PARTICIPAÇÃO DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS NA INFECÇÃO

POR LISTERIA MONOCYTOGENES EM MACRÓFAGOS.

Taynná da Costa Goltara Gomes

Rio de Janeiro

2021
 TAYNNÁ DA COSTA GOLTARA GOMES

PARTICIPAÇÃO DS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS NA INFECÇÃO POR

LISTERIA MONOCYTOGENES EM MACRÓFAGOS.

Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,

apresentado ao Curso de Graduação em
Farmácia, da UEZO como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de
Bacharel em Farmácia. Orientador(a): Dr.
Filipe Santos Pereira Dutra. Co-orientador:
Dr. Patrícia Torres Bozza

Rio de Janeiro

Outubro de 2021
PARTICIPAÇÃO DOS CORPÚSCULOS LIPÍDICOS NA INFECÇÃO
POR LISTERIA MONOCYTOGENES EM MACRÓFAGOS.

Elaborado por Taynná da Costa Goltara Gomes

Discente do Curso de Farmácia da UEZO

Este trabalho de Graduação foi aprovado com grau: _____

Rio de Janeiro, 07 de outubro de 2021.

_______________________________________________
Filipe Santos Pereira-Dutra, Drª., Fiocruz

________________________________________________
Flávia Lúcia Piffano Costa Pellegrino, Dra., UEZO

________________________________________________
Tamiris da Cunha Fernandes, MSc, Fiocruz

________________________________________________
Suelen da Silva Gomes Dias, MSc, Fiocruz (Suplente)

Outubro de 2021
 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus que em todos momentos se faz presente em

minha vida. À minha família, especialmente ao meus pais Simone e André, que me
criaram, sempre me deram o melhor e me incentivaram a estudar e correr atrás dos
meus sonhos, por acreditarem em mim até mesmo quando eu não acreditava. Ao
meu tio Roberto que mesmo distante, em momentos de saudades se fez presente e
me apoiou a persistir e seguir em frente. A minha vó Rita pelo apoio, carinho e
dedicação que sempre teve por mim. Ao meu namorado Jônatas por me dar força,
acreditar sempre em mim, por me entender e estar ao meu lado.

Agradeço a minha orientadora da iniciação cientifica Drª. Patrícia Torres

Bozza e ao meu co-orientador Filipe pelo apoio, aprendizado e incentivo durante a
elaboração da pesquisa, e também pelo crescimento pessoal que me proporcionou
durante a concretização do projeto. A todos os integrantes do laboratório de
Imunofarmacologia do Instituto Oswaldo Cruz, em especial a Ellen e Felipe por
fazerem parte do meu dia a dia, me auxiliaram na pesquisa acrescentando
conhecimento, além do grande incentivo mostrado e parceria de bancada. Agradeço
ainda ao Cnpq, PIBIC/FIOCRUZ e a CAPES que com o financiamento tornaram
possível esse trabalho.

Agradeço ainda aos meus queridos amigos, tanto de perto quanto de longe,
por sempre compartilharem comigo minhas alegrias e frustrações. Também aos
meus colegas de faculdade, por estarmos sempre juntos e nos ajudando. Aos
professores que tive na UEZO, por terem feito parte da minha formação, pelas aulas
e por transmitirem seus conhecimentos.
 RESUMO

Listeria monocytogenes é uma bactéria gram-positiva patogênica intracelular e

agente etiológico da listeriose. Apesar da listeriose normalmente resultar em
gastroenterite leve, a infecção grave por L. monocytogenes, principalmente em
populações de risco (indivíduos imunocomprometidos, idosos e grávidas) pode
resultar em complicações como septicemia, meningite, endocardite ou aborto
espontâneo. Os corpúsculos lipídicos são organelas dinâmicas e complexas que
fornecem todas as células eucarióticas substratos lipídicos. Muitos detalhes sobre a
interação patógeno / CL ainda são desconhecidos. A participação dos CLs na
relação patógeno-hospedeiro já foi verificada na infecção por vírus, bactéria e
parasitas protozoários. Resultados recentes indicaram também que o CL participa
da resposta pró-inflamatória. Nosso objetivo nesse trabalho foi investigar a
participação dos corpúsculos lipídicos na infecção por L. monocytogenes em
macrófagos e seu envolvimento na patogenicidade. Para isso, macrófagos derivados
de medula óssea ou macrófagos murinos imortalizados, bem como nocautes para os
principais receptores da via TRL associados ao reconhecimento de patógenos
(TLR2 e Myd88 / TRIFF), foram utilizados com o objetivo de avaliar a biogênese dos
CLs em 1 e 24 horas pós a infecção. Nossos resultados mostram que após 1h de
infecção por Listeria monocytogenes houve indução da biogênese de CLs em ambos
os tipos de macrófagos e esse fenômeno é dependente da via de sinalização Toll
(Myd88/TRIFF). Nossos dados mostraram que a infecção por Listeria inoccua, uma
cepa não patogênica, e a Listeria irradiada (bactéria morta) não foi capaz de induzir
a biogênese precoce de CLs como visto na infecção por L. monocytogenes.
Indicando que a formação precoce de CLs é dependente da patogenicidade e
atividade da bactéria. Curiosamente, a sinalização via TRL2 mostrou-se como um
contrarregulador do acúmulo de CL. Além disso, usando inibidores de importantes
vias metabólicas ligadas a biossíntese de lipídios e ao remodelamento lipídico, a
indução de CLs em macrófagos por L. monocytogenes é um evento dependente da
atividade das enzimas DGAT-1, DGAT-2 e fosfolipase A2. Para melhor elucidação
da natureza desta relação e a contribuição dos corpúsculos lipídicos para a
proliferação de Listeria sp intracelular mais experimentos ainda são necessários.

Palavras chaves: Listeria monocytogenes, corpúsculos lipídicos, TLRs.

 ABSTRACT

Listeria monocytogenes is a intracellular pathogenic Gram-positive bacteria and the

etiological agent of listeriosis. Despite of listeriosis normally results in mild
gastroenteritis, severe L. monocytogenes infection, especially in at‐risk populations
(immunocompromised, elderly, or pregnant individuals) may result incomplications
such as septicemia, meningitis, endocarditis, or spontaneous abortion. Lipid droplets
(LDs) are dynamic and complex organelles that provide all eukaryotic cells with lipid
substrates. Many details about the pathogen / LDs interaction are still unknown. LDs
participation in pathogen- host relationship has already been verified infection by
virus, bacteria and protozoan parasites. Recent results also indicated that LD
participate in proinflammatory response. Our objective in this work was to investigate
the participation of LDs in Listeria monocytogenes infection in macrophages and its
involvement in pathogenicity. For this, bone marrow-derived macrophages or
immortalized murine macrophages, as well as knockouts for the main receptors of
the TLR pathway associated with pathogen recognition (TLR2 and Myd88 / TRIFF).
Our results show that after 1h of infection by Listeria monocytogenes induced LDs
biogenesis in both types of macrophages and this phenomenon is dependent on the
TLR signaling pathway (Myd88 / TRIF). Our data induced that infection by Listeria
inoccua, a non-pathogenic strain, and irradiated Listeria (dead bacteria) do not
induce LD biogenesis as seen in L. monocytogenes infection. Indicating that the
formation of LDs is dependent on the pathogenicity and viability of the bacteria.
Interestingly, a signaling via TRL2 is shown to be a counter-regulator of LD
accumulation. Furthermore, using inhibitors of important metabolic pathways linked
to lipid biosynthesis and lipid remodeling, an induction of LDs in macrophages by
Listeria sp is an event dependent on the activity of DGAT-1, DGAT-2 and
phospholipase A2. For a better elucidation of the nature of this relationship and the
contribution of lipid bodies to the proliferation of intracellular Listeria sp, further
experiments were carried out.

Keywords: Lipid droplets, Listeria monocytogenes, TLRs.

