LÍVIA MARIA DO AMORIM COSTA

INVESTIGAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DA OCORRÊNCIA DE

PRODUÇÃO DE METALO-BETA-LACTAMASES EM AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS NA CIDADE DE ARACAJU,
SE

Niterói,
2011
 LÍVIA MARIA DO AMORIM COSTA

INVESTIGAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DA OCORRÊNCIA DE

PRODUÇÃO DE METALO-BETA-LACTAMASES EM AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS NA CIDADE DE ARACAJU,
SE

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Patologia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Patologia Humana

Orientadoras: Profª. Drª. Silvia Susana Bona de Mondino

Profª. Drª. Cláudia Rezende Vieira Mendonça de Souza

Niterói
2011
 LÍVIA MARIA DO AMORIM COSTA

INVESTIGAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DA OCORRÊNCIA DE

PRODUÇÃO DE METALO-BETA-LACTAMASES EM AMOSTRAS DE
Pseudomonas aeruginosa ISOLADAS NA CIDADE DE ARACAJU,
SE

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Patologia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Patologia Humana

Aprovada em 07 de dezembro de 2011

Prof. Dr. Fábio Aguiar Alves

Universidade Federal Fluminense – UFF

Profª. Drª. Fabíola Kegele

Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Profª. Drª. Flávia Lúcia Piffano Costa Pellegrino

Faculdade São José - FSJ
AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, que sempre iluminou meu caminho, me

dando coragem e determinação para superar todos os obstáculos.

Agradeço aos meus pais, Hermes e Edna, pelo amor incondicional,

incentivo e dedicação, por jamais deixarem que eu desistisse dos meus sonhos.

Ao meu noivo Bruno, por toda paciência, carinho e companheirismo, por

sempre acreditar em mim até quando eu duvidava que fosse capaz. Pessoa

essencial na realização desse projeto. Te amo!

Agradeço à minha irmã Leila, que mesmo sem saber, me ajudou com todo

o seu entusiasmo e alegria.

À avó mais carinhosa do mundo, vovó Celina, por sempre me receber

com amor e alegria cada vez que voltava para Aracaju.

Aos meus queridos tios Amorim e Eduardo, por serem fontes de

inspiração, cada um com seu jeito. Obrigada por me ensinarem a ser uma vitoriosa!

Gostaria de agradecer à Prof.ª Cláudia Souza, minha orientadora, pela

oportunidade, orientação e ensinamentos, por acreditar que no final tudo daria certo!
 À professora Silvia Mondino, por sempre estar à disposição quando foi

preciso.

Às minhas amigas e companheiras de mestrado Thainá Miranda, Júlia

Honorato, Vanessa de Carla, Bruna Picciani, por me receberem de braços abertos,

pelas conversas divertidas e troca de conhecimento.

À minha companheira de mestrado, Laís Lisboa, por toda ajuda inicial,

quando ainda me encontrava em período de adaptação, pelas conversas divertidas

e por ouvir meus desabafos.

Agradeço aos professores Geraldo Renato de Paula e Lenise Teixeira,

por cederem o laboratório para realização desse trabalho, pela dedicação,

orientação, ensinamentos e o mais importante pela paciência nas horas de

turbulência. Muito obrigada!

Agradeço às meninas do Laboratório de Controle Microbiológico, que

foram essenciais nessa caminhada, tornando o trabalho mais leve e agradável. Em

especial, à Maria Emília, por todo carinho, ajuda e amizade, por me ouvir e me

acalmar nas horas de desespero

Gostaria de agradecer a professora Beatriz Meurer por possibilitar a

realização do PFGE e a análise dos géis no Laboratório de Epidemiologia Molecular

das Infecções Bacterianas da UFRJ, pelas conversas matinais com seus

ensinamentos e incentivo.
 Agradeço às alunas do LEMIB, por me receberem com todo carinho, em

especial à Luciana Cacci, por torcer junto comigo pelo sucesso a cada experimento

realizado.

Gostaria de agradecer a diretoria dos Hospitais Primavera, HUSE e

Fundação de saúde Parreiras Horta – LACEN/SE por proporcionarem a realização

desse trabalho, cedendo suas amostras. Agradeço ainda, à Renata Raupp e

Paulinho por toda ajuda durante o período de coleta das amostras.

Ao professor Fábio Alves, por aceitar ser meu examinador prévio,

contribuindo para o aperfeiçoamento e entendimento do trabalho.

Aos membros da banca, professores Fábio Alves, Fabíola Kegele e

Flávia Pellegrino por aceitarem o convite para avaliar esse trabalho

Ao Programa de Pós-Graduação em Patologia, por me receberam bem,

sempre dispostos a atender minhas dúvidas. A toda equipe administrativa e de

docentes pela dedicação e comprometimento.

Por fim, agradeço a todos familiares, e amigos que torceram para a

realização desse trabalho.

 Há pessoas que transformam o sol numa simples mancha
amarela. Mas há, também, aquelas que fazem de uma simples
mancha amarela, o próprio Sol.

Pablo Picasso
RESUMO

Pseudomonas aeruginosa é a espécie de maior importância clínica entre os bacilos

Gram negativos não-fermentadores. Esses micro-organismos são importantes
agentes de infecções relacionadas com o cuidado em saúde. Uma característica
marcante das infecções causadas por P. aeruginosa, especialmente naquelas
adquiridas por pacientes internados em Unidades de Tratamento Intensivo, é a
multirresistência. P. aeruginosa possui mecanismos intrínsecos de resistência frente
a diferentes antimicrobianos, como a maioria dos -lactâmicos, tetraciclinas,
cloranfenicol, quinolonas e aminoglicosídeos, devido à combinação da baixa
permeabilidade da sua membrana externa com a presença de sistemas de bomba
de efluxo. Além disso, esses micro-organismos têm adquirido mecanismos de
resistência, como a produção de metalo-beta-lactamases, com atividade contra os
carbapenêmicos, restringindo ainda mais as opções terapêuticas para o tratamento
de infecções graves causadas por essas bactérias. No presente trabalho, foram
estudadas 95 amostras de P. aeruginosa isoladas em três instituições de saúde de
Aracaju e identificadas através do sistema automatizado Vitek 2. Os objetivos foram:
avaliar os perfis de susceptibilidade de amostras de P. aeruginosa isoladas no
município de Aracaju, SE; detectar fenotipicamente a produção de metalo-β-
lactamases entre as amostras resistentes a ceftazidima; caracterizar o genótipo de
resistência das amostras resistentes a ceftazidima; avaliar a diversidade genética
das amostras resistentes a ceftazidima. O sítio de isolamento mais freqüente foi o
trato respiratório inferior (25,3%, 24/95). Em relação ao setor de isolamento, a
maioria das amostras avaliadas (62,1%, 59/95) foi oriunda de pacientes admitidos
em Unidades de Tratamento Intensivo. A análise dos perfis de susceptibilidade
mostrou um percentual alto de resistência em relação à ceftazidima (51,6%, 49/95) e
taxas moderadas em relação aos carbapenêmicos testados (imipenem: 23,2%,
22/95; meropenem: 20%, 19/95). A menor taxa de resistência observada foi frente à
amicacina (16,8%, 16/95). Os testes de disco-aproximação para investigação da
produção de metalo-β-lactamases entre as amostras resistentes a ceftazidima
revelaram que 28,6% das amostras (14/49) foram positivas. Os testes de disco
combinado confirmaram os resultados obtidos pelo método de disco-aproximação
(13/49) e revelaram mais três amostras, totalizando 35,6% (17/49) amostras metalo-
β-lactamase positivas. De acordo com os resultados obtidos na PCR, duas amostras
(4,1%) entre aquelas resistentes a ceftazidima possuíam o gene blaSPM-1. Nenhuma
amostra apresentou os determinantes genéticos blaIMP-1, blaVIM-2, blaGIM-1. A técnica
de PFGE, realizada em 49 amostras resistentes a ceftazidima, revelou a ocorrência
de uma elevada diversidade genética (37 pulsotipos). Também foi observada a
presença de nove grupos clonais, compostos por duas ou três amostras cada, sendo
que as amostras SPM-1 positivas foram geneticamente relacionadas entre si e com
o clone São Paulo epidêmico no nosso meio. Os resultados sugerem que a
produção de metalo-beta-lactamases não seria o principal mecanismo de resistência
à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos entre as amostras estudadas. A ocorrência
de grupos clonais compreendendo amostras isoladas em diferentes instituições de
saúde e diferentes setores dentro da mesma instituição sugere a disseminação inter
e intra-hospitalar durante o período estudado.

Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, Resistência aos antimicrobianos,

Metalo-beta-lactamases
ABSTRACT

Pseudomonas aeruginosa is the species of greatest clinical relevance among Gram

negative non-fermenters bacilli. These organisms are important agents of healthcare-
associated infections. One striking feature of infections caused by P. aeruginosa,
especially those acquired by patients hospitalized in Intensive Care Units, is the
multidrug resistance having intrinsic mechanisms of resistance against different
antibiotics, as most β-lactams, tetracyclines, chloramphenicol, quinolones,
aminoglycosides, due to the combination of low permeability of its outer membrane
with the presence of efflux pump systems. In addition, these organisms have
acquired resistance mechanisms such as production of metallo-beta-lactamase
(MβL), β-lactamases of Ambler class B, with activity against carbapenems, further
restricting the therapeutic options for treating serious infections caused by these
microorganisms. In this work we studied 95 strains of P. aeruginosa isolated from
three health institutions of Aracaju and identified through the Vitek 2 automated
system. The objectives of the study were to evaluate the susceptibility profiles of
strains of P. aeruginosa isolated in the city of Aracaju, SE; detect phenotypically the
production of metallo-beta-lactamase between strains resistant to ceftazidime;
characterize the genotype resistance of strains resistant to ceftazidime; assess the
genetic diversity of ceftazidime resistant strains. The most common site of isolation
was lower respiratory tract (25.3%, 24/95). Most of the strains (62.1%, 59/95) were
isolated from patients admitted to Intensive Care Units and the percentages of
resistance among the isolates in this sector were higher. The analysis of the
susceptibility profiles showed a high percentage of resistance to ceftazidime (51.6%,
49/95) and moderate rates in relation to the tested carbapenems (imipenem 23.2%,
22/95; meropenem: 20% , 19/95). The lower rate of resistance was observed against
amikacin (16.8%, 16/95). The disk-approximation tests to investigate the production
of metallo-beta-lactamase between strains resistant to ceftazidime revealed that
28,6% of the samples (13/49) were metallo-beta-lactamase positive. The combined
disk tests confirmed the results obtained by disk-approximation (14/49) and three
strains revealed a total of 35.6% (17/49) positive strains MβL. According to the
results obtained in PCR, two strains carried the gene blaSPM-1. No strain showed the
genetic determinants, blaIMP-1, blaVIM-2, blaGIM-1. The PFGE method, performed on 49
ceftazidime resistant strains, revealed the occurrence of a high genetic diversity (37
pulsotipes). It was also observed the presence of nine clonal groups, consisting of
two or three strains each, and the SPM-1 positive strains were genetically related to
each other and with the epidemic clone São Paulo in our midst. The results suggest
that the production of metallo-beta-lactamase was not the main mechanism of
resistance to ceftazidime and/or carbapenems between the studied strains. The
occurrence of clonal groups comprising strains isolated in different health care
institutions and different sectors within the same institution suggests the spread inter-
and intra-hospital during the study period.

Key-words: Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial resistance, Metallo-beta-

lactamases
LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Distribuição de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas na

cidade de Aracaju, SE, no período de março de 2008 a dezembro de 2009, de
acordo com a instituição de origem............................................................................20

TABELA 2. Distribuição de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas em

três instituições de saúde de Aracaju, SE, no período de março de 2008 a dezembro
de 2009, de acordo com o setor hospitalar ...........................................................................22

TABELA 3. Seqüências de oligonucleotídeos utilizadas e tamanhos de fragmentos

esperados nas reações de PCR para detecção de genes que codificam MLs........30

TABELA 4. Perfis de susceptibilidade de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa

isoladas em três instituições de saúde de Aracaju, SE, no período de março de
2008 a dezembro de 2009, de acordo com os testes de difusão em
agar............................................................................................................................34

TABELA 5. Distribuição das 49 amostras de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima

de acordo com setor hospitalar..................................................................................37

TABELA 6. Resultado da detecção de produção de metalo-beta-lactamase

utilizando como substrato ceftazidima e agentes quelantes EDTA/2MPA de 49
amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas na cidade de Aracaju, SE ............39

TABELA 7. Características das duas amostras de Pseudomonas aeruginosa

produtoras de SPM-1.................................................................................................41

TABELA 8. Características das 19 amostras de P. aeruginosa pertencentes aos

nove grupos clonais detectados através da análise de seus perfis eletroforéticos
obtidos por eletroforese em campo pulsado em gel de agarose (PFGE)..................47
LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1. Distribuição de amostras de Pseudomonas aeruginosa, isoladas em

Aracaju, de acordo com a fonte de isolamento..........................................................21

GRÁFICO 2. Percentuais de resistência de amostras de Pseudomonas aeruginosa

isoladas em três instituições de saúde de Aracaju, SE, no período de março de 2008
a dezembro de 2009, de acordo com setor de isolamento
hospitalar...................................................................................................................35

GRÁFICO 3. Distribuição percentual das 49 amostras de P. aeruginosa resistentes

ao ceftazidima por fonte de
isolamento..................................................................................................................36
LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Representação esquemática da disposição, na placa de ágar Mueller

Hinton, dos discos contendo os agentes quelantes e antimicrobianos utilizados no
teste fenotípico de disco-aproximação para detecção de
MβL............................................................................................................................25

FIGURA 2. Representação esquemática da disposição, na placa de ágar Mueller

Hinton, dos discos contendo os agentes quelantes e antimicrobianos utilizados no
teste fenotípico de disco combinado para detecção de
MβL............................................................................................................................26

FIGURA 3. A – Ilustração do teste de disco aproximação de uma amostra positiva

(Ceftazidima/EDTA). B – Ilustração do teste de disco aproximação de uma amostra
positiva (Ceftazidima/2-MPA). C - Ilustração de teste disco combinado de uma
amostra positiva (Ceftazidima/2-MPA)
(Ceftazidima/EDTA)....................................................................................................38

FIGURA 4 . Detecção do gene blaSPM-1 em amostras de Pseudomonas aeruginosa

resistentes a ceftazidima............................................................................................40

FIGURA 5. Gel representativo de perfis eletroforéticos de fragmentação do DNA

cromossômico de amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima,
obtidos após digestão com SpeI................................................................................42

FIGURA 6. Gel representativo de perfis eletroforéticos de fragmentação do DNA

cromossômico de amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima,
obtidos após digestão com SpeI................................................................................44

FIGURA 7. Dendrograma resultante da análise computadorizada dos perfis da

fragmentação do DNA cromossômico, obtidos através de eletroforese de campo
pulsado em gel de agarose, das 49 amostras de Pseudomonas aeruginosa
resistentes a
ceftazidima................................................................................................................ 46
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................15

3 OBJETIVOS............................................................................................................18

3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................19

3.1 AMOSTRAS BACTERIANAS...............................................................................19

3.2 IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS....................................................................22

3.3 TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS..........................23

3.4 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE P. aeruginosa PRODUTORAS

DE METALO-Β-LACTAMASES.................................................................................23

3.4.1 Testes de Disco-aproximação.......................................................................24

3.4.2 Testes de Disco combinado..........................................................................25

3.5 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS AMOSTRAS RESISTENTES À

CEFTAZIDIMA ...........................................................................................................27

3.5.1 Liberação do DNA Bacteriano........................................................................27

3.5.2 Detecção de Determinantes Genéticos que Codificam a Produção de

Metalo-beta-Lactamase, Através da Reação em Cadeia da Polimerase.............28

3.5.3 Eletroforese em Campo Pulsado em Gel de Agarose..................................31

4 RESULTADOS........................................................................................................33

4.1 TESTES DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS..................................33

4.2 PERCENTUAIS DE RESISTÊNCIA DE ACORDO COM SETOR DE

ISOLAMENTO......................................................................................................34

4.3 DISTRIBUIÇÃO DAS AMOSTRAS RESISTENTES A CEFTAZIDIMA POR

FONTE DE ISOLAMENTO..................................................................................35

4.4 DISTRIBUIÇÃO DAS AMOSTRAS RESISTENTES A CEFTAZIDIMA DE

ACORDO COM O SETOR HOSPITALAR...........................................................36

4.5 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE METALO

BETA-LACTAMASES..........................................................................................37
4.6 DETECÇÃO GENOTÍPICA DE METALO-BETA-LACTAMASES........................40

4.7 AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE AMOSTRAS de P. aeruginosa

RESISTENTES A CEFTAZIDIMA ATRAVÉS DE ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE EM CAMPO PULSADO.....................................................................41
5 DISCUSSÃO..........................................................................................................48

6 CONCLUSÃO........................................................................................................58

7 REFERÊNCIAS.....................................................................................................60

ANEXOS.........................................................................................................................67
 15

1 INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, a ocorrência de pacientes hospitalizados,

colonizados ou infectados por microorganismos multirresistentes, tem merecido uma

atenção das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) e dos serviços

de saúde, especialmente se considerando a diversidade das condições clínicas dos

pacientes e a conduta de profissionais (STHOHL, et al., 2004).

