor 3,688 a 5,858 a 30,268 a 42,268 b 20,520 a
Média das Parcelas 3,257 A 12,348 B 28,951 C 47,440 D 22,999
Letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste Scott-Knot a 5% de probabilidade para cultivares e letras
maiúsculas diferentes na linha diferem entre si pelo teste Scott-Knot a 5% de probabilidade.
35
Em relação ao teor de P contido nas folhas, não verificou-se correlação significativa
com nenhuma característica do sistema radicular, mas foi possível verificar correlação
significativa entre o número de vagens por planta, número de sementes e a produtividade,
sendo as correlações de respectivamente 65,2; 55,0 e 46,8% (Tabela 14).
ZILIO et al (2011) também relata em estudo de correlação dos componentes de
produção que obteve resposta diferenciada dos 26 genótipos nos ambientes testados para
todos os caracteres avaliados, com exceção da massa de 100 grãos, A seleção indireta para
massa de 100 grãos para elevado rendimento de grãos não é uma boa estratégia para o
progresso genético, devido aos efeitos indiretos negativos, Mas, a seleção para número de
vagens por planta, número de grãos por vagem e número de lóculos por legume podem
contribuir efetivamente para incrementar o rendimento de grãos.
36
Tabela 14. Correlação de Pearson dos caracteres agronômicos nos 20 genótipos de feijoeiro cultivados em hidroponia e submetidos às diferentes
doses de fósforo nas parcelas PA, PB, PC e PD, respectivamente, 0,05; 2,00; 4,00 e 8,00 mg L-1.
IRC1 IRC2 ALT NÓS AF MSF MSRM MSR P CR ASR VR DR NV NS NVP MCS PROD
IRC1 - 0,724** 0,538** 0,635** 0,718** 0,722** 0,708** 0,529** 0,595** 0,598** 0,609** 0,595** 0,051 0,764** 0,749** 0,36** 0,447** 0,705**
IRC2 - 0,566** 0,611** 0,526** 0,596** 0,609** 0,572** 0,287** 0,654** 0,667** 0,650** 0,130 0,606** 0,565** 0,302** -0,563** 0,513**
ALT - 0,810** 0,619** 0,708** 0,759** 0,483** 0,508** 0,578** 0,558** 0,508** -0,074 0,668** 0,626** 0,181 -0,261* 0,624**
NÓS - 0,692** 0,735** 0,743** 0,5647** 0,405** 0,661** 0,650** 0,606** -0,0687 0,688** 0,648** 0,247* 0,345** 0,636**
AF - 0,948** 0,867** 0,522** 0,774** 0,585** 0,586** 0,564** -0,0002 0,887** 0,914** 0,499** -0,222* 0,927**
MSF - 0,926** 0,562** 0,693** 0,616** 0,618** 0,591** -0,005 0,885** 0,907** 0,479** -0,256* 0,923**
MSRM - 0,639** 0,519** 0,673** 0,703** 0,703** 0,113 0,826** 0,827** 0,398** -0,233 0,856**
MSR - 0,091 0,926** 0,952** 0,936** 0,116 0,560** 0,469** 0,056 -0,447 0,395**
MCS - -0,186
Produtividade (g/planta)
65
9
IR ER
2 10
60
55
13 1 19 5
11
50
6
Alto P
8 15
45
12
3 4 20 14
7
40
18
17
35
INR ENR
16
30
20 25 30 35 40
Baixo P
Figura 9 Desempenho dos 20 genótipos de feijoeiro quanto à eficiência no uso do fósforo,
classificados em quatro categorias: IR, Ineficientes e responsivos; INR, Ineficientes e não
responsivos; ER, Eficientes e responsivos; ENR, Eficientes e não responsivos, O eixo das
abscissas está representado pelos valores de produtividade em estresse de P e, o eixo das
ordenadas, pelos valores de produtividade em condições ideais de P, parcelas P C e PD
respectivamente.
N° Genótipos PC PD IS
1 IAC Alvorada 27,44 53,79 1,02
2 IAC Carioca Tybatã 34,21 60,11 1,77
3 IAC Diplomata 19,47 42,95 0,41
4 IAC Formoso 29,07 42,60 0,91
5 IAC Imperador 37,93 53,90 1,95
6 Uirapuru 28,51 48,90 1,00
7 BAT 477 22,36 41,75 0,52
8 SEA 5 28,60 43,90 0,90
9 Carioca Comum 35,50 63,68 2,02
10 IAPAR 81 41,12 62,01 2,64
11 BRS Pontal 25,84 49,53 0,83
12 BRS Estilo 28,34 43,63 0,88
13 Pérola 24,62 53,64 0,82
14 IPR Tangará 32,64 42,21 1,13
15 Diamante Negro 31,03 45,92 1,11
16 Jalo Precoce 25,68 29,93 0,50
17 G 4000 25,95 36,59 0,62
18 DOR 364 21,17 37,47 0,42
19 G 2333 29,27 54,01 1,16
20 BRS Esplendor 30,27 42,27 0,97
Médias 28,95 47,43 1,07
39
4. Conclusões
5. Referências bibliográficas
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Sementes, v. 28 n.1, p.9-15.
43
Capítulo 2
Avaliação da resposta de genótipos de feijoeiro à deficiência de P em
sistema hidropônico.
RESUMO
44
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is widely grown in weathered soils with low
phosphorus (P) availability, which is one of the main limitations of the production. The
objectives of this study were to evaluate 42 genotypes for number of whorl, basal roots and
also for phosphorus use efficiency to validate a routine genotypes classification
methodology to be used at IAC bean breeding program and, to assess the variability
between genotypes, identifying the traits with greatest effects, as well to assess most
significant correlations. The genotype were evaluated for number of whorls, basal roots
and for P use efficiency. The experiment design was a split plot with application of two
concentrations of P, (4,00; 8.00 mg L-1) as plot, 42 genotypes as subplot and three
replications. The Canonical variables and Pearson correlation were performed using the
stressed plot. The variance analysis revealed a significant effect for genotypes for both root
traits number of whorls and basal roots, with a high correlation (R² = 96.66). Foliar
analysis of the 42 genotypes confirmed the treatments effectiveness, and the average
content of P in the leaves of plants in the stressed and control plots were 2.20 and 3.50 g
kg-1respectively. For Grain yield, the stressed and control plots mean were 10.55 and 9.79
g plant-¹, respectively. The genotypes G2333, Pérola, IAC-Carioca Taurino, Santa Rosa e
PI-310724 stood out for the best performance, greater than 15g per plant, while the
genotypes that presented higher root length were Preto s.3888, the positive control G 2333,
Pintado Rajado e Cal-143. The traits which showed higher relative importance in the
canonical variables were grain yield, number of pods, root surface area, root volume and
number of whorls. With Pearson correlation, we found significant correlation between the
root traits, total length, superficial area and volume with the yield components.
45
1. Introdução
46
O sistema radicular do feijoeiro é típico de uma planta dicotiledônea anual,
constituído por uma raiz primária e de raízes basais e adventícias (BASU et al., 2007). A
raiz primária do feijoeiro tem gravitropismo positivo e cresce normalmente em linha reta
descendente (LYNCH & BROWN, 2001). O feijoeiro pode apresentar de um a quatro
verticilos, que são anéis localizados na interface raiz-caule, de onde surgem as raízes
basais (VIEIRA et al., 2008). Cada verticilo pode apresentar de duas a quatro raízes basais
(BASU et al., 2007). Em conjunto com as raízes laterais que surgem delas, constituem a
maior parte do comprimento total de raízes da planta (BASU et al., 2007).
A identificação de caracteres de raiz importantes na aquisição de P permite que os
melhoristas que trabalham com a cultura do feijoeiro possam desenvolver novas cultivares,
com melhor rendimento em condições de baixa fertilidade de solo (ROSADO, 2012). Em
geral, a profundidade do sistema radicular determina a eficiência de exploração dos
recursos superficiais, como o P e recursos profundos, como a água. As raízes laterais
formam geralmente a maior parte da biomassa do sistema radicular. Em solos com baixa
disponibilidade de nutrientes, é vantajoso para a planta desenvolver um sistema radicular
com raízes laterais, pois grande volume de solo poderia ser explorado com baixo custo
metabólico até que os nutrientes fossem alcançados (LIMA, 2010).
Os objetivos desse trabalho foram avaliar 42 genótipos do banco ativo de
germoplasma do Instituto Agronômico - IAC, quanto às características número de
verticilos, número de raízes basais e à eficiência do uso do fósforo a fim de validar o
método de rotina para classificação de genótipos quanto à eficiência de uso do nutriente.
2. Material e Métodos
47
Quadro 1. Genótipos de feijoero utilizados para as caracterizações quanto ao número de
verticilos e de raízes basais e quanto a eficiência ao uso do P.
Código Acesso Genótipo Cor do Tegumento Origem
1 33 Jalo Amarelo IAC
48
Caracterização do sistema radicular quanto ao número de verticilos e raízes basais
49
foram transferidas para vasos individuais de 3,5 L de capacidade, preenchidos com areia de
filtro, sendo cultivadas em sistema hidropônico.
As soluções nutritivas utilizadas foram preparadas com água deionizada, sendo
composta por 143,0 mg L-1 de N; 132,5 mg L-1 de K; 121,0 mg L-1 de Ca; 25,5 mg L-1 de
Mg; 33,0 mg L-1 de S; 1,81 mg L-1 de Fe; 0,45 mg L-1 de Cu; 0,18 mg L-1 de Zn; 0,45 mg
L-1 de Mn; 0.45 mg L-1 de B; 0,09 mg L-1 de Mo e 0,09 mg L-1 de Ni. Os tratamentos com
P aplicados nas parcelas PA (estressada) e PB (controle) constaram de: 4,00 e 8,00 mg L-1 de
P. A doses utilizadas foram definidas no experimento anterior (capítulo 1).
Na primeira quinzena, após instalação do experimento, as plantas foram irrigadas
com solução nutritiva meia força, ou seja, metade da concentração total a ser utilizada.
Foram aferidos diariamente na solução nutritiva, a condutividade elétrica, mantida entre
1,8 a 2,0 mS cm-1 e o pH mantido próximo a 5,8.
Aos 45 dias após a transferência das plântulas, foi atingido o estádio de pleno
florescimento, sendo realizadas as coletas de folhas do terço mediano da planta para a
determinação dos teores de nutrientes nas folhas. Amostras de 1,0 g de tecido foliar, secas
e moídas, foram submetidas à digestão nítricoperclórica para extração de P, K, Ca, Mg e S.
Nos extratos, os teores desses nutrientes foram determinados por espectrofotometria de
absorção atômica. Para determinação do N total, amostras de 0,2 g do tecido foliar foram
submetidas à digestão sulfúrica e o N total foi determinado por destilação pelo método
Kjeldahl e o P por espectrofotometria UV-VIS (MALAVOLTA et al., 1996).
Com relação às raízes, foram avaliados a massa seca de raiz (g), o diâmetro (mm), o
volume (cm3), o comprimento total (m) e a área superficial, utilizando-se o software
WinRHIZO®.
Os caracteres avaliados para produtividade foram: número de vagens por planta
(NVP); número de sementes por vagem (NSV); massa de cem sementes em gramas (MCS)
e produtividade de grãos em g planta-1 (PG).
Os resultados foram submetidos à análise de variância ANOVA (teste F) pelo
programa R, para delineamento de parcelas subdivididas, adotando o seguinte modelo
matemático:
Yijk = µ + ai + γi +bj + abij + eijK
Em que,
Yijk : Observação
µ : Média;
ai: Fator a,
50
γi: Erro do fator a;
bj : Fator b;
abij: Interação a x b
eijK:Erro experimental
Para quantificação dos efeitos dos tratamentos compararam-se as médias pelo teste
Scott-Knot a 5% de probabilidade.
Análises Multivariadas
3. Resultados e Discussões
51
Tabela 1. Análises de variância das características: número de verticilo e número de raízes
basais, referente à avaliação de 42 acessos pertencentes ao Banco de Germoplasma de
Feijoeiro do IAC.
Número de verticilos Número de raízes basais
Causa da variação G.L. S.Q. Q.M. F S.Q. Q.M. F
Tratamentos 41 269,665 6,577 103,962** 4108,071 100,197 92,344**
Resíduo 588 37,200 0,063 638,000 1,085
Total 629 306,865 4746,071
CVe (%)
11,20 12,19
CVG (%)
29,34 30,07
Herdabilidade (%)
99,04 98,92
**Significativo a 1% de probabilidade
14
12
3
10
8
2
6
4
1
2
0
52
(Diacol Calima) apresentaram a menor média para número de raízes basais, 4,26; 4,26 e
4,20, respectivamente (Tabela 2).
Houve alta correlação positiva entre o número de verticilos e número de raízes
basais, com o coeficiente de regressão igual a 96,66 % (Figura 3), sendo que os genótipos
com maior número de verticilos foram também aqueles que apresentaram maior número de
raízes basais. Para número de verticilos, 10 genótipos se destacaram por apresentar média
igual ou superior a três, assim como, 10 genótipos apresentaram média igual ou superior a
10 raízes basais.
53
28 2,00 g 24 7,53 f
30 2,00 g 3 7,26 f
32 2,00 g 9 7,26 f
33 2,00 g 10 7,26 f
35 2,00 g 17 7,26 f
38 2,00 g 36 7,26 f
42 1,73 g 37 6,00 g
7 1,53 h 38 5,93 g
8 1,53 h 16 5,93 g
5 1,00 i 5 4,26 h
6 1,00 i 6 4,26 h
17 1,00 i 25 4,20 h
54
observaram variação dos caracteres com a disponibilidade de fósforo, demonstrando que
não ocorre plasticidade na característica para os genótipos avaliados. No entanto, os
autores observaram a importância do maior número de verticilos, que resulta no aumento
da aquisição de fósforo em solo de baixa concentração.
Para aferir a eficácia dos tratamentos, foram realizadas análises foliares no estádio
de pleno florescimento dos 42 genótipos. O teor médio de P no tecido foliar nas parcelas
com e sem estresse de P (PA, PB), foi, respectivamente, 2,20 e 3,50 g kg-1. O genótipo
G2333, testemunha considerado eficiente e responsivo ao uso do P, apresentou o menor
teor de P nas folhas nas duas parcelas, podendo ser explicada pela maior translocação do
nutriente para órgãos reprodutivos e pelo efeito de diluição pelo maior desenvolvimento
das plantas, assim como o genótipo DOR 364, testemunha ineficiente e não responsiva,
apresentou a maior concentração de P em ambas as parcelas, podendo também ser
explicada analogamente pela menor translocação do nutriente na planta (Figura 4).
Alto P Baixo P
3.0
4
2.5
2.0
3
g Kg-¹ de P
g Kg-¹ de P
1.5
2
1.0
1
0.5
0.0
0
55
metade da dose do nutriente, foi 62% menor que a parcela que recebeu a dose completa,
PB.
56
Quanto as características PG, NVC, NS, AP, NÓS e DF, houve diferença
significativa para subparcela, demonstrando o efeito dos genótipos, bons coeficientes
genéticos, variando de 27,21 para produtividade de grãos a 0,78 para dias até o
florescimento, e altos coeficientes de herdabilidade, maiores que 69%, o que nos confere
certa segurança na seleção de genótipos com base nessas variáveis.
Para a característica PG ocorreu variação de 24,76 a 3,54 g planta-¹, sendo que as
médias das parcelas PA e PB foram de 10,55 e 9,79 g planta-¹, respectivamente, que não
diferiram entre si estatisticamente. Os genótipos 41 (G 2333), 33 (Pérola), 35 (IAC-
Carioca Taurino), 19 (Santa Rosa) e 20 (PI-310724) se destacaram por apresentar os
melhores desempenhos, superiores a 15 g planta-¹, enquanto os genótipos 11 (Rosinha), 24
(EMP 407), 31 (Car s. L476-4), 30 (Car s. L476-2) e 5 (Venezuela 350), apresentaram pior
desempenho, com produtividade inferior a 6,2 g planta-¹.
A característica número de vagens totais (NVT) não apresentou diferença
significativa para dose, genótipo e efeito da interação dose de P x genótipos (P x G), no
entanto, a parcela PB foi numericamente maior, apresentando 17,33 vagens por planta,
comparado com a parcela PA, que apresentou 15,05. Vale ressaltar que, essa característica
foi afetada, principalmente, pela infestação de ácaros, pois era notável a perda de flores e
de vagens na parcela PB.
