ELOAH CHRISTINA LYRIO NERI

PAPEL DA VITAMINA D NA INDUÇÃO DE OXIDO NÍTRICO E

PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM MACRÓFAGOS E CELULAS
DENDRÍTICAS INFECTADOS POR Leishmania braziliensis
 ELOAH CHRISTINA LYRIO NERI

PAPEL DA VITAMINA D NA INDUÇÃO DE OXIDO

NÍTRICO E PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM
MACRÓFAGOS E CELULAS DENDRÍTICAS INFECTADOS
POR Leishmania braziliensis

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação

em Patologia Geral na Universidade Federal Fluminense,
como requesito parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Área de concentração: Patologia Humana

Orientador(a): Dilvani Oliveira Santos

Co-orientador(a): Maria de Fátima Madeira

NITERÓI
2012

2
LYRIO, Eloah Christina Neri
PAPEL DA VITAMINA D NA INDUÇÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO DE PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS EM MACRÓFAGOS
E CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS
INFECTADOS POR Leishmania
braziliensis / Eloah Christina Lyrio Neri
Niterói: UFF / Faculdade de Medicina,
2012.
58 f.
Dilvani Oliveira Santos
Dissertação de Mestrado – Universidade
Federal Fluminense, Faculdade de
Medicina, Programa de Pós-Graduação em
Patologia, 2012.
1. Macrófagos. 2. Células dendríticas. 3.
Vitamina D. 4. Catelicidina. 5.
Leishmaniose. 6. Leishmania braziliensis. I.
Santos, Dilvani. II. Universidade Federal
Fluminense, Pós-Graduação em Patologia.
III. Papel da vitamina D na indução de
óxido nítrico e peptídeos antimicrobianos
em macrófagos e células dendríticas por
Leishmania braziliensis.

3
 ELOAH CHRISTINA LYRIO NERI

PAPEL DA VITAMINA D NA INDUÇÃO DE OXIDO NÍTRICO E PEPTÍDEOS

ANTIMICROBIANOS EM MACRÓFAGOS E CELULAS DENDRÍTICAS
INFECTADOS POR Leishmania braziliensis

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação

em Patologia Geral na Universidade Federal Fluminense,
como requesito parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Área de concentração: Patologia Humana

Aprovado em ___ de______de 2012

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Andrea Alice da Silva

Universidade Federal Fluminense

Dra. Suzana Côrte-Real

Fundação Oswaldo Cruz

Dr. Paulo Renato Zuquim Antas

Fundação Oswaldo Cruz

Niterói

4
 Esta batalha como muitas outras sempre serão
dedicadas para a minha querida e melhor amiga, minha mãe.

5
 AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar meus passos e sempre me dar forças e saúde para batalhar
pelos meus estudos e conquistar os meus sonhos.
A família pelo apoio e imenso carinho, sempre mandando energias positivas e
sendo compreensivos quanto à distância. Sempre serão meus melhores amigos e
companheiros desta e de muitas outras vidas.
À minha fiel escudeira de laboratório, Ivy, ao Cezar, meu amigo de muitas
gargalhadas e a Mariana, minha IC predileta!
Ao Prof. Dr. Saulo Bourguignon pelo meu início na pesquisa científica com os
tripanossomatídeos e ao Guilherme Lechuga na convivência harmoniosa na sala
multiusuária de cultura de células no GCM.
Aos meus amigos, agradeço pelas conversas, pelo ombro amigo, pelas risadas e
gargalhadas, pelas vitórias compartilhadas, pelas noites de estudo, pelos lanches e
sucos de graviola...
A minha orientadora, Profa. Drª Dilvani Oliveira Santos, por ter me aturado durante 4
anos e ainda assim, sempre ter algum conselho ou analogia que me faz rir e
entender melhor a situação...
A co-orientadora Dra. Maria de Fátima Madeira e sua equipe, muito gentis em nos
ajudar. Foi um grande prazer trabalhar em colaboração com o Vigileish.
A revisora Profa. Dra. Helena Carla Castro, sua agilidade e capacidade sempre
impressionantes!
Ao Prof. Dr. Maurício, pelas suas tardes analisando amostras de citometria e
discussão de artigos. Sempre muito agradável.
Ao professor Licinio Silva, pela gentileza e análises estatísticas.
Ao Dr. Paulo Renato Zuquim Antas pelas consultorias na citometria de fluxo.
A equipe de microscopia Fiocruz, Drª Suzana Côrte-Real, Drª Miriam Pereira,
Alanderson Nogueira e Francisco de Oliveira Jr. MUITO OBRIGADA!
Aos Professores, Secretárias e amigos do Programa de Pós Graduação em
Patologia (HUAP/UFF), foi um grande prazer conhecê-los nesses dois anos. Levo
com muito carinho a lembrança de cada um de vocês.
Ao setor de Hemoterapia do HUCFF, pelo fornecimento de buffy-coat.
.Aos membros da banca por aceitarem o convite de participar da defesa dissertação.
6
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 13
2 OBJETIVOS 17
2.1 OBJETIVO GERAL 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17
3 MATERIAL E MÉTODOS 18
3.1 CULTURA DE CÉLULAS 18
3.1.2 Procedência das células mononucleares humanas 18
3.2 ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES 18
SANGUÍNEAS (CMN) E PURIFICAÇÃO DE MONÓCITOS
3.3 PROCEDÊNCIA DO Leishmania braziliensis 19
3.4 TRATAMENTO DAS CÉLULAS COM VITAMINA D 20
3.5 TRATAMENTO COM L-NAME 20
3.6 INTERAÇÃO DE L. braziliensis COM AS CÉLULAS 20
APRESENTADORAS DE ANTÍGENOS
3.7 MICROSCOPIA ÓPTICA 21
3.7.1 Análise qualitativa e quantitativa das células 22
infectadas
3.8 CITOMETRIA DE FLUXO 23
4 RESULTADOS 25
4.1 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓPTICA DA 25
INTERAÇÃO DE L. braziliensis COM AS CÉLULAS
APRESENTADORAS DE ANTÍGENOS
4.1.2 Tratamento com vitamina D 25
4.1.3 Inibição da NO sintase 29
4.2 QUANTIFICAÇÃO DE PARASITAS POR CÉLULA APÓS 30
A INFECÇÃO
4.3 CITOMETRIA DE FLUXO 35
5 DISCUSSÃO 42
6 CONCLUSÃO 50
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
8 ANEXO 58

7
 RESUMO
A espécie Leishmania braziliensis corresponde ao maior agente causador de
leishmaniose cutânea no Brasil e leishmaniose mucocutânea na América Latina. De
acordo com o seu ciclo de vida, esse parasita pode infectar células
preferencialmente fagocíticas do sistema imune, macrófagos e células dendríticas. A
ativação de resposta imune inata na Leishmaniose em adição à liberação de
citocinas secretadas por macrófagos e células dendríticas podem, em conjunto,
orquestrar a modulação da resposta imune adquirida. A vitamina D tem demonstrado
grande importância nos mecanismos de resposta imunológica e especialmente na
resposta imune inata, e seu receptor tem sido identificado em monócitos,
macrófagos, células dendríticas e linfócitos. Assim, neste trabalho, temos como
hipótese que vitamina D induz efeitos moduladores sobre macrófagos e células
dendríticas humanos infectados “in vitro” por L. braziliensis. Esta via de sinalização
leva à ativação de macrófagos e células dendríticas e, consequentemente, a
expressão de moléculas de superfície, produção de Catelicidina. Para comprovar
esta hipótese, as células mononucleares sanguíneas (CMN) foram obtidas a partir
de buffy-coat colhido de doadores normais, cedidos pelo Serviço de Hemoterapia do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ). Durante três dias, as células
diferenciadas (macrófagos e células dendríticas) foram incubadas com vitamina D
(10-7M), e logo após a interação, as mesmas foram infectadas com L. braziliensis. As
células nas Labteks® foram fixadas em metanol e coradas por May Grunwald para
analisar e quantificar a porcentagem de infecção e o número de parasitas
intracelulares por microscopia óptica. Para citometria de fluxo, as células foram
lavadas e marcadas com os seguintes anticorpos: CD-3-PE, CD-14-FITC, CD209-
PE, CD80-FITC; Catelicidina foi marcada intracelularmente. Através da microscopia
óptica, foi observado o aumento da infecção por L. braziliensis em macrófagos e
células dendríticas na presença da vitamina D, demonstrando uma susceptibilidade
da endocitose dos parasitas. A análise por citometria de fluxo demonstrou que após
a infecção por L. braziliensis, a expressão de CD14 e CD80 foram reduzidas em
macrófagos e caracterizada pelo aumento da expressão de DC-Sign em ambas as
células, macrófagos e células dendríticas. Na presença da vitamina D, a expressão
dos marcadores de superfície teve um comportamento diferenciado em macrófagos
e células dendríticas. Nossos resultados indicam que a vitamina D aumentou a
infecção por L. braziliensis em macrófagos e células dendríticas e,
interessantemente, não teve efeito sobre a inibição de Catelicidina induzida por L.
braziliensis em células dendríticas.

Palavras-chave: Macrófagos, Células Dendríticas, vitamina D, Catelicidina,

Leishmaniose, Leishmania braziliensis.

