UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E
MANEJO DE RECURSOS NATURAIS – NÍVEL MESTRADO

LAÍS DAYANE WEBER

Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo

essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

CASCAVEL-PR
Agosto/2013
 LAÍS DAYANE WEBER

Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo

essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo
de Recursos Naturais – Nível Mestrado, do Centro
de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade
estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em Conservação
e Manejo de Recursos Naturais

Área de Concentração: Conservação e Manejo de

Recursos Naturais

CASCAVEL-PR
Agosto/2013

ii
"Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro
da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que
existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles."
(Augusto Cury)

iii
DEDICATÓRIA

A minha família e ao meu namorado, por todo amor e

constante incentivo, com gratidão, dedico.

iv
 AGRADECIMENTOS

A Deus por iluminar meu caminho e permitir que eu realizasse essa conquista.
A minha mãe pela fé, carinho, amor e incentivo, serei eternamente grata.
A minha orientadora Professora Fabiana Gisele da Silva Pinto por sua disponibilidade,
empenho, apoio e confiança. Serei eternamente grata por oportunizar esse trabalho.
Ao Professor Luis Francisco Angeli Alves, pelas sugestões recebidas na elaboração deste
trabalho.
A Professora Tereza Cristina Marinho Jorge, por ceder o Laboratório de Farmacognosia e
apoiar o desenvolvimento desta pesquisa.
A professora Lívia Godinho Temponi pela disponibilização do Herbário (UNOP) e
identificação de todas as plantas.
Aos colegas do laboratório de Biotecnologia Agrícola, pela amizade e pelo apoio durante
esses anos.
A Universidade Estadual do Oeste do Paraná, pela oportunidade de realização desta pesquisa.
Ao PTI pela disponibilidade da bolsa de mestrado.
Enfim, obrigado a todos, mesmo àqueles que não tenham sido citados, mas que de alguma
forma colaboraram para o desenvolvimento desta pesquisa.

v
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................p.1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................p.2
2.1 Resistência bacteriana e antimicrobianos sintéticos.................................p.2
2.2 Antimicrobianos alternativos...................................................................p.3
2.3 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana...............................p.5
2.4 Cromatografia...........................................................................................p.5
2.5 Atividade antioxidante.............................................................................p.6

3. CAPÍTULO 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de

óleo essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.....................p. 8

4. CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies

Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária...................................p. 28

5. REFERÊNCIAS....................................................................................................p.44

6. ANEXOS ..............................................................................................................p.53
Anexo 1 – Nomas Revista Journal of Food, Agriculture & Environment............p.54
Anexo 2 – Nomas Revista Brasileira de Plantas Medicinais...............................p.65

vi
 RESUMO:

A propriedade antimicrobiana das plantas pode ser explicada pela produção de compostos
ativos gerados durante o metabolismo secundário como também por compostos voláteis.
Atualmente os conhecimentos, as vezes empíricos, desta propriedade têm sido confirmados
cientificamente, revelando assim o enorme potencial das plantas no controle de doenças
infecciosas, enquanto verifica-se um aumento nos casos de micro-organismos patogênicos
resistentes aos antimicrobianos conhecidos. Extratos e óleos essenciais de plantas têm
mostrado efeitos sobre desenvolvimento de microrganismos em inúmeras situações, o que
sugere uso prático destes produtos. No presente estudo voltado à pesquisa de plantas como
fonte natural e alternativa de substâncias antimicrobianas, determinou-se a composição
química de diferentes extratos vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do
óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem
fitoquímica e CG/MS respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro-
organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella
Typhimurium (ATCC 14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433),
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Bacillus subtillis (CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação
dos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima
(CBM) utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade
antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais
livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica
dos extratos verificou-se a presença de metabolitos secundários como, flavonoides, taninos
(etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram ativas em
diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico ausência de
metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de compostos voláteis
identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido de 3-hexen-1-ol
(0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o efeito
antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta
tendência de maior susceptibilidade para a cepas Gram positivas. Os resultados apontam o
extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao
óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma
terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre o extrato aquoso,
etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico
e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana
dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante
dos mesmos. Em outro estudo, também voltado à pesquisa de plantas como fonte natural e
alternativa de substâncias antimicrobianas, teve por objetivo comparar a ação inibitória de
extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa),
Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-
branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle
L. (aroeira) de extratos vegetais (aquoso e etanolico) através da determinação da

vii
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) por
meio da técnica de microdiluição em caldo frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de
origem avícola e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. De maneira geral verificou-se a
atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais eficazes
quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e P.guajava,
apresentaram as maiores atividades inibitórias. Esses resultados confirmaram o potencial
antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua
possível adição na alimentação de aves.

Palavras-chave: Ação antimicrobiana, Plantas nativas, Patógenos, Extrato Vegetal, Óleo

Essencial.

viii
1. Introdução

As doenças infecciosas representam uma importante causa de morbidade e

mortalidade entre humanos, especialmente nos países em desenvolvimento. Assim, as
indústrias farmacêuticas têm sido motivadas para o desenvolvimento de novas drogas
antimicrobianas nos últimos anos, especialmente em função da ocorrência de resistência
microbiana a tais medicamentos. Em geral, bactérias têm habilidade genética de transmitir
e adquirir resistência a drogas usadas como agentes terapêuticos (NASCIMENTO et al.
2000), pois são frequentes os relatos sobre isolamentos de bactérias que eram
reconhecidamente sensíveis às drogas de uso na rotina, mas que se tornam resistentes a
todos, ou a quase todos, fármacos disponíveis no mercado (SAKAGAMI; KAJAMURA,
2002).
Assim, no momento em que os antimicrobianos estão sendo substituídos, os
produtos alternativos se constituem numa alternativa importante. Neste contexto, os
extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos
alternativos. Os princípios ativos dos óleos e extratos vegetais podem ser encontrados em
todo tecido vivo de plantas, geralmente concentrados na casca, flores, folhas, frutos,
sementes e quimicamente são constituídos frequentemente por um grupo de compostos
distintos como os hidrocarbonetos, alcoóis e compostos carbonílicos (aldeídos e cetonas),
etc. A exploração da atividade biológica de substâncias químicas de plantas brasileiras
constitui uma forma potencial de controle alternativo de doenças, zoonoses e resistência
microbiana gerando o desenvolvimento de modelos que viabilizem sistemas de produção
sustentáveis e a conservação da biodiversidade e recursos naturais.
Os principais compostos naturais com propriedades antimicrobianas encontrados
nas plantas são geralmente fenóis simples, ácidos fenólicos, quinonas, flavonas, flavonóis e
flavonóides, assim como o tanino, cumarina, terpenóides, alcalóides, lectinas e
polipeptídios (GONÇALVES et al., 2005).
Visto que os extratos vegetais e óleos essenciais têm um papel de destaque como
eficientes antimicrobianos, torna-se importante o estudo do efeito desses compostos
alternativos para o controle da salmonelose em aviários a fim de substituir os produtos
sintéticos que diminuem a qualidade dos alimentos e degradam o meio ambiente como
também em patógenos comumente relacionados a doenças hospitalares.