A característica número de vagens cheias (NVC) também não apresentou diferença
estatística significativa para as doses de P, sendo que as parcelas P B e PA apresentaram
12,03 e 11,59 vagens por planta, respectivamente. A amplitude média da característica na
análise conjunta foi de 22,5 para o melhor genótipo (G2333) até 5,33 para o pior genótipo
(Diacol Calima).
A característica número de sementes por planta (NS) apresentou para as parcelas P B
e PA, médias de 50,61 e 49,26, respectivamente. Na análise conjunta a característica variou
de 111,83 até 16 sementes por planta. Os genótipos 41 (G2333), 33 (Pérola), 16 (Preto
s.3888), 20 (PI 310724) e 35 (IAC-Carioca Taurino) apresentaram médias acima de 77
sementes e, os genótipos 25 (Diacol Calima), 39 (IAC-Boreal), 11 (Rosinha), 18
(Vermelho Graúdo) e 23 (Cal-143) as piores médias, menos de 23 sementes por planta.
As parcelas PA e PB apresentaram médias semelhantes para número de sementes por
vagens, 4,17 e 4,04, respectivamente. O genótipo 40 (IAC-Jabola) apresentou o maior
número médio de sementes por vagens, 5,14 e o genótipo 41 (G2333) o menor valor, 3,18.
As parcelas PA e PB apresentaram médias para a massa de cem sementes de 23,35 e
20,07 g, respectivamente. O resultado alcançado para essa característica mostra claramente
57
a influência que a infestação de ácaros acarretou na fase de enchimento de grãos, uma vez
que, era de se esperar que a parcela que recebeu a maior dose de fósforo, fosse a que
produzisse grãos mais densos, e consequentemente, fosse a mais produtiva. Na análise
conjunta, os genótipos 23 (Cal-143), 5 (Venezuela 350), 1 (Jalo), 2 (Retinto Santta Rosa) e
28 (IAC-Una) se destacaram por apresentar massa de cem sementes maior que 26g e os
genótipos 27 (Bayo), 19 (Santa Rosa), 32 (Car s. L476-4), 22 (Rai-76) e 15 (Carioca MG),
médias menores que 18g.
A altura de plantas apresentou médias de 100,89 cm para a parcela P A e 93,69 cm
para a parcela PB. Os genótipos com maiores médias, acima de 160 cm foram o 41 (G
2333), 17 (Dom Timóteo), 1 (Jalo), 13 (Cavalo Amarelo) e 34 (Pintado Rajado), os
genótipos com altura menor que 38 cm foram o 24 (Emp 407), 25 (Diacol Calima), 10 (s.
73 vul-6621-CMG), 31 (car s. L476-4) e 39 (IAC-Boreal).
As parcelas PA e PB apresentaram médias semelhantes para número de nós por
planta, 14,81 e 14,53, respectivamente. Os genótipos 29 (IAC-Bico de Ouro), 30 (Car*
(s.L476-2)), 20 (PI-310725), 26 (s. RG1342CH60 (MA)) e 41 (G 2333) apresentaram
médias superiores a 17 nós por planta e, os genótipos 25 (Diacol Calima), 21 (Lagartixa
Precoce), 23 (Cal-153), 39 (IAC-Boreal) e 27 (Bayo) os menores valores, inferiores a 10
nós por planta.
A avaliação do número de dias para o florescimento revelou efeito significativo
para parcelas e genótipos, sendo que, as médias para PA e PB foram 46,03 e 45,01 dias. O
início do florescimento variou de 36 para o genótipo mais precoce ate 51 dias para o
genótipo mais tardio. Os genótipos mais precoces que apresentaram médias inferiores a 40
dias foram o 2 (Retinto Santa Rosa), 5 (Venezuela 350), 23 (Cal-143), 39 (IAC-Boreal) e
21 (Lagartixa Precoce); e os genótipos mais tardios, com médias superiores a 48 dias: 6
(Mulatinho-Branco), 19 (Santa Rosa), 26 (s. RG1342CH60 (MA)), 7 (Rosado-14) e 29
(IAC-Bico de ouro).
As características CR, VR e MSR apresentaram diferenças significativas para dose
e, as características CR, ASR, VR diferenças significativas para genótipos e efeito da
interação doses de P e genótipos (P x G), evidenciando variabilidade entre os genótipos
(Tabela 5).
A variável comprimento de raiz apresentou maior média para a parcela P A, 52,69%
superior a parcela PB com a maior dose. Os genótipos 34 (Pintado Rajado), 1 (Jalo), 16
(Preto s.3888), 8 (s. 91/71-212) e 19 (Santa Rosa) apresentaram as maiores médias para a
característica, superiores a 16480 cm, assim como os genótipos 28 (IAC-Una), 17 (Dom
58
Timóteo), 31 (Car s. L476-4), 30 (Car* s. L476-2) e 25 (Diacol Calima) as menores
médias, 9200 cm.
59
Comprimento de raiz (cm)
19
34
15000 2
13
10 1
33 20 23 41
Alto P
38 16
10000
32 40
29 7 27
21 26 22
3 5 42 39 14 8
28 31 18 37 35
25 11 9
30 15
5000
36
17 4
24 6 12
Baixo P
60
pelos genótipos 28 (IAC-Una), 17 (Dom Timóteo), 30 (Car* s. L476-2), 25 (Diacol
Calima) e 6 (Mulatinho- Branco).
O Volume de raiz apresentou crescimento cerca de 50% maior da parcela P A em
relação à PB, com médias de 20,01 e 10,42, respectivamente. Os genótipos 34 (Pintado
Rajado), 22 (Rai-76), 16 (Preto s.3888), 26 (s. RG1342CH60 (MA)) e 8 (s. 91/71-212)
tiveram os melhores desempenhos, superiores a 8 cm³, enquanto que os genótipos 28 (IAC-
Una), 17 (Dom Timóteo), 30 (Car* s. L476-2), 6 (Mulatinho- Branco)e 11 (Rosinha) as
piores médias, inferiores a 10 cm³.
Para o Diâmetro de raiz, pode-se observar que não houve diferença significativa
para nenhum fator. As médias variaram de 0,426 a 0,347mm.
Com relação a Massa seca de raiz, houve aumento de aproximadamente 50% da
parcela PA em relação à parcela PB, 2,01 e 1,06 g, respectivamente. Não houve diferença
significativa para essa característica entre os genótipos.
Análise Multivariada
61
Tabela 6. Autovalores e variância acumulada (%) das 16 variáveis de parte aérea, sistema
radicular e componentes de produção de 42 genótipos de feijoeiro cultivados em
hidroponia e submetidos à dose restritiva de 4,00 mg L-1 de P.
62
Figura 6. Dispersão dos escores dos 42 genótipos de feijoeiro em relação às duas
primeiras variáveis canônicas (VC1 e VC2), tendo como base 16 variáveis, incluindo
caracteres morfofisiológicos agronômicos de produtividade e de raiz.
63
Tabela 7. Coeficientes de Correlação de Pearson das 16 variáveis analisadas nos 42 genótipos de feijoeiro submetidos à deficiência por P.
DF1 AP2 NÓS3 PG4 NVT5 NVC6 NS7 NSV8 MCS9 NV10 NRB11 CR12 ASR13 VR14 DIAMR15 MSR16
DF -0,190 0,664** 0,053 -0,031 0,168 0,313* 0,176 -0,097 -0,592** -0,064 -0,043 -0,051 -0,044 0,032 0,000
AP 0,200 0,393** 0,295 0,337* 0,195 0,079 -0,052 -0,148 0,046 0,179 0,082 0,008 -0,293 -0,170
NÓS 0,303* 0,204 0,386 0,473** -0,101 0,161 -0,505** -0,031 0,100 0,032 0,009 -0,138 0,090
PG 0,661** 0,836** 0,752** -0,007 -0,033 -0,080 0,178 0,395** 0,366* 0,330* -0,073 0,103
NVT 0,901* 0,801 -0,111 -0,211 -0,132 0,127 0,632** 0,640** 0,616** -0,062 0,067
NVC 0,905** -0,028 -0,154 -0,318* 0,101 0,490** 0,485** 0,464** -0,078 0,076
NS -0,051 -0,141 -0,407** 0,034 0,484** 0,483** 0,472** -0,047 0,064
NSV -0,514** -0,198 0,200 -0,287 -0,263 -0,271 -0,144 0,144
MCS 0,102 -0,005 -0,090 -0,125 -0,119 0,109 0,131
NV 0,385* 0,044 0,128 0,171 0,317* 0,136
NRB -0,099 -0,034 -0,020 0,085 0,319*
CR 0,968** 0,904** -0,035 -0,025
ASR 0,978** 0,152 -0,015
VR 0,3286* -0,019
DIAM -0,039
1
Dias para o florescimento, 2Altura de planta, 3Número de nós por planta, 4Produtividade de grãos (g), 5Número de vagens totais, 6Número de vagens cheias, 7Número de
sementes, 8Número de sementes por vagem, 9Massa de cem sementes (g), 10Número de verticilos, 11Número de raízes basais, 12Comprimento de raiz (cm), 13Área superficial
de raiz (cm²), 14Volume de raiz (cm³), 15Diâmetro de raiz (mm), 16Massa seca de raiz (g).
Como já era esperado houve correlação significativa entre as características de
raiz (CR, ASR e VR) com os componentes de produtividade (PG, NVT, NVC e NS). A
carcterística diâmetro de raiz, apresentou correlações significativas e positivas apenas
com as número de verticilos e volume de raiz. A variável massa seca de raiz apresentou
correlação apenas com número de raizes basais.
4. Conclusões
65
5. Referências Bibliográficas
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68
Capítulo 3
Avaliação de genótipos de feijoeiro quanto à eficiência do uso do P em
Latossolo Vermelho Eutrófico
RESUMO
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma das leguminosas mais
importantes na América Latina sendo que, na maioria das vezes, é cultivada em solos de
baixa fertilidade, com pouca disponibilidade de fósforo (P) e escasso uso de tecnologia
para sua produção. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar em vasos as
respostas morfofisiológicas de 20 genótipos de feijoeiro e classifica-los quanto à
eficiência no uso do P. O delineamento experimental utilizado foi um fatorial 2 x 20,
sendo o primeiro fator constituído pelos tratamentos com doses de fósforo e, o segundo
fator, pelos 20 genótipos de feijão, com seis repetições, das quais, três foram coletadas
no estádio florescimento (R6), para as avaliações biométricas e, as outras três,
conduzidas até a produção de grãos. Como substrato utilizou-se uma mistura de um
Latossolo Vermelho Eutrófico, com baixo teor de P, misturado com areia na proporção
de 3:1. Para aplicação dos tratamentos com as doses de P utilizou-se o Superfostato
simples, constando de duas doses: restritiva e controle, com a aplicação respectivamente
de 45 e 90 kg ha-1 de P2O5. Aos 28 dias foi possível observar os primeiros sintomas de
deficiência do nutriente, com as mudanças na coloração das folhas mais velhas e
diminuição do Índice relativo de clorofila das plantas que receberam a dose restritiva,
evidenciando o início da abscisão foliar. Além disso, foi possível verificar que os
tratamentos com as doses de fósforo foram efetivos para diferenciar tanto os efeitos de
doses, quanto os efeitos de genótipos para os parâmetros: parte aérea, raiz e
produtividade de grãos. Foi possível classificar os genótipos quanto à eficiência de uso
e responsividade à aplicação do P de acordo com seus desempenhos produtivos médios
nas quatro classes: Eficientes e responsivos; Eficientes e não responsivos; Ineficientes e
responsivos; Ineficientes e não responsivos. Sete genótipos se destacaram apresentando
desempenhos superiores à média em ambas as doses de P aplicadas, sendo assim
classificados como Eficientes e Responsivos, sendo eles: IAC Formoso, G 2333, IAC
Carioca Tybatã, IAPAR 81, IAC Imperador, Esplendor e IPR Tangará.
69
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is one of the most important legumes
in Latin America and, in most cases, it’s grown in low fertility soils with low
phosphorus (P) availability and low use of technology for their production. Thus, this
study aimed to evaluate the morphophysiological responses of 20 bean genotypes grown
in pots and classifying then in terms of P use efficiency. The experimental design was
an 2 x 20 factorial, the first factor was composed by the treatments P levels and the
second factor by the 20 genotypes, with six replications, which three of them were
collected in the flowering stage (R6) for biometric evaluations and the other three, led to
the grains production. As substrate it was used a mixture of a red oxisol eutrophic with
low P content, mixed with sand in the ratio of 3: 1. For the application of the P
treatments it were used simple superphosphate, consisting of two doses: restrictive and
control, with the application of respectively 45 and 90 kg ha-1 of P2O5. At 28 days it was
observed the first symptoms of nutrient deficiency, with color changes in the old leaves
and chlorophyll relative index decrease in the plants that received the restrictive dose,
indicating the beginning of leaf abscission. In addition, it was observed that the
treatment phosphorus doses were effective to differentiate effects doses and genotypes
for the parameters: shoot, root and grain yield. It was possible to classify the genotypes
for use efficiency and responsiveness to the application of P according to their
productivity mean performances in four classes: Efficient and responsive; Efficient and
not responsive; Inefficient and responsive; Inefficient and unresponsive. Seven
genotypes stood out presenting higher performances in both P concentration, being
classified as Efficient and Responsive, namely IAC Formoso, G 2333, IAC Carioca
Tybatã, IAPAR 81, IAC Imperador, Esplendor and IPR Tangara.
70
1. Introdução
71
Segundo SCHRÖDER et al., (2011), os fertilizantes fosfatados minerais,
intensivamente utilizados na produção de alimentos nos últimos 50 anos, são
processados a partir das reservas fósseis, no entanto, devido a ineficiências na cadeia de
produção e consumo de alimentos, apenas um quinto desse P atinge os alimentos
consumidos pela população global. Frente ao aumento populacional mundial dos
próximos 40 anos e da taxa de esgotamento de reservas para a produção de fertilizantes
fosfatados, previstas para 50-150 anos, é extremamente necessário que haja o uso
eficiente do recurso.
BEEBE et al., (2013), afirmam que os atuais esforços quanto ao aumento da
eficiência de aquisição e utilização de nutrientes em baixa fertilidade natural dos solos
certamente contribuirão também para melhorar a eficiência do uso de fertilizantes, de
maneira sustentável. Os autores reforçam a importância da recuperação do P aplicado,
antes de ser irreversivelmente fixado por óxidos de ferro e de alumínio nos solos
tropicais com alta capacidade de fixação, o que implica num sistema radicular eficiente
que acesse agressivamente os nutrientes do solo.
Diante do exposto, e utilizando 20 genótipos de feijoeiro previamente
classificados em hidroponia, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as respostas
morfofisiológicas desses genótipos, em Latossolo Vermelho Eutrófico de média
fertilidade e baixo teor de P, com a imposição de adubação suplementar do nutriente e
classifica-los quanto à eficiência e responsividade no uso.
2. Material e Métodos
72
Quadro 1. Genótipos utilizados no estudo quanto à eficiência de absorção e uso do
fósforo, descrição do tegumento e da classificação realizada em solução nutritiva (1),
sendo classificados nas seguintes classes: Eficientes e responsivos (EF), Eficientes e
não responsivos (ENR), Ineficientes e responsivos (IR) e Ineficientes e não responsivos
(INR).
Genótipo Tegumento Classe Genótipo Tegumento Classe
1. IAC ALVORADA Carioca IR 11. BRS PONTAL Carioca IR
2. IAC CARIOCA TYBATÃ Carioca ER 12. BRS ESTILO Carioca INR
3. IAC DIPLOMATA Carioca INR 13. PÉROLA Carioca IR
4. IAC FORMOSO Carioca ENR 14. IPR TANGARÁ Carioca ENR
5. IAC IMPERADOR Carioca ER 15. DIAMANTE NEGRO Preto ENR
6. IPR UIRAPURU Preto IR 16. JALO PRECOCE Amarelo INR
7. BAT 477 Creme INR 17. G4000 Marrom INR
8. SEA 5 Creme INR 18. DOR 364 Vermelho INR
9. CARIOCA COMUM Carioca ER 19. G2333 Vermelho ER
10. IAPAR 81 Carioca ER 20. BRS ESPLENDOR Preto ENR
1
SILVA et al., (2014).