8
 ABSTRACT

Leishmania braziliensis corresponds to the largest causative agent of cutaneous

leishmaniasis in Brazil and mucocutaneous leishmaniasis in Latin America.
According to its life cycle, this parasite can infect preferably phagocytic cells of the
immune system, macrophages and dendritic cells. The activation of the innate
immune response in leishmaniasis in addition to the release of cytokines secreted by
macrophages and dendritic cells may together orchestrate cellular immune response
modulation. Vitamin D has shown great importance in mechanisms of immune
response and especially in the acquired immune rsponse and its receptor has been
identified on monocytes, macrophages, dendritic cells and lymphocytes. In this work,
we hypothesized that vitamin D induces modulatory effects on humans macrophages
and dendritic cells infected "in vitro" with L. braziliensis. This signaling pathway leads
to the activation of macrophages and dendritic cells, and consequently the
expression of surface molecules, and Cathelicidin production. To prove this
hypothesis, the blood mononuclear cells were obtained from buffy-coat collected
from normal donors, assigned by the Office of Hematology, University Hospital
Clementino Fraga Filho (UFRJ). For three days, the differentiated cells
(macrophages and dendritic cells) were incubated with vitamin D (10-7M) and after
the interaction, they were infected with L. braziliensis. Cells cultured in Labteks®
were fixed in methanol and stained with May Grunwald to analyze and quantify the
percentage of infection and the number of intracellular parasites, by optical
microscopy. For flow cytometry, cells were washed and labeled with the following
antibodies: CD-3-PE, CD-14-FITC, CD209-PE, CD80-FITC; the Cathelicidin was
intracellularly stained. By light microscopy, it was observed increase of infection by L.
braziliensis in macrophages and dendritic cells in the presence of vitamin D, showing
a susceptibility of parasites’ endocytosis. Analysis by flow cytometry showed that
after infection with L. braziliensis the expression of CD14 and CD80 were reduced
on the macrophages and characterized by increased expression of DC-SIGN on both
cells, macrophages and dendritic cells. In the presence of vitamin D, expression of
surface markers have a different behavior on macrophages and dendritic cells. Our
results indicate that vitamin D increased the infection by L. braziliensis in
macrophages and dendritic cells and, interestingly, had no effect on the inhibition of
cathelicidin L. braziliensis induced in dendritic cell.

Key word: Macrophages, Dendritic cells, vitamin D, Cathelicidin, Leishmaniasis,

Leishmania braziliensis.

9
 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Representação esquemática de uma Labtek®. Representação da

Labtek® desmontada em forma de lâmina, demonstrando o desenho
21
experimental para macrófagos e DC. Indicado pelas setas são as situações
experimentais com as células, sendo feita sempre em duplicata (poço ao lado).

Figura 02 - Efeito da vitamina D sobre a infecção de macrófagos derivados de

monócitos isolados de sangue periférico humano com Leishmania braziliensis.
A - Macrófago humano cultivado na ausência de vitamina D; B - Macrófagos
tratados com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias. Observe a presença 26
de vacúolos (indicados pelas setas), indicando a ativação célular; C -
Macrófagos infectados por Leishmania braziliensis; D - Macrófagos tratados
com a forma ativa da vitamina D por 3 dias e infectados por L. braziliensis.
Observe o maior número de parasitas intracelulares.

Figura 03 - Efeito da vitamina D sobre a infecção de células dendríticas

derivadas de monócitos isolados de sangue periférico humano com Leishmania
braziliensis. A – Células dendríticas (DC) humanas cultivadas na ausência de 27
vitamina D; B - DC tratadas com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias. C -
DC infectadas por Leishmania braziliensis; D - DC tratadas com a forma ativa
da vitamina D por 3 dias e infectadas por L. braziliensis. Observe o maior
número de parasitas intracelulares (parasitas indicados pelas setas). Doador 01

Figura 04 -. Efeito da vitamina D sobre a infecção de células dendríticas

derivadas de monócitos isolados de sangue periférico humano com Leishmania
braziliensis. A – Células dendríticas (DC) humanas cultivadas na ausência de
vitamina D; B - DC tratadas com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias. 28
Observe a presença de vacúolos (indicados pelas setas), indicando a ativação
célular; C -DC infectadas por Leishmania braziliensis; D - DC tratadas com a
forma ativa da vitamina D por 3 dias e infectadas por L. braziliensis. Observe o
maior número de parasitas intracelulares (parasitas indicados pelas setas).
Doador 02

Figura 05 - Efeito do L-NAME, inibidor da NO-sintase induzível na interação

entre células dendríticas derivadas de monócitos isolados de sangue periférico
humano e Leishmania braziliensis. Interação de células dendríticas com L.
braziliensis. A - DC infectadas por Leishmania braziliensis na ausência de L- 29
NAME. Nota-se um grande número de parasitas aderidos a membrana das
células. B - DC tratadas com L-NAME por 3 horas antes da infecção por L.
braziliensis. Observe o maior número de parasitas intracelulares (parasitas
indicados pelas setas).

Figura 06 - Área de seleção das células apresentadoras de antígenos na

análise por citometria de fluxo. Análise por citometria de fluxo dos controles 35
sem marcação de macrófagos (A) e células dendríticas (B). Indicado pela linha
vermelha está a área do pool de células analisadas
10
 LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 01 – Gráfico da quantificação do número de L. braziliensis

endocitadas por Macrófagos. Representação do número de L. braziliensis
(eixo x) endocitados por macrófagos (eixo y) quando tratados ou não por
31
vitamina D. Nota-se o aumento do número de parasitas endocitados quando
na presença da vitamina D. A – Doador 01; B – Doador 02.

Gráfico 02 – Gráfico da quantificação do número de L. braziliensis

endocitadas por células dendríticas. Representação do número de L.
braziliensis (eixo x) endocitados por células dendríticas (eixo y) quando
tratadas ou não por vitamina D. Nota-se o aumento do número de parasitas 32
endocitados quando na presença da vitamina D. A – Doador 01; B – Doador
02.

Gráfico 03 - Porcentagem de macrófagos infectados por L. braziliensis.

Representação comparativa da porcentagem de macrófagos pré-tratados ou
não por vitamina D (COM VD e SEM VD, respectivamente) e infectados por L. 33
braziliensis. A - Doador 01; B – Doador 02.

Gráfico 04 - Porcentagem de Células Dendríticas infectadas por L.

braziliensis. Representação comparativa da porcentagem de células
dendríticas pré-tratadas ou não por vitamina D (COM VD e SEM VD,
34
respectivamente) e infectados por L. braziliensis. A - Doador 01; B – Doador
02.

Gráfico 05 – Análise por citometria de fluxo da expressão de CD14 em

macrófagos e células dendríticas. A – Doador 01; B – Doador 02. 36

Gráfico 06 – Análise por citometria de fluxo da expressão de B7-1 em

macrófagos e células dendríticas. A – Doador 01; B – Doador 02. 37

Gráfico 07 - Análise por citometria de fluxo da expressão de CD3 em

macrófagos e células dendríticas. A – Doador 01; B – Doador 02. 39

Gráfico 08 - Análise por citometria de fluxo da expressão de CD209 em

macrófagos e células dendríticas. A – Doador 01. 40

Gráfico 09 - Análise por citometria de fluxo da expressão de Catelicidina em

macrófagos e células dendríticas. A – Doador 01. 41

11
 LISTA DE ABREVIATURAS

APC – Células Apresentadoras de Antígenos

BSA – Albumina de Soro Bovino
CD – Cluster of differentiation
CMN – Células mononucleares
CO2 – Dióxido de carbono
DC – Célula Dendrítica
DC-SIGN - Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-
integrin
ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
eNOS - Óxido Nítrico sintase endotelial
GM-CSF - Fator Estimulador de colônia de Monócitos e Granulócitos
ICAM-3 - Intercellular adhesion molecule 3
IFN - Interferon
IL - Interleucina
iNOS – Óxido Nítrico sintase induzível
IPEC – Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
L-NAME - N-nitro-L-arginina-metil-éster
LPS - Lipopolissacarídeo
NK – Natural killer
nNOS – Óxido Nítrico sintase neuronal
NO – Óxido Nítrico
PBS – Tampão fosfato-salino
PMA - Forbol 12-miristato 13-acetato
Th1 – T helper 1
Th2 – T helper 2
TLR – Toll like receptor
TNF – Fator de necrose tumoral
VD ou Vit. D – Vitamina D
VDR – Receptor da vitamina D
VDRE – Elementos de resposta à vitamina D

12
 1 INTRODUÇÃO

Leishmaniose é uma zoonose causada pelo protozoário do gênero

Leishmania, transmitida pelo vetor díptero da sub-família Phlebotominia, do gênero
Fhlebotomus no Velho Mundo e pelo gênero Lutzomyia, no Novo Mundo (SANTOS
et al.,2008). De acordo com Liu e colaboradores (2009) a leishmaniose é prevalente
em seis continentes do mundo e considerada endêmica em 88 países, havendo
mais de 12 milhões de pessoas sofrendo da doença e uma parcela da população de
aproximadamente 350 milhões com risco de contraí-la. Segundo o Ministério da
Saúde no Brasil, existem relatos de aproximadamente 28.000 casos por ano da
doença (SOUZA, 2010).