 LISTA DE ABREVIATURAS

CL: corpúsculos lipídicos

ADRP: Proteína relacionada à diferenciação do tecido adiposo, do inglês “Adipose -

differentiation related protein”

TIP: “Tail-Interaction Protein”

PAMP: Padrão Molecular Associado a Patógeno, do inglês “Pathogen-Associated

Molecular Pattern”

PRR: Receptor de Reconhecimento de Padrão, do inglês “Pattern Recognition

Receptor”

LPS: Lipopolissacarídeo, do inglês “Lipopolysaccharide”

MyD88: Myeloid differentiation primary response gene 88

PPARγ: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma

TRL: Receptores do tipo Toll, do inglês toll-like receptor

DGAT: diacilglicerol acetiltrasferase

DAPI: 4',6'-diamino-2-fenil-indol

MOI: Multiplicidade de infecção, do inglês “Multiplicity of Infection”

WT: Tipo selvagem, do inglês “Wild Type”

ORO: Oil-Red-O

DMSO: Dimetilsufóxido

SFB: Soro fetal bovino

BMM: Macrófago derivado de medula óssea, do inglês Bone Marrow Macrophage

CDC: Centers for Disease Control and Prevention

 Lista de Figuras

Figura 1: Listeria monocytogenes, bacilo gram-positivo.........................................................12

Figura 2: Distribuição global da listeriose...............................................................................14
Figura 3: Visão geral da infecção por Listeria monocytogenes..............................................17
Figura 4: Imagem representativa da estrutura dos corpúsculos lipídicos...............................19
Figura 5: Corpúsculo lipídicos são centrais na resposta inflamatória tanto pró-patógeno
como na resposta protetiva ao hospedeiro.............................................................................20
Figura 6: L. monocytogenes induz a formação de CLs rápida e tempo dependente em
macrófagos derivados de medula murina...............................................................................27
Figura 7: Infecção por L. innocua não induz biogênese de corpúsculos lipídicos em
macrófagos.............................................................................................................................28
Figura 8: A indução da biogênese de CLs é dependente da viabilidade da L.
monocytogenes.......................................................................................................................29
Figura 9: Biogênese de CLs induzida pela L. monocytogenes é dependente da via TRL, e
contrarregulado por TLR2.......................................................................................................30
Figura 10: Biogênese de CLs é dependente da atividade da cPLA2.....................................31
Figura 11: Biogênese precose de CLs é dependente da atividade de enzimas envolvidas na
síntese de triglicerídeos (DGAT1 e DGAT2)..........................................................................32
Figura 12: Infecção por Listeria induz PGE2 e IL-6 em macrofagos murinos.........................33
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................11

2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................12

2.1 Gênero Listeria..............................................................................................12

2.2 Epidemiologia................................................................................................13

2.3 Fisiopatologia................................................................................................ 14

2.4 Corpúsculos lipídicos.....................................................................................18

3. OBJETIVO.......................................................................................................... 22

3.1 Objetivo geral................................................................................................ 22

3.2 Objetivos específicos.....................................................................................22

4. METODOLOGIA..................................................................................................23

5. RESULTADOS....................................................................................................27

6. DISCUSSÃO.......................................................................................................34

7. CONCLUSÃO......................................................................................................39
 1. INTRODUÇÃO

A listeriose é uma grave infecção alimentar cujo agente etiológico é a

Listeria monocytogenes, cujo surtos recentes vêm sendo associados ao consumo de
diversos alimentos contaminados, como leite não pasteurizado, saladas, camarões e
manteiga. Os sintomas da listeriose se confundem com os de outras gastroenterites
intestinais de origem alimentar (Orsi et al., 2011). Estima se que 1.600 pessoas
obtenham listeriose a cada ano, cerca de uma em cada cinco pessoas infectadas
por L. monocytogenes morrem, tornando se a terceira principal causa de morte por
infecção alimentar nos Estados Unidos (CDC, 2021). Dentre os grupos de risco
estão, os idosos, pessoas imunocomprometidas e recém-nascidos, que tem uma
maior frequência de septicemia e a meningite como as manifestações clínicas da
listeriose. Além disso, a infecção em grávidas em torno do terceiro trimestre de
gestação frequentemente vem sendo associada com abortos ou parto prematuro.
No Brasil, a listeriose é desconhecida pela maioria da população, mas devido à alta
taxa de mortalidade nos casos graves, esta doença tem chamado atenção dos
órgãos governamentais e pesquisadores por ser considerada um problema de saúde
pública.

Ao curso da infecção por L. monocytogenes há uma modulação do

metabolismo e equilíbrio lipídico da célula do hospedeiro. Os corpúsculos lipídicos
são organelas dinâmicas e plásticas formadas por um núcleo de lipídeos neutros
que estão envolvidos no ciclo de infecção, patogênese, sobrevivência e
multiplicação de diversos patógenos. Recentemente foi demonstrado a atuação dos
CLs na resposta antibacteriana, ou seja, a existência de outra face nesta interação
patógeno-hospedeiro. Ensaios in vitro publicados por Anand et al., (2012) mostram
que CLs purificados de embriões de Drosophila melanogaster possuem atividade
antibacteriana in vitro contra Staphylococcus epidermidis e Escherichia coli.
Embriões e adultos de D. melanogaster deficientes em jabba foram mais suscetíveis
à infecção bacteriana por L. monocytogenes quando comparadas aos organismos
selvagens (Anand et al., 2012).

Como a participação dos CLs na infecção por Listeria monocytogenes ainda

não foi explorada, nosso objetivo nesse trabalho foi determinar se a infecção por L.
 12

monocytogenes modula a biogênese dos CLs. Para isso analisamos a correlação da

quantidade dos CLs frente a infecção por bactérias in vitro, em cultura de
macrófagos.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Gênero Listeria

O gênero Listeria é formado por bacilos Gram-positivos, não formadores de

esporo, anaeróbicos facultativos. As células bacterianas jovens desse gênero,
quando observadas ao microscópio, apresentam-se na forma lisa, assemelhando-se
a pequenos difteróides, medindo de 1,0 a 2,0 µm por 0,5 µm (Figura 1). Após três a
cinco dias de incubação no organismo, no entanto, apresentam-se como bacilos
longos, medindo de 6 a 20 µm. Além disso, Listeria sp são bactérias móveis devido a
presença de flagelos, apresentando movimento característico denominado
tombamento, que auxilia na sua identificação. Este microrganismo apresenta reação
positiva para catalase e negativa para oxidase. Além disso, esse gênero é
termoresistente, crescendo em temperaturas de 0 a 42º C, podendo ainda se
multiplicar lentamente em baixas temperaturas (FRANCO & LANDGRAF,1996).

Atualmente, o gênero Listeria é constituído por sete espécies: L.

monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L.
Murray. A L. monocytogenes se destaca em importância como patógeno tanto para
o homem como para outras espécies de animais. Com exceção de L. grayi e L.
Murray, todas as espécies são contaminantes de alimentos. Já as espécies L.
innocua, L. welshimeri e L. seeligeri são consideradas avirulentas (TRABULSI,
1999).

Figura 1: Listeria monocytogenes, bacilo gram-positivo.

 13

Fonte: Centers for Disease Control and Prevention (CDC,2021)

L. monocytogenes é o agente etiológico causador da listeriose. Uma infecção

grave causada pela ingestão de alimentos contaminados por L. monocytogenes. A
infecção tem maior probabilidade de adoecer mulheres grávidas e seus recém-
nascidos, adultos com 65 anos ou mais e pessoas com sistema imunológico
enfraquecido. Os sintomas vão desde febre e diarreia, comuns também em outras
infecções de origem alimentar como também calafrios, dores musculares, vômitos.
Em geral os sintomas duram entre 5 a 10 dias. Na forma mais grave da doença, a
listeriose invasiva, L. monocytogenes se espalha para além do intestino, podendo
provocar septicemia e meningites (Orsi et al., 2011).

2.2 Epidemiologia

Diversos surtos associados à listeriose possuem origem alimentar e sua

elevada taxa de mortalidade faz com que L. monocytogenes seja considerada um
perigo em saúde pública (FARBER; PETERKIN, 1991). Um estudo conduzido por
Scallan e colaboradores (2011), aponta que nos Estados Unidos da América (EUA),
este patógeno causa, anualmente, cerca de 1.600 surtos, originando ao todo 1.500
hospitalizações e 260 mortes (CDC, 2015) (Figura 2).