Tem-se observado uma maior incidência de bacilos Gram-negativos

resistentes a cefalosporinas de espectro ampliado no ambiente hospitalar,

ocasionando, assim, maior uso dos carbapenêmicos (MARRA et al., 2006). Esse

aumento na utilização de carbapenêmicos no ambiente hospitalar resulta numa

maior pressão seletiva sobre a microbiota hospitalar, favorecendo a seleção de

subpopulações de microrganismos com sensibilidade diminuída ou resistente a

esses antimicrobianos.
 16

Nos últimos anos, bactérias Gram negativas resistentes aos

carbapenêmicos, incluindo as enterobactérias e os bacilos Gram negativos não

fermentadores, como Pseudomonas aeruginosa, um patógeno hospitalar de grande

importância, têm sido freqüentemente isoladas. P. aeruginosa apresenta resistência

intrínseca a um grande número de agentes antimicrobianos, tais como a maioria dos

β-lactâmicos, tetraciclinas, cloranfenicol e grande parte das fluoroquinolonas e

aminoglicosídeos (LI et al., 1994; 1995), limitando o número agentes antimicrobianos

com ação efetiva contra esses micro-organismos. Os carbapenêmicos são opção

terapêutica de escolha nas infecções graves causadas por P. aeruginosa (WANG et

al., 2010).

Entre os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, um dos mais

importantes em P. aeruginosa, é a produção de metalo-beta-lactamases (ML),

enzimas com atividade sobre vários beta-lactâmicos, incluindo cefalosporinas e

carbapenêmicos, o que dificulta o tratamento de infecções causadas por esses

microrganismos (TORRES et al., 2006; MALTEZOU, 2008; CHIN et al. 2011).

Até o momento, foram descritas nove subclasses de ML: IMP

(imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM-1 (São Paulo metalo-beta-

lactamase), GIM-1 (German imipenemase), SIM-1 (Seoul imipenemase), AIM

(Australian imipenemase), KHM-1 (Kyorin Health metalo-beta-lactamase), DIM-1

(Dutch imipenemase) e NDM-1 (New Delhi metalo-beta-lactamase) (OSANO et al.,

1994; LAURETTI et al., 1999; TOLEMAN et al., 2002; CASTANHEIRA et al., 2004;

LEE et al., 2005; GUPTA, 2008; SEKIGUCHI et al., 2008; YONG et al., 2009;

POIREL et al., 2010). Dessas, cinco classes: SPM, IMP, VIM, GIM e AIM já foram
 17

descritas em amostras de P. aeruginosa isoladas em diversas localidades no mundo

(MENDES et al., 2006; GUPTA, 2008).

Este mecanismo é codificado por genes bla (beta-lactamases) que podem

ser encontrados em plasmídeos (blaSPM-1) e em cassetes genéticos ligados a

integrons de classe 1, localizados em cromossomos ou elementos móveis como

plamídeos e transposons, resultando numa maior facilidade de disseminação

horizontal desses genes (WALSH et al., 2005).

Nos últimos anos, amostras hospitalares de P. aeruginosa produtoras de

MβL, particularmente da classe SPM, têm sido relatadas com freqüência, em várias

regiões geográficas do Brasil. Os dados referentes à ocorrência de amostras de P.

aeruginosa MβL positivas, na região nordeste do Brasil, ainda são escassos.

Estudos fenotípicos e genotípicos visando à investigação e caracterização de

amostras apresentando esse mecanismo de resistência, bem como à descrição da

sua prevalência em áreas geográficas específicas são de grande relevância.

 18

2 OBJETIVOS

- Objetivo Geral

 Investigar a produção de metalo-beta-lactamases entre amostras clínicas

de P. aeruginosa isoladas no município de Aracaju, SE

- Objetivos específicos

 Avaliar os perfis de susceptibilidade de amostras de P. aeruginosa

isoladas no município de Aracaju, SE.

 Detectar fenotipicamente a produção de metalo-beta-lactamases entre as

amostras resistentes a ceftazidima.

 Investigar os determinantes genéticos da produção de metalo-beta-

lactamases, entre as amostras resistentes a ceftazidima.

 Avaliar a diversidade genética das amostras resistentes a ceftazidima e/ou

aos carbapenêmicos.
 19

3 MATERIAL E MÉTODOS

O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa da

Faculdade de Medicina do HUAP (Hospital Universitário Antonio Pedro,

Universidade Federal Fluminense), sob o número 100/2010.

3.1 Amostras Bacterianas

Foram estudadas, retrospectivamente, 95 amostras de P. aeruginosa

isoladas no período março de 2008 a dezembro de 2009, no município de Aracaju,

SE.

As amostras foram provenientes de espécimes clínicos enviados aos

Laboratórios de Bacteriologia pertencentes às seguintes instituições de saúde: 1-

Fundação de Saúde Parreiras Horta – LACEN/SE (FSPH/Lacen) (40 amostras,

 20

42,1%), Laboratório de Saúde Pública do Estado de Sergipe, que recebe amostras

de diversos hospitais públicos de pequeno porte e do Hospital Universitário da

Universidade Federal de Sergipe, entre outros; 2- Hospital Primavera (HP),(45

amostras, 47,4%), hospital da rede privada, com 200 leitos, com serviços de

Urgência e Emergência, Centro Cirúrgico, Unidades de Tratamento Intensivo (UTI) e

Alas de Internação e 3- Hospital de Urgência de Sergipe – Gov. João Alves Filho

(HUSE) (10 amostras, 10,5%), hospital da rede pública, com 421 leitos com serviços

de Urgência e Emergência Adulto, Pronto-Socorro Infantil, Centro Cirúrgico,

Unidade de Tratamento de Queimados, UTI-Adulto, Semi-Intensiva-Adulto, UTI

Pediátrica e 13 Alas de Internação (Tabela 1).

TABELA 1. Distribuição de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas na cidade de Aracaju,

SE, no período de março de 2008 a dezembro de 2009, de acordo com a instituição de origem

Local n (%)

HP 45 (47,4)

LACEN/FSPH 40 (42,1)

HUSE/FSH 10 (10,5)

Total 95 (100)

HP: Hospital primavera; LACEN/FSPH: Laboratório central de Saúde Pública do Estado de Sergipe;
HUSE/FSH: Hospital de Urgência e Emergência do Estado de Sergipe

Do total de 95 amostras estudadas, 24 (25,3%) foram isoladas a partir de

secreções do trato respiratório inferior [aspirado traqueal, 15/24 (62,5%) e lavado

 21

bronco-alveolar, 9/24 (37,5%)], 21 (22,1%) de urina; 11 (11,6%) de líquido

cefalorraquidiano (LCR); 8 (8,4%) de secreções de feridas de sítio cirúrgico; 3 (3,2%)

de sangue e 28 (29,4%) de materiais diversos (secreção ocular, da nasofaringe,

prótese óssea, ponta de cateter, swab anal, biopsia) (Gráfico 1).

25,3% (24)
29,4% (28)

3,2% (3)

8,4% (8) 22,1%(21)

11,6% (11)

Trato Respiratório Inferior Urina Líquor Ferida Sangue Materiais diversos

GRÁFICO 1. Distribuição das 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa, isoladas em Aracaju, de

acordo com a fonte de isolamento

Em relação ao setor de isolamento, a maioria das amostras avaliadas

(62,1%) foi oriunda de pacientes admitidos em UTI (Tabela 2).

 22

TABELA 2. Distribuição de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas em três instituições de

saúde de Aracaju, SE, no período de março de 2008 a dezembro de 2009, de acordo com o setor
hospitalar

Setor de Isolamento n ( %)

Unidade de Terapia Intensiva 59 (62,1)

Outros setores 36 (37,9)

Total 95 (100)

3.2 Identificação das Amostras

As amostras foram identificadas, nos Laboratórios de Bacteriologia do

LACEN/SE, do Hospital Primavera e do HUSE, como pertencentes à espécie P.

aeruginosa através do sistema automatizado Vitek 2 (BioMérieux Clinical

Diagnostics, Marcy l’Etoile, France).

Para a estocagem das amostras as mesmas foram congeladas a -20ºC,

sob forma de suspensões densas de leite desnatado Molico (Nestlé, Araçatuba, São

Paulo) a 10% (p/v) acrescido de glicerol a 10% (v/v).

 23

3.3 Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

3.3.1 Testes de Difusão em Agar

A determinação dos perfis de susceptibilidade das amostras foi realizada

através de testes de difusão em agar, utilizando-se os seguintes antimicrobianos:

amicacina (30µg), aztreonam (30µg), cepepima (30µg), ceftazidima (30µg),

ciprofloxacina (5µg), gentamicina (10µg), imipenem (10µg), meropenem (10µg),

piperacilina/tazobactam (75g/10µg) (CECON, São Paulo). Os testes e suas leituras

e interpretações foram realizados segundo os critérios do Clinical and Laboratory

Standard Institute (CLSI, 2009).

Para o controle de qualidade dos testes foram utilizadas amostras padrão

de Escherichia coli (ATCC 25922) e P. aeruginosa (ATCC 27853).