Existem 20 espécies de Leishmania que podem causar infecções no

homem (BANULS, 2007). Sendo a espécie Leishmania braziliensis, o maior agente
causador de leishmaniose cutânea na América Latina e da leishmaniose
mucocutânea (OLIVEIRA & BRODSKYN, 2012; VARGAS-INCHAUSTEGUI, 2008).
Leishmania sp. são protozoários parasitas dimórficos, que podem existir sob as
formas promastigotas flagelados, no trato digestório de dípteros e como amastigotas
intracelulares em células hospedeiras de mamíferos (WILKINS-RODRÍGUEZ et al,
2010). A transmissão dos protozoários ocorre durante o repasto sanguíneo do
flebótomo, através das fêmeas infectadas, quando introduzem no hospedeiro
vertebrado, as formas infectantes de Leishmania, promastigostas metacíclicas
flageladas. Estas formas atingem como alvo as células fagocíticas do sistema
imune, onde transformam-se em amastigotas. Dentro de poucas horas, multiplicam-
se dentro do fagolisossomo e rompem as células que servem como reservatório,
infectando novamente outras células. Uma vez que, um flebótomo não infectado,
faça a hematofagia em um indivíduo contaminado, este adquire as formas
amastigotas que migrarão para o trato digestivo e glândulas salivares, se
diferenciando em promastigotas. Estas formas podem ser encontradas livres ou

13
aderidas às microvilosidades – reiniciando o ciclo no hospedeiro invertebrado
(SANTOS et al., 2008; ALMEIDA et al., 2003).

Uma vez presente no hospedeiro vertebrado, de acordo com seu ciclo de

vida descrito anteriormente, a Leishmania faz de reservatório, as células
mononucleares fagocíticas do sistema imune, macrófagos. As células
apresentadoras de antígenos (APC), macrófagos, células dendríticas (DC) realizam
o reconhecimento de patógenos por meio de um perfil variado de moléculas de
superfície, co-estimulatórias e de adesão. Através do Complexo Principal de
Histocompatibilidade de classe II (MHC), apresentam os peptídeos dos parasitas aos
linfócitos T CD4+, desencadeando a resposta imunológica (KUMAR et al., 2010).
Estudos recentes in vitro e in vivo tem destacado a importância das interações entre
DC - Leishmania induzindo e ativando células T CD4+ parasito-específicas. As DC
compõem um grupo heterogêneo de APC que podem ser divididas em diversos
subtipos, de acordo com o fenótipo de sua superfície e função (HEATH et al., 2004;
SHORTMAN & LIU, 2002, apud WILKINS-RODRÍGUEZ et al, 2010). Estas células
possuem uma determinada plasticidade quanto as suas atividades, baseada em
neuropeptídios ou citocinas, visto que suas propriedades podem variar com as
diferentes etapas de vida ao longo do percurso. Um exemplo é o de monócitos
isolados de sangue periférico humano que são tratados com IL-4 e diferenciados em
DC (GEIJTENBEEK et al., 2002). Inicialmente à resposta imunológica adaptativa, em
tecidos não linfóides, as DC são apresentadas como células imaturas – naive -
preparadas para detectar, fagocitar e fazer o processamento de antígenos para
transportá-los para os linfonodos, sendo esta apresentação essencial para sua
maturação (WILKINS-RODRÍGUEZ et al, 2010).

Como excelentes APC, as DC são importantes células de vigília do

sistema imune, e através de pesquisas a respeito da relação entre as células T, um
novo receptor foi descoberto e chamado DC–Sign (CD209). Este receptor tem a
capacidade de disparar o sinal inicial entre DC e célula T através da ligação ao
ICAM-3 sobre a célula T. A partir da identificação deste receptor, pode-se
compreender determinados mecanismos de infecção causados por patógenos e
inclusive, um auxílio em sua marcação para determinar a diferenciação de DC a
14
partir de monócitos (GEIJTENBEEK et al., 2002). Através de abordagens
imunológicas, as DC demonstram participar nos processos de defesa do sistema
imune quanto ao amplo espectro de doenças causadas pelos mais variados
agentes, como vírus, bactérias, parasitas e fungos. Inclusive, estratégias a respeito
de vacinação mediada por populações selecionadas de DC com fragmentos de
Leishmania major, mostraram-se eficazes durante uma apresentação posterior às
células T (SCHNITZER, 2010). Um modelo experimental conhecido é a infecção de
camundongos BALB/c com o protozoário para analisar quais fatores e citocinas são
responsáveis por modular o desenvolvimento por células T (Th1) ativadas.
Entretanto, quando comparado com DC humanas, pouco se sabe quanto a
imunidade inata diante à Leishmania (SCHNITZER, 2010; ZAHN, 2010).

As células fagocíticas produzem uma grande quantidade de componentes

microbicidas, como radicais livres, óxido nítrico (NO) e peptídeos antimicrobianos
que servem como mecanismos de controle da proliferação parasitária intracelular
(VIARO & ÉVORA, 2000). O óxido nítrico, um gás mediador químico da inflamação,
é considerado como um potente vasodilatador, com importantes atividades
microbicidas e antiparasitárias através de seus reativos intermediários, atribuindo-lhe
a característica de defesa contra patógenos (SOUZA, 2010; BODGAN, 2001; VIARO
& ÉVORA, 2000). Camundongos deficientes na expressão da enzima óxido Nítrico
sintase induzível (iNOS) são incapazes de controlar a infecção por Leishmania e
seus macrófagos não conseguem eliminar as formas promastigotas da cultura
(OLIVIER, 2005).

Como demonstrado nas pesquisas de White (2010), a vitamina D tem

apresentado grande importância nos mecanismos de resposta imunológica e em
especial na resposta imune inata. Uma característica interessante é a capacidade de
converter a vitamina 25(OH) 2D3 em 1,25(OH)2D3, quando células fagocitárias, como
macrófagos entram em contato com uma infecção microbiana. As atividades da
vitamina D são moduladas através da interação do receptor de vitamina D (VDR)
com os elementos de resposta à vitamina D (VDRE), e os VDR foram identificados
em células do sistema imune, tais como, monócitos, células dendríticas e linfócitos T
e B ativados. Os metabólitos ativos da vitamina D podem ativar monócitos, suprimir

15
a proliferação de linfócitos T CD4+, induzir a produção de imunoglobulinas e
citocinas, tais como IL-2, IFN-γ e TNF-α. (GOMBART, 2009) E, através da forma
ativa 1,25(OH)2D3, tem a possibilidade de atuar inibindo a maturação de células
dendríticas mielóides, reduzir a expressão de moléculas co-estimuladoras e
funcionar como indutora direta na expressão de genes que codificam peptídeos
antimicrobianos (GOMBART, 2009; LEANDRO et al., 2009).

Todavia, existem diversos mecanismos influenciados pela ação da

vitamina D que poderão contribuir contra a infecção de células humanas pela
Leishmania sp., bem como a indução na produção de NO, ativação e modulação de
peptídeos, e a ativação de monócitos através do receptor Toll-like (TLR2 / 1) que
levam a produção de Catelicidinas. Visto que, a família das Catelicidinas possui
múltiplas funções, além da mais conhecida atividade microbiana direta, ainda podem
atuar como mediadoras das respostas inflamatórias, quimiotaxia, ligação e
neutralização de LPS, promoção de reepitelização e reparo (DELUCA, &
CANTORNA, 2001).

Embora ainda não descrito na literatura a possível relação da vitamina D

em resposta à infecção por Leishmania braziliensis, percebe-se a grande influência
dessa vitamina sobre as células do sistema imune e seus mecanismos de defesa
contra patógenos (HEWISON, 2011). Sendo a Leishmaniose uma doença cuja porta
de entrada para o protozoário é a pele, e sendo as células de Langerhans as
principais APC desta região. A hipótese científica deste trabalho é que vitamina D
induz a produção de agentes antimicrobianos bem como a expressão de moléculas
de superfície em macrófagos e células dendríticas derivados de monócitos isolados
de sangue periférico humano em resposta à interação com Leishmania braziliensis.

16
 2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o papel da vitamina D na interação in vitro de macrófagos e

células dendríticas derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano
com Leishmania braziliensis.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Analisar de forma qualitativa e quantitativa a interação in vitro de

macrófagos e células dendríticas com L. braziliensis, através da microscopia
óptica.

2. Investigar o efeito indireto do óxido nítrico sobre o processo de infecção

de macrófagos e células dendríticas por L. braziliensis a partir da inibição de
NO-sintase utilizando L-NAME.

3. Detectar a expressão de marcadores de superfície celular (CD14, DC-

Sign e CD80) na interação de macrófagos e células dendríticas com L.
braziliensis através da citometria de fluxo.

4. Detectar a expressão intracelular de Catelicidina na interação entre

macrófagos e células dendríticas e L. braziliensis através da citometria de fluxo.

17
 3 METODOLOGIA

3.1 CULTURA DE CÉLULAS

3.1.2 Procedência das células mononucleares humanas

As células utilizadas foram obtidas a partir da capa leucoplaquetária

(buffy-coat) subproduto da separação em componentes de sangue total colhido de
doadores normais voluntários, cedidos pelo Serviço de Hemoterapia do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ). O projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ), sob o número CAAE-
0157.0.197.000-09.

3.2 ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES

SANGUÍNEAS (CMN) E PURIFICAÇÃO DE MONÓCITOS

O sangue foi diluído com meio RPMI (Gibco), submetido ao gradiente

Ficoll-Hypaque (Sigma, densidade 1077) e posterior centrifugação de 30 minutos,
2000 rotações por minuto (rpm) a 21º C, obtendo-se um anel de células
mononucleares conforme descrito por Santos e colaboradores (2001). As CMN,
linfócitos e monócitos, foram submetidas ao procedimento de agregação ao frio,
sendo os linfócitos descartados posteriormente (SANTOS et al., 2001). Este
procedimento permite que os monócitos se agreguem ao frio através de lectinas da
superfície, e por uma pequena centrifugação de 40 segundos a 1500 rpm, 4°C, esse
agregado sedimenta, separando-se do sobrenadante que contém os linfócitos.