1
2. Revisão Bibliográfica

2.1 Resistencia bateriana e antimicrobianos sintéticos

As doenças infeciosas afetam milhões de pessoas em todo o mundo e ao longo da
história da humanidade, sempre representaram uma das principais causas de morte.
Segundo dados da Organização Mundial da Sáude (OMS), as doenças infeciosas
representam 26% da mortalidade global estimando-se que cerca de 50.000 pessoas morra a
cada dia em todo o mundo por estas doenças (BECKER et. al., 2006; CHANDA;
RAKHOLIYA, 2011). O problema tem se agravado devido o surgimento de micro-
organismos multirresistentes, presentes em infecções hospitalares e comunitárias,
diminuindo as opções de antibioticoterapia (LEVY, 2005; ANDRADE et al., 2006;
REYNOLDS, 2009; ANURADHA et al., 2010).
Segundo critério mais usado, bactérias multirresistentes são os micro-organimos
que apresentam resistência à maioria dos antimicrobianos, para os quais são originalmente
sensíveis (COUTO, 2003). O uso inteso e inadequado de antibióticos, terapêutica ou
profilaticamente, humano ou veterinário, a dificuldade dos pacientes em seguir o
tratamento prescrito, o transporte de bactérias resistentes a novas áreas em função das
viagens no mundo tem favorecido a pressão seletiva e predominância de espécies
bacterianas cada vez mais resistentes a diversos princípios ativos, bem como causam
diversos problemas ambientais (DEL FIOL et al., 2010; SAKARIDIS et al., 2011).
Segundo NGOWKE et al. (2011), a epidemiologia da resistência aos antibióticos
varia de região e de país. Enquanto alguns países estão registrando um declínio, outros
estão experimentando um aumento da resistência bacteriana. No entanto, esta evidente que
o aumento ou a diminuição tem sempre uma ligação com o uso indiscriminado de
antibióticos (TACCONELLI et al., 2009).
Elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos são registradas em estudos
realizados no mundo todo e na medicina humana e veterinária (MOTA et al., 2005). Para
Salmonella, também, há registros de alta resistência aos principais antimicrobianos
normalmente utilizados em avicultura (RIBEIRO et al., 2008).
Genes resistentes, adquiridos por micro-organismos, podem ser facilmente
transferidos para organismos de diferentes ecossistemas, sendo levados da água para o solo
e vice-versa (BILA; DEZOTTI, 2003). No meio aquático, o contato físico entre as
bactérias possibilita alta freqüência de troca de plasmídeos codificadores de resistência aos

2
antimicrobianos (RHODES et al., 2000). A resistência pode ocorrer pela inativação do
composto por enzimas desintoxicantes, redução da permeabilidade celular ou expulsão da
droga por bombas específicas ou não-específicas e modificação dos alvos dos
antimicrobianos. Além disso, as bactérias podem adquirir um fenótipo de resistência via
reguladores transcricionais globais ou específicos. Estes mecanismos podem ser induzidos
pelo antibiótico em si ou por sinais ambientais (BOERLIN; REID-SMITH, 2008).
Apesar da disponibilização de novos antibióticos, a resistência bacteriana ocorre
em ritmo crescente nos diferentes patógenos Gram positivos e Gram negativos e representa
um grande desafio terapêutico (ROSSI; ANDREAZII, 2005). Nas últimas décadas o
enfoque dado para o controle das infecções por bactérias Gram negativas, pode ter
contribuído para o surgimento de bactérias Gram positivas multirresistentes,
principalmente Staphylococcus resistentes a meticilina, Pneumococcus resistente à
penicilina e eritromicina, Enterococcus resistentes à vancomicina e também as Gram
negativas Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae resistentes a β-lactâmicos e
carbapenens (LOW; NADLER, 1997; SANTOS FILHO et al. 2002).
Ressalta-se a importância de compreender o mecanismo de resistência microbiana,
bem como na busca de novos compostos antimicrobianos, sintéticos ou naturais, no intuito
de controlar a ação de micro-organismos patogênicos (CASTRO et al., 2002).

2.2 Antimicrobianos alternativos

As propriedades farmacológicas das plantas têm sido reconhecidas empiricamente
durante séculos, mas foram cientificamente confirmadas apenas nas últimas décadas.
Filtrados, infusões, macerados, sucos e extratos de plantas com propriedades medicinais
são utilizados no tratamento de diversas doenças, desde a antiguidade (COUTINHO et al.,
2008). O interesse por esses metabólitos extraídos de plantas se deve, principalmente, à
capacidade de produção de compostos biologicamente ativos que podem servir de modelos
para a síntese de novos fármacos e por possuírem propriedades terapêuticas utilizadas
como tratamento alternativo no cuidado de saúde tradicional (GIBBONS, 2005).
Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos,
as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de
produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os
extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir
disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos

3
vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais
(NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006; BONA et al., 2010).
A forma de ação dos princípios ativos de extratos vegetais sobre as células
bacterianas são muito similares ao dos antimicrobianos convencionais. Os efeitos positivos
dos extratos vegetais estão associados aos princípios ativos, componentes químicos
presentes em todas as partes das plantas ou em áreas específicas que conferem às plantas a
capacidade de inibir a atividade de bactérias e de outros micro-organismos (DUARTE,
2004; RIZZO et al., 2010). Além dos extratos desempenharem um importante papel,
garantindo a sobrevivência das espécies no ecossistema, metabólitos secundários são
utilizados em escala industrial para a produção de inseticidas, corantes, flavorizantes,
aromatizantes e medicamentos (MARASCHIN; VERPOORTE, 1999). Existem vários
trabalhos que reportam a constituição fitoquímica de extratos vegetais, mas poucos estudos
reportam quais são as substancias responsáveis pelas atividades antimicrobianas destes
compostos. Portanto, é fundamental conhecer a classe dos componentes ativos através de
técnicas espectrométricas (MOREIRA et al., 2007).
Óleos essenciais são substâncias com alta volatilidade, odoríferas, líquidas e
lipofílicas, resultantes do metabolismo secundário das plantas e apresentam um elevado
potencial biológico, principalmente quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. Do
ponto de vista farmacológico podem conter mais de 100 compostos orgânicos, sendo
terpenos e fenilpropenos os mais encontrados (CASTRO et al., 2004). Seu uso como
agentes medicinais é conhecido desde a antiguidade, em geral os óleos essenciais podem
apresentar propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória, antisséptica, antioxidantes,
antifúngica, anticarcinogênicos entre outros, sendo produtos purificados e de alto efeito
comercial nas indústrias farmacêuticas, alimentícia, entre outras (SKOCIBUSI´C; BEZIC;
DUNKIC, 2006).
O Brasil, detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, possui
uma grande diversidade genética vegetal ainda pouco explorada. Dados revelam que
apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (PINTO et
al, 2002). Essa grande diversidade genética vegetal que representa aproximadamente um
terço da flora mundial é promissora em compostos com potencial bioativo (YUNES et al,
2001). Essa riqueza necessita ser mais explorada, pois compostos potencialmente úteis
podem ser perdidos, deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas
espécies (PATINÕ; CUCA, 2011).

4
 A Organização Mundial de Saúde, desde 1977, incentiva estudos que avaliem
cientificamente os benefícios e riscos do uso tradicional de plantas como medicamentos.
São necessárias evidências laboratoriais e clínicas a respeito da eficácia dessas plantas
medicinais utilizadas tradicionalmente pela população (LOGUERCIO et al, 2005).
Metabólitos secundários, produzidos por algumas espécies de plantas, são alvos de
maior interesse, pois agem como substâncias de defesa contra micro-organismos
patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem composição química variada com
presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que apresentam, com freqüência,
atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007).
Com esta perspectiva, é fundamental avaliar, a partir de técnicas microbiológicas
modernas e padronizadas, a atividade de extratos vegetais e óleos essenciais sobre
diferentes sorotipos de Salmonella e diferentes patógenos comumente relacionados com
doenças hospitalares.

2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antimicrobiana e
antifúngica dos extratos vegetais e óleo essencial, sendo que os mais conhecidos incluem:
método de difusão em ágar e o método de diluição em caldo (OSTROSKY et al., 2008).
São técnicas usualmente aceitas internacionalmente para medir quantitativamente a
atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano,
sendo estas técnicas padronizadas para o uso de antimicrobianos comerciais (CLSI, 2003;
CLSI, 2006).
Pesquisas realizadas anteriormente por diversos autores com o objetivo de avaliar
métodos de avaliação de extratos vegetais e óleo essencial, sugerem uso de diferentes
metodologias para que os resultados possam ser comparados com estudos de diferentes
grupos de pesquisas (OSTROSKY et al., 2008; OTHMAN et al., 2011).

2.4 Cromatografia
Os óleos essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e
nas mais variadas concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise dos óleos essenciais
requer a aplicação de métodos analíticos atuais e instrumentação adaptada que permitam
avaliar a qualidade do óleo essencial e garantir a identificação de seus constituintes.

5
 A cromatografia pode ser acoplada a diferentes sistemas de detecção, e trata-se de
uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor desempenho. O acoplamento do
cromatógrafo com um espectrômetro de massas (CG-EM) associa as vantagens da
cromatografia, que é a alta seletividade e eficiência de separação, com as vantagens da
espectrometria de massas, que é obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento
adicional da seletividade. Esta técnica permite a separação dos constituintes pela
cromatografia gasosa, que são introduzidos individualmente em ordem de eluição na
câmera de ionização do espectrômetro de massas. O espectro de massas obtido para cada
um dos constituintes geralmente indica a massa molecular e o seu padrão de fragmentação.
O padrão de fragmentação pode ser comparado eletronicamente com aqueles constantes da
biblioteca de espectros de massas (AVATO et al., 2005).
Desse modo, é possível resolver picos cromatográficos parcialmente superpostos.
Assim, a espectrometria de massas acoplada à cromatografia gasosa fornece as
fragmentações dos componentes individuais separados (TAVARES et al., 2005).
A CG-EM é aplicável a compostos voláteis (como os óleos essenciais) e
termicamente estáveis nas temperaturas relativamente elevadas empregadas durante o
processo de separação cromatográfica (ARDREY, 2003).
A identificação de componentes de óleos voláteis tem feito o uso de CG e de CG-
MS em associação com a determinação do índice de Kovats. Este procedimento vem sendo
aplicado com sucesso na identificação de substâncias de estruturas conhecidas porque, em
sua maioria, os dados gerados podem ser comparados diretamente com os valores de tempo
de retenção (índice de retenção) obtidos em colunas de polaridades diferentes e com os
espectros de massas dos constituintes voláteis publicados (ADAMS, 2007).

2.5 Atividade Antioxidante

Um antioxidante é uma substancia sintética ou natural acrescida em produtos para
prevenir ou retardar a deterioração desses produtos através da ação do oxigênio presente no
ar. Para bioquímica e a medicina, os antioxidantes são enzimas ou substancias orgânicas,
como vitamina E ou β-caroteno, capazes de atuar contra os danos da oxidação nos tecidos
animais. Os antioxidantes naturais ou sintéticos interferem na participação do oxigenio e
atuam como inibidores de reação, fazendo papel ou de doadores de hidrogênio ou de
receptores de raicais livres dos ádicos graxos. (HUANG et al., 2005).

