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Florianópolis
2011
Priscila Graziela Alves Martins
________________________
Prof., Dr. Marcelo Farina
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
________________________ ________________________
Prof. Dr. Hernán Terenzi Dr. Guilherme Razzera
Orientador Universidade Federal de Santa
Universidade Federal de Santa Catarina
Catarina
________________________ ________________________
Dr. Javier Vernal Prof., Dr. Carlos Peres Silva
Co-Orientador Universidade Federal de Santa
Universidade Federal de Santa Catarina
Catarina
________________________
Prof., Dr. Ronaldo da Silva
Mohana Borges
Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho (UFRJ)
À minha família, meu namorado, meus amigos e
àqueles que me apoiaram e torceram por mim.
AGRADECIMENTOS
William Harvey
RESUMO
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
GSH glutationa reduzida
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato
PMSF fluoreto de fenil metil sulfonila
pNPP p-nitrofenilfosfato
pNP p-nitrofenol
PTK protein tyrosine kinase
PTP protein tyrosine phosphatase
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
TEV Tobacco etch vírus
Tris tris (hidroximetil) aminometano
Yop Yersinia outer membrane proteins
SUMÁRIO
1.0 INTRODUÇÃO 25
1.1 Doença de Chagas 25
1.2 Trypanosoma cruzi 27
1.3 Yersinia spp 29
1.4 Proteínas Tirosina Fosfatases (PTPs) 31
1.5 Inibidores de fosfotirosina fosfatases 33
1.6 Arsenato redutases 35
2.0 OBJETIVOS 39
2.1 Objetivo Geral 39
2.2 Objetivos específicos 39
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS 41
3.1 Transformação das bactérias Escherichia coli 41
3.1.1 Preparação de células competentes para transformação 41
3.1.2 Transformação de bactérias E. coli BL21(DE3)pLysS com os
vetores pDEST17-PTP e pTH24-TEVSH 41
3.1.3 Transformação de bactérias E. coli BL21(DE3) com os vetores p7-
7Yop51*∆162 e PET101/D-TOPO-GRX1 42
3.2 Expressão das proteínas recombinantes 42
3.2.1 Expressão da fosfotirosina fosfatase putativa de Trypanosoma
cruzi 42
3.2.2 Expressão da protease TEV 43
3.2.3 Expressão da proteína glutaredoxina 1 de E. coli 43
3.2.4 Expressão da proteína YopH de Yersinia enterocolitica 43
3.3 Purificação das proteínas recombinantes 44
3.3.1 Purificação da fosfotirosina fosfatase putativa de Trypanosoma
cruzi 44
3.3.2 Purificação da protease TEV 45
3.3.3 Purificação da glutaredoxina 1 de E. coli 45
3.3.4 Purificação da YopH da Yersinia enterocolitica 45
3.4 Clivagem da fosfotirosina fosfatase putativa de Trypanosoma cruzi
com a protease TEV 46
3.5 Separação da fosfotirosina fosfatase putativa da protease TEV e da
cauda de histidina 46
3.6 Modelagem computacional da estrutura da PTP putativa de
Trypanosoma cruzi 47
3.7 Teste de atividade de fosfatase da PTP putativa de T. cruzi 48
3.8 Teste de atividade de arsenato redutase 48
3.9 Triagem de inibidores para a fosfotirosina fosfatase (YopH) de
Yersinia enterocolitica 49
3.10 Cálculo de IC50 50
3.11 Cinética enzimática 51
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO 53
4.1 Obtenção das proteínas recombinantes 53
4.1.1 Obtenção da PTP putativa de Trypanosoma cruzi 53
4.1.2 Obtenção da protease TEV 55
4.1.3 Obtenção da glutaredoxina 1 de E. coli 56
4.1.4 Obtenção da fosfotirosina fosfatase (YopH) de Yersinia
enterocolitica 57
4.2 Separação da fosfotirosina fosfatase putativa da protease TEV e da
cauda de histidina 58
4.3 Modelagem computacional da estrutura da PTP putativa de
Trypanosoma cruzi 59
4.4 Teste de atividade de fosfatase com a enzima PTP putativa de
Trypanosoma cruzi 60
4.5 Teste de atividade de arsenato redutase com a enzima PTP putativa
de Trypanosoma cruzi 62
4.6 Triagem de inibidores da fosfotirosina fosfatase YopH de Yersinia
enterocolitica 64
4.7 Cálculos de IC50 64
4.8 Cinética enzimática 67
5.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS 71
6.0 PERSPECTIVAS 73
REFERÊNCIAS 75
APÊNDICE A – Compostos sintéticos testados na YopH 85
25
1.0 INTRODUÇÃO
2. OBJETIVOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3000
100
2500
% de tampão B
2000
FT
mAU
1500 50
1000 1 2
25
500
0
0
0 10 20 30 40 50 60
mL
3000
100
2500
% de tampão B
2000
mAU
FT
1500 50
1
1000
2 25
500
0
0
0 8 16 24 32 40 48
mL
2500
1
% de tampão B
2000
mAU
1500 50
1000
2 25
500
0
0
0 10 20 30 40 50 60
mL
3000
100
2500
75
% de tampão Y+
(NaCl 500 mM)
2000
FT
mAU
1500 50
3
1000 2
25
500
1
0
0
0 10 20 30 40
mL
Figura 19. Disposição dos elementos cisteína 114 (C114), Arginina 120 (R-
120), ácido aspártico 75 (D75) e glutamina 156 (Q156) no modelo estrutural da
PTP de Trypanosoma cruzi.
