TCC Gabriel Macedo Marion

UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
FACULDADE DE FARMÁCIA
GABRIEL MACEDO MARION
MODELAGEM COMPUTACIONAL DA NTPDase5 DE Homo sapiens E ESTUDOS

DE DOCKING DE CHALCONAS E AURONAS
JUIZ DE FORA
2018
GABRIEL MACEDO MARION
MODELAGEM COMPUTACIONAL DA NTPDase5 DE Homo sapiens E ESTUDOS

DE DOCKING DE CHALCONAS E AURONAS
Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Curso de graduação em
Farmácia, da Universidade Federal de Juiz
de Fora, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em
Farmácia.
Orientadora: Dra. Priscila Vanessa Zabala Capriles Goliatt
JUIZ DE FORA
2018
“It's never too late
To be who you wanna be
To say what you wanna say
It's never too late
To leave if you wanna leave
Or to stay if you wanna stay”
Lana Del Rey

AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Ademilson e Sandra, por todo apoio, carinho,
conselhos e atenção.
Ao meu irmão, Gustavo, por todas as conversas, conselhos e companheirismo.
À minha orientadora, Priscila, por ter me recebido na sua equipe em 2016 e ter
tido grande paciência em me ensinar do nível básico ao esperto, com todos os truques
e macetes, me ensinando também o melhor comando no terminal: “modlove”.
Ao Vinicius, por ter me ajudado tanto nesses dois anos, com seus scripts, muita
paciência e ensinamentos que agilizavam o eterno processo de organizar as tabelas
de alinhamento e aos momentos de descontração no laboratório do PGMC.
Às minhas amigas Lara, Larissa e Maiara, que me ajudaram com o trabalho e
me proporcionaram momentos marcantes nessa trajetória no PGMC e na vida.
Aos meus amigos do colégio militar, UFJF e intercâmbio que me ajudaram e
incentivaram todos esses anos.
À UFJF pelo apoio com a bolsa de treinamento.
E a todos que de alguma forma, me ajudaram a chegar aqui.
RESUMO
O câncer é um grupo de doenças, nas quais as células do organismo começam a se

dividir sem controle e se espalham para os diferentes tecidos e órgãos. Isso ocorre
porque, em algum momento, o maquinário responsável pelo “controle de qualidade”
dos processos celulares deixa de funcionar e a célula passa a apresentar o
comportamento anormal observado nos tecidos cancerígenos, tornando-se invasivas
e capazes de sobreviver além do seu sítio primário. De acordo com a Organização
Mundial da Saúde, o câncer é a segunda principal causa de morte em todo o mundo,
portanto, a necessidade de encontrar novos alvos terapêuticos e tratamentos mais
eficientes é evidente. Um promissor alvo apontado neste trabalho é a proteína proto-
oncogênica NTPDase5 de Homo sapiens (HsNTPDase5), também conhecida como
PCPH. Essa enzima pertence à família das ecto-nucleosídeo trifosfato
difosfohidrolase (E-NTPDase) e é responsável pela hidrólise de nucleotídeos
extracelulares (p. ex. ATP) aos respectivos nucleosídeos. O aumento de sua
expressão em tecidos neoplásicos confere resistência às células sob condições de
estresse, devido a redução do ATP intracelular e inativação das proteínas quinases
ativadas por estresse, reduzindo o nível de apoptose, por exemplo. Assim, a inibição
da HsNTPDase5 pode ser uma promissora terapia contra o câncer. De acordo com a
literatura, flavonoides como as chalconas e auronas apresentam resultados
prospectivos na atividade anticancerígena, inibindo enzimas dependentes de ATP.
Esta propriedade pode estar relacionada a semelhança entre a adenina da estrutura
de ATP e flavonoides, tornando-as atraentes para o desenvolvimento de novos
fármacos para o tratamento do câncer. Neste estudo, a estrutura tridimensional da
HsNTPDase5 foi predita usando a técnica de modelagem por homologia, afim de
realizar o docking de derivados de chalconas e auronas. Além disso, foi realizada a
análise de toxicidade desses compostos por meio de preditores. Os resultados
indicaram que o modelo gerado da proteína satisfez as necessidades para o estudo e
as análises dos compostos através do docking e preditores de toxicidade indicaram
os compostos LS29 e LS24 como sendo os mais promissores para futuros estudos.
Palavras-chave: NTPDase5, PCPH, câncer, docking molecular, modelagem por

homologia, chalconas, auronas.
ABSTRACT
Cancer is a group of related diseases, where the cells in the organism start to divide
without control and spread throughout the many tissues and organs. It happens
because, at some point, the machinery responsible for the “quality control” of the
cellular processes stop working and then, the cell starts to present the abnormal
behavior observed in cancerous tissues, such as being invasive and able to survive in
places where it was not supposed to. According with the World Health Organization,
cancer is the second leading cause of death globally and accounted for millions of
deaths. Therefore, the need to find new and more therapeutic targets and efficient
treatments is evident. A promising target pointed out in this work is the proto-oncogenic
protein NTPDase5 from Homo sapiens (HsNTPDase5), also known as PCPH. This
enzyme belongs to the family of the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase
(E-NTPDase) and is responsible for the hydrolysis of extracellular nucleotides (eg.
ATP) to the respective nucleosides. Increased expression in neoplastic tissues confers
resistance to cells under stress conditions, due to the reduction of intracellular ATP
and inactivation of stress-activated protein kinases, reducing the level of apoptosis, for
example. Thus, inhibition of HsNTPDase5 may be a promising cancer therapy.
According to the literature, flavonoids such as chalcones and aurones present
prospective results in anticancer activity, inhibiting ATP-dependent enzymes. This
property may be related to the similarity between the adenine structure of ATP and
flavonoids, making them attractive for the development of new drugs for the treatment
of cancer. In this study, the three-dimensional structure of HsNTPDase5 was predicted
using the homology modeling technique, in order to perform the docking of chalcones
and aurones derivatives. In addition, toxicity analysis of these compounds was
performed by online prediction programs. The results indicated that the generated
model of the protein satisfied the needs for the study and the analyzes of the
compounds through docking and predictors of toxicity indicated the compounds LS29
and LS24 as being the most promising for future studies.
Key words: NTPDase5, PCPH, cancer, molecular docking, homology modeling,

chalcones, aurones.
LISTA DE ILUTRAÇÕES
Figura 1.1 Perfil do câncer no Brasil entre o público masculino em 2014 13
Figura 1.2 Perfil do câncer no Brasil entre o público feminino em 2014 13
Figura 1.3 Estimativa dos casos de câncer no Brasil entre o público masculino para os
anos de 2018-2019 14
Figura 1.4 Estimativa dos casos de câncer no Brasil entre o público feminino para os
anos de 2018-2019 14
Figura 1.5 Mapa do mundo mostrando a migrações e o impacto disso no
desenvolvimento dos tipos de câncer 17
Figura 1.6 Isoformas das NTPDases e suas localizações 24
Figura 1.7 Demonstração de como seria o posicionamento da água catalítica
(molécula vermelha - 1) e demais resíduos importantes no sítio ativo da RnNTPDase2
para a hidrólise do substrato 28
Figura 1.8 Representação dos movimentos que os domínios fazem com a presença
do substrato no sítio ativo 30
Figura 1.9 Resíduos catalíticos da StNTPDase1 31
Figura 1.10 Representação das moléculas de água que intermedeiam a interação do
íon de cálcio com os resíduos da enzima e o substrato 32
Figura 1.11 Workflow da modelagem por homologia 35
Figura 1.12 Estrutura básica de uma chalcona 38
Figura 1.13 Estrutura básica de uma aurona 39
Figura 4.1 Representação do alinhamento global entre as sequências da
HsNTPDase5 e 4BR0 48
Figura 4.2 Modelo escolhido da HsNTPDase 5 gerado pelo programa Modeller 49

Figura 4.3 Alinhamento do modelo construído de HsNTPDase5 (cinza) com o molde
utilizado 4BR0 (azul) 50
Figura 4.4 Resultado do programa MolProbity para o modelo escolhido de
HsNTPDase5 51
Figura 4.5 Resultado do programa Procheck para o modelo escolhido de
HsNTPDase5 52
Figura 4.6 Posicionamento dos ligantes testados no sítio ativo da HsNTPDase5 56
Figura 4.7 Representação do docking entre o composto Cardamonina e a enzima
HsNTPDase5 57
Figura 4.8 Representação do docking entre o composto IA-C2 e a enzima
HsNTPDase5 58
Figura 4.9 Representação do docking entre o composto Uvangoletina e a enzima
HsNTPDase5 59
Figura 4.10 Representação do docking entre o composto LS06 e a enzima
HsNTPDase5 60
HsNTPDase5 61
HsNTPDase5 62
HsNTPDase5 63
HsNTPDase5 64
Figura 4.15: Exemplo de gráfico gerado pelo SwissADME 66
Quadro 1 Dados das avaliações de qualidade da estrutura selecionada 50

Quadro 2 Estruturas dos ligantes utilizados no estudo 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Resultados das energias, interações e Ki para as simulações com a

HsNTPDase5 no AutoDock Vina 55
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 12
1.1 Câncer ........................................................................................................ 12
1.1.1. Definição e contextualização ............................................................ 12
1.1.2. Causas internas e externas............................................................... 15
1.1.3. Diagnóstico ........................................................................................ 17
1.1.4. Tratamento ......................................................................................... 21
1.2 As Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases ................................. 23
1.3 NTPDase5 em Homo sapiens e câncer ................................................... 25
1.4 Mecanismo catalítico das NTPDases ...................................................... 27
1.5 Modelagem por homologia ...................................................................... 32
1.6 Docking receptor-ligante .......................................................................... 36
2 OBJETIVOS....................................................................................................... 40
2.1 Geral ........................................................................................................... 40
2.2 Específicos ................................................................................................ 40
3 METODOLOGIA ................................................................................................ 41
3.1 Modelagem computacional da estrutura 3D da proteína alvo .............. 41
3.1.1. Predição do peptídeo sinal, domínio transmembranar, estrutura
secundária, contato de resíduos e desordem ............................................... 41
3.1.2. Obtenção dos modelos ..................................................................... 42
3.1.3. Validação dos modelos ..................................................................... 43
3.2 Docking molecular .................................................................................... 43
3.2.1. Preparo da proteína e grids .............................................................. 44
3.2.2. Preparo dos compostos .................................................................... 44
3.2.3. Simulações de docking ..................................................................... 45
3.2.4. Cálculo do Ki e avaliação de toxicidade .......................................... 45
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 48
4.1 O modelo 3D da HsNTPDase5.................................................................. 48
4.2 Estudos de docking receptor-ligante ...................................................... 53
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS .................................................................. 68
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 69
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Câncer
1.1.1. Definição e contextualização
A multiplicação desordenada de células que invadem os tecidos e órgãos e,