Foram utilizados vasos com volume de 5 dm3, contendo como substrato uma
mistura de um Latossolo Vermelho Eutrófico e areia na proporção respectiva de 3:1. De
acordo com a análise química e granulométrica (Tabela 1), o solo é considerado
argiloso, com fertilidade média, contendo teor de fósforo de 3 mg dm-3, considerado
muito baixo segundo RAIJ et al. (1997).
pH MO Presina H + Al K Ca Mg SB CTC V
-3
(CaCl2) (g dm ) -3
(mg dm ) -3 ---------------------- mmolc dm ----------------------- (%)
--
5,9 14 3 14 2,2 29 8 39,3 53,3 74
73
vegetação, sendo que, três repetições foram coletadas no florescimento (R6), para
avaliações biométricas e, as outras três, foram conduzidas até a produção de grãos.
Foram aplicados em cada vaso 500 mg de N, na forma de Ureia (correspondendo
a 90 kg de N ha-1) e, os dois tratamentos com fósforo nas parcelas aplicados na forma de
Superfostato simples, constando de: Parcela PA (dose restritiva): 45 kg ha-1 de P2O5 e
Parcela PB (dose controle): 90 kg ha-1 de P2O5. Dessa forma, na Parcela PA foram
aplicados 625 mg e na Parcela PB 1.250 mg de superfosfato simples por vaso. A dose
aplicada na Parcela PA é restritiva por corresponder á metade da dose da Parcela P B,
denominada controle, recomendada para aplicação nas condições da fertilidade do solo
(RAIJ et al., 1997). Aos 28 dias após o transplantio (DAT), foi realizada a avaliação do
índice relativo de clorofila (IRC) na folha cotiledonar, utilizando-se o método não
destrutivo (SPAD-502Plus – Konica Minolta).
No estádio R6, foram realizadas as coletas de plantas para a avaliação dos
caracteres biométricos: altura de planta; número de nós por planta; área foliar; massa
seca de folhas, caule e raízes; área superficial, comprimento, volume total e diâmetro de
raiz.
Para a determinação da área foliar total (cm2), foi utilizado um integrador de
área - Modelo LI-3100C – LI-COR. Para obtenção da massa seca de folhas, caule e raiz,
as amostras foram secas em estufa de circulação forçada de ar com temperatura de 60
°C, até atingir peso constante. As raízes foram avaliadas com a utilização do software
WinRHIZO® (Regent Instruments Inc., Quebec, Canada).
Na maturidade fisiológica foram avaliados os componentes de produção: número
de vagens por planta (NV); número de sementes por planta (NS), número de sementes
por vagem (NSV); massa de cem sementes em gramas (MCS) e produtividade de grãos
em g planta-1 (PG).
Para determinar os teores de nutrientes nas folhas, amostras de 1,0 g de tecido
foliar, secas e moídas, foram submetidas à digestão nítricoperclórica para extração de P,
K, Ca, Mg e S. Nos extratos, os teores desses nutrientes foram determinados por
espectrofotometria de absorção atômica. Para determinação do N total, amostras de 0,2
g do tecido foliar foram submetidas à digestão sulfúrica. O N total foi determinado por
destilação e o P por espectrofotometria UV-VIS (MALAVOLTA et al., 1989).
74
3. Resultados e discussões
Aos 28 dias após o transplantio foi possível observar o início da abscisão foliar
nas plantas que receberam a dose restritiva. Foram observadas diferenças estatísticas
para o Índice relativo de clorofila - IRC a 1% de probabilidade, tanto para o fator dose
de P, como para o fator genótipos (Tabela 2).
Doses P 1 1027,9**
Genótipos 19 113,3**
PxG 19 39,5
CV % 19,19
75
Tabela 3. Médias para índice relativo de clorofila nas folhas cotiledonares do feijoeiro
aos 28 dias após o transplantio.
76
Todas as características de parte aérea apresentaram diferenças estatísticas a 1%
de probabilidade para as doses de P e diferenças estatísticas a 1% de probabilidade para
os genótipos para todas as características, exceto para área foliar, sendo que, os
coeficientes de variação experimental observados foram considerados satisfatórios,
variando de 10,75 a 19,63% (Tabela 4).
Quadrado Médio
FV
GL AFn MSFn MSRMn ALTn
Para a área foliar houve uma redução de 25,42% com a aplicação da dose
restritiva de P. Nessas parcelas, a área foliar variou de 1752,66 a 707 cm², enquanto a
amplitude na dose controle foi de 1862,33 a 849,66 (Tabela 5). Apesar de não ter sido
detectada diferença significativa entre os genótipos, na análise conjunta dos dados as
maiores médias foram obtidas por BAT 477, Pérola, G2333, IPR Uirapuru e BRS
Esplendor.
Houve redução de 33,44% na produção de massa seca de folhas com aplicação
da dose restritiva em relação a dose controle. As médias dos tratamentos foram de 1,91
e 2,87 g, respectivamente para a dose restritiva e para a dose controle. Nas parcelas que
receberam a dose restritiva a amplitude das observações variou de 1,2 a 2,88 g, no
entanto, não foi possível verificar diferença estatística para a diferenciação dos
genótipos. Na dose controle a amplitude observada foi de 1,43 a 6,62, diferenciando os
genótipos em três categorias; os genótipos que apresentaram maior produção de massa
seca de folha foram: G 2333, Pérola e BRS Esplendor. Pela análise conjunta foi possível
observar que o genótipo G 2333 apresentou maior produção de massa seca de folhas
(4,73g), enquanto os genótipos IAPAR 81, IPR Tangará e Carioca comum apresentaram
os piores desempenhos (Tabela 5).
77
A produção de massa seca de ramos foi influenciada tanto pela dose de P quanto
pelos genótipos. As parcelas que receberam a dose restritiva apresentou média de 1,49
g, enquanto a parcela com a dose controle com média de 1,73 g, ou seja, houve uma
redução de 13,87%. A amplitude nas parcelas com dose restritiva foi de 2,44 a 0,64,
sendo que, os genótipos com maior massa seca de ramos foram: Jalo Precoce, G 2333 e
Pérola; os genótipos que apresentaram os piores desempenhos foram DOR 364, BRS
Estilo e BRS Esplendor. Os genótipos que apresentaram os melhores desempenhos nas
parcelas com a dose controle foram os mesmos genótipos que se destacaram nas
parcelas com a dose restritiva e, os piores desempenhos, foram dos genótipos DOR 364,
Carioca Comum e IAPAR 81(Tabela 5).
A característica altura de planta foi influenciada tanto pela dose de P como pelos
genótipos. A dose restritiva resultou na redução de 19,65% na altura das plantas, sendo
as médias das parcelas de 91,93 e 76,86 cm, respectivamente, para as parcelas com dose
controle e nas parcelas com dose restritiva. A altura de plantas variou de 217,33 a 31,33
cm na dose restritiva e de 262,33 a 40 cm na parcela que recebeu a dose controle. O
genótipo que apresentou a maior altura de plantas foi o genótipo G 2333, com hábito de
crescimento indeterminado, apresentando média de 239,83 cm em análise conjunta,
seguido dos genótipos Pérola, IAC Imperador, BRS Pontal e IAC Carioca Tybatã,
apresentando respectivamente as médias: 166,16; 126,66; 108,66 e 104,66. Os
genótipos que apresentaram as menores médias para altura de plantas foram IPR
Tangará, SEA 5 e DOR 364 com médias respectivamente de, 35,66; 40,00 e 43,83 cm
(Tabela 5).
Quanto ao número de nós por planta (NNP), houve redução de 6,98% com a
aplicação da dose restritiva, havendo uma variação no número de nós de 13,5 a 7,5.
Considerando o teste de média da análise conjunta dos dados, os genótipos IAC
Imperador, IAC Alvorada, IAC Carioca Tybatã e BRS Estilo apresentaram as maiores
médias, ou seja, mais do que 12,5 nós por planta. Os genótipos que apresentaram os
piores desempenhos para essa característica foram SEA 5, IPR Tangará, BRS Esplendor
e Jalo Precoce, com médias inferiores a 10,5 nós (Tabela 5).
78
Tabela 5. Desempenho médio de 20 genótipos de feijão comum quanto aos caracteres de parte aérea Área foliar (AF), Massa seca de folhas
(MSF), Massa seca de Ramos (MSRM), Altura de planta (ALT) e Número de nós por planta (NNP) submetidos à aplicação de duas doses de P,
sendo aplicados 45 e 90 kg de P2O5, respectivamente, nas parcelas PA (dose restritiva) e PB (dose controle).
AF MSF MSRM ALT NNP
Genótipo Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB
1- IAC Alvorada 1039,00 a 927,67 a 1150,3 a 2,19 b 1,71 a 2,68 c 1,67 b 1,28 b 2,40 b 86,3 c 78,33 c 94,33 d 12,83 a 12,67 a 13,00 a
2- IAC Carioca Tybatã 1107,50 a 779,33 a 1435,7 a 2,52 b 1,7 a 3,35 c 1,62 b 1,03 b 2,47 b 105 c 76,00 c 133,33 c 12,66 a 11,67 a 13,67 a
3- IAC Diplomata 1178,16 a 1101,33 a 1255 a 2,41 b 2,04 a 2,79 c 1,64 b 1,38 b 2,12 c 71,8 d 66,33 c 77,33 d 10,66 b 10,67 a 10,67 b
4- IAC Formoso 1092,83 a 1071,33 a 1114,3 a 2,32 b 2,14 a 2,51 c 1,57 b 1,46 b 1,55 c 65,3 d 50,33 c 80,33 d 12,16 a 11,67 a 12,67 a
5- IAC Imperador 1163,50 a 1105,33 a 1221,7 a 2,25 b 1,78 a 2,74 c 1,58 b 1,22 b 1,93 c 127 c 114,33 c 139,00 c 13,5 a 12,67 a 14,33 a
6- IPR Uirapuru 1313,50 a 1377 a 1250 a 2,32 b 2,06 a 2,59 c 1,53 b 1,19 b 1,62 c 60 d 56,67 c 63,33 d 11 b 10,33 a 11,67 b
7- BAT 477 1701,66 a 1752,67 a 1650,7 a 2,71 b 2,79 a 2,65 c 1,59 b 1,45 b 1,69 c 93,3 c 94,00 c 92,67 d 12,33 a 12,33 a 12,33 a
8- SEA 5 984,66 a 768 a 1201,3 a 2,34 b 1,6 a 3,1 c 1,49 b 0,98 b 1,55 c 40 d 32,00 c 48,00 d 7,5 c 7,00 b 8,00 c
9- Carioca Comum 977,83 a 1106 a 849,67 a 1,89 b 2,22 a 1,57 c 1,48 b 1,38 b 1,12 c 84,7 c 96,33 c 73,00 d 11,66 a 12,00 a 11,33 b
10- IAPAR 81 794,50 a 707 a 882 a 1,32 b 1,22 a 1,43 c 1,43 b 0,99 b 1,19 c 57,8 d 63,33 c 52,33 d 11,16 b 11,00 a 11,33 b
11- BRS Pontal 1188,00 a 1004 a 1372 a 2,2 b 1,67 a 2,73 c 1,56 b 1,05 b 1,96 c 109 c 101,67 c 115,67 d 12,66 a 12,00 a 13,33 a
12- BRS Estilo 1164,33 a 902,67 a 1426 a 2,01 b 1,2 a 2,83 c 1,6 b 0,86 b 2,43 b 54,8 d 41,00 c 68,67 d 12,66 a 12,33 a 13,00 a
13- Pérola 1391,16 a 1008,33 a 1774 a 3,27 b 2,22 a 4,33 b 1,91 a 1,87 a 3,61 a 166 b 148,00 b 184,33 b 12,5 a 11,67 a 13,33 a
14- IPR Tangará 931,25 a 777 a 1085,5 a 1,74 b 1,24 a 2,26 c 1,58 b 1,04 b 2,07 c 35,7 d 31,33 c 40,00 d 9,5 b 9,00 b 10,00 b
15- Diamante Negro 1187,33 a 1300 a 1074,7 a 2,22 b 2,12 a 2,33 c 1,5 b 1,22 b 1,34 c 55,5 d 66,00 c 45,00 d 10,5 b 10,67 a 10,33 b
16- Jalo Precoce 1093,33 a 1320,67 a 866 a 2,35 b 2,88 a 1,83 c 1,9 a 2,44 a 2,83 b 69,8 d 66,33 c 73,33 d 10,33 b 10,67 a 10,00 b
17- G 4000 1150,50 a 1009,67 a 1291,3 a 2,17 b 1,75 a 2,6 c 1,49 b 1,00 b 1,55 c 54,8 d 51,00 c 58,67 d 11,66 a 11,67 a 11,67 b
18- DOR 364 953,66 a 745,33 a 1162 a 2,09 b 1,73 a 2,45 c 1,34 b 0,64 b 0,99 c 43,8 d 40,00 c 47,67 d 11,16 b 10,33 a 12,00 a
19- G 2333 1350,50 a 838,67 a 1862,3 a 4,73 a 2,86 a 6,62 a 2,04 a 2,23 a 4,32 a 240 a 217,33 a 262,33 a 12,5 a 11,33 a 13,67 a
20- BRS Esplendor 1212,33 a 782,33 a 1642,3 a 2,76 b 1,34 a 4,18 b 1,63 b 0,89 b 2,59 b 68,2 d 47,00 c 89,33 d 10,33 b 9,33 b 11,33 b
Média das Parcelas 1148,78 1019,22 B 1278,3 A 2,39 1,91 B 2,88 A 1,61 1,49 B 1,73 A 84,396 76,86 B 91,93 A 11,463 11,05 B 11,88 B
Valores médios seguidos por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si para genótipos e valores médios com diferentes letras
maiúsculas na linha diferem entre si para as doses de P pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade.
79
Pôde-se observar que a imposição da condição de deficiência do P influenciou
na redução de todos os caracteres avaliados relacionados à parte aérea. De acordo com
WHITE & HAMMOND (2008), muitas das respostas das plantas à deficiência de P
parecem ser iniciadas, ou moduladas pela diminuição do transporte do P inorgânico (Pi)
para a parte aérea e, consequentemente, ocorre a redução do Pi disponível para o
metabolismo, assim, na maioria das vezes, essa condição resulta na redução imediata da
taxa de crescimento da parte aérea, antes mesmo que o crescimento da raiz seja afetado.
Os autores ainda enfatizam que a redução do elemento a nível celular afeta diretamente
a fotossíntese, glicólise e respiração. Assim, as modificações no metabolismo de
carboidratos são reforçadas pela reprogramação transcricional, resultando na síntese de
ácidos orgânicos, amido e acumulação de sacarose nas folhas das plantas deficientes.
Os teores médios de P no tecido foliar determinados pela análise química foliar
foi de 1,49 e 1,24 g Kg-1, respectivamente para a dose restritiva e para a dose controle.
A menor concentração de P nas folhas que receberam a maior dose de P pode ser
explicada pelo fato de ter ocorrido maior acúmulo de massa seca de folhas “diluindo” a
concentração do elemento no total das folhas produzidas, constatado pela produção de
33,44 % maior nas parcelas com a dose controle em relação às parcelas com a dose
restritiva. RAPOSO et al., (2004) observaram em diferentes grupos de maturação de
soja cultivados em Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico, com médio teor de P,
relação negativa entre a concentração de P das folhas e a biomassa produzida,
enfatizando o efeito de diluição do nutriente. Foi determinado o conteúdo de P nas
folhas, pelo produto do teor de P foliar e da massa seca de folhas, sendo
respectivamente de 2,78 e 3,42 g de P para as parcelas com a dose restritiva e dose
controle, ou seja, 18,71% de redução do conteúdo nas parcelas com a dose restritiva,
confirmando o maior acúmulo do nutriente nas folhas, acompanhada pela maior
produção de massa seca.
Com a determinação do teor foliar dos macronutrientes foi possível verificar
que, assim como ocorreu com o P, houve também um maior acúmulo do N, K, Ca, Mg e
S nas folhas nas parcelas com a dose restritiva, ocorrendo o efeito de diluição do
nutriente, com a maior formação de massa seca das plantas controle. Os teores
apresentados na Tabela 6, para a maioria dos nutrientes, encontram-se próximos aos
indicados como adequados à cultura do feijoeiro por ABROSANO et al., (1997), sendo
os desvios também atribuídos a não utilização de amostragem das folhas mais novas
totalmente expandidas, mas a utilização total das folhas para a realização das análises.