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tempo (min)
0.8
0.7
0.6
0.5
0 1 2 3 4 5
Tempo (min)
O
CF3
P4 O 15,08 ± 1,12 µM
O
O2N O
O
R28 O 20,29 ± 1,11 µM
(P4, P11, L46) esta observação não se aplicaria pois estes possuem
apenas dois anéis aromáticos.
Figura 22. Estudo cinético da inibição da YopH pela chalcona L46. O gráfico
duplo-recíproco de Lineweaver- Burk mostra uma inibição do tipo competitiva.
Figura 23. Estudo cinético da inibição da YopH pela chalcona P4. O gráfico
duplo-recíproco de Lineweaver- Burk mostra uma inibição do tipo competitiva.
Figura 24. Estudo cinético da inibição da YopH pela chalcona P11. O gráfico
duplo-recíproco de Lineweaver- Burk mostra uma inibição do tipo competitiva.
69
Figura 25. Estudo cinético da inibição da YopH pela chalcona R28. O gráfico
duplo-recíproco de Lineweaver- Burk mostra uma inibição do tipo competitiva.
6.0 PERSPECTIVAS
REFERÊNCIAS
N N
OCH3
A16 OH O C9 O NH
O
B81 OH O COOH
C10 O
Br
N
H3CO OCH3 O S
O
C1 H3CO
O
C11 O
H3 C
OCH3
C2 OCH3 O
C12 S
O
Cl
C3 H3CO
O
C13 OH O
HO H3CO OCH3
OCH3
C4 Cl O
C24
O
H3CO
H3CO
OCH3
Cl
C5 C25
O O
Cl
Cl Br
C6 H3CO
O
C26 O
Continua...
86
Continua...
C27 D4
OH O O OCH3
CH3O OCH3
OCH3
C28 D05
O O OCH3
CH3O
CH3O OCH3
H3CO OCH3
O2 N OCH3
O2N
OCH3
C30 D07
O O OCH3
O2 N
O2N
OCH3
OCH3
C31 D08
O O OCH3
H3CO HO
OCH3
HO
OCH3
C33 D09
O OCH3 O OCH3
H3CO
H3CO OCH3
OCH3 OCH3
O OCH3
C37 OCH3 O
D10
HO OCH3
OCH3 OCH3
OCH3
C38 D12
NO2 O OH O OCH3
OCH3
OCH3
D01 D13
O OCH3 O OCH3
Br OCH3 N OCH3
N
OCH3 OCH3
D02 D14
OCH3 O OCH3 O OCH3
D3 D15
O OCH3 OCH3 O OCH3
Continua...
87
Continua...
D17 O
O OCH3
J14 OCH3 O
OCH3 H3CO
OCH3 OCH3
J04 OCH3 O
J18 OCH3 O
H3CO H3CO F
OCH3 OCH3
OCH3 O Cl
J06 OCH3 O
Cl
J19
H3CO Cl H3CO
OCH3 OCH3
J07 OCH3 O
J20 OCH3 O OCH3
J08 OCH3 O
J21
OCH3 O OCH3
CH3
H3CO N H3CO H3CO OCH3
J09 OCH3 O Cl
J22 OCH3 O
H3CO NO2
H3CO Cl
OCH3
OCH3
J11 OCH3 O
J23 OCH3 O
H3CO H3CO
OCH3 OCH3
J12 OCH3 O
Cl
J24 OCH3 O COOH
H3CO H3CO
OCH3 OCH3
J13 OCH3 O
J25 OCH3 O
OCH3
Continua...
88
Continua...