6
 Os antioxidantes podem ser classificados em dois grupos: primários e secundários.
Os primários são aqueles que interrompem a cadeia de reações envolvidas na oxidação
lipídica através da doação de elétrons ou hidrogênio aos radicais livres, fazendo assim a
conversão deles em produtos mais estáveis. Os secundários são compostos que reduzem ou
diminuem a taxa de iniciação da oxidação, através da decomposição de hidroperóxidos
(SHAHIDI; NACZK, 2004).
A medida da habilidade antioxidante reflete a ação acumulada de todos os
antioxidantes que estiverem presentes em um extrato ou amostra biológica,
proporcionando, desta forma, uma analise de parâmetros associados. A capacidade
antioxidante pode ser considerada um marcador sensível e confiável para detectar
mudanças no estresse oxidativo in vivo, provendo ajuda no esclarecimento de fatores
fisiológicos e nutricionais importantes, e ainda, suprindo informações sobre absorção e
biodisponibilidade de compostos antioxidantes (GHISELLI et al., 2000).
Portanto, o interesse pela pesquisa sobre novos antioxidantes naturais tem
aumentado nos últimos anos, levando as indústrias de alimentos, de cosméticos e
farmacêuticos a ter maior atenção em novas fontes, principalmente às de origem vegetal.
Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os compostos fenólicos têm
sido apontados como responsáveis por maior capacidade antioxidante, sendo representados
pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas, xantonas e outros (RAZAVI et al.,
2008).
São várias as metodologias utilizadas para determinar a capacidade antioxidante de
uma amostra, portanto estão sujeitas a interferências e também se baseiam em diversos
fundamentos. Um método frequentemente utilizado para avaliar a capacidade antioxidante
se dá através da medição do sequestro de radicais livres. Ele se fundamenta na habilidade
de antioxidantes, que estão presentes na amostra, se ligarem com o DPPH, um radical
orgânico e estável. É um método tecnicamente rápido e não detecta agentes pró oxidantes,
sendo que determina apenas o poder redutor dos compostos analisados (BRAND-
WILLIANS et al 1995). Este método foi primeiramente descrito por Brand-Willians (1995)
e baseia-se na capacidade redutora dos antioxidantes presentes em uma amostra sobre o
DPPH, radical orgânico e estável, através de uma reação de transferência de elétrons, a
qual é medida através do decréscimo da absorbância a 515nm.

7
 1 3. Capítulo 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo
2 essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.
3
4 Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo
5 essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.
6
7 Journal of Food, Agriculture & Environment
8
9
10
11 Laís Dayane Weber, Fabiana Gisele da Silva Pinto, Mayara Camila Scur, Juliete Gomes de
12 Lara de Souza, Willian Ferreira da Costa
13 Weber, L.D.; Pinto, F.G.S.; Scur, M.C.; Souza, J.G.L.; Costa, W.F.
14
15
16 RESUMO
17 No presente estudo determinou-se a composição química de diferentes extratos
18 vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do óleo essencial de Prunus
19 myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem fitoquímica e CG/MS
20 respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro-organismos
21 patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella Typhimurium (ATCC
22 14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883),
23 Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus
24 epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtillis
25 (CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação dos valores de
26 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)
27 utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade
28 antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais
29 livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica
30 dos extratos verificou-se a presença de de metabolitos secundários como, flavonoides,
31 taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram

8
32 ativas em diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico
33 ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de
34 compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido
35 de 3-hexen-1-ol (0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o
36 efeito antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta
37 tendência de maior susceptibilidade para as cepas Gram positivas. Os resultados apontam o
38 extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao
39 óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma
40 terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre os extratos aquoso,
41 etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico
42 e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana
43 dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante
44 dos mesmos.
45
46
47 Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático.
48
49
50
51 INTRODUÇÃO
52 O Brasil possui a maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta e
53 consequentemente uma grande diversidade genética vegetal pouco explorada. Em relação
54 ao potencial medicinal, apenas aproximadamente 17% das plantas foram estudadas
55 (PINTO et al, 2002). Devido essa grande diversidade o Brasil ganhou destaque na busca
56 por compostos com potencial bioativo (YUNES et al, 2001). Sendo necessária a
57 exploração desses vegetais, pois compostos potencialmente úteis podem ser perdidos,
58 deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas espécies (PATINÕ; CUCA,
59 2011).
60 A família Rosaceae compreende cerca de 100 gêneros e 3.000 espécies, sendo uma
61 das principais famílias do ponto de vista econômico, concentrada no Hemisfério Norte,
62 com poucas espécies nativas no Brasil (SOUZA; LORENZI, 2005). Fornece espécies que

9
63 detêm grande potencial nutricional e farmacológico sendo utilizadas na medicina popular
64 para o tratamento de diversas enfermidades e para a manutenção de boas condições de
65 saúde. O gênero Prunus é constituído por aproximadamente 130 espécies que ocorrem nas
66 regiões Norte, Sul e Sudeste do Brasil. Diversas frutas introduzidas e consumidas no Brasil
67 pertencem ao gênero Prunus, encontram-se o pêssego (P. persica), nectarina (P. persica
68 var. nucipersica), ameixa (P. domestica), amêndoa (P. dulcis) e a cereja (P. avium, P.
69 cerasus) (JUDD et al., 2002; SOUZA; LORENZI, 2005).
70 Quanto às espécies nativas do gênero Prunus, merece destaque Prunus myrtifolia
71 (L.) Urb. por ser uma espécie de ampla distribuição geográfica, (SOUZA; LORENZI,
72 2005), que possui como sinonimos Prunus sphaerocarpa Hook e Prunus sellowii Koehne.
73 P. myrtifolia é conhecida popularmente como pessegueiro-bravo, pessegueiro-do-mato,
74 miguel-pintado, coração-de-negro, marmelo-do-mato, coração-de-bugre, varova, varoveira
75 (LORENZI, 1992).
76 Nos últimos anos, a composição química, propriedades antibacterianas e
77 antioxidantes dos vegetais ganharam interesse na busca por produtos alternativos. Os óleos
78 essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e nas mais variadas
79 concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise requer a aplicação de métodos analíticos
80 atuais e instrumentação adaptada que permitam avaliar a qualidade do óleo essencial e
81 garantir a identificação de seus constituintes. Os metabólitos secundários, produzidos por
82 algumas espécies de plantas, são alvos de maior interesse, pois agem como substâncias de
83 defesa contra micro-organismos patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem
84 composição química variada com presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que
85 apresentam, com frequência, atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007).
86 Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos,
87 as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de
88 produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os
89 extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir
90 disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos
91 vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais
92 (NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006).
93 A busca por novos antioxidantes naturais tem aumentado nos últimos anos, levando
10
 94 as indústrias de alimentos, de cosméticos e farmacêuticos voltar pesquisas para material de
95 origem vegetal. Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os
96 compostos fenólicos têm sido apontados como responsáveis por maior capacidade
97 antioxidante, sendo representados pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas,
98 xantonas e outros (RAZAVI et al., 2008).
99 No presente estudo, determinou-se a composição química dos extratos vegetais e do
100 óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), bem como seu efeito
101 antimicrobiano contra micro-organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa ATCC
102 27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus mirabilis ATCC 25933,
103 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus
104 faecalis ATCC 19433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus
105 ATCC 25923, Bacillus subtillis CCD-04 e Candida albicans ATCC 10231; e por fim
106 buscou-se avaliar a atividade antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial.
107
108 MATERIAL E MÉTODOS
109 Material Vegetal
110 Folhas de Prunus myrtifolia foram coletadas na região Oeste do Paraná, Brasil. As
111 coletas foram realizadas de janeiro a fevereiro de 2013, sempre pelo período da manhã, de
112 acordo com a distribuição natural e disponibilidade da espécie. O material foi identificado
113 pela profª Drª Livia Godinho Temponi e incorporado no Herbário da Universidade
114 Estadual do Oeste do Paraná (UNOP).
115 As folhas coletadas foram secas em estufa com circulação de ar a 40 °C por 48h e
116 trituradas em moinho elétrico de facas. O pó da planta foi armazenado em recipiente
117 escuro, hermeticamente fechado, até ser usado para produção dos extratos e triagem
118 fitoquímica.
119 Obtenção do extrato aquoso
120 20 g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de água destilada e mantido
121 em agitador rotativo a 220 x g durante 24 h. Em seguida o material foi filtrado em papel de
122 filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi
123 recolhido, obtendo-se, desta forma, o extrato na concentração final de 200 mg/mL. Os
124 extratos obtidos foram armazenados em frascos hermeticamente fechados, sob abrigo da

