UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Fisiopatologia

Sporothrix brasiliensis:
aspectos imunológicos e virulência

LUANA ROSSATO

Tese para obtenção do Título de DOUTOR

Orientador:

Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida

SÃO PAULO

2017
 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Fisiopatologia

Sporothrix brasiliensis:
aspectos imunológicos e virulência

LUANA ROSSATO

Versão Corrigida

Tese para obtenção do Título de DOUTOR

Orientador:

Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida

SÃO PAULO

2017
 Luana Rossato

Sporothrix brasiliensis: aspectos imunológicos e virulência

Comissão Julgadora

da

Tese para Obtenção do Título de DOUTOR

Prof.Dr. Sandro Rogério de Almeida

Orientador/Presidente

1° Examinador

2° Examinador

3° Examinador
 Aos meus pais, Valdir e Leonalda, que me deram a vida e me ensinaram a vivê-la com
dignidade, honestidade e respeito, que não mediram esforços para que eu conquistasse todos
os meus objetivos. Obrigada por sempre estarem ao meu lado em todos os momentos da
minha vida.
 AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado saúde, força e sabedoria para sempre seguir em frente e alcançar
meus objetivos.

Ao Professor Sandro Rogério de Almeida, a quem admiro e respeito, por ter confiado em mim
e por toda ajuda e contribuição para a realização desse trabalho.

Aos meus primos Alexania Rossato e Leonardo Maggi, que me receberam em São Paulo
minha eterna gratidão. Se hoje cheguei até aqui é por que tive o apoio de vocês.

Aos meus pais, pelo amor incondicional, pela dedicação, apoio, por confiarem e acreditarem
em mim e na minha capacidade. Muito obrigada por tudo.

Aos meus irmaõs:

Andréia, que sempre foi como uma mãe, juntamente com meu cunhado/dindo/pai Dinho,
sempre foram meus grandes apoiadores e incentivadores. Vocês foram fundamentais!

Alexandre, que sempre me incentivou, mesmo distante eu sempre soube que eu poderia
contar. A minha cunhada Marivane, que me inspira como grande profissional. Muito obrigada
por tudo!

Maurício, por sempre acreditar em mim, muito mais do que eu acredito, e a minha cunhada
Clediane, por todo o apoio e incentivo.

Aos meus sobrinhos, Pedro Henrique, Laura, Maria Antonia, Manuela, Ana Julia e Angelo,
cada sorrisso de vocês é um sorriso meu. Amo vocês!

Aos amigos que São Paulo me trouxe, Raquel Cardoso, Rafael Rezende, Cris de Leis, Nádia
de Oliveira, Neila Drabrach, Pati Reckziegel e Maria Carmen, vocês tornaram tudo mais fácil.
Muito obrigada!

Ao Elcio, que chegou nessa última etapa tornando tudo mais leve e fácil. Muito Obrigada!

Aos meus colegas de laboratório, pelos bons momentos vividos, pelo coleguismo,
especialmente aos meus amigos Lucas Ferreira e Suelen dos Santos, peças importantes na
construção desse trabalho.
I am very thankful to my supervisor Dr. Sybren de Hoog for all shared knowledge, patience,
friendship, empathy and careful consideration. It was a great opportunity to work with such a
brilliant and humble researcher. I also want to thank Joanna Freeke and thank all students and
technicians of my group at CBS/Utrecht for all the knowledge, attention and support.

Aos meus amigos da Holanda: Isabela Souza, Renan Nascimento, Leandro Ferreira Moreno e
Juliana Kenski. Sem palavras para agradecer todo o apoio de vocês.

Aos meus amigos de Nova Palma, que sempre estiveram comigo, aqueles nos quais a amizade
é tão grande que os considero da família, em especial minhas queridas Marci e Carlinha!

Aos amigos do Lapemi, que sempre torceram e me apoiram, e m especial minha amiga
Tarcieli Venturini, na qual infinita vez compartilhei dramas da pós-graduação. Tarci, muito
obrigada por cada palavra!

A todos os funcionários e técnicos da FCF/USP por toda a ajuda e suporte ao longo dos anos.

A FAPESP ( Processo 2013/19213-4 e BEPE 2015/20290-4) pelo suporte financeiro,

permitindo a divulgação desse trabalho em âmbito nacional e internacional.

A todos aqueles que não foram aqui mencionados, que cruzaram meu caminho me ajudando
de inúmeras formas, muito obrigada a todos!
 ‘”Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante
de meus olhos” (Isaac Newton)
O presente trabalho foi desenvolvido com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP). Processo 2013/19213-4/ BEPE: 2015/ 20290-9.
 ROSSATO, L. Sporothrix brasiliensis: aspectos imunológicos e virulência. 2017. 137f.
Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São
Paulo, 2017.

Resumo
A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos
do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais,
dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como
responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados
ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e
estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de
surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta
imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos
direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-
2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de
proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis
quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se
modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente
expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in
vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta
imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção
e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de
infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa
de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S.
schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa
diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na
virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados
encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é
dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras
vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses
receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da
fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes
para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados.

PALAVRAS-CHAVE: Sporothrix brasiliensis, esporotricose, TLR-2, TLR-4, proteômica,

virulência.
 ROSSATO, L. Sporothrix brasiliensis: immunological aspects and virulence. 2017. 137f.
Thesis (Ph. D) – Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo,
2017.

Abstract

Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix

that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was
the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies
of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and
was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix
complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to
evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies
directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2
(TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was
look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when
compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques
were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom- up
proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the
dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of
inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of
these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during
the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was
polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S.
brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis
differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as
important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The
results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is
dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling
pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the
context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this
disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins
described in this work should be evaluated.

KEYWORDS: Sporothrix brasiliensis, sporotrichosis, TLR-2, TLR-4, proteomics, virulence.

 Lista de Figuras

Figura 1. Fase filamentosa (A) e leveduriforme (B) de Sporothrix sp....................................02

Figura 2. Esporotricose em gatos.............................................................................................05
Figura 3. Esporotricose linfocutânea.......................................................................................10
Figura 4. Esporotricose cutânea fixa........................................................................................11
Figura 5. Representação esquemática da cascata de sinalização mediada pelos receptores da
família TLR...............................................................................................................................20
Figura 6. Ausência de TLR-2 e TLR-4 em BMDMs prejudica a fagocitose de S.
brasiliensis................................................................................................................................33
Figura 7. Menor carga fúngica de S. brasiliensis na ausência dos receptores A) TLR-2 e B)
TLR-4........................................................................................................................................34
Figura 8. Maior citotoxicidade na ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4...........................35
Figura 9. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 prejudicou a produção de NO após 12h de
interação....................................................................................................................................36
Figura 10. Perfil de secreção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatória na ausência
de TLR-2 após a interação in vitro com S. brasiliensis................................................ ...........38
Figura 11. Perfil de secreção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatória na ausência de
TLR-4 após a interação in vitro com S. brasiliensis.................................................................39
Figura 12. Elevada carga fúngica no fígado, baço e rins de camundongos nocautes para TLR-
2 após 7, 14 e 28 dias de infecção com S.brasiliensis..............................................................41
Figura 13. Elevada carga fúngica no fígado, baço e rins de camundongos nocautes para
TLR-4 após 7, 14 e 28 dias de infecção com S..brasiliensis....................................................42
Figura 14. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-2 após 7 dias de
infecção com S. brasiliensis......................................................................................................44
Figura 15. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-2 após 14 dias de
infecção com S. brasiliensis.. ...................................................................................................45
Figura 16. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-2 após 28 dias de
infecção com S. brasiliensis......................................................................................................46
Figura 17. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-4 após 7 dias de
infecção com S. brasiliensis. ....................................................................................................47
Figura 18. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-4 após 14 dias de
infecção com S. brasiliensis......................................................................................................48
Figura 19. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-4 após 28 dias de
infecção com S. brasiliensis......................................................................................................49
Figura 20. Diferenças entre as técnicas de proteômica: bottom-up e top-down......................63
Figura 21. Clusters específicos para as diferentes espécies de Sporothrix spp.......................72
 Lista de Tabelas

Tabela 1. Classificação taxonômica do Sporothrix spp...........................................................03

Tabela 2. Principais manifestações clínicas na esporotricose..................................................09
Tabela 3. Comparação entre as técnicas de proteômica bottom-up e top-down com relação à
identificação de proteínas, quantificação e análises de proteínas modificadas (PTMs) ..........64
Tabela 4. Identificação, informações clínicas e geográficas e número de proteínas
identificado para as cepas de Sporothrix spp utilidas nesse estudo......................................... 68
Tabela 5. Número total de genes, clusters e genes espécie-específicos referente à Sporothrix
spp.............................................................................................................................................71
Tabela 6. Relação de nove proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis e sua
importância na virulência e escape imune em outras espécies.................................................73
 Lista de Abreviaturas

ABC Bicarbonato de amônio IgG Imunoglobulina G

BHI Brain Heart Infusion IL-1β Interleucina 1β
BMDMs Macrófagos derivados da medula IL-2 Interleucina 2
óssea IL-4 Interleucina 4
CBA Cytometric beads Array IL-6 Interleucina 6
CGD Candida Genome Database IL-8 Interleucina 8
CLRs Receptores de lectina do tipo C IL-10 Interleucina 10
CO2 Dióxido de carbono IL-17 Interleucina 17
CXCL1 Quimiocinas derivadas de IFN-γ Interferon gama
queratinócitos IRAK Receptor da IL-1 associado à
DCs Células dendríticas quinase 4
DNAr Ácido desoxiribonucleico JNK JUN N-terminal quinase
ribossômico LC Cromatografia líquida bidimensional
Drk1 Cinase reguladora do dimorfismo LCCM Meio condicionado de células
DTT 1,4 ditiotreitol L929
FCF-USP Faculdade de Ciências LDH Lactato desidrogenase
Farmacêuticas da Universidade de São LPS Lipopolissacarídeo
Paulo M1 Macrófagos ativados por meio da via
GAPDH Fosfato desidrogenase clássica
gliceraldeído M2 Macrófagos ativados por meio da via
GMS Gomori metenamina-prata alternativa
GO Ontologia de gene MAL/TIRAP Proteína adaptadora de
gp70 Glicoproteína 70 KDa MyD88
gp 60 Glicoproteína 60 KDa MAPKs Proteínas quinases ativadas por
HeLa Padrão de Proteína Digerida mitogênese
HEPES Ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1- MIP-2 Proteína inflamatória do macrófago
piperazineetanesulfonico MOI 5 Multiplicidade de infecção 5
HIV Vírus da imunodeficiência humana MS Espectrometria de massas
HMG Hidroximetilglutaril MyD88 Fator 88 de diferenciação mieloide
HSP Proteínas de choque térmico NCBI National Center for Biotechnology
IF Índice de fagocitose Information
NF-kB Fator nuclear kB
NLRs Receptores do tipo NOD
NOD Domínio citosólico oligomerizado
NO Óxido nítrico
P6E7 Anticorpo monoclonal contra gp70
p38 Proteína quinase ativada por
mitógeno
PAMPs Padrões moleculares associados
aos patógenos
PAS Ácido periódico de Schiff
PBS Tampão fosfato-salino
PRRs Receptores de reconhecimento de
padrões
PTMs Modificações pós-traducionais
RLRs Receptores do tipo RIG-I
RNA Ácido ribonucleico
RNAm RNA mensageiro
ROS Espécies reativas de oxigênio
Rpm Rotações por minuto
RPMI-1640 Roswell Park Memorial
Institute
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SFB Soro fetal bovino
SOD superóxido dismutase
Th1 Células T helper 1
Th2 Células T helper 2
Th17 Células T helper 17
TLRs Receptores do tipo Toll
TLR-2 Receptor Toll like-2
TLR-4 Receptor Toll like-4
TLR-2 -/- Camundongos nocautes para
TLR-2
TLR-4 -/- Camundongos nocautes para
TLR-4
TNF-α Factor de Necrose Tumoral Alfa
Treg Células T reguladoras
TRAF Fatores associados ao receptor TNF
TRAM Molécula adaptadora de TRIF
TRIF/ TICAM-1 Molécula adaptadora do
receptor Toll Like
UFC Unidades Formadoras de Colônias
UV Ultravioleta
WT Wild-type
 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL: Conhecendo a esporotricose …………………………..…….....01

1. Sporothrix: da descoberta ao estabelecimento do Complexo .......................................02
2. Epidemiologia da Esporotricose: cenário da infecção no âmbito mundial e no
Brasil, importância dos felinos e distribuição de espécies.............................................04
3. Espectro de manifestações clínicas na Esporotricose....................................................08
4. Diagnóstico de infecções fúngicas causadas por Sporothrix sp......................................11
5. Tratamento da Esporotricose...........................................................................................13
CAPÍTULO I: Importância dos receptores TLR-2 e TLR-4 na esporotricose causada por
S. brasiliensis. ........................................................................................................................16
1. Desvendando a resposta imune frente a S. brasiliensis................................................17
2. A importância da resposta imune inata na esporotricose.............................................18
3. Importância da resposta imune adaptativa na esporotricose .......................................22
4. Imunidade adaptativa humoral na esporotricose..........................................................24
5. Justificativa...................................................................................................................25
OBJETIVOS.............................................................................................................................26
1. Objetivo geral...............................................................................................................26
2. Objetivos específicos................................................................................................... 26
MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................................27
1. Fluoxograma de execução dos experimentos...............................................................27
2. Microrganismo, condições de cultura e preparo do inóculo fúngico...........................28
3. Camundongos...............................................................................................................28
4. Macrófagos Derivados de Medula Óssea (BMDMs) ..................................................28
5. Produção de LCCM (Meio condicionado de células L929) ........................................29
6. Infecção in vitro- Ensaio de Fagocitose/Adesão...........................................................29
7. Mensuração da Lactato desidrogenase (LDH) .............................................................30
8. Dosagem de óxido nítrico (NO) ...................................................................................30
9. Dosagem de citocinas in vitro (IL-6, IL-10 e TNF-α) .................................................30
10. Cálculo do Índice de Fagocitose...................................................................................30
11. Ensaio de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)...................................................31
12. Infecção in vivo.............................................................................................................31
13. Análise da Carga Fúngica - (UFC)...............................................................................31
 14. Dosagem de citocinas nas suspensões de órgãos.........................................................32
15. Análise Estatística........................................................................................................32
RESULTADOS........................................................................................................................33
1. Ausência de TLR-2 e TLR-4 em BMDMs prejudica a fagocitose de S. brasiliensis..33
2. BMDMs deficientes em TLR-2 e TLR-4 exibem menor carga fúngica........................34
3. Ausência de TLR-2 e TLR-4 promove maior citotoxicidade nos BMDMs em resposta a
S. brasiliensis.................................................................................................................35
4. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 prejudicou os mecanismos microbicidas por
meio da produção de NO................................................................................................36
5. Ausência do receptor TLR-4 resultou em baixa produção in vitro de TNF-α e da
citocina anti-inflamatória IL-10.....................................................................................37
6. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 promove maior disseminação de S.
brasiliensis......................................................................................................................40
7. Ausência de TLR-2 e TLR-4 prejudica a produção de citocinas nos primeiros 14 dias
de infecção com S. brasiliensis......................................................................................43
DISCUSSÃO............................................................................................................................50
CONCLUSÕES .......................................................................................................................55
CAPÍTULO II: Investigação de proteínas envolvidas na virulência e evasão do sistema
imune diferencialmente expressas em S. brasiliensis...............................................................56
1. Patogenicidade e virulência de fungos.........................................................................57
2. Principais fatores de virulência para Sporothrix spp. ..................................................57
3. Proteômica como ferramenta na elucidação de fatores de virulência..........................62
4. Justificativa...................................................................................................................66
OBJETIVOS.............................................................................................................................67
1. Objetivo geral...............................................................................................................67
2. Objetivos específicos....................................................................................................67
MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................................68
1. Microrganismos e condições de crescimento ..............................................................68
2. Genômica: aquisição de dados e detecção de ortólogos...............................................68
3. Extração Proteica..........................................................................................................69
4. Preparação das amostras para análise...........................................................................69
5. Análises por espectrometria de massas (MS) (Bottom-Up) ........................................70
6. Identificação de proteínas.............................................................................................70
RESULTADOS .......................................................................................................................71
 1. Análises comparativas genéticas para espécies de Sporothrix.....................................71
2. Análises de proteômica................................................................................................72
3. Estudos combinados de genômica e proteômica..........................................................74
DISCUSSÃO............................................................................................................................75
CONCLUSÔES........................................................................................................................81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................82
ANEXOS................................................................................................................................103
 1

INTRODUÇÃO GERAL
Conhecendo a esporotricose
 2

1. Sporothrix: da descoberta ao estabelecimento do Complexo

A esporotricose foi primeiramente descrita por Benjamin Schenck, em 1898, nos

Estados Unidos (EUA), por meio do isolamento do agente etiológico de lesões da mão direita
de um paciente de 36 anos. Após alguns meses, a ulceração espalhou-se por todo braço, dando
origem a abscessos que apresentavam drenagem de líquido seropurulento. O fungo isolado
desses abscessos foi posteriormente estudado pelo micologista Erwin Smith, que o classificou
no gênero Sporotrichum (SCHENCK, 1898). O segundo relato desta micose foi feito por
Hektoen e Perkins em 1900, classificando pela primeira vez o agente etiológico como
Sporothrix schenckii. Em seguida, Lutz e Splendore, 1907, registraram o primeiro caso de
infecção natural por S. schenckii em animais e também demonstraram que era possível
cultivar a levedura in vitro (LUTZ & SPLENDORE, 1907). Em 1927, Pijper e Pullinger
reportam um surto envolvendo 14 mineradores em Witwater, cidade próxima à capital
Johanesburgo, África do Sul, que posteriormente, entre 1941 e 1944, também foi palco do
maior surto epidêmico de esporotricose pulmonar já documentado, envolvendo cerca de 3.000
mineradores. Concluiu- se que o reservatório para o crescimento saprofítico do fungo ocorria
nas madeiras das estruturas de sustentação da mina (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
O dimorfismo térmico apresentado por este fungo, porém, só foi demonstrado mais tarde, em
1961, por Howard (HOWARD, 1961). Devido a este comportamento, o fungo apresenta-se na
forma filamentosa em condições ambientais e nos cultivos in vitro sob temperatura de 25ºC;
passando a levedura in vivo e in vitro a 37ºC (figura 1) (LACAZ, 1998).

A B

Figura 1. Fase filamentosa (A) e leveduriforme (B) de Sporothrix sp. Fonte: Lacaz, 1998.

Alguns anos atrás, o gênero Sporothrix era tratado como uma única espécie
patogênica, S. schenckii, e classificado na divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina,

INTRODUÇÃO GERAL
 3

classe Sordariomycetes, ordem Moniliales e família Moniliaceae (LACAZ, 1998). No

entanto, hoje devemos considerar a antiga espécie, até então conhecida como Sporothrix
schenckii, como um complexo de seis espécies crípticas, isto é, seis espécies com
características morfológicas parecidas, mas distintas ao ponto de vista genotípico. Em 1999,
Guarro et al reclassificaram o fungo na divisão Ascomycota, classe Sordariomycetes, ordem
Ophiostomatales e família Ophyostomataceae (Tabela 1). Posteriormente, análises
filogenéticas, realizadas com isolados provenientes de diferentes partes do mundo,
investigaram variações na sequência de nucleotídeos de três genes: quitina sintase, β-tubulina
e calmodulina. Tais estudos identificaram o gene da calmodulina como um bom marcador
para a identificação de novas espécies, culminando no estabelecimento do complexo
Sporothrix. Além de análises genéticas, métodos fenotípicos, como características macro e
microscópicas (diâmetro das colônias e presença de conídios sésseis pigmentados), testes de
assimilação de sacarose e rafinose e a capacidade de crescer a 37°C também podem ser
empregados na identificação (GUARRO; GENÉ; STCHIGEL, 1999).

Tabela 1. Classificação taxonômica do Sporothrix spp. Classificação proposta por Guarro et al., 1999.

Reino Fungi
Divisão Ascomycota
Classe Sordariomycetes
Ordem Ophiostomatales
Familia Ophiostomataceae
Gênero Sporothrix
Espécie S. schenckii; S. brasiliensis; S. globosa; S. mexicana; S. albicans; S. luriei

Além de identificar novas espécies, tais estudos também permitiram agrupá-las

segundo sua distribuição geográfica (MARIMON et al., 2006). O grupo 1 refere-se à
Sporothrix brasiliensis, principal causador da epidemia zoonótica no Rio de Janeiro, Brasil; o
grupo 2 inclui S. schenckii stricto sensu, isolado principalmente nos Estados Unidos e na
América do Sul; o grupo 3 contem S. globosa, de distribuição mundial; o grupo 4, com S.
mexicana, é restrito ao México; e o grupo 5 é constituído por S. albicans, relacionado à
Europa, e S. luriei, considerada rara, com poucos relatos de infecção em humanos
(MARIMON et al., 2006). Análises filogenéticas de DNAr e β-tubulina sugerem que S.

INTRODUÇÃO GERAL
 4

albicans, S. pallida e S. nivea, dada a similaridade, deveriam ser considerados uma espécie
única, S. pallida (DE MEYER et al., 2008).

Tornou-se evidente que as novas espécies do complexo Sporothrix descritas– S.

albicans, S. luriei, S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii stricto sensu -
possuem características fenotípicas e genotípicas distintas e são de interesse clínico
(MARIMON et al., 2006; MARIMON et al., 2007).

2. Epidemiologia da esporotricose: cenário da infecção no âmbito mundial e no Brasil,

importância dos felinos e distribuição de espécies.

No que tange á ocorrência mundial da esporotricose, surtos ocorreram ao longo dos anos
(BARROS et al., 2011; ZHANG et al., 2015). Inicialmente, na França, foi relatada uma
epidemia de esporotricose durante um período de 6 anos, incluindo mais de 200 casos
(BEURMANN & GOUGEROT, 1912). Em seguida, na década de 1940, uma epidemia
ocorreu em uma mina de ouro na África do Sul, envolvendo mais de 3 000 mineradores que
desenvolveram a doença depois de terem sido infectados após o contato com madeira não
tratada contaminada por Sporothrix (HELM & BERMAN, 1947). Outras grandes epidemias
foram relacionadas a materiais vegetais como musgo Sphagnum nos EUA (Centros para
Controle e Prevenção de Doenças, 1988) e feno na Austrália (FEENEY et al., 2007).
Recentemente, temos surtos descritos na China, envolvendo a colheita de cana e milho, sendo
causado prevalentemente pela espécie S. globosa (SONG et al., 2013; MOUSSA et al., 2017),
e o surto zoonótico de esporotricose, causado pela espécie S. brasiliensis, que tem ocorrido no
sudeste do Brasil (RODRIGUES et al., 2013).

Especificamente na China, a esporotricose causada pela espécie S. globosa, relaciona-se a

colheita do milho, visto que, ocorre uma alta exposição dos agricultores a detritos
contaminados (ZHANG et al., 2015). Nesse mesmo estudo, Zhang et al. 2015, hipotizaram
que o Sporothrix não é um agente patogênico de plantas, mas requer condições particulares,
como a decomposição e a fermentação de material vegetal, promovendo o crescimento desse
microrganismo. De forma similar ao que ocorre na China, na Índia, a infecção por Sporothrix
spp. foi frequentemente relatada nas mãos e no rosto de 90% dos pacientes que estavam
envolvidos no trabalho agrícola (VERMA et al., 2012). Contrapondo o perfil anteriormente
descrito, surtos de esporotricose no Brasil por transmissão zoonótica têm ocorrido, sendo os

INTRODUÇÃO GERAL
 5

gatos os principais hospedeiros do microrganismo (Figura 2). A forma de transmissão

diferencia o Brasil de outros surtos pelo mundo, e parece ser independente da ocupação,
sendo que qualquer contato com um animal infectado pode predispor à infecção
(RODRIGUES et al., 2013; MOUSSA et al., 2017).

Figura 2. Esporotricose em gatos. Múltiplas lesões ulcerativas. Imagens adaptadas de Lloret et al., 2013.

Anteriormente ao surgimento do surto de esporotricose ocasionada por ga tos, essa doença

era frequentemente observada entre os que trabalhavam no cultivo de plantas ornamentais,
especialmente a roseira, por isso a doença também é conhecida como doença dos jardineiros e
classicamente causada pela espécie S. schenckii (KWON-CHUNG & BENNET, 1992). A
esporotricose geralmente é uma doença adquirida pela implantação traumática do fungo no
tecido subcutâneo pelo contato com um material contaminado, como espinhos, farpas de
madeiras e outros materiais de origem vegetal. Porém outras formas incomuns de inoculação
também já foram descritas, como picada de inseto e outras formas de transmissão por animais
como roedores, cães, tatus, cavalos e aves (KWON-CHUNG & BENNET, 1992).

No entanto, o panorama da esporotricose no Brasil mudou ao longo dos anos e diversos

pesquisadores fizeram referência ao papel dos gatos na transmissão da esporotricose para
humanos e a associação dessa epidemia a espécie S. brasiliensis (READ & SPERLING, 1982;
BARROS et al., 2001, 2004, 2011; DUNSTAN et al., 1986; MARQUES et al., 1993;
SANCHOTENE et al., 2015; SCHUBACH T et al., 2005, SCHUBACH A et al., 2008;
MIRANDA et al., 2016). Essa forma de transmissão conta com um agravante: o
comportamento felino. Animais adultos saem durante a noite em busca de caça ou em função
dos rituais reprodutivos, quando a fêmea em cio, costuma atrair os machos que irão disputá- la
em brigas. Nestas ocasiões, animais portadores de lesões ulceradas, com grande quantidade de
células leveduriformes, poderão transmitir a esporotricose pelo contato direto com essas

INTRODUÇÃO GERAL
 6

lesões ou pelos ferimentos produzidos por mordeduras ou arranhaduras de gatos doentes

(CRUZ, 2010; MONTENEGRO et al., 2014).). Outro comportamento felino que facilita a
disseminação da esporotricose é que diferentemente dos cães, que se fixam nos locais onde
vivem, o gato sai de casa, caminhando pela rua, caçando pássaros, ratos e outros pequenos
animais, se relaciona com outros gatos e eventualmente, volta para casa. Somado ao fato de
que em algumas regiões a população de gatos nas ruas e praças tem aumentado
consideravelmente, e algumas pessoas têm o hábito de recolherem animais (sadios ou
doentes) das ruas, abrigando-os em casas ou apartamentos, formando colônias numerosas,
sem qualquer controle sanitário. Quando o proprietário toma conhecimento dos riscos de
contágio para ele e seus familiares, abandona esses animais, ou até mesmo quando esses
animais morrem, são enterrados em locais inapropriados, contribuindo para a disseminação
dessa doença (BARROS et al., 2010; FREITAS et al., 2010). Estudos mostraram que 70%
dos pacientes com suspeita de esporotricose que procuram a Fiocruz para um primeiro
atendimento, já haviam dado um destino inadequado ao seu animal, perpetuando o ciclo de
transmissão da doença (GALHARDO, 2011).

No que diz respeito aos casos de esporotricose tanto em humanos quanto animais, os
dados são alarmantes. Entre 1998-2004, 1503 casos de esporotricose felina foram notificados
em diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro e, no período de 1998-2009, foram
reportados cerca de 2.200 casos humanos na mesma região (BARROS; DE ALMEIDA
PAES; SCHUBACH, 2011). Já no período de 2005 a 2011, 2301 casos de esporotricose felina
por S. brasiliensis foram diagnosticados no Laboratório de Pesquisa Clínica em
Dermatozoonoses em Animais Domésticos (Lapclin-Dermzoo)/Instituto Nacional de
Infectologia/Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) (PEREIRA et al., 2014). Dados da
Vigilância Sanitária do Rio de Janeiro mostram um aumento de 400% no número de felinos
diagnosticados com esporotricose em 2016, quando comparados a 2015, revelando a
magnitude e a expansão dessa doença. No ano de 2016 foram feitos 13.536 atendimentos,
10.283 a mais do que o ano anterior (Vigilância Sanitária-RJ). Esses dados enfatizam a
importância desta micose como um problema de saúde pública

Quando analisamos outros estados brasileiros acometidos pela esporotricose,

verificamos uma expansão dessa doença. Entre 2008 e 2012, todos os casos de esporotricose
em um hospital de Vitória– ES foram diagnosticados como causados por S. brasiliensis e

INTRODUÇÃO GERAL
 7

adquiridos por transmissão felina (ARAUJO et al., 2015). Durante 2011-2014, foram
notificados 163 casos de esporotricose felina na cidade de São Paulo, com comprovada
cultura de S. brasiliensis. A predominância de casos na região leste da cidade,
especificamente nos distritos de Itaquera e Itaim Paulista, denota um caráter epidêmico
(MONTENEGRO et al., 2014).

Como vimos anteriormente, classicamente a esporotricose é causada por S. schenckii,

no entanto, estudos mostram que a espécie prevalente na epidemia zoonótica que vem
ocorrendo no Brasil é a espécie S. brasiliensis. A análise da distribuição de espécies revela
que, no período de 1998 a 2008, na cidade do Rio de Janeiro, dentre as 247 amostras isoladas
de pacientes, 6% se tratavam do fungo S. schenckii e 93,4% dos casos estavam relacionados à
S. brasiliensis (OLIVEIRA et al., 2011). Isolados zoofílicos, antropofílicos e geofílicos,
originalmente identificados como S. schenckii, foram reclassificados, segundo as análises dos
loci (calmodulina e ITS), em S. schenckii ou S. brasiliensis, sendo os isolados de
esporotricose felina todos identificados como S. brasiliensis (OLIVEIRA et al., 2011).

Em um estudo comparativo, utilizando 161 isolados de esporotricose de diversas

regiões do país, todos os isolados zoofílicos foram genotipados como S. brasiliensis.
Enquanto S. schenckii é amplamente distribuído pelo Brasil, a ocorrência das demais espécies
é irregular. Nas regiões nordeste e sudeste as quatro espécies predominantes são: S.
brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. mexicana. A região centro-oeste restringe-se a três
espécies: S. brasiliensis, S. schenckii e S. globosa. Apenas duas espécies foram detectadas na
região sul (S. brasiliensis e S. schenckii), ao passo que as únicas três cepas na região Norte
foram classificadas como S. schenckii (RODRIGUES et al., 2013). No entanto, os estudos
destacam a prevalência de S. brasiliensis (96%) isolados de gatos com esporotricose e,
consequentemente, em humanos que contraíram a doença. O perfil desses isolados no estado
do Rio de Janeiro é o mesmo observado em São Paulo, Paraná e Minas Gerais (RODRIGUES
et al., 2013). Como descrito, a esporotricose causada por S. brasiliensis tem grande
importância devido à dimensão que tem atingido. Esses dados são alarmantes e mostram que
a esporotricose transmitida por animais, embora registrada em vários países, atingiu níveis
críticos no Brasil.

INTRODUÇÃO GERAL
 8

3. Espectro de manifestações clínicas na esporotricose

As diferentes manifestações clínicas da esporotricose em humanos relacionam-se

diretamente com a via de infecção e estado imunológico do paciente. O período de incubação
de Sporothrix spp. permanece desconhecido e pode variar de alguns dias a alguns meses,
sendo a média de três semanas (BARROS et al., 2011).