posteriormente, se espalham por todo o organismo é denominado câncer. Essa
doença possui variadas causas, tanto internas, quanto externas ao organismo,
estando essas inter-relacionadas (INCA, 2018).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS ou do inglês WHO-
World Health Organization), o câncer é a segunda maior causa global de morte e foi
responsável por 8,8 milhões de mortes em 2015. Aproximadamente 70% das mortes
ocorrem em países de baixa ou média renda e entre as causas estão o diagnóstico
tardio e a doença em estágio avançado. Em 2017, apenas 26% dos países com baixa
renda afirmaram ter serviços de patologia disponíveis no setor público. Em contraste,
mais de 90% dos países desenvolvidos afirmaram ter o serviço de tratamento
disponível contra 30% dos países de baixa renda. O impacto econômico da doença é
grande, sendo que no ano de 2010 o gasto estimado foi de 1,16 trilhões de dólares
(OMS, 2018).
Segundo o relatório da OMS de 2014 sobre o perfil da doença no Brasil, entre
o público masculino a maior incidência é o câncer de próstata e para o público
feminino, é o câncer de mama (OMS, 2018). As figuras 1.1 e 1.2 a seguir demonstram
os tipos de câncer e suas incidências entre os dois públicos.
13
Figura 1.1: Perfil do câncer no Brasil entre o público masculino em 2014.
HOMENS
Próstata
15% Traqueia, brônquios

e pulmão
Estômago
48% 14%
Colorretal
9% Esôfago
7% Outros
7%
Fonte: OMS, 2014.
Figura 1.2: Perfil do câncer no Brasil entre o público feminino em 2014.
MULHERES
Mama
17%
Traqueia, brônquios
e pulmão
10% Colorretal
49%
Cervical
9%
Estômago
9%
6% Outros
Fonte: OMS, 2014.
A estimativa para os anos de 2018 e 2019, de acordo com o Instituto Nacional

do Câncer (INCA) (2017), é a ocorrência de 600 mil casos novos de câncer, para cada
ano, no Brasil. As figuras 1.3 e 1.4 demonstram tais estimativas divididas por estado
e para os sexos masculino e feminino, respectivamente.
14
Figura 1.3: Estimativa dos casos de câncer no Brasil entre o público masculino para
os anos de 2018-2019 – incidência/100 mil homens – todas as neoplasias malignas,
exceto as de pele não melanoma.
Fonte: INCA, 2017.
Figura 1.4: Estimativa dos casos de câncer no Brasil entre o público feminino para os
anos de 2018-2019 – incidência/100 mil mulheres – todas as neoplasias malignas,
exceto as de pele não melanoma.
Fonte: INCA, 2017.

15
1.1.2. Causas internas e externas
As células cancerosas violam regras básicas do comportamento normal e

conhecido dos organismos multicelulares, como vias de sinalização, diferenciação e
nos mecanismos de controle que impedem a divisão celular ou induzem a apoptose.
Essas características aumentam a capacidade dessas células de sobreviverem,
crescerem e se dividirem em seus tecidos originais, e em seguida formar metástases
(ALBERTS et al., 2010). Essas mudanças, de caráter individual e genético, quando
somadas às causas externas, como carcinogênicos físicos, biológicos e químicos,
resultam na formação do tumor maligno (OMS, 2018).
Das causas internas, algumas merecem destaque, de acordo com Alberts et al.
(2010):
(i) Reprodução desenfreada e colonização de outros tecidos: o crescimento
anormal da célula (aumento de massa) e proliferação exacerbada dá origem ao
tumor ou neoplasia, que se invasivo, origina o câncer;
(ii) Células cancerosas possuem mutações somáticas: a compreensão do câncer
consiste em definir se a aberração hereditária foi causada por uma alteração
genética (na sequência do DNA) ou epigenética (alteração no padrão de
expressão genética, sem que haja mudança na sequência de DNA). A maioria
é causada pelas alterações genéticas, que se acumulam com o passar do
tempo;
(iii) Uma mutação isolada não é o suficiente para o desenvolvimento do câncer:
durante a vida, as células de um organismo humano passam por cerca de 10 16
divisões celulares. Certamente ocorrem mutações ocasionais, porém os
mecanismos de controle são capazes de eliminar as células defeituosas. A
ocorrência de um câncer está associada a um acúmulo de mutações e acidente
raros que ocorreram na linhagem da célula;
(iv) Células cancerosas humanas são geneticamente instáveis: o acúmulo de
mutações ao longo dos ciclos faz com que as células se tornem geneticamente
instáveis. Essa instabilidade se manifesta através de anomalias grosseiras,
como falha na manutenção de cromossomos, dificuldades no reparo do DNA e
mecanismos de controle epigenético;
16
(v) As células cancerosas malignas devem sobreviver e proliferar em um ambiente

inóspito: ao estabelecer a metástase, as células devem se despregar do tumor
primário, invadir o tecido local até alcançar a circulação sanguínea e
estabelecer a uma nova colônia em locais distantes. Esses processos exigem
que o sistema celular rompa o que é programado como sua atividade normal,
dando-lhe a característica de invasibilidade. Assim, as células malignas são
menos dependentes dos sinais de outras células e possuem uma sinalização
celular alterada, o que lhes confere a capacidade de instalação em outro
ambiente. Um exemplo é a indução da angiogênese, que é a formação de
novos vasos sanguíneos que nutrem os tumores metastáticos.
As causas externas podem ser também chamadas de causas evitáveis. De

acordo com Alberts et al. (2010), comparando-se a incidência de tipos de câncer em
diversos países, nota-se que para praticamente todo tipo de câncer comum em um
país, existe um outro onde a incidência é baixa. Tais diferenças aparentemente são
causadas por fatores ambientais e não genéticos, pois as populações migrantes
passam a apresentar o padrão de incidência de câncer característico do novo país.
Assim, o que a população migrante deixa de ser exposta no local de origem, passa a
ser exposta no país destino (figura 1.5). Em um estudo publicado por Merrill e Lyon
(2005), que analisa a influência das causas externas no desenvolvimento do câncer,
a taxa de câncer de um grupo de mórmons foi comparada com a de não mórmons.
Tendo em vista as restrições que os praticantes têm, como não consumir álcool, café,
cigarros, drogas e não praticar sexo eventual, a incidência de câncer entre eles foi
mais baixa que a incidência dos não mórmons.
17
Figura 1.5: Mapa do mundo mostrando as migrações e o impacto disso no

desenvolvimento dos tipos de câncer. As setas azuis demonstram diminuição e as
vermelhas, aumento.
Fonte: ALBERTS et al., 2010.
A idade também é um fator que possui grande influência no desenvolvimento

da doença. Sabe-se que a idade avançada aumenta os riscos para o surgimento de
certos tipos de câncer, pois os sistemas de controle dos mecanismos celulares ficam
menos efetivos a cada ano (ALBERTS et al., 2010).
1.1.3. Diagnóstico
Por ser uma patologia com localização e aspectos clínico-patológicos múltiplos

e não possuir sintomas específicos, o diagnóstico do câncer não é simples em
comparação ao de outras doenças, e pode ser detectado em vários estágios de
evolução histopatológica e clínica (INCA, 2018).
Assim, uma política de monitoramento que estimule o diagnóstico precoce é a
melhor maneira de garantir o sucesso do tratamento e sobrevivência do paciente. O
diagnóstico tardio faz com que as chances de tratamento e sobrevivência diminuam,
aumentando a morbidade da doença e os custos do tratamento. Além disso, o
18
interesse em manter políticas de conscientização e importância do diagnóstico

precoce é do interesse de todos, principalmente do sistema público de saúde. (OMS,
2018).
O screening ou diagnóstico precoce possui o intuito de detectar o câncer antes
do aparecimento dos sinais, pois a identificação de tecidos anormais precocemente
faz com que a possibilidade de remoção cirúrgica ou tratamentos mais brandos sejam
eficazes (NIH, 2017).
Esta etapa faz uso de alguns testes, que são agrupados nos tipos a seguir:
(i) Exames físicos e histórico do paciente: check up com o objetivo de identificar
algum tipo de sinal estranho, como caroços ou manchas estranhas. É realizada
também uma anamnese do paciente, com o objetivo de coletar informações
importantes sobre seu passado e histórico familiar;
(ii) Testes laboratoriais: procedimentos para a análise de materiais biológicos,
como sangue, urina, tecido ou outras que venham ao caso;
(iii) Investigação por imagem: procedimentos que geram imagens do interior do
corpo, facilitando avaliar o dimensionamento da doença;
(iv) Testes genéticos: têm por finalidade identificar mutações que já se sabem estar
ligadas ao desenvolvimento de certos tipos de cânceres (NIH, 2017).
Tais testes têm sido cada vez mais explorados, tendo em vista o sucesso em
sua utilização. Além disso, para a ciência é um campo de oportunidades na pesquisa,
com a finalidade de aprimoramento, descoberta e teste de novos métodos. Já para a
população, acaba sendo uma chance de sobrevivência, por aumentar os recursos.
Dentre os testes laboratoriais e exames de diagnóstico podemos citar:
(i) Pesquisa de sangue oculto nas fezes (PSO) e colonoscopia: exames utilizados
para a identificação precoce do câncer colorretal. O teste de PSO parte do
princípio de que os carcinomas sangram e sendo assim, tal teste é capaz de
identificar a hemoglobina presente no teste (ALTENBURG; BIONDO-SIMÕES;
SANTIAGO, 2007). A colonoscopia permite a visualização da mucosa dos
intestinos e tem sido uns dos melhores testes de triagem, por identificar
mudanças que já se sabem ser características de um câncer em
desenvolvimento (REX, 2006);
19
(ii) Tomografia computadorizada helicoidal em baixa dose: por possuir maior

sensibilidade que a radiografia, detectando nódulos menores, tem sido a
técnica recomendada para detecção precoce de cânceres como o de pulmão
(SOBUE, 2002);
(iii) Auto-exame e mamografia: a palpação das mamas permite a identificação de
nódulos e pode ser realizada pela paciente ou por um profissional e a
mamografia, que é tido como o método mais eficiente para a detecção do
câncer de mama, possui boa sensibilidade e alta percentagem de confirmação
dos casos (MOLINA; DALBEN; LUCA, 2003);
(iv) Exame de sangue de alfa-fetoproteína: Essa glicoproteína, produzida pelo
fígado do embrião, está presente em baixa concentração no organismo adulto.
Entretanto, desde 1970 já é utilizada como marcador para o diagnóstico
precoce de carcinoma hepatocelular, tendo em vista que sua alta concentração
na maioria dos casos está associada a cânceres hepáticos (MA; WANG; TENG,
2013);
(v) Teste PSA (prostate-specific antigen): realizado para a detecção precoce do
câncer de próstata e para o monitoramento da reincidência ou metástase em
pacientes tratados. Essa glicoproteína é produzida pelas células da próstata e
uma potencial função fisiológica é a dissolução de coágulos. Apesar da alta
disseminação/utilização, este teste tem sido questionado, tendo em vista os
relatos de falsos-positivos e falsos-negativos. Outro marcador associado ao
PSA por ser um substrato de enzima, a Galectina-3, tem sido sugerido como
um marcador complementar (BALAN et al., 2013).
A subjetividade da doença e dificuldade na obtenção de informações

completas, assim como grande variedade de tipos de cânceres, sendo muitos deles
atípicos, fazem com que o diagnóstico seja confuso e aumente a possibilidade de
realização de procedimentos caros e desnecessários, além de expor o paciente a
situações desconfortáveis. Com a finalidade de evitar tais situações, novas técnicas
têm recebido grande atenção e investimento (ZOU; WANG, 2007).
Como exemplo de algumas técnicas novas para o diagnóstico, temos:
20
(i) Padrões proteômicos: representa a pesquisa de padrões de proteínas