11
125 luz a uma temperatura de 4º C (BONA et al., 2010).
126 Obtenção dos extratos orgânicos
127 Os extratos orgânicos foram obtidos segundo a metodologia descrita por Ceyahn et
128 al. (2012). Etanol (95%), acetato de etila e hexano foram utilizados como solventes
129 orgânicos. A partir de 10g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de solvente
130 orgânico e levado a um agitador rotativo a 220 x g por 24 h. Em seguida foi filtrado em
131 papel filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 minutos. O sobrenadante
132 foi recolhido e submetido a roto-evaporadoção a temperatura máxima de 40ºC (Laboratório
133 de Farmacognosia, UNIOESTE), a fim de se retirar o solvente. O extrato obtido foi diluído
134 com água destilada estéril seguindo a proporção do seu peso, resultando em uma
135 concentração final de 400 mg/mL. Os extratos obtidos foram armazenados em frascos
136 hermeticamente fechados, sob abrigo da luz a uma temperatura de 4ºC.
137 Triagem fitoquímica
138 Os principais metabólitos secundários foram detectados de acordo com
139 metodologia desenvolvida por Wall et al (1954); Barbosa-Filho et al (1984) e Agra et al
140 (1990) na classificação química de 4.000 plantas diferentes, com modificações.
141 Extração óleo essencial
142 70 g de folhas frescas de Prunus myrtifolia foram submetidos a metodologia padrão
143 de arraste por vapor d’água durante 3 horas utilizando o equipamento tipo Clevenger. O
144 óleo foi recolhido diretamente sem a adição de qualquer solvente, e armazenado em frascos
145 escuros a 4 ° C.
146 Análise da composição química
147 Os constituintes do óleo essencial foram identificados através da cromatografia em
148 fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e pela determinação de seus
149 índices de retenção de Kovats (IK).
150 Cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas
151 As análises de GC-MS foram realizadas no Laboratório de Cromatografia Gasosa
152 acoplada à Espectrometria de Massas – COMCAP, Universidade Estadual de Maringá
153 (UEM), Paraná, Brasil.
154 A análise do óleo da Prunus myrtifolia foi realizada empregando um sistema CG-
155 MS Thermo-Finigan, sendo realizadas em um sistema composto por um cromatógrafo em
12
156 fase gasosa FOCUS GC (Thermo Electron), acoplado a um espectrômetro de massas DSQ
157 II (Thermo Electron), empregando um detector com fonte de ionização por impacto de
158 elétrons de 70V e analisador de massas do tipo quadrupolo. As amostras foram injetadas
159 por um sistema automático de injeção modelo Triplus (Thermo Electron). O programa
160 “Xcalibur” (“Thermo Electron”) foi empregado para à aquisição e processamento dos
161 dados.
162 A separação cromatográfica foi realizada por uma coluna capilar de sílica fundida
163 DB-5ms da “J&W Scientific” (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25
164 µm de fase estacionária de composição de 5% fenil e 95% dimetilpolissiloxano). O gás de
165 arraste empregado foi o gás hélio 5.0.
166 A temperatura do injetor foi de 250 °C e a vazão do gás de arraste foi mantida
167 constante a 1,0 mL.min-1. A amostra e os padrões dos alcanos foram injetados no modo
168 split com na razão de 1:25. A programação de temperatura empregada foi: temperatura
169 inicial 50 oC mantida por 2 min, aumento da temperatura para 180 oC a uma razão de 2,0
o
170 C.min-1 seguida de aumento para 290 oC a uma razão de 5,0 oC.min-1. A interface entre o
171 CG e o EM foi mantida em 270 °C e a temperatura da fonte de ionização do espectrômetro
172 de massas foi de 250 °C. A faixa da razão massa/carga monitorada foi de 50-500 m/z.
173 Índice de retenção de Kovats
174 O cálculo do índice de retenção de Kovats foi baseado no emprego de uma mistura
175 de padrões de alcanos (C7 a C28). As amostras foram diluídas em n-hexano e analisada.
176 Os índices de retenção dos compostos foram determinados com a equação proposta por
177 (VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963):
178 A identificação dos componentes foi baseada na comparação de seus espectros de
179 massas com os obtidos através dos espectros de massas da biblioteca espectral “NIST MS
180 Search 2.0” contida no software “Xcalibur” que acompanha o equipamento e pela
181 comparação dos seus índices de retenção de Kovats, obtidos experimentalmente, com os
182 dados de índice de retenção de Kovats obtidos na literatura para os mesmos compostos
183 analisados empregando a mesma coluna.
184 Micro-organismos utilizados
185 Para a realização do teste da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extratos
186 vegetais de Prunus myrtifolia foram utilizados 5 patógenos Gram negativo, sendo eles,
13
187 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus
188 mirabilis ATCC 25933, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC
189 25922; 4 patógenos Gram positivo, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus
190 epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Bacillus subtillis CCD-
191 04 e Candida albicans ATCC 10231 como levedura.
192 Os micro-organismos previamente mantidos a -20 °C foram recuperadas em meio
193 enriquecido, “Brain Heart Infusion” (BHI) e incubados a 36 °C por 24h. Após esse
194 período, foram ressuspensas em solução salina estéril a 0,9% (p/v) para se obter o inóculo
195 padrão a uma concentração de 1x108 UFC/mL na escala de MacFarland. Posteriormente
196 foram realizadas diluições em solução salina estéril (0,9% p/v) a fim de se obter um
197 inóculo final na concentração de 1x105 UFC/mL. Com exceção da Candida albicans que é
198 utilizada na concentração final de 1x106 UFC/mL.
199 Determinação da Concentração inibitória mínima (CIM)
200 Óleo essencial
201 A CIM do óleo essencial foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo
202 proposta por Santurio et al. (2011) com modificações. Após pesagem de 70 mg do óleo
203 essencial foi diluído com metanol até atingir a concentração de 70 mg.mL-1 (solução I). A
204 seguir, foi diluído na proporção de 1:10 em Caldo Muller-Hinton (MH) para todos os
205 micro-organimos exceto Candida albicas que utilizou-se RPMI, obtendo-se a concentração
206 de 7000 µg.mL-1 (solução II). Com base no documento M31-A3 do CLSI (2008), volumes
207 de 100 µL da solução II foram adicionados ao primeiro poço e, após homogeneização,
208 realizou-se diluições sucessivas obtendo-se concentrações finais de 13.67 a 3500 µg.mL-1.
209 Alíquotas (10 µL) da diluição dos micro-organismos foram distribuídas em cada poço já
210 contendo o óleo essencial em suas diluições finais. As placas foram incubadas a 36 °C por
211 24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de 10 µL de
212 cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM foi
213 definida como a menor concentração do extrato em mg.mL-1 capaz de impedir o
214 crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004).
215 Extratos vegetais
216 A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da microdiluição em caldo
217 proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (10 µL) da diluição foram distribuídas em
14
218 placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo MH (concentração dupla),
219 com a adição anterior dos extratos. Os extratos foram diluídos em concentrações entre 0,04
220 e 100 mg/mL para o extrato aquoso, entre 0,035 e 75 mg/mL para o extrato etanólico e
221 acetato de etila entre 0,0012 e 3 mg/mL para o extrato hexânico. As placas foram
222 incubadas a 36 °C por 24 h. Após avaliação visual seguiu-se os mesmos padrões de
223 avaliação que óleo essencial.
224 Determinação da Concentração bactericida mínima (CBM)
225 A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al.
226 (2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM,
227 anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do
228 ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a
229 menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e
230 CBM foram realizados em triplicata.
231 Água destilada, etanol, acetato de etila e hexano foram usados como controle
232 negativo. Gentamicina foi utilizada como controle positiva para as bactérias e Nistatina
233 para C. albicans (Tabela 1). Os antimicrobianos sintéticos foram testados nas
234 concentrações de 0.78 a 100 mg/mL.

Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima

(CBM) de água destilada, solventes orgânicos e antimicrobianos referência frente a micro-
organismos patogênicos.

CIM/CBM (mg/mL)

Água Acetato de
Micro-organimos Etanol Hexano Gentamicina Nistatina
Destilada etila

P. aeruginosa ATCC 27853 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

S. Typhimurium ATCC 14028 Na Na Na Na 3.125/6.25 Nt

P. mirabilis ATCC 25933 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

K. pneumoniae ATCC 13883 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

E. coli ATCC 25922 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

E. faecalis ATCC 19433 Na Na Na Na 3.125/6.25 Nt

S. epidermidis ATCC 12228 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

15
 S. aureus ATCC 25923 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

B. subtillis CCD-04 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt

C. albicans ATCC 10231 Na Na Na Na Nt 6.25/6.25
*Na: Sem atividade; Nt: não foi testado

235 Atividade antioxidante

236 A atividade antioxidante foi determinada pelo método de captura de radicais livres
237 DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil) baseado na metodologia preconizada por Scherer e
238 Godoy (2009) com modificações. Para a análise das amostras, 0,1 mL de cada diluição das
239 amostras ou padrões foram adicionados em tubos de ensaio que continham 3,9 mL do
240 radical DPPH (0,2 mM) diluído em metanol e homogeneizados em agitador de tubos. Para
241 o controle negativo, foi utilizado 0,1 mL de solução controle (álcool metílico, acetona e
242 água) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizados. Como controle positivo utilizou-se
243 o antioxidante sintético BHT (butil hidroxi tolueno) e seguiu-se o mesmo procedimento do
244 controle negativo. Como branco foi utilizado álcool metílico, afim de calibrar o
245 espectrofotômetro. Todas as análises foram realizadas em triplicata. As leituras (λ = 515
246 nm) foram monitoradas a cada 30 minutos, até a estabilização da absorbância.
247 O índice DPPH foi calculado através da equação 1: I (%) = [(Abs0 -Abs1) /Abs0]
248 x100, onde Abs0 é a absorbância do branco e Abs1 é a absorbância da amostra.
249 Para o cálculo dos valores de IC50 (concentração do óleo/extrato necessário para
250 reduzir 50% do radical DPPH), utilizou-se as equações
251
252
253 RESULTADOS E DISCUSSÃO
254 Os testes realizados, na triagem fitoquímica (Tabela 2), revelaram que o extrato
255 aquoso apresenta apenas a classe dos taninos e flavonoides. O extrato etanolico foi o que
256 revelou maior número de classes de substâncias: taninos, saponinas, terpenos e
257 flavonoides. O extrato com o solvente acetato de etila revelou apenas a classe de
258 substancias dos flavonoides e o extrato hexânico não apresentou resultado positivo para as
259 classes de substanciais testadas.
260 Tabela 2. Classes de metabólitos secundários identificados nos diferentes
261 extratos de Prunus myrtifolia
EXTRATOS
16
 Classes de Aquoso Etanolico Acetato de Hexânico
metabólitos Etila
Taninos + + - -
Alcaloides - - - -
Cumarinas - - - -
Saponinas - + - -
Antocianinas - - - -
Antocianidinas - - - -
Flavonoides + + + -
Triterpenoides - + - -
Esteroides - - - -
262 *- ausente + presente
263
264 Sabe-se que a constituição química de Rosaceae inclui especialmente taninos (OKUDA
265 et al., 1992), flavonóides (HARBONE, 1988; CHALLICE et al., 1972), além de triterpenos
266 e esteróides (WALLAART, 1980).
267 A maior classe de compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia
268 pertence aos aldeidos os quais representaram cerca de 97% da área total de picos. Em
269 sequência foram identificados em porcentagens inferiores as classes de álcoois (3-hexen-1-
270 ol) e ésteres (Benzil e Benzoato) com 0,07 e 0,09% de área total de pico, respectivamente.
271 (Tabela 3).
272 Tabela 3. Composição química do óleo essencial de Prunus myrtifolia

