Po Teste de Sensibilidade

CÓDIGO: PÁG.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PO.LAB.GDIA.103 1 / 21
TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
1. OBJETIVO
1.1. FINALIDADE: Verificar a susceptibilidade bacteriana frente aos antimicrobianos.
1.2. SINONÍMIA: Antibiograma.
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO:
A realização e a interpretação do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) é uma das principais e
desafiadoras tarefas do laboratório de microbiologia, seja pelas limitações dos testes utilizados, como por exemplo
as encontradas no teste de Kirby e Bauer e automação, seja pela detecção cada vez mais crescente de novos
mecanismos de resistências.
2. ÂMBITO DE APLICAÇÃO
Laboratórios de Microbiologia dos Serviços Próprios da Unimed BH.
3. PREPARAÇÃO
3.1. PREPARO DO PACIENTE: Não aplicável.
3.2. MATERIAL BIOLÓGICO:
3.2.1 TIPO: Isolados bacterianos
3.2.2 RECIPIENTE/ADITIVO: Agar Mueller Hinton, Agar Mueller Hinton Sangue,Cartões e consumíveis Vitek 2.
3.2.3 PRESERVAÇÃO:
4. DESCRIÇÃO
4.1. EQUIPAMENTOS: Vitek 2 -Biomerieux/ Vitek MS – Biomerieux.
4.2. CALIBRAÇÃO: Não aplicável.
EMISSÃO: ANÁLISE CRÍTICA: APROVAÇÃO:

Laura Nunes Rosana Krambeck Rosana Krambeck
02/08/2022 02/08/2022 02/08/2022
Somente são considerados controlados os documentos disponíveis no sistema
Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010
Documento de referência: PO.GSG.GEPP.003
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4.3. PROCEDIMENTO TÉCNICO:
ANTIBIOGRAMA: MÉTODO DE KIRBY BAUER OU DISCO DIFUSÃO
São utilizados discos de papel filtro impregnados com uma concentração padronizada do antimicrobiano. O seu
princípio baseia-se na difusão do antimicrobiano na superfície do ágar. Os diâmetros dos halos de inibição de
crescimento ao redor de cada disco são mensurados e categorizados – resultado qualitativo.
Procedimento passo a passo:
 Retirar as placas de Ágar Mueller Hinton e os discos de antibióticos a serem usados da geladeira para
alcançar a temperatura ambiente. A superfície do ágar deve está seca antes do uso.
 Fracionar 2 mL de Cloreto de Sódio 0,9% em um tubo. Identificar o tubo com o número de registro do
paciente e suas iniciais;
 Pescar duas a quatro colônias devidamente isolada em meio de cultura (colônias morfologicamente similares)
e transferi-la para a solução salina de acordo com turvação 0,5 da escala de Mac Farland – a semeadura deverá
ser realizada em até 15 minutos;
 Identificar as placas de Mueller Hinton com a etiqueta extraída do sistema REAL;
 Introduzir o swab estéril dentro da suspensão bacteriana: para bastonetes gram negativos comprimir contra a
parede do tubo para retirada o excesso da suspensão; para cocos gram positivos NÃO pressionar o swab contra a
parede interna do tubo.
 Semear de forma suave e uniforme a placa de Mueller Hinton em 3 direções da placa, procurando abranger
toda a superfície;
 Aguardar cerca de 15 minutos, à temperatura ambiente, para que o inóculo seja absorvido totalmente pelo
Ágar antes de colocar os discos de antibióticos;
 As colocações dos discos de antibióticos devem ser realizadas com a pinça estéril (é recomendado a
colocação de até 6 discos em placas de 90mm e até 12 discos em placas de 150mm, evitando assim a
superposição dos halos e a interferência dos antimicrobianos).
 Pressionar levemente com auxílio da pinça sobre o disco de antibiótico. Uma vez colocado o disco no Ágar
este não deve ser removido, pois a difusão da droga é imediata;
 Ao finalizar a colocação dos discos a placa deve ser incubada de forma invertida na estufa a temperatura de
35 ±1ºC, até 15 minutos após a colocação dos discos.
Observações
- As suspensões de Streptococcus pneumoniae devem ser preferencialmente preparadas a partir de cultura obtida
em de Ágar sangue de modo a obter densidade equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland. Quando a
suspensão for preparada a partir de cultura em ágar chocolate, a turbidez do inóculo deve ser equivalente ao
padrão 1.0 da escala de McFarland.
- É recomendado colocar no máximo 12 discos de antibióticos na placa de Mueller Hinton (150mm), pois pode
ocorrer confluência dos halos, dificultando a sua leitura; porém, quando for realizar a confirmação de perfil em
testes já realizado por automação ou o Polisensidisc, estes conterão 15 discos de antibióticos. Caso, algum halo
apresente distorcido, comprometendo sua leitura, novo teste deverá ser realizado.

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- Para a realização do antibiograma para Enterobactérias, Pseudomonas spp, Stenotrophomas maltophilia,

Acinetobacter spp, Staphylococcus spp e Enterococcus spp, utilizar o Ágar Mueller Hinton; para Streptococcus
spp, Moraxella spp, Listeria monocitogenes utilizar o Mueller Hinton Sangue.
Segue abaixo a recomendação do Bracast para as condições de incubação Método Disco Difusão – Brcast, 2021:
Leitura das placas de antibiograma:
 O crescimento bacteriano deve ser confluente e está uniformemente distribuído na placa.
 Após 16 a 20 horas de incubação (ver tabela acima), proceder a leitura das placas. Com auxílio de uma régua
medir o diâmetro dos halos de cada disco consultando a padronização estabelecida pelo BRCAST do ano vigente
para determinar se a bactéria em análise é S - “Sensível, dose padrão”, I - “Sensível, aumentando exposição” ou R
– “Resistente” ao antibiótico testado:
o Ler as placas de Ágar Müeller-Hinton não suplementadas pelo seu fundo, com luz refletida (sobre a placa)
contra um fundo escuro.
o Ler as placas de ágar Müeller-Hinton suplementadas com a tampa removida, observando a superfície
contendo os discos, sob luz refletida.