observadas em uma amostra biológica por meio da técnica de espectrometria
de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e
analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF ou em inglês, SELDI-TOF MS). A
técnica não exige identificação das proteínas e, com auxílio de redes neuronais
interpreta os padrões dos picos obtidos, sendo capaz de fornecer um
diagnóstico mais preciso. As vantagens da técnica são maior especificidade e
sensibilidade, tendo em vista a maior concentração das proteínas quando
comparadas aos biomarcadores atualmente utilizados (DIAMANDS, 2003;
CONRADS, 2003);
(ii) Técnicas de data mining: análise estatística de um conjunto de dados por
programas computacionais fazendo uso de uma árvore de decisão. Consegue-
se mapear diversos fatores que podem levar ao desenvolvimento do câncer.
De acordo com Kharya (2012), a metodologia é viável, por exemplo, na análise
das imagens de mamografia, onde há grande dificuldade na interpretação,
realizando a extração de características recorrentes e já associadas ao câncer.
Entretanto, precisa ser utilizada com bancos de dados maiores, com a
finalidade de encontrar associações com maior confiabilidade estatística.
(iii) Aplicação de redes neuronais: segundo Ganesan et al. (2010), a medicina
voltada para a oncologia tem sido um excelente campo de utilização das redes
neuronais. Elas são capazes de realizar aprendizagem de máquina e
reconhecimento de padrões e na carcinogênese já se mostraram eficientes na
aplicação do diagnóstico pré-clínico. Através do uso de algoritmos e rigorosa
avaliação dos resultados demográficos, é possível a identificação de padrões
que auxiliem na detecção da doença;
(iv) RAMAN: De acordo com Lui et al. (2012), a técnica RAMAN se mostrou eficaz
para a detecção de lesões malignas na pele por detectar mudanças
moleculares ou bioquímicas associadas a patologias. A espectroscopia
RAMAN se baseia na emissão de luz que ao atingir um objeto ou o material de
estudo, interage através de fenômenos como absorção, transmissão, extinção
e espalhamento, sendo que há uma alteração no comprimento de onda da luz
espalhada, o que é característico de cada molécula. No estudo publicado, a
21
técnica se mostrou sensível, específica e aplicável, já que muitas vezes as

lesões são tidas como benignas, dificultando o diagnóstico do câncer de pele.
1.1.4. Tratamento
Com o passar dos anos, a ciência avançou e investimentos foram feitos, o que
vem aumentando cada vez mais as opções de tratamento e consequentemente, as
chances de sobrevivência dos pacientes. Ainda assim, não há um tratamento
totalmente eficaz.
Entretanto, a política criada em torno da doença tem se mostrado eficaz no
suporte aos diagnosticados que estão em tratamento ou já foram tratados e na
população em geral, como forma de alerta, pois a prevenção é sempre melhor que a
cura (WHO, 2018).
Os tratamentos atuais anticâncer focam nas anormalidades moleculares de
células cancerosas que as diferenciam das células normais. A instabilidade genética
é a mais explorada, pois as células cancerosas não possuem funções fundamentais
como manutenção de cromossomos, verificação do ciclo celular e reparo de DNA bem
reguladas. Assim, quaisquer danos causados a célula a tornam incapaz de se
recuperar (ALBERTS et al., 2010).
De acordo com o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos, existem oito
tipos de tratamentos disponíveis (NIH, 2017), que estão listados a seguir:
(i) Cirurgia: procedimento que pode retirar o tumor por completo ou não, caso haja
risco de dano severo a algum órgão. Normalmente é realizada quando o câncer
não está em estágio avançado e requer tratamento auxiliar depois,
considerando-se que o procedimento é incapaz de remover todas as células
cancerosas (NIH, 2017);
(ii) Radioterapia: tratamento onde é utilizada radiação ionizante, que ao atingir o
tecido causa ruptura das cadeias de DNA, sendo utilizada para destruir ou
impedir o crescimento das células (INCA, 2018);
(iii) Quimioterapia: Se baseia na utilização de compostos químicos para o
tratamento da doença. Apesar de muitos não agirem de forma seletiva, os
citotóxicos causam maiores danos às células malignas, tendo em vista a
22
diferença nos processos metabólicos entre essas e as células normais (INCA,

2018);
(iv) Imunoterapia: tratamento onde ocorre a estimulação do sistema imune do
organismo por meio de substâncias modificadoras da resposta biológica. Pode
ser dividida em ativa, quando substâncias estimulantes e restauradoras da
função biológica e as vacinas de células tumorais são aplicadas com o objetivo
de impedir o crescimento tumoral, e a passiva, quando anticorpos antitumorais
ou células mononucleares são administradas, com a finalidade de reforçar a
resposta imune contra a doença (INCA, 2018);
(v) Terapia hormonal: possui a finalidade de manipular o sistema endócrino, pois
em alguns tipos de câncer, como o de mama e próstata, os níveis hormonais
influenciam na doença. A terapia pode ter a finalidade de suprimir ou estimular
a produção de hormônios e normalmente é associada com outros tratamentos,
como quimioterapia, radioterapia ou cirurgia (INCA, 2018);
(vi) Transplante de células tronco: Abordagem utilizada para pacientes que tiveram
suas células da medula óssea destruídas pela quimioterapia ou radioterapia. O
transplante tem a finalidade de acelerar a recuperação do paciente após as
agressivas sessões de quimio e radioterapia, pois são células que ao
amadurecer, originam as plaquetas, leucócitos e hemácias. Existem dois tipos
de transplante, o autólogo, onde o paciente recebe suas próprias células, ou
o alogênico, onde o paciente recebe as células tronco de um doador (NIH,
2017);
(vii) Terapia direcionada e terapia com base na genética do paciente e da doença:
a terapia direcionada ou do inglês, “targeted therapy”, foca na elucidação das
mudanças celulares que levam a formação do câncer. Assim, com a pesquisa
específica, os esforços são focados no desenvolvimento de novas moléculas e
anticorpos monoclonais com atuação direcionada, aumentando a eficácia do
tratamento e evitando o dano a células saudáveis. Com o estudo mais focado
em entender as diferenças em cada tipo de câncer, o tratamento passa a ser
mais individualizado, levando em consideração a situação de cada paciente,
que em inglês é a chamada “precision medicine”. Este tipo de abordagem ainda
não é muito comum, pois a necessidade de compreender mais a doença é
23
necessária, mas promete ser o futuro do tratamento contra o câncer (NIH,

2017).
A expectativa para o tratamento do câncer é promissora. Com o avanço dos

estudos e compreensão dos processos celulares e das falhas que acabam gerando
células anormais, a tendência é que sejam elucidadas etapas chave para o processo
de estabelecimento da doença. De posse de tal conhecimento, espera-se que o
tratamento seja mais eficaz e específico, aumentando as chances de cura e
diminuindo os efeitos colaterais (ALBERTS et al., 2010).
1.2 As Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases
As enzimas pertencentes à família das ecto-nucleosídeo trifosfato

difosfohidrolases [E-NTPDase/CD39 (cluster of differentiation)], também conhecidas
como NTPDases - nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases, ATP-difosfohidrolases ou
apirases são responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos em seus respectivos
nucleosídeos e são cátion-dependentes, principalmente cálcio e magnésio (NUNES,
2015; ROBSON; SEVIGNY; ZIMMERMANN, 2006).
Uma característica importante da família é que todas as enzimas possuem
cinco regiões altamente conservadas, chamadas de “regiões conservadas da apirase”
(ACR, do inglês apyrase conserved regions), que estão localizadas próximas ao sítio
ativo (NUNES, 2015; VORHOFF, 2005). Atualmente, existem oito isoformas da
NTPDase elucidadas em mamíferos, sendo elas a NTPDase1 (CD39, ecto-apirase),
NTPDase2 (CD39L1, ecto-ATPase), NTPDase3 (CD39L3), NTPDase4 (UDPase),
NTPDase5 (CD39L4, ER-UDPase, PCPH, ENTPD5), NTPDase6 (CD39L2),
NTPDase7 (LALP1), e a NTPDase8. As NTPDases 1-3 e 8 estão ancoradas na
membrana celular pelos domínios transmembranares presentes nas porções N e C-
terminal, com o sítio ativo exposto ao meio extracelular. As NTPDases 4-7 estão
ancoradas na membrana das organelas intracelulares por um domínio
transmembranar presente na porção N-terminal da proteína (NTPDase5 e 6) ou dois
domínios, nas porções N e C-terminal (NTPDase 4 e 7). Além disso, as NTPDases 5
e 6 também são secretadas no ambiente intra e extracelular, ficando livres na
24
circulação (STELLA, 2010) A figura 1.6 a seguir descreve graficamente as oito

isoformas.
Figura 1.6: Isoformas das NTPDases e suas localizações.
Fonte: McCARTHY, 2011.
As NTPDases estão envolvidas no processo de sinalização purinérgica, que já

se sabe estar envolvida na gravidez e em diversos processos, como diabetes,
hipertensão, doença renal crônica, câncer de mama e próstata, neoplasia do cérvix
uterino, infarto do miocárdio e hipercolesterolemia (SCHETINGER, 2007). A
sinalização tem seu início com os nucleotídeos tri- ou di-fosfatados atuando nos
receptores purinérgicos ianotrópicos P2X e metabrotópicos P2Y. As NTPDases
modulam a sinalização, pois metabolizam os nucleotídeos tri- ou difosfatados em
nucleotídeos di- ou monofosfatados. Sabe-se que por pequenas diferenças
estruturais, as oito isoformas apresentam preferências por nucleotídeos tri- ou
difosfatados. A NTPDase 1 hidrolisa nucleotídeo trifosfatado (NTP, do inglês
nucleoside thiphosphate) e nucleotídeo difosfatado (NDP, do inglês nucleoside
diphosphate) igualmente, enquanto as NTPDases 3 e 8 preferem NTP ao NDP, o que
acontece para a NTPDase2 também, porém de uma forma bem mais acentuada. As
NTPDases 4 e 5 hidrolisam na seguinte ordem: uridina difosfato (UDP, do inglês
uridine diphosphate) > guanosina difosfato (GDP, do inglês guanosine diphosphate) >
citosina difosfato (CDP, do inglês cytosine diphosphate) enquanto que a NTPDase 6
possui preferência pela seguinte ordem: GDP > inosina difosfato (IDP, do inglês
25
inosine diphosphate) > UDP e a NTPDase 7 hidrolisa uridina, guanosina e citosina

trifosfato (UTP, GTP, CTP) (SCHETINGER, 2007).
Na sequência da cascata enzimática, as ecto-5’-nucleotidases desfosforilam os
nucleotídeos monofosfatados não cíclicos, gerando como produtos o fosfato e o
ribonucleosídeo correspondente, sendo que este último, por sua vez atua no receptor
purinérgico metabotrópico P1 (ALTENHOFEN, 2013; DEAGLIO, 2011; ROBSON;
SEVIGNY; ZIMMERMANN, 2006).
1.3 NTPDase5 em Homo sapiens e câncer
A NTPDase5, alvo desse estudo, é uma proteína que pode ser secretada e por
tanto, solúvel. Algumas de suas características são presença de ACRs, domínio
transmembranar e domínio extracelular, já citadas, e além disso, a proteína conta com
glicosilações e cisteínas estrategicamente situadas o que permite a formação de
ligações dissulfídicas e consequente dimerização. Entretanto, tais características não
afetam a atividade catalítica ou no caso da dimerização, até reduzem tal atividade,
fazendo com que a enzima esteja praticamente inativa (MULERO, 2000).
Ainda não há disponível no banco de dados de proteínas (PDB, do inglês
Protein Data Bank) uma estrutura tridimensional (3D) para a NTPDase5 de Homo
sapiens (HsNTPDase5) (McCARTHY, 2011), o que justifica a utilização de métodos
computacionais para a elucidação do que seria a estrutura tridimensional desta e
assim, a realização de estudos in silico que envolvam essa enzima.
A HsNTPDase5 se diferencia do resto das outras enzimas por ser a única com
a característica de protooncogene, conhecido como PCPH, do inglês proto-
carcinogenic progression of hamster embryo cells, onde foi feito sua primeira
identificação (McCARTHY, 2011). Este gene é altamente conservado, tendo em vista
que sua presença já foi detectada na levedura. Sua transformação em oncogene,
chamado de mt-PCPH, ocorre simplesmente pela eliminação de um par de bases,
levando a formação de um códon de parada prematuro que gera uma proteína menor
que a normal (BRACCO; BERTONI; WINK, 2014).
De acordo com estudo publicado por Recio et al. (2000), a expressão de PCPH
em tecidos saudáveis ocorre normalmente, porém em tecidos malignos a expressão
26
de PCPH diminui dando lugar ao aumento da expressão de mt-PCPH. Isso sugere