80
Tabela 6. Níveis dos macronutrientes no tecido foliar (g kg-1) de 20 genótipos de
feijoeiro cultivados em Latossolo Vermelho Eutrófico submetidos às doses de fósforo
nas parcelas com dose restritiva e controle, respectivamente, 45 e 90 kg há-¹ P2O5.
Tratamento N P K Ca Mg S
-1
g kg
Adequado* 30-50 2,5-4,0 20-24 10-25 2,5-5,0 2-3
PA 54,27 1,49 23,64 20,61 3,99 1,04
PB 42,50 1,24 20,06 19,05 3,61 0,79
*Faixas de teores considerados adequados para os macronutrientes em folhas de feijoeiro amostradas no
florescimento, nas terceira folhas como pecíolo, tomadas no terço médio de 30 plantas (AMBROSANO et al., 1997).
Quadrado Médio
FV
GL CRn ASRn VRn DIAM MSR R/PA
81
destacaram-se na dose restritiva os genótipos: BAT 477, IPR Uirapuru, Diamante Negro
e IAC Formoso, apresentando médias superiores a 11500 cm. Nas parcelas doa dose
controle, destacaram-se os genótipos: Diamante Negro, Pérola, IAC Carioca Tybatã,
com médias superiores a 12500 cm. Em ambas as condições de doses de P, o genótipo
DOR 364 apresentou o pior desempenho 4138,30 e 6374,75 cm para as doses com
restrição e dose controle, respectivamente (Tabela 8).
Houve uma redução de 15,5% na característica área superficial de raiz nas
parcelas com a dose restritiva, com as parcelas com a dose restritiva e controle
apresentando respectivamente médias gerais de 869,04 e 1028,48 cm². Os valores para a
característica variaram de 1345,52 a 542,06 cm², sendo que, os genótipos que
apresentaram melhor desempenho médio foram: BAT 477, Diamante Negro, IPR
Uirapuru e Pérola, enquanto que, os genótipos DOR 364, G 2333 e IAC Imperador
apresentaram os menores valores para a característica. Na dose restritiva, destacaram-se
os genótipos BAT 477, IAC Formoso e IPR Uirapuru e, na dose controle, os genótipos
de maior destaque foram Diamante Negro, BAT 477 e BRS Esplendor (Tabela 8).
O volume de raiz foi a única característica do sistema radicular a apresentar
diferenças estatísticas significativas tanto para o tratamento de doses, como para os
genótipos. O volume radicular sofreu uma redução de 17,46% com a aplicação da dose
restritiva de P, havendo uma variação total de 11,76 a 4,5 cm³, sendo que, os genótipos
que apresentaram os maiores volumes radiculares médios foram BAT 477, SEA 5 e
IAC Formoso, assim como os menores desempenhos foram observados nos genótipos
DOR 364, G 2333 e IAC Imperador. Nas parcelas que receberam a dose restritiva, os
melhores desempenhos foram observados pelos genótipos BAT 477, IAC Formoso e
Jalo Precoce. Na parcela controle, os genótipos que apresentaram os maiores valores
para a característica foram BAT 477, BRS Esplendor e SEA 5 (Tabela 8).
A característica massa seca de raiz foi a característica do sistema radicular mais
prejudicada pela redução na dose de P, apresentando 22,7% de redução, assim as médias
das parcelas com restrição e controle da adubação fosfatada foram de 0,565 e 0,726 g,
respectivamente. A amplitude das observações variaram de 0,790 g para o melhor
genótipo, Diamante Negro, à 0,394 g, para o genótipo DOR 364, com o pior
desempenho. Na condição de restrição do P, os genótipos que apresentaram melhores
desempenhos foram Diamante Negro, Jalo Precoce, IAC Formoso e IPR Uirapuru, Nas
parecelas com a dose controle, os melhores genótipos foram BRS Esplendor, Diamante
Negro e IAC Carioca Tybatã (Tabela 8).
82
Tabela 8. Desempenho médio de 20 genótipos de feijão comum quanto ao Sistema Radicular com as avaliações de: Comprimento total de raiz
(CR), Área superficial de raiz (AR), Volume de raiz (VR), Diâmetro médio de raiz (DR) e Massa seca de raiz (MSR), submetidos a duas doses
de P nas parcelas PA (dose restritiva) e PB (dose controle).
CR AS R VR DR MS R RPA
Genótipo Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB
1- IAC Alvorada 8315,05 a 8,167,577 a 8462,52 a 883,51 a 820,758 a 946,267 a 7,52 a 6,61 a 8,45 a 0,342 a 0,329 a 0,355 a 0,609 a 0,510 a 0,709 a 0,62 a 0,59 a 0,67 a
2- IAC Carioca Tybatã 10250,12 a 7,980,743 a 12519,5 a 993,42 a 758,687 a 1228,17 a 7,67 a 5,75 a 9,61 a 0,311 b 0,305 b 0,317 b 0,676 a 0,493 a 0,859 a 0,65 a 0,59 a 0,72 a
3- IAC Diplomata 10772,05 a 10532,16 a 11012 a 1059,4 a 1008,53 a 1110,32 a 8,31 a 7,69 a 8,93 a 0,317 b 0,310 b 0,326 b 0,72 a 0,655 a 0,786 a 0,56 a 0,65 a 0,47 a
4- IAC Formoso 10410,78 a 11507,02 a 9314,55 a 1078,3 a 1165,15 a 991,378 a 8,92 a 9,44 a 8,41 a 0,331 b 0,327 b 0,336 b 0,737 a 0,787 a 0,687 a 0,68 a 0,69 a 0,67 a
5- IAC Imperador 7774,73 a 7,418,584 a 8130,88 a 775,63 a 756,229 a 795,04 a 6,19 a 6,16 a 6,24 a 0,321 b 0,321 b 0,321 b 0,536 a 0,491 a 0,581 a 0,6 a 0,59 a 0,63 a
6- IPR Uirapuru 11982,85 a 12163,49 a 11802,2 a 1113,1 a 1108,8 a 1117,45 a 8,29 a 8,16 a 8,44 a 0,294 c 0,289 b 0,300 b 0,735 a 0,678 a 0,793 a 0,69 a 0,68 a 0,72 a
7- BAT 477 12317,05 a 13501,83 a 11132,2 a 1345,5 a 1424,5 a 1266,55 a 11,76 a 12,04 a 11,48 a 0,351 c 0,340 a 0,363 a 0,787 a 0,797 a 0,777 a 0,66 a 0,7 a 0,64 a
8- SEA 5 8271,28 a 6,575,561 a 9967 a 990,91 a 805,55 a 1176,29 a 9,49 a 7,87 a 11,11 a 0,385 a 0,392 a 0,379 a 0,709 a 0,584 a 0,835 a 0,63 a 0,6 a 0,67 a
9- Carioca Comum 9409,64 a 11497,94 a 7321,34 a 882,44 a 1068,24 a 696,652 a 6,61 a 7,92 a 5,31 a 0,3 c 0,300 b 0,301 b 0,562 a 0,652 a 0,472 a 0,62 a 0,64 a 0,61 a
10- IAPAR 81 8366,44 a 7,727,971 a 9004,9 a 915,47 a 857,377 a 973,568 a 7,98 a 7,59 a 8,39 a 0,348 a 0,348 a 0,348 a 0,61 a 0,516 a 0,705 a 0,51 a 0,36 a 0,66 a
11- BRS Pontal 8349,94 a 7,066,546 a 9633,34 a 835,84 a 684,184 a 987,513 a 6,68 a 5,30 a 8,06 a 0,316 b 0,307 b 0,325 b 0,561 a 0,455 a 0,667 a 0,62 a 0,58 a 0,67 a
12- BRS Estilo 7663,75 a 5,306,278 a 10021,2 a 855,15 a 591,044 a 1119,26 a 7,62 a 5,25 a 9,99 a 0,357 a 0,356 a 0,360 a 0,65 a 0,451 a 0,850 a 0,62 a 0,56 a 0,69 a
13- Pérola 12199,50 a 10528,82 a 13870,2 a 1110,4 a 982,626 a 1238,1 a 8,11 a 7,35 a 8,89 a 0,298 c 0,305 b 0,292 b 0,703 a 0,619 a 0,789 a 0,69 a 0,66 a 0,72 a
14- IPR Tangará 8426,45 a 6,783,009 a 10069,9 a 861,51 a 690,263 a 1032,76 a 7,01 a 5,59 a 8,44 a 0,326 b 0,325 b 0,328 b 0,633 a 0,498 a 0,769 a 0,65 a 0,6 a 0,7 a
15- Diamante Negro 13565,15 a 11923,5 a 15206,8 a 1205 a 1071,79 a 1338,27 a 8,53 a 7,69 a 9,38 a 0,28 c 0,290 b 0,271 b 0,79 a 0,717 a 0,864 a 0,72 a 0,69 a 0,76 a
16- Jalo Precoce 8982,71 a 9,707,179 a 8258,23 a 891,42 a 1021,07 a 761,772 a 7,08 a 8,55 a 5,63 a 0,317 b 0,333 a 0,301 b 0,646 a 0,717 a 0,576 a 0,66 a 0,67 a 0,65 a
17- G 4000 8135,51 a 8,096,303 a 8174,73 a 912,36 a 858,112 a 966,619 a 8,17 a 7,24 a 9,12 a 0,355 a 0,338 a 0,373 a 0,681 a 0,580 a 0,783 a 0,64 a 0,63 a 0,66 a
18- DOR 364 5256,52 a 4138,3 a 6374,75 a 542,07 a 443,741 a 640,399 a 4,5 a 3,84 a 5,17 a 0,339 a 0,361 a 0,319 b 0,394 a 0,298 a 0,491 a 0,52 a 0,44 a 0,6 a
19- G 2333 7353,85 a 5,732,142 a 8975,56 a 732,72 a 539,817 a 925,632 a 5,84 a 4,08 a 7,61 a 0,315 b 0,305 b 0,326 b 0,442 a 0,325 a 0,561 a 0,57 a 0,52 a 0,62 a
20- BRS Esplendor 8955,39 a 6,759,906 a 11150,9 a 991,12 a 724,467 a 1257,77 a 8,75 a 6,18 a 11,33 a 0,351 a 0,339 a 0,364 a 0,725 a 0,482 a 0,969 a 0,64 a 0,58 a 0,72 a
M édia das Parcelas 9337,94 8655,74 B 10020,1 A 948,76 869,04 B 1028,48 A 7,75 7,01 B 8,49 A 0,33 0,325 A 0,33 A 0,645 0,565 B 0,726 A 0,628 A 0,6 B 0,66 A
Valores médios seguidos por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si para genótipos e valores médios com diferentes letras
maiúsculas na linha diferem entre si para as doses de P pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade.
83
Segundo LÓPES-BUCIO et al. (2003) os nutrientes do solo são elementos
críticos para o crescimento das plantas e produtividade. A biodisponibilidade de
nutrientes na solução do solo pode determinar o crescimento e proliferação das raízes,
sendo o P um dos nutrientes que podem alterar os processos de desenvolvimento pós-
embrionários do sistema radicular. Além disso, devido à baixa biodisponibilidade e
mobilidade de P na maioria dos solos, a capacidade do sistema radicular de explorar
eficazmente o solo a um custo metabólico mínimo é essencial para o desenvolvimento
da planta (LYNCH E BROWN, 2008).
TRINDADE & ARAUJO (2014) avaliando a variabilidade de 24 genótipos de
feijoeiro quanto aos caracteres do sistema radicular em Argissolo Vermelho-Amarelo
submetidos à aplicação de duas doses de P, 20 e 80 kg de P2O5, observaram que a maior
oferta de P no solo melhorou o desenvolvimento do sistema radicular, aumentando as
características massa de raiz principal, basal e lateral, massa de nódulos, área de raízes e
comprimento de raízes tanto no início de formação como no período de enchimento das
vagens. Os autores reforçam a importância da seleção de cultivares com maior
crescimento da raiz como uma estratégia para aumentar a absorção de P e produção de
grãos, especialmente em ambientes tropicais e subtropicais onde a disponibilidade de P
no solo é geralmente muito baixa.
Outra característica a ser levada em consideração é o maior desenvolvimento do
sistema radicular em detrimento da formação de parte aérea, ou seja, relação raiz x parte
aérea. A análise de variância para essa característica evidenciou significância apenas
para o efeito da dose de P, sendo que, a maior aplicação do nutriente aumentou também
a relação raiz x parte aérea de 0,60 para 0,66. Apesar de não ter sido possível verificar o
aumento médio dessa relação com a diminuição da dose do nutriente, pôde-se verificar
que os genótipos Diamante Negro, IAC Formoso, BAT 477, Carioca Comum e Jalo
Precoce apresentaram maior relação raiz parte aérea respondendo ao tratamento com a
dose restritiva de P (Tabela 8). Segundo RAGHOTHAMA (1999) o aumento da relação
raiz x parte aérea sob déficit de P é uma característica da resposta da planta à deficiência
de Pi, aumentando a área de superfície total disponível para a exploração do solo e
aquisição de nutrientes.
Em ambos os tratamentos aplicados não foi possível verificar uma correlação
significativa entre a produção de massa seca de raiz com a produtividade de grãos,
sendo observado baixos coeficiente de regressão, tanto para as parcelas com restrição de
P como para as parcelas controle. No entanto, é interessante ressaltar que os genótipos
84
IAC Formoso e BAT 477 apresentaram os melhores desempenhos produtivos médios e
os melhores desempenhos para a produção de massa seca de raiz na condição de
restrição do elemento. Nas parcelas com a dose controle, o genótipo Pérola foi o único
que apresentou elevada produtividade associada ao maior acúmulo de massa seca de
raiz (Figura 1).
Déficit Controle
7
4
19
5.0
2 13
Y= 0.793 - 0.016x R²=1.66%
10
4.5
6
5
4.0
20
14 19 14 1
9
5
3.5
12 11
PG
PG
6
10 17 4
18 17 2
3.0
1 13 20
3 4 8
11
6 12 18
2.5
8 7
3
16
2.0
15
9
15 16
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
MSR MSR
Figura 1. Análise de regressão linear simples entre os caracteres Massa seca de raiz e
Produtividade de grãos de 20 genótipos de feijoeiro cultivados em Latossolo Vermelho
Eutrófico, submetidos às doses 45 e 90 kg há-¹ de P2O5 nas parcelas com dose restritiva
e controle.
85
Tabela 9. Resumo da análise de variância quanto aos componentes de produção de 20
genótipos de feijoeiro cultivados em Latossolo Vermelho Eutrófico e submetidos às
doses 45 e 90 kg há-¹ de P2O5 nas parcelas com dose restritiva e controle.
Quadrado Médio
86
Tabela 10. Desempenho médio de 20 genótipos de feijão comum quanto aos Componentes de Produtividade Número de vagem (NV), Número
de sementes (NS), Número de sementes por vagem (NSV), Massa de cem sementes (MCS) e Produtividade de grãos (PG), submetidos à
aplicação de duas doses de P, sendo aplicados 45 e 90 kg de P2O5, respectivamente, nas parcelas P A (dose restritiva) e PB (dose controle).
