UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS

CURSO DE AGRONOMIA

Maria Eduarda Klepacki

Efeito de BAP (6-Benzilaminopurina) na multiplicação in vitro de Schomburgkia

crispa Lindley (Orchidaceae)

Curitibanos
2022
 Maria Eduarda Klepacki

Efeito de BAP (6-Benzilaminopurina) na multiplicação in vitro de Schomburgkia

crispa Lindley (Orchidaceae)

Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação

em Agronomia do Centro de Curitibanos da
Universidade Federal de Santa Catarina como
requisito parcial para a obtenção do Título de
Bacharel em Agronomia.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Poeta Fermino
Junior

Curitibanos
2022
 Maria Eduarda Klepacki

Efeito de BAP (6-Benzilaminopurina) na multiplicação in vitro de Schomburgkia

crispa Lindley (Orchidaceae)

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do

Título de Engenheiro Agrônomo, e aprovado em sua forma final pelo
Curso de Graduação em Agronomia

Curitibanos, 14 de julho de 2022.

_____________________________
Prof. Dr. Douglas Adams Weiler
Coordenador do curso
Banca examinadora

____________________________________
Prof. Dr. Paulo César Poeta Fermino Júnior
Orientador
Universidade Federal De Santa Catarina

__________________________________
Prof. Dr ª Elis Borcioni
Avaliadora

____________________________
Prof. Dr ª Adriana Terumi Itako
Avaliadora
“Só quando a verdade foi adquirida por seu
próprio pensamento, através dos esforços
de seu intelecto, ela se torna membro de seu
próprio corpo, e só essa verdade realmente
nos pertence.”
Arthur Schopenhauer
 AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus pela minha vida, por ter me dado forças nos meus
piores momentos ao longo dessa caminhada, e jamais ter me deixado desistir.
À minha família, Mãe, Tia, Vô, Tio Du e Pai, vocês são a razão de tudo. Obrigado por
terem me dado os maiores exemplos de caráter, honestidade e bom coração. Jamais
poderei retribuir tudo o que fizeram por mim, em especial a minha tia Edite e Mãe
Olanda, mas espero chegar o mais próximo de dar o que vocês merecem.
Ao meu namorado, Felipe André, por estar ao meu lado ao longo desses dois últimos
anos e ter me apoiado na realização deste trabalho, e nos demais desafios da vida, te
amo!
Aos meus amigos, Tainara, Eduardo e Sabrina, companheiros de longa data, obrigada
por estarem ao meu lado nos perrengues e sempre ter um ombro amigo disponível,
desejo a vocês sucesso!
Aos demais amigos que tive o prazer de conhecer ao longo da faculdade e compartilhar
um pouco da vida, obrigada.
Ao meu orientador, professor Paulo, por todo o conhecimento adquirido ao longo deste
projeto, muito obrigada.
Aos demais professores que contribuíram para minha formação acadêmica, meu muito
obrigada.
 RESUMO

A micropropagação in vitro de orquídeas possui um papel importante na preservação de

várias espécies de orquídeas, que no ambiente natural devido a sua importância
ornamental sofrem exploração podendo levar algumas espécies à extinção. Esse método
é o mais eficaz, levando em conta que a porcentagem de germinação de sementes é
baixa, devido ao tamanho minúsculo das sementes. A micropropagação viabiliza a
produção de mudas de excelente qualidade sanitária em larga escala. Diversas espécies
de orquídeas nativas já entraram em extinção e outras estão presentes na lista de
espécies ameaçadas, incluindo a espécie Schomburgkia crispa Lindley, uma orquídea
epífita, que pode ser encontrada nas matas secas do Cerrado e em florestas de galeria. O
objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de BAP (6-Benzilaminopurina) na
multiplicação e conservação in vitro de Schomburgkia crispa Lindley a partir de
protocormos. Foram testadas as concentrações de 0; 3; 6; 9; 12 e 15 µM de BAP no
meio MS, suplementado com 30 g.L-1 de sacarose e 2 g.L-1 de Phytagel
Sigma-Aldrich®. Foram realizadas as avaliações com 90 dias de cultivo in vitro,
consistindo na porcentagem de sobrevivência, número de brotos regenerados por
explante e altura dos brotos. O efeito da dose de 9 µM de BAP apresentou os melhores
resultados para o protocolo de micropropagação. A micropropagação com a utilização
de BAP a partir de protocormos desenvolvidos in vitro é um protocolo viável para S.
crispa.