que a perda de PCPH e aumento de mt-PCPH esteja envolvida em alguns tumores.
Por outro lado, em um estudo publicado por Zadran et al. (2012), onde se discute o
glioblastoma multiforme (GBM), a ENTPD5 possui o papel de aumentar o
desempenho das células cancerosas em obter AMP a partir de ATP e aumentar a
concentração de glicose nas células do GBM, tendo em vista que essas são
dependentes da glicólise para sobreviver e proliferar e são deficientes de PTEN
(phosphatase and tensin homolog), uma enzima supressora de tumores. Ainda de
acordo com Zandran, sabe-se que no GMB a oxidação completa da glicose está
comprometida, então o processo que garante a sobrevivência da célula passa a ser a
glicólise no próprio citoplasma. Assim, o aumento da expressão de ENTPD5, que está
associado a ausência de PTEN, contribui para a progressão da doença.
Seguindo essa linha de pesquisa, Recio et al. (2002) demonstraram que assim
como o mt-PCPH confere resistência aos estímulos que causam o estresse celular,
como hipertermia, radiação ionizante e drogas quimioterápicas, o PCPH também
confere, porém de maneira mais branda. Tal resistência se deve a atividade catalítica
da enzima, que causa a redução da concentração intracelular de ATP e consequente
inativação das proteínas quinases ativadas pelo estresse (BRACCO; BERTONI;
WINK, 2014).
Um outro mecanismo celular no qual a HsNTPDase5 possui importância é na
proteção contra mecanismos apoptóticos através da inibição da mTOR (mammalian
target of rapamycin), uma proteína quinase. Após exposição a uma radiação ionizante,
por exemplo, mTOR atua estimulando a apoptose, que pode ser antagonizado pela
expressão da proteína do mt-PCPH ou HsNTPDase5 com expressão acima do
normal. O bloqueio da ativação da mTOR e sua movimentação do citoplasma para o
núcleo, previne a fosforilação do resíduo S18 da proteína p53, que desencadearia a
liberação do citocromo C pelas mitocôndrias e subsequente ativação da caspase 9/3,
o que acaba por induzir a apoptose. O resultado então das altas concentrações de
HsNTPDase5 é a diminuição dos níveis de ATP citoplasmático, fazendo com que
proteínas quinases, como a mTOR, não sejam ativadas (BRACCO; BERTONI; WINK,
2014).
27
A capacidade de invasão do câncer também pode ter influência da

HsNTPDase5. Em um estudo publicado por Villar et al. (2007), a análise
imunohistoquímica do tecido prostático saudável não apresentava expressão do
PCPH, porém a mesma aumentou no decorrer da progressão da doença. As células
com alta expressão de PCPH passaram a ter maiores concentrações de colágeno e
maior capacidade de invasão, sendo que a regulagem desses processos ocorre
através de um mecanismo envolvendo a proteína quinase C (PKC), que segue a
mesma proporção de concentração de PCPH. Além disso, a HsNTPDase5, ativando
a proteína quinase B, também conhecida com AKT, acaba induzindo o efeito de
Warburg, que é quando as células cancerosas produzem energia através da glicólise
seguida da fermentação do acido lático no citosol, aumentando os níveis de lactato e
produção de importantes macromoléculas para a proliferação celular, favorecendo a
angiogênese e a metástase (BRACCO; BERTONI; WINK, 2014).
Portanto, o envolvimento da HsNTPDase5 em diversos eventos promotores do
câncer faz dela um alvo promissor para a pesquisa e desenvolvimento de novos
fármacos para o tratamento da doença.
1.4 Mecanismo catalítico das NTPDases
O modelo de mecanismo foi proposto por Zebisch e Sträter em um estudo

publicado em 2008, no qual um cristal de NTPDase2 de Rattus novergicus
(RnNTPDase2) foi gerado em diversos estados conformacionais (depositados no PDB
sob os códigos 3CJ1, 3CJ9, 3CJ7 e 3CJA), de modo a se mapear as variações durante
a hidrólise do nucleotídeo. De acordo com o estudo, a hidrólise ocorre primeiramente
no fosfato terminal (-fosfato) do AMPPNP (do inglês adenylyl-imidodiphosphate,
composto análogo ao ATP) pelo ataque nucleofílico de uma molécula de água. Os
resíduos A123, E165 e S206 da NTPDase2 estariam influenciando a posição da água
nucleofílica. Uma segunda molécula de água estaria interagindo com o resíduo Q208
e a água nucleofílica. De acordo com o autor, não há molécula ou resíduo melhor
localizado para realizar o citado ataque nucleofílico (ZEBISCH; STRäTER, 2008). A
distância entre a água catalítica e o grupo -fosfato (3,1Å) e o ângulo de 168,7º entre
esses, assim como a distância entre o grupamento carboxilato e a água catalítica
28
(2,7Å) são fatores que sustentam todo o modelo. A figura 1.7 demonstra o
posicionamento da molécula de água catalítica (molécula 1 destacada em vermelho),
a água que interage com Q208 e a presença do íon de cálcio, acompanhado de mais
quatro moléculas de água.
O resíduo E165 possui a função de base catalítica, observando-se sua
proximidade com a água catalítica e o direcionamento de seu grupamento carboxilato,
facilitando a transferência de elétrons. A importância dos resíduos citados é
sustentada por trabalhos sobre mutações, como por exemplo a substituição do
resíduo E165 nas NTPDases 1 e 3 resultando em perda da atividade catalítica, assim
como a substituição dos equivalentes a S206 nas NTPDases 1 e 3 por uma alanina
(ZEBISCH; STRäTER, 2008).
Figura 1.7: Demonstração de como seria o posicionamento da água catalítica

(molécula 1 em vermelho) e demais resíduos importantes no sítio ativo da
RnNTPDase2 para a hidrólise do substrato.
Fonte: ZEBISCH e STRäTER, 2008.
O íon de cálcio é um catalisador, já que sua possível função no sítio ativo

durante a hidrólise é polarizar uma das ligações P-O (fósforo-oxigênio) do fosfato
29
terminal. A sua importância foi comprovada por estudos onde houve a mutação de
resíduos que estão envolvidos no seu posicionamento dentro do sítio ativo, como os
D45 e D201, T122, E165 e W436, o que resultou na perda de atividade enzimática,
alteração na afinidade pelo substrato ou até mesmo pelo cofator (ZEBISCH;
STRäTER, 2008).
Em um outro estudo, publicado em 2013 por Zebisch et al., a movimentação
dos domínios da RnNTPDase2 na presença do substrato e a dualidade NTP/NDP,
assim como as interações com os diferentes tipos de bases foram demonstrados.
A enzima em seu estado natural adota uma conformação aberta. Com a
aproximação do substrato, as primeiras interações ocorrem com os resíduos R394,
Y350 e H50 e uma movimentação de 3,4º no sentido de adaptação ao tipo de base do
substrato ocorre no domínio II (figura 1.7.a). Logo em seguida, de forma a diminuir a
distância entre o fosfato terminal e o resíduo catalítico E165, ocorre uma segunda
movimentação de 15,1º (figura 1.7.b). Assim, tais movimentações, junto com o fato de
que os NTPs adotam uma conformação mais relaxada quando comparada com a
conformação mais alongada dos NDPs, justificam a enzima metabolizar os dois tipos
de nucleotídeos (ZEBISCH et al., 2013).
30
Figura 1.8: Representação dos movimentos que os domínios fazem com a presença
do substrato no sítio ativo. (A) Aproximação, reconhecimento e captura da base.
Enzima, que está na conformação aberta (cinza), realiza rotação de 3,4º em torno do
eixo representado. (B) Aproximação dos domínios. A forma aberta está representada
em cinza e após rotação de 15,1º em torno do eixo, está representada a forma
fechada em azul/verde. Os resíduos envolvidos na rotação estão representados em
laranja.
Fonte: ZEBISCH e STRäTER, 2008.
No outro modelo existente na literatura, proposto por Kozakiewicz et al. (2008),

o mecanismo da hidrólise do ATP foi proposto em cima da apirase da batata (Solanum
tuberosum) ou StNTPDase1. Neste modelo, a hidrólise ocorre em duas etapas, sendo
a primeira para o -fosfato com a participação dos resíduos S54, T127 e E170 e a
segunda para a hidrólise do - fosfato com a participação dos resíduos T55 e E78. A
figura 1.9 mostra os resíduos citados e o substrato no sítio ativo da enzima.
31
Figura 1.9: Resíduos catalíticos da StNTPDase1. Representação dos principais

resíduos citados e a água nucleofílica (Wat), associado ao ligante, que é o ATP.
Fonte: KOZAKIEWICZ et al., 2008.
A função dos resíduos S54, T127 e E170 seriam de posicionamento do ATP no

sítio ativo, ativação da molécula de água que faria o ataque nucleofílico e
posicionamento dessa molécula de água, respectivamente. Para os resíduos do
segundo grupo, o T55 seria o responsável pelo ataque nucleofílico (KOZAKIEWICZ et
al., 2008).
Assim como no modelo de Zebisch e Sträter (2008), não há interação direta do
íon metálico com os resíduos. Tal interação ocorre por meio de moléculas de água.
Essas mesmas moléculas de água, acompanhadas dos resíduos D50, D197 e E170,
seriam responsáveis pelo posicionamento do íon metálico no sítio ativo da enzima
(NUNES, 2015), como mostrado na figura 1.10.
32
Figura 1.10: Representação das moléculas de água que intermedeiam a

interação do íon de cálcio (Ca) com os resíduos da enzima e o substrato.
Fonte: KOZAKIEWICZ et al., 2008.
Para os estudos de docking receptor-ligante realizados neste trabalho, os

resíduos tidos como importantes para análise das interações e que são compatíveis
com os dois modelos são o E152, S37, T38, R41, Y313, L227, D34 e T110.
1.5 Modelagem por homologia
A estrutura tridimensional de uma proteína e sua função estão profundamente

correlacionadas. É a partir dessa afirmativa que todos os estudos e programas
computacionais de predição de estrutura de proteínas por homologia baseiam-se ao
tentar reproduzir a estrutura nativa de uma proteína, tendo como ponto de partida a
sequência de aminoácidos e uma estrutura molde (template) de referência.
A dependência dos estudos computacionais sobre a estrutura tridimensional de
uma proteína é constante e na ausência das estruturas resolvidas experimentalmente,
a modelagem por homologia se torna uma ferramenta acessível capaz de suprir essa
necessidade (ESWAR et al., 2006; CAPRILES, 2014).
Os atuais métodos de modelagem por homologia produzem um modelo
completo, com todos os resíduos da sequência primária, baseado nas sequências de
um ou mais templates, e de acordo com Eswar et al. (2006), consiste em quatro etapas
(figura 1.11):
33
(i) Identificação de estruturas relacionadas e seleção de template(s): para que a