NV NS NS V MCS PG
Genótipo Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB Conjunta PA PB
1- IAC Alvorada 3,83 a 2,67 a 5,00 a 12,83 b 9,00 a 16,67 a 3,29 b 3,25 a 3,33 a 33,49 a 35,07 a 31,91 a 4,2 a 3,19 a 5,22 a
2- IAC Carioca Tybatã 5,33 a 6,00 a 4,67 a 21,16 a 21,67 a 20,67 a 3,98 b 3,50 a 4,47 a 22,31 d 22,83 b 21,80 b 4,76 a 4,97 a 4,55 a
3- IAC Diplomata 3,33 a 2,67 a 4,00 b 14,16 b 11,67 a 16,67 a 4,52 a 4,93 a 4,12 a 23,12 c 25,43 b 20,82 b 3,11 a 2,91 a 3,31 a
4- IAC Formoso 4,33 a 4,33 a 4,33 a 18,83 a 18,00 a 19,67 a 4,51 a 4,08 a 4,95 a 27,47 b 30,77 a 24,18 b 4,92 a 5,17 a 4,68 a
5- IAC Imperador 4,00 a 3,00 a 5,00 a 16,83 a 14,33 a 19,33 a 4,46 a 5,07 a 3,87 a 29,73 b 28,01 a 31,47 a 5,06 a 4,03 a 6,10 a
6- IPR Uirapuru 3,16 a 3,00 a 3,33 b 13,33 b 11,33 a 15,33 a 3,99 b 3,78 a 4,22 a 27,6 b 30,14 a 25,07 b 3,59 a 3,42 a 3,76 a
7- BAT 477 3,16 a 3,33 a 3,00 b 15,5 a 16,00 a 15,00 a 4,73 a 4,42 a 5,06 a 26,06 c 27,91 a 24,21 b 4 a 4,39 a 3,62 a
8- SEA 5 2,50 a 2,00 a 3,00 b 10,33 b 8,33 a 12,33 a 3,9 b 3,50 a 4,31 a 28,29 b 25,28 b 31,31 a 3,07 a 2,31 a 3,84 a
9- Carioca Comum 3,00 a 3,33 a 2,67 b 12,33 b 13,67 a 11,00 a 4,37 a 4,41 a 4,33 a 25,28 c 25,57 b 25,01 b 3,12 a 3,53 a 2,71 a
10- IAPAR 81 4,83 a 4,67 a 5,00 a 19 a 19,33 a 18,67 a 3,68 b 3,67 a 3,70 a 25,88 c 26,78 b 24,99 b 4,69 a 4,77 a 4,61 a
11- BRS Pontal 4,33 a 3,00 a 5,67 a 16,66 a 11,67 a 21,67 a 3,64 b 3,50 a 3,78 a 24,26 c 25,66 b 22,88 b 3,83 a 2,74 a 4,93 a
12- BRS Estilo 3,33 a 3,33 a 3,33 b 11,5 b 10,67 a 12,33 a 3,48 b 3,22 a 3,75 a 31,46 a 32,42 a 30,52 a 3,6 a 3,50 a 3,71 a
13- Pérola 4,16 a 2,67 a 5,67 a 15,33 a 10,67 a 20,00 a 3,83 b 4,17 a 3,50 a 33,13 a 30,25 a 36,02 a 5,06 a 3,14 a 6,99 a
14- IPR Tangará 3,66 a 3,00 a 4,33 a 15,66 a 12,67 a 18,67 a 4,28 a 4,03 a 4,53 a 29,15 b 29,95 a 28,37 a 4,52 a 3,77 a 5,29 a
15- Diamante Negro 2,66 a 2,00 a 3,33 b 11,41 b 7,50 a 15,33 a 4,25 a 3,83 a 4,67 a 20,4 d 22,01 b 18,81 b 2,29 a 1,68 a 2,91 a
16- Jalo Precoce 2,16 a 1,67 a 2,67 b 7,16 b 6,00 a 8,33 a 3,52 b 3,78 a 3,27 a 32,8 a 36,51 a 29,09 a 2,32 a 2,07 a 2,59 a
17- G 4000 4,66 a 4,33 a 5,00 a 20,33 a 17,00 a 23,67 a 4,36 a 3,85 a 4,87 a 19,94 d 20,31 b 19,58 b 4,01 a 3,38 a 4,66 a
18- DOR 364 3,33 a 3,00 a 3,67 b 13,83 b 11,67 a 16,00 a 4,31 a 4,33 a 4,31 a 24,84 c 26,27 b 23,43 b 3,47 a 3,19 a 3,75 a
19- G 2333 3,66 a 4,00 a 3,33 b 19,33 a 17,67 a 21,00 a 5,48 a 4,67 a 6,31 a 26,8 b 29,61 a 24,00 b 5,05 a 5,09 a 5,02 a
20- BRS Esplendor 4,16 a 3,67 a 4,67 a 21,33 a 19,33 a 23,33 a 5,11 a 5,28 a 4,95 a 20,19 d 21,05 b 19,34 b 4,19 a 3,93 a 4,47 a
M édia das Parcelas 3,68 3,28 B 4,08 A 15,34 13,41 B 17,28 A 4,18 4,06 A 4,31 A 26,61 27,59 A 25,63 B 3,943 3,56 B 4,33 A
Valores médios seguidos por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si para genótipos e valores médios com diferentes letras
maiúsculas na linha diferem entre si para as doses de P pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade.
87
A característica número de semente por vagem não teve efeito de dose de P e, as
parcelas com aplicação das doses controle e restritiva apresentaram valores
aproximados, respectivamente, de 4,31 e 4,06 sementes por vagem, apresentando uma
redução de 5,8%. Foi observado efeito do genótipo influenciando a característica, sendo
que, os genótipos com melhor e pior desempenho médio foram o G 2333 e IAC
Alvorada, apresentando, respectivamente, 5,48 e 3,29 sementes por vagem. Os melhores
genótipos nas parcelas com a dose restritiva foram BRS Esplendor, IAC Imperador e
IAC Diplomata, nas parcelas com aplicação da dose controle os melhores desempenhos
foram dos genótipos G 2333 e BAT 477 (Tabela 10).
A característica massa de cem sementes sofreu influência tanto das doses de P
como do genótipo, no entanto, foi observado 7,10% a mais de massa de sementes na
parcela que recebeu a menor dose de P, sendo os valores médios das parcelas com dose
restritiva e controle, respectivamente, de 27,59 e 25,64 g. Avaliando a produtividade e a
qualidade de semente do cultivar Carioca Precoce submetidos a 6 níveis de adubação de
P o estudo de ZUCARELI et al., (2011) mostrou que as doses de P aplicadas não
influenciaram na massa de cem sementes e tão pouco na qualidade fisiológica, no
entanto, houve um aumento linear da produtividade em função da dose de P aplicada .
Os autores enfatizam que em situação de deficiência nutricional as plantas tendem a
ajustar a produção de sementes aos recursos disponíveis, sem prejudicar o vigor das
mesmas. Para essa característica os genótipos que apresentaram maior desempenho
médio, em ambas as condições de adubação com P, com valores superiores a 32g,
foram: IAC Alvorada, Pérola e Jalo Precoce e, os genótipos com menor massa de cem
sementes foram Diamante Negro, IAC Carioca Tybatã e IAC Diplomata (Tabela 10).
Na condição de aplicação da dose restritiva de P, os genótipos Jalo Precoce, IAC
Alvorada e BRS Estilo apresentaram os maiores valores, respectivamente, 36,51; 35,07
e 32,41 g. Na parcelas com a dose controle os genótipos que apresentaram os maiores
valores foram os cultivares comerciais de tegumento carioca Pérola, IAC Alvorada e
IAC Imperador, com valores médios de 36,01; 31,91 e 31,47 g (Tabela 10).
Em relação à produtividade de grãos foram observadas diferenças estatísticas
apenas para o fator dose de P. A produtividade média das parcelas que recebeu a dose
restritiva e controle foi respectivamente de 3,56 e 4,33 g por planta, ou seja, a dose
restritiva de P reduziu a produtividade em 17,78%. A produtividade de grãos apresentou
uma variação média de 5,06 a 2,29 g.planta -1, sendo que, os genótipos com os melhores
desempenhos em ambas as condições da aplicação de doses de P, foram IAC Imperador,
88
Pérola e G 23333 e, os genótipos que apresentaram os piores desempenhos foram
Diamante Negro, Jalo Precoce e SEA 5. Na condição de restrição do P a produtividade
variou de 5,17 a 1,68 g, sendo os melhores resultados alcançados pelos genótipos IAC
Formosos, G 23333, IAC Carioca Tibatã e IAPAR 81. Na dose controle, a
produtividade variou de 6,98 a 2,58 g e os genótipos com os melhores desempenhos
foram Pérola, IAC Imperador, IPR Tangará (Tabela 10).
Pela tabela de análise de Regressão linear simples entre as características
conteúdo de P nas folhas e produtividade de grãos nas parcelas com restrição de P, não
foi possível verificar correlação significativa entre os caracteres, no entanto, foi possível
constatar que o genótipo BAT 477 além de apresentar o maior conteúdo de P nas folhas
apresentou também alta produtividade. Nas parcelas com a dose controle, verificou-se
correlação positiva, ou seja, uma tendência de maior produtividade de grãos
correlacionado ao maior conteúdo de P foliar, sendo os genótipos Pérola e G 2333 os
que apresentaram maiores valores para ambas as características (Figura 2).
Déficit Controle
7
4 13
19 Y = 2,163 + 0,635 x R²= 28,29
5.0
5
6
20
4.0
1
Produtividade
Produtividade
14 14
9 19
5
6 11
3.5
4 17
12 2
10
18 17 20
13
3.0
1
3 8
4
11
6
2.5
18 7
3 12
8
16
2.0
15
9
15 16
Conteúdo de P Conteúdo de P
89
ambas as doses de P aplicadas, sendo eles: IAC Formoso, G 2333, IAC Carioca Tybatã,
IAPAR 81, IAC Imperador, Esplendor e IPR Tangará. SILVA et al., (2014) observaram
resultados similares classificando os mesmos genótipos de acordo com a eficiência ao
uso do P em solução nutritiva, foram classificados ainda cinco genótipos como
eficientes e responsivos: IAPAR 81, Carioca Comum, IAC Carioca Tybatã, IAC
Imperador e G 2333, ou seja, quatro destes apresentando resultados em comum. O
genótipo BAT 477, classificado como Eficiente e Não Responsivo, além de apresentar
um bom desempenho produtivo nas parcelas com a dose restritiva de P, apresentou
melhor desempenho quanto aos caracteres do sistema radicular.
OLIVEIRA et al., (2012) classificaram 19 genótipos de feijoeiro em Latossolo
Vermelho-Amarelo Distrófico com baixo nível de P, adubados com 20 e 120 kg de
P2O5, esses autores também verificaram variabilidade entre os genótipos e identificaram
cinco destes como eficientes e responsivos: IAC-Una, IPR-Saracura, IPR-Juriti, IAC-
Centauro e IPR-Corujinha.
Produtividade (g/planta)
7
13
IR ER
5
6
1 14
19
Alto P
11
17 10
20 4
2
4
8 18 6
7
12
3
3
15 INR ENR
9
16
Baixo P
90
4. Conclusões
5. Referências Bibliográficas
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período das águas 1 Phosphorus on the productivity and seed quality of bean
Carioca Precoce cultivated during the rainy season, 32–38.
93
Capítulo 4
Análise do Transcriptoma de Plantas de Feijoeiro Comum (Phaseolus
vulgaris L) Quanto a Eficiência do Uso do Fósforo.
RESUMO
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é um alimento de grande importância nas
regiões tropicais, onde a maioria da produção ocorre em pequenas propriedades com
baixo emprego tecnológico e, consequentemente maior vulnerabilidade aos estresses
abióticos como os estresses nutricionais, sendo o fósforo o nutriente mais limitante para
o crescimento da cultura nessas regiões. Assim, esse estudo teve como objetivo
caracterizar os perfis de expressão gênica dos genótipos de feijoeiro comum IAC
Imperador e DOR 364, previamente classificados como Eficiente e Ineficiente quanto
ao uso do P, utilizando a tecnologia de sequenciamento de transcritos RNAseq. As
plantas foram cultivadas em hidroponia, com aplicação de duas concentrações de P,
dose restritiva e dose controle (4,00; 8,00 mg L-1). O delineamento experimental foi um
fatorial 2X2, sendo o primeiro fator constituído pelo tratamento dose de fósforo e o
segundo fator pelos dois genótipos, com nove repetições. Seis repetições foram
coletadas no estádio de florescimento (R6) para a realização das análises dos caracteres
agronômicos e para a extração do RNA do sistema radicular, as outras três replicatas
foram conduzidas até a produção de grãos. Os perfis de expressão gênica foram obtidos
a partir de 12 amostras únicas e as análises de mapeamento genômico realizadas contra
o genoma do feijoeiro disponível base de dados Phytozome v.9.1. A análise de
expressão diferencial foi realizada primeiramente com a contagem bruta dos reads,
seguido da normalização dos dados e correção FDR utilizando o pacote
R/Bioconductor. Os contigs diferencialmente expressos foram anotados tendo como
referência a base de dados NCBI utilizando a ferramenta blastx, a classificação
funcional foi realizada utilizando o programa Blast2GO, além da Análise de
Enriquecimento (por teste de Fisher – Fisher 2-Tailed) para vias metabólicas
enriquecidas. As análises dos caracteres agronômicos evidenciaram a superioridade do
genótipo IAC Imperador. Foram mapeados 99,2% dos reads no genoma de referência, e
do total aproximado de reads únicos, 193 milhões foram observados no tratamento com
restrição do P e 180 milhões na condição controle. Em relação ao tratamento com
restrição do P foram associados 21725 termos GO, sendo distribuídos num percentual
de 0,04; 59,97 e 39,98% nas categorias funcionais componentes celulares, função
94
molecular e processos biológicos. No tratamento controle foram associados 7876 termos
GO, distribuídos num percentual de 89,02%, 10,74% e 0,22% para respectivamente
processos biológicos, função molecular e componente celular. Foi possível verificar
diferença no perfil de expressão gênica entre os genótipos em ambos os tratamentos,
sendo possível identificar 3217 genes diferencialmente expressos no genótipo IAC
Imperador e 15 genes diferencialmente expressos no genótipo DOR 364, considerando
as condições controle e de restrição do P.
95
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a food of great importance in the tropics,
where most of the production takes place on small farms with low technologic and
therefore more vulnerability to abiotic stresses such as nutritional stress, being the
phosphorus the most limiting nutrient to the growth of crops in those regions. Thus, this
study aimed to characterize the profiles of gene expression of common bean genotypes
IAC Imperador and DOR 364, previously classified as Efficient and Inefficient in
regarding of P use efficiency, using RNAseq transcripts sequencing technology. The
plants were grown in hydroponics, applying two concentrations of P, dose control and
restrictive dose (8.00; 4,00mg L-1). The experimental design was an 2x2 factorial, with
P dose treatment as the first factor and the two genotypes as the second factor, with nine
replications. Six replicates were collected at the flowering stage (R6) to carry out the
agronomic traits analysis and to for RNA extraction from the root system, the other
three replicates were conducted until grain production. Gene expression profiles were
obtained from 12 single samples and the genomic mapping analyzes were realized
against the common bean genome available on the Phytozome V.9.1 database. The
differential expression analysis was performed first with the gross count of reads,
followed by normalization of the data and FDR correction using the R / Bioconductor
package. The differentially expressed contigs were annotated having as reference the
NCBI database, using the blastx tool and the functional classification was performed
using the program Blast2GO, beyond Enrichment Analysis (by Fisher test - Fisher's 2-
Tailed) for enriched metabolic pathways. The analysis of agronomic traits showed the
superiority of the genotype IAC Imperador. It was verified that 99.2% of reads were
mapped on the reference genome, and approximately 193 million unique reads were
observed in the treatment with P restriction and 180 million in the control condition.
Regarding the treatment with P restriction were associated 21725 GO terms, being
distributed in a percentage of 0.04; 59.97 and 39.98% in the functional categories
cellular components, molecular function and biological processes. In the control
treatment were associated 7876 GO terms, distributed a percentage of 89.02%, 10.74%
and 0.22% respectively for biological processes, molecular function and cellular
component. It was possible to verify differences in gene expression profile between
genotypes in both treatments, identifying 3217 genes differentially expressed in the
96
genotype IAC Imperador and 15 differentially expressed genes in the genotypes DOR
364, considering the treatments control and P restriction.
97
1. Introdução
98
de variedades de feijão capazes de adquirir fósforo de ambientes com solos limitantes,
sendo essa capacidade atribuída á variabilidade genética.
É sabido que a restrição do P reduz rapidamente as taxas de crescimento da
planta. No entanto, a demanda de P nos tecidos e as respostas quanto à disponibilidade
do elemento variam muito entre genótipos. A deficiência do P altera a bioquímica
celular, a alocação de biomassa e a morfologia radicular para atender as exigências de P
da planta. As respostas típicas das plantas à restrição do nutriente incluem a
remobilização, a redução ou a substituição do P em compostos celulares não essenciais,
a exsudação de metabolitos e enzimas para a rizosfera, e alterações na morfologia da
raiz, podendo ocorrer associações com microrganismos para aumentar a eficiência de
aquisição do P a partir do solo (WHITE & HAMMOND, 2008).
Para compreender a relação entre o genoma e do funcionamento das células, têm
se procurado estudar os produtos do genoma, as proteínas e RNAs expressos, com o
intúito de preencher a lacuna do entendimento do código genético, das moléculas
funcionais presentes nas células e os diferentes perfis de expressão gênica. Assim, a
comparação de transcriptomas de diferentes tipos de células, tecidos e condições
fornece uma compreensão mais profunda do que constitui um tipo específico de célula e
como as mudanças na atividade transcricional pode refletir ou contribuir para a ativação
ou repressão de genes em vários tipos de células e tecidos (ADAMS, 2008).