Já a listeriose invasiva (os casos na qual a bactéria se espalha para além do

intestino) é uma doença relativamente rara, com incidência típica de 3 a 8 casos por
1.000.000 indivíduos, mas frequentemente grave, com taxas de mortalidade de 20 a
30% dos pacientes hospitalizados (FAO & WHO,2001). Os dados epidemiológicos
disponíveis mostram que a listeriose invasiva ocorre tanto em casos esporádicos
quanto em surtos, sendo os esporádicos os responsáveis pela maior parte dos
casos (CDC, 2015)
 14

Poucos casos de listeriose têm sido relatados no Brasil, e destes a fonte de

infecção não foi elucidada ou não esteve associada ao consumo de alimentos
contaminados. Segundo o Centro de Vigilância Epidemiológica do estado de São
Paulo (CVE), a listeriose é subnotificada e subdiagnosticada, o que possivelmente
contribui para seus baixos índices de notificação em território nacional
(BARANCELLI 2 et al., 2011). Apesar de muitas classes de alimentos serem
implicadas em casos de listeriose em todo mundo, como produtos vegetais, leite cru,
produtos cárneos e seus derivados, além de produtos prontos para o consumo, no
Brasil, a Resolução RDC nº 12 de 02 de janeiro de 2001 da ANVISA, determina a
pesquisa deste agente bacteriano somente em alguns tipos de queijos. Diante do
exposto torna-se necessária a avaliação de sua ocorrência em outras classes de
alimentos para que os resultados possam subsidiar a inserção de padrões
microbiológicos para outros produtos, propiciando desta maneira aumento na
segurança alimentar (BARANCELLI 2 et al., 2011).

A dose infecciosa necessário para causar infecção não é conhecido porém

os dados epidemiológicos existentes sugerem que esta seja elevada. Os alimentos
implicados em alguns surtos apresentaram concentrações superiores a 10 3 UFC por
grama. O longo período de incubação, em alguns casos superior a 70 dias, dificulta
a determinação da dose infecciosa (FAO & WHO,2001).

Figura 2: Distribuição global da listeriose.

Fonte: Guideon informatics, 1994 – 2017. Foram coletadas informações no período de 1994 a 2017.
O mapa acima demonstra áreas endêmicas em verde e em vermelho as notificações de casos por
países do globo. Onde, a África e Europa concentram maior número de casos notificados. Casos
esporádicos estão sendo evidenciados em bege no mapa.
 15

2.3 Fisiopatologia

O ciclo de infecção por L. monocytogenes inicia-se com a adesão da

bactéria à superfície da célula eucariótica e posterior entrada na mesma através de
fagocitose ou, no caso de células não-fagocíticas, pela interação entre moléculas
ligantes presentes na superfície da bactéria e receptores da superfície da célula
eucariótica. (GAILLARD,1991). Os ligantes de L. monocytogenes são principalmente
as internalinas A e B (InlA e InlB), que são proteínas de superfície caracterizadas por
possuir repetições ricas em leucina (LRR), responsáveis por intermediar a ligação
com a célula do hospedeiro. Estas proteínas são codificadas pelos genes inlA e inlB.
(CABANES, 2004).

Durante a infecção, padrões associados ao patógeno (PAMPs) são

detectados na superfície da célula por receptores do tipo Toll (TLR). Os receptores
TLRs participam da imunidade inata detectando diferentes patógenos invasores
(ADEREM, et al., 2001) e estimulando a ativação celular através de moléculas
adaptadoras, como o fator de diferenciação mieloide 88 (MyD88), a proteína
adaptadora que contém o domínio do receptor de interleucina-1 (TIRAP) e o
adaptador contendo domínio receptor Toll-interleucina-1 que induz interferon beta
(TRIF), que irão ativar fatores de transcrição, como o fator nuclear κB (NF-κB), que
por sua vez irão ativar a transcrição de um amplo conjunto de genes pró-
inflamatórias (TAKEDA et al., 2003).

Os TLRs reconhecem estruturas moleculares conservadas em patógenos

(AKIRA et al., 2001), discriminando bactérias gram-positivas e gram-negativas de
fungos e outros patógenos (UNDERHILL et al., 1999). O ácido lipoteicóico
bacteriano (LTA), peptidoglicanos e lipoarabinomanano (ADEREM, et al., 2001) e
zimosano da levedura (AKIRA, et al., 2001) induzem a ativação celular de maneira
dependente do TLR2. Esse amplo e incomum espectro de reconhecimento de
patógenos pode ser explicado pelo fato de o TLR2 formar heterodímeros em
associação com TLR6 ou TLR1 (OZINSKY et al., 2000). Na infecção por Listeria sp,
o TLR2 vendo sendo associado com controle infecção, mas outros sinais
dependentes de MyD88 contribuem para a resistência do hospedeiro (TORRES et
al, 2014). Hayashi et al. (2001) demonstraram que a Listeria é reconhecida pelo
 16

TLR5 por meio de sua flagelina. Além disso, TLR9, que está implicado em respostas
inflamatórias induzidas por DNA bacteriano não metilado (HEMMI et al. 2000), pode
ser outro candidato.

Uma vez que a L. monocytogenes é internalizada dentro do vacúolo, fatores

de patogenicidade listeriolisina O e duas fosfoslipases, fosfolipase A (também
conhecida como 1-fasfatidilnositol fosfodiesterase) e fosfolipase B, rompem o
vacúolo e promovem o escape da bactéria do fagossomo para o citoplasma, sendo
etapas crucias na patogênese da L. monocytogenes. (RADOSHEVICH & COSSART,
2018), ambos os processos não permitem a formação de fagolisossomos que
poderiam destruir a bactéria por meio de hidrolises ácidas ali existentes (Figura 3).

Ao mesmo tempo, a bactéria induz, através de um gene chamado actA,

numerosos e pequenos filamentos de actina da célula hospedeira a serem montados
através de sua superfície, formando uma cauda polar. (TRABULSI, 1999). Esses
filamentos causam o deslocamento da bactéria no citoplasma, permitindo a invasão
das células adjacentes, dando início a um novo ciclo de infecção. (FRANCO &
LANDGRAF,1996). Uma vez dentro do citoplasma, as bactérias se multiplicam com
um tempo de geração de aproximadamente 1 hora. (GAILLARD, 1987).

Quatro genes envolvidos na síntese de purinas (purA, purQ, lmo1771) e

pirimidinas (pyrE) são necessários para a proliferação intracelular de L.
monocytogenes, sugerindo que essas bases e nucleotídeos não são fornecidos pela
célula hospedeira, mas devem ser sintetizados pela bactéria. Outros genes
importantes para a replicação intracelular de L. monocytogenes são serC,
Lmo0517, glpD. O gene lmo0517 codifica uma enzima crítica para a glicólise
(fosfoglicerato mutase periplasmático), glpD codifica uma glicerol-3-fosfato
desidrogenase que desempenha um papel importante no metabolismo lipídico.
(SHAUER K., 2010).

Macrófagos desempenham um papel fundamental como a linha de frente

das defesas do hospedeiro. Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) e
outros receptores de sinalização expressos por macrófagos os tornam fagócitos
profissionais e células apresentadoras de antígenos (BISWAS & MANTOVANI,
2010). Está bem estabelecido que os macrófagos fazem uso de proteínas solúveis
para comunicação com outras células imunes para iniciação de cascatas de
 17

sinalização durante o processo de infecção. Além disso, é cada vez mais evidente
que os lipídios desempenham um papel igualmente importante nas funções efetoras
dos macrófagos, influenciando no resultado das infecções (BOYCE, 2007; HELMS,
2006).

Os macrófagos infectados secretam citocinas inflamatórias, como fator de

necrose tumoral (TNF), interleucina-12 (IL-12) e várias quimiocinas, permitindo o
recrutamento e a ativação de células imunes. A IL-12 participa do desenvolvimento
de linfócitos T que expressam citocinas do tipo Th1, como interferon gama (IFN-γ),
TNF e IL-2) (EDELSON & UNANUE, 2000) e a ativação de células T e das natural
killer. Isso resulta na secreção de mais IFN-γ, que em combinação com o TNF leva à
ativação total de macrófagos e morte bacteriana através da produção de óxido
nítrico (NO) (BECKERMAN et al., 2000).