Após a inoculação traumática, a pele e os vasos linfáticos circundantes estão

envolvidos no desenvolvimento da doença, formando pequenas e endurecidas lesões papulo-
nodulares no local da inoculação. No entanto, apesar de trauma ser mencionado pela maioria
dos pacientes, em alguns casos podem ser facilmente negligenciados. Sendo assim, a
inoculação subcutânea não precisa ser aparente para o início da esporotricose (ZHANG et al.,
2015).

A esporotricose pode se desenvolver em diferentes formas segundo a classificação

proposta por Lopes-Bezerra et al. (2006): Cutânea (linfocutânea, cutânea- fixa e disseminada),
mucosa, extracutânea, residual e formas especiais (Tabela 2). As lesões podem ulcerar (cancro
esporotricótico), sem causar sintomas sistêmicos, ou desenvolver múltiplas lesões. As três
principais manifestações clínicas da esporotricose correspondem à forma cutânea: forma
linfocutânea, cutânea-fixa ou cutânea disseminada/multifocal.

A forma extracutânea ou esporotricose sistêmica ocorre a partir da propagação

hematogênica do local de inoculação primária (MAHAJAN, 2014). Também podem ser
consideradas situações em que há comprometimento de mucosas tais como a conjuntiva
ocular e mucosa nasal. Nas manifestações extracutâneas da micose podem ser relatados casos
como esporotricose pulmonar, osteoarticular, meníngea ou sistêmica (LOPES-BEZERRA;
SCHUBACH; COSTA, 2006).

Globalmente, a forma clínica mais frequente (cerca de 80% dos casos) é a

linfocutânea. Inicia-se como uma lesão nodular ou ulcerada no local da inoculação fúngica e
segue via vasos linfáticos regionais, caracterizada por lesões nodulares que ulceram, fistulam
e que podem regredir. Estes sinais clínicos caracterizam a denominação desta forma como
linfagite nodular ascendente (LOPES-BEZERRA; SCHUBACH; COSTA, 2006) (Figura 3).

INTRODUÇÃO GERAL
 9

Tabela 2. Principais manifestações clínicas na esporotricose. Fonte: Bezerra et al., 2006.

1. Cutânea
Linfocutânea
Fixa
Disseminada ou múltipla
2. Mucosa
Ocular
Nasal
Outras
3. Extracutânea
Pulmonar
Osteoarticular
Meningite
Generalizada
4. Residual (Sequela)

5. Formas Especiais
Regressão espontânea
Hipersensibilidade (eritema nodoso, eritema multiforme)

Figura 3. Es porotricose linfocutânea. Lesões ulcerativas que aparecem ao longo dos vasos linfáticos, pró ximos
ao local de inoculação traumática. Figuras adaptadas de Mahajan, 2014 e Ferreira et al., 2015.

INTRODUÇÃO GERAL
 10

A esporotricose cutânea fixa aparece como lesão única permanecendo restrita ao local
de infecção e é predominante na epidemia por S. globosa na China (ZHANG et al., 2015).
Não há migração da lesão pelo trajeto linfático adjacente a área afetada. São normalmente
pápulas eritematosas ou placas que podem tornar-se ulceradas ou verrucosas (Figura 4). Não
tendem a regressão espontânea, havendo casos descritos com até 26 anos de evolução. De
acordo com Kwon-Chung (1979) esta forma clínica pode ocorrer como uma reinfecção em
pessoas que foram previamente sensibilizadas com o fungo, e o agente etiológico é muitas
vezes incapaz de crescer a temperaturas superiores a 35°C. A esporotricose cutânea fixa
localiza-se com maior frequência na face ou nos membros superiores com manifestações
polimórficas, sendo um desafio para o diagnóstico clínico, podendo conduzir a erros, já que é
facilmente confundida com outras patologias como leishmaniose, cromomicose, blastomicose
e piodermite vegetante. Representam em torno de 25% dos casos e são mais freqüentes em
áreas de alta endemicidade (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

Figura 4. Es porotricose cutânea fixa. Placas verrucosas se desenvolvem nos sítios de inoculação. Figura
adaptada Mahajan., 2014 e Ferreira et al., 2015.

As formas cutânea-disseminada e extracutânea têm sido observadas principalmente,

mas não exclusivamente, em pacientes imunocomprometidos, com doenças hematológicas,
diabetes mellitus, uso de fármacos imunossupressores, infecção pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV) ou em indivíduos com histórico de consumo de álcool. A
esporotricose disseminada é caracterizada por lesões múltiplas que inicialmente aparecem

INTRODUÇÃO GERAL
 11

como nódulos subcutâneos e então podem evoluir para pápulas, pústulas, úlceras ou lesões
ulcero-gomosas (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Entre as formas extracutâneas, as
mais comuns são a osteoarticular e a pulmonar, mas há relatos de disseminação hematogênica
com envolvimento de múltiplos órgãos, como os olhos e o sistema nervoso central (LOPES-
BEZERRA; SCHUBACH; COSTA, 2006). A esporotricose pulmonar causada por S.
brasiliensis é rara, visto que, comumente a infecção ocorre após a inoculação traumática e não
por inalação de conídios, sendo muitas vezes a fonte destes conídios desconhecida. Essa
doença ocorre sem necessariamente existir uma doença de base e pode ser confundida com
doenças como a tuberculose (OROFINO-COSTA et al., 2013). Em um caso de esporotricose
causada por S. brasiliensis em paciente com HIV, encontrou-se o fungo em culturas de pele,
escarro, sangue, líquor e exames radiológico revelaram osteomielite fúngica (PAIXÃO et al.,
2015). Foi demonstrado recentemente que além das típicas manifestações clínicas da
esporotricose, a infecção por S. brasiliensis pode causar formas clínicas atípicas. Essas formas
incluem esporotricose cutânea disseminada na ausência de uma condição imunossupressora
de base, envolvimento de mucosas, afetando a cavidade nasal ou conjuntiva, causando
hipersensibilidade (ALMEIDA-PAES et al., 2014). Acredita-se que as reações de
hipersensibilidade possam indicar uma resposta do hospedeiro frente às células
leveduriformes de S. brasiliensis e desempenham um papel protetor na esporotricose.

Com o intuito de relacionar a espécie e as manifestações clínicas, isolados

provenientes de 50 pacientes foram estudados quanto às diferenças fenotípicas e genotípicas.
Os dados revelam que 45 desses pacientes foram infectados por S. brasiliensis, cuja
manifestação clínica foi à forma cutânea disseminada, sem doença subjacente, sendo casos
mais graves quando comparados à infecção por S. schenckii. Apesar da maior gravidade, esses
pacientes responderam melhor ao tratamento com itraconazol (ALMEIDA-PAES et al.,
2014).

4. Diagnóstico de infecções fúngicas causadas por Sporothrix sp.

O diagnóstico da esporotricose é obtido pelas correlações clínicas, epidemiológicas e

laboratoriais, incluindo cultura e caracterização fenotípica. A avaliação clínica é a chave para
o diagnóstico precoce de lesões cutâneas causadas por Sporothrix sp. Essas lesões precisam
ser diferenciadas de outras infecções, tais como: tuberculose cutânea, leishmaniose
tegumentar, nocardiose, cromoblastomicose, blastomicose, paracoccidioidomicose e

INTRODUÇÃO GERAL
 12

micobacteriose (LOPES-BEZERRA; SCHUBACH; COSTA, 2006). O exame direto do

material proveniente das lesões não é o recomendado, pois há poucas células fúngicas
presentes. A técnica utilizando citologia aspirativa por agulha fina de uma lesão,
particularmente em formas extracutâneas ou disseminadas, pode mostrar o granuloma de
células epitelióides, corpos asteróides, e /ou células de levedura em forma de charuto, quando
coradas com ácido periódico de Schiff (PAS) ou Gomori metenamina-prata (GMS). No
entanto, a sensibilidade/especificidade de exame microscópico direto de amostras de tecido é
muito baixa e considerada inútil devido a escassez de células fúngicas presentes (MAHAJAN,
2014). A cultura continua sendo o padrão-ouro para o correto diagnóstico. O isolamento de
Sporothrix sp. é facilmente obtido por meio de semeadura do espécime clínico que, em geral,
é biópsia ou pus de lesão sem um tratamento prévio, em Ágar Sabouraud com cloranfenicol.
Após cinco a sete dias de incubação a 25ºC ou a temperatura ambiente já é possível observar
o aparecimento de colônias filamentosas, hialinas com aspecto úmido que, com o tempo, ou
começam a apresentar uma coloração escura no centro que vai aumentando centrifugamente
ou permanecem hialinas. Observando o crescimento de uma colônia com esse aspecto faz-se o
teste de termoconversão do fungo em meio brain heart infusion (BHI) ágar com extrato de
levedura, distribuindo-se um pequeno inóculo por toda a superfície do meio de cultura e
incubando a 37ºC por cinco dias. A colônia, após a conversão do fungo à forma
leveduriforme, assumirá um aspecto cremoso de cor bege amarelado (MORRIS-JONES,
2002). O exame histopatológico também pode ser utilizado, mas geralmente é inespecífico e
pode ser confundido com outras doenças granulomatosas (infecções fúngicas profundas,
tuberculose cutânea, lepra, sarcoidose e granulomas de corpo estranho). As leveduras, no
exame histopatológico, tem aspecto variado, apresentando-se como formas globosas a
ovaladas com brotamentos claveiformes, no interior de macrófagos, e em cerca de 40% dos
casos onde o fungo é encontrado, nota-se a presença de corpo asteróide, substância
eosinofílica de forma radiada constituída de complexo antígeno-anticorpo, que se deposita na
parede de alguns fungos, fenômeno denominado de Splendore-Hoeppli (MORRIS-JONES,
2002).

O teste cutâneo (intradermorreação) com esporotriquina detecta reação de

hipersensibilidade do tipo tardia, ou seja, a resposta imune celular, e pode ser uma ferramenta
diagnóstica útil, principalmente em estudos epidemiológicos. Ela é usualmente positiva em

INTRODUÇÃO GERAL
 13

mais de 90% dos casos comprovados de esporotricose, mas pode também indicar infecção
prévia (ITOH et al., 1986).

A correlação entre dados moleculares e características fenotípicas é fundamental para

a identificação de espécies do complexo Sporothrix. Dentro deste complexo, a espécie S.
brasiliensis apresenta conídios sésseis pigmentados, não assimila rafinose e é também a única
que não assimila sacarose. Apresenta o menor crescimento em ágar batata a 20ºC e 30ºC, já a
37ºC, quando comparada a outras espécies do complexo Sporothrix, é a que apresenta maior
crescimento (MARIMON et al., 2007; MARIMON et al., 2006).

Recentemente, avanços nos campos da genômica, proteômica e metabolômica, estão

gerando novos conhecimentos e novos parâmetros no campo da identificação de fungos.
Técnicas imunológicas também têm sido empregadas para estabelecer o diagnóstico da
esporotricose, tais como: reações de imunodifusão, teste de imunoeletroforese, testes de
aglutinação, detecção de anticorpos contra pepdio-ramnomananas e Immunoblot (BARROS;
DE ALMEIDA PAES; SCHUBACH, 2011). Pesquisas recentes têm estabelecido o MALDI-
TOF- MS como uma ferramenta para a caracterização de microrganismos e diferenciação de
espécies. A identificação de isolados clínicos e ambientais também pode ser feita com base
em perfis proteômicos por meio da análise direta de colônias. Esse método tem se mostrado
confiável e rápido (PASTERNAK et al., 2012).

5. Tratamento da Esporotricose

A escolha da terapia na esporotricose é dirigida por fatores como o baixo custo, facilidade
de administração, perfil de segurança e local da infecção (localizada ou disseminada)
(MAHAJAN, 2014). Para o tratamento da forma cutânea ou linfocutânea da esporotricose,
utiliza-se agentes antifúngicos orais, sendo que o uso diário de itraconazol (200mg) o padrão-
ouro. O iodeto de potássio é administrado por via oral, possui baixo custo e é uma escolha no
tratamento de lesões não complicadas de esporotricose cutânea. Entretanto, podem ocorrer
problemas na administração deste medicamento, em especial alergias e problemas mais
graves, como edema pulmonar, angioedema, mialgia, linfadenopatia, urticária, vasculite,
psoríase pustular, acidose metabólica e iododerma, entre outros. Seu uso é desaconselhável
em mulheres grávidas e pessoas com comprometimento de rim e tireóide (STERLING &
HEYMANN, 2000). Portanto, nos países desenvolvidos e no Brasil, tem sido utilizado o

INTRODUÇÃO GERAL
 14

itraconazol no tratamento de pacientes com esporotricose, com uma boa evolução para cura
das lesões nestes pacientes (BARROS et al., 2011). Entretanto, estudos de susceptibilidade a
antimicrobianos in vitro demonstram que isolados de pacientes com fo rma disseminada da
infecção apresentam uma menor susceptibilidade ao itraconazol, o que provavelmente
contribui para a falha terapêutica com este fármaco nos pacientes com esta forma mais grave
(TRILLES et al., 2005). Uma alternativa ao itraconazol nesses casos é o tratamento com
anfotericina B, apesar de que casos refratários a esta abordagem já foram relatados (BARROS
et al., 2011). No caso de doença refratária, o tratamento é realizado com 2 doses diárias de
itraconazol (200 mg) ou terbinafina (500 mg), ou com 3 doses diárias de solução saturada de
iodeto de potássio. Em pacientes com esporotricose disseminada, o tratamento intravenoso
com anfotericina B é requerido. A anfotericina B pode ser utilizada no regime de manutenção
da terapia, juntamente com itraconazol. Essa é a melhor opção para o tratamento da
esporotricose disseminada (KAUFFMAN et al., 2007). Na esporotricose disseminada causada
por S. brasiliensis, a combinação de anfotericina B e itraconazol in vivo tem mostrado boa
atividade (ISHIDA et al., 2015). Quando a anfotericina B e o itraconazol sozinhos não são
eficientes, outra combinação pode ser utilizada, que é anfotericina B e posaconazol (MARIO
et al., 2015).

Como vimos anteriormente, o panorama mundial da esporotricose mudou a partir da

classificação proposta por Marimon et al. (2007), e a unicidade foi quebrada para o
surgimento da pluralidade, conduzindo a mudanças em conceitos e certezas há anos
estabelecidas (CRUZ, 2013). O surgimento do complexo Sporothrix schenckii, trouxe
mudanças no cenário epidemiológico, bem como, novas informações acerca da distribuição
dessas novas espécies pelo Brasil e pelo mundo. Nesse contexto observamos a importância
dos felinos e a prevalência da espécie S. brasiliensis na epidemia no Brasil. No entanto,
alguns questionamentos permanecem sem respostas, como aqueles relacionados à resposta
imune e virulência. No decorrer desse trabalho, procuraremos entender alguns desses
aspectos.

Diante disso, esse estudo divide-se em 2 capítulos:

INTRODUÇÃO GERAL
 15

Capítulo I

 O capítulo I foca na resposta do hospedeiro frente a S. brasiliensis e refere-se à

investigação da resposta imune, especificamente do papel dos receptores TLR-2 e TLR-4 in
vitro e in vivo.

Capítulo II

 O capítulo II enfatiza o microrganismo S. brasiliensis e assim, utilizando ferramentas de

proteômica, como a técnica de Bottom-up, procura elucidar o proteoma de S. brasiliensis,
comparando-o com a espécie S. schenckii. Foca nas proteínas diferencialmente expressas por
S. brasiliensis e discute o papel das mesmas na virulência e evasão frente ao sistema imune.

INTRODUÇÃO GERAL
 16

CAPÍTULO I
Importância dos receptores TLR-2 e TLR-4 na esporotricose causada
por S. brasiliensis

INTRODUÇÃO GERAL
 17

1. Desvendando a resposta imune frente a S. brasiliensis

Pouco se sabe sobre a resposta imune frente a Sporothrix spp., bem como os receptores
envolvidos no seu reconhecimento e fagocitose. O que se sabe é que essas etapas são críticas
para o desenvolvimento de uma resposta protetora. Os macrófagos desempenham papel
importante no início, manutenção e resolução das respostas inflamatórias no hospedeiro.
Primeiramente para que ocorra o estabelecimento da esporotricose, é requerida a transição
dimórfica, onde os conídios transformam-se em leveduras (GUZMAN-BELTRAN et al.,
2012). Quando os conídios entram em contato com os macrófagos, há uma baixa indução de
resposta pró-inflamatória e morte celular induzida por espécies reativas de oxigênio (ROS),
quando comparada as leveduras. Assim, o fungo sobrevive e ocorre a transição dimórfica
(GUZMAN-BELTRAN et al., 2012).

Em seguida temos a fagocitose, que é um importante mecanismo da imunidade inata na

esporotricose. O processo inicial da fagocitose ocorre por meio do reconhecimento direto de
componentes como a manose, mananas, β-glucanas e lipopolissacarídeo (LPS), ou
componentes do soro que opsonizam os patógenos antes da sua internalização (UNDERHILL
& GANTNER, 2004). Os fagócitos agem como células regulatórias e efetoras do sistema
imune, sendo que o aumento da função fagocítica pode ser aplicado como terapia contra
infecções microbianas (POPOV et al., 1999). Se uma falha nesse sistema ocorrer, há maior
facilidade do microrganismo em se desenvolver no hospedeiro e intensificar o processo
infeccioso. Ensaios de fagocitose mostraram que os macrófagos foram capazes de internalizar
conídios opsonizados e não opsonizados e leveduras de S. schenckii. No reconhecimento de
conídios, houve a participação de receptores de manose e o desenvolvimento de uma resposta
Th1, já no reconhecimento de leveduras, houve a participação de receptores de complemento
(GUZMAN-BELTRAN et al., 2012). O receptor de manose está principalmente relacionado
a uma resposta Th1 e Th17 em fungos (ROMANI, 2011). Interessantemente, embora os
conídios de S. schenckii sejam reconhecidos por receptores de manose, a resposta inflamatória
induzida é fraca, no qual pode favorecer a transição dimórfica de conídios para leveduras.
Após a ativação dos macrófagos, os mesmos fagocitam os patógenos invasores e promovem a
produção de citocinas pró- inflamatórias, tais como, IL-6, TNF-α e IL-1β. Isto estimula as
respostas fagocíticas e promove a liberação de agentes tóxicos, tais como, compostos
intermediários reativos de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO), que é um potente mediador
da resposta imune e inflamatória. O NO é produzido nos momentos iniciais da infecção, bem

CAPÍTULO I
 18

como no seu término, para a resolução total (CARLOS et al., 2003). Além dos macrófagos, a
resposta imune inflamatória gerada por S. schenckii também foi estudada em outras células
características da resposta inata, como os mastócitos (ROMO-LOZANO; HERNANDEZ-
HERNANDEZ; SALINAS, 2014) e queratinócitos (LI et al., 2012). A interação de mastócitos
com conídios e leveduras de S. schenckii conduziu a produção de TNF-α e IL-6, sendo que a
via ERK foi ativada quando mastócitos foram desafiados com leveduras (ROMO-LOZANO;
HERNANDEZ-HERNANDEZ; SALINAS, 2014). De forma semelhante, queratinócitos
tratados com conídios e leveduras de S. schenckii proporcionaram aumento da expressão de
RNAm de TLR-2 e TLR-4, e aumentaram os níveis de IL-6 e IL-8 por meio da sinalização
por NF-kB (LI et al., 2012).

Estudos de resposta imune frente a fungos revelam diferenças associadas às espécies,

bem como, ao estado imunológico do hospedeiro (CARLOS et al., 1994; DA SILVA et al.,
2001; FERNANDES et al., 2013), havendo a participação de vários mecanismos de defesa.
Sabe-se que leveduras e conídios expressam em sua superfície estruturas microbianas
conservadas, denominadas padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) (AKIRA
et al., 2001). Estas estruturas são reconhecidas por diferentes receptores de reconhecimento de
padrões (PRRs), presentes nos macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (AKIRA et al.,
2001). A seguir, temos um panorama dos principais estudos de resposta imune frente à
Sporothrix, no entanto, a maioria deles relaciona-se a espécie S. schenckii. Esses estudos
fornecem informações importantes para o direcionamento e condução do trabalho frente à
espécie S. brasiliensis.

2. A importância da resposta imune inata na esporotricose

Para a compreensão do desencadeamento da resposta imune inata, é preciso conhecer a

principal fonte e a natureza dos PAMPs em fungos de importância médica, bem como, os
principais receptores envolvidos no seu reconhecimento. Os PAMPs podem variar quanto a
sua natureza molecular, podendo ser lipídios, proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos.
Especificamente em fungos, a parede celular é a principal fonte de PAMPs, sendo que, os
principais componentes são β-glucanas, quitina e mananas (ROMANI et al., 2011).
Especificamente em leveduras de S. schenckii, a peptido-rhamnomanana é uma fração de
glicoproteína composta de 33,5% de ramnomanose, 57% de manose e 14,2% galactose
(LLOYD & BITTON, 1971). Os PAMPs podem ser reconhecidos por diferentes PRRs, tais

CAPÍTULO I
 19

como: receptores do tipo Toll (TLRs), receptores do tipo RIG-I (RLRs), receptores do tipo
NOD (NLRs), receptores de lectina do tipo C (CLRs) e sensores de DNA citosólico (AKIRA
et al., 2006). Gonçalves et al. (2014) verificaram que células do exudato peritoneal de
camundongos infectados com leveduras de S. schenckii cultivadas na presença de extrato
lipídico proveniente do fungo promoveram um aumento de IL-18 e IL-1β, por meio da
ativação da caspase-1, sugerindo a participação do inflamassoma e de receptores de domínio
citosólico ologomerizado (NOD). Além disso, recentemente, verificou-se que a dectina-1
reconhece β-1,3-glucana e outros componentes fúngicos de S. schenckii, aumentando a
liberação de citocinas durante a infecção (JELLMAYER et al., 2017).

Nossos estudos concentram-se nos TLRs, especificamente TLR-2 e TLR-4. Os TLRs são
encontrados nas células do sistema imunológico e o seu papel tem sido amplamente estudado
no reconhecimento de fungos. Eles fazem parte de uma família de receptores
transmembrânicos evolutivamente conservados que contêm um domínio externo a membrana
com sequências ricas em leucina particulares para cada TLR (PANDEY et al., 2015). Até o
presente momento, 10 e 12 membros dessa família foram identificados em humanos e
camundongos, respectivamente (PANDEY et al., 2015). A proteína Toll foi inicialmente
descrita na mosca das frutas, Drosophilla melanogaster, como um receptor transmembrana
tipo I, composto de repetições ricas em leucina e com um papel importante no
desenvolvimento dorso-ventral dos embriões dessas moscas. Lemaitre et al. (1996),
descreveram primeiramente a relação do Toll com a defesa em Drosophila sp. A ausência do
receptor Toll nas moscas promoveu a rápida morte das mesmas, após o contato com agulhas
contaminadas com uma suspensão de conídios de Aspergillus fumigatus (LEMAITRE et al.,
1996). Em seguida, um homólogo deste receptor (conhecido como Toll-like receptor 4–TLR-
4) foi encontrado em mamíferos, estando relacionado à indução da expressão de genes
envolvidos nas respostas inflamatórias (MEDZHITOV et al., 1997).

Após o reconhecimento de estruturas microbianas pelos TLRs, estes receptores sofrem

mudanças conformacionais permitindo o recrutamento de moléculas adaptadoras. São elas:
Fator 88 de diferenciação mielóide (MyD88), proteína adaptadora de MyD88 (MAL/TIRAP),
domínio TIR (TRIF/ TICAM-1) e a molécula adaptadora de TRIF (TRAM) (TAKEUCHI &
AKIRA, 2010). O tipo de sinalização depende de diferentes combinações de moléculas
adaptadoras. A sinalização intracelular está dividida em 2 vias e depende primariamente do
adaptador utilizado: Via dependente de MyD88 ou Via dependente de TRIF (figura 5). Com

CAPÍTULO I
 20

exceção de TLR-3, todos os membros usam a via MyD88 para ativação do fator de
transcrição NF-kB (fator nuclear kB) e das MAPKs (proteínas quinases ativadas por
mitogênese) para a indução de genes pró-inflamatórios (PANDEY et al., 2015).

A ativação dependente da molécula MyD88 é iniciada com a facilitação da associação da

MyD88 com a IRAK4. Isso favorece a fosforilação de IRAK1, que permite a ligação da
molécula TRAF6 ao complexo que por sua vez, ativa TAK1 que faz um complexo com TAB1
e TAB2. Após a formação do complexo, TAK1 ativa o complexo IKK que leva a ativação de
NF-kB. Simultaneamente, TAK1 ativa dois membros das MAP quinases que
subsequentemente ativam JUN N-terminal quinase (JNK) e p38, induzindo a produção de
citocinas inflamatórias. Os receptores TLR-2 e TLR-4 necessitam, além da MyD88, da
molécula adaptadora TIRAP (O'NEILL & BOWIE, 2007).

Figura 5. Representação esquemática da cascata de sinalização medi ada pel os receptores da família TLR.
Adaptado de Bourgeois & Kuchler, 2012.

CAPÍTULO I
 21

Em modelos de doenças infecciosas, quando há perturbação na sinalização por MyD88, há

uma diminuição da indução da resposta imune inata e adaptativa, aumentando a sensibilidade
do hospedeiro à infecção. Por exemplo, em modelos de infecção de fungos como C. albicans
e A. fumigatus, a deficiência de MyD88 provoca bloqueio na produção precoce de citocinas
pró-inflamatórias, diminuição do recrutamento de neutrófilos e diminuição da ativação de
células T (BELLOCCHIO et al., 2004; BRETZ et al., 2008). Bellochio et al., (2004),
mostraram que as vias dependentes de MyD88 são fundamentais para a imunidade contra
fungos. Uma vez que diferentes TLRs podem ser simultaneamente recrutados dependendo da
espécie fúngica, morfologia e sítio de infecção envolvidos, a sinalização por MyD88 participa
extensivamente na resposta inata contra diferentes patógenos. Além disso, estas vias também
são necessárias para o desenvolvimento de respostas adaptativas do tipo Th1, que são
protetoras em diversas micoses.

A ausência do receptor TLR-2 está relacionada a uma maior susceptibilidade à candidíase

disseminada em modelos murinos devido a uma diminuição na secreção de TNF-α e MIP-2 e
recrutamento de neutrófilos (BELLOCCHIO et al., 2004). Em contraste, outros estudos
mostraram que camundongos TLR-2-/- são mais resistentes a candidíase sistêmica, exibindo
um aumento na quimiotaxia e secreção de IFN-γ, diminuição na secreção de IL-10, bem
como, no número de células Treg CD4+ CD25+. Interessantemente, o recrutamento de
monócitos aumentou em camundongos TLR-2-/-, sugerindo um aumento da atividade anti-
Candida nesses animais (NETEA et al., 2004). A imunossupressão em camundongos TLR-2-
/- resultou em maior susceptibilidade a infecções por Aspergillus (BALLOY et al., 2005); no
entanto, o polimorfismo de TLR-2 não resultou em aspergilose invasiva (CUNHA et al.,
2013). Além de estar envolvido no reconhecimento de células fúngicas, TLR-2 também está
presente nos mecanismos de resposta do hospedeiro a outros microrganismos como
Staphylococcus, Mycobacterium e Pneumococcus (KOEDEL et al., 2003). Na avaliação de
seu papel na infecção por leveduras de S. schenckii, observou-se que, na ausência desse
receptor, houve uma menor taxa de fagocitose e menor produção de citocinas co mo TNF-α,
IL-1β, IL-12 e IL-10 frente a antígenos lipídicos. Isso revela o papel desse receptor no
desenvolvimento da proteção em resposta a esse microrganismo, induzindo a produção de
mediadores em resposta ao fungo S. schenckii (NEGRINI et al., 2013).

TLR-4 é o receptor que está envolvido no reconhecimento de LPS, um componente da

parede celular de bactérias gram-negativas causadoras de choque séptico (KAWAI et al.,

CAPÍTULO I
 22

2010). Alguns estudos mostram seu envolvimento no reconhecimento de fungos.

Camundongos nocautes para TLR-4 são mais suscetíveis a candidíase sistêmica devido à
deficiência na secreção de citocinas e diminuição do recrutamento de neutrófilos, o que
resulta no aumento da carga fúngica nos rins (NETEA et al., 2002). TLR-4 nocautes são mais
suscetíveis a infecções por Aspergillus, sendo que polimorfismos nesse receptor estão
associados a desenvolvimento de aspergilose invasiva (BOCHUD et al., 2008). No caso da
esporotricose, resultados similares aos obtidos na ausência de TLR-2, foram observados na
ausência de TLR-4. O TLR-4 é ativado em resposta a componentes lipídicos de S. schenckii,
promovendo uma resposta imune mais eficiente. Por outro lado, macrófagos provenientes de
animais nocautes em TLR-4 foram incapazes de produzir altos níveis de citocinas, tais como,
IL-1β, IL-12 e TNF-α. Esses dados evidenciam a importância desse receptor na imunidade
frente a S. schenckii (SASSÁ et al., 2009).

3. Importância da resposta imune adaptativa na esporotricose

No que se refere ao desenvolvimento da resposta imune adaptativa, a predominância de

subpopulações de células T (Th1, Th2 ou Th17) durante uma infecção é extremamente
importante, uma vez que cada eixo é mais eficiente no combate a determinadas classes de
patógenos (TACHIBANA et al., 1999). As respostas do tipo Thl promovem a liberação de
IFN-γ, um forte ativador de macrófagos (POULIOT et al., 2008), de fundamental importância
na patogênese da esporotricose sendo que sua ativação diferencial é responsável por
manifestações clínicas variadas (UENOTSUCHI et al., 2006). Em algumas doenças crônicas,
entretanto, a resposta celular de linfócitos T CD4 + é inapropriada e pode exacerbar a doença,
impedindo a erradicação do microrganismo. Infecções fúngicas em humanos e em modelos
animais indicam que a imunidade celular é crucial para a de fesa do hospedeiro,
potencializando respostas fungistáticas e fungicidas, como a produção de reativos de oxigênio
(ROS), em especial o ânion superóxido e seus metabólitos reativos. Consequentemente, a
ausência de uma resposta adaptativa adequada está relacionada a uma maior letalidade,
comprovada em modelos murinos de infecção (KAJIWARA et al., 2004). A ativação das
células Th1 parece ser determinada em parte pela resposta de células dendríticas (DCs) frente
a antígenos fúngicos específicos, provenientes de isolados de lesões cutâneas ou viscerais de
esporotricose causada por S. schenckii. Tratando DCs com conídios de S. schenckii ou com
leveduras provenientes de lesão cutânea, houve indução da produção de IFN-γ por células T,
com ativação da via ERK, sugerindo uma resposta Th1. No entanto, antígenos provenientes

CAPÍTULO I
 23

de lesão visceral aumentaram a produção de IL-4, uma citocina da imunidade humoral

(UENOTSUCHI et al., 2006).