HERNÁNDEZ et al., (2007), estudando a genômica funcional de plantas de
feijoeiro submetidas a uma redução no suplemento de P de 1 mM to 5 mM P e coletadas
3 semanas após a indução do estresse, obtiveram um perfil de transcrição do sistema
radicular do genótipo Negro Jampa 81 através de análises de macroarranjos. Do total de
2212 unigenes das bibliotecas de cDNA de raiz sob deficiência, 126 sequências
apresentaram expressão diferencial em resposta ao P. Assim, os autores identificaram
uma série de genes candidatos, com funções diversas na adaptação das plantas de feijão
à deficiência de P, contribuindo para aumentar o rol de informações sobre a regulação e
sobre as vias de sinalização durante a deficiência do nutriente.
Em 2014 SCHMUTZ et al. disponibilizaram a primeira versão V1.0 da escala
cromossômica de feijoeiro comum na plataforma de dados genômicos de plantas
“Phytozome”, resultado do projeto de cooperação USDA-NIFA "Um mapa seqüência
do genoma para melhoramento do feijão" a fim de facilitar os estudos de genômica
comparativa. Esta versão inclui bibliotecas de cromossomos artificiais bacterianos
(BAC), sequências finais fosmidios e um mapa denso, saturado com 7.015 marcadores.
99
Foram montados 473 Mb do genoma de 587 Mb e 98% dessas sequências foram
ancoradas aos 11 cromossomos da escala, para tal foram utilizados o sequenciamento
de 60 indivíduos selvagens e 100 variedades crioulas dos conjuntos gênicos
mesoamericano e andino. Além disso, o banco de dados fornece livre acesso ao genoma
sequenciado e anotado, facilitando os estudos de mapeamento da espécie e de anotação
funcional.
Segundo HIZ et al., (2014) recentes abordagens em relação ao estudo do perfil
de expressão gênica em larga escala têm se mostrado como uma importante ferramenta
para entender como as plantas respondem à estresses bióticos e abióticos. Os autores
relatam que, apesar do acúmulo de informações de dados de sequenciamento de
transcritos de plantas modelos e de culturas agronomicamente importantes, ainda há
poucos estudos sobre a análise de transcriptoma sob condições de estresse abióticos
nestas espécies, sendo os estudos mais abordados os de efeitos da seca e estresse salino
em perfil de expressão gênica. Os autores ainda mencionam que apresar de ainda não
haver disponível análise do transcriptoma do feijoeiro sob estresse abiótico, as análises
de sequências de RNA de nova geração irão fornecer informações valiosas tanto para a
identificação e clonagem de genes de tolerância ao estresse a fim de serem utilizadas
como ferramenta ao melhoramento de variedades com aprimorados mecanismos de
tolerância.
Assim, esse trabalho teve como objetivo avaliar os genótipos de feijoeiro comum
previamente classificados como eficiente e ineficiente ao uso do P, IAC Imperador e
DOR 364 tanto para os cracteres agronômicos das plantas cultivadas em hidroponia com
e sem restrição do P, quanto para os perfis de expressão gênica do sistema radicular pela
tecnologia de sequenciamento de transcritos RNAseq.
2. Material e Métodos
100
O delineamento experimental utilizado foi um fatorial 2 x 2, sendo o primeiro
fator constituído pelas duas doses de fósforo e, o segundo fator, constituído pelos dois
genótipos, com nove repetições. No estádio de florescimento pleno (R6) foram
coletadas três plantas para a obtenção dos perfis de expressão gênica e três plantas para
as análises dos caracteres de parte aérea e do sistema radicular, as outras três repetições,
foram conduzidas até a produção de grãos.
As plantas foram conduzidas em vasos de 3,5 L preenchidos com areia de filtro,
sendo cultivadas em sistema hidropônico. A solução nutritiva utilizada nos dois
tratamentos foram preparadas com água deionizada, sendo composta de 143,0 mg L-1 de
N; 132,5 mg L-1 de K; 121,0 mg L-1 de Ca; 25,5 mg L-1 de Mg; 33,0 mg L-1 de S; 1,81
mg L-1 de Fe; 0,45 mg L-1 de Cu; 0,18 mg L-1 de Zn; 0,45 mg L-1 de Mn; 0.45 mg L-1 de
B; 0,09 mg L-1 de Mo e 0,09 mg L-1 de Ni. Os tratamentos com P constaram de 4,00 e
8,00 mg L-1 de P. As plantas foram irrigadas com solução “meia força”, ou seja, com a
metade da concentração total na primeira quinzena após instalação do experimento.
Foram aferidos diariamente a condutividade elétrica, mantida entre 1,8 a 2,0 mS cm-1 e
o pH da solução nutritiva mantido próximo a 5,8.
Aos 41 DAT, quando foi atingido o estádio de florescimento (R6) foram
realizadas as coletas de três repetições para a avaliação dos seguintes caracteres
agronômicos: altura de planta; número de nós por planta; área foliar; massa fresca e seca
de folhas, caule e raízes; área superficial, comprimento, volume total e diâmetro de raiz
e análise química foliar. Outras três repetições foram coletadas para a obtenção do perfil
de expressão gênica do sistema radicular, por meio de lavagem do substrato
delicadamente com água corrente, sendo a raiz imediatamente congelada em nitrogênio
líquido e armazenada em ultra freezer (-80 °C).
Para a avaliação dos caracteres agronômicos, as três repetições foram separadas
entre parte aérea e raiz. A da área foliar total (cm2) foi determinada utilizando-se um
integrador de área - Modelo LI-3100C – LI-COR. Essas mesmas plantas foram
utilizadas para avaliação da massa seca de parte aérea, sendo fracionadas em folha e
caule e pesadas em balança de precisão. Para obtenção da massa seca, as amostras
foram secas em estufa de circulação forçada de ar com temperatura de 60 °C, até atingir
peso constante.
O sistema radicular, depois da lavagem e retirada do substrato, foi avaliado
quanto ao comprimento total (cm), a área superficial (cm2), o volume (cm3), diâmetro
(mm) e massa seca (g). As imagens das raízes de cada planta foram obtidas em scanner
101
LA2400 (EPSON) e as características de raiz foram calculadas por meio da utilização
do software WinRHIZO® (Regent Instruments Inc., Quebec, Canada).
Para determinar os teores de nutrientes da parte aérea, raiz e dos grãos, amostras
de 1,0 g de tecido seco e moído, foram submetidas à digestão nítricoperclórica para
extração de K, Ca e Mg. Nos extratos, os teores desses nutrientes foram determinados
por espectrofotometria de absorção atômica. Para determinação do N total e P, amostras
de 0,2 g do tecido foliar foram submetidas à digestão sulfúrica. O N total foi
determinado por destilação e o P por espectrofotometria UV-VIS (MALAVOLTA et
al., 1989).
Os componentes de produção avaliados foram: número de vagens por planta
(NVP); número de sementes por vagem (NSV); massa de cem sementes em gramas
(MCS) e produtividade de grãos em g planta-1 (PG).
Em que,
CONTPT: Conteúdo de fósforo total;
CONTPPA: Conteúdo de fósforo de parte aérea;
102
CONTPG: Conteúdo de fósforo no grão;
MSR: Massa seca de raiz;
MSPA: Massa seca de parte aérea;
MST: Massa seca total;
MSG: Massa seca de grãos
Cada amostra foi macerada e cerca de 100 mg foram utilizadas para extração dos
RNAs totais pelo método de extração TRIzol® Reagent (CHOMCZYNSKI & SACCHI,
1987). Para determinar a concentração dos RNAs, as amostras foram quantificadas em
Nanodrop 2000 a uma densidade óptica de 280nm e avaliadas quanto à pureza através
da verificação da relação 260/280 com valores entre 1,8 e 2. A integridade das amostras
foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1% a 70 v por 50 min e os
produtos visualizados através de coloração das bandas de RNA com SYBR® Safe (1x)
e obtenção de imagem em transiluminador U.V. a 280 nm.
As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Biotecnologia Animal da
ESALQ/USP, onde foram novamente quantificadas no equipamento Bioanalyser
(Agilent) e ajustadas a uma concentração de 500 ng/μL. As bibliotecas foram
preparadas com a utilização do kit TruSeq RNA Sample Prepv2 Low Throughput (LT)
da Illumina® de acordo com o fabricante. O método consiste no preparo das
bibliotecas “paired-end” do DNA genômico (gDNA) para a subsequente geração dos
“clusters” e o sequenciamento do DNA com a adição de adaptadores nas extremidades
dos fragmentos de DNA para gerar sequências únicas de leitura ‘indexed single read”
ou bibliotecas de sequenciamento paired-end “paired- end sequencing libraries”.
Assim, após o ajuste da concentração, as amostras de RNA total foram
purificadas e o RNA mensageiro foi isolado através da ligação entre a extremidade poli-
A do mRNA às moléculas poli-T ligadas a beads magnéticas, sendo posteriormente
eluídas e fragmentadas. Os cDNAs foram sintetizados por reação de trascriptase reversa
e, as extremidades da dupla fita do cDNA foram adeniladas, ou seja, foram adicionadas
uma adenina às extremidades 3’ da molécula, que além de evitar a formação de dímeros,
é complementar á timina da extremidade 3’ dos adaptadores, que foram então
103
adicionados. Após preparo das amostras, procedeu-se o sequenciamento no
equipamento Hiseq 2500 da Illumina®.
Análise de dados
Pré-processamento e montagem
A etapa de obtenção dos dados brutos foi realizada utilizando o software CASAVA
1.8.2 fornecido pela Illumina, que faz o base call dos dados brutos e os transforma em
reads no formato fastq acompanhados dos scores de qualidade phred. Os reads foram
visualizados utilizando o programa FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/).
A filtragem dos reads de baixa qualidade, sequências de adaptadores e vetores foi
realizada pelo programa Seqyclean (https://bitbucket.org/izhbannikov/seqyclean),
utilizando como cutoff bases com qualidade inferior a 24 QScore. A bases de dados de
contaminantes usada foi a Univec (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html).
Após filtragem, reads com comprimento inferior a 65pb foram removidos.
Mapeamento
O mapeamento das amostras foi feito contra o genoma de Phaseolus vulgares
(Pvulgaris 218 v1.0) da base de dados Phytozome v.9.1. Para o mapeamento foi utilizado o
programa Bowtie2 v2.1.0 (LANGMEAD & SALZBERG, 2012), com a seguinte linha de
comando:
bowtie2 --very-sensitive-local -x Phaseolus_index -1 seqyclean_PE1.fastq -2
seqyclean_PE2.fastq -S mapping.sam
104
huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/index.html) para extração de contagens brutas dos
reads.
Após obtenção das contagens, os grupos foram analisados usando o script dentro do
programa DESeq2 (Love et al 2014), um pacote do R/Bioconductor (GENTLEMAN, et al
2004). Dentro do programa DESeq2 os dados foram normalizados pelo tamanho das
bibliotecas. Em seguida, as contagens normalizadas dos gens que passaram na filtragem
foram analisadas segundo um modelo linear generalizado (GLM) para obtenção do
log2foldchange. Sobre o teste foi aplicada a correção de FDR- Benjamini-Hochberg
(BENJAMINI & HOCHBERG, 1995) para múltiplos testes a fim de evitar os erros tipo I,
ou seja, os falso positivos.
Os contigs foram alinhados contra uma seleção da base de dados NCBI não-
redundante (nr, data: 12/11/2013) utilizando o subgrupo de proteínas da base de
greenplant (agosto/2014). Para isso foi utilizado o programa blastx com o cut-off de 1e-
10 (ALTSCHUL et al, 1990; CAMACHO et al., 2009). A anotação funcional dos
termos de ontologia gênica (GO) e seus derivados foi e realizada utilizando o programa
Blast2GO - b2g4pipe v2.5 (CONESA et al., 2005) a partir de 20 hits do Blast para cada
contig. O teste de enriquecimento foi feito pelo no próprio B2GO usando o teste exato
de Fisher e considerando apenas as categorias com FDR < 0.05. Foram utilizados como
background os genes que passaram pela filtragem do baseMean >5 de cada análise de
expressão diferencial.
3. Resultados e discussões
105
tratamento que recebeu a dose restritiva, exceto para a característica diâmetro médio de
raiz, apresentou maior desenvolvimento que o tratamento controle. Em relação aos
genótipos, não foi possível verificar diferenças estatísticas para a característica diâmetro
médio de raiz (Tabela 1). Além disso, o genótipo IAC Imperador apresentou melhor
desempenho no desenvolvimento do sistema radicular que o genótipo DOR 364,
apresentando uma produção de 27,97; 27,55; 26,64 e 40,15% a mais nas características
comprimento de raiz, área superficial, volume radicular e massa seca de raiz.
É sabido que uma resposta comum das plantas em relação à deficiência de P é o
aumento do tamanho do sistema radicular em relação à parte aérea. Assim, a taxa de
formação da parte aérea normalmente diminui com o aumento do crescimento da raiz,
aumentando assim, a relação raiz/parte aérea. (LYNCH E BROWN, 2008). Nesse
experimento foi observado que, as plantas cultivadas em condição de restrição do
fósforo apresentaram uma relação raiz parte aérea maior que as plantas cultivadas na
condição controle, respectivamente de 0,186 e 0,094 e o genótipo eficiente IAC
Imperador apresentou uma relação de 0,160, superior que à apresentada pelo genótipo
DOR 364, de 0.121.
Em relação aos componentes de produção, as análises de variâncias mostraram
que só foi possível verificar diferença estatística para o fator dose de fósforo na
característica produtividade de grãos. No entanto, para o fator genótipos, foi possível
verificar diferenças altamente significativas (P>0,01) para todos os caracteres avaliados,
exceto para número de sementes por vagem. As análises também não identificaram
diferenças estatísticas para a interação dose de P x genótipos para os caracteres de
produção, o que nos remete à estabilidade dos genótipos aos tratamentos impostos
(Tabela 1).
106
Tabela 1. Resumo da análise de variância dos caracteres de parte aérea, do sistema
radicular e dos componentes de produção dos genótipos de feijoeiro IAC Imperador e
DOR 364, cultivados em hidroponia em condição de restrição do fósforo e em condição
controle.
Quadrado Médio - Parte aérea
FV. GL
AF MSF MSRAM ALT NÓS
Dose de P 1 56650111** 72.39** 114.56** 8164** 8.333**
Genótipos 1 2109247 84.85** 9.13 61 0.000
Dose de P x Genótipos 1 931304 15.52* 14.83 252 0.333
Resíduo 8 1861100 2.00 3.02 493 0.500
CV% 13.60 15.81 11.99 15.67 4.61
Quadrado Médio - Sistema Radicular
FV. GL
CR ASR VR DIAM MSR
Dose de P 1 65853831 279200 1.3 0.00121 1.26
Genótipos 1 389862011** 4831724** 370.1** 0.0000002 6.98**
Dose de P x Genótipos 1 27381 578 0.3 0.000046 0.17
Resíduo 8 15442839 261722 30.9 0.0003814 0.33
CV% 11.2 12.9 15.37 5.44 18.78
Embora não tenham sido detectadas diferenças estatísticas para o fator dose de
P, todas as características dos componentes de produção apresentaram maior incremento
da característica com o incremento da dose fornecida. Também ficou evidente a
superioridade do genótipo IAC Imperador, pois apresentou desempenhos de 62,8;
61,97; 2,34; 11,84 e 66,19 % superiores que DOR 364, respectivamente para as
características número de vagens, número de sementes, número de sementes por vagem,
massa de cem sementes e produtividade de grãos.
108
O Índice de Eficiência da utilização do P na parte aérea revelou, com diferença
altamente significativa, uma maior utilização do elemento no tratamento com dose
restritiva, sendo 31,45% maior que no tratamento que recebeu dose controle, isso se
explica provavelmente pela maior ativação de genes de respostas ao estresse, e a relação
de menor produção de massa seca de parte aérea em relação ao maior conteúdo de P na
parte aérea na condição de estresse. Em relação aos genótipos, IAC Imperador
apresentou o melhor índice de utilização de parte aérea, equivalente a 0,48; enquanto o
genótipo Dor 364 apresentou um índice de 0,39, esses resultados se mostram coerentes,
uma vez que o genótipo IAC Imperador foi o genótipo que mais produziu massa seca de
parte aérea em ambas as condições.