3.4 Detecção Fenotípica de Amostras de P. aeruginosa

Produtoras de Metalo-β-Lactamases

As amostras de P. aeruginosa resistentes à ceftazidima (CAZ-R)

segundo os resultados dos testes de difusão, foram submetidas à avaliação da

 24

produção de ML através dos métodos de disco-aproximação, segundo os critérios

de Arakawa e colaboradores (2000) e Lee K. e colaboradores (2001), com

modificações (Figura 1) e de disco combinado, segundo os critérios sugeridos por

Picão e colaboradores (2008) (Figura 2). Foram utilizados como inibidores de ML, o

ácido 2-mercaptopropiônico (2-MPA) e o EDTA. Foram utilizadas como controles

positivos para os dois testes, uma amostra produtora de SPM-1 (P 1088) e uma

produtora de IMP-1 (P 4978), gentilmente cedida pela Dra. Ana Gales do laboratório

Alerta, disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São Paulo. Como controle

negativo foi utilizada a cepa padrão de P. aeruginosa ATCC 27853.

3.4.1 Testes de Disco-aproximação

Cerca de três colônias de cada amostra bacteriana foram utilizadas para

o preparo das suspensões em salina fisiológica estéril, para obtenção de turvação

semelhante à da escala 0,5 de McFarland. Essas suspensões foram semeadas com

o auxílio de swabs estéreis em placas contendo meio de ágar Mueller-Hinton (Difco,

Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos). Foram posicionados na placa, discos de

ceftazidima (CAZ), imipenem (IMP) e discos estéreis de papel de filtro em branco e

posteriormente adicionado a um dos discos em branco, 3 µL de uma solução não

diluída de 2-MPA (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) e ao outro, 10 µL de uma

solução 0,5M de EDTA, pH 8,0. As distâncias centro a centro, entre os discos de

antimicrobianos e os discos de papel de filtro, que receberam as substâncias

 25

inibidoras foram de 1,5 cm para o teste com EDTA e de 2,0 cm, para o teste com 2-

MPA. Discos controles de CAZ e IMP foram colocados numa distância de 5 cm. As

placas foram incubadas a 35ºC, por um período de 16 a 18 horas. A observação do

surgimento ou distorção do halo ao redor do disco de ceftazidima ou imipenem,

localizado próximo ao disco com 2-MPA ou com EDTA, indicou a produção de ML.

FIGURA 1. Representação esquemática da disposição, na placa de ágar Mueller Hinton, dos discos
contendo os agentes quelantes e antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de disco-aproximação
para detecção de MβL

Fonte: FIGUEIREDO et al.,2009.

3.4.2 Testes de Disco combinado

As suspensões bacterianas, apresentando turvação semelhante à da

escala 0,5 de McFarland, foram semeadas em placas contendo ágar Mueller-Hinton

(Difco). Três discos de CAZ foram posicionados a uma distância de 5cm, centro a
 26

centro, de cada um. Uma alíquota de 4µL de uma solução não diluída de 2-MPA

(Sigma, St. Louis, Estados Unidos) foi adicionada a um dos discos de CAZ. Outra

alíquota, de 8 µL de EDTA, foi adicionada ao outro disco de CAZ. Após o período de

incubação de 18-24h a 35°C, uma diferença > a 9mm entre os halos de inibição

obtidos ao redor dos discos de CAZ com e sem o EDTA indicou positividade para

produção de ML e uma diferença > a 15mm entre os halos de inibição obtidos ao

redor dos discos de CAZ com e sem o 2-MPA indicou positividade para produção de

ML.

FIGURA 2. Representação esquemática da disposição, na placa de ágar Mueller Hinton, dos discos
contendo os agentes quelantes e antimicrobianos utilizados no teste fenotípico de disco combinado
para detecção de MβL
 27

3.5 Caracterização Genotípica das Amostras Resistentes à

Ceftazidima

3.5.1 Obtenção do DNA Bacteriano

A obtenção do DNA bacteriano das amostras de P. aeruginosa CAZ-R foi

realizada através de lise térmica, conforme a metodologia proposta por Schuenck e

colaboradores (2008). As suspensões bacterianas foram preparadas em 500 L de

tampão TBE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,8), em tubo do tipo eppendorff. Esta

suspensão foi mantida a temperatura de ebulição, em torno de 100oC, por 10

minutos e, em seguida, centrifugada por 2 minutos (8000 rpm). O sobrenadante

contendo o DNA bacteriano foi utilizado para a reação da PCR.

Foram utilizadas como controles positivos das reações, amostras de P.

aeruginosa produtoras de SPM-1 (P 1088), IMP-1(P 4978), gentilmente cedidas pela

Drª Ana C. Gales (Laboratório Alerta, Disciplina de Infectologia, Universidade

Federal de São Paulo) e uma amostra de P. aeruginosa produtora de VIM-2

gentilmente cedida pelo Dr Ronald Jones (JMI Laboratories, North Liberty, Iowa,

USA); como controle negativo, foi utilizada a cepa padrão P. aeruginosa ATCC

27853.
 28

3.5.2 Detecção de Determinantes Genéticos que Codificam

a Produção de Metalo-beta-Lactamases, Através da Reação em

Cadeia da Polimerase

As amostras CAZ-R foram submetidas à técnica de PCR para detecção

dos genes blaSPM-1, blaIMP-1, blaVIM-2 e blaGIM-1 que codificam produção de ML. Em

cada tubo de microdiluição, foram adicionados 3 μL do DNA bacteriano, 2,5 μL de

tampão da enzima 10X (Tris HCl 10 mM, KCl 25 mM), 1,5 mM de MgCl2 (Invitrogem,

São Paulo, Brasil), 0,04 M de cada iniciador (Invitrogem), 200 μM de cada

deoxinucleotídeo trifosfatado (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) (Invitrogem), 1,5 UI de

Taq DNA polimerase (Invitrogem) e água livre de nucleases para um volume final de

25L.

A amplificação dos fragmentos codificados pelos genes foi realizada em

um termociclador (Bioneer, Daejeon, Coréia). Os parâmetros de amplificação para o

gene blaSPM-1 foram os seguintes: desnaturação inicial a 94 oC por 5 minutos,

seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, de anelamento a 54°C

por 1 minuto, de extensão a 68°C por 1 minuto, e extensão final a 72°C por 7

minutos.

Para o blaIMP-1, desnaturação inicial a 94º C por 5 minutos, 35 ciclos de

desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 53°C por 1 minuto, de extensão a

72°C por 1 minuto, e extensão final a 72°C por 7 minutos.

 29

Já para o gene blaVIM-2 , os parâmetros foram: desnaturação inicial a 94°C

por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto,

anelamento a 44°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto, e extensão final a

72°C por 7 minutos.

Para o gene blaGIM-1, os parâmetro utilizados foram: desnaturação inicial a

94°C por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto,

anelamento a 55°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto, e extensão final a

72°C por 7 minutos.

Os produtos de PCR foram revelados através de eletroforese em gel de

agarose a 1,0% em tampão TBE 1X (Tris ácido bórico/EDTA (pH 8.0). Foi aplicado

no gel 10 μL do produto de amplificação adicionados de 2 μL de tampão de amostra

(azul de bromofenol a 0,25%, xilenocianol-FF a 0,25% e glicerol a 30%) (Invitrogen).

Utilizou-se o marcador de peso molecular de 1Kb (Invitrogem) a fim de se determinar

o tamanho do fragmento obtido. O gel foi corado com brometo de etídio (10 µg/mL)

e posteriormente visualizados através de um transluminador U.V. (Vilber Lourmat,

Marne-la-Valleé, França)

Como controle interno, foi incluído na reação um par de iniciadores para a

amplificação da subunidade 16S do RNA ribossomal com a seguinte sequência:

sense 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’; antisense 5’-

ATTACCGCGGCTGCTGG-3’. Em todas as reações de amplificação, utilizou-se

como controle negativo, a cepa padrão de P. aeruginosa ATCC 27853.

 30

TABELA 3. Seqüências de oligonucleotídeos utilizadas e tamanhos de fragmentos esperados nas

reações de PCR para detecção de genes que codificam MLs

Tamanho de
Gene Seqüência iniciadora (5’-3’) fragmento Referência
(pb)

blaIMP-1 GAATAGRRTGGCTTAAYTCTC 188 Mendes et al., 2007

CCAAACYACTASGTTATC
ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG
blaVIM-2 CTACTCAACGACTGAGCG 801 Poirel et al., 2000

blaSPM-1 CCTACAATCTAACGGCGACC 648 Toleman et al., 2002

TCGCCGTGTCCAGGTATAAC

blaGIM-1 TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC 72 Mendes et al., 2007

CGGAACGACCATTTGAATGG

3.5.3 Eletroforese em Campo Pulsado em Gel de Agarose

A análise da diversidade genética das amostras de P. aeruginosa CAZ-R

foi realizada através da técnica de PFGE de acordo com os parâmetros descritos por