As células Th17 têm ganhado destaque dado ao papel chave na defesa contra bactérias e
fungos extracelulares, apresentando efeitos tanto protetores quanto deletérios (CUA & TATO,
2010; HERNÁNDEZ-SANTOS & GAFFEN, 2012). A resposta Th17, com a secreção de IL-
17, promove atividades pró- inflamatórias, incluindo o recrutamento de neutrófilos e produção
de citocinas pró-inflamatórias pelas células epiteliais. Utilizando modelo experimental murino
verificou-se que a ausência dessas respostas está relacionada a uma maior letalidade
(KAJIWARA et al., 2004). O papel de células Th17 é conhecido para a eliminação do S.
schenckii em camundongos com infecção sistêmica, uma vez que a depleção de IL-23 conduz
a um aumento da carga fúngica (FERREIRA et al., 2015). Estudos in vitro mostram que as
DCs reconhecem antígenos de S. schenckii e conduzem ao desenvolvimento de um padrão
misto Th1/Th17 (VERDAN et al., 2012). Sabe-se que o exoantígeno de S. schenckii é capaz
de aumentar níveis de citocinas inflamatórias produzidos por macrófagos e DCs.
Consequentemente, a co- incubação de células T com DCs ativadas por exoantígeno provocam
um padrão de citocinas Th1 / Th17 (IFN-γ/Th17, IL-23 e TGF-β, respectivamente) (MAIA et
al., 2006; VERDAN et al., 2012).

Há uma série de evidências que indicam que os anticorpos protetores e as células CD4+
Th1 e Th17 são elementos fundamentais na resposta imune frente a S. schenckii (FRANCO et
al., 2012; ALMEIDA et al., 2015; FERREIRA et al., 2015; VERDAN et al., 2012; LIU et al.,
2016). Estudos mostram que não só o IFN-γ é secretado durante a imunização passiva, mas
que IL-10 e IL-4 também aumentaram durante o período de infecção, sugerindo um padrão
misto de resposta Th1 / Th2 (ALMEIDA et al., 2015).

Além do exoantígeno, peptídeo-polissacarídeo extraído da parede celular de leveduras de

S. schenckii é capaz de induzir um padrão misto de resposta (Th1/Th2), havendo ativação de
macrófagos por meio da via clássica (M1), com secreção de IL-12 e resposta Th1, bem como,
macrófagos da via alternativa (M2), com altos níveis de IL-10, estando associados a uma
resposta Th2 (ALEGRANCI et al., 2013).

Analisando a literatura acima descrita, verifica-se que um padrão misto de respostas (Th1,
Th2, Th17) pode ser observado na resposta frente a S. schenckii. O que se sabe é que as

CAPÍTULO I
 24

respostas Th1 e Th17, são fatores-chave no controle da infecção por fungos, especialmente na
patogênese da esporotricose causada por S. schenckii. No entanto, pouco se sabe a respeito da
espécie S. brasiliensis.

4. Imunidade adaptativa humoral na esporotricose

As respostas imunes celulares e humorais estão ligadas ao perfil de citocinas gerado. Os

sinais de ativação mais fortes que direcionam a diferenciação de células T para a linhagem
Th2 são desencadeados por IL-4 e IL-13, com uma diminuição concomitante na resposta Th1.
Uma característica da resposta Th2 é a secreção de anticorpos. Dependendo da forma clínica
da esporotricose verifica-se um perfil diferente de anticorpos. Isso foi sugerido pela
observação de que 15 a 20 antígenos na faixa de 22 a 70 kDa presentes em uma solução
solúvel de extrato peptídico do fungo foram reconhecidos pelos soros de pacientes com
esporotricose extracutânea, enquanto soro de pacientes com esporotricose cutânea
reconheceram apenas 8-10 antígenos (SCOTT &MUCHMORE, 1989). Sabe-se que além das
diferentes formas clínicas, existem outros determinantes para a especificidade ou intensidade
de anticorpos contra antígenos de Sporothrix spp, tal como, diferenças relacionadas as
espécies.

Almeida-Paes et al. (2012), mostraram que isolados de S. brasiliensis provenientes de

diferentes formas clínicas apresentaram o mesmo padrão antigênico. No entanto, quando
comparada a resposta de anticorpos induzida por S. brasiliensis isolado de um paciente com a
forma linfocutânea, com a resposta induzida por S. schenckii isolado da mesma forma clínica,
o perfil era diferente, sugerindo que as diferentes espécies do complexo Sporothrix são
responsáveis por respostas específicas.

Duas moléculas antigênicas glicoproteicas, nomeadas gp70 e gp 60, foram descritas em S.

schenckii (RUIZ-BACA et al., 2014; RUIZ-BACA et al., 2011; RUIZ-BACA et al., 2009). A
gp60 encontra-se principalmente na parede celular de leveduras de três diferentes espécies do
complexo Sporothrix: S. schenckii strictu sensu, S. brasiliensis e S. globosa. Ela mostrou ser
imunodominante já que foi reconhecida pelo soro de camundongos infectados com cepas do
complexo S. schenckii (FERNANDES et al., 2013). Rodrigues et al. (2015) mostraram que a
gp70 sofre modificações pós-traducionais, provavelmente glicosilação e substituição de
aminoácidos, uma vez que pelo menos seis proteínas variando de 60 a 70 kDa compartilharam

CAPÍTULO I
 25

o mesmo peptídeo, assim, após análises por espectrometria de massa, conclui- se que gp60 e
gp70 eram o mesmo antígeno.

Apesar da observação de que gp60 e gp70 compartilham o mesmo peptídeo, o padrão de

glicosilação pode influenciar significativamente o tipo de resposta inicial desencadeada após o
reconhecimento pelos receptores das células de resposta imune. Soros de camundongos
infectados com S. schenckii apresentaram anticorpos específicos contra a proteína de 70 kDa,
principalmente isotipos IgG1 e IgG3, sugerindo que gp70 induz uma forte resposta humoral
(NASCIMENTO & ALMEIDA, 2004). Além disso, a imunização passiva com anticorpo
monoclonal específico anti- gp70, modificou o curso da infecção causada por S. schenckii em
camundongos BALB/c, diminuindo a carga fúngica e aumentando a produção de IFN-γ, um
efeito observado até mesmo em camundongos deficiente em células T (NASCIMENTO et al.,
2008). Mesmo que o maior interesse esteja focado nas isoformas gp60-gp70, recentemente
Portuondo-Fuentes et al. (2015) mostraram que a transferência passiva de soro de
camundongos imunizados contendo anticorpos contra duas proteínas de S. schenckii de 44 e
47 kDa tem um papel protetor durante a esporotricose experimental.

5. Justificativa

Embora existam estudos acerca da resposta imune frente a S. schenckii, ainda pouco se
sabe sobre a resposta imune desencadeada pela espécie S. brasiliensis. Vericou-se mediante
os estudos apresentados, que a resposta imune pode variar de acordo com as diferentes
manifestações clínicas e também se relaciona as diferentes espécies. Os TLRs desempenham
um importante papel na infecção por fungos, especificamente frente a S. schenckii, no entanto,
para S. brasiliensis que é um fungo com comprovada virulência e importância no cenário das
infecções fúngicas, há escassez de publicações que desvendem seus mecanismos de resposta
imune. Diante disso, nos questionamos: Qual o pape l dos receptores TLR-2 e TLR-4 no
reconhecimento de S. brasiliensis?

CAPÍTULO I
 26

OBJETIVOS

1. Objetivo Geral

 Caracterizar o papel dos receptores TLR-2 e TLR-4 em resposta a espécie S. brasiliensis

ATCC MyA-4823, utilizando modelo murino.

2. Objetivos específicos

Utilizando ensaios in vitro, objetivou-se:

 Analisar interação entre macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) e S.

brasiliensis, e com isso:

I. Verificar os processos iniciais de interação (fagocitose) utilizando BMDMs C57Bl/6

e nocautes para TLR-2 e TLR-4.
II. Determinar a importância e a consequência da ativação dos receptores TLR-2 e TLR-
4 na produção de citocinas pró- inflamatórias como TNF-α e IL-6 e a citocina anti-
inflamatória IL-10, bem como, avaliar o impacto da ausência dos receptores TLR-2 e
TLR-4 na produção de óxido nítrico.
III. Analisar comparativamente a carga fúngica de BMDMs C57Bl/6 e nocautes para
TLR-2 e TLR-4, após os diferentes tempos de interação com S. brasiliensis.

Com as análises in vivo, objetivamos:

 Analisar a importância dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desenvolvimento da

esporotricose experimental causada por S. brasiliensis e assim:

I. Avaliar o impacto da ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 na produção de

citocinas;
II. Verificar disseminação da doença no curso da infecção por S. brasiliensis;

CAPÍTULO I
 27

MATERIAIS E MÉTODOS

1.Fluoxograma de execução dos experimentos

CAPÍTULO I
 28

2. Microrganismo, condições de cultura e preparo do inóculo fúngico

Para a realização dos experimentos, foi utilizado o isolado de S. brasiliensis ATCC MyA-
4823. Essa espécie é originária do Rio de Janeiro e foi isolada de felinos e de lesões cutâneas.
Este isolado é mantido na micoteca do Laboratório de Micologia Clínica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (FCF-USP), na fase filamentosa, em
ágar Sabouraud, à temperatura ambiente (25-30ºC), sob óleo mineral. Utilizamos em nossos
ensaios, a cepa na forma revertida para a fase leveduriforme em ágar BHI (Brain Heart
Infusion) (Difco BD, Estados Unidos) a 37ºC e repiques são mantidos a cada 15 dias.

Para a preparação do inóculo fúngico, o isolado de S. brasiliensis foi cultivado em meio

BHI a 37ºC por 72 horas. A seguir as leveduras foram suspensas em 5 mL de tampão fosfato
salino (PBS) estéril para realização da contagem das leveduras. As leveduras foram contadas
na câmara de Neubauer e diluídas na proporção de 1:1 com corante azul de Trypan para
verificação da viabilidade celular.

3. Camundongos

Os ensaios foram conduzidos com camundongos C57Bl/6 fêmeas e machos, de fenótipo

selvagem (WT), com 8 a 12 semanas de idade, obtidos do Biotério de Produção e
Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Instituto de Química/USP. Os
ensaios com camundongos nocautes para TLR-2 (TLR-2 -/-), TLR-4 (TLR-4-/-) foram
realizados com camundongos de 8 a 12 semanas de vida, obtidos do Biotério de Experimentos
do Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto / USP. Os experimentos foram realizados com a aprovação da
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA - FCF) cujo protocolo de aprovação (Protocolo
431) segue em anexo (Anexo I).

4. Macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs)

Os macrófagos foram obtidos segundo descrito por Marim et al., 2010. Procedeu-se a
excisão cirúrgica da medula óssea dos fêmures dos animais e as células obtidas, foram
incubadas em meio RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Sigma-Aldrich)
suplementado com bicarbonato de sódio (Synth), HEPES (ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineetanesulfonico) (Bio Basic Inc), gentamicina 40 mg/L (Inlab), β- mercaptoetanol

CAPÍTULO I
 29

(Sigma), 20% de soro fetal bovino (SFB) (Vitrocell) e 30% de LCCM (Meio condicionado
de células L929) (meio R20 /30), durante sete dias, sendo que no quarto dia a cultura foi
suplementada com o mesmo meio R20/30. No sétimo dia, as células aderidas foram coletadas
e ressuspensas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com bicarbonato de sódio
(Synth), HEPES (Bio Basic Inc), gentamicina 40 mg/L (Inlab), β- mercaptoetanol (Sigma),
10% de SFB (Vitrocell) e 5% de LCCM (meio R10/5) na concentração de trabalho.

5. Produção de LCCM (Meio condicionado de células L929)

O LCCM foi produzido a partir de sobrenadante de culturas de fibroblastos L929

mantidas em estado de 100% de confluência em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich)
suplementado com bicarbonato de sódio (Synth), HEPES (Bio Basic Inc), gentamicina 40
mg/L (Inlab), β-mercaptoetanol (Sigma), 10% de SFB (Vitrocell) por sete dias. O
sobrenadante destas culturas foi filtrado em filtros de 0,22 µm- sendo denominado LCCM- e
armazenado a -196 °C (N 2 Líquido) até o momento de uso.

6. Infecção in vitro- Ensaio de fagocitose/adesão

Para a realização dos ensaios in vitro, BMDMs WT, TLR-2-/- e TLR-4-/- foram
plaqueados em placas de 24 poços (2x105 /poço) sobre lamínulas de vidro e mantidos toda a
noite em estufa a 37ºC e 5% CO 2 para possibilitar a aderência das células. Em seguida, os
poços foram lavados com PBS 1x e incubados com a suspensão fúngica de leveduras na
multiplicidade de infecção 5 (MOI 5=1x106 leveduras/mL) ou apenas meio R10 como
controle. O sistema foi mantido em estufa a 37ºC e 5% CO 2 por 3, 6, e 12 horas. Depois de
atingido o tempo de infecção, os sobrenadantes foram coletados para dosagem de citocinas.
As lamínulas foram coletadas e coradas com kit hematológico comercial (Instant-Prov,
NewProv) e analisadas por microscopia ótica comum. Para a realização da microscopia
eletrônica foi utilizado o tempo de 6 h de infecção. Após esse período, o sobrenadante foi
removido, e as células foram lavadas 3 vezes com PBS 1x e fixadas em 2% de Osmium por
2h. Em seguida, a amostra foi desidratada em etanol (25 a 100%) e cobertas por ouro (12nm).
As células foram visualizadas em microscópio eletrônico GOL X-100 no aumento de 5000-
10000 vezes.

CAPÍTULO I
 30

7. Mensuração da lactato desidrogenase (LDH)

Após interação entre os BMDMs WT, TLR-2-/- e TLR-4-/- e leveduras de S. brasiliensis

ATCC MyA-4823 durante 3, 6 e 12h, realizou-se a mensuração da lactato desidrogenase no
intuito de verificar se o fungo tinha a capacidade de matar esses macrófagos. Para isso, o
sobrenadante desse ensaio foi recolhido e 50 μL foram pipetados para uma placa de 96 poços.
Em seguida, adicionou-se 50 μL do substrato em cada poço e incubou-se por 30 minutos ao
abrigo da luz e sob temperatura ambiente. Decorrido esse tempo, adicionou-se 50 μL da
solução Stop. A leitura foi realizada na absorbância de 490nm (Promega-Cytotox Assay).

8. Dosagem de óxido nítrico (NO)

A quantificação de NO foi realizada pelo acúmulo de nitrito no sobrenadante da cultura de

células, após 3, 6 e 12h de interação de BMDMs com leveduras de S. brasiliensis, utilizando o
método espectrofotométrico da reação de Griess (Sigma-Aldrich). Após os períodos de
incubação, alíquotas de 50μL do sobrenadante da cultura de células foram transferidas para
uma placa de cultura de células estéril (96 poços-Corning, Inc.) e acrescidas de 50 μL de
solução de Griess (1g de sulfanilamida (Merk), 0,1g de dicloro N(1- naftil) etilenodiamina
(Merk), 2,5 mL de ácido ortofosfórico (Mallinckrodt Chemical) e água deionizada q.s.p 100
mL) e após 10 minutos de incubação em temperatura ambiente ao abrigo da luz, a absorbância
foi verificada em 540nm em espectrofotômetro (Multiskan Ascent, Labsystems) e os
resultados expressos em micromoles de nitrito.

9. Dosagem de citocinas in vitro (IL-6, IL-10 e TNF-α)

Os sobrenadantes foram centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos e armazenados a -

20°C até o momento do uso. A detecção de IL-6, IL-10 e TNF-α foi realizada pela técnica de
ELISA de captura, empregando-se kits comerciais (R&D Systems) e seguindo as instruções
do fabricante.

10. Cálculo do Índice de Fagocitose

Para o cálculo do índice fagocitose (IF), foram observadas, para cada lamínula, uma
média de 100 células, nas quais se determinou o número de leveduras fagocitadas (C), o
número de macrófagos com pelo menos uma levedura em seu interior (F) e o número de

CAPÍTULO I
 31

macrófagos totais observados (T). Com esses dados, o índice foi definido pela seguinte
fórmula:

IF = X X 100

11. Ensaio de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

A viabilidade do fungo no decorrer da interação foi avaliada pelo ensaio de Unidades

Formadoras de Colônia (UFC). Ao término de cada intervalo de interação, os BMDMs,
incubados com as leveduras foram lavados com solução de PBS 1x, para remoção das
leveduras não fagocitados, e lisados com 1 mL de solução 0.1% de Triton X-100. A seguir,
100 μL da suspensão foram cultivados em Ágar Sabouraud Dextrose por sete dias a
temperatura de 37°C. Ao final, o número de colônias crescidas foi contabilizado e, após
correção pelo fator de diluição, os resultados foram expressos em logaritmo da razão (log
UFC/mL).

12. Infecção in vivo

O protocolo de infecção foi adaptado da metodologia descrita por Nascimento et al.

(2008) e De Lima Franco et al. (2011). Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente com 5x106 leveduras/mL (ou com PBS 1X, como veículo controle).
Após 7, 14 e 28 dias de infecção os animais foram eutanasiados e procedeu-se a retirada do
fígado, baço, rins e cérebro. Os órgãos foram macerados e homogeneizados em 2 mL de PBS
1x. As suspensões obtidas foram empregadas para a análise d a carga fúngica e armazenadas
para a dosagem de citocinas.

13. Análise da carga fúngica - (UFC)

A carga fúngica nos órgãos coletados foi determinada pelo ensaio de UFC. Diluições
das suspensões de órgãos foram cultivadas em Ágar Sabourand Dextrose (DifcoT MBD) a
37°C. As colônias crescidas após 5-7 dias foram contabilizadas e corrigidas pelo fator de
diluição. Os resultados foram expressos como Logaritmo da razão do UFC/ g de órgão.

CAPÍTULO I
 32

14. Dosagem de citocinas nas suspensões de órgãos

As suspensões de órgãos foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e os

sobrenadantes foram coletados e armazenados a -20°C até o momento do uso. A detecção de
citocinas (IL-10, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-2) nestes sobrenadantes foi realizada pela
técnica de cytometric beads array (CBA) (BD bioscienses).

15. Análise Estatística

Os gráficos e os dados foram analisados pelo software Prism, versão 5 (GraphPad). O

tipo de análise estatística e o número de experimentos para cada ensaio estão descriminados
nas legendas de cada figura.

CAPÍTULO I
 33

RESULTADOS

1. Ausência de TLR-2 e TLR-4 em BMDMs prejudica a fagocitose de S. brasiliensis.

Avaliou-se o índice de fagocitose após a incubação de S. brasiliensis (MOI 5) com

BMDMs C57Bl/6, TLR-2-/- e TLR-4-/- por tempos de 3 e 6h. A fagocitose dos BMDMs
C57Bl/6 foi significativamente maior em 3h e 6h quando comparado a TLR-2-/- e TLR-4-/-
(figura 6A e 6B). Não foi possível determinar o índice de fagocitose, após 12h de interação,
devido a intensa destruição celular. O índice de fagocitose (IF) foi determinado por meio da
microscopia óptica, cuja representação visual está na figura 6C onde se comparou C57Bl/6 e
TLR-2-/- após 3h de interação. A confirmação e demonstração da fagocitose em BMDMs
C57Bl/6 foram obtidas por meio da microscopia eletrônica (figura 6D).

Figura 6. Ausência de TLR-2 e TLR-4 em B MDMs prejudica a fagocitose de S. brasiliensis. A) e B) Índice

de fagocitose comparativo entre BMDMs C57Bl/6 e TLR-2-/- e TLR-4 -/-, respectivamente. Os BMDMs foram
incubados com leveduras de S. brasiliensis (MOI 5), durante 3, 6 e 12 horas e a interação foi analisada por
microscopia óptica. C) Representação comparativa da fagocitose de BMDMs C57Bl/6 e TLR-2-/- após 3h de
interação C) Imagem obtida por microscopia elet rônica, após 6h de interação de BM DMs WT co m leveduras de
S. brasiliensis. Os ensaios de interação foram realizados em triplicata sendo representativos de três
experimentos independentes. A análise estatística empregada foi Two way -A NOVA e teste de Bonferroni. **
p<0, 05

CAPÍTULO I
 34

2. BMDMs deficientes em TLR-2 e TLR-4 exibem menor carga fúngica

BMDMs C57Bl/6, TLR-2-/- e TLR-4 -/- foram incubados com S. brasiliensis (MOI 5)
nos tempos de 3, 6 e 12 h. Posteriormente, plaqueou-se 100 µL do lisado celular. A ausência
de TLR-2 se refletiu em uma redução significativa da carga fúngica após 3 h de interação
(figura 7A). Quando analisamos o receptor TLR-4, também houve redução, porém ela foi
significativa apenas no tempo de 12h (figura 7B).

A) B)

Figura 7. Menor carga fúngica de S. brasiliensis na ausência dos receptores A) TLR-2 e B) TLR-4. Fungo
quantificado a partir do lisado de BMDMs incubados com leveduras de S. brasiliensis (MOI 5). Resultados de
três experimentos independentes expressos com desvio padrão. One way ANOVA e teste de Bonferroni. ** p<
0,05

CAPÍTULO I
 35

3. Ausência de TLR-2 e TLR-4 promove maior citotoxicidade nos BMDMs em resposta a

S. brasiliensis

A avaliação da citotoxicidade em resposta a S. brasiliensis foi determinada pelo ensaio

de LDH com os sobrenadantes coletados durante a interação com os BMDMs. Nos tempos de
6 e 12h houve maior produção de LDH em BMDMs TLR-2-/- quando comparado a BMDMs
C57Bl/6 (figura 8A). Para os BMDMs TLR-4 -/-, essa diferença foi observada no tempo de
12h (figura 8B). Como foi observado, após 12h de incubação, a ausência de TLR-2 e TLR-4
comprometeram consideravelmente a viabilidade dos BMDMs, prejudicando a análise do
índice de fagocitose, como vimos anteriormente na figura (6A e 6B).

A) B)

Figura 8. Maior citotoxici dade na ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4. Teste realizado após a incubação
de BMDMs C57Bl/6 e nocautes para TLR-2 e TLR-4 co m leveduras de S. brasiliensis (MOI 5) nos tempos de 3,
6 e 12h. Resultado representativo de 3 experimentos independentes. Two way -A NOVA e teste de Bonferroni.
*** p<0, 001.

CAPÍTULO I
 36

4. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 prejudicaram os mecanismos microbicidas

por meio da produção de NO

No intuito de verificar o impacto da ausência de TLR-2 e TLR-4 nos mecanimos

microbicidas de BMDMs, foi analisada a produção de óxido nítrico no sobrenadante da
interação de BMDMs C57Bl/6, TLR-2-/- e TLR-4-/- após 3, 6 e 12h. Tanto na ausência do
receptor TLR-2, quanto na ausência de TLR-4, após 12h de interação com S. brasiliensis,
verificou-se que a produção de NO foi prejudicada (figura 9 A e B).

A)
B)

Figura 9. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 prejudicou a produção de NO após 12h de interação.
Ensaio realizado pelo método de Griess. Teste realizado após a incubação de macrófagos obtidos da medula de
camundongos C57Bl/6 e nocautes para TLR-2 e TLR-4 co m leveduras de S. brasiliensis (MOI 5) nos tempos de
3, 6 e 12h. Resultado representativo de 3 experimentos independentes. Two way -A NOVA e teste de Bonferroni.
*** p<0, 001.

CAPÍTULO I
 37

5. Ausência do receptor TLR-4 resultou em baixa produção in vitro de TNF-α e da

citocina anti-inflamatória IL-10

Após os períodos de incubação (3, 6, 12 h) de BMDMs C57Bl/6, TLR-2-/- e TLR-4-/-

com leveduras de S. brasiliensis foi analisada comparativamente a produção de citocinas pró-
inflamatórias (IL-6 e TNF-α) e da citocina anti-inflamatória IL-10.
Na ausência do receptor TLR-2, foi observada uma baixa produção de citocinas (IL-6,
IL-10 e TNF-α) in vitro, no entanto, essas diferenças não foram significativas quando
comparadas a BMDMs C57Bl/6 (figura 10). Já na ausência do receptor TLR-4, observamos
uma diminuição nos níveis de TNF-α (após 6h) e IL-10 (após 12h), quando comparado a
BMDMs C57Bl/6 (figura 11). Enquanto BMDMs C57Bl/6 exibem um aumento de TNF-α
após 6h de interação, seguida pela sua redução em 12h, nenhum dos nocautes avaliados
produziu quantidades relevantes no mesmo período. Os resultados sugerem que in vitro,
especialmente o receptor TLR-4 é importante na produção de citocinas.

CAPÍTULO I
 38

Figura 10. Perfil de secreção de citocinas pró-inflamatórias e anti -inflamatóri a na ausência de TLR-2 após a interação in vitro com S. brasiliensis. Multip licidade de
infecção 5 (MOI 5). Aplicação de técnica de ELISA de captura para mensuração dos níveis de citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6 no sobrenadante do ensaio de cinética entre
macrófagos e leveduras de S. brasiliensis. A análise estatística empregada foi Teste de Bonferron i para múlt iplas comparações. S.b: Sporothrix brasiliensis ***p<0,001.
Limites de detecção: IL-6: 15.60 - 1,000 pg/mL, IL-10: 31.20 - 2,000 pg/mL, TNF-α: 31.20 - 2,000 pg/mL

CAPÍTULO I
 39

Figura 11. Perfil de secreção de citocinas pró-infl amatóri as e anti-inflamatóri a na ausência de TLR-4 após a interação in vitro com S. brasiliensis. Mu ltiplicidade de
infecção 5 (M OI 5). Aplicação de técnica de ELISA de captura para mensuração dos níveis de citocinas TNF-α IL-10 e IL-6 no sobrenadante do ensaio de cinética entre
macrófagos e leveduras de S. brasiliensis. A análise estatística empregada foi Teste de Bonferron i para múlt iplas comparações. S.b: Sporothrix brasiliensis ***p<0,001.
Limites de detecção: IL-6: 15.60 - 1,000 pg/mL, IL-10: 31.20 - 2,000 pg/mL, TNF-α: 31.20 - 2,000 pg/mL

CAPÍTULO I
 40

6. Ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 promove maior disseminação de S.

brasiliensis
Confirmada a importância de TLR-2 e TLR-4 em macrófagos no sistema in vitro, em
seguida, foi investigada sua relevância in vivo. Empregando o modelo de infecção
intraperitoneal (5x 106 leveduras), avaliou-se primeiramente como a colonização do fígado,
baço, rins e cérebro seria influenciada pela deficiência de TLR-2 e TLR-4, após 7, 14 e 28
dias. Para ambos os receptores, na sua ausência, após 14 e 28 dias de infecção, verificou-se
que houve maior carga fúngica nos órgãos como fígado, baço e rins, qua ndo comparados aos
animais C57Bl/6 (figura 12 e 13). Após 7 dias de infecção, não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos analisados.
Na ausência do receptor TLR-2, após 14 dias de infecção, verificou-se maior carga
fúngica no fígado, baço e rins. No entanto, após 28 dias de infecção, apesar das altas cargas
fúngicas em ambos os grupos (C57Bl/6 e TLR-2-/-), as diferenças foram significativas apenas
no baço (figura 12). Quando foi avaliado o receptor TLR-4, após 14 dias de infecção com S.
brasiliensis, sua ausência revelou maior carga fúngica no fígado, baço e rins, quando
comparado a animais C57Bl/6. Após 28 dias de infecção, essa diferença manteve-se para
órgãos como o fígado e baço (figura 13). Quando verificamos a carga fúngica no céreb ro, não
observamos crescimento fúngico para todos os grupos testados. Esses dados sugerem que
TLR-2 e TLR-4 são importantes no controle da infecção por S. brasiliensis.

CAPÍTULO I
 41

Figura 12. Elevada carg a fúngica no fígado, baço e rins de camundongos nocautes para TLR-2 após 7, 14 e 28 dias de infecção com S. brasiliensis. Os camundongos
C57Bl/6 WT (n=5) e nocautes para TLR-2 (n=5) foram infectados com 5x106 leveduras de S. brasiliensis e as unidades formadoras de colônias foram recuperadas no 7°, 14°
e 28° dia de infecção. A análise estatística foi realizada pelo teste de Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 42

Figura 13. Elevada carga fúngica no fígado, baço e rins de camundong os nocautes para TLR-4 após 7, 14 e 28 di as de infecção com S. brasiliensis. Os camundongos
C57Bl/6 (n=5) e nocautes para TLR-4 (n=5) foram infectados com 5x106 leveduras de S. brasiliensis e as unidades formadoras de colônias foram recuperadas no 7°, 14° e 28°
dias de infecção. A análise estatística foi realizada pelo teste de Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 43

7. Ausência de TLR-2 e TLR-4 prejudica a produção de citocinas nos primeiros 14 dias

de infecção com S. brasiliensis.

Os camundongos C57Bl/6 e nocautes para TLR-2 e TLR-4 foram infectados com

5x106 leveduras/mL de S. brasiliensis por um período de 7, 14 e 28 dias. Foi analisada a
produção de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF-α no macerado do fígado, baço e
rins.
Nos primeiros 7 dias de infecção, verificou-se que a ausência de TLR-2 prejudicou a
produção de IL-6 (baço), IL-17 (fígado e rins), IFN-γ (baço) e TNF-α (baço), quando
comparado a camundongos C57Bl/6 (figura 14). Para as demais citocinas analisadas,
observou-se diferenças apenas entre os grupos controles e infectados. Após 14 dias de
infecção, verificou-se que as secreções de IL-6 e TNF-α (baço) na ausência de TLR-2 foram
prejudicadas (figura 15). No entanto, após 28 dias de infecção, nos rins e baço de
camundongos TLR-2-/- houve um aumento da produção de IL-17, quando comparado aos
animais C57Bl6 (figura 16). Para as demais citocinas analisadas, não foram encontradas
diferenças significativas.
Verificando a importância de TLR-4 na produção de citocinas foi observado que após
7 dias de infecção, detectou-se baixos níveis de IL-6, IFN-γ e TNF-α no baço de animais
TLR-4-/- quando comparados a animais C57Bl/6 (figura 17). Após 14 dias de infecção, as
diferenças ocorreram para IFN-γ (baço) e IL-6 (baço e rins) (figura 18). Assim como ocorreu
para TLR-2-/-, na ausência de TLR-4, após 28 dias de infecção, houve um aumento na
produção de citocina nos rins, e diferentemente de TLR-2-/- cujo aumento foi de IL-17, nesse
caso, houve um aumento de IL-6 (rim) quando comparado a camundongos C57Bl/6 (figura
19). As demais citocinas analisadas apresentaram diferenças estatísticas apenas entre os
grupos controle e infectados. Os resultados permitem concluir que a ausência de TLR-2 e
TLR-4 prejudicam a produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção.

CAPÍTULO I
 44

Figura 14. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-2 após 7 di as de infecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente com 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 7 dias foram eutanasiados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como média + desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/mL. A aná lise estatística foi realizada pelo teste de
Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 45

Figura 15. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR -2 após 14 di as de i nfecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente com 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 7 dias foram eutanasiados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como média + desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/mL. A aná lise estatística foi realizada pelo teste de
Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 46

Figura 16. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR -2 após 28 di as de i nfecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente co m 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 28 dias foram eutanasiados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como méd ia +desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos independentes. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/mL. A análise estatística foi realizada pelo
teste de Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 47

Figura 17. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR-4 após 7 di as de infecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram in fectados
intraperitonealmente com 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 7 dias foram eutanasiados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como média +desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/ mL. A análise estatística foi realizada pelo teste de
Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 48

Figura 18. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR -4 após 14 di as de i nfecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente co m 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 14 dias foram eutanaziados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como média +desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/ mL. A análise estatística foi realizada pelo teste de
Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 49

Figura 19. Análise da produção de citocinas na ausência do receptor TLR -4 após 28 di as de i nfecção com S. brasiliensis. Grupos de 5 camundongos foram infectados
intraperitonealmente co m 5 x106 UFC/ mL de S. brasiliensis e após 28 dias foram eutanasiados. As citocinas foram quantificadas a partir do macerado dos órgãos e expressas
como méd ia +desvio padrão. Resultados referentes a 3 experimentos independentes. Os níveis de citocinas estão sinalizados em pg/mL. A análise estatística foi realizada pelo
teste de Bonferroni, para múltiplas comparações. * p< 0,05, ** p<0,01, ***p<0,001.