Figura 3: Visão geral da infecção por Listeria monocytogenes

 18

A) Esquema da infecção por Listeria monocytogenes de um ser humano hospedeiro. Após a ingestão
de alimentos contaminados, L. monocytogenes pode atravessar a barreira intestinal e se es0palhar na
corrente sanguínea através dos gânglios linfáticos para se disseminar aos tecidos-alvo, como o fígado
e o baço. Em indivíduos imunocomprometidos, L. monocytogenes pode cruzar a barreira
hematoencefálica ou a barreira fetoplacentária e causar meningite potencialmente fatal, sepse, parto
prematuro ou aborto. B) L. monocytogenes entra em células não fagocíticas, como células epiteliais,
por meio de endocitose mediada por receptor e, na maioria dos casos, escapa do vacúolo. Em células
caliciformes, pode se replicar em fagossomas contendo Listeria (SLAPs). Sobre escape vacuolar, L.
monocytogenes subsequentemente polimeriza a actina e pode se espalhar de célula para célula. A
infecção L. monocytogenes tem uma infinidade de efeitos na célula por meio da atividade de fatores
de virulência potentes. Listeriolisina O (LLO), fosfolipase A (PlcA) e PlcB medeiam o escape vacuolar.
LLO também leva a mudanças na modificação da histona, desumoylation, fissão mitocondrial,
estresse de retículo endoplasmático (ER) e permeabilização lisossomal, todos os quais podem
ocorrer a partir da atividade de formação de poros de LLO extracelular. Fonte: Rodoshevich L., &
Cossart P., 2017.
 19

2.4 Corpúsculos lipídicos

Os CL são organelas dinâmicas e complexas formadas por um núcleo de

lipídeos neutros (ésteres de colesterol e triacilgliceróis) envoltos por uma
monocamada de fosfolipídios associada a um conteúdo proteico diversificado
(BOZZA, 2007). Os CL são os principais sítios de armazenamento de lipídeos
intracelular. Estas organelas podem ser encontradas em praticamente todos os tipos
de células, de procariotas e eucariotas multicelulares (POL, GROSS e PARTON,
2014; BOZZA, MAGALHÃES e WELLER, 2009). As proteínas associadas a esta
organela fazem parte da família das Perilipinas, sendo as mais caracterizadas em
macrófagos a Plin-2 (BRASAEMLE et al., 2004) e Plin-3 (WOLINS et al., 2001). Os
fosfolipídios presentes nos CLs incluem fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,
fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina e lisofosfatidiletanolamina (TAUCHI-SATO et al.,
2002).

O tamanho, a função e constituição lipídica e proteica dos CL são

dependentes do tipo e do estágio celular. As funções clássicas dos CL envolvem o
armazenamento e o fornecimento de substratos lipídicos para diversos processos
biológicos, a exemplo do metabolismo energético e síntese das membranas
celulares. Embora os CLs estejam praticamente ausentes nos leucócitos em
repouso, em processos inflamatórios e infecciosos ocorre aumento no tamanho e no
número dessas organelas (BOZZA, MAGALHÃES e WELLER, 2009; MELO et al.,
2011). Nesse contexto, o trabalho pioneiro de PACHECO et al. (2002) foi o primeiro
a demonstrar que a biogênese dos CLs em leucócitos pode ser desencadeada pelo
reconhecimento de PAMPs pelos PRRs. Entre os PRRs descritos, a família dos
TLRs se destaca como uma via molecular bem estabelecida de indução da
biogênese dos CLs por agentes infecciosos (PEREIRA-DUTRA et al.; 2019).
 20

Figura 4: Imagem representativa da estrutura dos corpúsculos lipídicos.

Podem ser vistas as características estruturais do CL, sendo possível observar os lipídios polares da
monocamada, os lipídios não polares do núcleo e uma variedade de proteínas da superfície do
corpúsculo. Fonte: (adaptado de FARESE et al., 2009).

Nas últimas décadas, os CL deixaram de serem visto apenas como um

depósito inerte de lipídios e fonte de armazenamento de energia, e passaram a
serem caracterizados como uma plataforma celular complexa e dinâmica envolvida
em diversos processos celulares, incluindo a resposta inflamatória, homeostase
energética e lipídica, biossíntese de membrana, sinalização celular e proteção
celular para lipotoxicidade (WELTE, 2015; OLZMANN e CARVALHO, 2019;
FUJIMOTO e PARTON, 2011; WILFLING et al., 2013; VIKTOROVA et al., 2018;
SAKA e VALDIVIA, 2012; FUJIMOTO e OHSAKA , 2006). Além disso, os CL são
importantes sítios de compartimentalização da via de eicosanoides, ocorrendo o
controle e síntese de importantes mediadores inflamatórios, como os
tromboxanos, leucotrienos e prostaglandinas. Trabalhos recentes também
demostraram a importância dessa organela na via de interferon (PEREIRA-DUTRA
et al 2019; FARESE & WALTHER, 2009; WALTHER & FARESE, 2012)
 21

Figura 5: Corpúsculo lipídicos são centrais na resposta inflamatória tanto pró-patógeno como
na resposta protetiva ao hospedeiro.

Corpúsculos lipídicos são estruturas centrais na resposta inflamatória, sendo local de síntese tanto de
protaglandina E2 via cicloxigenase 2, e/ou de leucotrieno B4 (LTB4) via 5-lipoxigenase, dois
mediadores centrais tanto na reposta pró-hospedeiro como na sobrevivência dos patógenos. Os CLs
também foram associados à respostas pró-patógeno e pró-hospedeiro. Fonte: PEREIRA-DUTRA et
al., 2019.

Os CL também estão envolvidos no ciclo de infecção, patogênese,

sobrevivência e multiplicação de diversos patógenos, que estimulam a biossíntese
dessa organela. Essa relação oportunista de estimulo da biossíntese pode ser tanto
para a obtenção de uma fonte de energia ou como parte dos mecanismos de evasão
do sistema imune (FARESE & WALTHER, 2009; SAKA & VALDIVIA, 2012). Dados
acumulados mostram que os CLs atuam como plataformas especializadas para a
síntese de eicosanoides em processos inflamatórios e infecciosos (MELO, D'AVILA
E WAN, 2011; BOZZA et al., 2011). Os eicosanoides derivam do ácido araquidônico
e atuam como mediadores lipídicos na inflamação e há evidências de que a
biogênese de CLs demonstra ter correlação com a síntese de eicosanoides. Os CLs
compartimentalizam enzimas envolvidas no metabolismo e no transporte de ácido
araquidônico, e ainda enzimas necessárias para a síntese dos prostanóides, como,
 22

a fosfolipase A2 (PLA2) (WOOTEN, 2008), as ciclooxigenases (COX) (DVORAK,

1993), prostaglandina E2 (PGE2) sintase e leucotrieno C4 (LTC4) sintase (BOZZA,
1997) (FIGURA 5). O papel da PGE2 já foi explorado em macrófagos e outros
leucócitos, onde foi associado com a modulação negativa da produção de citocinas
pró inflamatórias, da apresentação de antígenos e da produção de espécies reativas
de oxigênio (ZAHM et al., 2008; GOMES et al., 2014). O papel imunomodulador na
resposta imune por PGE2 parece ser uma estratégia no qual muitos microrganismos
se utilizam para o estabelecimento das infecções (ZAHM et al., 2008; GOMES et al.,
2014). Como sítios especializados para síntese de eicosanoides, os CLs têm um
papel importante na sobrevivência dos patógenos, bem como na resposta do
hospedeiro frente à infecção (BOZZA et al., 2011; PETERS-GOLDEN e BROCK,
2000). Essa relação patógeno-hospedeiro envolvendo os CL já foi constatada para
diferentes organismos pelo nosso grupo de pesquisa, a exemplo do Mycobacterium
leprae (MATTOS et al., 2011), Microbacterium bovis BCG (D’AVILA et al., 2008),
vírus da dengue (CARVALHO et al., 2012; MARTINS et al., 2012; SAMSA et al.,
2009), Toxoplasma gondii (GOMES et al., 2014; MOTA et al., 2014) e Tripanosoma
cruzi (D’AVILA et al., 2011).