Resultado semelhante foi observado para o Índice de Eficiência da utilização do
P total, havendo também uma maior utilização total do elemento pelas plantas que
receberam a dose restritiva, apresentando 34,48% a mais do que a dose controle. O
genótipo IAC Imperador mostrou-se mais eficiente também na utilização do P total,
apresentando um índice de 0,53, enquanto o genótipo Dor 364 apresentou índice de
0,43.
A análise de variância referente ao Índice da Eficiência e utilização do P da parte
aérea para a formação do grão apresentou diferença estatística para as doses de P e
genótipo. O tratamento que recebeu a dose restritiva de P apresentou maior índice
EUPGA, de 1,55 enquanto o tratamento controle apresentou índice de 1,01. O genótipo
IAC Imperador, mais produtivo em ambos os tratamentos, apresentou um índice de
1,89, quase três vezes maior que o índice do genótipo DOR 364, que foi de 0,66.
Para o Índice de colheita de P, foi possível verificar diferença altamente
significativa para as doses de P aplicadas, sendo que os tratamentos com dose restritiva
e controle apresentaram, respectivamente, índices de 9,59 e 5,01. Esse resultado implica
no maior acúmulo de P nos grãos dos tratamentos estressados, ou seja, nos tratamentos
em que foi observado menor produtividade de grãos. Houve também diferença
significativa para os genótipos, sendo o DOR 364 o genótipo que apresentou maior
índice de colheita do nutriente, de 8,51, enquanto o genótipo mais produtivo IAC
Imperador apresentou menor índice de colheita do P, de 6,09.
Sequenciamento
O sequenciamento das bibliotecas gerou aproximadamente 450 milhões de
sequências “paired reads” e após a filtragem dos reads de baixa qualidade, ou seja, após
109
a limpeza das sequências de adaptadores e vetores e de reads que apresentaram
tamanhos inferiores a 56pb, o total de reads filtrados foi de aproximadamente 400
milhões de sequências, das quais 207 milhões de reads foram provenientes das
bibliotecas que receberam a restrição do P e 193 milhões foram obtidas do tratamento
controle (Tabela 3).
Foram mapeados aproximadamente 396 milhões de reads no genoma do feijão
utilizado como referência (Pvulgaris 218 v1.0) da base de dados Phytozome v.9.1, desse
total de reads mapeados, cerca de 382 milhões foram alinhados, ou seja, em média
99,2% dos pares de reads foram mapeados na mesma região cromossômica do genoma
de referência. Como foi observada uma alta taxa de mapeamento dos reads, conferindo
boa precisão experimental, procederam-se as análises de expressão diferencial
utilizando os reads que alinharam apenas uma vez, ou seja, que mapearam em apenas
uma região do genoma sem ambiguidade. Do total aproximado de 373 milhões de reads
únicos, 193 milhões foram observados no tratamento com restrição do P e 180 milhões
na condição controle (Tabela 3).
Alinhamento e Anotação
A anotação funcional das sequências únicas que apresentaram expressão
diferencial foram realizadas por meio de buscas de proteínas ortólogas utilizando o
programa BLASTx do banco de dados do NCBI, com teste de enriquecimento
considerando FDR < 0.05. O alinhamento desses unigenes contra o banco de dados de
110
proteínas e a busca de domínios funcionais foi realizado. Assim, as sequências dos
unigenes diferencialmente expressos foram associadas à proteínas com GO previamente
anotadas, ou seja, apresentaram similaridade com proteínas de ontologia gênica
conhecida.
A partir do alinhamento dos 29828 unigenes foram então identificados pelo
BLASTx cerca de 20 mil genes, ou seja, 66,5% dos unigenes foram anotados,
apresentando similaridade com GO conhecidos; 3% dos unigenes apresentaram
similaridade com proteínas não conhecidas, 26,5% das sequências não foram mapeadas
e em 4% dos unigenes não houve alinhamento (Figura 1). Assim, havendo similaridade
dada pelo BLAST, transferem-se os termos associados à proteína anotada à sequência
em estudo.
111
pela tecnologia RNAseq os padrões de expressão gênica de 24 amostras coletadas de
setes tecidos e em diferentes fases do desenvolvimento submetidos a três tratamentos
com o fornecimento de nitrogênio associado à Rhizobium tropici e Rhizobium Giardini.
Assim, os autores identificaram 11.010 genes diferencialmente expressos entre os
diferentes tecidos e no mesmo tempo de coleta, 15.752 genes diferencialmente
expressos dentro de um mesmo tecido nas diferentes fases de desenvolvimento, 2.315
genes expressos apenas em um único tecido e 2.970 genes com padrões de expressão
que parecem ser diretamente dependente da fonte de nitrogênio disponível.
Em relação ao enriquecimento das sequências, foram atribuídos os termos GO,
ou seja, as informações relativas à ontologia gênica aos genes anotados. Assim, foram
identificados 86785 termos GO relacionados às 29828 sequências alinhadas. Devido a
alguns desses genes apresentaram mais de uma categoria funcional, mais de um termo
GO pode ser atribuído à uma sequência. Os termos GO associados aos unigenes foram
categorizados em três categorias funcionais principais, sendo: componentes celulares,
função molecular e processos biológicos.
Em relação ao tratamento com restrição do P foram associados 21725 termos
GO, sendo distribuídos num percentual de 0,04; 59,97 e 39,98% nas categorias
funcionais componentes celulares, função molecular e processos biológicos. No
tratamento controle foram associados 7876 termos GO, sendo a categoria função
molecular a categoria a apresentar maior representatividade, com 89,02%, seguida pela
categoria processos biológicos, com 10,74% e finalmente a categoria componentes
celulares com uma pequena participação, 0,22% (Figura 2). A realização da anotação
nos faz inferir que na condição de restrição do P houve 63,75% a mais de atribuição de
termos de ontologia gênica, havendo uma participação mais efetiva de genes das
categorias funcionais função molecular e processos biológicos como resposta ao
estresse, já na condição controle 89% dos unigenes anotados foram da categoria
funcional função molecular.
PATEL et al, (2014) pela técnica RNAseq avaliaram 20,4 milhões de reads
únicos do banco de dados NCBI, desses reads 6.999 foram mapeados no genoma do
feijoeiro, identificando 1.679 genes conhecidos, dos quais, apenas 629 unigenes foram
anotados. Realizando a caracterização funcional, foram atribuídos aos 629 genes
anotados 3724 termos de ontologia (GO), sendo agrupados nas três categorias
funcionais GO principais, sendo assim distribuídos: 46,37% Função Molecular, 31,36%
Processo Biológico e 22,26% Componente Celular.
112
Restrição do P Controle
CC FM PB CC FM PB
0% 11% 0%
40%
60%
89%
113
A
114
Figura 4. - Proporção de genes diferencialmente expressos na condição de restrição ao
fósforo. Pontos em azul representam genes diferencialmente expressos e pontos em
vermelho os genes com perfil expressão basais em ambos os tratamentos. À esquerda da
origem do plano estão representados os genes do genótipo IAC Imperador e a direita de
DOR 364.
115
superexpressos dos que foram reprimidos em cada genótipo avaliado. Ainda nessa figura, é
possível observar a alta fidelidade entre as bibliotecas referentes às repetições biológicas e
similaridade entre o perfil de expressão entre os genes analisados.
116
subcategorias foram obtidas, dos quais obeservou-se maior participações das funções:
processos metabólicos (13%), processo metabólico de um único organismo (7%),
resposta à estímulo (5%), processo metabólico de pequenas moléculas (4%), processos
metabólicos de compostos organonitrogenados, processo metabólico do fósforo (4%),
processos metabólicos de compostos fosfatados (4%), resposta à estresse (4%), processo
metabólico oxoácido (3%) e processos metabólicos de ácidos orgânicos(3%) (Figura 6).
Figura 6. Distribuição das subcategorias dos termos de ontologia gênica obtidos dos
genes diferencialmente expressos do genótipo IAC Imperador em condição de restrição
de P dentro das categorias funcionais função molecular e processo biológico.
117
A tabela 4 representa as 20750 sequências (domínios funcionais)
subcategorizadas nos 123 termos de ontologia gênica, seguidos pelo valor da correção
de FDR, a significância estatística dada pelo P-valor e o número de termos que
representam cada subcategoria.
118
48 Response to biotic stimulus PB 1,716E-06 1,165E-08 91
49 Oxidoreductase activity FM 2,246E-06 1,556E-08 197
50 Phosphorus metabolic process PB 2,681E-06 1,895E-08 325
51 Phosphate-containing compound metabolic PB 3,298E-06 2,378E-08 323
52 processbinding
Heme FM 7,298E-06 5,366E-08 62
53 Flavonoid metabolic process PB 9,054E-06 6,785E-08 21
54 Tetrapyrrole binding FM 1,549E-05 1,183E-07 63
55 Cell communication PB 1,592E-05 1,238E-07 145
56 Naringenin-chalcone synthase activity FM 2,076E-05 1,644E-07 8
57 Binding FM 4,726E-05 3,809E-07 914
58 Oxidation-reduction process PB 7,827E-05 6,419E-07 203
59 Phenylpropanoid metabolic process PB 0,0002032 1,695E-06 24
60 Multi-organism process PB 0,0002496 2,117E-06 100
61 Iron ion binding FM 0,0002597 2,239E-06 61
62 Response to karrikin PB 0,0003258 2,856E-06 27
63 Monooxygenase activity FM 0,0004716 4,201E-06 44
64 Secondary metabolic process PB 0,0006687 6,051E-06 31
65 Secondary metabolite biosynthetic process PB 0,0009358 8,6E-06 25
66 Signal transduction PB 0,0009776 9,122E-06 117
67 Oxidoreductase activity, acting on peroxide as FM 0,0010914 1,065E-05 26
68 acceptor reaction
Peroxidase PB 0,0010914 1,065E-05 26
69 Peroxidase activity FM 0,0010914 1,065E-05 26
70 Systemic acquired resistance PB 0,0011344 1,123E-05 13
71 Protein modification process PB 0,0013144 1,338E-05 225
72 Cellular protein modification process PB 0,0013144 1,338E-05 225
73 Pattern binding FM 0,0013436 1,413E-05 22
74 Polysaccharide binding FM 0,0013436 1,413E-05 22
75 Phenylpropanoid biosynthetic process PB 0,0013436 1,445E-05 18
76 Single organism signaling PB 0,0013436 1,463E-05 117
77 Signaling PB 0,0013436 1,463E-05 117
78 Defense response, incompatible interaction PB 0,0013974 1,541E-05 21
79 Antioxidant activity FM 0,0020526 2,315E-05 28
80 Dioxygenase activity FM 0,0020526 2,322E-05 36
81 Endopeptidase regulator activity FM 0,0022312 2,587E-05 9
82 Endopeptidase inhibitor activity FM 0,0022312 2,587E-05 9
83 Regulation of endopeptidase activity PB 0,0034254 4,165E-05 9
84 Negative regulation of endopeptidase activity PB 0,0034254 4,165E-05 9
85 Peptidase inhibitor activity FM 0,0034254 4,165E-05 9
86 Peptidase regulator activity FM 0,0034254 4,165E-05 9
87 Lipid transport PB 0,0044963 5,531E-05 17
88 Response to oxidative stress PB 0,0047486 5,908E-05 52
89 Regulation of peptidase activity PB 0,0050967 6,485E-05 9
90 Negative regulation of peptidase activity PB 0,0050967 6,485E-05 9
91 Response to other organism PB 0,0054172 6,97E-05 70
92 Immune response PB 0,00568 7,388E-05 29
93 Innate immune response PB 0,005925 7,791E-05 28
Oxidoreductase activity, acting on paired donors,
with incorporation or reduction of molecular
94 oxygen, 2-oxoglutarate as one donor, and FM 0,0061461 8,168E-05 27
incorporation of one atom each of oxygen into
both donors
95 Lipid localization PB 0,0061854 8,308E-05 17
96 Immune system process PB 0,0071216 9,666E-05 32
97 Cinnamic acid metabolic process PB 0,0077831 0,0001067 5
98 Negative regulation of hydrolase activity PB 0,010419 0,0001444 9
99 Cellular response to hypoxia PB 0,0115035 0,000161 7
100 Chitin binding FM 0,0117063 0,0001655 6
101 Single-organism biosynthetic process PB 0,0129244 0,0001846 87
102 Macromolecule modification PB 0,0147542 0,0002128 230
103 Response to fungus PB 0,0150197 0,0002187 30
104 Multi-multicellular organism process PB 0,0158321 0,0002373 29
105 Multi-organism reproductive process PB 0,0158321 0,0002373 29
119
106 Pollination PB 0,0158321 0,0002373 29
107 Cellular response to oxygen levels PB 0,0172891 0,000264 7
108 Cellular response to decreased oxygen levels PB 0,0172891 0,000264 7
109 Jasmonic acid and ethylene-dependent systemic PB 0,0198687 0,0003062 4
110 resistance binding
Coenzyme FM 0,0253441 0,0003942 51
111 Defense response by callose deposition PB 0,0256445 0,0004035 9
112 Cellular response to stimulus PB 0,0256445 0,0004061 164
113 Amino sugar metabolic process PB 0,0305558 0,0004882 17
114 Cofactor binding FM 0,0310382 0,0005003 66
115 RNA-directed DNA polymerase activity FM 0,0312351 0,0005079 14
116 Lignin metabolic process PB 0,0329884 0,0005438 15
117 Defense response to fungus PB 0,0329884 0,0005457 24
118 Nutrient reservoir activity FM 0,036145 0,000603 10
119 Cellular response to salicylic acid stimulus PB 0,0364842 0,0006138 11
120 Alkaloid biosynthetic process PB 0,0490308 0,000848 6
121 Phenylalanine ammonia-lyase activity FM 0,0490308 0,0008526 4
122 Cinnamic acid biosynthetic process PB 0,0490308 0,0008526 4
123 Response to indolebutyric acid stimulus PB 0,0490308 0,0008526 4
120
Figura 7. Distribuição das subcategorias dos termos de ontologia gênica obtidos dos
genes diferencialmente expressos do genótipo IAC Imperador em condição de restrição
de P dentro das categorias funcionais função molecular e processo biológico.
121
Pode-se verificar que o genótipo DOR 364 apesar de apresentar 1964 genes
diferencialmente expressos, valor próximo aos 2159 unigenes observados no genótipo
IAC Imperador, foram atribuídos na análise de enquiquecimento 969 termos de
ontologia gênica, ou seja, foram associados 95,3% a menos de domínios funcionais às
sequências desse genótipo, que se mostrou ineficiente ao uso do nutriente em
comparação ao genótipo eficiente IAC Imperador. Assim, é possível verificar na tabela
5 a classificação dos 969 termos em 24 subcategorias de domínios funcionais, seguidos
pelos valores de correção (FDR) e significância estatística (P-valor).
122
análise hierárquica, como a análise de componentes principais demonstrou a alta
confiabilidade do experimento, com o grupamento das replicatas biológicas de mesmo
genótipo (Figura 8).
123
Figura 9. - Proporção de genes diferencialmente expressos na condição controle.
Pontos em azul representam genes diferencialmente expressos e pontos em vermelho os
genes com perfil expressão basais em ambos os tratamentos. À esquerda da origem do
plano estão representados os genes do genótipo IAC Imperador e a direita de DOR 364.
124
Figura 10. Perfil de expressão de 50 genes diferencialmente expressos no tratamento
controle. As bibliotecas de 7-9 representam as replicatas biológicas do genótipo IAC
Imperador e as bibliotecas de10-12 do genótipo DOR 364. Em verde apresentam-se os
genes superexpressos e em vermelho os genes reprimidos.
125
relacionadas aos processos de: resposta à estimulo (36%), resposta à estresse (26%),
oxi-redução (18%), defesa (15%), biossíntese de flavonoides (2%), metabolismo de
flavonoides (2%) e catabolismo de terpenódes (1%) (Figura 11).
Figura 11. Distribuição das subcategorias dos termos de ontologia gênica obtidos dos
genes diferencialmente expressos do genótipo IAC Imperador em condição controle
dentro das categorias funcionais função molecular e processo biológico.
126
do valor de correção FDR, da signifiãncia estatística dada pelo teste P-valor e pelo
número de sequências que compuseram cada sub classe de termos GO atribuídos.