CAPÍTULO I
 50

DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento na incidência de infecções fúngicas,

especialmente em pacientes imunocomprometidos (LEONART et al., 2017). Portanto, é
fundamental a compreensão de como a resposta imune funciona a partir da interação das
células com o agente infeccioso e posteriormente com a deflagração do processo inflamatório.
O reconhecimento dos microrganismos por meio dos PRRs dirige a resposta imune inata por
meio da indução de quimiocinas e citocinas inflamatórias que irão coordenar o recrutamento
de neutrófilos em resposta à ativação de macrófagos (AKIRA; TAKEDA; KAISHO, 2001).
Sabe-se que os macrófagos são a principal população de células envolvidas na proteção do
hospedeiro e têm a capacidade de eliminar o Sporothrix spp por meio da fagocitose (ODA et
al., 1983; CARLOS et al., 1994). Sendo assim, os questionamentos que dirigiram nosso
estudo são os seguintes: Qual a importância dos receptores TLR-2 e TLR-4 presentes nos
macrófagos no reconhecimento e desencadeamento da resposta imune frente a S. brasiliensis?
Qual o impacto da ausência desses receptores no modelo murino de infecção com S.
brasiliensis?
O receptor TLR-2 detecta vários componentes presentes em bactérias e fungos,
principalmente lipoproteínas de bactérias e tri/ diacilatolipopeptídeos (TAKEUCHI, OSAMU;
AKIRA, 2010). Já o receptor TLR-4 é expresso principalmente em monócitos, neutrófilos,
macrófagos e DCs. Ele foi inicialmente identificado como a molécula responsável por
reconhecimento de LPS e após sua ativação, os macrófagos podem se tornar células efetoras
que liberam citocinas pró- inflamatórias e espécies reativas do oxigênio para eliminar os
antígenos estranhos (MEDZHITOV et al., 1997; MARTINEZ; HELMING; GORDON,
2009).
Apesar da importância de TLR-2 e TLR-4 estar estabelecida para a espécie S.
schenckii (SASSA et al., 2009; SASSA et al., 2012; NEGRINI et al., 2012), com a
emergência da espécie S. brasiliensis, estudos acerca da resposta imune tornam-se
necessários. As principais diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii referentes
a perfil epidemiológico, virulência, patogenicidade, bem como, reconhecimento por células
mononucleares de sangue periférico humano, estão bem estabelecidas (FERNANDES et al.,
2012; RODRIGUES et al., 2015; MARTÍNEZ-ÁLVAREZ et al., 2017). No intuito de
determinar a dependência desses receptores no desencadeamento de uma resposta imune

CAPÍTULO I
 51

durante a infecção por S. brasiliensis, foram realizados ensaios de interação in vitro e ensaios
de infecção in vivo.
Os resultados in vitro aqui encontrados para S. brasiliensis revelam a importância dos
receptores TLR-2 e TLR-4 em BMDMs e corroboram com os observados para S. schenckii,
onde a sua ausência promove redução do número de leveduras internalizadas e a diminuição
da produção de mediadores pró e anti- inflamatórios (CARLOS et al., 2003; SASSÁ et al.,
2009; NEGRINI et al., 2012). Dentre eles, o NO é amplamente reconhecido como uma
molécula microbicida essencial para a atividade fungicida de macrófagos frente a S. schenckii
(FERNANDES et al., 2000). A baixa produção de NO na ausência de TLR-2 e TLR-4,
suporta a hipótese de que a interação receptor-fungo foi prejudicada, consequentemente,
houve uma insuficiente ativação de macrófagos na ausência desses receptores e assim
estímulos menos eficientes para a síntese de NO (GODALY et al., 2001). A elevada produção
de LDH, na ausência de TLR-2 e TLR-4, mostra que a depuração do patógeno também foi
prejudicada (LABBE & SALEH, 2008). As análises microscópicas mostram que na ausência
dos receptores, houve crescimento dos fungos no interior dos BMDMs, que provavelmente
acarretou maior morte celular. Assim, acredita-se que a ausência desses receptores promove
um microambiente favorável ao crescimento e desenvolvimento do fungo. Em relação à
produção de citocinas, a ausência de TLR-4, prejudicou significativamente a produção desses
mediadores in vitro (TNF-α e IL-10). De maneira geral, nos camundongos C57Bl/6 infectados
com S. brasiliensis, houve uma baixa produção de citocinas, no entanto, foi observado um
pico na produção de TNF-α em 6h. Esse dado corrobora aos encontrados por Fernandes et al.,
(2008) na infecção inicial de camundongos WT com S. schenckii. Os dados encontrados nas
análises in vitro, indicam que a sinalização por TLR-2 e TLR-4 é importante na deflagração
da resposta imune inata, sendo que na ausência de TLR-4 in vitro teve maior impacto, visto
que, além de prejudicar significativamente a fagocitose e a produção de óxido nítrico, a
produção de TNF-α e IL-10 também foi afetada.
Sabe-se que a produção e liberação de mediadores pró- inflamatórios durante a
infecção in vivo dependem em grande parte da ativação de receptores TLR-2 e TLR-4, como
foi observado na infecção por S. schenckii, Paracoccidioides brasiliensis, C. albicans,
Aspergillus fumigatus e Pneumocystis jirovecii (BELLOCCHIO et al., 2004; DING et al.,
2005; NAKAMURA et al., 2006; GASPAROTTO et al., 2010; LEAL et al., 2010; SASSA et
al., 2012). Quando foi analisada a importância dos receptores TLR-2 e TLR-4 no sistema in
vivo de infecção sistêmica por S. brasiliensis, observou-se que na ausência desses receptores,

CAPÍTULO I
 52

as cargas fúngicas dos órgãos foram significativamente maiores quando comparadas aos
camundongos C57Bl/6 após 14 e 28 dias. Esse aumento da carga fúngica nos órgãos dos
animais TLR-2-/- e TLR-4 -/- pode estar associado a uma produção reduzida de citocinas pró-
inflamatórias (IL-6, TNF-α e IFN-γ) durante os primeiros 14 dias de infecção, conduzindo a
multiplicação de leveduras de S. brasiliensis.
A importância do receptor TLR-2 é estabelecida frente a S. schenckii, e mostra que o
mesmo é necessário à produção de IL-6 e IL-8 por queratinócitos humanos (LI et al., 2012).
Resultados similares aos aqui encontrados também foram relatados para C. albicans, onde a
fagocitose e a produção de quimiocinas exibiram um comportamento TLR-2 dependente,
sendo necessário à quimiotaxia de neutrófilos para os locais de infecção, e cuja ausência
promoveu a disseminação do patógeno (TESSAROLLI et al., 2010). O bloqueio de TLR-2 foi
capaz de inibir 60-75% a produção de TNF-α e IL-1β em resposta a C. albicans,
demonstrando que a indução de citocinas pró- inflamatórias é parcialmente, e não
exclusivamente, mediada por TLR-2 (NETEA et al., 2002). Também em concordância com
este estudo, o estudo do papel de TLR-2 na resposta imune frente à A.
actinomycetemcomitans mostrou baixo percentual de fagocitose de macrófagos e neutrófilos
TLR-2-/- quando comparado a WT, conduzindo a um aumento na gravidade da infecção
(GELANI et al., 2009). Camundongos nocautes para TLR-2, infectados com Streptococcus
pneumoniae, bactéria causadora da meningite bacteriana, tiveram agravamento da doença,
apresentando maiores títulos bacterianos no sistema nervoso central (KOEDEL et al., 2003).
Da mesma forma, na infecção por S. aureus, camundongos nocautes para TLR-2 e MyD88
apresentaram maior carga bacteriana e elevada mortalidade (TAKEUCHI et al., 2000).
Interessantemente, verificou-se aqui, que a ausência de TLR-2 após 28 dias de infecção,
promoveu um aumento de IL-17 nos rins e baço, sugerindo o surgimento de um padrão de
resposta Th17, sendo que para os camundongos C57Bl/6 infectados com S. brasiliensis houve
uma polarização de resposta Th1 durante o todo o curso de infecção.
Sabe-se que anticorpos protetores e as células CD4+ Th1 e Th17 são elementos
fundamentais na resposta imune frente a S. schenckii (FRANCO et al., 2012; ALMEIDA et
al., 2015; FERREIRA et al., 2015; VERDAN et al., 2012; LIU et al., 2016). As citocinas
padrão Th17 estão sabidamente envolvidas no controle de infecções causadas pelos fungos
Candida e Aspergillus, particularmente em condições de deficiência de resposta Th1
(ROMANI, 2011). A IL-17 é uma potente citocina inflamatória envolvida na amplificação
imune e é produzida principalmente por células CD4 + Th17, embora outras células também

CAPÍTULO I
 53

são relatadas como produtoras de de IL-17 (KORN et al., 2007). Reforçando os resultados
aqui encontrados, o mesmo foi observado por Negrini et al. (2012), na infecção de
macrófagos esplênicos por S. schenckii. Verificou-se que na ausência de TLR-2, além da
baixa produção de citocinas pró- inflamatórias e NO, houve maior produção de IL-17 quando
comparada a animais WT, mostrando que a ausência de citocinas de padrão Th1 nos animais
TLR2-/- coincidiu com a produção de IL-17 (NEGRINI et al., 2012). Loures et al. (2009)
avaliaram o papel do TLR-2 em modelo experimental de infecção pulmonar crônica induzida
pelo Paracoccidioides brasiliensis e também observaram que macrófagos provenientes de
camundongos TLR-2-/- apresentaram resposta polarizada para Th17. O aumento de IL-17 na
ausência de TLR-2 também foi observado em abscessos cerebrais na infecção por S. aureus.
Uma possível explicação seria que esses animais possam exibir infiltrados Th17 que
compensem funcionalmente a perda de sinais dependentes de TLR-2 por meio dos efeitos pró-
inflamatórios da IL- 17. No caso em estudo, a IL-17 potencializou a liberação de quimiocinas
a partir de macrófagos estimulados por TNF-α. Logo, a resposta exagerada de IL-17 que
ocorre em camundongos TLR-2-/- pode ser um mecanismo compensatório para facilitar o
controle da progressão da doença (NICHOLS et al., 2009), como já foi observado na infecção
causada pelo fungo do gênero Coccidioides, onde a produção de IL-17 promoveu o
recrutamento de neutrófilos para os pulmões e reparação tecidual (LIN et al., 2010). Estudos
mostram que em um modelo murino de infecção sistêmica por C. albicans a deleção do gene
de TLR-2 proporcionou uma produção muito diminuída de citocinas Th1 (IFN-γ, IL-12 e
TNF-α) em comparação com os animais controle, no entanto, eles foram igualmente capazes
de montar uma resposta humoral específica (VILLAMON et al., 2004), o que sugere que a
ausência desse receptor faz com que o sistema imune desses animais utilize outras vias na
tentativa de combate aos patógenos.
Assim como para TLR-2, o papel de TLR-4 não é descrito na infecção por S.
brasiliensis, no entanto, ele é sabidamente envolvido no reconhecimento de S. schenckii e
outras espécies fúngicas, tais como: C. albicans, Aspergillus sp, Cryptococcus neoformans,
Paracoccidioides brasiliensis e Pneumocystis jirovecii (SASSA et al., 2012; NETEA et al.,
2002; GASPAROTO et al., 2010; NAKAMURA et al., 2006; LOURES et al., 2010; LEAL et
al., 2010). A ausência de sinais mediados por TLR-4 foi descrito por causar um aumento da
susceptibilidade a candidíase disseminada. Este efeito estaria associado com uma diminuição
da liberação da quimiocinas, tais como CXCL1, proteína inflamatória de macrófagos MIP-2 e
CXCL2, além de prejudicar o recrutamento de neutrófilos para o local da infecção. Além

CAPÍTULO I
 54

disso, polimorfismos de TLR-4 estão envolvidos com a susceptibilidade a candidíase grave

em seres humanos (NETEA et al., 2002). Em concordância, Gasparoto et al., (2010)
mostraram que, na ausência de TLR-4, o influxo de neutrófilos em resposta a C. albicans na
cavidade peritoneal foi significativamente reduzido. Assim, a ausência de TLR-4 poderia estar
prejudicando o mecanismo de ativação do sistema imune e promo vendo ineficiente
ingestão/eliminação das leveduras do fungo. Estudos similares mostram que macrófagos
provenientes de camundongos nocautes para TLR-4 produzem menos TNF-α e IL-1β, quando
estimulados com conídios de A. fumigatus (NETEA et al., 2003). Em modelo de infecção por
C. neoformans, no entanto, os resultados são diferentes. Nakamura et al., (2006) não
encontraram nenhuma diferença na produção de IL-1β, IL-6, IL-12p40 e TNF-α no pulmão de
camundongos nocautes para TLR-2 e TLR-4, quando comparado a camundongos WT. Após
28 dias de infecção, na ausência de TLR-4, observou-se aumento a produção de IL-6. A IL-6
é uma citocina pró- inflamatória, envolvida no na resolução da esporotricose (REED et al.,
1993), e nesse estudo provavelmente atua permitindo o controle da doença após 28 dias de
infecção.
O modelo de infecção disseminada por S. brasiliensis empregado nesse estudo revelou
que o baço foi o principal órgão da infecção, mostrando alta carga fúngica na ausência dos
receptores e produzindo altos níveis de citocinas, especialmente nos camundongos C57Bl/6.
Sabe-se que durante a infecção, o desenvolvimento da inflamação, gera aumento de peso e
tamanho do baço, que foi verificado em nosso estudo (dados não mostrados), já que este
órgão desempenha um papel fundamental na eliminação de patógenos e, portanto, é
submetido a aumento de infiltração celular e produção de exsudado (ALTAMURA et al.,
2001; MIRKOV et al., 2011).
Com base nos dados encontrados nesse trabalho, foi demonstrado que os receptores
TLR-2 e TLR-4 são importantes no desencadeamento da resposta imune por macrófagos in
vitro frente a S. brasiliensis. A análise in vivo demonstrou que a ausência de TLR-2 e TLR-4,
prejudicou o desenvolvimento de uma resposta Th1 principalmente nos primeiros 14 dias de
infecção. Após 28 dias de infecção, especificamente para TLR-2-/-, houve o desencadeamento
de uma resposta padrão Th17 e quando observada a ausência de TLR-4, o aumento da
citocina IL-6, sugerindo mecanismos de controle da esporotricose. Um dado interessante a ser
notado é que a ausência de um receptor provavelmente faz com que o sistema imune venha
utilizar outras vias de sinalização na tentativa de combater o patógeno, o que não exclui a
possibilidade de outros receptores estarem envolvidos na resposta induzida pelo fungo S.

CAPÍTULO I
 55

brasiliensis. Uma vez que grande parte dos fungos que são reconhecidos TLR-2 e também são
reconhecidos pelo TLR-4, seria significativo avaliar o sinergismo entre esses dois TLRs no
contexto da infecção fúngica por S. brasiliensis.

CAPÍTULO I
 56

CONCLUSÕES

I. A ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 em BMDMs prejudica a fagocitose de S.

brasiliensis. Isso foi evidenciado por um menor número de leveduras internalizadas e
consequente diminuição da carga fúngica e mecanimos microbicidas prejudicados
após os tempos de interação estudados. Especificamente, TLR-4 interfere na produção
de citocinas de forma significativa. Isso mostra a dependência desses receptores no
reconhecimento e desencadeamento da resposta imune in vitro frente à S. brasiliensis.

II. Na ausência dos receptores TLR-2 e TLR-4 houve maior disseminação de S.

brasiliensis nos órgãos como fígado, baço e rins durante todo o período investigado
(28 dias).

III. Nos primeiros 14 dias de infecção houve a polarização de uma resposta Th1 nos
camundongos C57Bl/6, e durante esse mesmo período a produção de citocinas
mostrou ser dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4.

IV. Na ausência do receptor TLR-2 verificou-se a polarização de uma resposta Th17 após
28 dias de infecção, possivelmente como uma tentativa de controle da infeção.

V. Na ausência de TLR-4, foi prejudicada a produção de citocinas, no entanto, após 28

dias de infecção houve um aumento de IL-6, citocina sabidamente importante na
resolução da esporotricose.

Os dados apresentados nos permitem concluir que TLR-2 e TLR-4 são importantes no
desencadeamento de uma resposta imune frente a S. brasiliensis, principalmente nos
primeiros 14 dias de infecção. Tardiamente, possivelmente outros mecanimos estão
envolvidos na resolução da doença. Assim, estudos que investiguem a utilização de outras
vias de sinalização, bem como mecanismos compensatórios e o sinergismo desses receptores
no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da
fisiopatologia dessa doença.

CAPÍTULO I
 57

CAPÍTULO II
Investigação de proteínas envolvidas na virulência e evasão do sistema imune
diferencialmente expressas em S. brasiliensis.

CAPÍTULO I
 58

1. Patogenicidade e virulência de fungos

A patogenicidade é a capacidade de um microrganismo infectar o hospedeiro e causar

doença. A patogenicidade de um fungo depende da sua capacidade de adaptação às condições
do ambiente e resistência frente às defesas do hospedeiro. Os determinantes da patogenicidade
são chamados de fatores de virulência. Logo, a virulência é referida como a capacidade de um
patógeno multiplicar-se e causar danos ao hospedeiro (CASADEVALL, 2007). Embora
virulência seja uma característica do microrganismo, esta pode ser determinada por múltiplas
interações entre o microrganismo e o hospedeiro (CHANG et al., 2003). Os fatores de
virulência podem ser produtos diretos da expressão gênica (proteínas), ou produtos de
caminhos biossintéticos complexos, como por exemplo, polissacarídeos ou mediadores
lipídicos. A importância dos fatores de virulência é determinada verificando a resposta
biológica de fungos na presença e ausência desses fatores. Os microrganismos patogênicos
possuem uma série de fatores e mecanismos de virulência que possibilitam a sua
sobrevivência, escape frente ao sistema imune e persistência no hospedeiro resultando em
danos teciduais e doença. Para fungos de forma geral, os principais fatores de virulência
incluem adesinas, proteases, dimorfismo térmico e tolerância a 37°C, que são de extrema
importância para a sobrevivência e disseminação no hospedeiro (IYALLA et al., 2017). Sabe-
se que a patogênese e a virulência são mecanismos complexos, com uma combinação de
propriedades, e a investigação da expressão de fatores de virulência em microrganismos
sabidamente virulentos é de extrema importância.

2. Principais fatores de virulência para Sporothrix spp.

Dentro do complexo Sporothrix, há variações na virulência entre espécies. Em modelo

murino de esporotricose experimental, S. brasiliensis foi a espécie mais virulenta, no que
tange à mortalidade e ao dano tecidual, seguido por S. schenckii e S. globosa (ARRILLAGA-
MONCRIEFF et al., 2009). Com relação a aspectos histopatológicos, leveduras de S.
schenckii foram encontradas no centro de granulomas hepáticos, ao passo que, S. brasiliensis
foi encontrado extensivamente nas células de Kupffer, mostrando semelhança com a infecção
por Histoplasma capsulatum (ARRILLAGA-MONCRIEFF et al., 2009). Ensaios de
sobrevivência revelaram que, após 40 dias de infecção, a cepa S. brasiliensis ATCC MyA-
4823, a mesma utilizada no presente estudo, conduziu 100% dos camundongos a óbito. Nesse
mesmo estudo, concluiu-se que os isolados de S. brasiliensis apresentam-se mais virulentos
nos modelos murino de esporotricose subcutânea quando comparado aos isolados de S.

CAPÍTULO II
 59

schenckii (SANCHES, 2013). Estudo desenvolvido por Mario et al., (2015) mostraram que a
infecção intravenosa com S. brasiliensis (2x107 UFC/mL), na ausência de qualquer tratamento,
acarretou no óbito dos camundongos entre os dias 14 e 18. Em um modelo similar, a
mortalidade foi observada no 26° dia após a infecção (ISHIDA et al., 2015).

Dentre os fatores necessários sabidamente conhecidos para Sporothrix sp, os quais

estão envolvidos na virulência e evasão ao sistema imune, temos: a secreção de fatores
tóxicos por vesículas extracelulares (ALBUQUERQUE et al., 2008; RODRIGUES et al.,
2008; O'MEARA et al., 2015), adesão e dimorfismo térmico. O dimorfismo térmico presente
em fungos patogênicos como Blastomyces, Histoplasma, Paracoccidioides, Coccidioides e
Talaromyces, é essencial para a virulência em hospedeiros mamíferos (KLEIN & TEBBETS,
2007). O dimorfismo relaciona-se a alterações na composição da parede celular, presença de
moléculas antigênicas e à expressão de componentes envolvidos na virulência. Nas infecções
por Sporothrix spp. o dimorfismo térmico é de grande importância, já que a transmissão por
leveduras foi associada a formas mais graves da doença. Isto permitiu concluir que a forma de
levedura é mais virulenta do que a forma filamentosa (KLEIN & TEBBETS, 2007). Além do
dimorfismo, alguns fatores de virulência comumente associados à patogênese do gênero
Sporothrix spp são: adesinas, enzimas extracelulares, melanina, termotolerância, presença de
ácido siálico e composição da parede celular (BARROS et al., 2011).

A adesão de microrganismos patogênicos aos tecidos hospedeiros é considerada como

o primeiro e maior passo na colonização e disseminação (VARTIVARIAN, 1992). A adesão
entre células, ou entre célula e matriz extracelular, é observada em alguns microrganismos tais
como, P. brasiliensis, B. dermatitidis, H. capsulatum e C. neoformans, e ocorrem quando
essas leveduras possuem moléculas na sua parede celular, ou cápsula, que permitem a adesão
ou disseminação da célula fúngica para outros tecidos. A aderência fúngica ao tecido do
hospedeiro tem papel crítico na infecção (JIMENEZ-LUCHO et al., 1990).

Uma adesina bem caracterizada em Sporothrix spp. é a glicoproteína de 70kDa (gp70)

(NASCIMENTO et al., 2008). Esta glicoproteína está localizada na superfície de isolados de
S. schenckii e S. brasiliensis, sendo capaz de mediar a interação do fungo à fibronectina
(CASTRO et al., 2013). Contudo, análises da expressão de gp70 mostraram q ue ela é pouco
expressa na superfície das leveduras da cepa S. brasiliensis ATCC MyA-4823. Tais resultados
sugerem que a quantidade de gp70 na superfície celular deste patógeno possa ter relação com

CAPÍTULO II
 60

sua virulência, justificando também um desequilíbrio observado na resposta imune protetora

induzida por esse antígeno (ALMEIDA, 2012; TEIXEIRA, 2011).

A capacidade de sobreviver e replicar a 37 °C parece ser uma propriedade comum aos

fungos patogênicos. Este fenômeno conhecido como termotolerância, é observado em
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum e Sporothrix schenckii (CASADEVALL
et al., 2007). Isolados de C. neoformans que não crescem de forma eficiente a 37°C são
incapazes de provocar infecção letal em camundongos (RHODES, 1988). Além disso, sabe-se
que as cepas de baixa virulência de H. capsulatum requerem um tempo maior de transição de
micélio para levedura a 37ºC, enquanto que cepas virulentas são capazes de suportar
mudanças drásticas de temperatura e conseguem transformar-se rapidamente (MEDOFF et al.,
1986). A termotolerância também parece ser um fator importante para o desenvolvimento de
algumas formas clínicas de esporotricose. Alguns estudos demonstraram que cepas de S.
schenckii isolados de lesões extracutâneas parecem ter algum (ns) fator(es) de virulência que
os permitem causar lesão visceral, uma vez que, estes isolados extracutâneos crescem muito
bem in vitro a 37ºC. Isolados capazes de crescer a 35ºC, mas incapazes de fazê-lo a 37ºC, não
causam linfangites, limitam-se a infecções cutâneas fixas. Já os isolados de lesões
linfangíticas, disseminadas e extracutâneas apresentam tolerância e crescimento a 37ºC
(KWON-CHUNG & BENNETT, 1992; TACHIBANA; MATSUYAMA; MITSUYAMA,
1999). Estudos mostram que a termotolerância entre S. schenckii e S. brasiliensis é
semelhante, no entanto, para S. brasiliensis, parece não estar relacionada às formas clínicas
(ALMEIDA-PAES et al., 2015).

A presença de melanina também tem sido relacionada à virulência de vários fungos

patogênicos. A melanina é hidrofóbica e protege contra condições severas, tais como,
radiação UV, aumento da temperatura e também protege contra espécies reativas de oxigênio
(ROS) (CASADEVAL et al., 2007). Em S. schenckii, a melanina protege os conídios de
danos oxidativos por radicais livres e luz ultravioleta e confere a lta resistência à fagocitose
pelos macrófagos (ROMERO-MARTINEZ et al., 2000). As células leveduriformes também
podem produzir pigmentos semelhantes à melanina in vivo e in vitro, sendo que a sua
presença, além de estar envolvida com a virulência, atua reduzindo os efeitos do tratamento
(MORRIS-JONES et al., 2003; MARIO et al., 2015). Especificamente com relação a S.
brasiliensis, estudos mostram que a rápida melanização e altos níveis de pigmentação, são em
parte devido à associação entre S. brasiliensis e gatos, pois esses animais possuem o hábito de

CAPÍTULO II
 61

enterrar urina e fezes no solo, onde podem ser infectados com micélio intensamente
melanizado de S. brasiliensis (ALMEIDA-PAES et al., 2015).

Os resíduos de ácido siálico são expressos na superfície celular do S.schenckii

(ALVIANO et al., 1982). A contribuição de moléculas de ácido siálico na virulência de
Sporothrix sp. é explicada pelo fato de células leveduriformes do fungo possuírem dupla
camada rica em resíduos de ácido siálico, enquanto as hifas possuem apenas uma. Estes
resíduos protegem as células da fagocitose por macrófagos peritoneais em camundongos.
Estes resíduos podem ainda ser liberados, formando agregados que interagem com os
anticorpos e outros elementos do sistema imune, deixando o fungo livre para proliferar e
invadir os tecidos (ODA et al., 1983). Corroborando esta pesquisa, a remoção enzimática dos
resíduos de ácido siálico das formas infectantes de S. schenckii os tornam mais suscetíveis à
fagocitose (ALVIANO, TRAVASSOS, SCHAUER, 1999).

Os fungos em meio de cultura secretam várias enzimas hidrolíticas tais como

proteinases, lipases e fosfolipases. Essas enzimas desempenham um papel fundamental no
metabolismo de fungos, e estão envolvidas na patogênese da infecção causando danos às
células hospedeiras (KUROKAWA et al., 1998). Especificamente, as proteases são enzimas
que auxiliam na invação da pele e tecidos. A capacidade de S. schenckii de invadir a pele e
tecidos cutâneos sugere a presença dessas proteases. Neste sentido, Tsuboi et al. (1987)
observaram que duas proteases (protease I e II) são secretadas por S. schenckii no meio de
cultura, sendo capazes de hidrolisar colágeno tipo I e elastina, que são componentes
naturais do extrato córneo humano. Isso sugere que as diferenças na composição da parede
celular podem influenciar o desencadeamento da infecção (TSUBOI et al., 1987). Com
relação às proteases, bem como o ácido siálico, não foram encontrados estudos específicos
relacionados à S. brasiliensis.

O papel da urease nas leveduras de S. schenckii não é bem estabelecido. A produção

de urease é variável e foi observada quando as novas espécies do complexo Sporothrix foram
descritas. A produção de urease difere entre as espécies do complexo Sporothrix, uma vez que
S. brasiliensis produz níveis mais elevados de urease que S. schenckii (ALMEIDA-PAES et
al., 2011). A produção de urease em isolados de pacientes com regressão espontânea de
esporotricose foi maior do que a de isolados de pacientes que necessitaram de tratamento para
a infecção. No entanto, a regressão espontânea de esporotricose tem sido historicamente rara
(IWATSU et al., 1985). No Rio de Janeiro-Brasil, onde predomina S. brasiliensis, a regressão

CAPÍTULO II
 62

espontânea foi observada em torno de 10% dos casos esporotricose (FREITAS et al., 2010).
Dessa forma, acredita-se que a urease possam resultar numa ativação ótima do sistema imune
de pacientes com esporotricose, induzindo a depuração desse fungo, sem a necessidade de um
tratamento antifúngico. No entanto, esses estudos são prelimirares e requerem um maior
número de cepas para verificar se a produção de urease está realmente associada à regressão
espontânea de esporotricose (ALMEIDA-PAES et al., 2015).

O peptídeo-ramnomanana é o principal componente da parede celular do S. schenckii e

estimula reações de hipersensibilidade do tipo tardio, bem co mo respostas de anticorpos
(TAKATA&ISHIZAKI, 1983; TRAVASSOS, 1989). O peptídeo-ramnomanana que foi
isolado da parede celular do S. schenckii foi extremamente reativo com o soro de pacientes
com esporotricose (LLOYD &BITOON, 1971). O papel destes polímeros de superfície
celular na modulação da resposta imune do hospedeiro não está completamente
compreendido, mas sabe-se que a camada externa da parede celular das leveduras e conídios
do S. schenckii é liberada no meio de cultura (TRAVASSOS, 1985). A variação na proporção
ramnose/manose na parede celular fúngica indica diferenças na expressão de glicoconjugados
na superfície celular. Os resíduos de ramnose no peptídeo-polissacarídeo de S. schenckii são
conhecidos por serem os principais epítopos antigênicos presentes na superfície da célula
fúngica (LLOYD & TRAVASSOS, 1975; LOPES-ALVES, 1994). Nesse sentido, conídios
cultivados por um menor período de tempo foram mais virulentos, pois tinham maior
proporção de ramnomanana em relação à manose (FERNANDES et al., 2000).

Em geral, as proteínas fúngicas relacionadas à virulência e escape frente às defesas do

hospedeiro (RAPPLEYE & GOLDMAN, 2008) são, por exemplo, proteína de ligação ao
cálcio e superóxido dismutase (SOD) em Histoplasma capsulatum, glucanas-sintase em
Coccidioides sp., 1,3- Glucana e Drk1 (cinase reguladora do dimorfismo) em vários fungos e
blastomices adesina-1 em B. dermatitidis (STERKEL et al., 2016).

As proteínas relacionadas à virulência e ao escape frente ao sistema imune,

identificadas em S. schenckii incluem a histidina quinase, fosfatidil inositol 3- quinase
(ZHANG et al., 2012), a proteína de 70-kDa (NASCIMENTO&ALMEIDA, 2005), 44-kDa
peptídeo hidrolase e 47- kDa enolase, que acredita-se ser uma adesina (PORTUONDO et al.,
2016). Especificamente, para S. brasiliensis a proteína 3-carboximuconato-ciclase-60-kDa foi
relacionada com a virulência (RODRIGUES et al., 2015).