18
 Para análise da viabilidade celular, uma amostra de células foi diluída em
azul de Trypan (Gibco), observadas e quantificadas em câmara de Neubauer, de
modo a aferir a integridade da membrana e quantidade das mesmas.

Após este procedimento, os monócitos foram plaqueados em Labteks® e

cultivados em tubos de poliestireno destinados para citometria de fluxo (Santos et al,
2001), na concentração de 2 x 105 células/mL e 1 x 106 células/mL, respectivamente,
de acordo com a finalidade. O cultivo das células foi feito em meio RPMI (completo)
suplementado com 10% de Soro fetal bovino, Penicilina e Estreptomicina e mantidos
em estufa a 37ºC numa atmosfera de 5% de CO 2, com reposição do meio completo a
cada 3 dias.

Para realizar a diferenciação das APC, os monócitos foram tratados ou não

com as citocinas rGM-CSF (100U/ml; Peprotech) e rIL-4 (1000U/ml, Peprotech) para
diferenciar em DC e macrófagos, respectivamente (SANTOS et al, 2001;
SALLUSTO, 1995). Durante 10 dias de cultura, a diferenciação de monócitos em
macrófagos e DC foi monitorada através da microscopia óptica, com a análise de
morfologia e imunofenotipagem através da citometria de fluxo.

3.3 PROCEDÊNCIA DA Leishmania braziliensis

Leishmania braziliensis foram gentilmente doadas pela Dra. Fátima

Madeira da Fundação Oswaldo Cruz (IPEC).

As amostras de L. braziliensis foram isoladas de lesões ulcerativas de

cães, diagnosticados com Leishmaniose, e criopreservadas. Para garantir a
capacidade infectiva dos parasitas, os mesmos foram criopreservados durante a
primeira passagem de cultivo.

Quando necessário, as amostras eram descongeladas e cultivadas em

meio líquido Schneider e mantidas em estufa a 28°C. Os parasitas utilizados para a
interação com as APC estavam na fase estacionária, dentre o 3º e 5º dia de cultivo.
19
 Para a interação das mesmas com as APC, os parasitas foram
centrifugados, lavados e diluídos com meio RPMI, para posterior quantificação em
Câmara de Neubauer através do microscópio óptico e infecção.

3.4 TRATAMENTO DAS CÉLULAS COM VITAMINA D

A vitamina 1,25(OH)2D3 (Sigma), amostra liofilizada, foi diluída em meio

RPMI e estocada em criotubos a 4°C.

As células dendríticas e macrófagos diferenciados, após 10 dias, foram

tratados ou não com a vitamina D na concentração 10-7M durante três dias. Foram
adicionados 10μL de vitamina D nos poços controles e nos poços de interação com
os parasitas.

3.5 TRATAMENTO COM L-NAME

Em alguns ensaios, foi realizada a inibição da NO sintase induzível através do

L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-éster; Sigma) em concentração de 20µM. Este foi
acrescentado ou não as culturas por 3 horas antes da infecção por L. braziliensis.
Culturas não tratadas foram utilizadas como controle.

3.6 INTERAÇÃO DE Leishmania braziliensis COM AS

CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENOS

Após três dias de tratamento com a vitamina D (10-7), os macrófagos e

células dendríticas plaqueados nas Labteks® foram incubados com L. braziliensis,
em uma proporção de 5:1 (parasitas/célula)1

1
Cinéticas anteriores foram realizadas no laboratório LaBioPac e a razão 5:1 (parasitas/célula) foi a que obteve
melhores resultados.
20
 Após o tempo de interação de 4 horas, o sobrenadante foi removido e as
células aderentes infectadas ou não foram lavadas 3 vezes com tampão fosfato
salino (PBS, Sigma) pH 7,2 – 7,4 para remover os parasitas extracelulares. Meio
RPMI completo foi reposto novamente e as culturas foram mantidas em estufa a
37ºC por 20 horas.
Segue abaixo o desenho esquemático reproduzindo as condições
individualizadas dos poços das Labteks®.

Figura 1 – Representação esquemática de uma Labtek®

DESENHO EXPERIMENTAL

Representação da Labtek® em forma de lâmina com o desenho experimental para

macrófagos e DC. As situações experimentais com as células, sendo os ensaios
sempre realizados em duplicatas. (Indicados pelas setas)

3.7 MICROSCOPIA ÓPTICA

A estrutura das Labteks® pode ser desmontada transformando-se em

lâminas (FIG.1). Células aderentes às lâminas foram processadas para a análise por
microscopia óptica.

21
 Para aperfeiçoar a coloração das lâminas, foram testadas duas técnicas
de fixação e coloração. Primeiro, fixadas em metanol (Vetec) por cerca de cinco
minutos e em seguida, realizada a coloração por Giemsa diluído em água destilada
por 8 minutos.
No segundo método, as células foram fixadas por cinco minutos em
metanol, coradas por May Grunwald (Merck) por dois minutos, adicionando água
destilada por dois minutos e como etapa final, corado por Giemsa diluído em água
destilada por 10 minutos. Sendo essa técnica a que obteve os melhores resultados.

3.7.1 Análise qualitativa e quantitativa das células

infectadas

As lâminas foram montadas com lamínulas usando Permount e

analisadas qualitativamente por microscopia óptica. As células foram observadas e
fotografadas em Microscópio Zeiss (Modelo Axio Imager M2; Laboratório de
Ultraestrutura Celular /Fiocruz) de acordo com os seguintes critérios de avaliação:
morfologia das células; presença de endossomas com formas amastigotas de L.
braziliensis em seu interior.

Foram analisados 100 campos em cada lâmina, quantificando células

infectadas ou não pelo parasita. No caso positivo, o número de parasitas
intracelulares por célula foi quantificado também. Foram realizadas fotomicrografias
de aumento de 400x e 630x para cada situação representada nas lâminas.

22
 3.8 CITOMETRIA DE FLUXO

Marcação de superfície

O procedimento segue o protocolo utilizado em nosso laboratório

(SANTOS et al., 2001). As células foram lavadas com 200 µl solução tampão de
citometria composta de PBS Dulbecco (Sigma), Azida sódica a 0,01% e
Soroalbumina Bovina (BSA) a 0,1%, através de centrifugação por 5 minutos, 1500
rpm, a 4°C e, posteriormente incubadas com os anticorpos, no gelo durante 30
minutos, ao abrigo da luz. Após essa etapa, as células foram novamente lavadas 3
vezes com solução tampão de citometria e fixadas com paraformaldeído 1%.

Os anticorpos de superfície utilizados foram: 10µg/mL CD-14-FITC

(Becton & Dickinson) para marcar monócitos; 1µg/mLde CD-3-PE (Becton&
Dickinson) para marcar células T; 10µg/mL CD209- PerCP-Cy 5.5 para marcar
células dendríticas e 1µg/mL CD80-FITC (Sigma) para marcar macrófagos e células
dendríticas.

Marcação intracelular de Catelicidina

A Catelicidina (Abcam) foi marcada intracelularmente, ou seja, desta

forma as células tiveram sua superfície permeabilizada através da solução de
Saponina (Sigma) a 0,3% para que os anticorpos pudessem entrar e marcar no
interior da célula (PRUSSING & CALFE, 1995).

Para a marcação intracelular, as células foram lavadas com PBS e, logo

após tratadas com Saponina durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após
lavagem, foram incubadas com 1µg/mL anti-Catelicidina por 30 minutos ao abrigo da
luz. Logo depois, as células foram lavadas e incubadas com o Anticorpo secundário
(IgG1 anti-mouse FITC, Invitrogen) por mais 30 minutos. Foram realizados tubos
controle para o anticorpo secundário.

23
 Após esse tempo, as células foram lavadas duas vezes com saponina
0.3% por meio de centrifugação por 5 minutos, a 1500 rpm, a 4°C. Em seguida, o
sobrenadante foi retirado e ao pellet adicionado 200µL de tampão (PBS + 0.1% BSA
+ 0.01% de azida sódica). Os tubos foram homogeneizados, em vórtex e,
posteriormente, centrifugado duas vezes por 5 minutos, 1500 rpm, a 4°C. O
sobrenadante foi descartado e as células foram fixadas com 200µl de
paraformoldeído (Sigma) a 1%, de acordo com protocolos descritos por Prussing &
Metcalfe (1995) e Antas e colaboradores (2004).

A leitura e análise das amostras foram realizadas no citômetro Accuri C6

pertencente ao Departamento de Biologia Celular e Molecular do Instituto de
Biologia da UFF (Ann Arbor, MI, EUA).

Análise Estatística
A comparação entre os percentuais de infecção das APC infectadas por
L. braziliensis foi realizada pelo teste Kolmogorov-Smirnov, ao nível de significância
α=0,05.