Pellegrino e colaboradores (2002). As amostras foram cultivadas em meio de TSA

(Tripticase Soy Agar, Oxoid, Cambridge, UK) e incubadas a 35°-37°C por 16-18

horas. A partir do crescimento bacteriano foram feitas suspensões em 500µL de

tampão PIV (NaCl 1M, Tris-HCl 10 mM – pH7,6) de modo a obter uma turvação

semelhante à escala 6 de McFarland. Esse volume de suspensão foi misturado com

um volume igual de agarose de baixo ponto de fusão (NuSieve GTG agarose; FMC

BioProducts, Rockland, Maine, EUA) a 2%, após a homogeneização, colocados em

moldes para solidificação a 4ºC por 15 minutos. Os blocos de agarose foram

colocados em 2 mL de solução de lise (Tris-HCl 6mM, pH 7,6; NaCl 1M; EDTA

100mM – pH7,5; 0,5% de Brij-58, 0,2% desoxicolato sódico; 0,5% de lauril

 31

sarcosinato de sódio; 1mg/ml de lisozima) e incubados de 15-18 horas, a 35°-37°C,

sob agitação suave. Posteriormente os tubos foram resfriados a 4°C, e a solução de

lise foi substituída por 2 mL de solução ESP (EDTA 0,5M, pH 9; 1% de lauril

sarcosinato de sódio e 0,1% de proteinase K) e incubada em banho-maria a 50°C

durante 18-24 horas. Terminada a incubação, a solução ESP foi substituída por 2

mL de tampão TE (Tris-HCl 10mM, ph7,5 e EDTA 0,1mM) para iniciar a lavagem dos

blocos sob agitação suave a 37°C. O procedimento de lavagem do TE foi realizado

três vezes, sendo as duas primeiras lavagens em um intervalo de uma hora cada, a

terceira com intervalo de 2h. Após a última incubação, os blocos foram submetidos à

digestão enzimática utilizando a enzima de restrição SpeI (Promega, Indiana, EUA).

Um ou dois blocos de cada amostra foram incubados por 30 minutos à temperatura

de 37°C, em solução, com volume de 200µl (20µl de tampão e 180µl de água Milli Q

estéril), de tampão para a enzima de restrição. Passado o tempo necessário, os

blocos foram submetidos a tratamento com solução contendo enzima (10U) por um

período de 16-18 horas, a 37°C, e posteriormente os blocos fundidos a 65°C foram

aplicados nos reservatórios do gel de agarose a 1,2% em tampão TBE 0,5X (Tris

0,89M, EDTA 0,025M e ácido bórico 0,89M). Foram incluídos padrões de pesos

moleculares (pulse Marker, 50-1000 Kb; Sigma).

Os fragmentos foram separados através de eletroforese, realizada no

sistema de eletroforese em campo pulsado CHEF DR III SYSTEM (Bio-Rad

Laboratories, Richmond, Califórnia, EUA) utilizando tempo de pulsos crescentes de

5 a 35 segundos, por 24 horas, a 6V/cm, em ângulo de 120° e na temperatura de

 32

11°C. Após a eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo de etídio

(0,5µg/ml) durante 30 minutos e descorado com água destilada por duas horas.

Os perfis de fragmentação obtidos foram analisados através de inspeção

visual (Tenover, et al. 1995) e análise computadorizada utilizando-se o programa

Gelcompar II versão 4.01 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). As amostras que

apresentaram um coeficiente de similaridade ≥ 80% foram consideradas como

pertencentes a um mesmo grupo clonal.

 33

4 RESULTADOS

4.1 Testes de sensibilidade aos antimicrobianos

Os perfis de susceptibilidade das amostras foram verificados através de

testes de difusão em agar. Os resultados obtidos mostraram que a maior taxa de

resistência entre as amostras analisadas foi em relação a ceftazidima (51,6%, 49

amostras), seguida das taxas verificadas frente ao aztreonan (37,9%, 36 amostras).

e cefepima (35,8%, 34 amostras). A menor taxa de resistência foi observada frente à

amicacina (16,8%, 16 amostras) (Tabela 4).

 34

TABELA 4. Perfis de susceptibilidade de 95 amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas em três

instituições de saúde de Aracaju, SE, no período de março de 2008 a dezembro de 2009, de acordo
com os testes de difusão em agar

Antimicrobianos Percentuais

S I R
n (%) n (%) n %)
Ceftazidima 40 (42,1) 7 (7,3) 49 (51,6)

Aztreonam 36 (37,9) 16 (16,8) 43 (45,3)

Cefepima 58 (61,1) 3 (3,1) 34 (35,8)

Piperacilina/tazobactam 56 (59,0) 8 (8,4) 31 (32,0)

Ciprofloxacina 65 (68,4) 4 (4,2) 26 (27,4)

Imipenem 72 (75,8) 1 (1,0) 22 (23,2)

Meropenem 74 (77,9) 2 (2,1) 19 (20,0)

Gentamicina 72 (75,8) 4 (4,2) 19 (20,0)

Amicacina 77 (81,1) 2 (2,1) 16 (16,8)

4.2 Percentuais de resistência de acordo com setor de

isolamento

Analisando as taxas de resistência de acordo com o setor de isolamento

hospitalar, observou-se que as amostras provenientes de pacientes internados em

UTIs apresentaram maiores taxas de resistência quando comparadas com amostras

isoladas dos outros setores hospitalares, em relação a todos os antimicrobianos

testados com exceção da piperacilina/tazobactam (Gráfico 2).

 35

80
70
60
% Resistência

50
40
30
20 UTI
Outros Setores
10
0

GRÁFICO 2. Percentuais de resistência de amostras de Pseudomonas aeruginosa isoladas em três

instituições de saúde de Aracaju, SE, no período de março de 2008 a dezembro de 2009, de acordo
com setor de isolamento hospitalar

4.3 Distribuição das amostras resistentes a ceftazidima por

fonte de isolamento

A distribuição das amostras resistentes a ceftazidima (CAZ-R) (n=49) de

acordo com a fonte de isolamento está demonstrada no Gráfico 3.

A maior parte das amostras CAZ-R foi proveniente de urina, 30,6%

(15/49); seguida de secreções do trato respiratório inferior, 28,6% (14/49) e

líquor,12,2% (6/49).
 36

35

30

25
%

20

15

10

GRÁFICO 3. Distribuição percentual das 49 amostras de P. aeruginosa resistentes ao ceftazidima por

fonte de isolamento

TRI: Trato Respiratório Inferior; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; Materiais diversos: secreção ocular,
da nasofaringe, prótese óssea, ponta de cateter, swab anal, biopsia.

4.4 Distribuição das amostras resistentes a ceftazidima de

acordo com o setor hospitalar

A maioria das amostras CAZ-R foi isolada de materiais clínicos obtidos

de pacientes internados em UTIs [67,3% (33/49)] (Tabela 5).

 37

TABELA 5. Distribuição das 49 amostras de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima de acordo com

setor hospitalar

Setor de Isolamento n (%)

Unidade de Terapia Intensiva 33 (67,3)

Outros setores 16 (32,7)

Total 49 (100)

4.5 Detecção Fenotípica de Amostras Produtoras de Metalo-

beta-lactamases

4.5.1 Testes de Disco Aproximação e disco combinado

Um total de 49 amostras (51,6%) de P. aeruginosa CAZ-R foi submetido

a testes de disco-aproximação e disco combinado (Figura 3).

Das amostras analisadas, 14 amostras (28,6%) foram consideradas

produtoras de MβL de acordo com a metodologia de disco aproximação (DA) e 17

(34,7%), de acordo com os resultados obtidos nos testes de disco combinado (DC).
 38

CAZ

FIGURA 3. A – Ilustração do teste de disco aproximação de uma amostra positiva

(Ceftazidima/EDTA). B – Ilustração do teste de disco aproximação de uma amostra positiva
(Ceftazidima/2-MPA). C - Ilustração de teste disco combinado de uma amostra positiva
(Ceftazidima/2-MPA) (Ceftazidima/EDTA)

Comparando-se entre os agentes quelantes utilizados nos DA, a solução

de EDTA 0,5 M demonstrou melhor atividade em relação ao ácido 2-

mercaptopropiônico, detectando um número maior de amostras positivas para

produção de ML (n = 09; 64,3%), em comparação com o 2-MPA (n = 6; 42,8%).

Nenhuma amostra foi detectada como sendo ML positiva através da utilização do

imipenem como substrato, independente do agente quelante.

Nos testes de DC a combinação CAZ/EDTA revelou 16 amostras ML

positivas enquanto que CAZ/2-MPA demonstrou produção de ML em apenas 11

amostras. Duas amostras foram consideradas ML positivas por ambos os testes

fenotípicos realizados (Tabela 6).