modelagem por homologia seja viável, a existência de pelo menos uma
estrutura relacionada e elucidada experimentalmente é necessária. Assim, a
busca em banco de dados é feita, procurando-se proteínas com boa
percentagem de similaridade e identidade (cutoff de 25% de identidade) com a
ajuda de algoritmos de alinhamento como o BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool), que compara sequências de nucleotídeos ou proteínas em
bancos de sequências e calcula o quão estatisticamente significante são as
correspondências (CAPRILES, 2014).
Essa ferramenta realiza o alinhamento das regiões das proteínas analisadas
que apresentam maior grau de resíduos idênticos ou similares. O racional disso
vem do fato de que as proteínas possuem um ou mais domínios funcionais na
mesma estrutura, sendo que tais domínios podem se repetir nas mesmas
proteínas de espécies diferentes. Assim, o BLAST identifica essas regiões com
similaridade/identidade, aumentando tais indicadores. Se fosse feito um
alinhamento global, o que considera toda a sequência, a chance de se
identificar tais domínios em comum seria menor, impactando na qualidade do
resultado de identidade e similaridade (HOEPPNER; LATTERNER; SIYAN, 2013;
CAPRILES, 2014).
O papel biológico da proteína a ser escolhida é imprescindível, pois é desejável
que o molde seja da mesma família e tenha a mesma função biológica. Além
disso, a resolução experimental com substratos, no caso de enzimas, também
é essencial, tendo em vista a importância de se saber a localização do sítio
ativo e das diferenças conformacionais na presença ou na ausência do
substrato na estrutura (CAPRILES, 2014);
(ii) Alinhamento global da sequência da proteína alvo com a do template: Com os
moldes escolhidos, o alinhamento global é feito através de programas como o
Clustal e este deve ter aproximadamente 40% de identidade para que seja
confiável. As regiões de gaps (trechos sem correspondências) do alinhamento
resultarão em estruturas preditas a partir de dados estatísticos acumulados
pelos algoritmos utilizados na modelagem (BAKER, 2001; CAPRILES, 2014);
34
(iii) Construção de um modelo baseado no(s) template(s) escolhido(s): A criação

do modelo se dá principalmente pela utilização de técnicas de construção
usando satisfação de restrições espaciais ou a de corpos rígidos (CAPRILES,
2014).
A construção usando satisfação de restrições espaciais ocorre com base nas
estruturas conservadas entre as proteínas e, a partir do alinhamento global,
informações como comprimento das ligações e ângulos diedrais são
transferidas da proteína molde para o modelo (NUNES, 2015).
As informações estatísticas obtidas de uma base de dados proveniente do
alinhamento de diversas proteínas, pertencentes a diferentes famílias com
estruturas resolvidas experimentalmente, permitem a obtenção de funções de
densidade probabilidade que avaliam o alinhamento. Essas funções expressam
relações quantitativas, como a correlação entre duas distâncias C α–Cα
equivalentes de proteínas similares ou a correlação entre ângulos diedrais
equivalentes da cadeia principal ou lateral de duas proteínas similares, e são
usadas como restrições espaciais. Inicialmente, essas funções abrangem
alguns locais da sequência, porém o objetivo final é gerar uma função que
consiga incorporar todas as funções dos segmentos. Assim, com a finalidade
de se construir a função “mestra” que, junto com os métodos de minimização
de energia, responsáveis pelo cálculo do modelo com a melhor energia no
campo de força utilizado, originarão o modelo tridimensional mais apropriado
(NUNES, 2015; ŠALI, BLUNDELL, 1993). Como exemplo de emprego dessa
técnica, temos o programa Modeller, que foi utilizado nesse estudo.
A outra técnica mais utilizada, a de construção utilizando corpos rígidos, ocorre
em etapas, sendo estas a modelagem de regiões conservadas, inserção de
alças e inserção de cadeias laterais (CAPRILES, 2014).
As regiões conservadas são obtidas dos resultados de preditores de estrutura
secundária, que posteriormente são alinhadas com a estrutura molde.
Em cima do modelo inicial, são inseridas as alças ou regiões variáveis, que
fazem a conexão das regiões conservadas já determinadas e por fim, há a
inserção das cadeias laterais dos aminoácidos. Nesta etapa, bibliotecas de
rotâmeros podem ser usadas para a diminuição do tempo computacional, pois
35
facilitam a busca por conformações preferenciais de cadeias laterais que

apresentam ângulos de torção favoráveis (NUNES, 2015);
(iv) Validação do modelo: o objetivo é a avaliação qualitativa do(s) modelo(s)
gerado(s). São feitas avaliações estereoquímicas (gráfico de Ramachandran),
de energia (por exemplo, DOPE, do inglês Discrete Optimized Protein Energy,
calculado pelo programa Modeller), e preservação de domínios e ligações.
Caso sejam apontados erros na estrutura 3D, ajustes podem ser feito, sendo
estes no alinhamento, cadeias laterais ou até mesmo na escolha de novos
moldes (NUNES, 2015).
Figura 1.11: Workflow da modelagem por homologia.
Fonte: Adaptado de ESWAR et al., 2006.

36
1.6 Docking receptor-ligante
A elucidação do modo de interação entre ligantes e receptores é fundamental

para o avanço de estudo direcionados no desenvolvimento de novos fármacos. Para
isso, uma técnica que vem sendo muito utilizada é o docking molecular ou docking
receptor-ligante, que é tido como a base para esses estudos (NUNES, 2015).
Dada a vasta participação de proteínas em diversos eventos biológicos, essas
estruturas são consideradas como os principais receptores em estudos de docking
molecular. As proteínas podem se ligar ao DNA, RNA, outras proteínas e a compostos
orgânicos com ou sem a presença de íons metálicos. Devido a essa variação de
interação, os algoritmos e programas computacionais podem variar, dependendo da
necessidade do estudo (LENGAUER; RAREY, 1996). O foco ao longo do texto será
na compreensão da interação entre proteína e compostos orgânicos, observando-se
a aplicação no presente estudo.
O modelo de chave-fechadura, proposto por Fisher (1894) é utilizado como
base para o desenvolvimento dos softwares de docking. O modelo compara que assim
como a chave se encaixa na fechadura, o ligante se encaixa no sítio ativo, uma região
específica do receptor, e exerce seu efeito (NUNES, 2015). Porém, como se trata de
uma proteína e um ligante, suas flexibilidades devem ser consideradas, de forma a se
aperfeiçoar os estudos e melhorar suas correspondências com a realidade (TOTROV;
ABAGYAN, 2008). Isso ocorreu com o modelo proposto por Koshland, chamado de
encaixe induzido (PAGADALA; SYED; TUSZYNSKI, 2017).
Os resultados do docking permitem uma estimativa das interações entre o
ligante e o receptor, que são influenciadas por fatores entrópicos e entálpicos
(MACHADO, 2007; SILVA, 2008). Esses efeitos podem ser estimados através da
energia livre de Gibbs (∆Glig), que está diretamente relacionada a constante de
equilíbrio de ligação Keq, sendo que esta pode ser calculada experimentalmente. A
seguinte equação demonstra como ∆Glig é calculada:
∆𝐺𝑙𝑖𝑔 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆 = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾𝑒𝑞 (1.1)

37
onde ∆𝐻 é a variação da entalpia, T é a temperatura absoluta, ∆𝑆 é a variação da

entropia e R é a constante universal dos gases. Já a constante de equilíbrio de ligação
pode ser representada pela constante de associação, que é calculada através de
equação exibida abaixo:
[𝑅𝐿]
𝐾𝑎 = [𝑅][𝐿] (1.2)
onde [R] é a concentração do receptor, [L] a concentração do ligante e [RL] a

concentração do complexo receptor-ligante (NUNES, 2015).
O interesse crucial da técnica de docking é a reprodução dos potenciais
químicos, que direcionam as conformações preferenciais das ligações e a energia livre
de ligação, gerando um grupo de conformações que são ordenadas por um escore
com base na sua estabilidade (NUNES, 2015; SILVA, 2008; TROTT; OLSON, 2009).
Uma das características mais importantes dos métodos de docking é a sua
capacidade de reproduzir modos de ligação observados experimentalmente,
funcionando até como uma forma de validação dos mesmos. A fim de se verificar se
as ligações observadas em estruturas resolvidas experimentalmente e as obtidas no
docking são semelhantes, o ligante oriundo da estrutura experimental é extraído e
reinserido por um software de docking (método também conhecido como redocking),
tornando possível a comparação dos resultados experimental e teórico (SILVA, 2008).
De forma sucinta, os dois principais componentes dos softwares de docking são
o algoritmo de busca e uma função que pontua a afinidade (SILVA, 2008). O algoritmo
avalia recursivamente a conformação do ligante, explorando os graus de liberdade
rotacional e translacional até que a energia mínima seja alcançada, enquanto a função
distingue os modos de ligação que teoricamente são mais próximos dos obtidos
experimentalmente dentre os demais modos explorados pelo algoritmo de busca,
classificando as conformações de acordo com a soma das energias eletrostáticas e
de van der Waals (PAGADALA; SYED; TUSZYNSKI, 2017; SILVA, 2008).
Contextualizando as moléculas estudadas, as chalconas, 1,3-difenil-2-
propeno-1-ona, são flavonoides de cadeia aberta com uma estrutura de 15 carbonos
dispostos em uma configuração C6-C3-C6. Eles consistem em dois anéis fenólicos
(anéis A e B) conectados por uma ponte 3C com uma ligação dupla entre posições “á”
e “â” (figura 1.12) (DÍAZ-TIELAS et al., 2016). De acordo com Orlikova et al. (2011),
38
esses metabólitos secundários apresentam grande potencial citotóxico e anticâncer,

fazendo com que se tornem alvos das pesquisas dedicadas ao desenvolvimento de
novos tratamentos para o câncer.
Figura 1.12: Estrutura básica de uma chalcona.
Fonte: Baseado em DÍAZ-TIELAS et al., 2016.
Segundo estudo publicado por Katsori e Litina (2009), além das atividades já
citadas, as chalconas apresentam atividade anti-angiogênese, sendo que o
mecanismo de atuação (citotoxicidade paras as células do endotélio) é similar ao dos
flavonoides. Algumas chalconas, como metochalcona e sofalcona já foram aprovadas
para estudos clínicos por apresentarem resultados satisfatórios nos testes de triagem.
Além disso, sabe-se que a ligação dupla das chalconas possui importante papel
na sua atividade. Quando substituídas, as chalconas assumem a conformação s-
trans, que já se sabe possui maior poder citotóxico nas células malignas da leucemia.
Esse resultado indica que as características geométricas da molécula possuem
importância na atividade biológica (DUCKI et al, 1998).
Já as auronas podem ser definidas como cetonas --insaturadas onde tanto
a carbonila quanto a porção olefínica estão ligadas a grupamentos aromáticos
(DORNAS et al., 2007). A figura 1.13 representa a estrutura descrita.
39
Figura 1.13: Estrutura básica de uma aurona.
Fonte: Baseado em ROUSSAKI et al., 2012.
Apesar dos estudos serem recentes quando comparados aos de outros

derivados flavonoides, as auronas demonstraram atividade anticâncer, colocando-as
na mesma linha de pesquisa das chalconas (ROUSSAKI et al., 2012).
De acordo com Boumendjel (2003), as auronas já apresentaram diversos
resultados satisfatórios na pesquisa do câncer, como na inibição da glicopoteina-P,
responsável pelo efluxo de drogas antineoplásicas, inibição de quinases envolvidas
na multiplicação celular e na interação com receptores de adenina, os quais as
NTPDases podem exercer certa modulação. Uma vantagem destas sobre as
chalconas é a não ciclizacao in situ a qual as chalconas estão sujeitas, possibilitando
a formação de flavononas inativas.
Assim, utilizando as técnicas computacionais mencionadas e que a
infraestrutura da UFJF comporta, o estudo foi desenvolvido com o intuito de se
compreender a nível molecular como é a interação de algumas dessas moléculas com
a HsNTPDase5.
40
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
O presente estudo tem por objetivo, além de modelar a estrutura 3D da