CAPÍTULO II
 63

Até o presente momento, todas as cepas de S. brasiliensis que foram testadas em

modelos animais foram mais virulentas quando comparadas a S. schenckii. Além disso, cabe
ressaltar que os estudos que tratam especificamente a investigação de fatores de virulência
para essa espécie são escassos (ARRILLAGA-MONCRIEFF et al., 2009; FERNANDES, et
al., 2013; CASTRO et al., 2013; ALMEIDA-PAES et al., 2015).

3. Proteômica como ferramenta na elucidação de fatores de virulência

A proteômica pode ser definida como o estudo geral das proteínas e enzimas, ou ainda,
o estudo integrado da soma de todas as proteínas produzidas pelos organismos ou grupo de
organismos (YANG et al., 2012). A primeira análise proteômica foi realizada em 1975, por
O’Farrell, por meio da técnica de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida para
separação de proteínas, no qual foram identificadas aproximadamente 1.000 proteínas de
Escherichia coli. Devido à sua alta resolução, esta técnica foi considerada uma ferramenta
valiosa para análise e detecção de complexos proteicos a partir de fontes biológicas
(O’FARRELL, 1975).

Estratégias foram desenvolvidas para fracionar as porções do proteoma, como meio de

enriquecê- las e caracterizá- las, pois inicialmente, a proteômica microbiana estava focada na
mudança da expressão proteica a nível celular em diferentes estágios ou condições específicas
de crescimento, resultando na detecção negligenciada de proteínas de baixa abundância,
incluindo a maioria dos fatores de virulência (HECKER et al., 2010; YAHN et al., 2012).

O estudo da proteômica é uma extensão do progresso na biologia molecular, no qual a

informações sobre o proteoma complementam e estendem a interpretação e aplicação dos
achados da genômica (JAMESDANIEL et al., 2009). Ao passo que, a sequência genômica
fornece apenas o desenho, o proteoma traduz o que realmente está sendo exp resso (BRÖKER
& BELKUM, 2011).

Estudos de proteômica são concebidos para produzir informações qualitativas sobre

proteínas (identificação, distribuição, interações, estrutura e função), e informações
quantitativas (abundância, distribuição dentro de diferentes localizações, variações temporais
de abundância devido a síntese e degradação, ou ambos) (OTTO et al., 2012). A variedade de
técnicas para a detecção, identificação e quantificação é grande, e ao menos uma técnica é
adaptada aos diferentes tipos de amostras ou análises (FRANÇOIS et al., 2010).

CAPÍTULO II
 64

O padrão ouro para as análises de proteômica, especificamente na biologia de

sistemas, é a espectrometria de massas (SABIDÓ et al., 2012). De maneira geral, as
metodologias empregadas em proteômica podem ser classificadas nos tipos bottom-up ou top-
down (figura 20). As principais diferenças quanto a capacidade de identificar e quantificar
proteínas, bem como caracterizar modificações pós-traducionais (PTMs), podem ser
visualizadas na tabela 3.

Figura 20. Diferenças entre as técnicas de proteômica: bottom-up e top–down. Co m a abordagem top-down a
proteína total é ionizada e analisada. A massa total, incluindo modificações p ós-traducionais (PTMs) são
observadas. Co m a abordagem bottom-up, primeiramente a proteína é d igerida em peptídeos. Os péptidos
individuais são então analisados por LC-MS/MS. Alguns peptideos podem ser mu ito pequenos para serem
observados por MS, ou podem ser perdidos durante a preparação da amostra ou durante a análise da amostra.
Fonte: Traduzido de Scherl, 2015.

CAPÍTULO II
 65

Tabela 3. Co mparação entre as técnicas de proteômica bottom-up e top-down com relação à identificação de proteínas, quantificação e anális es de proteínas modificadas
(PTMs).

Bottom-up MS Top-down MS

++
(Maior Robustez e alto rendimento
Identificação de Proteínas para a identificação de proteínas,
com melhores ferramentas de
bioinformática disponíveis)
+
(Identificação proteica mais confiável, especificamente para proteínas com alta
similaridade de sequência, mas tem um rendimento relativamente menor)

++ +++
(Possível para o estudo em grande (Análise confiável e abrangente de todos os tipos de PTMs simultaneamente
Proteínas Modificadas escala de PTMs, mas com sem conhecimento prévio, com cobertura da sequência completa, mas requer
cobertura limitada de sequências, purificação e separação antes do estudo por MS)
devido perda de peptídeos durante
a preparação e digestão da
amostra)

+++ ++
(Método bem desenvolvido para a (Quantificação exata de proteoformas do mesmo gene e suas variações (PTMs),
Quantificação de Proteínas quantificação relativa e absoluta do mas a quantificação do nível de expressão da proteína permanece
nível de proteínas expressas, mas subdesenvolvida)
com limitação na quantificação de
peptídeos com PTMs)
Capacidade de identificar e quantificar proteínas, bem como caracterizar PTMs: + baixa, ++ moderada, +++ excelente. Fonte: Traduzido de Gregorich et al., 2014

CAPÍTULO II
 66

A metodologia bottom-up refere-se à separação por cromatografia líquida dos

peptídeos obtidos após digestão tríptica de soluções proteicas complexas, seguidas de análise
por espectrometria de massas (MS). As proteínas extraídas de uma amostra são submetidas à
digestão proteolítica em solução, utilizando uma enzima como a tripsina, ou são separadas
pela primeira vez utilizando SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis) seguido de digestão em gel (AEBERSOLD & MANN, 2003). No primeiro
caso, os peptídeos são frequentemente separados por cromatografia líquida bidimensional
(LC), com base na hidrofobicidade (cromatografia em fase reversa) e carga (cromatografia de
troca iônica) e, neste último caso, as bandas de gel são excisadas, digeridas e os peptídeos
resultantes são separados usando o LC de fase reversa (STEEN & MANN, 2004). Os
peptídeos separados são então ionizados, introduzidos no espectrômetro de massa e o número
de íons com cada valor m/z é registrado pelo detector. Após uma varredura completa de todos
os valores de m/z, os íons direcionados são isolados e fragmentados utilizando técnicas de MS
(MS/MS) em tandem, que fornecem informações relacionadas à sequência de proteínas e à
localização de PTMs (YATES, RUSE, NAKORCHEVSKY, 2009). A abordagem por bottom-
up possui muitas vantagens, como sensibilidade e reprodutibilidade, mesmo para proteoma
complexos como os de soro e lisados celulares. Entretanto, as respostas obtidas são
fragmentos de um todo e, embora seja possível a identificação de uma proteína com base em
alguns peptídeos, as modificações pós-traducionais não são reconhecidas. Além disso, um
peptídeo pode ser perdido durante a cromatografia ou não gerar espectros de massas
adequados.

A proteômica por top-down é um processo no qual as proteínas intactas (e não os

peptídeos) são submetidas à análise por MS. Proteínas intactas serão analisadas, em vez de
peptídeos, o que diminui a complexidade da amostra (em contraste com MS bottom-up em
que a complexidade da amostra é aumentada em consequência da digestão proteolítica) e em
todas as informações relacionadas ao status da proteína intacta, incluindo PTMs, variações de
sequência decorrentes de mutações, truncamentos e eventos de splicing alternativos (SIUTI &
KELLEHER, 2007). Infelizmente, uma vez que a diversidade físico-química das proteínas
intactas é muito maior do que a dos peptídeos, a separação em larga escala de proteínas
intactas é desafiadora e, portanto, os estudos tradicionais de top-down concentraram-se
principalmente na análise de um único ou pequeno número de proteínas, obtidas por meio de
purificação por afinidade.

CAPÍTULO II
 67

4. Justificativa

Como mencionado anteriormente, dentro do complexo Sporothrix, há variações na

virulência entre espécies. Todos os estudos acerca da virulência de Sporothrix revelam que a
espécie S. brasiliensis é a mais virulenta. No entanto, a completa explicação para esse fato
ainda é desconhecida. Diante disso, as perguntas que direcionaram nosso trabalho foram: Sob
o ponto de vista genômico, quais as principais diferenças entre S. schenckii e S. brasiliensis?
Quais as proteínas diferencialmente expressas por S. brasiliensis quando comparado à espécie
S. schenckii? O que torna o S. brasiliensis mais virulento e com capacidade de evasão frente
ao sistema imune?

Nesse estudo procuramos elucidadar diferenças no genoma e proteoma entre as

espécies patogênicas S. schenckii e S. brasiliensis, correlacionando-as a virulência e evazão
frente ao sistema imune.

CAPÍTULO II
 68

OBJETIVOS

1. Objetivo geral

Elucidar diferenças entre as espécies S.brasiliensis e S. schenckii, utilizando ferramentas

de proteômica e genômica.

1.1 Objetivos específicos

-Analisar comparativamente diferentes espécies de Sporotrhix utilizando dados genômicos;

- Verificar o proteoma de S. brasiliensis utilizando a ferramenta Bottom-Up;

- Observar proteínas diferencialmente expressas em S.brasiliensis e descrever quais as

envolvidas em virulência e escape frente ao sistema imune;

CAPÍTULO II
 69

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Microrganismos e condições de crescimento

Os isolados de S. schenckii (CBS 132969, CBS132978) e S. brasiliensis (CBS 132992,

CBS 132990, ATCC MYA-4823) foram mantidos na coleção de microrganismos do CBS
Fungal Biodiversity Centre, Utrecht-Holanda. As informações sobre o país de origem e o sítio
clínico de isolamento podem ser visualizadas na tabela 4. Para a realização da conversão da
fase miceliar para a fase leveduriforme, as colônias foram transferidas para caldo BHI (brain
heart infusion broth) (SIGMA-ALDRICH) a 35°C e agitadas a 100 rpm durante 7 dias. Em
seguida, alíquotas foram transferidas para placas de ágar BHI e incubadas até o completo
crescimento.

Tabela 4. Identificação, informações clínicas e geográficas e nú mero de proteínas i denti ficado para as
cepas de Sporothrix spp utilizadas nesse estudo.

CBS Outras Localização Número de proteínas

Espécies Identificação Coleções Geográfica Origem

Sporothrix 132969 SSs80 Rio de Janeiro, Humano, 664

schenckii Brasil biópsia de pele
Sporothrix 132978 Ss167 Peru Solo 743
schenckii
Sporothrix - ATCC MYA- Rio de Janeiro, Lesões de pele 594
brasiliensis 4823 Brasil de felinos
Sporothrix 132990 Ss54 Rio Grande do Lesões de pele 740
brasiliensis Sul, Brasil de felinos
Sporothrix 132992 Ss82 Rio de Janeiro, Humanos, 809
brasiliensis Brasil secreção, lesão
de pele

2. Genômica: aquisição de dados e detecção de ortólogos

As sequências de proteínas de Sporothrix brasiliensis, Sporothrix schenckii e

Sporothrix insectorum foram obtidas do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sporothrix schenckii foi utilizado para
desempenho no programa AGUSTUS (STANKE et al. 2004) para a predição ab initio de
genes nos genomas de Sporothrix pallida e Sporothrix globosa utilizando os parâmetros
padrão. O conjunto de proteínas correspondente a estas cinco espécies de Sporothrix foi
avaliado para a identificação de ortólogos e parálogos usando OrthoVenn (WANG et al.
2015). Os parâmetros de Orthomcl (LI et al., 2003) foram definidos para a inferência de

CAPÍTULO II
 70

Markov de 1,5 e um valor máximo de e-value de 10-5 . As proteínas específicas para as

espécies foram extraídas usando um script Bash personalizado.

3. Extração Proteica

Após a transformação de micélio para levedura, os isolados foram cultivados durante 4

dias a 35 °C. As leveduras foram coletadas e adicionamos 100 µL de solução de lise (50%
ácido fórmico- CH2 O2, 25% acetonitrila-CH3 CN, 25% água-H2 O). Na sequência, procedeu-se
a sonicação (probe sonicator, 1 min), no intuito de lisar e promover a liberação de proteínas,
seguida de centrifugação (200g/2min) para precipitação de debris celulares. O sobrenadante
foi recuperado e foram adicionados 100 µL de acetonitrila (CH3 CN) (50%) para posterior
armazenamento a -80o C.

4. Preparação das amostras para análise

Os extratos foram secos (Concentrator Plus/Eppendorf@) por 2h e reconstituídos em

100 µL de bicarbonato de amônio (ABC) (50 mM) com auxílio de sonicador (Branson-1-
291@) por 10 min. O próximo passo teve como objetivo reduzir os títulos de dissulfureto.
Foram adicionados 2,4 μL de 1,4 ditiotreitol (DTT) (10 mM) (Sigma-Aldrich@) seguido de
incubação a 60°C durante 45 min. A alquilação foi realizada utilizando 5 μL de
iodoacetamida (30 mM) (Sigma-1149) e incubação à temperatura ambiente no escuro durante
45 min. Após este processo, foram adicionados 10 μL de tripsina (Pierce-90057, 90058,
90059), previamente diluídos em ABC (100 ng / μL). As amostras foram mantidas a 37 ° C
overnight. No dia seguinte, foram adicionados 2 μL de ácido fórmico (CH2 O2 , -Optima ™ LC
/ MS Grade, Fisher Chemical) às amostras e incubadas a 37°C durante 10 min. Em seguida, as
mesmas foram centrifugadas (1400 rpm/ 5min), e os sobrenadantes foram transferidos para
@
novos tubos, os quais foram secos durante 2 h (Concentrador Plus / Eppendorf ).
Posteriormente, foram utilizados 200 μL de ácido fórmico (0,1% em água) (Optima ™
LC/MS, Solvente Misturas, Fisher Chemical) para reconstituir as amostras para análise. Na
análise, também foi incluído, como um controle, o HeLa (Padrão de Proteína Digerida)
(Pierce ™ -Thermo Fisher).

CAPÍTULO II
 71

5. Análises por espectrometria de massas (MS) (Bottom-Up)

As digestões trípticas (peptídeos) foram analisadas por nanoflow LC on-line usando o

sistema EASY-nLC II (Thermo Fisher Scientific). Os peptídeos (injeção de 5μL) foram
separados com um gradiente de 60 min (0 a 35% de Tampão B durante 50 minutos, 35-80%
de tampão A durante 5 minutos e em seguida mantidos a 80% de tampão B durante os 5
minutos restantes; Tampão A: 0,1% de ácido fórmico/ 2% de acetonitrila; Tampão B: 0,1% de
ácido fórmico em acetonitrila) a uma taxa de fluxo de 200 nl/min (45°C) numa coluna
EasySpray (PepMap RSLC 75μm x 25cm ES802, Thermo Scientific). O controle HeLa foi
utilizado para verificar se o método foi bem-sucedido. O EASY-nLC foi acoplado a um
espectrômetro de massa QExactive-HF com uma fonte de íons de eletro-pulverização
EASYspray (Thermo Fisher Scientific). Todas as amostras foram medidas em um modo de
aquisição dependente de dados em uma faixa de varredura de MS1 350-2000 m/z no
Orbitrap, 5 microscans, uma configuração AGC de 3×10 6 e resolução 120k. A fragmentação
foi realizada de forma dependente dos dados com uma energia de colisão normalizada de 27
para os picos top 5 em cada varredura MS (janela de isolação MS2 de 2,0 m/z, resolução 60k,
1 microscópio, AGC 1 × 105 com o tempo máximo de injeção de íons de 60 Ms e tempo de
exclusão dinâmico de 60s). As medidas de MS para as diferentes amostras foram
randomizadas para eliminar artefatos técnicos.

6. Identificação de proteínas

A identificação de proteínas foi realizada com arquivos de espectros de massa brutos

usando o Sequest HT com o software Proteome Discoverer versão 1.4.1.14 (Thermo
Scientific). Pesquisas foram realizadas utilizando o banco de dados de Sordariomycetes,
composto por todas as sequências de proteínas para este táxon baixados do Uniprot-SwissProt
(http://www.uniprot.org) para identificar peptídeos e proteínas. O software Protein Center
(Thermo Scientific) foi utilizado para análise de dados e para geração de gráficos. Termos de
Ontologia de Gene (GO) em Candida Genome Database (CGD) foram usados para classificar
proteínas de espécies de Sporothrix.

CAPÍTULO II
 72

RESULTADOS

1. Análises comparativas genéticas para espécies de Sporothrix

A predição do gene n-silico foi realizada por AUGUSTUS (modelo Sporothrix

schenckii) para Sporothrix pallida e S. globosa, resultando em 9,712 e 8,747 genes previstos,
respectivamente. Os conjuntos de genes de S. brasiliensis, S. schenckii e S. insectorum foram
adquiridos do GenBank. Os genes ortólogos foram identificados usando OrthoVenn (WANG
et al., 2015). O número total de genes previstos em cada espécie, o número de clusters
contendo ortólogos e o número de genes específicos de espécies não atribuídos a qualquer
cluster podem ser visualizados na Tabela 5. De forma geral, foi identificado a presença de
6,130 clusters de ortólogos conservados nas 5 espécies de Sporotrix. Nenhum dos clusters foi
específico para S. brasiliensis. Para as espécies S. schenckii e S. globosa foram encontrados 1
e 3 clusters específicos, respectivamente (Figura 21).

Tabela 5. Número total de genes, clusters e genes espécie-específicos referente à Sporothrix spp.

# Número total # Número de Genes

Espécies de genes clusters espécie-específicos

Sporothrix brasiliensis 9091 8525 395

Sporothrix schenckii 10293 8673 1474
Sporothrix insectorum 9496 7768 1380
Sporothrix pallida 9712 8167 1200
Sporothrix globosa 8747 8479 176

Espécies filogeneticamente remotas, como Sporothrix insectorum e S. pallida têm o

maior número de clusters específicos, 95 e 91, respectivamente, (Figura 21, Tabela 5).
Clusters de ortólogos específicos de uma determinada espécie ou grupos de parálogos podem
incluir grupos de genes específicos de espécies ou expansão de genes específicos de
linhagem. Vários genes permaneceram desagrupados, e as espécies ambientais, como a
espécie S. insectorum, apresentaram maior número de genes específicos de espécies que não
pertencem a nenhum grupo de ortólogos. O menor número de genes específicos de espécies
foi encontrado em S. brasiliensis (Tabela 5).

CAPÍTULO II
 73

Figura 21. Clusters específicos para as diferentes espécies de Sporothrix spp. Identificou-se 6,130 clusters
de ortólogos conservados nas 5 espécies de Sporotrix. Nenhum dos clusters foi específico para S. brasiliensis.
Para as espécies S. schenckii e S. globosa foram encontrados 1 e 3 clusters específicos, respectivamente.

2. Análises de proteômica

Com base nas análises de Bottom-up que foram realizadas para S. brasiliensis usando
o Sequest HT com o software Proteome Discoverer v 1.4.1.14 (Thermo Scientific), o menor
número de proteínas (594) foi detectado no isolado S. brasiliensis ATCC MYA-4823,
enquanto que, o maior número (809) foi detectado para S.brasiliensis CBS 132992. As
funções moleculares, biológicas e as localizações celulares para cada proteína, estão listadas
na Tabela A (Anexos). Não foram observadas diferenças significativas entre as cepas. Quando
comparadas proteínas comuns às cepas de S. brasiliensis e S. schenckii, foram observadas 541
e 355 proteínas, respectivamente. Concentrando-se apenas em proteínas expressas
exclusivamente em cada grupo, foram encontradas 60 proteínas diferencialmente expressas
em S. brasiliensis e 87 proteínas para S. schenckii. Uma lista completa das proteínas únicas
para S. brasiliensis, com descrição, número de peptídeos únicos, cobertura e sequência
peptídica é fornecida na Tabela B (Anexos). Pesquisas bibliográficas sobre as 60 proteínas

CAPÍTULO II
 74

diferencialmente expressas em S. brasiliensis revelaram que 9 proteínas, têm grande impacto

na virulência e escape frente ao sistema imune em outros microrganismos. As referidas
proteínas são: Glucanase extracelular da parede celular, aminopeptidase I, Mn superóxido
dismutase, proteína de choque térmico 70 kDa 1/8, 3-fosfato desidrogenase gliceraldeído
(GAPDH), hidroximetilglutaril-CoA liase, proteína de ligação a progesterona, fator de
alongamento 1-beta, acetil-CoA hidrolase e NADH ubiquinone oxidoreductase subunidade
B17.2 (Tabela 6).

Tabela 6. Relação de nove proteínas diferencial mente expressas em S. brasiliensis e sua i mportância na
virulência e escape imune em outras espécies.

Virulência e importância
Proteínas imunológica Espécies

Glucanase extracelular de Componente de vesículas extracelulares, S. schenckii, C. albicans,

parede celular escape frente ao sistema imune C. neoformans

Aminopepti dase I
Escape frente ao sistema imune Blastomyces dermatitidis

Mn superóxido dismutase S. schenckii, C. gattii ,

Crescimento e sobrevivência sob stress C.albicans
oxidativo
Proteína de choque térmico 70 Invasão de células do epitélio e endotélio, sua C.albicans, C.neoformans
kDa 1/8 ausência atenua a virulência

Gliceraldeído 3-Fosfato C.albicans, P.brasiliensis

desidrogenase Adesina, imunogênica

Hidroximetilglutaril-CoA liase H. capsulatum

Escape frente ao sistema imune

Proteína ligante de Evasão do sistema immune, sobrevivência e P.brasiliensis, C.albicans,

progesterona transição dimórfica Phialophora verrucosa

Acetil coenzima A Elaboração de cápsula polissacarídica, baixo Cryptococcus neoformans,

crescimento Saccharomyces cerevisiae

Biossíntese 3-oxoacil-[acil- Virulência, modulação do sistema imune, P.aeruginosa

carrier-proteína] redutase atividade antimicrobiana, produção de
ramnolipídeos biofilmes e mobilidade

CAPÍTULO II
 75

3. Estudos combinados de genômica e proteômica

A análise das 60 proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis frente aos

grupos de ortólogos identificados pela Ortho MCL mostrou que todas as 60 proteínas
possuem ortólogos correspondentes em S. schenckii. No entanto, quando S. brasiliensis foi
comparada às espécies S. pallida e S. globosa, foram encontradas 7 proteínas que não
possuem ortólogos: proteína hipotética SPBR_08110, proteína hipotética SPBR_05199,
proteína hipotética SPBR_06610, proteína hipotética SPBR_08650, glutamato
carboxipeptidase II, proteína de ligação de ácido nucléico e Het-c. Para a espécie S. globosa, a
proteína ligante de ácido nucleico e Het-c estavam ausentes. Foram encontrados parálogos da
proteína hipotética SPBR_08650 em quatro espécies estudadas, exceto para S. globosa. Em S.
pallida, a proteína ligante de ácido nucleico e a carboxipeptidase II do glutamato estão
ausentes.

CAPÍTULO II
 76

DISCUSSÃO

A caracterização da virulência, bem como, dos fatores envolvidos no escape frente ao

sistema imune é fundamental na compreensão das interações micróbio-hospedeiro. Os fungos
patogênicos desenvolveram estratégias eficientes para burlar a morte por células efetoras do
sistema imune inato. Uma hipótese amplamente aceita para explicar a virulência fúngica nos
oportunistas é a interação contínua de micróbios com seu ambiente, sua competição uns com
os outros, o que possibilita a aquisição de estratégias de sobrevivência que conduzem a uma
maior virulência quando encontram acidentalmente um hospedeiro animal (CASADEVALL,
2007). Assim sendo, os patógenos são reconhecidos pela sua fase patogênica especia lizada,
consequentemente, a elucidação de fatores de virulência nesta fase é fundamental para a
compreensão do processo de escape frente ao sistema imunológico e geração de doença.

O fungo Sporothrix é intrigante, pois o papel da levedura nos tecidos do hospedeiro

não está claro. A transição de micélio para levedura é a chave para a ocorrência da doença,
sendo que as diferentes formas apresentarão diferentes perfis proteicos. Ancestrais de
Sporothrix estão relacionados a Ophiostomatales dispersos em insetos (DE BEER et al., 2017)
que não possuem uma fase leveduriforme invasiva em mamíferos. No clado patogênico, S.
schenckii e S. brasiliensis apresentam baixa diversidade genética quando a calmodulina é
utilizada como marcador (RODRIGUES et al., 2013). No entanto, S. schenckii está associado
a zoo e sapronoses, enquanto S. brasiliensis e S. globosa são quase exclusivamente zoonóticos
e sapronóticos, respectivamente.

No presente estudo, foram analisadas as proteínas diferencialmente expressas por

leveduras de S. brasiliensis, quando comparadas às leveduras de S. schenckii, tendo como
ênfase, as proteínas envolvidas em virulência e em estratégias de evasão frente ao sistema
imune.
O proteoma foi obtido sob uma condição específica, isto é, predominantemente na
forma de levedura, após 4 dias de incubação a 35°C. Entre as 60 proteínas encontradas
exclusivamente expressas em S. brasiliensis, ou seja, proteínas com algumas modificações
quando comparadas com os seus ortólogos em S. schenckii, nove estão implicadas na
virulência em outros microrganismos e estão envolvidas em mecanismos de subversão da
imunidade inata do hospedeiro. Alguns dos mecanismos empregados são: dimorfismo
térmico, produção de vesículas extracelulares, respiração aeróbia, imunogenicidade e

CAPÍTULO II
 77

invasividade. As proteínas em questão são: glucanase extracelular de parede celular,

aminopeptidase I, Mn superóxido dismutase, proteína de choque térmico 70 kDa 1/8,
gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase (GAPDH), hidroximetilglutaril-CoA liase, proteína
ligante de progesterona, acetil-CoA hidrolase biossíntese 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]
ramnolipídeo redutase.

As análises de genômica permitiram verificar que os genes ortólogos conservados,

correspondentes nas 60 proteínas exclusivamente expressas em S. brasiliensis, também foram
encontrados em S. schenckii. Este resultado sugere que, ao invés de estudos envolvendo
análises genômicas comparativas, pesquisas que utilizem espécies Sporothrix estreitamente
relacionadas, devem abordar modificações que só poderiam ser identificadas a nível proteico.
De fato, a composição gênica de S. brasiliensis parece ser altamente similar em
comparação com S. schenckii. Como consequência, S. brasiliensis não possui um conjunto de
clusters de ortólogos espécie-específicos. Clusters de ortólogos que são específicos de uma
determinada espécie ou grupos de parálogos podem incluir grupos de genes específicos de
espécies ou expandir para genes específicos de linhagem.

Dentre os mecanismos utilizados para causar danos às células hospedeiras é a secreção

de fatores tóxicos em vesículas extracelulares, como observado em Ascomicetos, como
Histoplasma capsulatum, Candida albicans, C. parapsilosis e S. schenckii, mas isso também
foi observado em Saccharomyces cerevisiae. A análise proteômica de vesículas extracelulares
fúngicas revelou composição proteica complexa com múltiplas funções, incluindo a presença
de fatores de virulência (ALBUQUERQUE et al., 2008; RODRIGUES et al., 2008;
O'MEARA et al., 2015). As vesículas extracelulares produzidas por fungos contêm proteínas
tais como: ATPases de membrana plasmática, proteínas de citoesqueleto, proteínas de choque
térmico, adesinas e proteínas antioxidantes, incluindo superóxido dismutase e catalase B.

Em S. brasiliensis foram identificadas várias proteínas associadas a vesículas:

glucanase extracelular de parede celular, aminopeptidase I, Mn superóxido dismutase e
proteína de choque térmico de 70 kDa 1/8. A presença de vesículas extracelulares é conhecida
em S. schenckii (RODRIGUES et al., 2010), e a proteína glucanase extracelular da parede
celular é um dos componentes transportados pelas vesículas e é encontrada diferencialmente
expressa em S. brasiliensis. Esta proteína foi descrita em Candida albicans como indutora de
lise em macrófagos e em leveduras do basidiomiceto Cryptococcus neoformans, o qual os

CAPÍTULO II
 78

componentes das vesículas são usados para remodelar a superfície celular, sugerindo um
mecanismo amplamente conservado entre os patógenos fúngicos (O'MEARA et al., 2015).

Aminopeptidase I é uma proteína que possui funções de “driblar” as defesas do

hospedeiro (STERKEL et al., 2016), e foi diferencialmente expressa em S. brasiliensis. Esta
proteína pode esclarecer a alta virulência e patogenicidade desta espécie em comparação com
outros membros do clado patogênico de Sporothrix. Aminopeptidases não são exclusivas de
fungos, mas também são encontradas em bactérias patogênicas e parasitas (KUMAGAI et al.,
2000). No entanto, em fungos, usando um modelo murino para Blastomyces dermatitidis,
essas enzimas demonstraram ser responsáveis por infecção pulmonar progressiva e letal.
Quando a expressão desta proteína no patógeno foi eliminada, a virulência foi atenuada
(STERKEL et al., 2016).

As superóxidos dismutases (SOD) contribuem para o crescimento e a sobrevivência

sob condições de estresse oxidativo, por exemplo, dentro dos macrófagos (POLI et al., 2004).
Em nosso estudo, Mn superóxido dismutase foi identificada em S. brasiliensis. A presença de
SOD foi previamente relatada em S. schenckii (PEREZ-SANCHEZ et al., 2010), mas o papel
específico de Mn SOD na sua virulência ainda não foi abordado. A virulência em
Cryptococcus gattii foi relatada como dependente de Mn SOD (NARASIPURA et al., 2005).
Estudos in vivo mostraram que os mutantes para o gene apresentavam virulência atenuada
(NARASIPURA et al., 2005). Um mutante de Mn SOD em Candida albicans foi mais
sensível ao estresse do que as células de tipo selvagem (HWANG et al., 2003), confirmando a
importância dessa proteína na virulência e escape frente ao sistema imune.

As proteínas de choque térmico (HSP) em fungos são produzidas em resposta a

mudanças na temperatura, estando envolvidas no dimorfismo térmico ( BURNIE et al., 2006),
permitindo a sobrevivência de patógenos no tecido do hospedeiro e promovendo a resistência
aos medicamentos antifúngicos (BROWN et al., 2010). Nesse estudo foi identificada a
proteína de choque térmico de 70 kDa diferencialmente expressa em S. brasiliensis. Esta
proteína já foi encontrada expressa na superfície de células de C. albicans, mediando a
invasão de células epiteliais e endoteliais in vitro. Em modelos murinos de candidíase
orofaríngea e disseminada, o mutante para esta proteína apresentou virulência
significativamente atenuada (SUN et al., 2010). Em um modelo murino de meningoencefalite
causada por Cryptococcus neoformans, a deleção de HSP 70 provocou a redução da produção
de lacase e melanina, bem como atenuação da virulência (ZHANG et al., 2006). A

CAPÍTULO II
 79

importância do HSP 70 foi confirmada na ligação de C. neoformans a células epiteliais

alveolares humanas, onde se mostrou que a proteína compete com glucuronoxilomananas, o
principal antígeno capsular, (SILVEIRA et al., 2013).

A adesão é um fenômeno biológico que permite que os microrganismos colonizem

habitats particulares como os tecidos do hospedeiro. Uma importante adesina foi identificada
para S. schenckii: glicoproteína-70 (NASCIMENTO & ALMEIDA, 2005). Esta é uma
proteína imunogênica cruzada associada à virulência, que sofre diferentes modificações pós-
traducionais e está presente como isoformas e glicoformas nos proteomas do clado patogênico
(RODRIGUES et al., 2015). No entanto, aqui foi identificada outra importante adesina, a
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Esta proteína está envolvida em virulência e
glicólise (GAO et al., 2014). Estudos in vitro mostraram que a GAPDH-adesina é capaz de
mediar a entrada de P. brasiliensis na célula (BAILÃO et al., 2006). A GAPDH em C.
albicans atua como uma fibronectina e laminina (GOZALBO et al., 1998) e proteína de
ligação ao plasminogênio que potencialmente aumenta a invasão de tecido (CROWE et al.,
2003). Além disso, a GAPDH na superfície celular de C. albicans teve papel imunogênico e
foi enzimaticamente ativa, sendo que cepas clínicas expressaram esse antígeno de super fície
tanto in vitro quanto em tecidos infectados (GIL et al., 1999). Em P. brasiliensis e H.
capsulatum, GAPDH estava presente em maiores quantidades na fase leveduriforme do que
na fase miceliar, sugerindo a importância dessa adesina na virulência (ALBUQUERQUE et
al., 2008).