 39

TABELA 6. Resultados positivos da detecção fenotípica de produção de metalo-beta-lactamase

utilizando como substrato ceftazidima e agentes quelantes EDTA e 2MPA de 49 amostras de
Pseudomonas aeruginosa isoladas na cidade de Aracaju, SE

AMOSTRA DISCO- APROXIMAÇÃO DISCO COMBINADO

CAZ/2-MPA CAZ/EDTA CAZ/2-MPA CAZ/EDTA

06 + - - +

07 + - + +

12 + - + +

13 - + - +

16 + + + +

19 - + + +

20 - + + +

24 - - + +

28 - - + +

29 - + + +

38 - + - +

54 - + - +

55 + - + +

61 - - - +

65 + - + -

78 - + - +

98 - + + +

P 1088 + + + +

P 4978 + + + +

ATCC 27853 - - - -

CAZ: Ceftazidima; 2-MPA: ácido 2-mercaptopropiônico; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético; P

1088: amostra produtora de metalo-β-lactamase da classe SPM; P 4978, amostra produtora de
metalo-β-lactamase da classe IMP; +: positivo; -: negativo.
 40

4.6 Detecção Genotípica de Metalo-beta-lactamases

Entre as 49 amostras de P. aeruginosa CAZ-R, duas (4,1%)

apresentaram o determinante genético blaSPM-1 (Figura 4). Nenhuma amostra

apresentou os determinantes genéticos blaIMP-1, blaVIM-2 e blaGIM-1 investigados

através de reações de PCR.

1 2 3 4 5

1000 pb
Controle interno (846 pb)
750 pb
SPM-1 (650 pb)
500 pb

250 pb

FIGURA 4. Detecção do gene blaSPM-1 em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes

a ceftazidima
Linha 1: Padrão de peso molecular 1kb; Linha 2: controle blaSPM-1 positivo; Linha 3: amostra 65; Linha
4: amostra 69; Linha 5: branco.

As duas amostras produtoras de SPM-1 foram oriundas de pacientes

atendidos no Hospital Primavera, no mesmo período, porém de setores diferentes.

As características dessas amostras estão demonstradas na Tabela 7. Curiosamente,

uma das amostras (69) apresentou resultado negativo nos dois testes realizados
 41

para detecção fenotípica de MβL e a outra amostra (65), apresentou susceptibilidade

ao imipenem e ao meropenem.

TABELA 7. Características das duas amostras de Pseudomonas aeruginosa produtoras de SPM-1

Data de Setor Fonte de Perfil de Fenótipo Genotipo

Amostra
isolamento Hospitalar Isolamento Resistência Mβl Mβl
AZT,CAZ, CIP,
65 15/08/2009 Enfermaria URINA POS blaSPM-1
GEN, P/T
AZT, CAZ, CEF,
69 18/08/2009 UTI TRI NEG blaSPM-1
CIP, IMP, MER, P/T

UTI: Unidade de tratamento intensivo; TRI: Trato Respiratório Inferior; CAZ: ceftazidima; IMP:
imipenem, MER: meropenem; AZT: aztreonam; CEF: cefepime; CIP: ciprofloxacina; GEN:
gentamicina; P/T: piperacilina/tazobactam

1 2 3 4 5

4.7 Avaliação da Diversidade Genética de Amostras de P.

aeruginosa resistentes a ceftazidima através de Eletroforese
em Gel de Agarose em Campo Pulsado

A diversidade genética das 49 amostras CAZ-R foi determinada pela

análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico, após digestão com Spe I

e separação por eletroforese em campo pulsado (PFGE). Não foi possível analisar

sete amostras, das 49 estudadas, pois as mesmas apresentaram degradação de

DNA.

A análise realizada através do programa Gelcompar II demonstrou um

total de 37 padrões eletroforéticos (pulsotipos) distintos entre as 42 amostras

analisadas. Foram observados três grupos clonais (A, D e H) compostos de três

 42

amostras cada e seis grupos (B, C, E, F, G e I), compostos por duas amostras cada.

Os outros 21 pulsotipos foram representados por uma única amostra (Figura 7).

O grupo clonal A compreendeu duas amostras com perfis indistinguíveis

(A1) e uma, com perfil eletroforético (A2) com duas bandas de diferença em relação

ao perfil A1 (85% de coeficiente de similaridade). Cada uma das três amostras foi

isolada de uma das três instituições envolvidas no estudo (HP, HUSE e LACEN),

entre agosto e setembro de 2009 (Figura 5)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

FIGURA 5. Gel representativo de perfis eletroforéticos de fragmentação do DNA cromossômico de

amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima, obtidos após digestão com SpeI.
Linhas 1 e 15: padrão de peso molecular; linhas 4, 9 e 11 (amarelo): amostras do grupo clonal A;
linhas 7 e 10 (azul): amostras do grupo clonal G; linha 8: amostra não tipável; linhas 2, 3, 5, 6, 12,13 e
14: padrões eletroforéticos distintos.

Os grupos clonais B e C foram compostos por duas amostras cada, as do

grupo B, isoladas de pacientes atendidos no Hospital Primavera, internados na UTI e

as amostras do grupo C, de pacientes do LACEN/SE.

 43

O grupo clonal D foi composto por três amostras, sendo duas isoladas de

pacientes atendidos no Hospital Primavera e uma, no LACEN/SE.

As duas amostras do grupo clonal E apresentaram perfis eletroforéticos

idênticos. Foram isoladas a partir de líquor, no período entre novembro e dezembro

de 2008 e foram provenientes de pacientes internados na UTI da mesma instituição

de saúde. Essas amostras foram enviadas ao LACEN/SE.

O grupo clonal F foi composto por duas amostras (65 e 69) isoladas de

dois pacientes atendidos em setores diferentes do Hospital Primavera. Essas

amostras apresentaram 95% de similaridade entre si e, cabe ressaltar que a amostra

65 apresentou um perfil eletroforético indistinguível ao da amostra representativa do

clone epidêmico produtor de SPM-1 disseminado em diversas regiões do Brasil

(clone SP). Já a amostra 69 apresentou perfil indistinguível do perfil de uma amostra

SPM positiva (365H2), isolada na cidade de Niterói/RJ (Figuras 6 e 7).

 44

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

FIGURA 6. Gel representativo de perfis eletroforéticos de fragmentação do DNA cromossômico de

amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima, obtidos após digestão com SpeI.
Linhas 1 e 10: padrão de peso molecular; Linhas 4 e 5: amostras CS 69 e CS 65 (grupo clonal F)
carreadoras do gene blaSPM-1; Linha 7: amostra controle representante do clone epidêmico SPM-1
positivo (P1088); Linha 8: amostra 365H2, SPM-1 positiva; Linhas 2, 3, 6 e 9: padrões eletroforéticos
distintos.

O grupo clonal G foi composto de duas amostras que apresentaram perfil

eletroforético com duas bandas de diferença (coeficiente de similaridade = 95%). As

amostras foram obtidas de pacientes oriundos de instituições diferentes, uma do

Hospital Primavera, paciente internado na UTI e a outra do HUSE, de um paciente

internado em enfermaria. Essas amostras apresentaram o mesmo perfil de

resistência (amicacina, ceftazidima, cefepime, ciprofloxacina e gentamicina).

Todas as três amostras do grupo clonal H foram isoladas de pacientes

internados no Hospital Primavera, dois no CTI e um, em enfermaria, no período

entre abril e junho de 2009.

 45

O grupo clonal I foi composto por duas amostras, isoladas em período

temporal diferentes, em instituições diferentes (Hospital Primavera e LACEN/SE).

As características das amostras pertencentes aos grupos clonais

observados, incluindo seus perfis de resistência, estão apresentadas na Tabela 8.

 46

Amostra Instituição Setor Fonte de isolamento Grupo clonal

Hospitalar

FIGURA 7. Dendrograma resultante da análise computadorizada dos perfis da fragmentação do DNA

cromossômico, obtidos através de eletroforese de campo pulsado em gel de agarose, de 44 amostras
de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima
 47

TABELA 8. Características das 19 amostras de P. aeruginosa pertencentes aos nove grupos clonais
detectados através da análise de seus perfis eletroforéticos obtidos através de eletroforese em campo
pulsado em gel de agarose

Data de Grupo
Amostra Instituição Perfil de Resistência
Isolamento Clonal

74 HP 27/08/08 CAZ, AZT, CEF A

91 HH 03/09/09 CAZ, IMP, MER, AMI, AZT, CEF, CIP, GEN, P/T A

95 LA 10/09/09 CAZ, IMP, MER, AZT, CEF, CIP, P/T A

31 HP 11/04/09 CAZ, IMP, MER, AMI, AZT, CEF, CIP, GEN, P/T B

97 HP 17/09/09 CAZ, IMP, MER, AMI, CEF, CIP, GEN, P/T B

09 LA 05/07/08 CAZ C

12 LA 01/09/08 CAZ, CEF, GEN C

28 HP 10/03/09 CAZ, AZT, P/T D

34 LA 04/05/09 CAZ D

35 HP 26/04/09 CAZ, AZT D

16 LA 03/11/08 CAZ, AZT, CEF, P/T E

20 LA 05/11/08 CAZ, CEF E

65 HP 15/08/09 CAZ, AMI, AZT, CIP, GEN, P/T F

69 HP 18/08/09 CAZ, IMP, MER, AZT, CEF, CIP, P/T F

80 HP 22/08/09 CAZ, AMI, CEF, CIP, GEN G

92 HH 14/09/09 CAZ, IMP, MER, AMI, AZT, CEF, CIP, GEN, P/T G

32 HP 14/04/09 CAZ, IMP, MER, AZT, P/T H

42 HP 15/06/09 CAZ, AMI, AZT H

29 HP 04/04/09 CAZ, AZT H

13 LA 07/10/2008 CAZ, CEF I

52 HP 20/07/2009 CAZ, IMP, MER, CEF, CIP, P/T I

LA: Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Sergipe – LACEN/FSPH; HP: Hospital
Primavera; HH: Hospital de Urgência e Emergência do Estado de Sergipe – HUSE/FHS; CAZ:
ceftazidima; IMP: imipenem, MER: meropenem; AMI: amicacina; AZT: aztreonam; CEF: cefepime;
CIP: ciprofloxacina; GEN: gentamicina; P/T: piperacilina/tazobactam
 48

5 DISCUSSÃO

P. aeruginosa é um dos agentes etiológicos mais freqüentes de

infecções hospitalares, sendo considerada uma das principais causas de

pneumonias, infecções de feridas cirúrgicas, infecções do trato urinário e de

bacteremias.