A identificação dos 3623 termos de ontologia gênica para no genótipo DOR 364
resultou na classificação dos mesmos nas três categorias principais e em 37
subcategorias (Figura 12). É interessante observar, que este genótipo dado como
ineficiente, apresentou em ambas as condições a expressão de genes que desempenham
papéis relacionados aos componentes celulares, além disso, também pôde-se observar
que na condição controle o genótipo ativou a expressão de genes de mais categorias
funcionais que o genótipo Eficiente IAC Imperador.
127
Figura 12. Distribuição das subcategorias dos termos de ontologia gênica obtidos dos
genes diferencialmente expressos do genótipo DOR 364 em condição controle dentro
das categorias funcionais função molecular e processo biológico.
128
Tabela 7. Anotação funcional dos genes diferencialmente expressos das bibliotecas
referentes ao genótipo DOR 364 em condição controle.
N° de termos
N Term Categoria FDR P-Value
GO
1 ADP binding F 1,61E-26 2,27E-30 74
2 defense response P 4,22E-13 1,2E-16 89
3 heterocyclic compound binding F 4,04E-06 7,42E-09 321
4 organic cyclic compound binding F 4,69E-06 9,28E-09 321
5 adenyl ribonucleotide binding F 4,24E-05 8,99E-08 160
6 adenyl nucleotide binding F 4,9E-05 1,11E-07 161
7 phospholipid translocation P 0,00045 1,4E-06 8
8 aminophospholipid transport P 0,00045 1,4E-06 8
phospholipid-translocating ATPase
9 F 0,00045 1,4E-06 8
activity
10 phospholipid transporter activity F 0,00045 1,4E-06 8
regulation of membrane lipid
11 P 0,00045 1,4E-06 8
distribution
12 lipid translocation P 0,00045 1,4E-06 8
13 phospholipid transport P 0,00061 2,07E-06 8
14 ribonucleoside binding F 0,001214 4,62E-06 163
15 nucleoside binding F 0,001214 4,64E-06 163
16 purine nucleoside binding F 0,001358 5,76E-06 162
17 purine ribonucleotide binding F 0,001358 5,76E-06 162
18 purine ribonucleoside binding F 0,001358 5,76E-06 162
19 purine nucleotide binding F 0,001859 8,23E-06 163
20 ribonucleotide binding F 0,001859 8,42E-06 163
21 carbohydrate derivative binding F 0,001973 9,21E-06 164
22 cuticle hydrocarbon biosynthetic process P 0,004882 2,35E-05 5
23 anion binding F 0,005188 2,57E-05 177
24 COPII vesicle coat C 0,009898 5,45E-05 6
25 ER to Golgi transport vesicle membrane C 0,009898 5,45E-05 6
26 lipid transport P 0,01005 5,69E-05 11
27 lipid localization P 0,012466 7,58E-05 11
28 binding F 0,014133 8,8E-05 419
29 ER to Golgi transport vesicle C 0,016303 0,000106 6
30 cellular response to hypoxia P 0,023971 0,000163 5
31 response to stress P 0,024793 0,000175 121
32 lipid transporter activity F 0,027845 0,000211 8
33 cellular response to oxygen levels P 0,029268 0,000236 5
34 cuticle development P 0,029268 0,000236 5
cellular response to decreased oxygen
35 P 0,029268 0,000236 5
levels
36 nucleoside phosphate binding F 0,040554 0,000344 179
37 nucleotide binding F 0,040554 0,000344 179
129
Figura 13. A. Análise hierárquica. B. Análise de Componentes Principais. Bibliotecas
de 1-3 representam o Genótipo IAC Imperador na condição de restrição ao P e
bibliotecas de 7-9 na condição controle.
130
Figura 14. Proporção de genes diferencialmente expressos do genótipo IAC Imperador.
Pontos em azul representam genes diferencialmente expressos e pontos em vermelho os
genes com perfil expressão basais em ambos os tratamentos. À esquerda da origem do
plano estão representados os genes do genótipo IAC Imperador sob restrição e a direita
na condição controle.
131
Quadro 1. Seleção dos 25 unigenes candidatos, mais induzidos do genótipo IAC Imperador (ordem decrescente de log2FoldChange). Da esquerda para a direita: gene
id (Phytozome); anotação do gene com base em blastx search utilizando a base de dados de P. vulgaaris (Phytozome) com cutoff de 1e-10; lfcSE (erro padrão);
pvalue, padj.
Expressão
N Unigene Anotação Funcional baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
Relativa
Hydroxyindole-O-methyltransferase and related SAM-
1 Phvul.007G091000 33,249 88,154 5,055 0,421 11,998 0,000 0,000
dependent methyltransferases/protein dimerization activity
Cytochrome P450 CYP2 subfamily/ oxidation-reduction
2 Phvul.002G126200 28,897 70,505 4,853 0,575 8,441 0,000 0,000
process/electron carrier activity
3 XLOC_002913 Sequência nova 25,543 49,207 4,675 0,628 7,449 0,000 0,000
4 Phvul.005G162800 Não anotado 24,253 56,416 4,600 0,467 9,856 0,000 0,000
5 XLOC_002909 Sequência nova 23,380 45,320 4,547 0,612 7,427 0,000 0,000
6 Phvul.009G173900 Não anotado 20,367 131,597 4,348 0,344 12,646 0,000 0,000
7 XLOC_013887 Sequência nova 19,425 130,317 4,280 0,396 10,820 0,000 0,000
Calcineurin-like phosphoesterase/acid phosphatase
8 Phvul.004G032300 17,466 88,602 4,126 0,403 10,242 0,000 0,000
related/hydrolase activity
9 Phvul.003G144700 Não anotado 15,730 340,916 3,975 0,363 10,951 0,000 0,000
Serine/threonine protein kinase/ATP binding/protein
10 Phvul.009G133000 15,170 434,203 3,923 0,423 9,264 0,000 0,000
phosphorylation
11 Phvul.002G065700 ALPHA-AMYLASE/cation binding 14,573 165,394 3,865 0,528 7,317 0,000 0,000
12 XLOC_029866 Sequência nova 13,624 26,165 3,768 0,597 6,316 0,000 0,000
Cytochrome P450 CYP2 subfamily/beta-carotene 15,15'-
13 Phvul.004G021300 12,882 59,317 3,687 0,420 8,772 0,000 0,000
monooxygenase /oxidation-reduction process
14 Phvul.002G003400 Cytochrome c oxidase, subunit vib/COX12/mitochondrion 12,767 35,312 3,674 0,628 5,851 0,000 0,000
Vacuolar H+-atpase V1 sector, subunit G/vacuolar proton-
15 Phvul.008G045800 12,526 18,212 3,647 0,566 6,447 0,000 0,000
transporting V-type atpase complex
Trypsin and protease inhibitor endopeptidase inhibitor
16 Phvul.011G169900 12,220 975,992 3,611 0,249 14,485 0,000 0,000
activity
17 Phvul.006G143200 MBOAT, membrane-bound O-acyltransferase family 12,018 42,499 3,587 0,479 7,484 0,000 0,000
18 XLOC_006513 Sequência nova 11,878 15,996 3,570 0,653 5,468 0,000 0,000
Cytochrome P450 CYP2 subfamily/beta-carotene 15,15'-
19 Phvul.002G025000 11,856 3423,318 3,568 0,276 12,935 0,000 0,000
monooxygenase /oxidation-reduction process
132
Putative Phosphatase/Predicted haloacid dehalogenase-like
20 Phvul.005G160800 11,586 1552,905 3,534 0,336 10,526 0,000 0,000
hydrolase
Xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1-related/spx
(syg1/pho81/xpr1) domain-containing protein/Protein
21 Phvul.010G072000 11,464 2086,707 3,519 0,396 8,896 0,000 0,000
involved in vacuolar polyphosphate accumulation, contains
SPX domain
Trypsin and protease inhibitor/endopeptidase inhibitor
22 Phvul.011G166500 11,330 1295,436 3,502 0,230 15,253 0,000 0,000
activity
23 Phvul.010G034400 Mlo protein/cell death/integral to membrane 11,191 231,742 3,484 0,246 14,158 0,000 0,000
Calcineurin-like phosphoesterase/Predicted DNA repair
24 Phvul.007G249800 10,744 283,832 3,426 0,642 5,335 0,000 0,000
exonuclease SIA1/hydrolase activity
25 Phvul.004G099700 Leucine-rich repeat protein/protein binding 10,651 20,278 3,413 0,580 5,886 0,000 0,000
Quadro 2. Seleção dos 25 unigenes candidatos, mais reprimidos do genótipo IAC Imperador (ordem decrescente de log2FoldChange). Da esquerda para a direita:
gene id (Phytozome); anotação do gene com base em blastx search utilizando a base de dados de P. vulgaris (Phytozome) com cutoff de 1e-10; lfcSE (erro padrão);
pvalue.
Expressão
N Unigene Anotação Funcional baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
Relativa
1 Phvul.007G258500 Não anotado -44,563 43,720 -5,478 0,575 -9,529 0,000 0,000
2 Phvul.007G258600 Não anotado -44,563 43,720 -5,478 0,575 -9,529 0,000 0,000
3 Phvul.011G160700 Não anotado -41,063 173,434 -5,360 0,355 -15,087 0,000 0,000
Predicted carbonic anhydrase involved in protection against
4
Phvul.004G013500 oxidative damage -36,974 45,463 -5,208 0,567 -9,189 0,000 0,000
5 XLOC_029764 Sequência nova -34,849 43,296 -5,123 0,571 -8,974 0,000 0,000
Branched chain aminotransferase BCAT1, pyridoxal
6
Phvul.009G075100 phosphate enzymes type IV superfamily -20,455 2962,768 -4,354 0,329 -13,249 0,000 0,000
7 XLOC_019165 Sequência nova -18,631 16,058 -4,220 0,619 -6,812 0,000 0,000
8 XLOC_025262 Sequência nova -15,359 267,958 -3,941 0,626 -6,295 0,000 0,000
9 Phvul.006G087800 protein binding -14,156 482,425 -3,823 0,409 -9,337 0,000 0,000
10 Phvul.011G029200 Não anotado -13,742 126,533 -3,780 0,331 -11,419 0,000 0,000
133
11 Phvul.003G124300 Não anotado -13,161 72,624 -3,718 0,451 -8,237 0,000 0,000
12 XLOC_006364 Sequência nova -12,994 8239,221 -3,700 0,376 -9,840 0,000 0,000
13 Phvul.009G188800 Não anotado -12,918 21,557 -3,691 0,620 -5,954 0,000 0,000
14 Phvul.003G226900 Polysaccharide catabolic process/beta-amylase activity -12,493 1252,133 -3,643 0,303 -12,010 0,000 0,000
15 Phvul.010G165600 Serine/threonine-protein kinase -12,325 104,192 -3,624 0,344 -10,535 0,000 0,000
16 XLOC_016307 Sequência nova -11,741 29,163 -3,554 0,615 -5,774 0,000 0,000
Nucleobase-containing compound metabolic
17 process/intracellular/3'-5' exonuclease activity/nucleic acid
Phvul.002G068500 binding -11,348 62,755 -3,504 0,537 -6,523 0,000 0,000
18 XLOC_019294 Sequência nova -11,141 33,325 -3,478 0,508 -6,848 0,000 0,000
19 XLOC_019171 Sequência nova -11,119 12,963 -3,475 0,597 -5,825 0,000 0,000
Na+/dicarboxylate, Na+/tricarboxylate and phosphate
20
Phvul.006G142700 transporters -11,032 2113,055 -3,464 0,292 -11,865 0,000 0,000
21 Phvul.008G282600 Raffinose synthase or seed imbibition protein Sip1 -10,907 279,405 -3,447 0,243 -14,160 0,000 0,000
22 Phvul.001G085200 Light regulated protein Lir1 -10,804 1449,564 -3,434 0,263 -13,049 0,000 0,000
23 Phvul.011G033800 heat shock protein binding -10,349 412,640 -3,371 0,368 -9,164 0,000 0,000
24 Phvul.003G274700 CTP synthase (UTP-ammonia lyase) -10,179 1060,325 -3,347 0,278 -12,052 0,000 0,000
25 XLOC_029515 Sequência nova -9,939 22,511 -3,313 0,587 -5,646 0,000 0,000
134
DOR 364
As comparações entre as bibliotecas do genótipo DOR 364 nas condições de
restrição do P e controle foram realizadas, tanto a análise hierárquica, como a análise de
componentes principais verificou-se uma relação do comportamento do genótipo em
relação à sua classificação quanto à eficiência de uso do nutriente. Assim, apesar de ser
possível observar a formação de dois grupos relacionados aos tratamentos, não se
observa uma divisão mais pronunciada como foi observada no genótipo IAC Imperador,
pois por ser considerado ineficiente e não responsivo há uma maior aproximação entre o
perfil de expressão do tratamento controle e o de restrição (Figura 15).
135
Ao contrário do genótipo eficiente IAC imperador que apresentou 3217 genes
diferencialmente expressos, o genótipo DOR 364 apresentou apenas 15 unigenes com
expressão diferencial, sendo dois deles induzidos na condição de restrição do P (Quadro
3) e 13 induzidos na condição controle (Quadro 4). Assim, é possível verificar na figura
o perfil de expressão do genótipo (Figura 16).
136
Quadro 3. Unigenes induzidos do genótipo DOR 364 (ordem crescente de log2FoldChange). Da esquerda para a direita: gene id (Phytozome); anotação do gene com
base em blastx search utilizando a base de dados P. vulgaaris (Phytozome) com cutoff de 1e-10; lfcSE (erro padrão); pvalue, padj.
Expressão
N Unigene Anotação Funcional baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
Relativa
Aminobenzoate/anthranilate synthase/ anthranilate synthase
1 Phvul.001G241600 4,810 12,652 2,266 0,494 4,583 0,000 0,022
component /Isochorismate synthase
Annexin/calcium ion binding/calcium-dependent 289,485
2 Phvul.005G030100 3,786 1,920 0,454 4,230 0,000 0,041
phospholipid binding
Quadro 4. Unigenes do genótipo DOR 364, reprimidos (ordem crescente de log2FoldChange). Da esquerda para a direita: gene id (Phytozome); anotação do gene
com base em blastx search utilizando a base de dados de P. vulgaris (Phytozome) com cutoff de 1e-10; lfcSE (erro padrão); pvalue.
Expressão
N Unigene Anotação Funcional baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
Relativa
Cytochrome P450 CYP2 subfamily/oxidation-reduction
1 Phvul.010G010900
process -2,982 173,066 -2,982 0,479 -6,225 0,000 0,000
2 Phvul.009G100300 Não anotado -2,714 15,997 -2,714 0,510 -5,327 0,000 0,001
3 XLOC_016307 Sequência nova -2,512 68,350 -2,512 0,512 -4,907 0,000 0,006
4 Phvul.006G139700 Não anotado -2,345 23,427 -2,345 0,466 -5,035 0,000 0,004
5 Phvul.010G062800 Domain of unknown function (DUF588) -2,222 54,550 -2,222 0,501 -4,440 0,000 0,029
Sequence-specific DNA binding transcription factor
6 Phvul.003G068700
activity -2,216 10,346 -2,216 0,524 -4,226 0,000 0,041
7 Phvul.007G136800 Ga1, dna binding / calmodulin binding / transcription factor -2,149 172,980 -2,149 0,485 -4,431 0,000 0,029
ANION EXCHANGE PROTEIN/inorganic anion
8 Phvul.005G174400
exchanger activity/membrane -2,097 20,695 -2,097 0,496 -4,229 0,000 0,041
CREB binding protein/P300 and related TAZ Zn-finger
9 Phvul.009G170600
proteins/histone acetyltransferase activity -1,963 170,855 -1,963 0,460 -4,268 0,000 0,041
10 Phvul.009G137700 Multitransmembrane protein -1,835 169,636 -1,835 0,413 -4,440 0,000 0,029
11 Phvul.011G026300 Não anotado -1,692 97,664 -1,692 0,390 -4,337 0,000 0,035
Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl
12 Phvul.011G077900
compounds/carbohydrate metabolic process -1,666 687,174 -1,666 0,398 -4,190 0,000 0,045
13 Phvul.007G229000 Não anotado -1,187 67,040 -1,187 0,273 -4,344 0,000 0,035
137
4. Conclusões
5. Referências Bibliográficas
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140
Conclusões Gerais
141