Palavras-chave: Cultura de tecidos. Micropropagação. Orchidaceae. Regulador de

crescimento.
 ABSTRACT

The in vitro micropropagation of orchids has an important role in the preservation of

several species of orchids, which in the natural environment, due to their ornamental
importance, suffer exploitation and may lead some species to extinction. This method is
the most effective, taking into account that the percentage of seed germination is low
due to the tiny size of the seeds. Micropropagation enables the production of seedlings
of excellent sanitary quality on a large scale. Several species of native orchids have
already become extinct and others are on the endangered species list, including the
species Schomburgkia crispa Lindley, an epiphytic orchid, which can be found in the
dry forests of the Cerrado and in gallery forests. The objective of this work was to
evaluate the effect of BAP (6-Benzylaminopurine) on the in vitro multiplication of
Schomburgkia crispa Lindley from protocorms. Concentrations of 0; 3; 6; 9; 12 and 15
µM BAP in MS medium, supplemented with 30 g.L-1 sucrose and 2 g.L-1 Phytagel
Sigma-Aldrich®. Evaluations were performed after 90 days of in vitro culture,
consisting of percentage of survival, number of shoots regenerated per explant and
shoot height. The effect of the 9 µM dose of BAP showed the best results for the
micropropagation protocol. Micropropagation using BAP from protocorms developed in
vitro is a viable protocol for S. crispa.

Keywords: Growth Regulator. Micropropagation. Orchidaceae. Tissues Culture.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Schomburgkia crispa Lindley..........................................................................12

Figura 2- Schomburgkia crispa Lindley..........................................................................17
Figura 3- Schomburgkia crispa Lindley..........................................................................18
Figura 4- Protocormos de Schomburgkia crispa Lindley formados após 4 meses de
cultivo in vitro (A); Detalhe dos protocormos (B); Protocormo individualizado
(C)....................................................................................................................................22
Figura 5- Microbotos de S. crispa regenerados in vitro nos experimentos de
morfogênese em meio de cultura de enraizamento.........................................................23
Figura 6- Microbotos de S. crispa em aclimatização em viveiro.................................... 24
Figura 7- Gráfico da porcentagem de sobrevivência/oxidação dos brotos de S. crispa na
multiplicação in vitro para cada
tratamento........................................................................................................................25
Figura 8- Gráfico da média do número de brotos adventícios regenerados na
multiplicação in vitro por protocormo para cada
tratamento........................................................................................................................26
Figura 9- Gráfico da média da altura em cm dos brotos de S. crispa regenerados na
multiplicação in vitro.......................................................................................................27
Figura 10- Figura 8 - Broto de S. crispa regenerado in vitro no tratamento 1 (0 µM de
BAP) (A); Broto de S. crispa regenerado in vitro no tratamento 2 (3 µM de BAP) (B);
Broto de S. crispa regenerado in vitro no tratamento 3 (6 µM de BAP) (C); Broto de S.
crispa regenerado in vitro no tratamento 4 (6 µM de BAP) (D); Broto de S. crispa
regenerado in vitro no tratamento 5 (12 µM de BAP) (E); Broto de S. crispa regenerado
in vitro no tratamento 6 (15 µM de BAP) (F);.................................................................28
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................12
1.1 JUSTIFICATIVA...............................................................................................13
1.2 OBJETIVOS......................................................................................................13
1.2.1 Objetivo Geral................................................................................................. 13
1.2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................13
2 REFERENCIAL TEÓRICO.......................................................................... 14
2.1 A FAMÍLA ORCHIDACEAE ...........................................................................14
2.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA FAMÍLIA ORCHIDACEAE .................14
2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS............................................................ 15
2.4 MICROPROPAGAÇÃO DE ORQUÍDEAS.....................................................15
2.5 Schomburgkia crispa Lindley............................................................................16
2.6 MEIO DE CULTURA.......................................................................................18
2.7 BAP (6-Benzilaminopurina) NO MEIO DE CULTURA PARA
ORQUÍDEAS................................................................................................... 19

3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 21
3.1 MATERIAL DE ESTUDO................................................................................21
3.2 MORFOGÊNESE IN VITRO............................................................................ 22
3.2.1 Efeito do regulador de crescimento BAP (6-Benzilaminopurina)..............22
3.3 ENRAIZAMENTO E ACLIMATIZAÇÃO...................................................... 23
3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS............................................................................24
4 RESULTADO E DISCUSSÃO....................................................................... 25
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................................29
6 CONCLUSÃO..................................................................................................30
REFERÊNCIAS.............................................................................................................31
1 INTRODUÇÃO