J27 OCH3 O
J52 OCH3 O
OCH3
NO2
H3CO OCH3
H3OC
OCH3
OCH3
J28 OCH3 O
Cl
J54 OCH3 O
CF3
H3CO H3CO Cl
OCH3 OCH3
J29 OCH3 O
J55 OCH3 O
Cl
H3CO
H3CO Br
OCH3 Cl
OCH3
J30 OCH3 O
J56 OCH3 O
H3OC O
H3CO CF3
OCH3
OCH3
J31 OCH3 O
OCH3
J57 OCH3 O
CF3
H3CO
H3CO OCH3
OCH3
OCH3 OCH3
J33 J61
OCH3 O F OCH3 O
H3CO
H3CO Cl N
OCH3
OCH3
J34 OCH3 O Cl
J62 OCH3 O
OCH3
H3CO Cl N
H3CO
OCH3
OCH3
J35 OCH3 O OH
J63 OCH3 O
F
H3CO
H3CO
OCH3
OCH3
J42 OCH3 O
J65 OCH3 O
CN
H3CO
H3CO COOH
OCH3
OCH3
J46 OCH3 O
OCH3
J66 OCH3 O
NO2
H3CO OH H3CO OH
OCH3 I OCH3
Continua...
89
Continua...
J68 L11
OCH3 O O
Cl
OCH3
O O
H3CO O OCH3
J69 OCH3 O
L12 O
S O O
H3CO O O
OCH3
L1 O
L13 O
O O
O O CH3
Cl
L2 O
L14 O
O Cl O
CH3
O N
O
CH3
L3 O Cl
L15 O
O O
O O
Cl
L4 O
L16 O
O Cl
O
O Cl O
L5 O
L17 O OCH3
O O
O H3CO
O NO2
L6 L18
O O
NO2 O
O
O O CH3
O
L7 L19
O O
O O
O Br O F
L8 O
L20 O F
O O
O OCH3 O
L9 L21
O OCH3 O
O
O
O OCH3
O
OCH3
L10 O OCH3
L22 O NO 2
O O
O H3CO OCH3
O
Continua...
90
Continua...
L23 O Cl
L42 O
CF3
O
O
O
O
L24 O
L43 O
O
Cl
O O
CH3 O
O Cl
L25 O
OCH3
L44 O
O Cl
O Cl
O
L26 O
L45 O
O OCH3 O Br
O O
OH
L27 O
L46 O
O
O
Cl
O S
O
CF3
O
L28 O
OCH3
L47 O
O
OCH3
O
O O Cl N
O
L29 O OCH3
L48 O
O
O O Cl N
OCH3
L38 O
L50
O
OCH3 O O
O
O
O OCH3 O2N
L39 O
L51 O OCH3
OCH3
O O
O O OCH3
CN
L40 O
CF3
Lou 2 OCH3 O
OCH3
O
Cl N
O Cl OCH3
L41 O
Lou 3 OCH3 O
O
Cl
O CF3 CF3
OCH3
Continua...
91
Continua...
Lou 4 OCH3 O O2N M13 H3CO
O
H3CO O
OCH3
OCH3
N
H3CO
M5 O
M16 H3CO
O
H3CO Cl
H3CO OCH3
H3CO Cl
OCH3
OCH3
M6 H3CO
O
M18 H3CO
O OCH3
OCH3 OCH3
M7 H3CO
O
M20 H3CO
O
OCH3
M8 H3CO
O Cl
M24 H3CO
O OCH3
M9 H3CO
O
M25 H3CO
O
OCH3
H3CO Br H3CO OH
OCH3 OCH3
M10 H3CO
O
M26 H3CO
O
O
CH3
H3CO NO2 H3CO
OCH3 OCH3
M11 H3CO
O
M30 H3CO
O
CF3
M12 H 3CO
O
M32 H3CO
O
Cl
H 3CO F H3CO
OCH 3 OCH3 Cl
Continua...
92
Continua...
M33 H3CO
O Cl
P11 O2N
O
O
H3CO Cl
OCH3
N9 OCH3 O
P12
O
H 3C O O
N
H 3C O O
N OCH 3
OCH3
P1 O
P13 NO2 O
O O
O O
P3 O
R6 OCH3 O
OCH3
O
Br O H3CO O
P4 O
R7 O
NO2
O
O2N O
P5 OCH3 O
R8 O
O NO2
OCH3
P6 OH O
R9 O NO2
O
P7 H3CO
O
R10 O
O Cl
HO
P8 O
R11 O
Cl
O
H3CO O
Cl
P9 H3CO
O
R12 O Cl
H3CO O Cl
P10 R13
OCH3 O O
O Cl
H3CO O
Continua...
93
Continua...