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o Em caso de halo duplo ou colônias isoladas dentro do halo de inibição verificar a pureza e repetir o teste, se
necessário. Se a cultura estiver pura, as colônias dentro do halo devem ser consideradas.
o Para Enterobacteriaceae, ao testar ampicilina, ampicilina-sulbactam e amoxicilina-ácido clavulânico ignorar o

crescimento que possa aparecer como uma fina película produzida no interior do halo em alguns lotes de ágar
Müeller-Hinton.
o Para Escherichia coli e Fosfomicina, não considere colônias isoladas dentro do halo de inibição e efetuar a
leitura na borda externa do halo.
o Para Sulfametoxazol-Trimetoprim ou trimetoprim, pode aparecer um crescimento reduzido dentro do halo de

inibição até o disco devido à presença de antagonistas no meio. Este crescimento deve ser ignorado e o diâmetro
do halo aferido na borda mais nítida do halo. Para Stenotrophomonas maltophilia, ao testar sulfametoxazol
trimetoprim, o crescimento no interior do halo de inibição pode ser substancial. Tal crescimento deve ser ignorado
e o halo de inibição deve ser lido onde a borda do halo possa ser vista. Ler como ausência de halo somente se
houver crescimento até o disco e se não houver qualquer halo de inibição.
o Para Proteus spp., ignore o véu (swarming) e ler as bordas de inibição.
o Quando a cefoxitina for utilizada para detecção da resistência à oxacilina (meticilina) em Staphylococcus
aureus, aferir o halo evidente e examinar os halos de inibição cuidadosamente contra a luz para detectar colônias
dentro do halo. Isto pode ser devido a presença de mais de um microrganismo ou expressão de resistência
heterogênea à oxacilina (meticilina).
o Ler os testes de sensibilidade de linezolida a partir do fundo da placa, com a placa contra a luz (luz
transmitida).
o Para Enterococcus spp., ao testar vancomicina, inspecionar as bordas do halo de inibição cuidadosamente
com a placa contra a luz (luz transmitida). Bordas irregulares e colônias dentro do halo de inibição indicam
resistência à vancomicina e devem ser melhor investigadas. Isolados não podem ser reportados sensíveis antes
de 24 horas de incubação.
o Para estreptococos hemolíticos, ler a inibição de crescimento e não da hemólise. A β-Hemólise é usualmente
livre de crescimento, enquanto α-hemólise e o crescimento geralmente coincidem. Inclinar a placa para frente e
para trás para melhor diferenciar hemólise de crescimento.
 O resultado obtido na leitura do antibiograma deverá ser registrado diretamente no Sistema REAL, assim
como a liberação clínica parcial (Validar Preliminar) e Liberação clínica final (Validar Final).
Interpretação dos resultados:
A medida do diâmetro das zonas de inibição permite categorizar os antimicrobianos frente ao microrganismo
como, segundo a padronização do Manual do Brcast:
S - Sensível, dose padrão: Um microrganismo é categorizado como Sensível, dosagem padrão, quando há uma
alta probabilidade de sucesso terapêutico utilizando o regime de dosagem padrão do agente.
I – Sensível, aumentando exposição: Um microrganismo é categorizado como Sensível, aumentando exposição

quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição foi aumentada ajustando-se o
regime de dosagem ou sua concentração no local de infecção.
R - Resistente: um microrganismo é categorizado como Resistente quando há alta probabilidade de falha

terapêutica mesmo quando há aumento da exposição.

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Utilizar a padronização da “Tabela de pontos de corte clínicos” – BRCAST, do ano vigente, para interpretação dos
resultados obtidos (disponível em: http://brcast.org.br/documentos/).
ANTIBIOGRAMA: MÉTODO AUTOMATIZADO - VITEK 2 COMPACT/ BIOMERIEUX:
Os sistemas automatizados utilizam cartões ou painéis para determinar a Concentração Mínima Inibitória (CIM)
dos antimicrobianos.
O equipamento VITEK 2 Compact caracteriza-se como um sistema integrado, o qual combina as funções de
inoculação, incubação e leitura do cartão de teste. Os cartões AST possuem um número determinado de
antibióticos e com concentrações pré-estabelecidas pelo fabricante. O VITEK® 2 monitoriza continuamente todos
os poços, medindo sua turvação por leitura fotométrica. O MIC é determinado através da comparação do
crescimento do isolado do paciente ao crescimento dos isolados com CMIs conhecidas. É como ter uma curva
padrão armazenada no VITEK® 2, onde a curva padrão se relaciona com CMIs de referência para a atividade dos
microrganismos nos poços de antibióticos – Conforme descrito no P.O. Antibiograma Automatizado - Vitek 2.
Procedimento analítico
O Vitek 2 monitora o crescimento bacteriano/fúngico na presença do antimicrobiano em pelo menos 3

concentrações crescentes, distintas. Os valores de transmitância dos poços são comparados ao poço controle.
O instrumento registra leituras correspondentes à atividade microbiana a cada 15 minutos: 3 leituras x 16 posições
- leituras turbidimétricas.
Para cada valor de MIC Referência avaliado, são coletados dados correspondentes do cartão VITEK 2.
Durante o desenvolvimento dos cartões VITEK2, formou-se uma extensa “Base de Dados de Algoritmos”,
contendo referências de cada microrganismo atrelado a um antimicrobiano.
Além dos MICs obtidos, o sistema Vitek 2 utiliza as regras AES para a interpretação dos resultados obtidos.
Os resultados obtidos são classificados como “S”, “I” ou “R” de acordo com a padronização do Manual do Brcast
do ano vigente.
Para Gram Positivos, utilizar o Cartão Vitek AST – P637; Para Gram Negativos utilizar o Cartão Vitek AST – N409
(para secreções e hemoculturas) e Cartão Vitek AST – N408 (para Uroculturas).
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – ENTEROBACTÉRIAS – NORMA BRCAST
*Antimicrobianos testados/ liberados – Uroculturas: Laboratórios e Pronto Atendimento Unimed BH:

Metodologia: Disco-difusão.
- Amicacina
- Ampicilina
- Amoxacilina – Clavulanato
- Cefalexina (quando aplicável)
- Ceftazidima
- Cefuroxima (quando aplicável)
- Ciprofloxacino
- Gentamicina
- Fosfomicina (quando aplicável)
- Nitrofurantoína (quando aplicável)
- Norfloxacino
- Trimetoprim Sulfametoxazol

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Obs: Utilizar Polisensidisc Série Urinária Brcast/ DME – Método de Disco Difusão. Em casos de isolados
multirressistentes (ESBL, KPC) ou a resistência a mais de 3 classe de antimicrobianos, realizar a confirmação da
identificação e a complementação dos antibióticos (liberar padronização para internados). Se necessário, utilizar
metodologia automatizada para realização do antibiograma (o exame disponível para solicitação nos Pronto-
Atendimentos e Laboratórios é Urocultura, Externo – Manual/ Disco Difusão).
* Antimicrobianos testados/ liberados - Uroculturas (internados)

Metodologia utilizada: Automação Vitek 2 e/ou Disco-difusão.
- Amicacina
- Amoxacilina Clavulanato
- Ampicilina
- Cefepime
- Ceftazidima
- Ceftriaxona
- Cefuroxima (quando aplicável)
- Ciprofloxacino
- Gentamicina
- Fosfomicina (quando aplicável)
- Imipenem (quando aplicável)
- Levofloxacina
- Meropenem
- Nitrofurantoína (quando aplicável)
- Norfloxacino
- Piperacilina Tazobactan
*Testar e liberar a Polimixina B somente nos casos de resistência aos carbapenêmicos – Realizar microdiluição.
*Testar e liberar Ceftazidima avibactam quando o microrganismo apresentar sensibilidade somente à Polimixina B
e aos aminoglicosídeos; sensibilidade somente à Polimixina B; ou microrganismo multirresistente (todos os atbs
resistentes). Determinar o MIC (E-test) para Hemoculturas e Líquidos nobres; para os demais materiais: Disco
Difusão.
* Antimicrobianos testados/ liberados - Secreções/ Hemoculturas:

Metodologia utilizada: Automação Vitek 2 e/ou Disco-difusão.
- Amicacina
- Amoxacilina Clavulanato
- Ampicilina
- Aztreonam
- Cefepime
- Ceftazidima
- Ceftriaxona
- Ciprofloxacino
- Ertapenem (triagem)
- Gentamicina
- Imipenem
- Meropenem
- Piperacilina Tazobactan
- Tigeciclina (quando aplicável)
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Difusão.
Obs: Realizar a identificação e antibiograma automatizados pelo Vitek MS e Vitek 2, respectivamente. Em caso de
isolados multirresistentes, realizar a confirmação do antibiograma automatizado pelo método de disco difusão.
Observações:
- Se resistente à Ciprofloxacino, reportar todas as Fluoroquinolonas como resistentes; se sensível à

Ciprofloxacino, reportar o resultado obtido para cada antibiótico.
- O ponto de corte para Fosfomicina, por disco difusão está disponível somente para E.coli; para outras
enterobactérias, determinar a CIM.
- Para E.coli, Klebsiella spp (exceto K.aerogenes) e Raoultella spp: Se resistentes a qualquer cefalosporina de 3ª
geração (cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima) ou 4ª geração (cefepima) e suscetível a Piperacilina-Tazobactam ou
Amoxicilina-Ác. Clavulânico, reportar o resultado obtido.
- Amoxacilina-Ac. Clavulânico: pontos de corte diferentes para ITU’s.
- Cefuroxima oral: Apenas para ITU’s não complicadas (E.coli, P.mirabilis, Raoultella spp, Klebsiella spp.- exceto
K. aerogenes).
Detecção fenotípica de mecanismos de resistência – Enterobactérias:
1- ESBL (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Proteus mirabilis)
ESBLs são enzimas capazes de hidrolisar a maioria das penicilinas e cefalosporinas 1ª a 4ª geração e
monobactâmicos, mas não cefamicinas (cefoxitina) ou carbapenêmicos. A maioria das ESBLs pertence à classe A
de Ambler e é inibida por inibidores de β-lactamase (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam) e por
diazabiciclooctanonas (avibactam).
Triagem:
Segundo o Brcast, suspeita-se da presença de ESBL quando:

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Teste fenotípico para confirmação:
Teste de sinergismo de disco duplo (TSDD) ou Disco Aproximação: Ao se realizar o antibiograma, colocar os
discos contendo as cefalosporinas (cefotaxima ou ceftriaxona, ceftazidima, cefepima, aztreonam) próximos a um
disco com o ácido clavulânico (amoxicilina-ácido clavulânico) – cerca de 25 mm de distância. Após a incubação -
16 a 20 horas de incubação a 35 +/- 1ºC - proceder a leitura: um resultado positivo é indicado quando as zonas de
inibição em torno de qualquer um discos de cefalosporinas são aumentadas na direção do disco que contém o
ácido clavulânico (zona fantasma).
Sistemas automatizados:
A automação possui sistemas automatizados para detecção de ESBL – é emitido uma mensagem no sistema.
*Liberação do resultado: Reportar o resultado encontrado (Sensível, dosagem padrão; Sensível, aumentando a
exposição ou Resistente); liberar a observação: “Teste de sinergismo de disco duplo (TSDD): Positivo - Cepa
produtora de beta lactamase de espectro ampliado”.
CÓDIGO: PÁG.:
- Para E.coli, Klebsiella spp (exceto K.aerogenes) e Raoultella spp: Se resistentes a qualquer cefalosporina de 3ª
geração (cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima) ou 4ª geração (cefepima) e suscetível a Piperacilina-Tazobactam ou
Amoxicilina-Ác. Clavulânico, reportar o resultado obtido.
2- Beta Lactamase do tipo AMP C:
Os microrganismos do grupo CESP (Citrobacter freundii; Enterobacter spp.; Serratia marcescens Providencia
spp.) e demais (Hafnia alvei, Aeromonas spp., M. morganii, P. aeruginosa, S. maltophilia) podem expressar o gene
cromossômico AMP C constitutivamente em baixos níveis, porém, quando induzidos por betalactâmicos,
desreprimem o gene, produzindo grande quantidade de beta lactamase do tipo AMP C.
Suspeita-se da produção de AMP C pelas cepas do grupo CESP e demais quando:
- Resistência ou sensibilidade intermediária à Cefoxitina e Amoxacilina- Ac. Clavulânico;