As orquídeas têm um potencial ornamental muito grande no mundo todo,

devido a exuberância de suas flores, possuindo diversas cores, tamanhos e formatos. A
família Orchidaceae é considerada a maior do grupo das angiospermas, abrangendo
cerca de 8%. Apresenta mais de 800 gêneros que se dividem em aproximadamente
25.000 espécies (TAKAHARA, 2014).
Em sua maioria são plantas epífitas, algumas podem ser espécies rupícolas,
terrícolas, palustres ou mico-heterotróficas. A morfologia das orquídeas consiste num
caule que foi modificado em um pseudobulbo, cuja função é o armazenamento de água
em períodos de escassez. As folhas podem ser coriáceas ou membranáceas. A principal
característica das raízes de epífitas é a presença de velame, que consiste numa estrutura
formada por células contendo celulose e lignina, que possui função de absorção e
retenção da água. Possui flores com simetria bilateral, trímeras (três sépalas e três
pétalas, sendo que uma delas é diferenciada em labelo) e normalmente são
hermafroditas. A estrutura reprodutiva é denominada coluna, e consiste na fusão entre
os órgãos masculinos (estames) e os órgão femininos (carpelos), apresentando antera e
estigma na mesma flor. Existe uma membrana denominada rostelo entre antera e
estigma que tem a função de evitar a autopolinização (JURAS, 2015).
As espécies nativas brasileiras há muito tempo vêm sofrendo com as atividades
extrativistas que visam seu comércio, e em razão disso muitas dessas espécies estão em
risco de extinção, dentre elas Schomburgkia crispa Lindley (TAKAHARA, 2014).
A espécie Schomburgkia crispa é uma orquídea epífita, que pode ser
encontrada em matas secas do Cerrado Brasileiro e também em florestas de galeria
(BARROS et al., 2018). Além de possuírem potencial ornamental, as orquídeas nativas
brasileiras também podem possuir propriedades medicinais que ainda são pouco
conhecidas. Schomburgkia crispa Lindley. possui um composto, denominado ácido
crispóico, o qual apresenta potencial anticarcinogênico (BELLOTO et al., 2017).

11
 Figura 1- Schomburgkia crispa Lindley

Fonte: Rosa, 2015.

O cultivo in vitro de orquídeas se tornou a melhor alternativa de propagação

levando em conta que, naturalmente, a porcentagem de germinação de sementes é baixa
e a propagação vegetativa é lenta. Contudo, plântulas cultivadas em meios que são
completamente assépticos apresentam sobrevivência baixa quando transferidas para seu
habitat de ocorrência natural (WU et al., 2011; AEWSAKUL et al. 2013).
Os meios de cultivo utilizados na germinação e desenvolvimento de orquídeas
são compostos por macro e micronutrientes, vitaminas e sais mineraisMURASHIGE ;
SKOOG, 1962). Estes meios podem ser modificados, com a adição de reguladores de
crescimento, visando o ótimo desenvolvimento dos explantes. Os reguladores mais
utilizados para orquídeas são as citocininas como BAP (6-benzilaminopurina), e auxinas
como TDZ (Thidiazuron), AIB (ácido indol butírico), entre outras (TAKAHARA,
2014).
Diversos estudos vêm sendo conduzidos com objetivo de estabelecer um
protocolo de propagação eficiente para diferentes espécies de orquídeas, a fim da
conservação destas espécies, visto que muitas delas correm risco de extinção. Estudos
de micropropagação de S. crispa ainda são incipientes. Sendo assim, o presente trabalho
tem como objetivo estabelecer um protocolo de multiplicação de brotos adventícios de

12
Schomburgkia crispa L. e verificar a eficiência da citocinina sintética com o uso de
BAP (6-Benzilaminopurina).

1.1 JUSTIFICATIVA

A micropropagação in vitro de orquídeas possui um papel importante na

preservação de várias espécies de orquídeas, que no ambiente natural devido a sua
importância ornamental sofrem exploração podendo levar algumas espécies à extinção.
Este trabalho visa fornecer um protocolo de indução de brotos de Schomburgkia crispa
Lindley, possibilitando a preservação desta espécie visto que a mesma já consta na lista
de espécies em extinção, e também, a produção em larga escala, visto que para esta
espécie há poucos estudos que mostrem protocolos eficientes na propagação. Neste caso
foi analisado o efeito de diferentes concentrações de BAP (6-Benzilaminopurina) na
multiplicação in vitro.