A maioria das amostras estudadas foi proveniente de espécimes do trato

respiratório inferior (25,3%), seguida de urina (22,1%). Resultado similar ao nosso foi

obtido por Santos Filho e colaboradores (2002), em estudo realizado na região

nordeste (Paraíba), descreveram que a maior parte das amostras de P. aeruginosa

(39,4%) foi proveniente do trato respiratório, seguido do trato urinário (24,2%). Por

sua vez, Figueiredo e colaboradores (2007), com amostras isoladas na cidade de

Recife, PE, também constataram em seu estudo que o maior percentual de

amostras foi oriundo da urina (26,7%), seguida da secreção traqueal (26,1%),

Segundo Torres e colaboradores (2006). Estudo realizado por Rodrigues e

colaboradores (2011) com 40 amostras de P. aeruginosa isoladas em Mato Grosso

do Sul revelaram que a maioria das amostras foi proveniente do trato respiratório

inferiora (17; 42,5%), seguido de urina (13; 32,5%) e ponta do catéter (4,10%). Esse
 49

microrganismo é agente etiológico de infecções hospitalares no trato respiratório

inferior, que são facilitadas pela realização de procedimentos invasivos, como o uso

de ventilação mecânica e catéteres, e infecções urinárias. O terceiro sítio mais

freqüente em nosso estudo foi o líquor, dado esse, incomum na literatura.

As amostras estudadas foram isoladas com maior freqüência (62,1%) a

partir de materiais oriundos de pacientes internados em Unidades de Tratamento

Intensivo (UTIs). Um estudo realizado por Pires e colaboradores (2009) no Hospital

Universitário do Estado de Pernambuco relatou que 53,3% das amostras isoladas

eram provenientes de pacientes admitidos em UTI. A colonização de pacientes

hospitalizados constitui um importante reservatório de P. aeruginosa em UTIs. Esses

pacientes estão mais susceptíveis a essa colonização devido à sua maior exposição

a equipamentos médicos, procedimentos invasivos e aos antimicrobianos de amplo

espectro (RICHARD et al., 1994; KISKA & GILLIAN, 1999).

Um atributo marcante das infecções por P. aeruginosa adquiridas em

UTIs é a multirresistência (SADER et al., 1993; GOLDMANN & HUSKINS, 1997). A

resistência a ciprofloxacina, imipenem, ceftazidima e piperacilina em amostras de

pacientes internados em UTIs chega a ser de 1,5 a 3 vezes maior que nas amostras

de pacientes internados em enfermarias e ambulatórios (ANONYMOUS, 2004).

Os percentuais de resistência observados por nós, de acordo com o setor de

isolamento hospitalar, revelaram taxas superiores entre as amostras de pacientes

atendidos em UTIs.

Os resultados obtidos nos testes de susceptibilidade revelaram um

percentual geral de 51,6% de resistência frente à ceftazidima, entre as amostras

 50

analisadas, percentual superior as taxas encontradas por Pellegrino (2002), de 40%,

entre amostras isoladas no Rio de Janeiro e por Santos Filho e colaboradores (2002)

na Paraíba (15,2%). Por outro lado, esse percentual foi inferior a taxa encontrada

por Gonçalves e colaboradores (2009), de 90,7%, em um estudo realizado no estado

de Goiás. Já Zavascki e colaboradores (2007) encontraram taxas de resistência à

ceftazidima de 48,6% nas amostras de P. aeruginosa isoladas de pacientes

internados no hospital São Lucas, em Porto Alegre, que também foram semelhantes

com nossos resultados.

O perfil de susceptibilidade das amostras desse estudo revelou, também,

além da taxa alta de resistência a ceftazidima, uma taxa elevada de resistência ao

aztreonam, o que poderia estar associado à produção de β-lactamases de espectro

ampliado (ESBL) na população investigada.

As taxas de susceptibilidade observadas em relação aos

carbapenêmicos foram de 75,8% frente ao imipenem e de 77,9%, em relação ao

meropenem. Em um estudo feito por Gales e colaboradores (2002), que objetivou

comparar as atividades in vitro destes dois carbapenêmicos, foram observadas taxas

de sensibilidade semelhantes, de 69,8% ao imipenem e de 74,4%, ao meropenem.

Pulcinelli e colaboradores (2009) também verificaram uma taxa semelhante de

susceptibilidade aos carbapenêmicos (67,3%), em um estudo realizado no Rio

Grande do Sul. Já Pires (2009), analisando amostras de pacientes internados no

Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco, verificou taxas de

susceptibilidade ligeiramente superior às do presente estudo, de 81,8% para o

imipenem.
 51

A maior taxa de susceptibilidade foi verificada frente à amicacina

(81,1%). Taxas semelhantes (80%) foram relatadas por Santos Filho e

colaboradores (2002) em estudo realizado na cidade da João Pessoa/PB, bem como

por Figueiredo e colaboradores (2009) (73,1%) em trabalho realizado na cidade de

Niterói/RJ. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que a amicacina seria

uma boa opção para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa nas

instituições investigadas, da cidade de Aracaju/SE.

Amostras produtoras de MβLs estão distribuídas por todo o mundo. Até o

momento foram descritas nove subclasses de MLs: IMP (imipenemase), VIM

(Verona imipenemase), SPM-1 (São Paulo metalo-beta-lactamase), GIM-1 (German

imipenemase), SIM-1 (Seoul imipenemase), AIM (Australian imipenemase), KHM-1

(Kyorin Health metalo-beta-lactamase), DIM-1 (Dutch imipenemase) e NDM-1 (New

Delhi metalo-beta-lactamase) (OSANO et al., 1994; LAURETTI et al., 1999;

TOLEMAN et al., 2002; CASTANHEIRA et al., 2004; LEE et al., 2005; GUPTA, 2008;

SEKIGUCHI et al., 2008; YONG et al., 2009; POIREL et al., 2010). Cinco classes

(SPM, IMP, VIM, GIM, AIM), já foram descritas em P. aeruginosa (GUPTA, 2008).

No Brasil, a detecção de amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL,

têm se tornado cada vez mais freqüente (SADER et al., 2005; MENDES et al., 2006;

DONG et al., 2008). A detecção dessas amostras produtoras de MβL é de grande

importância para o controle da disseminação desse mecanismo de resistência,

podendo também auxiliar na escolha adequada do esquema terapêutico

antimicrobiano, uma vez que essas enzimas apesar de serem capazes de hidrolisar

a maioria dos beta-lactâmicos, nem sempre conferem um fenótipo de resistência aos

 52

carbapenêmicos in vitro (OH et al., 2003; KIM et al., 2007). Por essa razão, a

resistência à ceftazidima foi definida como critério de inclusão das amostras nos

testes fenotípicos, no presente estudo.

Das amostras resistentes à ceftazidima, 34,7% (17/49) apresentaram

fenótipo positivo para produção de MβL. Taxas semelhantes foram encontradas por

Pulcinelli e colaboradores (2009) de 31,0% de amostras de P. aeruginosa produtoras

de MβL, em estudo realizado na cidade de Porto Alegre, utilizando o método de

disco aproximação. Um estudo realizado por Gonçalves e colaboradores (2009) em

um hospital de Goiânia/GO, revelou taxas superiores (56,4%) de produção fenotípica

para MβL. Já Gaspareto e colaboradores (2007) num estudo com amostras de P.

aeruginosa isoladas em hospitais de Porto Alegre/RS durante um período de dois

anos encontraram índices superiores a 70% de amostras MβLs positivas, entre

cepas resistentes a carbapenêmicos. Um estudo realizado por Fernandes e

colaboradores (2010), com amostras de P. aeruginosa isoladas de hemoculturas de

crianças e adolescentes com câncer revelou uma taxa de positividade de 48,6%,

através do método de disco aproximação. Por outro lado, Torres e colaboradores

(2006) relataram um percentual bem mais baixo (7,7%) entre amostras isoladas na

cidade de Fortaleza/CE. Machado e colaboradores (2011) verificaram taxas de

17,4% de amostras MBL positivas, em estudo na cidade de Passo Fundo/RS.