Recentemente foi demonstrado a atuação dos CL na resposta antibacteriana,

ou seja, a existência de outra face, um papel protetor associado aos CLs nesta
interação patógeno-hospedeiro. Ensaios in vitro publicados por Anand et al., (2012)
mostram que CLs purificados de embriões de Drosophila melanogaster possuem
atividade antibacteriana in vitro contra Staphylococcus epidermidis e Escherichia
coli. Neste mesmo trabalho foi constatado que esta resposta antimicrobiana era
devido ao conteúdo proteico dessa organela (principalmente devido a ação das
histonas) e não devido aos lipídios. A presença de histonas nos CL envolve a
participação da proteína jabba que interage fisicamente com as histonas e as recruta
para os CL (LI et al., 2012). Embriões de D. melanogaster deficientes em jabba
foram mais suscetíveis à infecção bacteriana quando comparadas aos organismos
selvagens (ANAND et al., 2012). Ainda nesse contexto, Bosh et al. 2020 em seu
estudo, mostraram que CLs de mamíferos possuem uma capacidade antibacteriana
mediada por proteínas e regulada positivamente por LPS. Os LPS-CLs também
acumularam catelicidina (CAMP), um peptídeo antimicrobiano de amplo espectro
com propriedades quimiotáticas. As células que superexpressam CAMP associado a
 23

CLs foram mais resistentes a diferentes espécies bacterianas, incluindo E.

coli, Staphylococcus aureus resistente à meticilina e Listeria monocytogenes.

Como a participação dos CLs na infecção por Listeria monocytogenes ainda

não foi explorada, nosso próximo objetivo nesse trabalho foi determinar se a
infecção por L. monocytogenes modula a biogênese dos CLs. Para isso analisamos
os mecanismos de biogênese de CLs em macrófagos induzidos pela infecção por L.
monocytogenes.

3. OBJETIVO

3.1 Objetivo geral

Avaliar o papel dos corpúsculos lipídicos durante a infecção por Listeria

monocytogenes em macrófagos murinos.

3.2 Objetivos específicos

- Avaliar a cinética dos corpúsculos lipídicos durante a infecção por Listeria

monocytogenes;

- Avaliar a participação de receptores da imunidade inata na biogênese de

corpúsculos lipídicos pela infecção por Listeria monocytogenes;

- Determinar a presença de atividade antibacteriana em corpúsculos lipídicos.

 24

4. METODOLOGIA

Animais

Nesse trabalho foram utilizados camundongos C57BL/6 machos com 6-8

semanas de idade, pesando entre 20 e 30g, fornecidos pelo Instituto de Ciências e
Tecnologia em Biomodelos (ICTB/Fiocruz). Durante a permanência dos animais em
nosso biotério, estes foram mantidos em temperatura constante (25°C), com ciclo de
12 h claro/escuro e livre acesso de água e comida. O Comitê de ética no uso de
animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA / FIOCRUZ), sob licença
número CEUA- L025/15 aprovou as experiências nestes estudos.

Diferenciação de macrófagos a partir da medula óssea murina

Os camundongos foram eutanaziados e tiveram os ossos das patas traseiras

removidos (fêmures e tíbias), epífises cortadas e as medulas ósseas removidas por
lavagem com meio de cultura BMM: 60% RPMI 1640 (GIBCO), 20% de soro fetal
bovino (SFB- GIBCO), 18% de sobrenadante de célula L929 (rico em M-CSF,
citocina que estimula a diferenciação de macrófagos), 1% de L-glutamina (GIBCO) e
1% de Penicilina/Estroptomicina (P/S) (GIBCO). As células foram homogeneizadas
para desfazer os grumos, contadas em líquido de Turk (2% de ácido acético em PBS
+ cristal violeta) e 4 x 106 células foram colocadas por placa de Petri comum com 10
mL de meio BMM. As placas foram incubadas em estufa com 5% de CO 2, a 37oC.
Após 3 dias de cultivo, as placas receberam adição de 10 mL de meio BMM. Após
mais 3 dias de incubação, os sobrenadantes são descartados e os macrófagos já
diferenciados foram removidos das placas por lavagem com PBS 1x gelado,
contados e plaqueados em placas de 24 poços (1 x 10 5 células/poço), placas de 12
poços (5 x 105 células/ poço). O meio utilizado para plaqueamento é composto por
RPMI 1640 com 10% de SFB e 1% de L-glutamina, e as células plaqueadas foram
mantidas em repouso na estufa por 24 horas antes do início da infecção.
 25

Cultura de macrófagos murino imortalizado derivado de medula (iBMM)

Utilizaram-se macrófagos knockouts gentilmente doados pelo Dr. Marcelo

Torres Bozza da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Além da linhagem
iBMM selvagem (WT), foram utilizadas as linhagens Myd88-/-/TRIFF-/- and TLR2-/-
foram obtidos sob a técnica de CRISPR-Cas9. Armazenou-se em nitrogênio líquido
em criotubos, contendo 90% de soro fetal bovino (SFB) e 10% de DMSO. Cultivou-
se as células em RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB (R10) e 1% de
penicilina [100 ug/mL] + estreptomicina [100 ug/mL] (PS) e 1% de L-glutamina. As
células são mantidas em garrafas de 75 cm², em estufa a 37°C e 5% de CO 2. Os
iBMMs crescem em aderência. As passagens em geral, são realizadas de 3 a 4 dias.
Para infecção, plaqueou-se macrófagos em placas de cultura de 24 poços
para CFU e 12 poços para microscopia. Na densidade celular de aproximadamente
1x105 e 1x106 células por poço respectivamente. Manteve-se o volume final de R10
de 0,5 mL por poço na placa de 24 poços e 1 mL por poço nas placas de 12 poços.
Incubou-se as placas em estufa de CO2 para a adesão por aproximadamente 24h.

Cultura da Listeria monocytogenes e Listeria inoccua

Utilizou-se à cepa Listeria monocytogenes 1/2a (CLIST 02044/CDC F4561) e

Listeria innocua (CLIST 02050 /CIP 12588) oriundas da Coleção de Listerias (CLIST)
do Instituto Oswaldo Cruz. Mantidas sob congelamento em -80°C. Para infecção
preparou-se um pré-inóculo, e as bactérias foram cultivadas em caldo BHI (brain
heart infusion), e incubado e 37°C por 24h em agitação (180 rpm). Após as 24h, as
bactérias foram purificadas e realiza-se a leitura por espectrofotometria na
Densidade Optica em 600 nm (OD600). Nos experimentos de avaliação da influência
da viabilidade, as L. monocytogenes foram crescidas por 24h em BHI e então
irradiadas com 104 Gy de uma fonte de cobalto por 12h, conforme descrito por Lahiri
et al., (2005).

Infecção por Listeria monocytogenes (in vitro)

 26

Para infecção removeu-se o sobrenadante das placas previamente

plaqueadas. As células aderidas foram infectadas. Adicionou-se meio de cultura
(R10) com L. monocytogenes no MOI 10. Uma hora após a infecção o sobrenadante
foi removido e realizado 3 lavagens com HBSS ou PBS + gentamicina (100μg/mL).
Posterior às lavagens os macrófagos são incubados com R10 + gentamicina
(100μg/mL) por 1h em estufa 37°C, 5% CO2. Passado o tempo de 1h foi realizada a
fixação das células para as análises microscópicas. Substitui-se o meio R10 +
gentamicina por R10 em todas as placas dos demais tempos (6h,24h, 48h). As
análises da infectibilidade (microscopia) se sucedem nos respectivos tempos. Para
avaliar o papel dos CLs na resposta a Listeria monocytogenes, macrófagos foram
pré-tratados com 1 μM de inibidor da cPLA2 (Cayman10650), 5 μM de inibidor de
DGAT1 (A922500), e 25 μM de inibidor de DGAT2 (PF-06423339) e incubado por 30
min antes da infecção por L. monocytogenes e permaneceu por todo o tempo de
estímulo, a 37 ° C em 5% de CO2. Os inibidores foram dissolvidos em
dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma).