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo Geral

Estabelecer um protocolo de micropropagação e conservação in vitro através
da indução de brotos adventícios com o uso do regulador de crescimento BAP
(6-Benzilaminopurina) de Schomburgkia crispa Lindley.

1.2.2 Objetivos Específicos

Avaliar o efeito de diferentes concentrações de BAP

(6-Benzilaminopurina) no crescimento e desenvolvimento in vitro de S. crispa;

Induzir o desenvolvimento dos brotos adventícios de S. crispa a partir de

protocormos germinados in vitro;

Enraizar e aclimatizar as plantas micropropagadas.

13
2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 A FAMÍLA ORCHIDACEAE

Orchidaceae é a maior família em número de plantas vasculares, sendo

formada por 736 gêneros e aproximadamente 25.000 espécies (BARROS et al., 2018).
Esta família é mais abundante e diversificada em regiões tropicais e subtropicais do
mundo, e o Brasil é o maior detentor de diversidades de orquídeas do mundo, possuindo
quase 10% do total de espécies da família, sendo encontradas no país 2.499 espécies e
221 gêneros de Orchidaceae, sendo que 1.636 delas endêmicas (BFG, 2018).
Dentre as características que definem as orquídeas podemos destacar a sua
morfologia, possuindo flores trímeras e raízes com velame; uma pétala que foi
modificada em labelo; caule separado em rizoma e cauloma; ovário ínfero unilocular; a
antera é opercula e o pólen é fusionado em polínias; o cauloma é intumescido em
pseudobulbo; o filete e estilete possuem estrutura colunar, e as sementes possuem
tamanho microscópico (BARROS et al., 2018).
Esta família destaca-se por incluir espécies que possuem alto valor comercial,
não só pelo aspecto ornamental, mas também por possuir raros táxons, o que as tornam
procuradas por colecionadores e deixando-as suscetíveis à exploração em seus
ambientes de ocorrência natural (GALDIANO et al., 2013; KULL et al., 2016).

2.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA FAMÍLIA ORCHIDACEAE

O comércio mundial de orquídeas movimenta em média cerca de US$ 60

bilhões por ano devido ao seu valor ornamental (MARTSYNOVSKA, 2011; SUZUKI,
2014). Em 2020 o Brasil importou mais de USS $20 milhões em flores, sendo as mudas
de orquídeas o principal produto de importação do setor, que correspondeu a 98% do
valor, de acordo com o Ministério da Economia.
A família Orchidaceae abrange flores que tem usos na perfumaria, culinária,
mudas, flores, e ainda algumas possuem propriedades medicinais, como é o caso de S.
crispa.
Em janeiro de 2017 a espécie Schomburgkia crispa, entrou na lista de espécies
vulneráveis à extinção, segundo o apêndice II da Convenção sobre Comércio
Internacional das Espécies da Flora e Fauna Selvagens em Perigo de Extinção (CITES,

14
2017). Sendo assim a propagação in vitro se torna uma alternativa para conservação
desta e muitas outras espécies de orquídeas.

2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

A cultura de tecidos vegetais pode ser considerada o principal meio para

obtenção de plantas através da indução de explantes. Pelos processos de embriogênese,
organogênese e morfogênese, temos a diferenciação celular que resulta na formação dos
tecidos vegetais (FLOH et al., 2015).
A cultura de tecidos é uma tecnologia eficiente na recuperação e na propagação
de plantas livres de agentes causadores de doenças, uniformes e com alta qualidade
fisiológica, na propagação de plantas comerciais, em larga escala, com baixo custo e
pouco tempo envolvido no processo. Ainda pode ser utilizada no melhoramento
genético, na engenharia genética, na produção de compostos secundários in vitro e na
conservação do germoplasma (JUNGHANS; ALBERTO; OLIVEIRA, 2013).
Essa técnica é baseada na capacidade das células vegetais, sejam estas de
qualquer tecido, se tornarem indiferenciadas e se multiplicarem dando origem a novas
células iguais, ou diferentes e se tornarem outros tecidos através de novas vias
metabólicas. Este processo irá depender da disponibilidade das condições ideais para o
desenvolvimento dos explantes, que por sua vez dependerão do meio de cultivo e
aditivos (SOUZA et al.,2018).
Diversos estudos são conduzidos na tentativa de desenvolver melhores e mais
eficientes protocolos de micropropagação para diversas espécies, no entanto, este
processo pode ser considerado mais custoso levando em conta o valor de mudas, mas
visto que garante plantas de alta qualidade e livres de patógenos, é a técnica mais
utilizada e eficiente na obtenção de mudas de qualidade, em larga escala e com um
tempo relativamente curto.