24
 4 RESULTADOS

4.1 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓPTICA DA INTERAÇÃO

DE L. braziliensis COM AS CÉLULAS APRESENTADORAS DE
ANTÍGENOS

4.1.2 Tratamento com vitamina D

A seguir, estão representadas por microscopia óptica a infecção de

macrófagos e DC derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano por
L. braziliensis, de dois doadores. (FIG. 02 - 04)

Observa-se que os controles das APC, tratadas com vitamina D

apresentam maior formação de vacúolos, indicando uma ativação celular. (FIG. 2B e
4B) Tanto macrófagos quanto DC endocitam L. braziliensis, sendo que DC são mais
susceptíveis a infecção. (FIG. 2C, 3C e 4C) O tratamento das células com a vitamina
D aumentou o número de parasitas endocitados pelas APC, demonstrando um
aumento da suscetibilidade à infecção em ambas as células. (FIG. 2D, 3D e 4D)

25
 Figura 02 – Efeito da vitamina D sobre a infecção de macrófagos derivados de monócitos isolados de sangue periférico humano
com Leishmania braziliensis

A - Macrófago humano cultivado na ausência de vitamina D; B - Macrófagos tratados com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias. Observe
a presença de vacúolos (indicados pelas setas), indicando a ativação célular; C - Macrófagos infectados por Leishmania braziliensis; D -
Macrófagos tratados com a forma ativa da vitamina D por 3 dias e infectados por L. braziliensis. Observe o maior número de parasitas
intracelulares.
26
 Figura 03 - Efeito da vitamina D sobre a infecção de células dendríticas derivadas de monócitos isolados de sangue periférico
humano com Leishmania braziliensis

A – Células dendríticas (DC) humanas cultivadas na ausência de vitamina D; B - DC tratadas com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias.
C -DC infectadas por Leishmania braziliensis; D - DC tratadas com a forma ativa da vitamina D por 3 dias e infectadas por L. braziliensis.
Observe o maior número de parasitas intracelulares. – Doador 01 - (parasitas indicados pelas setas)

27
 Figura 04 - Efeito da vitamina D sobre a infecção de células dendríticas derivadas de monócitos isolados de sangue periférico
humano com Leishmania braziliensis

A – Células dendríticas (DC) humanas cultivadas na ausência de vitamina D; B - DC tratadas com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias.
Observe a presença de vacúolos (indicados pelas setas), indicando a ativação célular; C -DC infectadas por Leishmania braziliensis; D - DC
tratadas com a forma ativa da vitamina D por 3 dias e infectadas por L. braziliensis. Observe o maior número de parasitas intracelulares. –
Doador 02 - (parasitas indicados pelas setas)
28
 4.1.3 Inibição da NO sintase

Quando a NO sintase induzível é inibida com o L-NAME, um inibidor

clássico dessa enzima observa-se um maior número de parasitas
internalizados em comparação com as células sem o tratamento, visto que a
produção de NO foi interrompida.

Este resultado pode ser observado em DC (FIG.05) durante a

interação com L. braziliensis. Percebe-se uma internalização exacerbada de
protozoários durante a inibição da NO sintase induzível, tornando as células
mais vulneráveis à infecção pelo parasita.

Figura 05 - Efeito do L-NAME, inibidor da NO-sintase induzível na

interação entre células dendríticas derivadas de monócitos isolados de sangue
periférico humano e Leishmania braziliensis

Interação de células dendríticas com L. braziliensis. A - DC infectadas por Leishmania

braziliensis na ausência de L-NAME. Nota-se um grande número de parasitas
aderidos a membrana das células. B - DC tratadas com L-NAME por 3 horas antes da
infecção por L. braziliensis. Observe o maior número de parasitas intracelulares.
(parasitas indicados pelas setas)

29
 4.2 QUANTIFICAÇÃO DE Leishmania braziliensis POR
CÉLULA HOSPEDEIRA APÓS A INFECÇÃO

Para avaliar o grau de infecção das células, foi realizada a contagem

do número de parasitas interiorizados após o tempo de infecção de 20 horas
(GRÁF. 01-04), e com isso a porcentagem de células infectadas.

Observa-se um aumento no número de parasitas endocitados

quando na presença da vitamina D tanto em macrófagos quanto em DC. Em
macrófagos, o número de parasitas intracelulares triplicou, indicando um
aumento da susceptibilidade da infecção das APC, quando na presença da
vitamina D.

Resultados similares foram encontrados para DC, porém numa

porcentagem maior de infecção, visto que mesmo com a ausência da vitamina
D, as DC possuem uma capacidade fagocítica maior que os macrófagos.
(GRAF. 2)

30
Gráfico 01 – Gráfico da quantificação do número de L. braziliensis endocitadas
por Macrófagos

Representação do número de L. braziliensis (eixo x) endocitados por

macrófagos (eixo y) quando tratados ou não por vitamina D. Nota-se o aumento
do número de parasitas endocitados quando na presença da vitamina. A -
Doador 01; B – Doador 02.

31
Gráfico 02 – Gráfico da quantificação do número de L. braziliensis endocitadas
por células dendríticas

Representação do número de L. braziliensis (eixo x) endocitados por células

dendríticas (eixo y) quando tratadas ou não por vitamina D. Nota-se o aumento
do número de parasitas endocitados quando na presença da vitamina. A -
Doador 01; B – Doador 02.

32
 A seguir, os gráficos 03-04 representam a porcentagem de células
infectadas por L. braziliensis quando na presença da vitamina D. Nota-se o
aumento da porcentagem de APC infectadas quando pré-tratadas com a
vitamina D. A porcentagem de infecção chega a ser 30% maior que a situação
experimental na ausência do tratamento.

Gráfico 03 – Porcentagem de macrófagos infectados por

L. braziliensis

Representação comparativa da porcentagem de macrófagos pré-tratados ou não por

vitamina D (COM VD e SEM VD, respectivamente) e infectados por L. braziliensis. A -
Doador 01; B – Doador 02.

33
 Gráfico 04 – Porcentagem de Células dendríticas infectadas por
L. braziliensis

Representação comparativa da porcentagem de células dendríticas pré-tratadas ou

não por vitamina D (COM VD e SEM VD, respectivamente) e infectados por L.
braziliensis. A - Doador 01; B – Doador 02.

34
 4.3 CITOMETRIA DE FLUXO

A figura abaixo representa as células analisadas por citometria de

fluxo; onde as características de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) foram
utilizadas para distinguir cada população celular e definir as regiões para
avaliar as APC. A análise das APC estudadas foram analisadas na região P1.

Figura 06 – Área de seleção das células apresentadoras de antígenos

na análise por citometria de fluxo
A B

Análise por citometria de fluxo dos controles sem marcação de macrófagos (A) e
células dendríticas (B). Indicado pela linha está a área do pool de células analisadas.

Os gráficos (GRAF. 05-08) a seguir mostram as análises por

citometria de fluxo dos marcadores de superfície, CD14, CD80, CD3, CD209 e
a marcação intracelular de Catelicidina (GRAF.09), em macrófagos e DC dos
doadores 01 e 02, respectivamente.

A expressão espontânea de CD14 indica a diferenciação de

monócitos em macrófagos, ou seja, CD14 está presente em monócitos e sua
expressão é mantida nos macrófagos diferenciados. CD14 teve sua expressão
diminuída quando macrófagos foram infectados por L. braziliensis. O pré-
tratamento com vitamina D não alterou esta expressão. (GRAF. 05) No entanto,

35
o pré –tratamento com vitamina D induziu o aumento da expressão de CD80
em macrófagos infectados por L. braziliensis. (GRAF. 06) PMA reduziu a
expressão de CD14 em macrófagos, porém induziu aumento de CD80 nestas
células. (GRAF.06)

Gráfico 05 - Análise da expressão do marcador de superfície CD14 em

macrófagos e células dendríticas através da citometria de fluxo

Análise por citometria de fluxo da expressão de CD14 em macrófagos e células

dendríticas. A - Doador 01; B – Doador 02.

36
 Gráfico 06 - Análise da expressão do marcador de superfície CD80 em
macrófagos e células dendríticas através da citometria de fluxo

Análise por citometria de fluxo da expressão de CD80 em macrófagos e células

dendríticas. A - Doador 01; B – Doador 02.

37
 A marcação para CD3 foi realizada apenas como controle para
demonstrar a qualidade da purificação dos monócitos por agregação ao frio
como descrito em Métodos, e apresentou apenas uma pequena quantidade de
linfócitos contaminantes - controle negativo. (GRAF.7) Como controle positivo,
foi utilizado um ativador celular, o acetato de forbol miristato (PMA).

A diferenciação de monócitos tratados por IL4 e GM-CSF em células

dendríticas foi caracterizada através da redução da expressão de CD14
(GRAF. 05) e aumento da expressão de CD80 (GRAF.06) e de CD209 (GRAF.
08).

L. braziliensis aumentou a expressão de DC-Sign em macrófagos. O

tratamento com vitamina D induziu um ligeiro aumento na expressão de DC-
Sign em macrófagos infectados por L. braziliensis. (GRAF. 08)

A análise de CD209 para investigação da expressão de DC-sign

revelou que L. braziliensis induziu aumento na expressão desse receptor e que
o pré-tratamento com Vitamina D não alterou muito essa expressão. (GRAF.08)

A análise intracelular de Catelicidina mostrou que DC expressa

espontaneamente maior quantidade de Catelicidina que macrófagos. No
entanto, L. braziliensis não influenciou a expressão de Catelicidina em
macrófagos e reduziu em DC. E, interessantemente vitamina D não influenciou
esta redução. (GRAF.09)

38
 Gráfico 07 – Análise da expressão do marcador de superfície CD3 em
macrófagos e células dendríticas através da citometria de fluxo

Análise por citometria de fluxo da expressão de CD3 em macrófagos e células

dendríticas. A - Doador 01; B – Doador 02.

39
Gráfico 08 – Análise da expressão do marcador de superfície CD209 em macrófagos
e células dendríticas através da citometria de fluxo

Análise por citometria de fluxo da expressão de CD209 em macrófagos e células

dendríticas.

40
 Gráfico 09 – Análise da expressão do marcador intracelular de Catelicidina em
macrófagos e células dendríticas através da citometria de fluxo

Análise por citometria de fluxo da expressão de Catelicidina em macrófagos e células

dendríticas.