HsNTPDase5, realizar estudos de atracamento (docking) de derivados de chalconas
e auronas, a fim de se obter maiores informações sobre o potencial de inibição dessas
sobre a enzima.
2.2 Específicos
• Avaliar a qualidade do modelo 3D criado através do método de modelagem

por homologia;
• Elucidação das interações das moléculas derivadas de chalconas e auronas
com os resíduos do sítio ativo da HsNTPDase5 por métodos de docking receptor-
ligante;
• Avaliar o potencial de inibição da enzima pelos ligantes testados através dos
resultados de docking e do parâmetro Ki (concentração teórica do ligante que
inibiria a enzima);
41
3 METODOLOGIA
3.1 Modelagem computacional da estrutura 3D da proteína alvo
Para a construção do modelo 3D da HsNTPDase5, o método utilizado foi o da

modelagem por homologia. A sequência de aminoácidos da HsNTPDase5 foi obtida
do banco de dados UniProt sob o código O75356(<http://www.uniprot.org/ >), a
escolha do template foi feita através do banco de dados PDB (<https://www.rcsb.org>)
usando a ferramenta de alinhamento local, o BLAST.
Após o upload da sequência FASTA (sequência de aminoácidos) da proteína
alvo, o BLAST responde exibindo as estruturas que obtiveram os melhores resultados
para alinhamentos locais, com base nos valores de identidade, similaridade e gaps. A
escolha do template é baseada, além dos parâmetros já citados, em cobertura do
alinhamento, qualidade da resolução experimental da estrutura, se o arquivo está
completo ou não (estrutura 100% elucidada) e na presença ou não de ligantes.
Nesta etapa, a estrutura que melhor atendeu a todos estes parâmetros foi a
4BR0 (ZEBISCH et al., 2013), que foi obtida de um cristal de NTPDase2 de Rattus
novergicus por meio do método experimental de cristalografia de raios X. Outro
modelo apresentou os parâmetros necessários para ser considerado um bom
template, porém só a 4BR0 apresentava um ligante, se enquadrando na conformação
fechada, como já foi abordado.
3.1.1. Predição do peptídeo sinal, domínio transmembranar, estrutura

secundária, contato de resíduos e desordem
A predição do peptídeo sinal foi feita utilizando o SignalP 4.0

(<http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/>) (PETERSEN et al., 2011), que
identificou os vinte primeiros resíduos da sequência completa como resíduos clivados.
Para a predição do domínio transmembranar, foi utilizado o TMHMM v. 2.0
(<http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/>) (KROGH et al., 2001), que detectou uma
região transmembranar na porção N-terminal da sequência submetida, confirmando
que a NTPDase5 pode ser ancorada, além de secretada (McCARTHY, 2011;
42
MULERO, 1999). Entretanto, o trabalho com a HsNTPDase5 neste estudo foi em cima
do fato de que ela é secretada, o que justifica o modelo final não possuir uma α-hélice
na região N-terminal.
Para a predição da estrutura secundária da sequência alvo, foram utilizados os
programas NetSurfP (<http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/>) (PETERSEN et
al.,2009), JUFO (<http://www.meilerlab.org/index.php/servers/show?s_id=%205>)
(LEMAN et al., 2013), PORTER (<http://distillf.ucd.ie/porterpaleale/>) (MIRABELLO et
al., 2013) e PSIPRED (<http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/>) (BUNCHAN et al., 2013).
Durante o processo de modelagem, foi necessária a escolha do melhor
posicionamento da porção N-terminal da proteína, um coil que devido a sua grande
extensão, com vinte e sete resíduos, possui um alto grau de liberdade. Esse coil livre
surge quando a proteína tem sua porção de peptídeo sinal clivada e a NTPDase5 é
secretada. Para definir a melhor posição, foram utilizados os preditores de contato
SCRATCH (<http://scratch.proteomics.ics.uci.edu>) (LENA, 2012; LENA, 2012;
POLLASTRI, 2002) e RaptorX (<http://raptorx.uchicago.edu/ContactMap/>) (WANG,
2016; WANG, 2017; MA, 2015), assim como os preditores de desordem DFL
(<http://biomine.cs.vcu.edu/servers/DFLpred/>) (MENG, 2016) e DISPROT
(<http://www.disprot.org>) (PIOVESAN, 2016). Os resultados dos preditores foram
avaliados e, durante a modelagem, critérios de distância e contato foram incorporadas
a estrutura através do script de modelagem, de forma a gerar o coil na melhor posição.
3.1.2. Obtenção dos modelos
A interpretação do arquivo PDB do template foi feita com os programas DSSP

(<https://swift.cmbi.umcn.nl/gv/dssp/index.html>) (KABSCH, 1983; TOUW, 2014) e
Stride (<http://webclu.bio.wzw.tum.de/cgi-bin/stride/stridecgi.py>) (FRISHMAN, 1995)
com o objetivo de identificar domínios conservados entre o template e a sequência
alvo.
O alinhamento global das sequências FASTA do template e da proteína alvo
foram feitos com o programa CLUSTALΩ
(<https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/>) (SIEVERS et al., 2011) e de posse
destes arquivos de alinhamento e estruturas, os modelos foram gerados a partir do
43
programa Modeller, versão 9.15 (ŠALI; BLUNDELL, 1993). As restrições de contato e

estrutura secundária foram feitas no script que é fornecido com o programa para a
realização da modelagem, assim como o número de modelos gerados a cada
alteração, que foram vinte e cinco.
3.1.3. Validação dos modelos
A partir da geração dos modelos e visualizando os mesmos através do

programa PyMOL versão 1.4.1 (Schrödinger, LLC, New York, NY), foi possível
encontrar um estado em que estes atendessem as necessidades do estudo,
considerando as modificações que o Modeller foi capaz de fazer seguindo as
restrições adicionadas no script. Assim, tais modelos passaram pela avaliação de dois
programas, o Procheck (<https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK/>)
(LASKOWSKI et al., 1993) e MolProbity (<http://molprobity.biochem.duke.edu>)
(DAVIS et al., 2007), que são responsáveis por apresentar a qualidade estereoquímica
das estruturas geradas, expondo se os resíduos estão em regiões energeticamente
favoráveis no gráfico de Ramachandran.
Por ser uma metodologia estocástica, é possível que nos modelos gerados na
modelagem por homologia existam resíduos considerados outliers. Assim, cabe aos
especialistas envolvidos no processo decidir se estes terão alguma influência negativa
na continuação dos seus estudos e, por meio de ajustes no preparo da proteína,
eliminá-los na medida do possível, reavaliando as estruturas com os programas já
citados (MARION; SOUZA; CAPRILES; 2017).
3.2 Docking molecular
Os estudos de dockings foram feitos com o software AutoDock Vina (TROTT;

OLSON, 2009), que permite a adição de flexibilidade a resíduos desejados na
proteína. Isso aproxima os resultados do evento real, considerando o elevado grau de
flexibilidade da proteína no ambiente fisiológico.
44
3.2.1. Preparo da proteína e grids
Para a realização dos estudos de docking molecular, a HsNTPDase5 passou

por um preparo, com a adição de hidrogênios, remoção de heteroátomos, ajuste de
outliers e minimização dos hidrogênios, levando em consideração o pH em que a ela
estaria inserida, que foi o pH fisiológico de 7,4  0,2. Tais procedimentos foram
realizados na estrutura 3D da proteína com a ferramenta PrepWizard do pacote
Maestro versão 9.3.5 (Schrödinger, LLC, New York, NY).
De forma a se utilizar a proteína preparada no Maestro para a realização do
docking no AutoDock Vina, a HsNTPDase5 precisou de alguns ajustes com relação
ao formato de arquivo. Para tais, foi utilizada a ferramenta AutoDock Tools (ADT),
versão 1.5.6.
A partir do arquivo pdb da proteína preparada no PrepWizard (Maestro), foi feita
a importação do mesmo para o ADT. Como esta já estava sem heteroátomos e
ligantes, foram apenas adicionados os hidrogênios e cargas de Gasteiger aos átomos,
finalizando o preparo inicial da proteína e já sendo possível salvar o arquivo em pdbqt,
que é o formato aceito pelo AutoDock Vina. A grid pode ser criada na opção “Grid” do
ADT, onde são solicitadas as coordenas do centro (X = 22,27, Y = 34,51 e Z = 21,62)
e número de pontos, o que é equivalente ao tamanho da grid, com 30 Å em todas as
dimensões.
Entretanto, como já mencionado, podemos selecionar a flexibilidade da cadeia
lateral de alguns resíduos. No caso da HsNTPDase5, os resíduos selecionados foram
o E152, S37, T38, R41, Y313, T110, D34 e a L227.
Por fim, geraram-se dois arquivos no final do preparo: um com toda proteína
rígida, exceto os resíduos citados e outro com os resíduos escolhidos para a cadeia
lateral flexível.
3.2.2. Preparo dos compostos
As moléculas derivadas de chalconas e auronas, utilizadas no estudo, cedidas

pelo Prof. D.Sc. Ademar Alves da Silva Filho, atual coordenador do Núcleo de
Identificação e Pesquisa em Princípios Ativos Naturais (NIPPAN), foram desenhadas
45
no software ChemSketch versão 11.0 (Advanced Chemistry Development, Inc., 2015),

exportadas no formato “.mol”, e minimizadas no software Avogadro (HANWELL et al,
2012) com o campo de força MMFF94. Em seguida as moléculas minimizadas foram
também preparadas com a ferramenta ADT passando pela adição de cargas de
Gasteiger e de torsões (permitindo a flexibilidade durante as simulações) e sendo
novamente minimizadas agora com o campo de força AMBER, campo de força padrão
no AutoDock Vina.
3.2.3. Simulações de docking
Com os arquivos da proteína e ligantes preparados, os testes de docking foram

feitos com o AutoDock Vina.
Como este programa não possui interface, para cada simulação foi criada uma
pasta com os arquivos das proteínas, ligantes e um com os parâmetros, que registra
o nome dos arquivos de entrada e saída, informando também o centro e tamanho da
grid e a exaustividade, parâmetro este voltado para diminuir a probabilidade de não
encontrar o mínimo global da função de pontuação.
Após reunir-se todos esses arquivos, o programa foi executado através do
terminal do sistema Linux.
3.2.4. Cálculo do cKi e avaliação de toxicidade
O cKi, que é a constante de inibição da enzima baseado na afinidade é

calculado através da equação abaixo (PHOSRITHONG; UNGWITAYATORN, 2009).
∆𝐺
𝐾𝑖 = 𝑒 (𝑅𝑇) (1.3)
onde G é a energia obtida da simulação, R é a constantes dos gases (1.98719 cal.K-