R14 O Cl
R27 O
R15 R28
O O
R16 O
R29 O
CH3
R17 R30
O O
OCH3
R19 O OCH3
R32 O
COOH
H3CO
R20 O OCH3
R36 O
O
CH3
OCH3
OCH3
R21 O
R42 O OCH3
CH3
N
CH3 OCH3
R23 R44
O O OCH3
O CH3
H3CO OCH3
R24 R45
O O
OCH3
O
F
R25 O F
R46 O
OCH3
Br O
R26 O
R48 O
Cl
Br
Cl
Continua...
94
Continua...
R49 O
R56 O
CF3 O
O 2N
R50 O
R57 O
OCH3
Cl N
CF3
R51 O
R58 O
OCH3
CF3
N N O
Cl
R52 O
R61 O
S OCH3
Cl
CN O
R53 O
R62 OCH3 O
Br OCH3
O
OCH3
R54 O Cl
T43 OCH3 O
H3CO OCH3 O
Cl
R55 O OCH3
T46 OCH3 O
OCH3
H3CO OCH3
OCH3
95
F2 OCH3
OCH3
F11 OCH3
OCH3
H H
N O N
N OCH3 N OCH3
O O
O
Br
F3 OCH3
OCH3
F12 OCH3
OCH3
H Cl H
N
N OCH3 N
N OCH3
O
O 2N O
F4 F13
OCH3 OCH3
OCH3 OCH3 H OCH3
H
N
N N
N OCH3 OCH3
O
O
H3CO
OCH3
F5 F14
OCH3 OCH3
OCH3 F H
H OCH3
Br N N
N OCH3 N
O
OCH3
O
HO
OCH3
F6 F16
OCH3 OCH3
F7 F17
OCH3 OCH3
OCH3 H OCH3
H
N
H3CO N N
N OCH3 OCH3
O
O F
HO
F8 F18
OCH3 OCH3
OCH3 H OCH3
H
N
N N
N OCH3 OCH3
O
O
O
F9 F19
OCH3 OCH3
OCH3 H OCH3
H
N
N N
N OCH3 OCH3
O
O CH3
Continua...
96
Continua...
F20 OCH3
F38 OCH3
H H H OCH3
OCH3
N N N
N N
OCH3 OCH3
O
N O
F21 F39
OCH3 OCH3
H OCH3 H OCH3
O2N N CH3O N
N N
OCH3 OCH3
O O
F23 F41
OCH3 OCH3
H OCH3 OH H OCH3
N
N N
OCH3
N
CH3 O OCH3
N O
CH3
Br
F24 F42
OCH3 OCH3
Cl H H OCH3
OCH3
CH3O N
N N
N OCH3
OCH3 O
O O
Cl
F25 H
OCH3
F43 Cl H
OCH3
OCH3 OCH3
Cl N N
N N
OCH3 OCH3
O O
Cl
F29 H
OCH3
F44 H
OCH3
OCH3 OCH3
S N CH3O N
N N
NO2 OCH3
OCH3
O O
CH3O
CH3O
F30 F46
OCH3 OCH3
COOH H H OCH3
OCH3
N
N N
N OCH3
OCH3 O
O F3C
F31 OH H
OCH3
F47 H
OCH3
OCH3
OCH3
Cl N
N N
N OCH3
OCH3 O
O
Cl
F32 H
OCH3
F48 H
OCH3
OCH3 OCH3
O N F3C N
N N
CH3
OCH3 OCH3
O O
Cl
F35 H
OCH3
OCH3
O N
N
OCH3
O
HO
97
Y07 O
Z7 OCH3
O
N N CH3 CH3O
NO2 N N CH3
O
CH3O
OH O
CH3O OH
Y13 O Z8 CH3O
OCH3
O
N N CH3 N N CH3
CH3O
O O
Y17 O
Z43 OCH3
O
CH3O
N N CH3
N N CH3
O O CH3O Cl
O
O
Cl
Cl
98
Cl
NO2
K13 K87
O O
O
O
O N S NH
O N S NH O N
O N CH3 O
CH3 O
Br
K14 K140
O O
O H3C S NH
O N S NH O N
O N
CH3 O
NO2
CH3
K15 O
O 1-naftil
O N S NH 8Q
O N
CH3 O
OCH3
K16 O
O SH140 O
H 3C S NH
O N S NH
N O NH2
O
CH3 O
NO2
K19 O
O p-OCH3-
O N S NH
N
8H
O
CH3 O
Cl
Cl
99
Inibidor Estrutura
K4 O
O
O N S N O
O
CH3 O
K6 O
O
O N S N
O
CH3 O