- Sensibilidade ao cefepime.
As cepas de K. pneumoniae/ oxytoca, E.coli, P. mirabilis e Samonella spp. (grupo KEPS) podem apresentar a
produção de AMP C mediada por plasmídeos, além da produção de ESBL. Neste caso, as cepas apresentam-se
totalmente resistentes ou intermediárias a Cefoxitina, cefalosporinas de 1ª a 3ª geração e penicilinas com
inibidores de betalactamase. Geralmente não degradam cefalosporinas de 4ª geração (Cefepime). Quando
associada a outros mecanismos (bombas de efluxo e/ou deficiência de porinas), a sensibilidade intermediária ou
resistência a carbapenêmicos pode ser observada.
Detecção de AMP C cromossômicas induzíveis (CESP e demais):
- Colocar um disco de Cefoxitina (indutor) próximo ao disco de Cefotaxima ou Ceftriaxona distante 20mm borda a
borda. Se houver a produção de AMP C induzível, observa-se o achatamento nos halos de Cefotaxima ou
Ceftriaxona.
- Colocar um disco de Impenem (indutor) próximo ao disco de Ceftazidima distante 20mm borda a borda. Se
houver a produção de AMP C induzível, observa-se o achatamento nos halos de Cefotaxima ou Ceftriaxona.
*Liberação do resultado: Reportar o resultado encontrado (Sensível, dosagem padrão; Sensível, aumentando a
exposição ou Resistente); liberar a observação quando ocorrer resistência às cefalosporinas: “Cepa produtora de
beta lactamase induzível (AMPC C), na qual a terapia com betalactâmicos, associados ou não aos inibidores de
betalactamase, está associada à falha terapêutica”.
Observação:
Caso o resultado do Teste de sinergismo de disco duplo (TSDD) para detecção de ESBL e Detecção de AMP C
cromossômicas induzíveis (CESP e demais) for negativo, e o isolado apresentar resistência às cefalosporinas de
3ª ou 4ª geração, liberar a observação: “O isolado é resistente a uma ou mais cefalosporinas de 3ª/ 4ª geração .
Isto pode sugerir a presença de ESBL, hiperprodução de Beta Lactamase do tipo AMP c e/ou outra Beta
Lactamase de Espectro Aumentado”.
3- Carbapenamase:
A resistência aos carbapenemicos pode ocorrer devido a hiperprodução de betalactamases do tipo AMP C ou
ESBL associadas à diminuição de permeabilidade da membrana externa (porinas e bombas de efluxo) ou
mediadas por beta lactamases (carbapenamases), capazes de hidrolisar o ertapenem, imipenem e meropenem.
Carbapenemases são β-lactamases que hidrolisam penicilinas, cefalosporinas na maioria dos casos, e em vários
graus carbapenêmicos e monobactâmicos (estes últimos não são hidrolisados por metalo-β-lactamases).

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Os pontos de corte atuais (CLSI e BRCAST) permite detectar a presença de mecanismos de resistência; alguns
isolados produtores de carbapenamase podem ser categorizados como sensíveis e devem ser relatados de
acordo com resultado encontrado – a presença de carbapenamase não influencia na categorização da
sensibilidade. A sua detecção é recomendada para fins de saúde pública e controle de infecções.
As cepas suspeitas da produção de carbapenamases apresentam o resultado resistente ao Ertapenem e/ou

Meropenem. Para esta cepas, realizar o teste m-CIM e e-CIM e/ ou encaminhar o isolado bacteriano para a
FUNED:
Método m-CIM:
Preparo dos discos:
- Em um tubo contendo 2ml de caldo TSB preparar uma suspensão da bactéria a ser testada utilizando alça estéril
de 1µl para enterobactérias e 10 µl para Pseudomonas aeruginosa;
- Agitar em vórtex por 10-15 segundos;
- Adicionar 1 disco de Meropenem (10 µg);
- Incubar o tubo à 35 +/- 1ºC em ar ambiente, por 4 horas.
Preparo da placa:
- Decorrido o tempo de incubação, preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922, 0,5 de McFarland;
- Mergulhar o swab na suspensão preparada, retirar o excesso do inoculo na parede do tubo e semear de maneira
homogênea sobre a superfície do Ágar Mueller Hinton;
- Deixar o inóculo secar durante 3 a 10 minutos;
- Aplicar o disco de Meropenem: Utilizando uma alça bacteriológica de 10 µl retirar o disco de Meropenem da
suspensão em TSB, retirando o excesso de líquido do disco na parede do tubo. Colocar o disco de Meropenem
sobre a superfície da placa de Mueller Hinton inoculada com E. coli ATCC 25922 (Meropenem sensível).
- Incubar a placa à 35 +/- 1ºC em ar ambiente, por 18 a 24 horas.
Leitura:
Se o isolado for produtor de carbapenamase, o Meropenem do disco será hidrolisado durante o período de
incubação em caldo com o microrganismo teste. A E. coli ATCC 25922 que é sensível ao Meropenem (halo 28-35
mm) apresentará diâmetro do halo de inibição entre 6 e 15 mm ou presença de pequenas colônias dentro de uma
zona de 16 e 18mm. Diâmetros >=19 mm são considerados negativos e diâmetros entre 16 e 18mm são
considerados indeterminados.
Método e-CIM:
Para enterobactérias, paralelamente ao teste de m-CIM, o teste de e-CIM pode ser realizado para determinar se a
carbapenamase é uma metalobetalactamase.
- Em um segundo tubo de TSB, adicionar 20 µl de EDTA 0,5M e seguir o preparo dos disco, conforme descrito no
m-CIM.
- Aplicar o disco incubado na mesma placa de Mueller Hinton preparada para o m-CIM.
- A presença de carbapenamase do tipo metalobetalactamase é confirmada por um aumento de 5mm de diâmetro
comparado ao disco sem EDTA.
- Somente no teste de e-CIM, colônias puntiformes dentro da zona de inibição devem ser ignoradas. Na presença
de metalobetactamase, o EDTA inibe a atividade da carbapenamase e o meropenem do disco não será
hodrolisado tão eficientemente quanto no tubo sem EDTA (m-CIM).
*Liberação de resultado