1.mol-1) e T é a temperatura em Kelvin (298.15°K). O cKi é calculado utilizando os
resultados de afinidade do AutoDock Vina e através da formula acima, o resultado é
expresso em nanomolar (nM), sendo a unidade derivada do Ki experimental. Devido
à necessidade de adequação da unidade do Ki para M (micromolar) no estudo, o
46
resultado final foi multiplicado por 1.000.000. Este varia facilmente com qualquer
alteração da energia, por ser uma equação exponencial e quanto menor seu valor,
significa que menor é a concentração necessária para se inibir a enzima, o que torna
o composto atrativo para desenvolvimento de um futuro fármaco, por exemplo.
No estudo de moléculas candidatas a serem futuros fármacos, os pontos
importantes a serem avaliados são a toxicidade e farmacocinética dessas.
Tradicionalmente, os fármacos eram desenvolvidos a partir de extensos estudos in
vivo e os mais promissores, seguiam para a fase de análise de metabolismo,
farmacocinética e de toxicidade. Eram nessas etapas, após muitos gastos, que efeitos
adversos do uso das moléculas eram identificados e todo o estudo era invalidado
(WATERBEEMD; GIFFORD, 2003).
Assim, em uma tentativa de tornar o processo de desenvolvimento mais eficaz,
esses testes passaram a ser feitos mais cedo e além disso contam com resultados de
predição de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADME/Tox)
por métodos computacionais que são utilizados cada vez mais, auxiliando no desenho
da molécula e evitando investimentos sem futuro (WATERBEEMD; GIFFORD, 2003).
Um exemplo de preditor é o SwissADME (<http://www.swissadme.ch/>), utilizado
nesse estudo, que realiza análises de propriedades físico-químicas, lipofilicidade,
farmacocinética e drogabilidade, ou seja, se a molécula possui características de
favoráveis com a de um fármaco e se viola algumas regras como a de Lipinski,
conhecida como regra dos cinco. Essa regra determina que o alvo do estudo não pode
ter mais do que 5 doadores de ligações de hidrogênio; não mais do que 10 aceptores
de ligações de hidrogênio; deve ter uma massa molecular inferior a 500 daltons e
coeficiente de partição octanol-água log P não superior a 5 para ser uma molécula
promissora (DAINA; MICHIELIN; ZOETE, 2017).
A predição in silico da toxicologia leva em consideração a carcigenocidade,
mutagenicidade, teratogenicidade, irritação, sensibilização e neurotoxicidade, porém
devido a escassez de resultados disponíveis, os softwares ainda estão em fase de
aprimoramento (WATERBEEMD; GIFFORD, 2003). O SwissTargetPrediction
(<http://www.swisstargetprediction.ch/index.php>), utilizado na predição dos alvos
biológicos dessas moléculas, tem a finalidade de ver os principais alvos biológicos,
como enzimas e receptores e consequentemente, a partir de onde é possível se inferir
47
efeitos colaterais que tais moléculas poderiam causar, dando indicações de segurança
e toxicidade das moléculas (GFELLER et al., 2014).
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 O modelo 3D da HsNTPDase5
Para a escolha do template no PDB, a proteína que melhor atendeu às

necessidades do tipo de estrutura que era necessário, incluindo que esta estava na
conformação fechada, foi a 4BR0, que apresentou 28% de identidade e 43% de
similaridade com a HsNTPDase5. O alinhamento global das estruturas está
representado na figura 4.1 abaixo.
Figura 4.1: Representação do alinhamento global entre as sequências da

HsNTPDase5 e 4BR0. As cinco ACRs estão destacadas (cores de preenchimento),
a região clivada (não foi modelada) está em magenta e os oito resíduos com cadeias
laterais flexíveis no docking estão em vermelho.
Após submissão dos arquivos necessários ao funcionamento do Modeller, vinte

e cinco modelos foram gerados. As funções utilizadas na avaliação da qualidade dos
resultados foram a de DOPE score, normalized DOPE score e GA341.
A pontuação do modelo DOPE é projetada para selecionar a melhor estrutura
de uma coleção de modelos construídos pelo Modeller. O escore não é normalizado
em relação ao tamanho da proteína e tem uma escala arbitrária, portanto escores de
proteínas diferentes não podem ser comparados diretamente. Para isso que é
49
utilizado o normalized DOPE score. Já o método GA341 usa a percentagem de

identidade de sequência entre o template e o modelo como um parâmetro.
Além desses parâmetros, ainda há o gráfico de ramachandran. Este, por sua
vez, analisa os ângulos diedrais  (psi) e  (phi) das cadeias principais da proteína e
exibe os resultados através de um gráfico, com as regiões favoráveis e não favoráveis
energeticamente. Por não ser um método empírico, a modelagem por homologia
acaba gerando modelos com resíduos nessas regiões ditas não favoráveis, chamados
de outliers.
Portanto, foi feita a análise das vinte e cinco estruturas geradas, com a
finalidade de avaliar se os outliers gerados teriam algum impacto no estudo de
docking, sendo a proximidade em relação ao sítio ativo o critério utilizado.
Após toda a avaliação, o modelo que melhor atendeu o estudo foi escolhido,
como mostra a figura 4.2 e seus dados do processo de validação estão presentes no
quadro 1 e figuras 4.4 e 4.5. A figura 4.3 exibe o alinhamento da estrutura construída
(HsNTPDase5) com a estrutura molde (4BR0).
Figura 4.2: Modelo escolhido da HsNTPDase 5 gerado pelo programa Modeller. Na

região circulada foi aplicada a restrição de estrutura secundária, no caso, fita- e na
região apontada pela seta foi aplicada a restrição de contato para o coil.
50
Figura 4.3: Alinhamento do modelo construído de HsNTPDase5 (cinza) com o molde

utilizado 4BR0 (azul).
Quadro 1: Dados das avaliações de qualidade da estrutura selecionada.

Modelo Parâmetros
Normalized
DOPE score
HsNTPDase5.B99990012 DOPE score
-39222,82 0,48123
Programas (Ramachandran)
Molprobity
Resíduos nas
Resíduos nas regiões
regiões Outliers
favoráveis
permitidas
97,5%
89,4% (363/406) 10
(396/406)
Procheck
Resíduos nas
Resíduos nas regiões mais
regiões Outliers
favoráveis
permitidas
86,30% 11,40% 5
51
Figura 4.4: Resultado do programa MolProbity para o modelo escolhido de

HsNTPDase5. As regiões favoráveis são as delimitadas pelos círculos azul-claro,
onde a maior parte dos resíduos se encontram e nas regiões não favoráveis os
outliers estão representados com um círculo rosa.
52
Figura 4.5: Resultado do programa Procheck para o modelo escolhido de

HsNTPDase5. As regiões favoráveis estão representadas em vermelho, onde a
maior parte dos resíduos se encontram e as regiões não favoráveis, onde se
encontram os outliers, estão representadas em branco.
Como foi citada a questão dos outliers, o modelo escolhido possuía o resíduo
S310 como um outlier no gráfico de ramachandran do programa Procheck (figura 4.4),
mesmo após preparo no Maestro. Tendo em vista sua proximidade em relação ao sítio
ativo, seu impacto em estudos preliminares de docking com o Maestro foi avaliado,
onde as diferenças notadas não foram de grande alcance, o que justificou a
continuação do estudo no AutoDock Vina com a S310 inalterada.
53
4.2 Estudos de docking receptor-ligante
Segue abaixo (quadro 2) as estruturas 2D das moléculas utilizadas neste

trabalho, sendo as três primeiras pertencentes à subclasse das chalconas e as demais
pertencentes à subclasse das auronas.
A cardamonina (a) já foi citada em estudos envolvendo inibição da NTPDase
de Schistosoma mansoni, parasito causador da esquistossomose (CASTRO et
al.,2015) e em estudos do câncer, onde esta inibe a atuação da mTOR (NIU et al.,
2018), que está envolvida com a expressão da HsNTPDase5. A uvangoletina (c) já foi
citada em estudos, por exemplo, envolvendo apoptose induzida em células
neoplásicas (ZHENG, et al., 2015) e as demais moléculas (“b”, “d”, “e”, “f”, “g” e “h”)
ainda estão sendo exploradas. Com a proteína preparada, as simulações foram
executadas, sendo os resultados obtidos no AutoDock Vina disponibilizados na tabela
1.
54
Quadro 2: Estruturas dos ligantes utilizados no estudo.
(b) IA-C2
(a) Cardamonina
(c) Uvangoletina
(d) LS06
(e) LS23
(f) LS24
(g) LS26
(f) LS29
55
Tabela 1: Resultados das energias, interações e Ki para as simulações com a

HsNTPDase5 no AutoDock Vina.
Compostos Energia (Kcal/mol) Interações Ki calculado (M)
ARG41, THR38,
LS06 -7,9 1,62
GLU152.
LS23 -7,1 ARG41, TRP392. 6,25
LS24 -7,9 ARG41, THR38. 1,62
THR110, GLU152,
LS26 -7,8 1,92
ARG41.
LS29 -9,0 ARG41, THR38. 0,25
ARG41, GLU152,
Cardamonina -8,0 1,37
SER37.
GLU152, SER37,
Uvangoletina -7,7 2,27
TRP392, ARG41.
TRP392, GLU152,
IA-C2 -7,4 3,76
ARG41.
Observa-se na tabela 1 as energias obtidas em Kcal/mol, que demonstram a

afinidade do ligante pela enzima. Essa afinidade se baseia na energia mínima do
ligante e nas interações entre ele e os resíduos mais próximos, sendo tais interações
(ponte de hidrogênio e dipolo-induzido), descritas na terceira coluna da tabela.
A figura 4.6 exibe de forma geral o posicionamento de todos os ligantes no sítio
ativo da proteína nos melhores resultados dos seus respectivos dockings. Tal imagem
tem a finalidade de comparar as conformações dos ligantes no sítio da HsNTPDase5.
56
Figura 4.6: Posicionamento dos ligantes testados no sítio ativo da HsNTPDase5. É

perceptível que não houve variação brusca nas conformações, o que demonstra um
padrão na forma em que os ligantes se estabilizam no sítio.
As imagens 4.7 a 4.14 a seguir representam os ligantes no sítio ativo da

proteína HsNTPDase5 e suas interações com os resíduos mais próximos. A S310 está
representada em todas as imagens com o intuito de mostrar que não houve interação
entre ela ou qualquer um dos compostos testados.
57
Figura 4.7: Representação do docking entre o composto Cardamonina e a

enzima HsNTPDase5. Os resíduos flexíveis estão indicados, assim como os
resíduos que interagiram com o ligante (linhas tracejadas em amarelo e
distâncias indicadas em ångström (Å) entre o ligante e ARG41, GLU152 e
SER37), garantindo sua estabilidade no sítio.
58
Figura 4.8: Representação do docking entre o composto IA-C2 e a enzima

HsNTPDase5. Os resíduos flexíveis estão indicados, assim como os resíduos
que interagiram com o ligante (linhas tracejadas em amarelo e distâncias
indicadas em ångström (Å) entre o ligante e TRP392, GLU152 e ARG41),
garantindo sua estabilidade no sítio.
59
Figura 4.9: Representação do docking entre o composto Uvangoletina e a enzima

indicadas em ångström (Å) entre o ligante e GLU152, SER37, TRP392 e
ARG41), garantindo sua estabilidade no sítio.
60
Figura 4.10: Representação do docking entre o composto LS06 e a enzima

indicadas em ångström (Å) entre o ligante e ARG41, THR38 e GLU152),
61

indicadas em ångström (Å) entre o ligante e ARG41 e TRP392), garantindo sua
estabilidade no sítio.
62