2.4 MICROPROPAGAÇÃO DE ORQUÍDEAS

Orquídeas sofrem predação na natureza devido a beleza de suas flores e a

raridade de algumas espécies, sendo a assim a multiplicação rápida e eficiente de
orquídeas, promove a preservação das espécies ameaçadas de extinção, e a produção em

15
larga escala através de técnicas de cultivo in vitro (CARDOSO, 2014; SORGATO et al.,
2014).
A porcentagem de germinação de sementes na natureza é muito baixa, e isso
faz com que precisem de associações com fungos micorrízicos para auxiliar na
absorção, principalmente, de carbono, e só assim possibilitando a germinação. Mesmo
no cultivo in vitro o uso de sementes não é recomendado, devido ao potencial
heterozigótico da semente, e sua pouquíssima quantidade de endosperma. Sendo assim,
as técnicas de micropropagação vegetativa são fundamentais para uma rápida e eficiente
propagação das espécies de interesse (ANDRIOLLI, 2019).
Em relação a outras espécies de orquídeas, diversos protocolos se mostram
eficientes na propagação, como observado por Villa et al., (2014), híbridos de orquídeas
(Brassocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow) cultivados em meio Knudson,
suplementado com vitaminas de meio MS (MURASHIGE ; SKOOG, 1962), BAP
(benzilaminopurina) e carvão ativado, obtiveram uma boa resposta morfogênica.
No crescimento in vitro de Cattleya harrisoniana Bateman ex Lindl. var. alba
Barb.Rodr, em meio MS (MURASHIGE ; SKOOG, 1962) acrescido de carvão ativado,
tiamina, inositol e sacarose, Schneiders et al., (2012) concluiu que esta composição se
mostrou eficiente, principalmente para o crescimento da parte aérea das plântulas.
Ainda há poucos trabalhos desenvolvidos para a propagação de orquídeas do
Cerrado brasileiro, como S. Crispa, é necessário o estudo de protocolos eficientes na
germinação, multiplicação e conservação para estas espécies (CARNEIRO, 2014).
Mudolon et al., (2018) testou fontes de luz na germinação assimbiótica e
estabelecimento inicial de S. Crispa, e obteve resultados satisfatórios utilizando a luz
natural e variações de leds brancos e amarelos, concluindo que a luz não é um fator
limitante para a germinação de sementes.

2.5 Schomburgkia crispa Lindley

A espécie Schomburgkia crispa Lindley se trata de uma orquídea epífita que

pode ser encontrada desde florestas de galeria até nas condições das matas secas do
Cerrado Brasileiro (OSTETTO, 2015).
Sua morfologia consiste em pseudobulbos bifoliados medindo
aproximadamente 8 a 10 cm de comprimento, folhas de 24 a 26 cm de comprimento e

16
largura de 5 a 7 cm. As inflorescências possuem de 95 a 110 cm, com flores possuindo
pétalas e sépalas castanhas e margens amarelas (BARROS et al., 2018).
Além de Schomburgkia crispa Lindley originar belas flores que fizeram com
que sua espécie sofresse com a exploração e entrasse para a lista de espécies ameaçadas
de extinção, mais recentemente a descoberta de propriedades medicinais e
farmacológicas fez com que a demanda de trabalhos a fim de preservar esta espécie
aumentasse. Foi relatado o isolamento de um produto natural, denominado ácido
crispóico que pode combater células cancerígenas (BELLOTO et al., 2017).

Figura 2 - Schomburgkia crispa Lindley

Fonte: Rosa, 2015.

17
 Figura 3 - Schomburgkia crispa Lindley

Fonte: Rosa, 2015.

2.6 MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura utilizados no cultivo in vitro tem como principais funções

o suporte físico e a disponibilização de nutrientes para a sobrevivência do explante. A
composição do meio depende da espécie a ser utilizada e do estágio de cultura. Para
orquídeas os meios mais utilizados são o Knudson e o Murashige e Skoog
(CARVALHO et. al., 2011). O Meio MS (MURASHIGE ; SKOOG, 1962) é o que mais
demonstra bons resultados para o cultivo de orquídeas e na obtenção de brotos (ROSA
et al., 2015).
Os meios de cultura que são utilizados no cultivo in vitro de plantas, contêm
substâncias essenciais para o desenvolvimento destas, como macro e micronutrientes,
carboidratos, reguladores de crescimento, entre outras. Cada espécie vegetal possui sua
demanda de nutrientes e a composição do meio de cultura deve fornecer para o
necessário para o seu desenvolvimento (FERREIRA et al., 1998).