Microscopia confocal

Esta análise foi realizada em placas de 24 poços, com lamínulas, do ensaio

de infectividade nos tempos de 1h, 6h e 24h (BMM e iBMM). A uma densidade
celular de 1x105 células por poço. Os corpúsculos lipídicos são marcados em
vermelho com Oil Red O (ORO), L. monocytogenes em azul corada com DAPI,
utilizando o meio de montagem fluoromount com DAPI para microscopia confocal. A
partir da microscopia é analisada a quantidade de corpúsculos lipídicos por células.
Mensurou-se o número de CLs pelo software ImageJ. As imagens foram capturadas
pelo microscópio FluoView FV10i da OLYMPUS, da plataforma de microscopia do
INCA.

Medições do nível de PGE2

Os níveis de prostaglandina E2 (PGE2) no sobrenadante de macrófagos

foram medidos usando kits EIA (Cayman Chemical) de acordo com as instruções do
fabricante.
 27

Análise do nível de IL-6

Níveis de interleucina 6 (IL-6) foram dosados pelo sobrenadante dos

macrófagos usando o kit Duoset ELISA de camundongo (R&D Systems;
Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
Análise Estatística

Os resultados representam as médias, erros padrões das médias dos

valores obtidos nos diferentes testes. As diferenças estatísticas foram determinadas
por análise da variância (ANOVA), seguida pelo pós-teste de comparação múltipla
de Turkey, sendo considerado significativo p<0,05.
 28

5. RESULTADOS

Para avaliar a participação dos CLs na infecção por L. monocytogenes,

nosso primeiro objetivo foi realizar a cinética da formação de CL durante a infecção
bacteriana em macrófagos. Para isso, foram utilizados macrófagos murinos
derivados da medula de camundongos C57BL/6 (BMM). Os macrófagos BMM foram
infectados por 1h, e foi avaliado a quantidade de CL nos tempos de 30 min, 1h, 6h,
24h e 48h após infecção. A biogênese dos CLs induzida por L. monocytogenes
ocorre já a partir de 1 hora após a infecção bacteriana (Figura 6A e 6B),
permanecendo significativamente elevado até 24h. Os macrófagos infectados por L.
monocytogenes atingiram a indução máxima dos CLs em 24 horas após a infecção
(Figura 6B).

Figura 6: L. monocytogenes induz a formação de CLs rápida e tempo dependente em

macrófagos derivados de medula murina.

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos BMM estimulados com L.

monocytogenes em MOI 10 nos tempos de 30 min, 1h, 6h, 24h e 48h pós infeccção. As células foram
fixadas e coradas com ORO vermelho para detector corpúsculos lipídicos (vermelho) e DAPI para
núcleos (azul). Imagens obtidas por microscopia confocal (n=3). (B) Cinética de formação de
corpúsculos lipídicos após estímulo de Listeria monocytogenes. Cada barra representa a media +-
EMP do número de CLs. Para análise estatística foi usado ANOVA, seguido do pós-teste-Turkey. As
 29

diferenças foram consideradas significativas quando p≤ 0,05. As diferenças em relação ao respectivo

grupo controle são indicadas pelo (*)(n=3).

A partir desse resultado investigamos Listeria innocua, uma espécie de

Listeria ubiquitária não patogênica, também induziria a biogênese de CLs. A L.
innocua é uma espécie fenotipicamente semelhante a L. monocytogenes, apenas se
diferenciando em relação a capacidade hemolítica e bioquimicamente na ausência
de uma enzima. Observamos que a L. innocua não foi capaz de induzir a formação
de CLs tanto em 1h (Figura 7A-B) como 24h pós-infecção (Figura 7C), diferente da
Listeria monocytogenes.

Figura 7: Infecção por L. innocua não induz biogênese de corpúsculos lipídicos em

macrófagos.

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos BMM estimulados com L.

monocytogenes e L. innocua MOI 10 nos tempos de 1h e 24h pós-infecção. As células foram fixadas
e coradas com ORO para detectar corpúsculos lipídicos (vermelho) e DAPI para núcleos (azul).
Imagens obtidas por microscopia confocal n =3. (B,C) Quantificação da formação de corpúsculos
lipídocos após estímulo com L. monocytogenes e L. innocua. Cada barra representa a média +- EMP.
Para análise estatística foi utilizada ANOVA, seguido do pós teste de Turkey. As diferenças foram
consideradas significativas quando p≤0,05. As diferenças entre os respectivos grupos são indicadas
pelo (*) (n=3).

Para avaliar se essa biogênese é um efeito dependente da capacidade de

invasão e replicação intracelular da L. monocytogenes, resolvemos realizar um
 30

experimento comparando uma bactéria replicativa viva e uma irradiada (morta)

(Figura 8A). As bactérias irradiadas foram expostas a radiação gama (1000 greys).
Observamos que em 1h após a infecção a bactéria irradiada não induziu CLs (Figura
8 B-C), indicando que esse evento precoce de indução de CLs é fortemente
dependente da viabilidade bacteriana. Já em 24h, a bactéria irradiada foi capaz de
induzir a biogênese de CL (FIGURA 8B e 8D), apesar dos níveis serem
significativamente inferiores ao da bactéria replicativa. (Figura 8D).

Figura 8: A indução da biogênese de CLs é dependente da viabilidade da L. monocytogenes.

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos BMM estimulados com L.

monocytogenes replicativa e irradiada em MOI 10 nos tempos de 1h e 24h pós-infecção. As células
foram fixadas e coradas com óleo vermelho O para detectar corpúsculos lipídicos (vermelho) e DAPI
para núcleos (azul). Imagens obtidas por microscopia confocal. (n=3). (B, C) Quantificação da
formação de CLs após estímulo com L. monocytogenes replicativa e irradiada. Cada barra representa
 31

a média ± EMP. Para análise estatística foi realizado ANOVA, seguido do pós-teste de Turkey. As
diferenças foram consideradas significativas quando p≤ 0,05. As diferenças em relação ao respectivo
grupo controle são indicadas pelo (*) (n=3).

Diversos trabalhos do nosso grupo já demonstraram que a biogênese de CLs

e macrófagos é desencadeado pela ativação dos TLRs (BOZZA et al, 2009;
PEREIRA DUTRA et al, 2019, KIARELI et al, 2021). Para investigar se esse
fenômeno também estaria envolvido na infecção por L. monocytogenes, nós usamos
um duplo nocaute das principais proteínas adaptadoras da via dos TLRs (MyD88 e
TRIF). Observamos que a biogênese de corpúsculos é dependente da ativação dos
TLRs. A partir disso, nos investigamos se o TLR2, principal TLR envolvido no
reconhecimento da L. monocytogenes, estaria envolvido na biogênese de CL (Figura
9). Na ausência de Myd88/TRIF não houve indução da biogênese de CLs.
Curiosamente, nos observamos que ausência de TLR2 levou a um aumento da
biogênese precoce de CL (Figura 9A-B).

Figura 9: Biogênese de CLs induzida pela L. monocytogenes é dependente da via TRL, e

contrarregulado por TLR2.

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos iBMM selvagem (wild-type) e deficientes

em Myd88/TRIF e TLR2 estimulados com L. mononocytogenes (MOI 10) após 1h de infecção. As
 32

células foram fixadas e coradas com óleo vermelho O para detctar corpúsculos lipídicos (vermelho) e
DAPI para núcleos (azul). Imagens obtidas por microscopia confocal (n=3). (B) Quantificação de
formação de CLs após estímulo com L. monocytogenes. Cada barra representa a média ± EMP do
número de CLs. Para análise estatística foi realizado ANOVA, seguido do pós-teste de Turkey. As
diferenças foram consideradas significativas quando p≤ 0,05. As diferenças em relação ao respectivo
grupo controle são indicadas pelo (*) e em relação ao wt estimulado (#) (n=3).