CÓDIGO: PÁG.:
Resultado m-CIM e e-CIM positivos. Reportar: Presença de metalobetalactamase
Resultado m-CIM positivo e e-CIM negativo. Reportar: Presença de serina carbapenamase.
Resultado m-CIM negativo e e-CIM inválido: Reportar: Carbapenamase não detectada.
Observação: Proteus sp, Providencia sp e Morganella sp podem ter sensibilidade reduzida ao Imipenem por
outros mecanismos de resistência sem ser a produção de carbapenamases.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – ACINETOBACTER SPP. – NORMA BRCAST
* Antimicrobianos testados/ liberados - Secreções/ Hemoculturas/ Uroculturas:
- Amicacina
- Ciprofloxacino
- Gentamicina
- Imipenem
- Levofloxacino
- Meropenem
*Testar e liberar a Polimixina B somente nos casos de resistência aos carbapenêmicos.

**Realizar a testagem de Ampicilina Sulbactam e Tigeciclina somente quando solicitado pela CCIH – utilizar os
parâmetros descritos no CLSI e Tabela PK/PD para interpretação do resultado.
Obs: Realizar a identificação e antibiograma automatizados pelo Vitek MS e Vitek 2, respectivamente. Em caso de
isolados multirresistentes, realizar a confirmação do antibiograma pelo método de disco difusão (o exame
disponível para ser solicitado é a Cultura Automatizada).
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – PSEUDOMONAS SPP. – NORMA BRCAST
- Amicacina
- Aztreonam
- Cefepime
- Ceftazidima
- Ciprofloxacina
- Imipenem
- Levofloxacino
- Piperacilina Tazobactam
Obs: Devido à baixa reprodutibilidade do antibiograma pelo método automatizado (coloração da cepa), este
deverá ser realizado somente por disco difusão.
Difusão.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – BURKOLDERIA CEPACIA – NORMA BRCAST

CÓDIGO: PÁG.:
Não há tabela específica para interpretação do antibiograma. Caso haja solicitação de liberação do antibiograma
pela CCIH, seguir a norma do CLSI e liberar a seguinte observação:
“Não há critérios definidos pelo Brcast para interpretação do antibiograma para as espécies do Complexo
Burkoldeira cepacia. Alternativamente, mas não consistindo em evidência definitiva de sucesso terapêutico, foram
utilizados os critérios interpretativos do CLSI”.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA -

NORMA BRCAST
- Trimetoprim-Sulfametoxazol
Obs: Realizar o antibiograma por Disco-difusão

*Realizar a testagem de Levofloxacino somente quando solicitado pela CCIH – utilizar os parâmetros do CLSI para
interpretação dos resultados.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – STAPHYLOCOCCUS SPP. – NORMA BRCAST
* Antimicrobianos testados/ liberados – Uroculturas - Laboratórios/ Pronto Atendimento Unimed BH:
- Gentamicina
- Nitrofurantoína
- Norfloxacino
- Oxacilina (testar cefoxitina – Disco Difusão)
- Vancomicina (testado mas não liberado)
Metodologia utilizada: Disco Difusão.
* Antimicrobianos testados/ liberados - Secreções/ Hemoculturas/ Uroculturas internados:
- Clindamicina (não liberado em uroculturas)

- Daptomicina (não liberado amostras pulmonares)
- Eritromicina (não liberado em uroculturas)
- Gentamicina
- Levofloxacino
- Linezolid
- Nitrofurantoína (somente uroculturas)
- Norfloxacino (somente uroculturas)
- Oxacilina (testar cefoxitina – Disco Difusão)
- Rifampicina
- Tigeciclina (não liberado amostras pulmonares e uroculturas)
- Vancomicina
Obs: Realizar a identificação e antibiograma automatizados pelo Vitek MS e Vitek 2, respectivamente.
Observações:

CÓDIGO: PÁG.:
- Isolados classificados como sensíveis ao norfloxacino podem ser reportados como sensíveis ao ciprofloxacino,
levofloxacino, moxifloxacino e ofloxacino. Isolados classificados como não sensíveis ao norfloxacino devem ser
testados individualmente para cada agente.
Detecção fenotípica de mecanismos de resistência
1- Mec A (MRSA):
Utilizar a Cefoxitina para determinar o perfil da Oxacilina (A cefoxitina funciona com um marcador com alta
sensibilidade e especificidade para detecção à oxacilina mediada pelo gene MecA).
2- Resistência indutível a Clindamicina
Realizar o D-test: Colocar o disco de Eritromicina 15µg e Clindamicina 2µg cerca de 12 a 20 mm de distância,
conforme figura abaixo. Se ocorrer o achatamento do halo da Clindamicina, o teste será positivo e ambos os
antibióticos deverão ser liberados como resistentes.
*Liberação do resultado: Reportar Clindamicina e Eritromicina como resistentes. Liberar a Observação: Presença
de resistência indutível à Clindamicina.
3- Resistência a Vancomicina
Isolados não sensíveis são raros. A identificação e o teste de sensibilidade em isolados não sensíveis devem ser
confirmados em centro de referência.
Concomitantemente, realizar a confirmação da identificação e teste com Ágar BHI incorporado 6 mcg/mL de
Vancomicina: Realizar suspensão 0,5 Mac Farland; inocular 1-10 µL da suspensão no meio BHI com Vancomicina
e incubar 35°C+/-1°C - O crescimento de > 01 colônia presumi a resistência a vancomicina. Comunicar o achado
para CCIH e encaminhar a cepa para o Laboratório de Referência.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – ENTEROCOCCUS SPP. – NORMA BRCAST