18
 Possuem como principais constituintes: a água, que está presente em maior
quantidade no meio de cultura e deve ser filtrada e destilada para não conter impurezas;
os nutrientes que fazem parte da nutrição mineral, como o Nitrogênio, Fósforo,
Potássio, Enxofre, Cálcio, Magnésio, Ferro, Boro, Molibdênio, Cobre, Cloro, Zinco,
Manganês e Cobalto; os constituintes orgânicos como o carboidrato, que é a principal
fonte de energia (esqueleto de carbono), aminoácidos e amidas, vitaminas que são
essenciais para o metabolismo celular, tiamina é a representante de maior importância, e
outras como vitamina A, B², C; reguladores do crescimento vegetal, pois a
organogênese é controlada por hormônios, auxina, citocinina, ácido giberélico e
abscísico são os principais deles; O pH, que de estar na faixa entre 5 e 6, variando para
meios líquidos e meios gelificados, normalmente são utilizados HCl ou NaOH para
fazer esse ajuste; e por último, os materiais de suporte, como o ágar, as pontes de papéis
para casos onde não podem ser utilizados meios líquidos ou geleificantes, e o carvão
ativado que é uma substância utilizada para eliminar toxinas e evitar a oxidação
(GUERRA et al., 2016).
Aditivos orgânicos podem ser utilizados para obter um bom crescimento, alguns
exemplos de aditivos orgânicos utilizados são a água de coco, suco de tomate, extrato de
banana, entre outros (ZAHARA et al., 2017).

2.7 BAP (6-Benzilaminopurina) NO MEIO DE CULTURA PARA ORQUÍDEAS

Os reguladores de crescimento são utilizados no meio de cultivo para suprir as

deficiências hormonais dos próprios explantes. Os mais utilizados são as auxinas e
citocininas, visto que as auxinas promovem o desenvolvimento de nós, raízes
adventícias e formação de calos, e as citocininas por sua vez são responsáveis pela
citocinese durante o processo de divisão celular e promovem o crescimento da parte
aérea dos explantes. Esses dois reguladores em combinação são muito utilizados para
diversas espécies (TAKAHARA, 2014).
Para orquídeas, como observado por Peréz et al., (2022) na micropropagação de
Catasetum integerrimum Hook (Orchidaceae) através da germinação de sementes e
regeneração direta de brotos de pseudobulbos e raízes, a combinação de 1,0 mg L-1 de
BAP (6-Benzilaminopurina) com 1,0 mg L-1 de AIA (ácido indol-3-acético) resultou no
melhor método para produzir plântulas inteiras de C.integerrimum a partir de
pseudobulbos como explantes por meio da organogênese direta. Já os explantes de

19
raízes são funcionais, mas a resposta é muito baixa e, em muitos casos, a indução de
brotos não é alcançada.
Para S. crispa, Takahara (2014) observou que no meio de cultivo WPM (Wood
Plant Medium) de Loyd e McCown (1980) suplementado com 5,0 mg L-1 de BAP teve
efeito significativo na multiplicação a partir de segmentos nodais. Já para a
multiplicação a partir de calos, o melhor efeito foi do meio MS (MURASHIGE ;
SKOOG, 1962) suplementado com 0,3 mg L-1 de AIA combinado com 0,3 mg L-1
TDZ.

20
3 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da

Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Curitibanos, no período de 09 de
dezembro de 2021 até até 09 de junho de 2022, e no viveiro de plantas da Universidade
Federal de Santa Catarina, Campus Curitibanos, no período de 09 de junho de 2022 até
09 de julho de 2022.

3.1 MATERIAL DE ESTUDO

Os protocormos de Schomburgkia crispa Lindley utilizados são provenientes de

sementes oriundas de doação da biofábrica “Cultivar Orquídeas in vitro”, localizada no
município de Arealva, São Paulo. Os frutos maduros de Schomburgkia crispa Lindley
foram enviados via Correio para a cidade de Curitibanos - SC, onde fica localizada a
Universidade. Após 10 dias de armazenamento em geladeira as sementes foram
removidas manualmente dos frutos maduros desinfectados superficialmente. Para tanto,
inicialmente os frutos foram lavados em água corrente com detergente, em seguida
submersos por 2 minutos em etanol 70%, depois imersos em solução de hipoclorito de
sódio (2,5% v/v) por 30 minutos, e finalmente lavados em água destilada esterilizada
por três vezes. Em câmara de fluxo laminar, com auxílio de bisturi, os frutos foram
excisados e as sementes removidas com pinça histológica para inoculação em meio de
cultura para germinação in vitro. O meio de cultura utilizado para a germinação in vitro
foi composto por sais e vitaminas de MS (MURASHIGE ; SKOOG, 1962), isento de
regulador de crescimento vegetal, suplementado com 30 g.L-1 de sacarose e 6 g.L-1 de
ágar Vetec®. Após quatro meses de cultivo in vitro, os protocormos formados no
estágio 5 de desenvolvimento (alongamento das folhas), de acordo com a classificação
proposta por Stewart e Zettler (2002) foram individualizadas (Figura 2) e inseridas no
experimento descrito a seguir.