A liberação rápida de ácido aracquidônico induz a biogênese precoce de

CLs de forma rápida (GUIJAS, et al. 2012). Com base nisso, nos tratamos os
macrófagos com um inibidor da fosfolipase A2, envolvida na hidrolise dos
fosfolipideos e liberação do ácido aracquidônico. Observamos que a inibição da
cPLA2 (Cayman 10860) inibiu a formção de CLs induzida pela L. monocytogenes
(Figura 10A-B).

Figura 10: Biogênese de CLs é dependente da atividade da cPLA2.

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos BMM pré-tratados por 30 min com 1 µM
de Cay10650. Após as células foram estimulados com L. monocytogenes (MOI 10) por 1h. O
tratamento com Cay10650 foi mantido durante todo o experimento. Após as células foram fixadas e
coradas com óleo vermelho O para detectar corpúsculos lipídicos (vermelho) e DAPI para núcleos
(azul). Imagens obtidas por microscopia confocal (n=3). (B) Quantificação de formação de CLs após
estímulo com L. monocytogenes. Cada barra representa a média ± EMP do número de CLs. Para
análise estatística foi realizado ANOVA, seguido do pós-teste de Turkey. As diferenças foram
consideradas significativas quando p≤ 0,05. As diferenças em relação ao respectivo grupo controle
são indicadas pelo (*) e em relação ao veículo infectado (#) (n=3).
 33

A remodelação lipídica intracelular tem sido associada à rápida formação de

CLs, principalmente à ativação da fosfolipase A2 citosólica (cPLA2) e hidrólise dos
fosfolipídios da membrana, e consequente liberação de ácidos graxos insaturados e
poli-insaturados, que são esterificados na forma de triglicerídeos pela diacilglicerol
O-aciltransferase (DGAT) (Hu et al., 2017; Jarc et al., 2018; Petan et al., 2018). Para
entender o papel desempenhado pelo acúmulo de CLs na infecção por L.
monocytogenes, nós pré tratamos macrófagos BMM com inibidores da DGAT1
(A922500) e da DGAT2 (PF-06423339) (Figura 11). Observamos que ambos os
inibidores reduziram de forma parcial a biogênese precoce de CLs.

Figura 11: Biogênese precoce de CLs é dependente da atividade de enzimas envolvidas na

síntese de triglicerídeos (DGAT1 e DGAT2).

(A) Imagens representativas do experimento de macrófagos BMM pré-tratados por 30 min com 1 µM
de DGAT (A922500). Após as células foram estimulados com L. monocytogenes (MOI 10) por 1h. O
tratamento com A922500 foi mantido durante todo o experimento. Após as células foram fixadas e
coradas com óleo vermelho O para detectar corpúsculos lipídicos (vermelho) e DAPI para núcleos
(azul). Imagens obtidas por microscopia confocal (n=3). (B) Quantificação de formação de CLs após
estímulo com L. monocytogenes. Cada barra representa a média ± EMP do número de CLs. Para
análise estatística foi realizado ANOVA, seguido do pós-teste de Turkey. As diferenças foram
consideradas significativas quando p≤ 0,05. As diferenças em relação ao respectivo grupo controle
são indicadas pelo (*) e em relação ao veículo infectado (#) (n=3).
 34

20

CLs são estoques de precursores da síntese de eicosanoides em leucócitos

e compartimentalizam todo o maquinário enzimático para a síntese de eicosanoides
(BOZZA et al., 2011). Investigamos se a infecção por L. monocytogenes induz a
produção de PGE2. De acordo com o esperado, a biogênese dos CLs inicial foi
seguida pelo aumento do nível de PGE 2 em 24 horas pós-infecção (FIGURA 12A).
Além disso, observamos que a infecção por L. monocytogenes induz a produção de
IL-6 em 24h pós infecção.

Figura 12: Infecção por Listeria induz PGE2 e IL-6 em macrofagos murinos

Gráficos das dosagens. (A) Níveis de PGE2 em sobrenadantes livres de células coletados de culturas
infectadas em 24 horas após a infecção, realizado pelo sistema de detecção EIA. (B) Nível de citocina
em sobrenadante livre de célula em 24 horas pós-infecção, realizados pelo sistema de detecção
ELISA. Média ± SEM para três ou quatro experiências independentes. (***) indica que o valor é
significativamente diferente (p <0,001).
 35

6. DISCUSSÃO

Diversos trabalhos vem mencionando a participação dos CLs no ciclo da

patogênese em todas as classes de patógenos (BOZZA et al, 2019). Em particular
nas infecções bacterianas, a formação de CLs vem sendo associadas
principalmente com um mecanismos de subersão das resposta imunologica e/ou
para obtenção energia para a sobrevivência e replicação de várias bactérias
intracelulares, como a Chlamydia spp (COCCHIARO et al., 2008; CAO et al., 2007),
Coxiella burnetti (MULYE, ZAPATA e GILK, 2018), Mycobacterium spp (RUSSELL et
al., 2009; D’AVILA et al., 2006; MATTOS et al., 2011).

Nesse contexto de interação patogeno/hospedeiro, nós investigamos a

participação dos CLs durante a infecção Listeria monocytogenes em macrófagos
murinos. Nesse estudo demostramos pela primeira vez que a infecção por L.
monocytogenes induz a formação de CLs de forma rápida e tempo dependente em
macrófagos, visto que já em 1h pós-infecção houve um aumento significativo da
quantidade de CLs, sendo que em 24h houve o pico da indução. Apesar de poucos
dados estarem disponíveis sobre a participação dos CLs em infecções por bactérias
Gram-positivas, Nicolaou et al. (2009), reportou que Staphylococcus aureus e
Staphylococcus epidermidis induzem o acúmulo intracelular de éster de colesterol
em macrófagos, provavelmente nos CLs, um fenótipo característico das células
espumosas. Além disso, o acúmulo de CLs foi reportado durante a infecção por
Streptococcus uberis (WHAN et al. 2021), e parece favorecer a infecção bacteriana.

Além disso, nossos dados fortemente sugerem que a indução de CL está

associado com viabilidade e a fatores de patogenicidade da L. monocytogenes,
como evidenciado pela incapacidade da L. inoccua de induzir a biogênese de CL. A
L. innocua é a espécie de listeria não patogênica mais intimamente relacionada a L.
monocytogenes (RAENGPRADUB et al. 2020). Estudos comparativos dessas duas
espécies vem permitindo a descoberta de vários fatores de virulência da L.
monocytogenes. Comparações entre essas duas espécies revelaram uma
semelhança genômica. A grande similaridade genômica entre essas bacterias vem
permitindo a identificação e caracterização dos genes presentes em L.
 36

monocytogenes mas ausentes em L. innocua, permitindo a descoberta de genes de

virulência não conhecidos anteriormente, como o gene aut. (CABANES et al. 2004).

Curiosamente, as principais diferenças entre a L. monocytogenes e L.

innocua estão na sua composição de proteína de superfície (GLASER et al. 2001).
Por exemplo, a proteína de superfície InlA presente apenas na L. monocytogenes
(GAILLARD et al. 1991) medeia a internalização bacteriana em células epiteliais por
meio da interação com seu receptor celular E-caderina. As proteínas InlB e Ami de
L. monocytogenes estão associados à superfície bacteriana por sua parte C-terminal
se ligagando ao ácido lipoteicóico (BRAUN et al., 1997 ; JONQUIERES et al.,
1999 ; MILOHANICET al., 2001), elementos cruciais dos mecanismos de invasão da
L. monocytogenes nas células hepáticas e epiteliais (DRAMSI et al ., 1995 ; Braun et
al ., 1998).

Os TLRs participam da imunidade inata, detectando diferentes tipos de

invasão de patógenos (ADEREM et al. 2000 , AKIRA et al. 2001) e estimulando a
ativação celular por meio de moléculas adaptadoras, como MyD88 e TRIFF
(TAKEDA et al. 2003). A biogênese de CLs é também fortemente correlacionada ao
reconhecimento dos PAMPs pelos TLRs em leucócitos (NICOLAOU, GOODALL e
ERRIDGE, 2012; PACHECO et al., 2002), porém para cada patógeno é observado o
envolvimento de TLRs diferentes (MATTOS et al., 2011; NICOLAOU et al., 2012).
Em especial na infecção por bactérias Gram-positivas, foi demonstrado que indução
do acúmulo de éster de colesterol foi um processo altamente regulado envolvendo
principalmente TLR2. (NICOLAOU et al. 2012). Nós observamos que indução de CL
pela L. monocytogenes é dependente da sinalização via TLR. Mas de forma
surpreendente, a ausência de TLR2 levou a um grande aumento de CL.