41
 5 DISCUSSÃO

A leishmaniose constitui uma doença de caráter médico-social com

crescente número de casos interligados ao desenvolvimento econômico, às
alterações no comportamento e no meio ambiente, o que leva a maior
exposição ao vetor (CASTELLANO, 2005).

Leishmania (Viannia) braziliensis é um parasita intracelular

predominante em áreas endêmicas ao sudeste no Brasil para a leishmaniose
cutânea e disseminada (MADEIRA, 2005). Constitui um grande problema de
saúde no país, atingindo o homem e animais de rua, principalmente cães
(MOURA, 2010; VARGAS-INCHAUSTEGUI, 2008; MADEIRA, 2005). No
presente trabalho foram utlizadas amostras de L. braziliensis isoladas de cães
para a infecção in vitro de macrófagos e DC.

No hospedeiro vertebrado homem, Leishmania faz o primeiro

contato com as células fagocíticas principais, levando ao desenvolvimento de
resposta imune (OLIVEIRA & BRODSKYN, 2012; DEPLEDGE, 2010).

Neste contexto, os macrófagos e as DC são conhecidos por sua

excelente capacidade apresentadora de antígenos e de defesa do hospedeiro
contra infecção por diversos patógenos, incluindo Leishmania sp. Uma via de
sucesso à destruição do parasita intracelular é a ativação de macrófagos
mediada por IFN-γ, por que leva à produção de NO, intermediários de oxigénio
reativos e radicais livres através da resposta Th1 (GIUDICE, 2012).
Camundongos deficientes na expressão da enzima Óxido Nítrico sintase
induzível (iNOS) são incapazes de controlar a infecção por Leishmania e seus

42
macrófagos não conseguem eliminar as formas promastigotas da cultura
(OLIVIER, 2005).

As células do sistema imune que expressam o gene para iNOS são

DC, macrófagos, células NK e células de linhagem e tumorais. O estímulo para
a produção de NO são as citocinas, IFN –γ, IL-2, IL-4 e TNF, principalmente em
macrófagos de camundongos, hepatócitos humanos e células epiteliais.
Entretanto, a produção de NO em células animais é muito maior que em
células humanas, visto que as humanas também fazem uso de outros
componentes intracelulares antiparasitários (BOGDAN, 2001).

Foram realizados ensaios com o inibidor da iNOS, L-NAME, a fim de

explorar a importância do seu papel no processo de infecção das APC com L.
braziliensis. Corroborando com os dados da literatura, a figura 5 mostra a maior
internalização de L. braziliensis em DC quando na presença do L-NAME, em
comparação a situação experimental com a produção constitutiva de NO.

Quando analisadas as Labteks®, os poços controle contendo

macrófagos e DC tratadas com L-NAME ou sem L-NAME, não apresentaram
nenhuma alteração morfológica, como verificada pela análise por microscopia
óptica (dados não mostrados).

Como observado na figura 5C, nas situações experimentais com

ausência do L-NAME muitos parasitas ficam aderidos à membrana das células
mesmo após o tempo de infecção de 24 horas, sugerindo que o NO formado
controla o processo de infecção por L. braziliensis. Enquanto que, nas células
tratadas com o inibidor, existe maior permissividade à infecção, culminado
numa maior quantidade de L. braziliensis no interior da APC.

A literatura menciona que fibroblastos de derme de camundongos

(células que não produzem muito NO) são mais suscetíveis à infecção por
Leishmania. (BODGAN, 2001) O similar ocorre na infecção dos fibroblastos de
derme de camundongo por C. deanei e H. roitmani, e demonstrado pela

43
infecção de camundongos imunodeprimidos com dexametasona (SANTOS et
al., 2010).

Tais dados reforçam o importante papel do Óxido Nítrico no combate

a infecções por parasitas, demonstrando como as células ficam vulneráveis
quando sua produção é interrompida ou inibida por algum agente, o que se faz
presente em doenças imunossupressoras (SANTOS et al., 2010).

Embora a produção de NO ainda seja um dos componentes mais

relatados em controlar a proliferação parasítica intracelular, Souza e
colaboradores (2010) demonstraram que algumas espécies de Leishmania
apresentam um comportamento resistente ao NO. Pacientes infectados por L.
braziliensis resistentes ao NO apresentam um tamanho maior de lesão cutânea
inicial, e inclusive, alguns pacientes são resistentes à própria produção de NO.

Além da produção de NO, peptídeos antimicrobianos induzidos pela

vitamina D tem se mostrado cada vez mais interessante no enredo da
imunidade inata (WHITE, 2010). Segundo Hart e colaboradores (2011), estudos
com indivíduos deficientes de vitamina D tem sido associados a um baixo
desenvolvimento imunológico e com o aumento da susceptibilidade a
infecções, de acordo com as propriedades imunoregulatórias de metabólitos
ativos da vitamina.

O receptor para vitamina D identificado em monócitos, macrófagos,

DC e células T e B tem sido amplamente estudado nos mecanismos de
resposta imunológica (GOMBART, 2009). De acordo com pesquisas recentes,
os metabólitos ativos da vitamina D são capazes de ativar monócitos, aumentar
a diferenciação em macrófagos - potencializando a capacidade fagocítica-,
modificar a produção de citocinas, fazer down-regulation de moléculas co-
estimulatórias, inibir a maturação de DC e induzir a produção de peptídeos
antimicrobianos (HART et al., 2011; GOMBART, 2009; LEANDRO et al., 2009).

44
 As culturas de células, tanto macrófagos quanto DC, pré-tratadas
com a forma ativa da vitamina D durante 3 dias, apresentaram uma maior
formação de vacúolos no citoplasma, indicando uma ativação celular. (FIG. 2B,
3B e 4B)

Youssef e colaboradores (2011) observaram que macrófagos

infectados por Mycobacterium tuberculosis desenvolveram uma resposta
dependente de vitamina D que levou a indução da autofagia, fusão
fagolisossomal e maturação do fagossomo. Especialmente, porque este tipo de
resposta gera a produção de peptídeos antimicrobianos.

Entretanto, nossos resultados demonstram um aumento da

endocitose de L. braziliensis tanto em macrófagos como DC quando na
presença da vitamina D, e com a redução da produção de Catelicidina. (FIG.
2D, 3D e 4D) A análise quantitativa das APC demonstra através dos gráficos
01-04 que macrófagos e DC tratados pela forma ativa da vitamina D
apresentam um grande número de parasitas intracelulares. Quando comparada
às células sem o tratamento com a vitamina D, existe um aumento do número
de parasitas endocitados pela célula e isso justifica uma provável proliferação
de L. braziliensis intracelular, uma vez que após um período de incubação com
L. braziliensis, os parasitas extracelulares são removidos por vigorosas
lavagens da cultura. Ou seja, ao que tudo indica L. braziliensis restringe a
produção de Catelicidina como observado em DC através da análise por
citometria de fluxo.

Corroborando com os dados obtidos, Whitcomb (2012) e Ehrchen

(2007) também demonstraram a susceptibilidade de macrófagos infectados por
L. major quando cultivados com vitamina D. Inclusive, camundongos knock-out
para o receptor da vitamina D desenvolveram uma resistência significativa à
infecção, com o surgimento de lesões menores e presença de poucos parasitas
no sitio da infecção, o que sugere que os metabólitos ativos da vitamina D
reduzem a resposta imune Th1 e redirecionam para o perfil Th2.

45
 O redirecionamento da resposta Th1 para a Th2 é influenciada pelo
perfil de citocinas liberado pelas APC na situação observada, visto que, a
vitamina D age como um feed back negativo controlando as respostas
inflamatórias das células e diminuindo a secreção de IFN–γ, IL-2, TNF-α e
aumentando de IL-4. Esta característica regulatória se mostra interessante para
o tratamento de doenças autoimunes como esclerose múltipla, doenças
intestinais e lúpus (WHITCOMB, 2012; BRUCE, 2008; ERCHEN, 2007; PENNA
& ADORINI, 2000).

O perfil de resposta Th1 obtém sucesso em controlar a proliferação

parasítica intracelular e sua disseminação na leishmaniose cutânea e
mucocutânea, entretanto não é capaz de erradicar a infecção pelo parasita. O
controle se faz através da produção das citocinas pró-inflamatórias e lesão
tecidual (GIUDICE et al., 2012).

Devido a plasticidade das DC, essas são responsáveis por liberar

grandes quantidades de IL-12 e IFN – α/β e ativar células NK. Após o estímulo
pelo patógeno, seja L. infantum, L. major ou L. braziliensis, a produção de tais
citocinas é estritamente relacionada com a ativação de determinados TLR,
como por exemplo TLR-9. Camundongos knock out para TLR-9 apresentam
severas lesões e inchaço nas patas (LIESE et al., 2008).

A literatura descreve (EHRCHEN et al., 2007), um dos primeiros

trabalhos relacionando a espécie Leishmania major com vitamina D, demonstra
que em contraponto com a inibição do NO, existe a indução de arginase 1. Tal
expressão leva a proliferação de parasitas intracelulares nos macrófagos,
inclusive gerando intermediários necessários para o crescimento do mesmo.
Alguns autores sugerem, que o aumento da produção de arginase compete
pelo mesmo substrato com a iNOS, consequentemente, resultando na
diminuição da produção de NO por macrófagos (INIESTA, 2002).