Componentes Area (%) IK* IK** TR*

3-Hexen-1-ol 0.07 852 845(1) 5.74
Benzaldeido 96.96 964 962(2) 10.22
Benzil, benzoato 0.09 1759 1765(3) 57.22
273 * IK – índice de Kovats calculado ** IK – índice de Kovats literatura *Tempo de retenção
274
275 A principal classe de compostos voláteis no óleo do gênero Prunus é aldeídos,
276 tendo como composto majoritário Benzaldeido em sua composição química (MAIA;
277 GODOY, 1984; IBARRA-ALVARADO et al., 2009). O benzaldeído é resultado da
278 hidrólise enzimática de amigdalina, que ocorre com a liberação de cianeto de hidrogênio e
279 duas moléculas de glicose (TATSUMA et al., 1998). Além disto, o benzaldeido é um dos
280 principais componentes responsáveis pelo odor característico dos óleos essenciais
281 (KERDOGAN-ORHAN e KARTAL, 2011). Diversas atividades biológicas, como
282 antimicrobiana e antifúngica, são atribuídas a presença de compostos como benzaldeido
283 (DU et al., 2002; FUJI et al., 2005).
17
284 Os resultados presentes na Tabela 4 indicam que o óleo essencial e extratos
285 apresentaram atividade antimicrobiana para todas as cepas testadas, embora para o extrato
286 hexânico a CBM foi maior do que o limite de detecção.

Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima

(CBM) de óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia frente a micro-organismos
patogênicos.

CIM/CBM (mg/mL)

Óleo
Acetato de
Micro-organimos essencial Aquoso Etanolico Hexânico
Etila
(µg/mL)

P. aeruginosa ATCC 27853 3500/3500 12.5/12.5 9.38/18.75 37.5/75 3/>LD

S. Typhimurium ATCC 14028 1750/3500 12.5/25 18.75/37.5 150/150 3/>LD

P. mirabilis ATCC 25933 3500/7000 12.5/12.5 18.75/18.75 37.5/75 3/>LD

K. pneumoniae ATCC 13883 3500/7000 12,5/12,5 18.75/37.5 37.5/37.5 3/>LD

E. coli ATCC 25922 1750/7000 12.5/25 9.38/37.5 37.5/75 3/>LD

E. faecalis ATCC 19433 1750/7000 12.5/25 9.38/18.75 9.38/18.75 3/>LD

S. epidermidis ATCC 12228 3500/7000 1.56/1.56 1.18/2.35 4.69/9.38 3/>LD

S. aureus ATCC 25923 3500/7000 0.04/0.09 0.07/0.15 2.34/4.68 3/>LD

B. subtillis CCD-04 3500/7000 3.13/6.25 4.69/4.69 4.69/9.38 3/>LD

C. albicans ATCC 10231 3500/7000 6.25/6.25 4.69/9.37 9.38/9.38 3/>LD

>LD: Maior que o limite de detecção

287 O óleo essencial apresentou atividade bacteriostática de 1750 a 3500 µg/mL

288 enquanto sua atividade bactericida foi em sua maioria de 7000 µg/mL, sendo que apenas P.
289 aeruginosa e S. Typhimurium apresentaram CBM de 3500 µg/mL. A atividade encontrada
290 no óleo pode ser devido à presença em sua composição do benzaldeido. Segundo Alanri et
291 al. (2012) derivados de benzaldeido são amplamente utilizados como compostos
292 antimicrobianos de modo ambientalmente seguro, considerando seu amplo espectro de
293 efeito inibidor, que são empregados como agente bactericida e fungicida. Benzaldeídos
294 assemelham fenóis na atividade antibacteriana interagindo com a superfície da célula e
295 levando a morte celular por meio da desintegração da membrana celular e liberação de
18
296 componentes intracelulares (ALANRI et al., 2012).
297 Em relação a atividade antimicrobiana encontrada nos extratos verificou-se uma
298 variação frente aos diferentes extratores utilizados. Para extrato aquoso observou-se
299 variação na CIM de 0.04 a 12.5 mg/mL e CBM de 0.09 a 25 mg/mL. O extrato etanolico
300 apresentou atividade bacteriostática variando entre 0.07-18.75 mg/mL e bactericida entre
301 0.15-37.5 mg/mL. O extrato de acetato de etila apresentou valores de CIM de 2.34 a 150
302 mg/mL e CBM de 4.68 a 150 mg/mL. E por fim, para o extrato hexânico todas as cepas
303 apresentaram valores de CIM de 3 mg/mL contudo a atividade bactericida não foi
304 detectada na concentração testada.
305 Yigit, et al. (2009) reportaram antibacteriana para os extratos etanolicos e aquosos
306 de Prunus armeniaca L. kernels frente a Gram negativa e positiva e a leveduras como
307 Candida albicans, corroborando com os dados encontrados em nossa pesquisa.
308 A atividade antibacteriana observada nos extratos aquoso, etanolico e acetato de
309 etila (Tabela 2) pode estar relacionada a presença de metabolitos secundários como,
310 flavonoides, taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se
311 mostraram ativas em diferentes estudos descritos na literatura (RECIO et al., 1989). Em
312 relação ao extrato hexânico a não detecção da atividade bactericida pode ser devido à
313 ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana.
314 Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a
315 compostos ativos presentes nos extratos vegetais. TALEB-CONTINI et al (2003)
316 avaliaram a atividade antimicrobiana de flavonoides isolados e constataram sua atividade
317 antibacteriana, principalmente frente a micro-organismos Gram positivos. Os flavonoides
318 agem na célula bacteriana através de complexos entre proteínas e a parede celular
319 bacteriana, ocasionando seu rompimento (TAGURI et al., 2004). Os taninos agem nos
320 micro-organismos impedindo seu crescimento, através da formação de complexos entre o
321 mesmo e a parede celular ou enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a
322 inibição do transporte de nutrientes para a célula (McSWEENEY et al., 2001). Estudos
323 sugerem que o mecanismo de ação dos triterpenos nos micro-organismos está relacionado
324 ao rompimento de compostos lipofílicos das membranas microbianas (BAGAMBOULA et
325 al., 2004). As saponinas são compostos que também possuem atividades biológicas como,
326 antilevadura e antibacteriano, agindo nos esteróis da membrana ativamente (KILLEEN et
19
327 al., 1998; SPARG et al., 2004)
328 No geral, os extratos aquoso e etanolico apresentaram melhores valores em
329 relação a CIM e CBM frente a todas as cepas testadas. Já o extrato acetato de etila
330 apresentou uma variação frente a atividade antimicrobiana em relação a Gram negativa,
331 onde apresentaram altos valores de CIM e CBM e em contrapartida as cepas Gram
332 positivas e leveduras quando analisados a CIM e CBM apresentaram maior suscetibilidade
333 ao extrato. A membrana externa tem constituição diferente conforme a bactéria seja Gram
334 negativa ou positiva. Entretanto, todas tem uma camada comum, o peptideoglicano que
335 serve como barreira de penetração para macromoléculas e compostos hidrofóbicos, e
336 consequentemente as tornam menos suscetíveis aos agentes antimicrobianos (TADEG et
337 al., 2005). Sendo justificada pela presença de flavonoides que possuem atividade
338 antimicrobiana principalmente em Gram positiva (TALEB-CONTINI et al., 2003).
339 O teste químico utilizado para a detecção de atividade antioxidante através do
340 sequestrador de radical DPPH, através do cálculo do índice de DPPH (Figura 1) e do IC 50
341 (Tabela 5).