21
 Figura 4- Protocormos de Schomburgkia crispa Lindley formados após 4 meses de
cultivo in vitro (A); Detalhe dos protocormos (B); Protocormo individualizado (C)

Fonte: Autor, 2021 .

3.2 MORFOGÊNESE IN VITRO

3.2.1 Efeito do regulador de crescimento BAP (6-Benzilaminopurina)

Protocormos de S. crispa com altura de 1 cm germinados in vitro foram

individualizados em câmara de fluxo laminar e inoculados em frascos de vidro com
capacidade de 250 mL e tampas plásticas convencionais, contendo 30 mL de meio de
cultura composto por sais e vitaminas de MS (MURASHIGE ; SKOOG, 1962),
suplementado com 30 g.L-1 de sacarose e 2 g.L-1 de Phytagel Sigma-Aldrich®, e
diferentes concentrações de BAP (6-Benzilaminopurina) (0, 3, 6, 9, 12 e 15 μM). Os
meios de cultura tiveram seu pH ajustado para 5,8 com 1 M de KOH e HCl antes da
autoclavagem a 121 °C por 20 min a 1,06 kg cm-2. As culturas foram incubadas em sala

22
de crescimento a 25 ±2 °C, 16 h de fotoperíodo, com lâmpadas fluorescentes brancas de
densidade de fluxo de fótons de 50 μmol m-2 s-1.
Após 90 dias foram feitas as análises morfológicas, consistindo na
determinação do percentual de sobrevivência/oxidação, número de brotos regenerados
por explante e altura dos microbrotos regenerados.

3.3 ENRAIZAMENTO E ACLIMATIZAÇÃO

Microbotos de S. crispa regenerados in vitro nos experimentos de morfogênese

descritos anteriormente foram individualizados e transferidos para meio de cultura de
enraizamento, composto pela metade da concentração salina de MS (MURASHIGE ;
SKOOG, 1962), suplementado com 15 g.L-1 de sacarose e 2 g.L-1 de Phytagel
Sigma-Aldrich® e 0,2 μM de AIB (Figura 2).

Figura 5- Microbotos de S. crispa regenerados in vitro nos experimentos de

morfogênese em meio de cultura de enraizamento

Fonte: Autor, 2021.

Após 90 dias em meio de enraizamento, no dia 09 de junho de 2022, os brotos

com aproximadamente 2 cm de altura, foram removidos do meio de cultura, lavados em
água corrente e transferidos para vasos plásticos com capacidade para 250 mL,
contendo casca de pinus como substrato (Figura 3) em viveiro com telado de sombrite
preto (50% de corte de luz) e irrigação automática por nebulização, duas vezes por dia
para a aclimatização das plantas micropropagadas.

23
 Figura 6- Microbotos de S. crispa em aclimatização em viveiro

Fonte: Autor, 2022.

3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os experimentos de morfogênese in vitro foram organizados em delineamento

inteiramente casualizado, com seis repetições para cada tratamento, sendo cada unidade
amostral composta por um frasco contendo 10 protocormos ou microbrotos. Os
resultados de cada parâmetro avaliado foram submetidos à análise da variância
(ANOVA) e de regressão com aplicação do teste F e as médias, quando significativas
estatisticamente, comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, usando o
software estatístico SISVAR 5.6. As variáveis discretas, provenientes de contagem
(número), foram transformadas na √(x+0,5), onde x é o valor obtido de cada variável.