Hidroximetilglutaril-CoA liase (HMG CoA-liase) é uma enzima metabólica que atua

no último passo no catabolismo de leucina. Em modelo murino de infecção por H.
capsulatum, a HMG-CoA liase atua promovendo a sobrevivência e replicação do fungo no
fagossoma de macrófagos. A deficiência de HMG CoA- liase promove acúmulo de compostos
ácidos resultando em comprometimento do metabolismo de leucina (ISAAC et al., 2013). O
presente estudo verificou que essa proteína é diferencialmente expressa em S. brasiliensis.

S. brasiliensis em humanos é relatado mais comumente em mulheres do que em

homens (2: 1) (ALMEIDA-PAES et al., 2014). Em S. schenckii, o ligante para receptor de
progesterona-adiponectina foi identificado (GONZALEZ-VELAZQUEZ et al., 2012), mas
sua importância na virulência, bem como patogenicidade dependente de sexo, não foi descrita.
Nas infecções por P. brasiliensis e Coccidioides immitis, os homens são mais suscetíveis que
as mulheres (POWELL et al., 1983). Os fungos podem apresentar receptores para vários

CAPÍTULO II
 80

hormônios do hospedeiro que, por sua vez, podem influenciar a patogênese, como ocorre na
coccidioidomicose (DRUTZ & HUPPERT 1983; DRUTZ et al., 1981). Em P. brasiliensis, a
conversão de micélio para levedura foi inibida na presença de estrogênio (MUCHMORE et
al., 1971). Loose et al. (1983) demonstraram um sistema de ligação de alta afinidade,
específico para 17 B-estradiol que inibe a transformação micélio- levedura. Em nosso estudo
foi identificada uma proteína de ligação à progesterona especificamente para S. brasiliensis
que não foi detectada para nenhuma das cepas de S. schenkii. A existência de uma proteína de
ligação ao corticosteróide e um ligante endógeno (esteróide) foi relatada em C.albicans
(LOOSE et al., 1982), e os esteróides foram relatados por alterar a resposta a drogas
antifúngicas (SHANKAR et al., 2011). O crescimento de dermatófitos foi afetado pela
progesterona, logo, acredita-se que esses efeitos sejam mediados devido a presença de
receptores intracelulares fúngicos (HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ et al., 1995). Čapek et al.
(1971) sugeriram que isso poderia representar um sistema de receptor de esteróides primitivo.

Dentre as proteínas identificadas e diferencialmente expressas em S. brasiliensis está a

acetil coenzima A, um metabólito importante nas vias de utilização de glicose e outras fontes
de carbono. A relação desta proteína com a virulência foi descrita para C. neoformans, onde a
perda de acetil coenzima A resultou em um defeito na elaboração da cápsula polissacarídica,
bem como incapacidade do fungo em causar doença (GRIFFITHS et al., 2012). As cepas de
Saccharomyces cerevisiae que não possuem acetil coenzima A mostraram crescimento
inadequado, e apresentaram defeitos no desenvolvimento de pseudo-hifas (BUU et al., 2003),
confirmando a importância dessa proteína na virulência, bem como no desenvolvimento dos
fungos.

Outra proteína encontrada exclusivamente expressa em S. brasiliensis é a biossíntese

redutase 3-oxoacil-[acil- transportadora-proteína] ramnolipídeos um glicolípido tensoativo. Os
ramnolípideos purificados atuam diretamente nas células da resposta imune. Ramnolipídeos
de P. aeruginosa estão envolvidos em virulência, atividade antimicrobiana, desenvolvimento
de biofilmes, motilidade superficial e modulação imunológica afetando o recrutamento de
neutrófilos (KHARAZMI et al., 1989). Zulianello et al. (2006) mostraram que ramnolípideos
são necessários para a invasão do epitélio respiratório, na infecção por P. aeruginosa. Os
ramnolipídeos também estimulam a liberação de glicoconjugados mucosos na traquéia felina
ou mucosa brônquica humana (SOMERVILLE et al., 1992; FUNG et al., 199,).

CAPÍTULO II
 81

No melhor do nosso conhecimento, e até o momento, este é o primeiro estudo no que

tange a caracterização do proteoma para a espécie altamente virulenta S. brasiliensis. As
proteínas descritas aqui são validadas por estudos na literatura em que esses alvos foram
relatados como significativos para a virulência em outros fungos. No entanto, os mecanismos
de virulência e evasão frente ao sistema imune, ainda não foram explorados e permanecem
desconhecidos para S. brasiliensis. Logo, estudos com mutantes para cada uma das proteínas
descritas nesse trabalho devem ser avaliados.

CAPÍTULO II
 82

CONCLUSÕES

O presente trabalho estabeleceu um perfil proteico comparativo entre d uas importantes

espécies patogênicas no Brasil: S. schenckii e S. brasiliensis. Os resultados aqui encontrados
permitem concluir que:

I. Análises gênicas das espécies S. schenckii e S. brasiliensis permitiram concluir que elas são
similares;

II. Análises protéicas sugerem que pequenas modificações podem ser importantes no que
tange a virulência e escape imunológico;

III. As proteínas descritas nesse estudo devem ser estudadas utilizando mutantes no intuito de
elucidar o impacto das mesmas na virulência de S. brasiliensis.

CAPÍTULO II
 83

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AEBERSOLD, R.; MANN, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, v.422, n.6928,

p.198-207, 2003.

AKIRA, S.; TAKEDA, K.; KAISHO, T. Toll- like receptors: critical proteins linking innate
and acquired immunity. Nature Immunology, v.2, p.675–680, 2001.

ALBUQUERQUE, P.C.; NAKAYASU, E.S.; RODRIGUES, M.L.; FRASES,

S.; CASADEVALL, A.; ZANCOPE-OLIVEIRA, R.M.; ALMEIDA, I.C.; NOSANCHUK,
J.D. Vesicular transport in Histoplasma capsulatum: an effective mechanism for trans-cell
wall transfer of proteins and lipids in ascomycetes. Cellular Microbiology, v.10, n.8, p.1695-
1710, 2008.

ALEGRANCI, P.; RIBEIRO, L.C.; FERREIRA, L.S.; NEGRINI, T.; MAIA,

D.C.; TANSINI, A.; GONÇALVES, A.C.; PLACERES, M.C.; CARLOS, I.Z. The
predominance of alternatively activated macrophages following challenge with cell wall
peptide-polysaccharide after prior infection with Sporothrix schenckii. Mycopathologia,
v.176, p.57–65, 2013.

ALMEIDA, J.R.; KAIHAMI, G.H., JANNUZZI, G.P.; ALMEIDA, S.R. Therapeutic vaccine
using a monoclonal antibody against a 70-kDa glycoprotein in mice infected with highly
virulent Sporothrix schenckii and Sporothrix brasiliensis. Medical Mycology, v.53, p.42–50,
2015.

ALMEIDA-PAES, R.; BAILAO, A.M.; PIZZINI, C.V.; REIS, R.S.; SOARES,

C.M.; PERALTA, J.M.; GUTIERREZ-GALHARDO, M.C.; ZANCOPÉ-OLIVEIRA, R.M.
Cell free antigens of Sporothrix brasiliensis: antigenic diversity and application in an
immunoblot assay. Mycoses, v.55, p.467–475, 2012.

ALMEIDA-PAES, R.; OLIVEIRA, M.M.; FREITAS, D.F.; VALLE, A.C.; ZANCOPÉ-

OLIVEIRA, R.M.; GUTIERREZ-GALHARDO, M.C. Sporotrichosis in Rio de Janeiro,
Brazil: Sporothrix brasiliensis is associated with atypical clinical presentations. PLoS
Neglected Tropical Diseases, v.8, n.9, art.3094, p.1-8, 2014.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 84

ALTAMURA M, CARADONNA L, AMATI L, PELLEGRINO NM, URGESI G,

MINIELLO S. Splenectomy and sepsis: the role of the spleen the immune- mediated bacteria
clearance. Immunopharmacology Immunotoxicology, v.23, n.2, p.153-161, 2001.

ARAUJO, M.L.; RODRIGUES, A.M.; FERNANDES, G.F.; CAMARGO, Z.P.; HOOG, G.S.
Human sporotrichosis beyond the epidemic front reveals classical transmission types in
Espírito Santo, Brazil. Mycoses, v.58, p.485–490, 2015.

ARRILLAGA-MONCRIEFF, I.; CAPILLA, J.; MAYAYO, E.; MARIMON, R.; MARINÉ,

M.; GENÉ, J.; CANO, J.; GUARRO, J. Different virulence levels of the species of Sporothrix
in a murine model. Clinical Microbiology Infection, v.15, n.7, p.651-655, 2009.

BAILÃO, A.M.; SCHRANK, A.; BORGES, C.L.; DUTRA, V.; MOLINARI-MADLUM,

E.E.; SOARES, MS.; SOARES, M.G.M.J.; MARTINS, W.S.; PEREIRA, M.; SOARES, C.
Differential gene expression by Paracoccidioides brasiliensis in host interaction conditions:
representational difference analysis identifies candidate genes associated with fungal
pathogenesis. Microbes Infection, v.8, p.2686-2697, 2006.

BALLOY, V.; SI-TAHAR, M.; TAKEUCHI, O.; PHILIPPE, B.; NAHORI, M.A.; TANGUY,
M.; HUERRE, M.; AKIRA, S.; LATGÉ, J.P.; CHIGNARD, M. Involvement of Toll-Like
Receptor 2 in experimental invasive pulmonary aspergillosis. Infection & Immunity, n.9,
p.5420–5425, 2005.

BARROS, M.B.; ALMEIDA-PAES, R.; SCHUBACH, A.O. Sporothrix schenckii and

Sporotrichosis. Clinical Microbiology Reviews, v.24, n.4, p. 633-654, 2011.

BARROS, M.B.; SCHUBACH, T.P.; et al. Sporotrichosis: development and challenges of an

epidemic. Revista Panamericana de Salud Publica, v.27, n.6, p.455-460, 2010.

BARROS, M.B.D.L.; ALMEIDA PAES, R.; SCHUBACH, A.O. Sporothrix schenckii and
Sporotrichosis. Clinical Microbiology Reviews, v.24, n.4, p.633–654, 2011.

BEER, Z.W.; HARRINGTON, T.C.; VISMER, H.F.; WINGFIELD, B.D.; WINGFIELD,

M.J. Phylogeny of the Ophiostoma stenoceras-Sporothrix schenckii complex. Mycologia,
v.95, n.3, p. 434-441, 2003.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 85

BELLOCCHIO, S.; MONTAGNOLI, C.; BOZZA, S.; GAZIANO, R.; ROSSI,

G.; MAMBULA, S.S.; VECCHI, A.; MANTOVANI, A.; LEVITZ, S.M.; ROMANI, L. The
contribution of the Toll- Like/IL-1 receptor superfamily to innate and adaptive immunity to
fungal pathogens in vivo. Journal of Immunology, v.172, n.5, p.3059–3069, 2004.

BEURMANN, L.; GOUGEROT, H. Les sporotrichose. Paris: Librairie Felix Alcan, 1912.

BOCHUD, P.Y.; CHIEN, J.W.; MARR, K.A.; LEISENRING, W.M.; UPTON, A.; JANER,
M.; RODRIGUES, S.D.; LI, S.; HANSEN, J.A.; ZHAO, L.P.; ADEREM, A.; BOECKH, M.
Toll- like receptor 4 Polymorphisms and aspergillosis in stem-cell transplantation. New
England Journal of Medicine, v.359, n.17, p.1766–1777, 2008.

BRETZ, C.; CHIEN, J.W.; MARR, K.A.; LEISENRING, W.M.; UPTON, A.; JANER,
M.; RODRIGUES, S.D.; LI, S.; HANSEN, J.A.; ZHAO, L.P.; ADEREM, A.; BOECKH, M..
MyD88 Signaling contributes to early pulmonary responses to Aspergillus fumigatus.
Infection and Immunity, v. 76, n. 3, p. 952–958, 2008.

BROWN, A.J.P.; LEACH, M.D., et al. The relevance of heat shock regulation in fungal
pathogens of humans. Virulence, v.1, n.4, p.330-332, 2010.

BURNIE, J.P.; CARTER, T.L. et al. Fungal heat-shock proteins in human disease. FEMS
Microbiological Review, v.30, n.1, p. 53-88, 2006.

BUU, L.M.; CHEN, Y.C.; GERSUK, G.; KNOBLAUGH, S.; CHAUDHARY,

N.; RANDOLPH-HABECKER, J.; HACKMAN, R.C.; STAAB, J.; MARR, K.A. Functional
characterization and localization of acetyl-CoA hydrolase, Ach1p, in Saccharomyces
cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, v.278, n.19, p.17203-17209, 2003.

CAPEK, A.; SIMEK, A. Antimicrobial agents, effect of steroids on dermatophytes. Folia

Microbiologica, v.16, n.4, p.299-302, 1971.

CARLOS, I.Z.; ZINI, M.M.; SGARBI, D.B.; ANGLUSTER, J.; ALVIANO, C.S.; SILVA,
C.L. Disturbances in the production of interleukin-1 and tumor necrosis factor in disseminated
murine sporotrichosis. Mycopathologia, v.127, p.189–194, 1994.

CASADEVALL, A. Determinants of virulence in the pathogenic fungi. Fungal Biology

Reviews, v.21, n.4, p.130-132, 2007.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 86

CASTRO, R.A.; KUBITSCHEK-BARREIRA, P.H., TEIXEIRA, P.A.; SANCHES,

G.F.; TEIXEIRA, M.M.; QUINTELLA, L.P.; ALMEIDA, S.R.; COSTA, R.O.; CAMARGO,
Z.P.; FELIPE, M.S.; DE SOUZA, W.; LOPES-BEZERRA, L.M. Differences in cell
morphometry, cell wall topography and Gp70 expression correlate with the virulence of
Sporothrix brasiliensis clinical isolates. PLoS ONE, v.8, n.10, art.75656, p.1, 2013.

CHAKRABARTI, A.; BONIFAZ, A.; BONIFAZ, A.; GUTIERREZ-GALHARDO, M.C.;

MOCHIZUKI, T.; LI S. Global epidemiology of sporotrichosis. Medical Mycology, v.53,
n.1, p. 3-14, 2015.

CHEN, X.; VODANOVIC-JANKOVIC, S.; JOHNSON, B.; KELLER, M.; KOMOROWSKI,

R.; DROBYSKI, WR. Absence of regulatory T-cell control of TH1 and TH17 cells is
responsible for the autoimmune- mediated pathology in chronic graft- versus- host disease.
Blood, v. 110, n.10, p.3804-1, 2007.

CLAVIJO-GIRALDO, D.M.; MATINEZ-ALVAREZ, J.A. Analysis of Sporothrix schenckii

sensu stricto and Sporothrix brasiliensis virulence in Galleria mellonella. Journal
Microbiology Methods, v.122, p. 73-77, 2016.

CROWE, J.D.; SIEVWRIGHT, I.K.; AULD, G.C.; MOORE, N.R.; GOW, N.A.; BOOTH,
N.A. Candida albicans binds human plasminogen: identification of eight plasminogen-
binding proteins. Molecular Microbiology, v.47, n.6, p.1637-1651, 2003.

CRUZ, L.C.H. Complexo Sporothrix schenckii: revisão de parte da literatura e considerações

sobre o diagnóstico e a epidemiologia. Veterinária e Zootecnia, v.20 (ed. comem.), p.8-28,
2013.

CUA, D.J.; TATO, C.M. Innate IL-17-producing cells: the sentinels of the immune system.
Nature Reviews Immunology, v. 10, n.7, p. 479–489, 2010.

CUNHA, C.; AVERSA, F.; ROMANI, L.; CARVALHO, A. Human genetic susceptibility to
invasive aspergillosis. PLoS Pathogens, v.9, n.8, p.3434, 2013.

DING, K.; SHIBUI, A.; WANG, Y.; TAKAMOTO, M.; MATSUGUCHI, T.; SUGANE, K.
Impaired recognition by Toll- like receptor 4 is responsible for exacerbated murine
Pneumocystis pneumonie. Microbes Infection, v.7, n.2, p.195–203, 2005.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 87

DRUTZ, D.J.; HUPPERT, M. Coccidioidomycosis: factors affecting the host-parasite

interaction. Journal Infection Disease, v.147, p.372-390, 1983.

DRUTZ, D.J.; HUPPERT, M.; SUN, S.H.; MCGUIRE, W.L. Human sex hormones stimulate
the growth and maturation of Coccidioides immitis. Infection Immunity, v.32, p.897-907.
1981.

DUNDERHILL, B.; GANTNER. Integration of toll- like receptor and phagocytic signaling for
tailored immunity. Microbes Infection, v. 6, p. 1368 –1373, 2004.

DUNSTAN, R.W.; REIMANN, K.A.; LANGHAM, R.F. Feline sporotrichosis. Journal of

the American Veterinary Medical Association, v.189, n.8, p.880-883, 1986.

FEENEY, K.T.; ARTHUR, I.H.; WHITTLE, A.J.; ALTMAN, S.A.; SPEERS, DJ. Outbreak
of sporotrichosis, Western Australia. Emerging Infection Disease, v.13, n.8, p.1228-31,
2007.

FERNANDES, G.F.; DOS SANTOS, P.O.; RODRIGUES, A.M.; SAZAKI, A.A.; BURGER,
E.; DE CAMARGO, Z.P. Characterization of virulence profile, protein secretion and
immunogenicity of different Sporothrix schenckii sensu stricto isolates compared with S.
globosa and S. brasiliensis species. Virulence, v.4, p.241–249, 2013.

FERNANDES, K.S.; NETO, E.H.; BRITO, M.M.; SILVA, J.S.; CUNHA, F.Q. Detrimental
role of endogenous nitric oxide in host defence against Sporothrix schenckii. Immunology,
v.123, n.4, p. 469–47, 2008.

FERNANDEZ, S.; CAPILLA, J.; MAYAYO, E.; GUARRO, J. Virulence of Sporothrix luriei
in a murine model of disseminated infection. Mycopathologia, v.173, n.4, p.245-249, 2012.

FERREIRA, C.P.; OLIVEIRA DE ALMEIDA, A.C.; CORTE-REAL, S. Transmission

Electron Microscopy Analysis of Skin Lesions from Sporotrichosis Epidemic in Rio de
Janeiro, Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 92, n. 2, p. 215–
216, 2015.

FRANCO, D.L.; NASCIMENTO, R.C.; FERREIRA, K.S.; ALMEIDA, S.R. Antibodies

against Sporothrix schenckii enhance TNF-a production and killing macrophages.
Scandinavian Journal Immunology, v.75, p.142–146, 2012.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 88

FREITAS D.F.S.; DO VALLE A.C.F.; DE ALMEIDA PAES R.; BASTOS

F.I.;GUTIERREZ-GALHARDO M.C. Zoonotic sporotrichosis in Rio de Janeiro, Brazil: a
protracted epidemic yet to be curbed. Clinical Infection Disease, v.50, p.453, 2010.

FUNG, D.C.; SOMERVILLE, M.; RICHARDSON, P.S.; SHEEHAN, J.K. Mucus

glycoconjugate complexes released from feline trachea by a bacterial toxin. Ame rican
Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v.12, p.296–306, 1995.

GALHARDO, M.C.G. Esporotricose zoonótica no Rio de Janeiro ainda sem controle.

Bol. Informativo, Soc. Infectol. Rio de Janeiro, v.34, p.3-5, 2011.

GAO, J.Y.; YE, C.L.; ZHU, L.L.; TIAN, Z.Y.; YANG, Z.B. A homolog of glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase from Riemerella anatipestifer is an extracellular protein and
exhibits biological activity. Journal of Zheijang University SCIENCE B,v.15, p. 776–787,
2014.

GELANI, V.; FERNANDES, A.P.; GASPAROTO, T.H.; GARLET, T.P.; CESTARI,

T.M.; LIMA, H.R.; RAMOS, E.S.; DE SOUZA MALASPINA, T.S.; SANTOS,
C.F.; GARLET, G.P.; DA SILVA, J.S.; CAMPANELLI, A.P. The Role of Toll-Like
Receptor 2 in the Recognition of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Journal of
Periodontology, v.80, n.12, p.2010–2019, 2009.

GIL, M.L.; VILLAMON, E.; MONTEAGUDO, C.; GOZALBO, D.; MARTÍNEZ, J.P.
Clinical strains of Candida albicans express the surface antigen glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase in vitro and in infected tissues. FEMS Immunol Med Microbiol, v.23, n.3, p.
229-234, 1999.

GODALY, G.; BERGSTEN G.; HANG, L.; FISCHER, H.; FRENDÉUS, B.; LUNDSTEDT,
A.C.; SAMUELSSON, M.; SAMUELSSON, P.; SVANBORG C. Neutrophil recruitment,
chemokine receptors, and resistance to mucosal infection. The Journal of Leukocyte
Biology, v. 5, p. 69–90, 2001.

GONZALEZ-VELAZQUEZ, W.; GONZALEZ-MENDEZ, R.; RODRIGUEZ-DEL VALLE,

N. Characterization and ligand identification of a membrane progesterone receptor in fungi:
existence of a novel PAQR in Sporothrix schenckii. BMC Microbiology, v.12, p.194-194,
2012.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 89

GOZALBO, D.; GIL-NAVARRO, I.; AZORÍN, I.; RENAU-PIQUERAS, J.; MARTÍNEZ,

J.P.; GIL, M.L. The cell wall-associated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of
Candida albicans is also a fibronectin and laminin binding protein. Infection Immunity,
v.66, p.11, 1998.

GREMIAO, I.D.; MENEZES, R.C.; SCHUBACH, T.M.; FIGUEIREDO, A.B.;

CAVALCANTI, M.C.; PEREIRA SA. Feline sporotrichosis: epidemiological and clinical
aspects. Medical Mycology, v.53, n.1, p. 15-21, 2015.

GRIFFITHS, E.J.; HU, G.; FRIES, B.; CAZA, M.; WANG, J.; GSPONER, J.; GATES-
HOLLINGSWORTH, M.A.; KOZEL, T.R.; DE REPENTIGNY, L.; KRONSTAD, J.W. A
defect in ATP-citrate lyase links acetyl-CoA production, virulence factor elaboration and
virulence in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology, v. 86, p. 1404–1423, 2012.

GUARRO, J.; GENÉ, J.; STC HIGEL, A.M. Developments in fungal taxonomy. Clinical
microbiology reviews, v.12, n.3, p.454–500, 1999.

GUZMAN-BELTRAN, S.; PEREZ-TORRES, A.; CORONEL-CRUZ, C.; TORRES-

GUERRERO, H. Phagocytic receptors on macrophages distinguish between different
Sporothrix schenckii morphotypes. Microbes Infection, v.14, p.1093–1101, 2012.

HELM, M.; BERMAN, C. The clinical, therapeutic and epidemiological features of the
sporotrichosis infection on the mines. In Sporotrichosis infection on mines of the
Witwatersrand. Proceedings of the Transvaal Mine Medical Officers’ Association,
December 1944, Johannesburg: p. 59–67, 1947.

HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, F.; BIEVRE, C.; CAMACHO-ARROYO, I.; CERBON,

M.A.; DUPONT, B.; LOPEZ-MARTINEZ, R. Sex hormone effects on Phialophora
verrucosa in vitro and characterization of progesterone receptors. Journal Medicine
Veterinarium Mycology, v.33, n.4, p. 235-9, 1995.

HERNÁNDEZ-SANTOS, N.; GAFFEN, S.L. Th17 Cells in Immunity to Candida albicans.

Cell Host & Microbe., v. 11, n. 5, p. 425–435, 2012.

HOWARD, D.H. Dimorphism of Sporotrichum schenckii. Journal of Bacteriology, v.81,

p.464–469, 1961.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 90

HWANG, C.S.; BAEK, Y.U.; BAEK, Y.U.; YIM, H.S.; KANG, S.O. Protective roles of
mitochondrial manganese-containing superoxide dismutase against various stresses in
Candida albicans. Yeast, v.20, p.11, 2003.

ISAAC, D.T.; COADY A.; VAN PROOYEN, N.; SIL, A. The 3-Hydroxy- methylglutaryl
coenzyme a lyase HCL1 is required for macrophage colonization by human fungal pathogen
Histoplasma capsulatum. Infection and Immunity, v.81, n.2, p. 411-420, 2013.

ISHIDA, K.; DE CASTRO, R.A.; BORBA DOS SANTOS, L.P.; QUINTELLA,

L.P.; LOPES-BEZERRA, L.M.; ROZENTAL, S. Amphotericin B, alone or followed by
itraconazole therapy, is effective in the control of experimental disseminated sporot richosis by
Sporothrix brasiliensis. Medical Mycology, v.53, n.1, p.34–41, 2015.

ITOH, M.; OKAMOTO, S.; KARIYA, H. Survey of 200 cases of sporotrichosis.

Dermatologica, v.172, n.4, p.209–13, 1986.

IYALLA, C.A. Review of the virulence factors of pathogenic fungi. African Journal of
Clinical and Experimental Microbiology, v.18, n.1, p. 53- 58, 2017.

JELLMAYER, J.A.; FERREIRA, L.S.; MANENTE, F.A.; GONÇALVES, A.C.; POLESI,

M.C.; BATISTA-DUHARTE, A.; CARLOS, I.Z. Dectin-1 expression by macrophages and
related antifungal mechanisms in a murine model of Sporothrix schenckii sensu stricto
systemic infection. Microbes Pathogens, v.110, p.78-84, 2017.

JIMENEZ-LUCHO, V.; GINSBURG, V.; KRIVAN, H.C. Cryptococcus neoformans,

Candida albicans, e other fungi bind specifically to the glycosphingolipid lactosylceramide
(Galß1-4Glcß1-1Cer), a possible adhesion receptor for yeasts. Infection Immunity, v.58, p.
2085-2090, 1990.

KAJIWARA, H.; SAITO, M.; OHGA, S.; UENOTSUCHI, T.; YOSHIDA, S. Impaired Host
Defense against Sporothrix schenckii in Mice with Chronic Granulomatous Disease.
Infection & Immunity, v.72, n.9, p.5073–5079, 2004.

KAUFFMAN, C.A.; BUSTAMANTE, B.; CHAPMAN, S.W.; PAPPAS, P.G. Clinical

Practice Guidelines for the Management of Sporotrichosis: 2007 Update by the Infectious
Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases, v.45, n.10, p.1255–1265, 2007.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 91

KAUFFMAN, C.A. Sporotrichosis. Clinical Infection Disease, v.29, n.2, p.231-236, 1999.

KAWAI, T.; AKIRA, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update
on Toll-like receptors. Nature Immunology, v.11, p.373–384, 2010.

KHARAZMI, A.; BIBI, Z.; NIELSEN, H.; HØIBY, N.; DÖRING, G. Effect of Pseudomonas
aeruginosa rhamnolipid on human neutrophil and monocyte function. Apmis, v.97, p.1068–
1072, 1989.

KLEIN, B.S.; TEBBETS, B. Dimorphism and virulence in fungi. Current opinion in

microbiology, v.10, n.4, p. 314-319, 2007.

KOEDEL, U.; ANGELE, B.; RUPPRECHT, T.; WAGNER, H.; ROGGENKAMP,

A.; PFISTER, H.W.; KIRSCHNING, C.J. Toll- Like Receptor 2 participates in mediation of
immune response in experimental Pneumococcal meningitis. The Journal of Immunology,
v.170, n.1, p.438–444, 2003.

KORN, T.; BETTELLI, E.; OUKKA, M.; KUCHROO, V.K. IL-17 and Th17 Cells. Annual
Review of Immunology, v.27, p.485–517, 2009.

KUMAGAI, Y.; KONISHI, K.; GOMI, T.; YAGISHITA, H.; YAJIMA, A.; YOSHIKAWA,
M. Enzymatic properties of dipeptidyl aminopeptidase IV produced by the periodontal
pathogen Porphyromonas gingivalis and its participation in virulence. Infection and
Immunity, v.68, p.716–724, 2000.

KUROKAWA, C. S.; SUGIZAKI, M.F.; PERACOLI, M. T. S. Virulence factors in fungi of

systemic mycoses. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São
Paulo, v.40, n.3, p.125-136, 1999.

KWON-CHUNG, K.J. Comparision of isolates of Sporothrix schenckii obtained from fixed

cutaneous lesions with isolates from other type of lesions. Journal Infection Disease, v.139,
p.424–231, 1979.

KWON-CHUNG, K.J.; BENNET, J.E. Medical Mycology. Philadelphia: Lea & Febiger;
1992.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 92

KWON-CHUNG, K.J.; BENNETT, J.E. Subcutaneous and Deep Mycoses - Sporotrichosis.

Medical Mycology, p.707–729, 1992.

LABBÉ, K.; SALEH, M. Cell death in the host response to infection. Cell Death &
Differentiation, v.15, p.1339–1349, 2008.

LACAZ, C.S. Guia para identificação: fungos actinomicetos algas de interesse médico.
São Paulo: Sarvier, 1998.

LEAL, S.M.; JR COWDEN, S.; HSIA, Y.C.; GHANNOUM, M.A.; MOMANY, M.;
PEARLMAN, E. Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of Aspergillus
fumigatus keratitis. PLoS Pathogens, v.6, p. 976, 2010.

LEMAITRE, B.; NICOLAS, E.; MICHAUT, L.; REICHHART, J.M.; HOFFMANN, J.A.
The dorso ventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal
response in Drosophila adults. Cell, v. 86, p. 973–983, 1996.

LEONART, L.P.; TONIN, F.S.; FERREIRA, V.L.; PENTEADO, S.T.S.; WIENS, A.;
MOTTA, F.A.; PONTAROLO, R.A. Network meta-analysis of primary prophylaxis for
invasive fungal infection in haematological patients. Journal Clinical Pharmacology
Therapy. Epub ahead of print, 2017.

LI, M.; CHEN, Q.; SUN, J.; SHEN, Y.; LIU, W. Inflammatory response of human
keratinocytes triggered by Sporothrix schenckii via toll like receptor 2 and 4. The Journal of
Dermatological Science, v.66, p.80–82, 2012.

LIN, Y.; SLIGHT, S.; KHADER, S. Th17 cytokines and vaccine- induce dimmunity.
Seminars in Immunopathology, v.32, p.79–90, 2010.

LLOYD, K.O.; TRAVASSOS, L.R. Immunochemical studies on L-rhamno-D-mannans of

Sporothrix schenckii and related fungi by use of rabbit and human antisera. Carbohydrates
Research, v. 40, n.1, p. 89–97, 1975.