CÓDIGO: PÁG.:
* Antimicrobianos testados/ liberados – Uroculturas - Laboratórios/ Pronto Atendimento Unimed BH:
- Ampicilina
- Ciprofloxacino
- Nitrofurantoína
- Gentamicina Sin
- Estreptomicina Sin
- Norfloxacino
- Vancomicina
Metodologia utilizada: Disco Difusão.
Obs: casos de isolados multirressistentes, realizar a confirmação da identificação e a complementação dos

antibióticos (internados). Se necessário, utilizar metodologia automatizada para identificação e realização do
antibiograma (o exame disponível para solicitação nos Pronto-Atendimentos e Ambulatórios é Urocultura, Externo
– Manual).
* Antimicrobianos testados/ liberados - Secreções/ Hemoculturas/ Uroculturas internados:
- Ampicilina
- Ciprofloxacino (somente uroculturas)
- Daptomicina
- Estreptomicina Sin
- Gentamicina Sin
- Linezolid
- Norfloxacino (somente uroculturas)
- Vancomicina
Obs: Realizar a identificação e antibiograma automatizados pelo Vitek MS e Vitek 2, respectivamente.
- A sensibilidade ao ciprofloxacino e ao levofloxacino pode ser inferida a partir da sensibilidade ao norfloxacino.
1- VRE:
Para confirmação de Enterococcus faecalis e E. faecium resistentes as Vancomicina, realizar a confirmação com
Ágar BHI incorporado 6 mcg/mL de Vancomicina ou Chromagar VRE (realizar suspensão 0,5 Mac Farland;
inocular 1-10 µL da suspensão no meio e incubar 35°C+/-1°C: o crescimento de > 01 colônia presumi a resistência
a vancomicina).
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE – NORMA BRCAST
- Clindamicina
- Ceftriaxona (testar Oxacilina - Seguir fluxograma abaixo)
- Eritromicina
- Levofloxacin
- Penicilina (testar Oxacilina - Seguir fluxograma abaixo)
- Vancomicina

CÓDIGO: PÁG.:
Triagem de resistências aos betalactâmicos – Brcast:
Obs: Realizar E-test Penicilina e E-test Ceftriaxona se a Oxacilina 1µg resistente.
Resistência indutível a Clindamicina
Realizar o D-test: Colocar o disco de Eritromicina 15µg e Clindamicina 2µg cerca de 12 a 20 mm de distância. Se
ocorrer o achatamento do halo da Clindamicina, o teste será positivo e ambos os antibióticos deverão ser
liberados como resistentes.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – STREPTOCOCCUS GRUPO VIRIDANS – NORMA

BRCAST
- Cefepime
- Ceftriaxona
- Clindamicina (não liberar para uroculturas)
- Penicilina
- Vancomicina

CÓDIGO: PÁG.:
Obs: Realizar o D-test (liberar somente Clindamicina).

A Penicilina pode ser utilizada como “triagem” para inferir a sensibilidade às cefalosporinas.
PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – STREPTOCOCCUS A, B, C,G – NORMA BRCAST
- Clindamicina (não liberar para uroculturas)

- Eritromicina (não liberar para uroculturas)
- Levofloxacino
- Penicilina
- Vancomicina
Obs: Realizar o D-test.

A Penicilina pode ser utilizada como “triagem” para inferir a sensibilidade às cefalosporinas.
Observações gerais:
Para os demais microrganismos (microrganismos isolados com menor frequência na rotina), consultar o manual do
BRCAST do ano vigente para avaliação da execução da técnica.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA POR E-TEST
O Etest é uma fita plástica, disponível comercialmente, impregnada por concentrações crescentes de
antimicrobiano . Este teste baseia-se na difusão de um gradiente antimicrobiano no ágar, para a determinação da
suscetibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado. Trata-se de uma técnica quantitativa para a
determinação de sensibilidade antimicrobiana. No Setor de Microbiologia Unimed BH temos disponível Etest de
Penicilina, Ceftriaxona e Ceftazidima Avibactam (vide as considerações descritas nas “Padronizações dos
Antibiogramas”, quando deverá ser utilizado os testes
Realização do Teste: A preparação do inóculo é feita da mesma maneira que no teste de disco-difusão. Com o
auxílio de um swab, o inóculo bacteriano (0,5 da escala McFarland) é semeado na superfície do Agar Mueller
Hinton. Após 15 minutos, em média, as fitas de Etest são dispensadas sobre o ágar, com o cuidado de acomodar
a fita com a face que contém o antimicrobiano voltado para a superfície do ágar. Pressione a fita no Agar para
evitar a formação de bolhas. Uma vez aplicada no Agar, a posição da fita não pode ser modificada.
Interpretação dos resultados: Após a incubação realizar a leitura da CIM no local onde a elipse de inibição
encontra-se com o início do crescimento bacteriano. Quando houver crescimento ao longo da fita, por exemplo,
nenhuma inibição elíptica é vista, a CIM reportada como > que o máximo valor da escala. Quando a inibição
elíptica está abaixo da fita, por exemplo, a zona de inibição não intersecciona com a fita, a CIM deve ser reportado
com o < valor que o mínimo valor da escala. Os critérios para interpretação da CIM são estabelecidos pelo Brcast.