Rajapakse e colaboradores (2007) observaram que o efeito do

metabólito ativo 1,25α (OH)2D3 sobre camundongos Balb/c infectados por
Toxoplasma gondii se mostra reverso a atividade contra a infecção por

46
Leishmania. Os camundongos, tratados com a vitamina D, apresentaram uma
carga menor de parasitas nas células epiteliais intestinais e nas lesões.
Embora a infecção tenha sido na mesma escala, acredita-se que a vitamina D
tenha inibido a proliferação intracelular do parasita, tanto in vitro quanto in vivo.

A literatura menciona a análise dos marcadores fenotípicos através

da citometria de fluxo demonstra que existe uma maior expressão do receptor
DC-Sign marcado pelo anticorpo CD209, em macrófagos e principalmente em
DC quando tratados pela vitamina D (SERRANO-GÓMEZ, 2007;
COLMENARES, 2004). Nossos resultados com macrófgaos corroboram esses
encontros, o mesmo não ocorrendo com DC.

O receptor DC-Sign consiste em uma lectina tipo C de superfície e

representa uma das portas de entrada nas DC para Leishmania. Uma vez que
sua expressão está aumentada, consequentemente houve uma maior
endocitose de Leishmania braziliensis. Trabalhos com L. pifanoi e L. infantum
são endocitadas somente através da via DC-Sign (COLMENARES, 2004)
reforçam nossos resultados.

A interação das APC com L. braziliensis induziu em macrófagos, a

redução da expressão de CD14 e B7-1. A molécula de CD14 está presente na
diferenciação dos monócitos em macrófagos e permite ser evidenciada pela
imunofenotipagem (CRUSE & LEWIS, 2009). Este receptor, também presente
na membrana de neutrófilos e menor quantidade em DC, é capaz de atuar
como um receptor fagocítico e como uma proteína acessória para o receptor
TLR4 para ligar-se a LPS da membrana dos patógenos (Kenneth Murphy,
2011).

A molécula co-estimulatória B7-1 ou CD80 presente em monócitos,

macrófagos e em maior quantidade, em DC e células B ativadas, também
representa uma peça chave no processo de apresentação antigênica. A família
B7 tem a função de se ligar ao receptor CD28 presente na célula T e está
relacionada ao desenvolvimento da resposta Th1 (CLAVREUL, 1998). Nossos

47
resultados mostram que L. braziliensis diminuiu a expressão de CD80 em
macrófagos e DC.

Em nossos resultados, a vitamina D não alterou a expressão de

CD80 em DC infectadas por L. braziliensis. No entanto, em macrófagos
infectados por L. braziliensis, a vitamina D aumentou a expressão de CD80.
Assim como descrito recentemente por alguns grupos de pesquisa que
demonstram a modulação negativa de moléculas co-estimulatórias quando na
presença dos metabólitos ativos dessa vitamina. Em conjunto com a diminuição
da produção das citocinas pró-inflamatórias, a vitamina D induz um perfil de
tolerância nas DC (WHITCOMB, 2012; GOMBART, 2009; LEANDRO et al.,
2009; EHRCHEN, 2007; PENNA & ADORINI, 2000).

Segundo Penna & Adorini (2000), o hormônio ativo da vitamina D e

seus análogos inibem a proliferação das células T e a produção de citocinas.
Entretanto, não é conhecido se o efeito se dá de forma direta sobre as
populações de linfócitos ou indiretamente através das APC. Nossos resultados
sugerem que as DC realmente são os primeiros alvos de imunosupressão por
1,25α (OH)2D3 devido ao aumento da susceptibilidade à infecção por L.
braziliensis bem como redução da molécula co estimulatória de resposta
imune, no caso CD80 e produção de Catelicidina.

A família das Catelicidinas possui múltiplas funções, além da mais

conhecida atividade antimicrobiana direta, e ainda podem atuar como
mediadoras das respostas inflamatórias. Experimentos com Mycobacterium
tuberculosis e Mycobacterium leprae demonstram que monócitos de
camundongo induzem uma atividade antimicrobiana dependente da ação do
NO sobre a ativação de TLR (EDFELDT, 2010; DELUCA, & CANTORNA,
2001).

Neste caso, em se tratando da produção de Catelicidina, não houve

alterações significativas em macrófagos infectados por L. braziliensis e tratados
por vitamina D. De acordo com os resultados obtidos pelo tratamento com L-
NAME, percebe-se que a inibição da NO-sintase induziu um aumento da

48
infecção por L. braziliensis em DC. Sugerindo que a via de NO está sendo mais
ativa na habilidade antiparasitária contra L. braziliensis.

Corroborando com nossos resultados, Whitcomb e colaboradores

(2012) também reforçam a ideia que a atividade de peptídeos antimicrobianos
não tem uma ação tão eficaz sobre as espécies de Leishmania, ao contrário do
observado sobre as micobactérias. Desta forma, mesmo com a ativação de
TLR específico e conseqüente up-regulation do VDR, a produção de
Catelicidina é pouca ou ineficaz ao combate do parasita.

Em suma, nossos resultados reforçam os dados da literatura,

relatando que a vitamina D possui atividade moduladora sobre as APC,
aumentando a susceptibilidade à infecção por L. braziliensis. Sendo assim, os
efeitos da vitamina D na interação de macrófagos e células dendríticas
humanos com L. braziliensis suscitam a necessidade de futuros experimentos
para maiores esclarecimentos do papel da vitamina D nesta interação.

49
 6 CONCLUSÕES

1. Macrófagos e células dendríticas derivados de monócitos isolados

de sangue periférico humano endocitam Leishmania braziliensis. Sendo
que células dendríticas são mais susceptíveis à infecção por este
parasita.

2. A infecção de células dendríticas por Leishmania braziliensis foi

aumentada pela inibição da NO-sintase.

3. As células apresentadoras de antígenos pré-tratadas com

vitamina D apresentam maior formação de vacúolos, sugerindo a ativação
da célula hospedeira.

4. Através da análise por citometria de fluxo observou-se que L.

braziliensis induz a redução da expressão do marcador de superfície
CD14 e ao aumento na expressão de CD209 em macrófagos.

5. Em células dendríticas, L. braziliensis aumenta a expressão de

CD14 e DC-sign e reduz a expressão de CD80.

6. Leishmania braziliensis reduz a expressão intracelular de

catelicidina em macrófagos e, mais proeminentemente, em células
dendríticas.

7. O tratamento com vitamina D induz endocitose de maior

quantidade de L. braziliensis tanto por macrófagos quanto por células
dendríticas.

50
8. Em macrófagos infectados com L. braziliensis, a vitamina D
aumenta a expressão de DC-Sign e CD80 e não altera produção de
Catelicidina.

9. Quando em células dendríticas infectadas por L. braziliensis,

vitamina D não altera a expressão dos marcadores de superfície, CD80 e
DC-Sign, e reduz discretamente a expressão de Catelicidina.

10. Em conjunto, os dados indicam uma atividade moduladora da

vitamina D sobre as células apresentadoras de antígenos, aumentando a
susceptibilidade à infecção por L. braziliensis e não exercendo influência
sobre a inibição de Catelicidina induzida por L. braziliensis.

51
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA, M. C.; VILHENA, V.; BARRAL-NETTO, M. Leishmanial

infection: Analysis of its first steps. A Review. Mem Inst Osw Cruz,
98 (7): 861-870, 2003.

ANTAS, P.; SALES, J. S.; PEREIRA, K.C. et al. Patterns of

intracellular cytokines in CD4 and CD8 T cells from patients with
mycobacterial infections. Braz J Med Biol Res 37: 1119-1129,
2004.

BANULS, A. L.; HIDE, M.; PRUGNOLLE, F. Leishmania and the

leishmaniases: a parasite genetic update and advances in taxonomy,
epidemiology and pathogenicity in humans. Adv. Parasitol, 64: 1–
109, 2007.

BOGDAN, C. Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol,

2, 10, 2001.

BRUCE, D.; WHITCOMB, J. P.; AUGUST, A. et al. Elevated non-

specific immunity and normal Listeria clearance in young and old
vitamin D receptor knockout mice. Int Immunol, 21, 2: 113–122,
2008.

CASTELLANO, L. R. C. Resposta imune anti-Leishmania e

mecanismos de evasão Anti-Leishmaniaimmune response
andevasionmechanisms. VITAE 25, 2005.

CLAVREUL, A.; D’HELLENCOURT, C. L.; MONTERO-MENEI, C. et

al. Vitamin D differentially regulates B7.1 and B7.2 expression on
human peripheral blood monocytes. Immunol, 95: 272-277, 1998.

COLMENARES, M.; CORBI, A. L.; TURCO, S. J. et al. The dendritic

cell receptor DC-SIGN discriminates among species and life cycle
forms of Leishmania. J Immunol, 172: 1186–1190. 2004.

CRUSE, J. M.; LEWIS, R. E. Illustrated dictionary of immunology. 3ª

ed. Boca Raton: CRC Press, 2009.

52
DE ALMEIDA, M. C.; VILHENA, V.; BARRAL, A.; BARRAL-NETTO.
M. Leishmanial Infection: Analysis of its First Steps. A Review. Mem
Inst Osw Cruz, 98(7): 861-870, 2003.

DE MOURA T. R.; OLIVEIRA, F.; RODRIGUES, G. C. et al.

Immunity to Lutzomyia intermedia Saliva Modulates the Inflammatory
Environment Induced by Leishmania braziliensis. PLoSNegl Trop
Dis, 4, 6: e712, 2010.

DELUCA, H. F.; CANTORNA, M. T. Vitamin D: its role and uses in

immunology. FASEBJ, 15: 2579–2585, 2001.

DEPLEDGE, D. P.; MACLEAN, L. M.; HODGKINSON, M. R. et al.