LOOSE, D.S.; SCHURMAN, D.J.; FELDMAN, D.A. Corticosteroid binding protein and
endogenous ligand in C. albicans indicating a possible steroid- receptor system. Nature,
v.293, n.5832, p. 477-79, 1981.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 93

LOOSE, D.S.; STEVENS, D.A.; SCHURMAN, D.J. Distribution of a corticosteroid binding

protein in Candida and other fungal genera. Journal Gene Microbiology, v.129, n.8, p.
2379-85, 1983.

LOPES-BEZERRA, L.M. Sporothrix schenckii cell wall peptidorhamnomannans. Frontiers

in Microbiology, v.2, p.243, 2011.

LOPES-BEZERRA, L.M.; SCHUBACH, A.; COSTA, R.O. Sporothrix schenckii and

sporotrichosis. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v.78, n.2, p.293–308, 2006.

LOPEZ-ROMERO, E.; REYES-MONTES, R.M.; REYES-MONTES, L.R.; PÉREZ-

TORRES, A.; RUIZ-BACA, E.; VILLAGÓMEZ-CASTRO, J.C.; MORA-MONTES,
H.M.; FLORES-CARREÓN, A.; TORIELLO, C. Sporothrix schenckii complex and
sporotrichosis, an emerging health problem. Future Microbiology, v.6, n.1, p. 85-102, 2011.

LOURES, F.V.; PINA, A.; FELONATO, M.; CALICH V.L. TLR2 is a negative regulator of
Th17 cells and tissue pathology in a pulmonary model of fungal infection. Journal
Immunology, v.183, p.279–90, 2009.

LUTZ, A.; SPLENDORE, A. Sobre uma micose observada em homens e ratos. Revista
médica São Paulo, v.21, p.433–450, 1907.

MADRID, I.M.; MATTEI, A.; MARTINS, A.; NOBRE, M.; MEIRELES, M. Feline
sporotrichosis in the southern region of Rio Grande do Sul, Brazil: clinical, zoonotic and
therapeutic aspects. Zoonoses Public Health, v.57, n.2, p. 151-154, 2010.

MAHAJAN, V.K. Sporotrichosis: An Overview and Therapeutic Options. Dermatology

Research and Practice, v.14, p.1–13, 2014.

MAIA, D.C.; SASSA, M.F.; PLACERES, M.C.; CARLOS, I.Z. Influence ofTh1/Th2
cytokines and nitric oxide in murine systemic infection induced by Sporothrix schenckii.
Mycopathologia, v.161, p.11–19, 2006.

MARIM, F.M.; SILVEIRA, T.N.; LIMA, D.S.; ZAMBONI, D.S. A method for generation of
bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS
ONE, v.5, p. 5263, 2010.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 94

MARIMON, R.; GENÉ, J.; CANO, J.; TRILLES, L.; DOS SANTOS LAZÉRA,
M.; GUARRO, J. Molecular Phylogeny of Sporothrix schenckii. Journal of Clinical
Microbiology, v.44, n.9, p.3251–3256, 2006.

MARIMON, R.; CANO, J.; GENÉ, J.; SUTTON, D.A.; KAWASAKI, M.; GUARRO,J.
Sporothrix brasiliensis, S. globosa, and S. mexicana, three new Sporothrix species of clinical
interest. Journal Clinical Microbiology, v.45, n.10, p. 3198-3206, 2007.

MARIO, D.A.N.; GUARRO, J.; SANTURIO, J.M.; ALVES, S.H.; CAPILLA, J. In Vitro and
In Vivo Efficacy of Amphotericin B Combined with Posaconazole against Experimental
Disseminated Sporotrichosis. Antimicrobial Agents and Che motherapy, v.59, n.8, p.5018–
5021, 2015.

MARQUES, S.; FRANCO, S.; CAMARGO, R.M.; DIAS, L.D.; HADDAD, J.R.V.; FABRIS,
V.E. Sporotrichosis of the domestic cat (Felis catus): human transmission. Revista do
Instituto de Medicina Tropical, v. 35, n.4, p. 327-330, 1993.

MARTINEZ-ALVAREZ, J.A.; PEREZ-GARCIA, L.A.; MELLADO-MOJICA, E.; LOPEZ,

M.G.; MARTINEZ-DUNCKER, I.; LOPES-BEZERRA, L.M. Sporothrix schenckii sensu
stricto and Sporothrix brasiliensis are differentially recognized by human peripheral blood
mononuclear cells. Frontiers in Microbiology, v.8, p.84, 2017.

MEDOFF, G.; MARESCA, B.; LAMBOWITZ, A.M. et al. Correlation between

pathogenicity e temperature sensitivity in different strains of Histoplasma capsulatum.
Journal Clinical Investigation, v.78, p.1638-1647, 1986.

MEDZHITOV, R.; PRESTON-HURLBURT, P.; JANEWAY, C.A.J.R. A human homologue

of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, v. 388, p.
394–397, 1997.

MESQUITA, J.R.D.; CRUVINEL, W.M.; CÂMARA, N.O.S.; KÁLLAS, E.G.; ANDRADE,

L.E.C. Autoimmune diseases in the TH17 era. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, v.42, n.6, p.476-486, 2009.

MEYER, E.M.; DE BEER, Z.W.; SUMMERBELL, R.C.; MOHARRAM, A.M.; DE HOOG,

G.S.; VISMER, H.F.; WINGFIELD, M.J. Taxonomy and phylogeny of new wood- and soil-

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 95

inhabiting Sporothrix species in the Ophiostoma stenoceras-Sporothrix schenckii complex.

Mycologia, v.100, n.4, p.647–661, 2008.

MIRANDA, L.H.M.; SANTIAGO, M.A.; SCHUBACH, T.M.P.; MORGADO, F.N.;

PEREIRA, S.A.; OLIVEIRA, R.V.C.; CONCEIÇÃO-SILVA, F. Severe feline sporotrichosis
associated with an increased population of CD8 low cells and a decrease in CD4⁺ cells.
Medical Mycology, v.54, n.1, p.29-39, 2016.

MIRKOV, I.; STOJANOVIC, I.; GLAMOCLIJA, J.; STOSIC-GRUJICIC, S.;

ZOLOTAREVSKI, L.; KATARANOVSKI, D.; KATARANOVSKI, M. Differential
mechanisms of resistance to sublethal systemic Aspergillus fumigates infection in
immunocompetent BALB/c and C57BL/6 mice. Immunobiology, v.216, n.1-2, p.234–42,
2011.

MONTENEGRO, H.; RODRIGUES, A.M.; DIAS, M.A.; DA SILVA, E.A.; BERNARDI, F.;
DE CAMARGO, Z. Feline sporotrichosis due to Sporothrix brasiliensis: an emerging animal
infection in Sao Paulo, Brazil. BMC Veterinary Research, v.10, n.269, p. 014-0269, 2014.

MORA-MONTES, H.M.S.; DANTAS, A.; TRUJILLO-ESQUIVEL, E.; DE SOUZA

BAPTISTA, A.R.; LOPES-BEZERRA, L.M. Current progress in the biology of members of
the Sporothrix schenckii complex following the genomic era. FEMS Yeast Research, v.15,
n.6, p.9, 2015.

MORRIS-JONES, R. Sporotrichosis. Clinical Experime ntal Dermatology, v.27, p.427–431,

2002.

MOUSSA, T.A.A.; KADASA, N.M.S.; AL ZAHRANI, H.S.; AHMED, S.A.; FENG, P.;
GERRITS, V.D.; ENDE, A.H.G.; ZHANG, Y.; KANO, R.; LI, F.; LI, S.; SONG, Y.; DONG,
B.; ROSSATO, L.; DOLATABADI, S.; HOOG, S. Origin and distribution of Sporothrix
globosa causing sapronoses in Asia. Journal Medical Microbiology, v.66, n.5, p.560-569,
2017.

MUCHMORE, H.G.; MCKOWN, B.A.; MOHR, J.A. Effect of steroid hormones on the
growth of Paracoccidioides brasiliensis. In proceding of the First Pan American Symposium
on Paracoccidioidomycosis; 1972; Washington, USA: PAHO Scientific Publication. n.254,
p. 300-304, 1972.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 96

NAKAMURA, K.; MIYAGI, K.; KOGUCHI, Y.; KINJO, Y.; UEZU, K.; KINJO,
T.; AKAMINE, M.; FUJITA, J.; KAWAMURA, I.; MITSUYAMA, M.; ADACHI,
Y.; OHNO.; TAKEDA, K.; AKIRA, S.; MIYAZATO, A.; KAKU.; KAWAKAMI, K.
Limited contribution of Toll- like receptor 2 e 4 to the host response to a fungal infectious
pathogen, Cryptococcus neoformans. FEMS Immunology & Medical Microbiology, v. 47,
n. 1, p. 148–154, 2006.

NARASIPURA, S.D.; CHATURVEDI, V.; CHATURVEDI, S. Characterization of

Cryptococcus neoformans variety gattii SOD2 reveals distinct roles of the two superoxide
dismutases in fungal biology and virulence. Molecular Microbiology, v.55, p.22, 2005.

NASCIMENTO, R.C.; ALMEIDA, S.R. Humoral immune response against soluble and
fractionate antigens in experimental sporotrichosis. FEMS Immunology Medical
Microbiology, v.43, p.241–247, 2004.

NASCIMENTO, R.C.; ESPÍNDOLA, N.M.; CASTRO, R.A.; TEIXEIRA, P.A.; LOUREIRO,

Y.; PENHA, C.V.; LOPES-BEZERRA, L.M.; ALMEIDA, S.R. Passive immunization with
monoclonal antibody against 70-kDa putative adhesin of Sporothrix schenckii induces
protection in murine sporotrichosis. European Journal Immunology, v.30, p.3080–3089,
2008.

NEGRINI, T.D.C.; FERREIRA, L.S.; ALEGRANCI, P.; ARTHUR, R.A.; SUNDFELD, P.P.;
MAIA, D.C.G.Role of TLR-2 and fungal surface antigens on innate immune response against
Sporothrix schenckii. Immunology Investigation, v.42, p.36–48, 2013.

NEIDHARDT, F.C. How microbial proteomics got started. Proteomics, v. 11, n.15, p. 2943-
2946, 2011.

NETEA, M. G.; VAN DER GRAAF, C.A.; VONK, A.G.; VERSCHUEREN, I.; VAN DER
MEER, J.W.; KULLBERG, B.J. The role of toll- like receptor TLR2 e TLR4 in the host
defense against disseminated candidiasis. Journal of Infectious Diseases, v.185, n.10,
p.1483–1489, 2002.

NETEA, M.G.; SUTMULLER, R.; HERMANN, C.; VAN DER GRAAF, C.A.; VAN DER
MEER, J.W.; VAN KRIEKEN, J.H.; HARTUNG, T.; ADEMA, G.; KULLBERG, B.J. Toll-

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 97

Like Receptor 2 Suppresses Immunity against Candida albicans through Induction of IL-10
and Regulatory T Cells. The Journal of Immunology, v. 172, n. 6, p. 3712–3718, 2004.

NICHOLS, J.R.; ALDRICH, A.L.; MARIANI, M.M.; VIDLAK, D.; ESEN, N.; KIELIAN, T.
Toll- like receptor 2 (TLR2) deficiency leads to increased Th17 infiltrates in experimental
brain abscesses. Journal of Immunology, v.182, n.11, p.7119-7130, 2009.

ODA, L.M.; KUBELKA, C.F.; ALVIANO, C.S.; TRAVASSOS, L.R. Ingestion of yeast
forms of Sporothrix schenckii by mouse peritoneal macrophages. Infection and immunity,
v.39, n.2, p. 497–504, 1983.

OLIVEIRA, M.M.E.; MAIFREDE, S.B.; RIBEIRO, M.A.; ZANCOPE-OLIVEIRA, R.M.

Molecular identification of Sporothrix species involved in the first familial outbreak of
sporotrichosis in the state of Espirito Santo, southeastern Brazil. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, v.108, n.7, p.936–938, 2013.

O'MEARA, T.R.; VERI, A.O.; KETELA, T.; JIANG, B.; ROEMER, T.; COWEN, L.E.
Global analysis of fungal morphology exposes mechanisms of host cell escape. Nature
Community, v.6, p.6741, 2015.

O'NEILL, L.A.; BOWIE, A.G. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in toll-
like receptor signalling. Nature Reviews: Immunology, v.7, n.5, p.353–364, 2007.

OROFINO-COSTA, R.; UNTERSTELL, N.; CARLOS, I.; GRIPP, A.; DE MACEDO,

P.M.; BROTA, A.; DIAS, E.; DE MELO TEIXEIRA, M.; FELIPE, M.S.; BERNARDES-
ENGEMANN, A.R.; LOPES-BEZERRA, L.M.. Pulmonary cavitation and skin lesions
mimicking tuberculosis in a HIV negative patient caused by Sporothrix brasiliensis. Medical
Mycology Case Reports, v.2, p.65–71, 2013.

PAIXÃO, A.G.; GALHARDO, M.C.G.; ALMEIDA-PAES, R.; NUNES,

E.P.; GONÇALVES, M.L.C.; CHEQUER, G.L.; LAMAS, C.D.C. The difficult management
of disseminated Sporothrix brasiliensis in a patient with advanced AIDS. AIDS Research
and Therapy, v.12, n.1, 2015.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 98

PANDEY, S.; KAWAI, T.; AKIRA, S. Microbial sensing by toll- like receptors and
intracellular nucleic acid sensors. Cold Spring Harbor Pers pectives in Medicine, v.5, n.1,
p.162-46, 2015.

PASTERNAK, J. Novas metodologias de identificação de microrganismos: MALDI-TOF.

Einstein (São Paulo), São Paulo, v.10, n.1, p.118-119, 2012.

PEREIRA, S.A.; GREMIÃO, I.D.; KITADA, A.A.; BOECHAT, J.S.; VIANA,

P.G.; SCHUBACH, T.M. The epidemiological scenario of feline sporotrichosis in Rio de
Janeiro, State of Rio de Janeiro, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, v.47, n.3, p.392–393, 2014.

PEREZ-SANCHEZ, L.; GONZALEZ, E.; GONZÁLEZ, E.; COLÓN-LORENZO, E.E.;

GONZÁLEZ-VELÁZQUEZ, W.; GONZÁLEZ-MÉNDEZ, R.; RODRÍGUEZ-DELVALLE,
N. Interaction of the heterotrimeric G protein alpha subunit SSG-1 of Sporothrix schenckii
with proteins related to stress response and fungal pathogenicity using a yeast two-hybrid
assay. BMC Microbiology, v.10, n.317, p.1471-2180, 2010.

POLI, G.; LEONARDUZZI, G. Oxidative stress and cell signalling. Current Medicinal
Chemistry, v.11, p.32, 2004.

POPOV, S.V.; POPOVA, G.Y.; OVODOVA, R.G.; BUSHNEVA, O.A.; OVODOV, Y.S.
Effects of polydaccharide from Silene vulgaria on phagocytes. Inte rnation Journal
Immunopharmacology, v. 21, p. 617–24, 1999.

PORTUONDO, D.L.; BATISTA-DUHARTE, A.; FERREIRA, L.S.; MARTÍNEZ,

D.T.; POLESI, M.C.; DUARTE, R.A.; DE PAULA E SILVA, A.C.; MARCOS,
C.M.; ALMEIDA, A.M.; CARLOS, I.Z. A cell wall protein-based vaccine candidate induce
protective immune response against Sporothrix schenckii infection. Immunobiology, v.221,
n.2, p. 300-309, 2016.

POULIOT, P.; PLANTE, I.; RAQUIL, M.A.; TESSIER, P.A.; OLIVIER, M. Myeloid-related
proteins rapidly modulate macrophage nitric oxide production during innate immune
response. Journal of Immunology, v.181, n.5, p.3595-601, 2008.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 99

POWELL, B.L.; DRUTZ, D.J.; HUPPERT, M.; SUN, S.H. Relationship of progesterone and
estradiol-binding proteins in Coccidioides immitis to coccidioidal dissemination in pregnancy.
Infection and Immunity, n.40, n.2, p.478-485, 1983.

RAPPLEYE C.A.; GOLDMAN, W.E. Fungal stealth technology. Trends Immunology, v.29,
n.1, p.18-24, 2008.

REED, K.D.; MOORE, F.M.; GEIGER, G.E.; STEMPER, M.E. Zoonotic transmission of
sporotrichosis: a case report and review. Clinical Infection Disease, v.16, p.384–7, 1993.

RODRIGUES, A.M.; DE HOOG, G.; ZHANG, Y.; DE CAMARGO, Z.P. Emerging

sporotrichosis is driven by clonal and recombinant Sporothrix species. Eme rging Microbes
Infection, v.3, n.5, p.7, 2014.

RODRIGUES, A.M.; FERNANDES, G.F.; ARAUJO, L.M.; DELLA TERRA, P.P.; DOS
SANTOS, P.O.; PEREIRA, S.A.; SCHUBACH, T.M.; BURGER, E.; LOPES-BEZERRA,
L.M.; DE CAMARGO, Z.P. Proteomics-based characterization of the humoral immune
response in sporotrichosis: toward discovery of potential diagnostic and vaccine antigens.
PLoS Negleted Tropical Disease, v.25, p.0004016, 2015.

RODRIGUES, A.M.; TEIXEIRA, M.M.; DE HOOG, G.S.; SCHUBACH, T.M.; PEREIRA,

S.A.; FERNANDES, G.F.; BEZERRA, L.M.; FELIPE, M.S.; DE CAMARGO, Z.P.
Phylogenetic Analysis Reveals a High Prevalence of Sporothrix brasiliensis in Feline
Sporotrichosis Outbreaks. PLoS Neglected Tropical Diseases, n.7, n.6, p.2281, 2013.

RODRIGUES, M.L.; NAKAYASU, E.S.; OLIVEIRA, D.L.; NIMRICHTER,

L.; NOSANCHUK, J.D.; ALMEIDA, I.C.; CASADEVALL, A. Extracellular vesicles
produced by Cryptococcus neoformans contain protein components associated with virulence.
Eukaryot Cell, n.7, n.1, p.58-67, 2008.

RODRIGUES, M.L.; NIMRICHTER, L.; OLIVEIRA, D.L.; NOSANCHUK,

J.D.; CASADEVALL, A. Vesicular Trans-Cell Wall Transport in Fungi: A Mechanism for
the Delivery of Virulence-Associated Macromolecules? Lipid Insights, v.2, p. 27-40, 2008.

ROMANI, L. Immunity to fungal infections. Nature Reviews Immunology, v.4, p.1–13,

2004.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 100

ROMO-LOZANO, Y.; HERNANDEZ-HERNANDEZ, F.; SALINAS, E. Sporothrix

schenckii yeasts induce ERK pathway activation and secretion of IL-6 and TNF-α in rat mast
cells, but no degranulation. Medical Mycology, v.52, p.862–868, 2014.

RUIZ-BACA, E.; HERNANDEZ-MENDOZA, G.; CUELLAR-CRUZ, M.; TORIELLO, C.;

LOPEZ-ROMERO, E.; GUTIERREZ-SANCHEZ, G. Detection of two immunoreactive
antigens of the cell wall of Sporothrix brasiliensis and S. globosa. Diagnostic Microbiology
Infection Disease, v.79, p.328–330, 2014.

RUIZ-BACA, E.; MORA-MONTES, H.M.; LOPEZ-ROMERO, E.; TORIELLO, C.;

MOJICA-MARIN, V.; URTIZ-ESTRADA, N. 2D- immunoblotting analysis of Sporothrix
schenckii cell wall. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.106, p.248–250, 2011.

RUIZ-BACA, E.; TORIELLO, C.; PEREZ-TORRES, A.; SABANERO-LOPEZ, M.;

VILLAGOMEZ-CASTRO, J.C.; LOPEZ-ROMERO, E. Isolation and some properties of a
glycoprotein of 70 kDa (Gp70) from the cell wall of Sporothrix schenckii involved in fungal
adherence to dermal extracellular matrix. Medical Mycology, v.47, p.185–196, 2009.

SAMSON, J.D.; RICHARD, S.; COLING, D. Auditory proteomics: methods,

accomplishments e challenges. Brain Research, v.24, n.1277, p. 24–36, 2009.

SASSÁ, M.F.; SATURI, A.E.; SOUZA, L.F.; RIBEIRO, L.C.; SGARBI, D.B.; CARLOS,
I.Z. Response of macrophage Toll- like receptor 4 to a Sporothrix schenckii lipid extract
during experimental sporotrichosis. Immunology, v.128, n.2, p. 301–309, 2009.

SASSÁ, M.F.; FERREIRA, L.S.; ABREU-RIBEIRO, L.C.; CARLOS, I.Z. Immune response
against Sporothrix schenckii in TLR-4-deficient mice. Mycopathologia, v.174, p. 21–30,
2012.

SCHUBACH, A.; BARROS, M.B. Epidemic sporotrichosis. Curre nt Opinion Infection

Disease, v.21, n.2, p.129-133, 2008.

SCOTT, E.N.; MUCHMORE, H.G. Immunoblot analysis of antibody responses to Sporothrix

schenckii. Journal Clinical Microbiology, v.27, p.300–304, 1989.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 101

SILVA, A.C.; BEZERRA, L.M.; AGUIAR, T.S.; TAVARES, D.; ARAUJO, L.M.; PINTO,
C.E.; RIBEIRO, O.G. Effect of genetic modifications by selection for immunological
tolerance on fungus infection in mice. Microbes Infection, v.3, p.215–222, 2001.

SILVEIRA, C.P.; PIFFER, A.C.; PIFFER, A.C.; KMETZSCH, L.; FONSECA,

F.L.; SOARES, D.A.; STAATS, C.C.; RODRIGUES, M.L.; SCHRANK, A.; VAINSTEIN,
M.H. The heat shock protein (Hsp) 70 of Cryptococcus neoformans is associated with the
fungal cell surface and influences the interaction between yeast and host cells. Fungal Genet
Biol, v.60, p. 53-63, 2013.

SOMERVILLE, M.; TAYLOR, G.; WATSON, D. Release of mucus glycoconjugates by

Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid into feline trachea in vivo and human bronchus in
vitro. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v.6, p.116–122,
1992.

STANKE, M.; STEINKAMP, R.; WAACK, S.; MORGENSTERN, B. AUGUSTUS: a web

server for gene finding in eukaryotes. Nucleic Acids Research, v.32, p.309–312, 2004.

STEEN, H.; MANN, M. The ABC's (e XYZ's) of peptide sequencing. Nature Reviews
Molecular Cell Biology, v.5, n.9, p.699-711, 2004.

STERKEL, A.K.; LORENZINI, J.L.; FITES, J.S.; SUBRAMANIAN, V.K.; SULLIVAN,

T.D.; WUTHRICH, M.; BRANDHORST, T.; HERNANDEZ-SANTOS, N.; DEEPE,
G.S.J.R., KLEIN, B.S. FUNGAL Mimicry of a Mammalian Aminopeptidase Disables Innate
Immunity and Promotes Pathogenicity. Cell Host & Microbe, v.19, n.3, p. 361-374, 2016.

SUN, J.N.; SOLIS, N.V.; PHAN, Q.T.; BAJWA, J.S.; KASHLEVA, H.; THOMPSON, A.;
LIU, Y.; DONGARI-BAGTZOGLOU, A.; EDGERTON, M.; FILLER SGHOST. Cell
Invasion and Virulence Mediated by Candida albicans Ssa1. PLoS Pathogens, v.6, n.11,
p.1001181, 2010.

TACHIBANA, T.; MATSUYAMA, T.; MITSUYAMA, M. Involvement of CD4+ T cells and

macrophages in acquired protection against infection with Sporothrix schenckii in mice.
Medical Mycology, v.37, n.6, p.397–404, 1999.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 102

TAKEUCHI, O.; HOSHINO, K.; AKIRA, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient e MyD88-

Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of
Immunology, v.165, n.10, p.5392–5396, 2000.

TAKEUCHI, O; AKIRA, S. Pattern Recognition Receptors e Inflammation. Cell, v.140, n.6,

p.805–820, 2010.

TEIXEIRA, P.A.; DE CASTRO, R.A.; NASCIMENTO, R.C.; TRONCHIN, G.; TORRES,

A.P.; LAZÉRA, M.; DE ALMEIDA, S.R.; BOUCHARA, J.P.; LOUREIRO, Y.; PENHA,
C.V.; LOPES-BEZERRA, L.M. Cell surface expression of adhesins for fibronectin correlates
with virulence in Sporothrix schenckii. Microbiology, p.155, p. 3730-3738, 2009.

UENOTSUCHI, T.; TAKEUCHI, S.; MATSUDA, T.; URABE, K.; KOGA, T.; UCHI,
H.; NAKAHARA, T.; FUKAGAWA, S.; KAWASAKI, M.; KAJIWARA, H.; YOSHIDA,
S.; MOROI, Y.; FURUE, M. .Differential induction of Th1-prone immunity by human
dendritic cells activated with Sporothrix schenckii of cutaneous and visceral origins to
determine their different virulence. International Immunology, v.18, n.12, p.1637–1646,
2006.

VARTIVARIAN, S.E. Virulence and nonimmune pathogenic mechanisms of fungi. Clinical

Infected Disease, v.14, p. 30-36, 1992.

VERDAN, F.F.; FALEIROS, J.C.; FERREIRA, L.S.; MONNAZZI, L.G.; MAIA,

D.C.; TANSINE, A.; PLACERES, M.C.; CARLOS, I.Z.; SANTOS-JUNIOR, R.R. Dendritic
cell are able to differentially recognize Sporothrix schenckii antigens promote Th1/Th17
response in vitro. Immunobiology, v. 217, n. 8, p. 788–794, 2012.

WANG, Y.; COLEMAN-DERR, D.; CHEN, G.; GU, Y.Q. OrthoVenn: a web server for
genome wide comparison and annotation of orthologous clusters across multiple species.
Nucleic Acids Res, v.43, p.78–84, 2015.

YANG, X.; LU, J.; SUN, X.; HE, Q. Application of subproteomics in the characterization of
Gram-positive bacteria. Journal of Proteomics, v.75, n.10, p.2803-2810, 2012.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 103

YATES, J.R.; RUSE, C.I.; NAKORCHEVSKY, A. Proteomics by mass spectrometry:

approaches, advances and applications. Annual Review of Biomedical Engineering, v.11,
p.49-79, 2009.

ZHANG, S.; HACHAM, M.; PANEPINTO, J.; HU, G.; SHIN, S.; ZHU, X.; WILLIAMSON,
P.R. The Hsp70 member, Ssa1, acts as a DNA-binding transcriptional co-activator of laccase
in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology, v.62, n.4, p.1090-1101, 2006.

ZHANG, Y.; HAGEN, F.; STIELOW, B.; RODRIGUES, A.M.; SAMERPITAK, K.; ZHOU,
X.; FENG, P.; YANG, L.; CHEN, M.; DENG, S.; LI, S.; LIAO, W.; LI, R.; LI, F.; MEIS,
J.F.; GUARRO, J.; TEIXEIRA, M.; AL-ZAHRANI, H.S.; PIRES DE CAMARGO,
Z.; ZHANG, L.; DE HOOG, G.S. Phylogeography and evolutionary patterns in Sporothrix
spanning more than 14 000 human and animal case reports. Persoonia: Molecular
Phylogeny and Evolution of Fungi, v.35, p. 1-20, 2015.

ZHANG, Z.; HOU, B.; XIN, Y.; LIU, X. Protein profiling of the Dimorphic Pathogenic
Fungus, Sporothrix schenckii. Mycopathologia, v.173, n.1, p.1-11, 2012.