CÓDIGO: PÁG.:
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA DE POLIMIXINA B – MICRODILUIÇÃO
O Policimbac é um sistema de microdiluição destinado à determinação da Concentração Inibitória Mínima de

Polimixina B para Bastonetes Gram Negativos multirresistentes. Ele será utilizado somente quando houver
resistência à multiplas categorias de antimicrobianos, incluindo carbapenêmicos e/ou quando solicitado pelo
médico.
Procedimento passo à passo:
- Retirar o kit da geladeira para atingir temperatura ambiente - cerca de 10 minutos antes do início do preparo.
- Remover a microplaca da embalagem plástica e reservá-la.
- Preparar a suspenção bacteriana em água estéril ou solução fisiológica à 0,5 do padrão de Mac Farland - Tubo
1.
- À partir do Tubo 1, fazer uma diluição de 1:100 (pipetar 50 mcL do Tubo 1 em 4950 mcL de àgua estéril ou
solução fisológica) - Tubo 2.
- À partir do Tubo 2, fazer uma diluição 1:10 (pipetar 500 mcL do Tubo 1 em 4500 mcL de àgua estéril ou solução
fisológica) - Tubo 3.
- Com auxílio de uma micropipeta, transferir 100 mcL da suspensão do Tubo para as cavidades da microplaca,
iniciando pelo controle.
- Após terminado preenchimento de todas as cavidades, recoloque a microplaca na embalagem plástica e incube
por 24h, À 35oC +/-1.
- Proceder a leitura observando a turvação do meio;a Concentração Mínima Inibitória será a primeira concentração
(cavidade) onde não houve a turvação do meio. O resultado deverá ser liberado em ug/mL.
Obs: Caso houver dificuldade para visualização da turvação, adicionar 1 gta da solução reveladora em cada
cavidade e incubar por 20 a 60 minutos. Após este período, a cavidade onde houver crescimento apresentará
coloração avermelhada.
ENVIO DE CEPAS PARA FUNED
Os isolados de Enterobactérias suspeitos de produção de carbapenemase - àqueles que apresentam diminuição

da sensibilidade aos carbapenêmicos, de acordo com a padronização BrCAST - são repetidos e confirmados
dentro do setor de microbiologia de forma automatizada e manual antes de serem liberados.
Mensalmente, o setor de microbiologia encaminhará uma amostragem (10 isolados bacterianos - Enterobactérias,
se aplicável) para FUNED para verificação da compatibilidade dos resultados dos testes fenotípicos das cepas que
foram realizadas mCIm e eCIM e/ou encaminhará as cepas diretamente à FUNED quando não for possível a
realização do m-CIM e e-CIM.

CÓDIGO: PÁG.:
Cepas de Pseudomonas aeruginosa que apresentarem resistência à ambos carbapenêmicos testados, deverão
ser submetidas ao teste de m-CIM e caso resultado for positivo, o isolado deverá ser encaminhado para FUNED.
Para o cadastro do sistema GAL/ FUNED, o setor de microbiologia solicita os dados do paciente para o NSP, onde
fica responsável por enviar as informações necessárias para o laboratório via e-mail, onde o laboratório é
responsável pelo preenchimento dos dados para encaminhamento do envio da cepa ao laboratório da FUNED, o
qual procederá com a análise.
A microbiologia preenche os dados solicitados no programa da FUNED (GAL) conforme descrito P.O.–
GERENCIAMENTO DE LABORATÓRIO DE APOIO. Após a conclusão do exame o setor de microbiologia
encaminha o resultado por e-mail para o NSP. O setor de microbiologia também fica com a cópia do resultado
arquivado.
OBS: As cepas que apresentarem resultados de m-CIM e e-CIM indeterminados e/ou duvidosos serão
encaminhadas para FUNED para realização da “Detecção de gentes de resistência” (Biologia Molecular).
*RESISTÊNCIAS INTRÍSECAS:

CÓDIGO: PÁG.:
4.4. INTERFERENTES/FONTES DE VARIABILIDADE:
Antibiograma:
Colônias não puras (não isoladas).
Amostras com prazo máximo de estabilidade ultrapassada.
Meio de Cultura e discos de antibióticos:

Armazenamento incorreto.
Transporte inadequado.
Contaminação do meio de cultura.
4.6. CONTROLE DE QUALIDADE:
4.6.1. CONTROLE INTERNO:

Vide procedimento: Controle de Qualidade em Microbiologia.
4.7. CRITÉRIOS PARA LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS:
Aprovação do controle interno.

Histórico e dados clínicos do paciente.
Uso de medicamentos.
Cumprimento das instruções de coleta.
Sexo e idade do paciente.
Resultados anteriores.
4.8. VALORES CRÍTICOS:

Consultar procedimento Comunicação de Resultados Críticos.
4.9. INTERPRETAÇÃO CLÍNICA:
Para realizar os testes de sensibilidade aos antimicrobianos é necessário um isolado bacteriano viável de cultura
recente a ser testada e um grupo de antimicrobianos mais indicado de acordo com o tipo de bactéria e o material
clínico do seu isolamento.
O teste de Sensibilidade Microbiana é uma importante ferramenta para orientar na escolha da terapia
antimicrobiana mais adequada, obtendo através desta uma diretriz para o tratamento eficaz.