24
4 RESULTADO E DISCUSSÃO

A regeneração dos brotos ocorreu em todos os tratamentos, porém os melhores

resultados obtidos, foram no tratamento 5 (12 μM de BAP), onde houve a regeneração
de 12 brotos representando 20% de sobrevivência e houve a oxidação e 48 brotos,
representando 80%; Seguido pelo tratamento 6 (15µM de BAP) onde 9 brotos se
regeneraram, representando 15% de sobrevivência e 51 brotos oxidados representando
85%; Em seguida veio o tratamento 4 (9 μM de BAP), com 6 brotos regenerados,
representando 10% de sobrevivência e 90 brotos oxidaram representando 90%. Os
piores resultados obtidos foram os tratamentos 2 (3 μM de BAP), 1 (0 µM de BAP) e 3
(6 µM de BAP) com apenas 3, 2 e 1 broto regenerados representando 6,66%, 3,33% e
1,66% de sobrevivência respectivamente, e a oxidação de 57, 58 e 59 brotos
respectivamente, representando 93,33%, 96,66% e 98,33% como podemos observar na
figura 7.

Figura 7 - Gráfico da porcentagem de sobrevivência/oxidação dos brotos de S. crispa na

multiplicação in vitro para cada tratamento.

Fonte: Autor, 2022.

25
 Para o número de brotos por explante, os tratamentos 1 (0 μM de BAP) e 2 (3
μM de BAP) apresentaram as menores médias. Os demais tratamentos não diferiram
estatisticamente entre si através do Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Figura 8 - Gráfico da média do número de brotos adventícios regenerados na

multiplicação in vitro por protocormo para cada tratamento

Fonte: Autor, 2022.

Para a altura dos brotos, os tratamentos 1 (0 BAP), 2 (3 μM de BAP), 3 (6 μM

de BAP), 4 (9 μM de BAP) e 5 (12 μM de BAP), apresentaram-se estatisticamente
iguais, apenas o tratamento 6 (15 μM de BAP) diferiu-se, apresentando a menor média.

26
Figura 9 - Gráfico da média da altura em cm dos brotos de S. crispa regenerados na
multiplicação in vitro.

Fonte: Autor, 2022 .

27
 Figura 10 - Broto de S. crispa regenerado in vitro no tratamento 1 (0 µM de BAP) (A);
Broto de S. crispa regenerado in vitro no tratamento 2 (3 µM de BAP) (B); Broto de S.
crispa regenerado in vitro no tratamento 3 (6 µM de BAP) (C); Broto de S. crispa
regenerado in vitro no tratamento 4 (6 µM de BAP) (D); Broto de S. crispa regenerado
in vitro no tratamento 5 (12 µM de BAP) (E); Broto de S. crispa regenerado in vitro no
tratamento 6 (15 µM de BAP) (F);

Fonte: Autor, 2022.

Na fase de enraizamento e aclimatização os brotos não sobreviveram, após 4

dias no viveiro entraram em senescência.

28
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O uso de BAP (6-Benzilaminopurina) na multiplicação in vitro de orquídeas

aumenta a regeneração dos brotos, assim como já observado por Silva et al., (2017).
Takahara (2014), obteve melhores resultados utilizando o meio WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd e McCown (1980). Para o número de brotos por explante as doses de
6, 9, 12 e 15 µM de BAP (6-Benzilaminopurina) apresentaram maiores números. Para a
altura dos brotos não houve interação significativa das doses de BAP
(6-Benzilaminopurina). Em relação à oxidação dos brotos recomenda-se o uso de
antioxidantes para orquídeas, como o carvão ativado, que reduz a oxidação de como
visto por (VILLA et al., 2014).
Na fase de enraizamento e aclimatização, o substrato utilizado não era o
considerado ideal para os brotos S. crispa, houve dificuldade para encontrar o material
“esfagno” e em razão disso foi utilizado casca de pinus. A mudança repentina de
ambiente pode ter causada a morte das plantas, que saíram de um ambiente controlado
em laboratório e foram para o viveiro, além disso a temperatura média registrada para o
dia da transferência era de 12,7 °C de acordo com a Estação Meteorológica da Área
Experimental UFSC Curitibanos (CIRAM/EPAGRI) o que é considerada muito baixa.
Recomenda-se uma fase de pré aclimatização, antes da transferência para as condições
adversas de um viveiro.

29
6 CONCLUSÃO

O uso de baixas concentrações de BAP (6-Benzilaminopurina) na

multiplicação in vitro de protocormos promove elevada oxidação. O uso de BAP
(6-Benzilaminopurina) aumentou o número de brotos adventícios regenerados, e a
melhor concentração foi a de 9 µM de BAP pois apresentou os melhores resultados com
o menor uso do regulador. O uso de 15 mM promoveu redução na altura dos brotos
regenerados. A micropropagação de S. crispa com o uso de BAP (6-Benzilaminopurina)
na fase de multiplicação é viável como indutor da regeneração de brotos adventícios no
protocolo.

30
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