ZULIANELLO, L.; CANARD, C.; KÖHLER, T.; CAILLE, D.; LACROIX, J.S.; MEDA, P.
Rhamnolipids are virulence factors that promote early infiltration of primary human airway
epithelia by Pseudomonas aeruginosa. Infection & Immunity, v.74, p.3134–3147, 2006.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 104

ANEXOS
Anexo I- Comitê de Ética

Anexo II-Tabelas

Anexo III- Currículo Lattes

Anexo IV- Ficha do Aluno

ANEXOS
 105

ANEXO I: COMITÊ DE ÉTICA

ANEXOS
 106

ANEXOS
 107

ANEXO II: TABELAS

ANEXOS
 108

Tabela A. Descrição de 60 proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis com informações sobre genes, funções biológicas, funções moleculares e localização
celular quando comparadas a espécie S. schenckii

Proteínas Espécie Genes GeneBank Funções Funções Localização Cobertura Identidade

biológicas metabólicas celular
Dihidroorotate desidrogenase Sporothrix SPBR_08348 KIH86494 processo atividade Citoplasma 100% 87%
(Fumarato) brasiliensis metabólico catalítica /Membrana
5110
NADH /ubiquinone Sporothrix SPBR_08943 KIH87935.1 processo atividade Membrana 100% 77%
oxidoredutase subunidade brasiliensis metabólico catalítica
B17.2 5110
Fn/atype H+ F / tipo H + Sporothrix SPBR_03833 KIH94953.1 atividade catalítica/ processo Membrana 100% 99%
transportando ATPase brasiliensis atividade metabólicotranspo
(proteína de conferência de 5110 transporteadora rte
sensibilidade à oligomicina)
Proteína ligante repressora de Sporothrix SPBR_01893 KIH91859.1 processo atividade n/a 79% 98%
TRP brasiliensis metabólico/ catalítica/ ligante
5110 regulação de de nucleotídeos
processo biológico
Chaperona molecular HtpG Sporothrix SPBR_08225 KIH87017.1 processo ligante de n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico/ nucleotídeos/
5110 resposta a estímulos ligante de
proteínas
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_08110 KIH86792.1 processo atividade n/a 100% 96%
SPBR_08110 brasiliensis metabólico catalítica
5110
Glicose-6-fosfato-isomerase Sporothrix SPBR_08313 KIH86517.1 processo atividade citosol/ 100% 99%
brasiliensis metabólico catalítica mitocondria
5110
Proteína Dissulfeto Isomerase Sporothrix SPBR_03704 KIH94903.1 Homeostase atividade n/a 100% 99%
A6 brasiliensis celular/ Regulação catalítica
5110 de processo
biológico
Proteína ribossomal L24 50S Sporothrix SPBR_00948 KIH90021.1 processo atividade ribossomo 100% 96%
brasiliensis metabólico molecular
5110 estrutural

ANEXOS
 109

Proteína hipotética Myceliophthora G2Q7P9 AEO56908.1 Organização celular transporte Retículo 0% 0%

MYCTH_87315 thermophila e biogênese endoplasmático
ATCC 42464
Biossíntese 3-oxoacyl-[acyl- Sporothrix SPBR_07600 KIH88611.1 n/a n/a n/a 100% 97%
carrier-protein] ramnolipídeo brasiliensis
redutase 5110
Proteína de transferência de Sporothrix SPBR_06198 KIH93973.1 transporte n/a n/a 100% 97%
Fosfatidilinositol/fosfati dilglicer brasiliensis
ol 5110
Amidase Sporothrix SPBR_06807 KIH89419.1 n/a atividade n/a 100% 98%
brasiliensis catalítica
5110
Argininosuccinato sintase Sporothrix SPBR_01738 KIH91160.1 processo atividade n/a 100% 98%
brasiliensis metabólico catalítica/ Ligante
5110 de nucleotídeos
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_07851 KIH88070.1 n/a n/a n/a 71% n/a
SPBR_07851 brasiliensis
5110
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_05199 KIH87334.1 n/a atividade n/a 100% 34%
SPBR_05199 brasiliensis catalítica/ ligante
5110 de íons
metabólicos
Isocitrate deidrogenase Sporothrix SPBR_08430 KIH86783.1 processo atividade n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
glutamate carboxypepti dase II Sporothrix SPBR_05612 KIH94312.1 processo atividade membrana 100% 95%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
4- aminobutirato Sporothrix SPBR_07224 KIH88319.1 processo atividade n/a 93% 99%
aminotransferase brasiliensis metabólico catalítica
5110
uracil fosforibosiltransferase Sporothrix SPBR_07698 KIH88638.1 processo atividade n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico molecular
5110 estrutural
Proteína ribossomal 50S L12 Sporothrix SPBR_03855 KIH94752.1 processo Ligante de RNA n/a 98% 98%
brasiliensis metabólico
5110

ANEXOS
 110

Ribonucleoproteína nuclear Grosmannia 25974317 XP_01417399 Organização Ligante de Citosol/Membra 98% 96%
pequena clavigera CMQ_1439 3.1 cellular e Proteína na/ complexo
kw1407 biogênese/ processo spliceomal
metabólico nuclear
Fosfoproteína induzida por Sporothrix SPBR_03671 KIH94846.1 n/a Ligante de n/a 100% 98%
stress brasiliensis Proteína
5110
Proteína de choque térmico1/8 Sporothrix SPBR_01381 KIH91446.1 Organização celular Ligante de n/a 100% 97%
70kDa brasiliensis e biogênese nucleotídeos
5110
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_06610 KIH88336.1 processo n/a n/a 99% 93%
SPBR_06610 brasiliensis metabólico/
5110 transporte
F / tipo H + transportando a Sporothrix SPBR_06158 KIH94562.1 processo atividade n/a 100% 99%
subunidade ATPase d brasiliensis metabólico transportadora
5110
aconitate hidratase 1 Sporothrix SPBR_06580 KIH88979.1 Processo Atividade Mitocôndria 100% 98%
brasiliensis metabólico catalítica/ ligante
5110 de íons metálicos
Alfa, alfa-trealose-fosfato Sporothrix SPBR_01272 KIH91949.1 processo atividade n/a 100% 99%
sintase (UDP) brasiliensis metabólico catalítica
5110
peptidilprolil isomerase Sporothrix SPBR_03853 KIH94837.1 processo atividade n/a 100% 97%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
Proteína ribossomal 60S Sporothrix 27672076 KJR81717.1 processo Ligante de RNA Ribossomo 80% 86%
L9 schenckii 1099 metabólico atividade
molecular
estrutural
Proteína HMG box Sporothrix SPBR_07025 KIH89565.1 processo n/a n/a 20% 30%
brasiliensis metabólico
5110
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_04209 KIH93566.1 processo atividade n/a 100% 99%
SPBR_04209 brasiliensis metabólico catalítica
5110
Proteína ribossomal grande Sporothrix SPBR_01995 KIH91855.1 processo Ligante de RNA Ribossomo 100% 99%
L10Ae brasiliensis metabólico atividade
5110 molecular

ANEXOS
 111

estrutural
Transaldolase Sporothrix 27671049 KJR90067.1 processo atividade Citoplasma 100% 96%
schenckii 1099 metabólico catalítica
Glicina Hidroximetiltransferase Sporothrix SPBR_08301 KIH86718.1 processo atividade n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
Malato deidrogenase Sporothrix SPBR_02876 KIH92656.1 n/a atividade n/a 100% 92%
brasiliensis catalítica
5110
succinate deidrogenase, Sporothrix HMPREF1624_ ERT00471.1 processo atividade Membrana 100% 100%
citocromo subunidade b556 schenckii 03844 metabólico catalítica /mitocôndria
ATCC 58251
Proteínas de domínio SET e Sporothrix SPBR_06963 KIH89592.1 processo ligante de íons n/a 100% 90%
MYND brasiliensis metabólico metálicos/Ligante
5110 de proteínas
6,7-dimethyl-8-ribityllumazine Sporothrix SPBR_03190 KIH92749.1 processo atividade n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
peptidil / a prolil isomerase D Sporothrix SPBR_08511 KIH86777.1 processo atividade n/a 100% 98%
(ciclofilina D) brasiliensis metabólico catalítica/Ligante
5110 de proteínas
Acetil CoA Sporothrix SPBR_08395 KIH86467.1 processo n/a 100% 98%
hydrolase brasiliensis metabólico atividade
5110 transporte catalítica
Aminopepti dase I Sporothrix SPBR_02593 KIH92463.1 n/a atividade n/a 58% 95%
brasiliensis catalítica /ligante
5110 de íons metálicos
Ubiquinol / citocromo c Sporothrix SPBR_08570 KIH92463.1 n/a atividade Membrana 100% 97%
redutase ferro / enxofre brasiliensis catalítica/ ligante /mitocôndria
subunidade 5110 de íons metálicos/
atividade
transportadora
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_01963 KIH91848.1 processo n/a n/a 98% 98%
SPBR_01963 brasiliensis metabólico
5110
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_08650 KIH86376.1 n/a n/a Membrana 100% 71%
SPBR_08650 brasiliensis

ANEXOS
 112

5110
Fator de Elongação 1-β Sporothrix SPBR_08497 KIH86915.1 Processo Ligante de RNA n/a 96% 93%
brasiliensis metabólico
5110
Ácido nucleico / proteína de Sporothrix SPBR_01765 KIH91260.1 processo Ligante de n/a 100% 94%
ligação brasiliensis metabólico nucleotídeos
5110
3- isopropilmalato Sporothrix SPBR_00587 KIH90609.1 n/a atividade Citoplasma 100% 99%
desidrogenase brasiliensis catalítica/ ligante
5110 de íons metálicos/
Ligante de
nucleotídeos
aminotransferase de Sporothrix SPBR_00671 KIH90264.1 n/a atividade n/a 100% 98%
aminoácidos de cadeia brasiliensis catalítica
ramificada 5110
Mn superóxido dismutase Grosmannia ""CMQ_4819 XP_01416845 Processo Atividade Mitocôndria 84% 49%
clavigera 25978072"" 0.1 metabólico/ antioxidante/ Lúmen de
kw1407 Resposta a atividade organelas
estímulos catalítica/ ligante
de íons metálicos
Gliceraldeído3-fosfato Sporothrix SPBR_04305 KIH93501.1 processo Atividade n/a 100% 99%
desidrogenase brasiliensis metabólico catalítica/ Ligante
5110 de nucleotídeos
acetil - CoA acetiltransferase Sporothrix SPBR_07331 KIH89516.1 processo atividade n/a 100% 99%
brasiliensis metabólico catalítica
5110
Proteína ligante de Sporothrix SPBR_06164 KIH94433.1 n/a n/a n/a 100% 97%
progesterona brasiliensis
5110
Proteína de replicação do DNA Sporothrix SPBR_01859 KIH91552.1 n/a transporte Membrana 100% 99%
YHM2 brasiliensis
5110
Hidrometil Coa-liase Sporothrix SPBR_00689 KIH90753.1 n/a atividadecatalítica n/a 100% 98%
brasiliensis
5110
Citocromo c oxidase Sporothrix SPBR_05223 KIH87484.1 transporte atividade transporte Membrana 100% 98%
subunidade 6a brasiliensis catalítica/ atividade /mitocôndria

ANEXOS
 113

5110 transporteadora
Het C Sporothrix SPBR_03215 KIH92608.1 transporte atividade Citoplasma 100% 98%
brasiliensis transporteadora
5110
Proteína hipotética Sporothrix SPBR_00881 KIH90812.1 processo atividade n/a 100% 96%
SPBR_00881 brasiliensis metabólico catalítica/ Ligante
5110 de nucleotídeos
Carboximetilenebutenoli dase Sporothrix SPBR_05059 KIH87357.1 atividade catalítica/ n/a n/a 100% 90%
brasiliensis atividade
5110 transporteadora
Glucanase extracelular de Sporothrix SPBR_00668 KIH90339.1 Organização celular atividade n/a 100% 95%
parede celular brasiliensis biogênese/processo catalítica
5110 metabólico

ANEXOS

Tabela B . Descrição de 60 proteínas diferenci al mente expressas em espécies de S. brasiliensis, com números de peptí deos únicos, cobertura e sequência de
peptídeos.
Descrição de Proteínas
Dihidroorotate desidrogenase
(Fumarato)
NADH /ubiquinone
oxidoredutase subunidade
B17.2
Fn/atype H+ F / tipo H +
transportando ATPase
(proteína de conferência de
sensibilidade à oligomicina)
Proteína ligante repressora de
TRP
Chaperona molecular HtpG
Proteína hipotética
SPBR_08110
Glicose-6-fosfato-isomerase
Proteína Dissulfeto Isomerase
A6
114
Peptídeos Cobertura Sequência Peptídica
únicos
1 3.7 DLQAAAPLTHILAA VVDAA R
INAWDPVAAPR,AWAVPEHRPNFTGTR,A GTLIGVDK,INAWDPVAAPRQ,TYSTTKPK
5 25.5
13 60.2 TVAALAALLAK,LGAILATPTLSTA DK,LA LLGDVATK,LETAIAK,TSTLDPTAKTVAALAALLAK,STNSANQ
PTVSHFLQTLA ENNR,TSTLDPTAK,DSKLGAILATPTLSTA DKTA VIA ELQK,STFVGQGK,TA VIA ELQK,APV
ALFGLDGTYATA LYTAA VK,TIDLSVSAK,VNPDILGGLVVEVGDR
8 42.1 QLAEAEK,IAIVFYSLYGHIR,A GGTADLYQVEETLSEEVLAK,MHAPPKPTDIPVLTDPATLLQYDAFLFGIPTR
,SGGIWASGGYA GK,YGNFPAQWK,EIATIQGEAFYK
45 66.7 SPFLDSLK,HFSVEGQLEFR,IDIIPDKDA K,DFELEETDEEK,RAPFDLFETKK,KVTETTIEEEELNK,DFELEETD
EEKK,YESLSDPSKLDSGK,APFDLFETK,KTFEISPQSPIIK,VEA DGEDDKTVK,RVFITDDATDLVPEWLSFIK,
ELVSNASDALDKIR,LTGSPCAIR,ELVSNASDA LDK,IILHLKDEQM DYLNESK,ADLVNNLGTIA R,KVEADGE
DDKTVK,DTSMSSYMSSK,LGIHEDTQNRPA LAK,LVSLGLNIDEEPEIDDAAPTEAPA VTDA GDSAM EEVD,SI
ELFTEISEDKEQFDK,TGQFGWSANM ER,GVVDSEDLPLNLSR,EA EEKEYEGVAK,NPQDINQEEYASFYK,SI
VQLLFETSLLVSGFTIDEPASFA ER,SIELFTEISEDKEQFDKFYTAFSK,YESLSDPSK,SGDEQTSLADYVTR,SL
TNDWEDHLA VK,VTETTIEEEELNK,ETEKEVPDEDAEEETTTEDSDDKKPK,RAPFDLFETK,NNDDEQYIW E
SSAGGTFTILPDTEGEPLGR,KKVEADGEDDK,GFEVLFLVDPIDEYAMTQLK,LVDITKDFELEETDEEKK,VFI
TDDATDLVPEW LSFIK,EVPDEDA EEETTTEDSDDKKPK,DFELEETDEEKKTR,TFEISPQSPIIK,HSEFISYPIYL
HVK,KLVDITK
18 49.8 AVEQAGPTVQK,VDSGAPGEGASAAAPATK,A VDTPVATLPVKEEPVAAK,VPEAPVTSDGTTTANNQSSISPT
AVVGSVTAAAAAIGATA LATATSAK,VGDVFQNTVELGNISK,ESIQQA GTSPEAAANPTAIQEK,ETPASSTVI
SSAAPASSTAALAADVPLEK,LVNPLPAAPGGVNPVK,QVLPTSIQEQLATTAA GGEA EASNVPA EVK,FVVDG
EWVLDPAAPK,ETSTATDIAAPVTAAAA GVAA VGAA VVATAK,KVDSGAPGEGASAAAPATK,AATSAPVKE
EAVPAVVK,ESQEAA GVSPEASAIPTEVTEK,A LDAPVSILPVTEAPIVA GATPAFASA ISSAAPQSSTAQLA GA
VPLEPK,SGDINA NVK,NIIPESSLPIVGGNDVAINSAAPAATTAALA GA VPLEK,KVPEAPVTSDGTTTANNQSS
ISPTAVVGSVTAAAAAIGATA LATATSAK
1 2.3 NFLTEETLA LLLK
2 8.2 YGVTTFPA LLLLTGDDDATPIA YEGK,ALATDFLGSIAIGQVR
ANEXOS

Proteína ribossomal L24 50S
Proteína hipotética
MYCTH_87315
Biossíntese 3-oxoacyl-[acyl-
carrier-protein] ramnolipídeo
redutase
Proteína de transferência de
Fosfatidilinositol/fosfati dilglic
erol
Amidase
Argininosuccinato sintase
Proteína hipotética
SPBR_07851
Proteína hipotética
SPBR_05199
Isocitrate deidrogenase
glutamate carboxypepti dase II
4- aminobutirato
aminotransferase
uracil fosforibosiltransferase
Proteína ribossomal 50S L12
Ribonucleoproteína nuclear
pequena
Fosfoproteína induzida por
stress
Proteína de choque térmico1/8
70kDa
115
1 7.8 VALGLPAEGLEAAQAAAEAAR
1 33.9 VAIHYGYLPLVLYLGYTR
2 16.8 LGKPEDFA GA VVYLTSR,QDSPEGIDILLA NA GATW GEPFDTHPDAAIAK
5 60.3 SVDLSPNPPQA GVELVITA VAA VSQTITK,GA YVNLQVK,LINTTADLCEQIENVDLECPIQK,SPLEFCPSDHSN
DILTIK,YTVLA DA YTVDDEPITCLTATVTFA R
1 3.0 SGTLSPVDVVEA LLPLVQR
3 12.0 LVADGQTYTDSVELFLQA NALGK,LAHLDLEGLVLDGK,FELAFLTIDPAIK
10 54.0 QEVIEFLKK,LDIRPTHFANLEA SK,TFDFA GSSFIVLADSKQEVIEFLKK,QEVIEFLK,TFDFA GSSFIVLA DSKQ
EVIEFLK,FGGAILK,TFDFA GSSFIVLADSK,RLDIRPTHFA NLEASK,DKPSDPADPK,LDIRPTHFANLEASKSR
7 50.0 VLSTFVDA YA DGSLSPPEKPA EVLAK,ATDATDYAALASTVDLA VSTW GR,IVLVSTGASK,LYDINVFSA LA L
AK,LADADLDAWKR,LDGVVINHGA LTPVQR,AAANALVQHLA VEEPEIVSVA VAPGR
6 17.4 GKLDDTPELVSFADA LER,DLA LA CGK,LILPFLDIDLK,ETSTNPIASIFAWTR,LVPGW EKPIIIGR,YYDLGLEH
R
5 9.0 GSPDHFIPSIPSVPISYVDALPILK,AFGVAAAQGWQPLR,IGPLGSGSDYTAFLDHA GITSVDVR,LDSA VSELA
ALAK,LALERLDSA VSELAALAK
10 32.2 LAAQYPDQFANLR,TFGVNIGGSGANA VR,HADILIDA LEK,VGDYLFGK,AEAAALA EVEDLILNFHSPPAA V
VVEPIQSEGGDNHASPAFFR,A VADDLNTVFDTR,VAPPGLDQVFTA LA GSDA NETA YK,NDLVA QTAR,AIID
YIQK,LDIPAFDWPR
2 20.9 ILFLNLIASPQGVSK,IGSQNPSATVSTPVNFETVTVLPQTPQLIALLSIIR
7 54.8 IATIVDQISQLTLLETASLVSSLKTR,FVESAPK,IATIVDQISQLTLLETASLVSSLK,LESFDA GSKPK,ESVPKEE
AEK,LNIPDLPIGGFAA GPAAPAAAAEAPEEDDAPAAAEK,SLLGLSLVDSK
2 7.7 YFILPDSLPLDTLLVDDAPKPK,GSTIRYFILPDSLPLDTLLVDDAPKPK
26 46.6 DWDHAFADAEKTTQLKPDWPKGW GR,A YEA YQEGLK,LGQLDQAIDNYNK,IGTAHER,A LGNKAIA AKNF
DEAVEHFTAAIAIDPENHILYSNR,DFDDA IAHYQK,DWDHAFADA EK,TKIQKLIAA GVIR,A EEKVEGVVEEP
EAPEEEDEEAK,DIVYLNNLGAAQFEK,GDYEAAIAACTQA VEEGR,LGQLDQAIDNYNKSLREQR,NFDEA VE
HFTAAIAIDPENHILYSNR,AAKEEADKEK,LGSA LYGK,A LGTASYK,TPDVVAK,QA YIDPAKA EAAR,DNET
EEQTR,TTQLKPDWPKGW GR,LQAIQA NPSNVQDIFSDPR,TDLDNVER,LLELPSA LDDCDAAIKHDPTFVR,LI
AAGVIR,LGQLDQAIDNYNKSLR,VEGVVEEPEAPEEEDEEAK
34 68.2 FELTGIPPAPR,SEVFSTFSDNQPGVLIQVFEGER,FYGSGGA PGGAPDGAPGGFPGAPGGATHDDGPTVEEVD,
SNQIVITNDKGR,TLSSSAQTSIEIDSLFEGIDFYTSITR,KSEVFSTFSDNQPGVLIQVFEGER,FEELCQDLFR,NQ
VAMNPQNTVFDA K,FKEEDEA EGRR,NTLSDSKVDEK,TTPSFVAFTDTER,SINPDEA VA YGAA VQAAILSGD
ANEXOS
 116

TSSK,IEIIANDQGNR,FKEEDEAEGR,IINEPTAAAIA YGLDK,NTTIPTKK,FA DPEVQADMK,DDRIEIIA NDQG

NR,LITDYFNGKEPNK,IDKSQVHEIVLVGGSTR,SQVHEIVLVGGSTR,GGKPVIEVEFK,DA GLIA GLNVLR,VV
SWLDESQQATR,STLQPVDR,GGKPVIEVEFKGETK,NGLESYA YSLR,LSKDDIER,IINEPTAAAIA YGLDKK,E
TAESYLGGTINNA VVTVPA YFNDSQR,ARFEELCQDLFR,STNEILLLDVA PLSLGIETA GGMMTK,SNQIVITN
DK,NVLIFDLGGGTFDVSLLTIEEGIFEVK
Proteína hipotética 1 3.7 YAVDLLTPVADEA VVAA VA EAIEGSPGGDLK
SPBR_06610
F / tipo H + transportando a 13 72.8 SAALKLDWAK,ETVDLEIK,KVQALSEQPTTVDFAHYR,ETVDLEIKDLEK,GQTVASLQAFK,NTA VVDEIEKR
subunidade ATPase d ,WSVPGYK,NIDEA RPFEDLTVDEVAAAESSIDEK,VQA LSEQPTTVDFAHYR,AIEAFEVEA VR,SILKNTA VVD
EIEKR,FAAFKPASYDVSR,TLKNIDEA RPFEDLTVDEVAAA ESSIDEK
aconitate hidratase 1 17 31.7 LQVLSPFDAWNGKDATDLPILIK,NDGNPATHAFVTSPDLVVA LTIA GSLHFNPLTDK,AQVQVQVSPTSDR,IL
YSHLDDPHGQDIER,NQLTGEFGGVPDVA R,VIGVNLTGK,AQVQVQVSPTSDRLQVLSPFDAWNGKDATDLP
ILIK,SIFTVTPGSEQIR,LNRPLNFA EK,LQVLSPFDAWNGK,VDVLSTELA VGKPLTLR,EVYDFLA SA CAK,A D
EGAEYDQVIEIDLNTLEPHINGPFTPDLATPISK,DGAAFDIPLAHTFNASQIEWFK,GTPNSIVSSYNR,DATDLP
ILIK,GIQW VVIGDW NYGEGSSR
Alfa, alfa-trealose-fosfato 1 2.6 IGNLPTIVANTLDAATSA VADA VSK
sintase (UDP)
peptidilprolil isomerase 19 85.4 HVVFGQINKEDGSWKVVK,HVVFGQINK,SLEACGDERGNVK,SLEA CGDERGNVKSPKPTITGA GVL,VYFD
VEWEGPVLNDNFDPVGKPQKQQGR,ELCTRPK,VYFDVEW EGPVLNDNFDPVGKPQK,ITFELFDKVVPK,SIY
GEKFPDENFK,IIPNFM IQGGDFTR,GNVKSPKPTITGA GVL,ELCTRPKGQGYVGSPFHR,HVVFGQINKEDGS
WK,SLEACGDER,GQGYVGSPFHR,FPDENFK,EGLLSMANA GPNTNGSQFFITTVVTNW LDNR,ITFELFDK
Proteína ribossomal 60S 2 7.4 LVTVEGPR,TLINNLIIGVTK
L9
Proteína HMG box 13 54.8 EADTGNDQDAIA EQLQQGAADDSAK,YA DEFHIPMPTSK,VIDVENFIR,LSTIQELLK,LMSDEEA LR,QTNLLL
GEGA GVDGVGELIGFDTGLLPPVGTVLPPVA VA VAPAADEK,QTNLLLGEGA GVDGVGELIGFDTGLLPPVG
TVLPPVA VA VAPAADEKK,GA VQEEGQR,GAAPASPDK,NFSGEYLR,EADTGNDQDAIA EQLQQGAADDSA
KTPK,TATPGAEA EPVK,LSTIQELLKNFSGEYLR
Proteína hipotética 11 48.6 ATQPHSPFDVVAWQGFYYPYK,FWQRPESA GAADSHLLKQ,FNVIGSISFDHPDPSIFTVLTAPSEHA GTA VAD
SPBR_04209 FVIFPPR,DFQVPVA CFDEPVAAAAAAHAAEPA YVLR,LSGTAFTAPR,QIA GA GDPTLK,W DPFPLPDPATEPT
DFVSGLR,ITPA CSLSPFQPEDDA LTHDNKDTDA LHYLPDQFR,DYVTHSW GK,TEM GW LLVRPLEICVIPR,GY
ALELYQGHFQLPELGPIGSNGLA NAR
Proteína ribossomal grande 3 18.4 ANVAEVLEYSNETK,KYDA FIASETLIK,NFLETVELQIGLK
L10Ae
Transaldolase 4 17.8 VSTEVDAR,NTGEITELA GCDYLTISPA LLEELLNSNEA VPK,VDATLDAILVAFGR,LIDEA VAIGK
Glicina 9 23.4 AVTIAVR,SEVADW VGTYPLPWSTKE,SIPSPFA YADIVTTTSHK,DKGGLGYSLVSGGTDNHLVLADLKPQGI
Hidroximetiltransferase DGGR,VFLDHLGNGDGVPEILQLR,IIVA GASA YSR,VADIVDR,SEVADW VGTYPLPWSTK,VLELVGVAANK
Malato deidrogenase 26 79.4 GYEPTASGLSAA LK,VTELALYDIR,GVYNPKRLFGVTTLDVVR,A VAESAPNA NILVISNPVNSTVPIVK,RLFG

ANEXOS
 117

VTTLDVVR,GVVEPSFVESPLYK,GSDPKDENITVVGGHSGVTIVPLFSQSSHPELSSNA DLVK,LFGVTTLDVV
R,VTVLGAA GGIGQPLSLLLK,GVVEPSFVESPLYKDQGIEFFSSKVELGPEGVEK,DQGIEFFSSK,VELGPEGV
EK,ILPVGEVDSVEQGLLEACFTDLKKNIAK,GVVEPSFVESPLYKDQGIEFFSSK,A VA ESA PNANILVISNPVN
STVPIVKEVFK,ILPVGEVDSVEQGLLEA CFTDLKK,VQFGGDEVVQAK,GVEFVASNPGK,VTVLGAA GGIGQ
PLSLLLKLNPR,DDLFNTNASIVR,VTELA LYDIRGGPGVAADISHVNTK,DLSKVTVLGAA GGIGQPLSLLLKL
NPR,GGPGVAADISHVNTK,ILPVGEVDSVEQGLLEACFTDLK,A VA ESAPNANILVIS NPVNSTVPIVKEVFKA
R,GSEVVLIPA GVPR
succinate deidrogenase, 2 12.9 HLVWDAAVK,TLAAFPFLFHSFNGVR
citocromo subunidade b556
Proteínas de domínio SET e 1 3.1 LNAVSAVAIELLESVLSSR
MYND
6,7-dimethyl-8-ribityllumazine 4 38.0 VQLDTGVPIIFGVLTVLSEK,STLQFDA LVAIGALIK,WNWNIIEPLLEGTK,LLESGVA ESNIVVESVPGAWELP
VAVQR
peptidil / a prolil isomerase D 10 33.6 QKDEEAAQK,IVFELYNDVVPK,SGAAA GEEAPA DPLA GLTGGGTATLSA ER,VAASNA LSVPGISDA DKA K,L
(ciclofilina D) APGDANVLK,YLNEEPDLDSAPEGTK,DVVIVDCGELKGDDAILSADAPK,VAASNA LSVPGISDA DK,LGAW
QEAR,HVVFGA VLA GK
Acetil CoA 4 17.7 LPPSLLPLQSGIGNIANA VIGGLQNAK,SQQVSNSPELIR,VIGVVESDYQDQTLPNAPGDAAASQIA GHLIEFFE
hydrolase HEVSHGR,IGTTSIPLDPEK
Aminopepti dase I 10 22.3 FITENPTVFHA VGYFEK,A VESLATNK,ICSWAALVA LLR,VAELSGNTLQR,LAALFDDEEIGSLLR,AQDNDD
AGVIR,VGYQQLGVAPYA GA LNATWWDR,ATTGA LDPGLGVK,LFQSFFELYEK,QGAWGNFLPVTIER
Ubiquinol / citocromo c 4 19.8 SEQAPDFSHYLSK,KGPAPLNLEIPA YEFPEDEKLVIG,VEVDLNTIPEGK,GPAPLNLEIPA YEFPEDEKLVIG
redutase ferro / enxofre
subunidade
Proteína hipotética 4 31.7 DYEFYTGESMNPDGLVVLLNYR,ETLLPNFK,EDGTTPYITVWQHGLK,AALQEA GK
SPBR_01963
Proteína hipotética 2 32.1 IPLIGPYFVK,YVSVA GPIA GA LGVAALFYASGIPR
SPBR_08650
Fator de Elongação 1-β 7 50.2 LVAVGFGIK,HIATYEDEFATLSGDASKPYTA YGPEIA EVTINPA K,SA PAADKYPNAAR,SINQDGLVW GLSK,
SYIVDHNATQA DVVVFK,VSLDDLQDTIA EFEDYVQSS DVVAMQK
Ácido nucleico / proteína de 8 39.6 ADDRPLREPSNCLYIGNLPYETTDADLTVTFR,NVVFDASDANLR,GFGFVYFENA EAQA K,NSSESQEEA VSE
ligação ATN,AAYEYLK,IDYASPTK,EAFEHYGPINSTFIA R,GFAHADFDSIESAK
3- isopropilmalato 3 22.5 TGEALTDEALAAA GAADAILLGAIGGPEW GPDAPVRPEQGLLK,YSLQLPADA VA VEQA VK,LGGYLA LAAD
desidrogenase PQNPLPVWSLDK
aminotransferase de 2 10.5 IALPTFSPTALIELIA R,TLGVGPPGSA LLYVIASPVGPYYPTGFK
aminoácidos de cadeia
ramificada
Mn superóxido dismutase 4 19.7 ANQDPVSGTLVPLLGIDAWEHA YYLQYENRK,KAEYFSAIWNVINWK,A EYFSAIWNVINWK,A NQDPVSGT

ANEXOS
 118

LVPLLGIDAW EHA YYLQYENR

Gliceraldeído3-fosfato 19 70.0 VPTANVSVVDLTAR,LVSW YDNEW GYSR,VVDLISYVAK,YDSTHGAFK,VEANGLNVNGK,ADVISNASCTT
desidrogenase NCLAPLAK,DPASIPW K,A GISLNPNFVK,RVVDLISYVAK,GASYDEIK,GILGYTEDDVVSSDLNGNLNSSIFD
AK,GAAQNIIPSSTGAAK,DTGA EYVVESTGVFTTTDK,NAIEHGDVEVVA VNDPFIDTNYAA YM LK,EASEGP
LK,VIPELNGK,LTGMSLR,VIISAPSADAPM YVIGVNEK
acetil - CoA acetiltransferase 14 42.4 QAAIFAGLPTSTEATTVNK,EDQDGYAIR,IQNVYFGNVLQGNVGQSPA R,ICSYADAA VEPIDFPVAPAK,SGIP
VDKIQNVYFGNVLQGNVGQSPA R,AAWDA GAFADEIAPVTVTDKR,FNGAFVSVPA PR,DVA VW EFNEAFAA
VIK,AAWDAGAFADEIAPVTVTDK,ILGLDA GA R,ASGLPAFGNVTLEDSLIK,ATQDA YILSASR,VNA LGGAI
ALGHALGSSGSR,RATQDA YILSASR
Proteína ligante de 8 85.1 GLVYDVTGNK,ALA LSSTKPDDVQSQWQDLDDKEK,YNVIGKVVGATNLS,GVLNDWITFFA KR,GVLNDWI
progesterona TFFAK,ALALSSTKPDDVQSQWQDLDDKEKGVLNDWITFFAK,TPVNLQPPKDDPITLEELSAANGVDGGK,A
YQPGGSYHVFA GK
Proteína de replicação do 2 14.8 ILASSLGGGLSAWNQPIEVIR,FSNLLLGA GLNLFEVTTLGQPLEVTK
DNA YHM2
Hidrometil Coa-liase 3 14.3 TIEAGSFVA PK,LSSPVPISYA FLVPNTK,EATA GAETKPSSFLPA VELA VFAAATESFSQK
Citocromo c oxidase 9 68.8 TEYPYQNIR,EHWEHW EHLPPLEER,NISIFVAIPALAASGYNA YLLYK,EHAAQTTNLWK,NFVW GDGDK,TL
subunidade 6a FWNEK,NFVW GDGDKTLFWNEK,TKNFVW GDGDKTLFWNEK,VNYHNKDKVA
Het C 3 20.5 LNAWLAALK,NIVEILETFLDSK,QLEAPGVSETLQSLVVNELK
Proteína hipotética 1 7.6 LGGAALDVFETEPLPAASELWK
SPBR_00881
Carboximetilenebutenoli dase 11 46.0 TYATGPDEATK,DAA GIKVPLVLLASKDEPPADVDAFEK,VPLVLLASK,HPPPVTASK,GIIYVADIFGYK,DQT
LQGADILSVTDK,VPLVLLASKDEPPADVDAFEK,VLIPDW FDGEPAA LEIFPPDTEDK,TVVEFFSK,VLIPDWF
DGEPAALEIFPPDTEDKK,AASEA YPTIK
Glucanase extracelular de 6 26.3 GGATYPQTPM QIK,LA DGTDLNYDTTK,TPFGPGSGAPYVA YYK,TLTYNDAK,GGTSPVSNPQSEFHTYTLD
parede celular WSPEALTWSIDGTVVR,GAEFVIAADTNA PTITSTK

ANEXOS
 119

ANEXO III: CURRÍCULO LATTES

ANEXOS
 120

ANEXO VI: FICHA DO ALUNO

ANEXOS