CÓDIGO: PÁG.:
Algumas bactérias possuem mecanismos específicos de resistência que as caracteriza, o que auxilia, algumas
vezes, até na sua identificação. Existem situações em que devemos ter cuidado no momento de liberação do
resultado e são refletidas, na grande maioria das vezes, devido à ineficiência in vivo do agente antimicrobiano em
atuar sobre a bactéria, ou seja, clinicamente, esse agente não é eficaz contra aquela bactéria, mesmo ela
apresentando resultado de sensibilidade no teste in vitro.
O Setor de Microbiologia – Laboratório dos Serviços Próprios Unimed BH utiliza os procedimentos descritos na
norma do BRCAST do ano vigente para execução e interpretação do antibiograma.
4.10. VALORES DE REFERÊNCIA:
Vide Manual do Brcast, ano vigente.
5. REFERÊNCIAS
Lima, A.O. Métodos de laboratório aplicados à clínica. 7ª ed, Guanabara Koogan, 1992.
Caio Marcio F. Mendes - Carmem, Cassia Maria Zoccoli, Sumiko Ikuna Sinto. Microbiologia Dinâmica - 156
perguntas e respostas 2005.
Oplustil, Carmen Paz; Zoccoli, Cássia Maria; Tobouti, Nina Reiko; Sinto, Sumiko Ikura. Procedimentos Básicos em
Microbiologia Clínica. Sarvier 4ª ed., 2020.
Guia de vigilância epidemiológica - Ministério da Saúde - Fundação Nacional de Saúde.
Manual de Microbiologia Clinica para o controle de infecção relacionada à assistência à saúde. Módulo 6:
Detecção e identificação de bactérias de importância médica. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília.
Anvisa, 2013.
Manuais do Brcast, disponível em: brcast.org.br/documentos.
Manual do fabricante: Vitek 2 – Biomerieux.
6. REGISTRO
Registro do resultado no Sistema REAL.

Laudo liberado por profissional habilitado (Bioquímico ou Biomédico).
7. ANEXOS
Não se aplica.
8. GESTAO DE RISCOS
Conforme Matriz de Gestão de Riscos.
Identificação das Alterações desta Revisão – revisão 02
 21/02/19: acrescentado o tópico “Envio das cepas multirresistentes para FUNED”.

 07/12/20: alteração do item 4.3: alteração para norma Brcast.
 22/10/21: acréscimo dos teste de m-CIM e e-CIM; revisão da padronização dos antimicrobianos liberados; revisão da padronização do envio
de cepas para Funed.
 28/06/22: revisão do item 3; revisado a padronização do envio de cepas para Funed.
 02/08/22: Incluído Levofloxacino à padronização do antibiograma de Staphylococcus; excluído a testagem de Colistina por automação –
Cartão Vitek 2.

CÓDIGO: PÁG.:


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TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

1.1. FINALIDADE: Verificar a susceptibilidade bacteriana frente aos antimicrobianos.

1.2. SINONÍMIA: Antibiograma.

1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO:

Laboratórios de Microbiologia dos Serviços Próprios da Unimed BH.

3.1. PREPARO DO PACIENTE: Não aplicável.

3.2. MATERIAL BIOLÓGICO:

3.2.1 TIPO: Isolados bacterianos

4.1. EQUIPAMENTOS: Vitek 2 -Biomerieux/ Vitek MS – Biomerieux.

4.2. CALIBRAÇÃO: Não aplicável.

EMISSÃO: ANÁLISE CRÍTICA: APROVAÇÃO:

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

4.3. PROCEDIMENTO TÉCNICO:

ANTIBIOGRAMA: MÉTODO DE KIRBY BAUER OU DISCO DIFUSÃO

Procedimento passo a passo:

 Identificar as placas de Mueller Hinton com a etiqueta extraída do sistema REAL;

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

- Para a realização do antibiograma para Enterobactérias, Pseudomonas spp, Stenotrophomas maltophilia,

Leitura das placas de antibiograma:

 O crescimento bacteriano deve ser confluente e está uniformemente distribuído na placa.

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

o Para Enterobacteriaceae, ao testar ampicilina, ampicilina-sulbactam e amoxicilina-ácido clavulânico ignorar o

o Para Sulfametoxazol-Trimetoprim ou trimetoprim, pode aparecer um crescimento reduzido dentro do halo de

o Para Proteus spp., ignore o véu (swarming) e ler as bordas de inibição.

Interpretação dos resultados:

I – Sensível, aumentando exposição: Um microrganismo é categorizado como Sensível, aumentando exposição

R - Resistente: um microrganismo é categorizado como Resistente quando há alta probabilidade de falha

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

ANTIBIOGRAMA: MÉTODO AUTOMATIZADO - VITEK 2 COMPACT/ BIOMERIEUX:

O Vitek 2 monitora o crescimento bacteriano/fúngico na presença do antimicrobiano em pelo menos 3

PADRONIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA/ UNIMED BH – ENTEROBACTÉRIAS – NORMA BRCAST

*Antimicrobianos testados/ liberados – Uroculturas: Laboratórios e Pronto Atendimento Unimed BH:

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

* Antimicrobianos testados/ liberados - Uroculturas (internados)

* Antimicrobianos testados/ liberados - Secreções/ Hemoculturas:

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

- Se resistente à Ciprofloxacino, reportar todas as Fluoroquinolonas como resistentes; se sensível à

- Amoxacilina-Ac. Clavulânico: pontos de corte diferentes para ITU’s.

Detecção fenotípica de mecanismos de resistência – Enterobactérias:

1- ESBL (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Proteus mirabilis)

Segundo o Brcast, suspeita-se da presença de ESBL quando:

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Teste fenotípico para confirmação:

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

2- Beta Lactamase do tipo AMP C:

Suspeita-se da produção de AMP C pelas cepas do grupo CESP e demais quando:

- Resistência ou sensibilidade intermediária à Cefoxitina e Amoxacilina- Ac. Clavulânico;

Detecção de AMP C cromossômicas induzíveis (CESP e demais):

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

As cepas suspeitas da produção de carbapenamases apresentam o resultado resistente ao Ertapenem e/ou

Preparo dos discos:

Código do anexo: AN.GSG.GEPP.010

TÍTULO: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Resultado m-CIM e e-CIM positivos. Reportar: Presença de metalobetalactamase

Resultado m-CIM positivo e e-CIM negativo. Reportar: Presença de serina carbapenamase.

Resultado m-CIM negativo e e-CIM inválido: Reportar: Carbapenamase não detectada.