Cabe ressaltar que o percentual de positividade nos testes fenotípicos

encontrado por nós, em comparação com aqueles observados em outros estudos

conduzidos com amostras da região nordeste, foi bem mais elevado.

 53

De acordo com Arakawa e colaboradores (2000), o agente quelante 2-

MPA apresenta um melhor desempenho quando comparado ao EDTA na detecção

de amostras produtoras de MβL utilizando-se a ceftazidima como substrato.

Diferentemente, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem que o EDTA foi

um melhor agente para detecção de MβL, revelando 32,6% de amostras positivas,

em comparação com o 2-MPA, que detectou a produção de MβL em % das

amostras.

Os métodos fenotípicos para detecção de MβL são considerados rápidos,

de baixo custo e fácil execução (MENDES et al., 2006), porém não existe uma

padronização pelos comitês internacionais, sedo necessária confirmação através de

métodos moleculares.

Nos últimos anos, a descrição de cepas de P. aeruginosa produtoras de

MβL tem sido freqüente no Brasil (GALES, et al., 2003; SADER et al., 2005; Mendes

et al., 2006; MARTINS el al., 2007; DONG et al., 2008; FRANCO et al.; 2010

SHEFFER et al., 2010).

Dentre as MβL descritas em P. aeruginosa, a SPM-1 é a mais prevalente

no Brasil (OLIVEIRA et al., 2001; ANDRADE et al., 2008, CORNAGLIA, et al.,

2011). Essa metalo-enzima foi descrita originalmente em São Paulo. Apesar da

disseminação de um único grupo clonal produtor de SPM-1 em diferentes regiões

brasileiras (clone SP), parece que amostras produtoras dessa MβL ainda estão

restritas ao nosso país (GALES et al., 2003, FRANCO et al., 2011). As taxas de

isolamento dessas amostras podem variar de 5,3% (MARRA et al., 2006), 55,6%
 54

(SADER et al., 2005) a 62,8% (PICÃO et al., 2009) em São Paulo; 20% no Rio de

Janeiro (CARVALHO et al., 2006), 33% em Minas Gerais (CEZÁRIO et al., 2009);

7,5% na região Norte (VIEIRA et al., 2005), e 19,7% no Sul do país (MARTINS et al.,

2007).

Das 49 amostras resistentes a ceftazidima analisadas nesse estudo,

apenas duas (4%) foram positivas para o gene blaSPM-1, porém uma dessas

amostras apresentou resultado negativo nos testes fenotípicos para detecção de

MβL. Nenhuma amostra do nosso estudo apresentou os determinantes genéticos

blaIMP-1, blaVIM-2 e blaGIM-1 investigados. Cabe ressaltar que, de todas as amostras

positivas para produção de ML nos testes fenotípicos, apenas uma foi positiva para

o gene blaSPM-1. Essa discrepância entre os resultados obtidos nos testes fenotípicos

e genotípicos pode estar relacionada com a variação da sensibilidade e

especificidade do método de acordo com a combinação do substrato e agente

quelante e/ou presença de outros mecanismos de resistência que possam interferir

no resultado de teste fenotípico, ocasionando falso-positivos. Franco e

colaboradores (2010) em estudo realizado com 69 amostras de P. aeruginosa

resistentes ao imipenem, relataram 53 amostras como sendo positivas no teste

fenotípico de DA. Entretanto o resultado variou de 13,2% (7/53) quando utilizada a

combinação IMP/MPA para 88,7% (43/53) quando utilizada a combinação

IMP/EDTA. Vale ressaltar, que, nesse estudo, 21 amostras foram confirmadas como

ML positivas através de testes de PCR. Por outro lado, foi observada uma amostra

positiva para o gene blaSPM-1 e negativa nos testes fenotípicos. Esses resultados

discrepantes podem ser explicados por uma não expressão do gene in vitro ou

ainda, um resultado falso-negativo.

 55

Esse é o primeiro relato de amostras positivas para o gene blaSPM-1 na

cidade de Aracaju/SE. O baixo índice encontrado (4,1%, 2/49) é compatível com

outros estudos da região nordeste. Apesar do percentual verificado ser baixo, esse

resultado reforça a importância dessa classe de MβL no nosso meio, uma vez que

foi a única observada no estudo e enfatiza também a necessidade de monitoramento

da disseminação desse mecanismo de resistência entre amostras de P. aeruginosa

nos hospitais investigados.

A baixa taxa de amostras de P. aeruginosa MβL positivas sugere que a

produção de MβLs não foi o principal mecanismo de resistência a ceftazidima e aos

carbapenêmicos em P. aeruginosa isoladas no município de Aracaju, SE, no período

estudado. A presença de outros mecanismos tais como produção de enzimas ESBL

ou hiperprodução de Amp C, bem como diminuição da permeabilidade da membrana

externa e bombas de efluxo poderiam estar presentes nessas amostras.

Para elucidação de outros possíveis mecanismos de resistência a

ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos presentes nas amostras desse estudo, testes

genotípicos posteriores serão realizados.

Em nosso estudo, a diversidade genética das 49 amostras de P.

aeruginosa resistentes a ceftazidima foi avaliada através de PFGE. Os resultados

obtidos revelaram uma elevada diversidade, tendo sido observados 21 pulsotipos

distintos. Esse resultado sugere que a disseminação da resistência a CAZ se deve

principalmente à disseminação horizontal de genes de resistência a esse

antimicrobiano
 56

Por outro lado, nove grupos clonais, compostos por duas ou três

amostras foram identificados, sendo que alguns deles, como o grupo F, foi composto

de amostras isoladas em diferentes setores do mesmo hospital. Em adição, o grupo

clonal A, compreendeu três amostras isoladas nas três instituições de saúde

estudadas. Esses resultados sugerem ocorrência de disseminação intra e inter-

hospitar na população investigada.

Gales e colaboradores (2003) realizaram um estudo com amostras de P.

aeruginosa coletadas a partir de sete centros médicos não relacionados, localizados

em cinco estados brasileiros. Encontraram 16 amostras com perfil eletroforético

indistinguível, através do PFGE, perfil esse idêntico ao exibido pelo clone São Paulo,

produtor de SPM-1, descrito anteriormente.

Franco e colaboradores (2010) em estudo realizado com 69 amostras de

P. aeruginosa resistentes ao imipenem verificaram a presença de 21 amostras

produtoras de ML [(SPM-1 (17) e VIM-2 (4)] em estudo realizado na cidade de São

Paulo. Nas amostras SPM-1 positivas, cinco apresentaram perfis indistinguíveis ao

do clone São Paulo; 11 estavam intimamente relacionadas e uma possivelmente

relacionada com o clone SP.

As duas amostras produtoras de SPM-1 (grupo clonal F) apresentaram

perfil eletroforético indistinguível ou intimamente relacionado ao do clone SP e

também a uma amostra isolada no Rio de Janeiro, relacionada com o clone SP.

Esses resultados corroboram os resultados obtidos em outros estudos, que apontam

 57

a SPM-1 como sendo a ML mais prevalente e o clone SP como sendo o mais

disseminado no Brasil.
 58

6 CONCLUSÕES

 Os resultados obtidos nos testes de susceptibilidade revelaram taxas de

resistência elevadas ou moderadamente elevadas frente às diversas classes de

antimicrobianos testadas, incluindo a ceftazidima e os carbapenêmicos.

 Os resultados dos testes fenotípicos indicaram uma ocorrência elevada de

amostras produtoras de MβL na população investigada, porém os testes

moleculares realizados foram positivos para apenas duas amostras, sugerindo

que os testes fenotípicos apresentaram resultados falso-positivos ou a presença

de outro determinante diferente dos que foram pesquisados poderia estar

envolvida.

 Duas amostras foram caracterizadas como carreadoras do gene blaSPM-1. No

nosso conhecimento, esse é o primeiro relato de amostras produtoras de ML

SPM-1, em Aracaju, SE. Esse resultado reforça a maior prevalência dessa classe

de ML entre amostras de P. aeruginosa isoladas no Brasil.

 59

 As amostras SPM-1 positivas foram geneticamente relacionadas ao clone

epidêmico São Paulo, reforçando a importância da disseminação desse clone no

nosso meio.

 Uma das amostras carreadora do gene blaSPM-1 apresentou resultado negativo

nos testes fenotípicos, o que poderia ser explicado pela não expressão do gene in

vitro ou pela baixa acurácia desses testes.

 Observou-se a presença de nove grupos clonais compostos de poucas amostras

e um número elevado de perfis distintos entre as amostras resistentes a

ceftazidima. Esses resultados sugerem que a disseminação clonal de amostras

resistentes a ceftazidima não seria a principal via de disseminação dessa

resistência na população investigada, mas sim, a aquisição horizontal de genes

de resistência a esse antimicrobiano.

 A ocorrência de amostras pertencentes aos mesmos grupos clonais isoladas em

diferentes instituições de saúde e em diferentes setores dentro da mesma

instituição sugere a disseminação inter e intra-hospitalar, durante o período

estudado.
 60

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ANEXOS
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