Nesse contexto, a ativação TLR2 é essencial para o controle da infecção por

L. monocytogenes (TORRES et al., 2005). O controle da infecção por L.
monocytogenes depende da ativação rápida do sistema imune inato, uma vez que a
infecção por camundongos deficientes para a proteína adaptadora MyD88
apresentam uma maior letalidade (TORRES et al. 2005). Nesse estudo de Torres et
al. (2005) mostraram ainda que camundongos deficientes em TLR2 eram mais
suscetíveis a infecção sistêmica por Listeria do que camundongos do tipo selvagem,
com uma taxa de sobrevivência muito baixa e apresentando uma carga bacteriana
 37

aumentada no fígado. Outros dados recentes mostraram que TLR2 pode

desempenhar um papel protetor durante a infecção por bactérias gram-positivas e
de fato camundongos deficientes em TLR2 são mais suscetíveis a infecção por
Staphylococcus aureus (TAKEUCHI et al. 2000) e Streptococcus pneumoniae
(ECHCHANNAOU et al. 2002). Além disso, o mecanismo da biogênese de CLs
dependente de TLR2 foi relatado para uma ampla gama de infecções por patógenos
(CAO et al., 2007; ALMEIDA et al., 2009; MATTOS et al., 2011a; NICOLAOU et al.,
2012). Esses dados sugerem que o papel contrarregulador do TLR2 na biogênese
de CL induzida pela infecção por L. monocytogenes pode estar associado a menor
capacidade dessas células de eliminar o patógeno.

A subversão da sinalização via TLR e a atuação TLR como um contra-

regulador da biogênese de CL foi recentemente reportado pelo nosso grupo na
infecção Salmonella enterica sorovar Thyphimurium (KIARELY et al., 2021). Nesse
modelo a biogênese de CLs é desencadeada por fatores de patogenicidade da
Salmonella, em especial o sistema de secreção do tipo 3 (T3SS) com a participação
do TRL2. Em contrapartida, a TLR4 se mostrou como contraregulador da biossintese
de CLs, associado com a perda de controle da infecção bacteriana (KIARELY et al.,
2021).

A remodelação lipídica intracelular tem sido associada à rápida formação de

CLs, principalmente à ativação da cPLA2 e da DGAT1 (HU et al., 2017). Quando a
síntese de lipídios é inibida, a biogênese do CLs é bloqueada (BOZZA et al., 2009).
Observamos que a inibição de cPLA2 levou à supressão da biogênese precoce dos
CLs induzida pela L. monocytogenes. Por outro lado, a inibição tanto da DGAT1
como da DGAT2 inibiram de forma parcial a biogênese de CL, indicando
mecanismos adicionais de sintese de lipideos podem estar associados a esse
fenômeno. Resultados semelhantes foram observados na infecção pela Salmonella.
A biogênese precose de CLs desencadeada pela Salmonella também foi abolida em
macrófagos pré-tratados com cPLA2 e DGAT1 (KIARELY et al., 2021). Nesse
modelo, a inibição da DGAT1 e da cPLA2 levou a uma diminuição significativa da
sobrevivência da bactéra nas primeiras 6h pós-infecção (KIARELY et al,; 2021).

Como nos observamos a que ativação da cPLA2, e consequente liberação

de ácido araquidônico, nos avaliarmos se esse processo estaria associado com a
 38

produção de PGE2, um importante mediador inflamatório lipídico. A PGE 2 é um dos

mediadores lipídicos derivados do ácido araquidônico através das vias de
ciclooxigenase (COX). Assim como observamos na infecção por L. monocytogenes,
a biossintese de PGE2 vendo sendo reportada durante a infecção por diversas
bactérias patogênicas (KOSTER et al., 1995 SHANNON et al., 2009 IZZO et al.,
1993).

Além disso, semelhante a L. monocytogenes, C. trachomatis e C.

pneumoniae, PGE2 desempenha um papel importante durante patogênese de C.
burnetii. A imunossupressão mediada por PGE2 in vitro em células
infectadas com C. burnetii e in vivo em pacientes (KOSTER et al., 1995 SHANNON
et al., 2009 IZZO et al., 1993) podem promover o crescimento intracelular das
bactérias. Assim, os CLs podem servir como uma fonte de nutriente e/ou modulador
imunológico para facilitar o crescimento intracelular de C. burnetii. Em macrófagos
peritoneais murinos infectados com M. bovis, o aumento na produção de CLs e
PGE2 estar associado a ativação de PPARγ por meio de uma via dependente de
TLR-2 (ALMEIDA et al., 2009). Além disso, M. bovis (BCG) induz a fagocitose de
neutrófilos apoptóticos pelos macrófagos, estimulando a formação de CLs e a
produção subsequente dos mediadores anti-inflamatórios PGE2 e TGFβ, facilitando
a sobrevivência do patógeno (D’AVILA et al., 2008).

Para invadir com sucesso o hospedeiro, P. aeruginosa utiliza uma série de

fatores de virulência como a proteína ExoU, ela possui atividade PLA2 citosólica
(DENG et al., 2008 ANDERSON et al., 2012) e interage com CLs da célula
hospedeira. Em células epiteliais das vias respiratórias infectadas, ExoU PLA2 induz
a produção de PGE2 que interfere com a migração dos neutrófilos (SADIKOTI et al.,
2007 ARONOFF et al. 2012), aumentando assim a sobrevivência bacteriana dentro
do hospedeiro, sugerindo a importância de PGE2 dependente de ExoU
na patogênese de P. aeruginosa (GUILLEMOT et al., 2014 HURLEY et al., 2011
SALIBA et al., 2005). Além disso, o bloqueio da atividade da PLA2 na bactéria
indicou que a infecção por P. aeruginosa reduz o acúmulo de CLs por meio da
atividade da ExoU PLA2 (PLOTKOWSKI et al., 2008). No geral, esses estudos
sugerem que P. aeruginosa secreta a proteína ExoU a fim de hidrolisar os CLs do
hospedeiro para aumentar os níveis de PGE2, evitando assim a infiltração de
neutrófilos e contribuindo para o crescimento bacteriano (PHILLIPS et al., 2003)
 39

Além disso, observamos que a indução de CLs pela infecção com L.

monocytogenes foi acompanhado pela indução da IL-6, uma citocina pró-
inflamatória. A indução de TLR ativando o acúmulo de triglicerídeos também foi
acompanhada pelo aumento de IL-6 em várias infecções bacterianas (KIARELY et
al, 2021, NICOLAOU et al., 2012). Além disso, a síntese de lipídios neutros e
acúmulo de CLs são importantes reforçadores do perfil pró-inflamatório dos
macrófagos (DIAS et al., 2020, CASTOLDI et al., 2020)
 40

7. CONCLUSÃO

Nosso resultados indicam que a indução de CLs durante a infecção por L.

monocytogenes é um evento precoce, relacionado diretamente a viabilidade da
bactéria e aos fatores de patogenicidade da bactéria. Além disso, nossos dados
indicam participação de receptores do tipo TLR nesse processo, mas de forma
curiosa não via TRL2, o principal receptor no reconhecimento de Gram-positivas.

Também observamos que a indução precose de CLs pela L.

monocytogenes envolve ativação de cPLA2 e das enzimas DGAT1 e DGAT2. Além
disso, a indução de CL pela por L. monocytogenes é acompanhada de uma reposta
inflamatória, evidenciada pelo aumento de PGE2 e IL-6. Como perspectivas desse
trabalho, pretendermos avaliar o impacto da modulação da biossíntese de CL na
sobrevivência e na proliferação da L. monocytogenes.
 41

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