Leishmania-Specific Surface Antigens Show Sub-Genus Sequence
Variation and Immune Recognition. PLoS Negl Trop Dis, 4(9): e829,
2010.

EDFELDT, K., LIU, P. T.; CHUN, R. et al. T-cell cytokines

differentially control human monocyte antimicrobial responses by
regulating vitamin D metabolism. PNAS, 28(52): 107, 2010.

EHRCHEN, J.; HELMING, L.; VARGA, G. et al. Vitamin D receptor

signaling contributes to susceptibility to infection with Leishmania
major. FASEB, 3208–3218, 2007.

ÉVORA, P. R. B.; GARCIA, L. V.; NOBRE, F. et al. Endotélio e óxido

nítrico: do laboratório à prática clínica. Med, 32: 65-81, 1999.

GEIJTENBEEK, T. B. et al. DC-sign DC –specific HIV -1 binding

protein that enhances trans-infection of T cells. J Leukoc Biol, 71:
921-931, 2002.

GIUDICE, A.; VENDRAME, C.; BEZERRA, C et al. Macrophages

participate in host protection and the disease pathology associated
with Leishmania braziliensis infection. BMC Infect Dis, 12: 75, 2012.

GOMBART, A. F. The vitamin D–antimicrobial peptide pathway and

its role in protection against infection. Fut Microbiol, 4: 1151-1173,
2009.

53
HART, P. H.; GORMAN, S.; FINLAY-JONES, J. J. Modulation of the
immune system by UV radiation: more than just the effects of vitamin
D? Nat Rev Immunol, 11: 584-596, 2011.

HEWISON, M. Antibacterial effects of vitamin D. Nat Rev

Endocrinol, 7(8): 436, 2011.

INIESTA, V.; GOMEZ-NIETO, L. C.; MOLANO, I. et al. Arginase I

induction in macrophages, triggered by TH2-type cytokines, supports
the growth of intracellular Leishmania parasites. Parasite Immunol,
24: 113-118, 2002.

WHITCOMB, J. P.; DEAGOSTINO, M.; BALLENTINE, M. et al. The

Role of Vitamin D and Vitamin D Receptor in Immunity to Leishmania
major Infection. J Parasitol Res, 10: 134645, 2012.

Janeway, C. A.; Travers, P.; Walport, M.; Shlomchik, M.

J.Immunobiology. The Immune System in Health and Disease. 5ª
ed, 2001, 732p.

Kenneth, Murphy. Janeway’s immunobiology. 8ª Ed, 2011, 880p.

KUMAR; ABUL K.; ABBAS; FAUSTO; ASTER. Robbins & Cotran:

Patologia - Bases Patológicas das Doenças. 8ª Ed. Elsevier,
2010, 1464p.

LANG, T.; LECOEUR, H.; PRINA, H. Imaging Leishmania

development, in their host cells. Cell press, 1471-4922, 2009.

LEANDRO, A. C. C. S.; ROCHA, M. A.; CARDOSO, C. S. A. et al.

Genetic polymorphisms in vitamin D receptor, vitamin D-binding
protein, Toll-like receptor 2, nitric oxide synthase 2, and interferon-
gamma genes and its association with susceptibility to tuberculosis.
Braz. J Med Biol Res, 42: 312-322, 2009.

LIESE, J.; SCHLEICHER, U.; BOGDAN, C. The innate immune

response against Leishmania parasites. Review. Immunobiol,
213(3-4):377-87, 2008.

54
LIU, D.; KEBAIER, C.; AKPOUR, N. et al. Leishmania major
Phosphoglycans Influence the Host Early Immune Response by
Modulating Dendritic Cell Functions. Infect Immunit, 3272–3283,
2009.

MADEIRA, M. F.; SCHUBACH, A. O.; SCHUBACH, T. M. P. et al. Is

Leishmania (Viannia) braziliensis preferentially restricted to the
cutaneous lesions of naturally infected dogs? Parasitol Res, 97: 73–
76, 2005.

OLIVEIRA, C.; BRODSKYN, C. The immunobiology of Leishmania

braziliensis infection. Front Immunol, 3: 145, 2012.

OLIVIER, M.; GREGORY, D. J.; FORGET, G. Subversion

Mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host
immune response: a signaling point of view. Clin Microbiol Rev,
293-305, 2005.

PARK, C. G.; TAKAHARA, K.; UMEMOTO, E. et al. Five mouse

homologues of the human dendritic cell C-type lectin, DC-SIGN. Int
Immunol, 13(10): 1283-1290, 2001.

PENNA, G.; ADORINI, L. 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Inhibits

Differentiation, Maturation, Activation, and Survival of Dendritic Cells
Leading to Impaired Alloreactive T Cell Activation. J Immunol, 1,
164(5):2405-11, 2000.

PETERS, C.; AEBISCHER, T.; STIERHOF, Y. D. et al. The role of

macrophage receptors in adhesion and uptake of Leishmania
mexicanaamastigotes. J Cell Sci, 108: 3715-3724, 1995.

PRUSSING, D.; CALFE, M. Detection of intracytoplasmic cytokine

using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine
antibodies. J Methodol, 188: 117-128, 1995.

RAJAPAKSE, R.; URING-LAMBERT, B.; ANDARAWEWA K. L. et al.

1,25(OH)2D3 inhibits in vitro and in vivo intracellular growth of
apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. J Steroid Biochem Mol
Biol, 103(3-5):811-4, 2007.

55
REINER, S. L.; LOCKSLEY, R. M. The regulation of immunity to
Leishmania major. Ann Rev Immunol, 13: 151-177, 1995.

RODRÍGUEZ, N. E.; DIXIT, U. G.; ALLEN, L. H. et al. Stage-Specific

Pathways of Leishmania infantumchagasi Entry and Phagosome
Maturation in Macrophages. PLosOne, 6: 4, 2011.

SALLUSTO, F.; CELLA, M.; DANIELI, C. et al. Dendritic cells use

macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate
macromolecules in the major histocompatibility complex class II
compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. J
Exp Med, 182(2): 389-400, 1995.

SANTOS, D.; SANTOS, S. L.; ESQUENAZI, D. et al. Evaluation of

B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) costimultory molecules and dendritic
cells on the immune response in leprosy. Jpn J Lepr, 70: 15-24,
2001.

SANTOS, D. O.; BOURGUIGNON, S. C.; MIRANDA, A. et al.

Crithidia deanei infection in normal and dexamethasone-
immunosuppressed Balb/c mice. Health (2): 391-394, 2010.

SANTOS, D. O.; COUTINHO, C. E. R.; MADEIRA, M. F. et al.

Leishmaniasis treatment—a challenge that remains: a review.
Parasitol Res, 2008.

SCHNITZER, J. K.; BERZEL, S.; FAJARDO-MOSER, M. et al.

Fragments of antigen-loaded dendritic cells (DC) and DC-derived
exosomes induce protective immunity against Leishmania major.
Vaccine, 28: 5785–5793, 2010.

SERRANO-GÓMEZ, D.; MARTÍNEZ-NUÑEZ, R. T.; SIERRA-

FILARDI, E. et al. AM3 Modulates Dendritic Cell Pathogen
Recognition Capabilities by Targeting DC-SIGN. Antimicrob Agents
Chemother, 2313–2323, 2007.

SILVESTRE, R.; SILVA, A. M.; CORDEIRO-DA-SILVA, A. et al. The

contribution of Toll-like receptor 2 to the innate recognition of a
Leishmania infantum silent information regulator 2 protein. Immunol,
128: 484–499, 2009.

56
SOUZA, A. S.; GIUDICE, A.; PEREIRA, J. M. B. et al. Resistance of
Leishmania (Viannia) braziliensis to nitric oxide: correlation with
antimony therapy and TNF-a production. BMC Infect Dis, 10: 209,
2010.

VARGAS-INCHAUSTEGUI, D. A.; XIN, L.; e SOONG, L. Leishmania

braziliensis Infection Induces Dendritic Cell Activation, ISG15
Transcription, and the Generation of Protective Immune Responses.
J Immunol, 180(11): 7537–7545, 2008.

VIARO, F.& ÉVORA, P. R. B. Expressão das óxido nítrico sintetases

na vasculopatia coronariana do transplante cardíaco. Rev Bras Cir
Cardio Vasc, 15(1): 55-65, 2000.

VON STEBUT, E.; BELKAID, Y.; JAKOB, T. et al. Uptake of

Leishmania major Amastigotes Results in Activation and Interleukin
12 Release from Murine Skin–derived Dendritic Cells: Implications
for the Initiation of Anti-Leishmania Immunity. J Exp Med, 188(8):
1547–1552, 1998.

WHITE, J. H. Vitamin D as an inducer of cathelicidin antimicrobial

peptide expression: Past, present and future. J Steroid Biochem
Molec Biol, 121: 234–238, 2010.

WILKINS-RODRÍGUEZ, A. A.; ESCALONA-MONTAÑO, A. R.;

AGUIRRE-GARCÍA, M. et al. Regulation of the expression of nitric
oxide synthase by Leishmania Mexicana amastigotes in murine
dendritic cells. Exp Parasitol, 126: 426–434, 2010.

YOUSSEF, D. A.; MILLER, C. W. T.; EL-ABBASSI, A. M. et al.

Antimicrobial implications of vitamin D. Dermato-Endocrinol, 3:4,
220-229, 2011.

ZAHN, S.; KIRSCHSIEFEN, P.; JONULEIT, H. et al. Human primary

dendritic cell subsets differ in their IL-12 release in response to
Leishmania major infection. Exp Dermatol, 919–930, 2010.

57