HsNTPDase5.Os resíduos flexíveis estão indicados, assim como os resíduos que
interagiram com o ligante (linhas tracejadas em amarelo e distâncias indicadas
em ångström (Å) entre o ligante e ARG41 e THR38), garantindo sua estabilidade
no sítio.
63

indicadas em ångström (Å) entre o ligante e THR110, GLU152 e ARG41),
64

indicadas em ångström (Å) entre o ligante e ARG41 e THR38), garantindo sua
estabilidade no sítio.
Através da análise dos resultados apresentados na tabela 1 e nas imagens 4.7

a 4.14, os resultados das energias se mantiveram entre -7,1 e -9,0 Kcal/mol. Estes
podem ser melhorados com futuros estudos de dinâmica e docking com ligante e
proteína flexíveis. Os ligantes que apresentaram os melhores valores, ou seja,
aqueles com as menores energias foram a LS29, seguido da Cardamonina, LS24 e
LS06. Estes consequentemente apresentaram os melhores Ki calculados.
De acordo com os resultados do preditor SwissADME, nenhum dos ligantes
violou as regras de Lipinski. Entretanto, de acordo com os gráficos gerados para a
biodisponibilidade oral (figura 4.15), todas as moléculas extrapolaram o parâmetro de
instauração, pois todas possuem grande número de ligações duplas, sendo que as
que apresentaram os resultados mais aceitáveis foram a Uvangoletina, LS06, LS24 e
LS29. Segundo o SwissTargetPrediction (STP), os melhores são a LS29, LS23 e
LS26. Os resultados do STP são as probabilidades dos compostos testados em
65
interagir com enzimas do corpo humano. No caso das três, as percentagens para
interações com quinases, desconhecidos e outros tipos de enzimas foi similar. A
vantagem nesses resultados está no fato de que há interação com proteínas que têm
ATP como substrato (quinases) e que os resultados “outros tipos de enzimas” e
“desconhecidos” podem ser uma chance de inovação na pesquisa, mas também um
alerta para possíveis efeitos que possam ser prejudiciais se não elucidados.
A LS23, apesar de não ter apresentado a menor energia, foi bem avaliada pelo
STP, fazendo dela uma boa candidata para maiores estudos, junto com a LS29 LS24.
A LS06 e a Cardamonina, apesar de terem apresentado boa energia, não foram bem
avaliadas pelos resultados dos dois preditores, fazendo com que investimentos no
estudo com essas moléculas não sejam favoráveis para essa enzima. Assim, a LS29
e a LS24 são os melhores compostos quando observados em conjunto os resultados
dos dockings e preditores SwissADME e SwissTargetPrediction.
66
Figura 4.15: Exemplo de gráfico gerado pelo SwissADME. Parâmetros que a

molécula precisa respeitar (região rosa) para que tenha boa biodisponibilidade oral.
“LIPO”: lipofilicidade; “SIZE”: tamanho; “POLAR”: polaridade; “INSOLU”:
insolubilidade; “INSATU”: insaturação e “FLEX”: flexibilidade.
As interações por meio das ligações de hidrogênio e dipolo-dipolo das cadeias

laterais dos resíduos importantes mencionados nos dois modelos de mecanismos com
os compostos ocorreram em todas as simulações. Isto favorece na inibição da enzima,
por garantir a estabilidade do ligante na cavidade da proteína. Além disso, o
posicionamento de todos os ligantes se mostrou favorável, por estarem a uma
distância de 2 a 3 Å dos resíduos flexíveis, o que fortaleceu as interações e impediria
uma aproximação do substrato da enzima e possível deslocamento do ligante. Esses
resultados são apoiados pelo estudo publicado por Demirayak et al. (2015), onde este
afirma que a atividade biológica que as chalconas e auronas apresentam sobre as
enzimas que tem o ATP como substrato, se deve em parte pela similaridade dos anéis
dos flavonoides com os da adenina do ATP, o que consolida a linha de pesquisa e
fortalece o racional de que há moléculas naturais ou sintéticas dessa classe que
podem ter uma atividade biológica almejada pelos cientistas envolvidos na pesquisa
de tratamento do câncer.
Apesar de o foco ser a inibição da enzima, deve-se pensar o que isso
acarretará. Como já discutido, as NTPDases estão envolvidas na sinalização
purinérgica, um processo essencial em diversos processos biológicos, como
67
neurotransmissão, atividade secretória de células exócrinas e endócrinas,

crescimento celular, apoptose, regulagem das funções de células imunológicas e etc.
A inibição pode ter consequências em todos esses processos, que devem ser levados
em consideração no avançar do estudo (ABBRACCHIO; BURNSTOCK, 1998).
De acordo com o estudo publicado por McCarthy (2011), no qual, com a
finalidade de mensurar a atividade catalítica ATPasica intracelular da NTPDase5,
foram desenvolvidos lipossomas com ATP encapsulados. As células utilizadas
apresentaram boas taxas de absorção e os estudos permitiram a determinação dos
tempos ideais de incubação, para que o delivery fosse eficaz e não provocasse
concentrações tóxicas. Esta técnica seria uma boa aplicação no estudo aqui realizado,
com a finalidade de aumentar a especificidade das moléculas pelos alvos pretendidos
sem causar efeitos adversos, tendo em vista os resultados promissores de algumas
moléculas como as duas melhores já citadas.
68
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Dada a importância da HSNTPDase5 nos mecanismos de desenvolvimento e

progressão do câncer e a necessidade de se encontrar tratamentos mais eficazes, a
enzima tornou-se um alvo-terapêutico promissor e cada vez mais estudado.
Nesse trabalho, apresentamos um modelo 3D inédito da HsNTPDase5 gerado
pelo método da modelagem por homologia, sendo capaz de atender às necessidades
dos estudos de docking receptor-ligante. A estrutura apresentou um baixo número de
outliers, sendo que o mais próximo do sítio (S310) não representou uma interferência
qualitativa nos valores das energias e na posição dos ligantes.
Os estudos in silico são indicativos de como seria o comportamento dos objetos
de estudo em condições determinadas. Assim, os resultados gerados se mostraram
favoráveis a considerar alguns compostos, como a LS29 e a LS24, candidatos a
maiores estudos tendo a HSNTPDase5 como alvo. Uma vez que o controle rígido das
condições não ocorre em estudos in vitro e in vivo, como ocorre no in silico, uma forma
de melhorar as análises e obter resultados mais robustos seria o investimento na linha
de pesquisa. O campo de estudos in silico ainda possui recursos que poderiam
aprimorar os resultados, como estudos de dinâmica molecular, onde o comportamento
da proteína seria avaliado e a partir disso, estruturas com melhor qualidade seriam
geradas. A utilização de softwares para docking onde o ligante e a proteína possam
ser considerados flexíveis ou a elucidação da HsNTPDase5 por métodos
experimentais, como RMN ou cristalografia também poderiam contribuir para uma
análise mais detalhada da interação proteína-ligante.
As perspectivas são os estudos in vitro e in vivo, onde estes poderiam
determinar as reais concentrações terapêuticas das moléculas testadas e quando
estas passam a ser tóxicas, além das células em que atuam melhor e bem como suas
avaliações farmacocinéticas.
69
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

GABRIEL MACEDO MARION

MODELAGEM COMPUTACIONAL DA NTPDase5 DE Homo sapiens E ESTUDOS

MODELAGEM COMPUTACIONAL DA NTPDase5 DE Homo sapiens E ESTUDOS

Trabalho de Conclusão de Curso

Orientadora: Dra. Priscila Vanessa Zabala Capriles Goliatt

Lana Del Rey

O câncer é um grupo de doenças, nas quais as células do organismo começam a se

Palavras-chave: NTPDase5, PCPH, câncer, docking molecular, modelagem por

Key words: NTPDase5, PCPH, cancer, molecular docking, homology modeling,

Figura 1.1 Perfil do câncer no Brasil entre o público masculino em 2014 13

Figura 1.2 Perfil do câncer no Brasil entre o público feminino em 2014 13

Figura 1.5 Mapa do mundo mostrando a migrações e o impacto disso no

desenvolvimento dos tipos de câncer 17

Figura 1.6 Isoformas das NTPDases e suas localizações 24

Figura 1.7 Demonstração de como seria o posicionamento da água catalítica

(molécula vermelha - 1) e demais resíduos importantes no sítio ativo da RnNTPDase2

para a hidrólise do substrato 28

do substrato no sítio ativo 30

Figura 1.9 Resíduos catalíticos da StNTPDase1 31

Figura 1.10 Representação das moléculas de água que intermedeiam a interação do

íon de cálcio com os resíduos da enzima e o substrato 32

Figura 1.11 Workflow da modelagem por homologia 35

Figura 1.12 Estrutura básica de uma chalcona 38

Figura 1.13 Estrutura básica de uma aurona 39

Figura 4.1 Representação do alinhamento global entre as sequências da

Figura 4.2 Modelo escolhido da HsNTPDase 5 gerado pelo programa Modeller 49

utilizado 4BR0 (azul) 50

Figura 4.4 Resultado do programa MolProbity para o modelo escolhido de

Figura 4.5 Resultado do programa Procheck para o modelo escolhido de

Figura 4.6 Posicionamento dos ligantes testados no sítio ativo da HsNTPDase5 56

Figura 4.7 Representação do docking entre o composto Cardamonina e a enzima

Figura 4.8 Representação do docking entre o composto IA-C2 e a enzima

Figura 4.9 Representação do docking entre o composto Uvangoletina e a enzima

Figura 4.10 Representação do docking entre o composto LS06 e a enzima

Figura 4.11 Representação do docking entre o composto LS23 e a enzima

Figura 4.12 Representação do docking entre o composto LS24 e a enzima

Figura 4.13 Representação do docking entre o composto LS26 e a enzima

Figura 4.14 Representação do docking entre o composto LS29 e a enzima

Figura 4.15: Exemplo de gráfico gerado pelo SwissADME 66

Quadro 1 Dados das avaliações de qualidade da estrutura selecionada 50

Tabela 1 Resultados das energias, interações e Ki para as simulações com a

1.1.1. Definição e contextualização

A multiplicação desordenada de células que invadem os tecidos e órgãos e,

Figura 1.1: Perfil do câncer no Brasil entre o público masculino em 2014.

15% Traqueia, brônquios

Fonte: OMS, 2014.

Figura 1.2: Perfil do câncer no Brasil entre o público feminino em 2014.

Fonte: OMS, 2014.

A estimativa para os anos de 2018 e 2019, de acordo com o Instituto Nacional

Fonte: INCA, 2017.

Fonte: INCA, 2017.

1.1.2. Causas internas e externas

As células cancerosas violam regras básicas do comportamento normal e

(v) As células cancerosas malignas devem sobreviver e proliferar em um ambiente

As causas externas podem ser também chamadas de causas evitáveis. De

Figura 1.5: Mapa do mundo mostrando as migrações e o impacto disso no

Fonte: ALBERTS et al., 2010.

A idade também é um fator que possui grande influência no desenvolvimento

Por ser uma patologia com localização e aspectos clínico-patológicos múltiplos

interesse em manter políticas de conscientização e importância do diagnóstico

(ii) Tomografia computadorizada helicoidal em baixa dose: por possuir maior