342
343 Figura 1. Índice de DPPH do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia
344 nas diferentes concentrações testadas
345
346
347

20
348 Tabela 4. IC50 do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia nas diferentes
349 concentrações testadas
Testes IC50
Controle 191,5
BHT 11,54
Oleo 1 167,36
Oleo 2 179,11
Oleo 3 184,72
Aquoso 1 14,45
Aquoso 2 21,9
Aquoso 3 23
Etanolico 1 15,9
Etanolico 2 15,27
Etanolico 3 13,54
Acetato de etila 1 14,27
Acetato de etila 2 53
Acetato de etila 3 62,09
Hexano 1 186,36
Hexano 2 186,45
Hexano 3 187,18
350
351 Quanto ao índice de DPPH o extrato aquoso e etanolicos nas diferentes
352 concentrações testadas apresentaram porcentagem de sequestro de DPPH aproximadas as
353 porcentagens encontradas para o BHT, antioxidante sintético comercializado, utilizado
354 como controle positivo. Variando de 89.73 a 94.77%, enquanto o índice de sequestro para
355 o BHT foi de 95.83%. Em relação ao extrato de acetato de etila houve uma redução
356 significativa no índice de sequestro quando comparadas as diferentes concentrações
357 avaliadas.
358 Segundo GAO (1999), os compostos fenólicos, como flavonoides, triterpenos e
359 taninos são polares e doadores de elétrons, portanto excelentes antioxidantes. Compostos
360 estes que foram encontrados na triagem fitoquímicas dos extratos testados (Tabela 2). O
361 flavonoides podem bloquear em grande escala efeitos enzimáticos, inclusive os que estão
362 associados a divisão celular (HOLLMAN, 1999). Foram relatados dados
363 etnofarmacológicos na literatura do gênero Prunus sobre a relação da atividade
364 antioxidante correlacionada com a presença de flavonoides (WANG et al., 1999;
365 NAKATANI et al., 2000). YGIT et al. (2012) reportaram atividade antioxidante bastante

21
366 significativa com valores de índice sequestro de DPPH iguais ou superiores aos
367 encontrados no BHT e extratos aquoso e etanolico.
368 O óleo essencial e extrato hexânico nas diferentes concentrações testadas
369 presentaram índice de DPPH relativamente baixos, não podendo ser detectada atividade.
370 Os valores encontrados no óleo essencial se devem a presença do seu composto
371 majoritário, benzaldeido, que conforme citado na literatura apresenta atividade
372 antioxidante de moderada a fraca (THANH; HOEI, 2012). Já o extrato hexânico
373 justificasse a ausência da atividade antioxidante devido à inexistência de metabolitos
374 secundários presentes no extrato que exerçam tal função.
375 Os valores do IC50 estão diretamente relacionados à porcentagem de sequestro do
376 DPPH, sendo inversamente proporcional (quanto maior o índice de sequestro menos o
377 IC50), portanto a relação dos dados permanece a mesma.
378 Gênero Prunus apresenta importância econômica na área de alimentos e
379 fitofármacos, sendo reportados na literatura mais de 100 patentes envolvendo diferentes
380 espécies de Prunus em sua formulação, com diversas finalidades: cosméticos clareadores
381 da pele (YAGI; NAGARUMA, 1998); protetores solares (HEO et al., 2001), como
382 alimento na pecuária (KHANAL, 2001), antimalárica (MUNOZ et al., 2000) e
383 hipotensivo (PIERONI, 2000).
384 Destaca-se a importância dos estudos fitoquímicos uma vez que através dos
385 mesmos justificam-se as atividades biológicas encontradas. Vale ressaltar a importância de
386 estudos preliminares para determinar a atividade desses compostos afim de que sirvam
387 como base para estudos posteriores a fim de isolar diferentes compostos com atividade
388 antimicrobiana. Em relação à atividade antioxidante ressalta-se a importância na
389 determinação da mesma uma vez que há necessidade de que o composto seja
390 antimicrobiano e antioxidante ao mesmo tempo.
391
392
393 CONCLUSÃO
394 O estudo químico de Prunus myrtifolia demonstra estar de acordo com relatos
395 encontrados na literatura no que concerne a química do gênero Prunus. Foram
396 identificados flavonoides, terpenoides, entre outros metabólitos especiais no extrato

22
397 vegetal aquoso, etanolico e acetato de etila. Com relação ao óleo essencial como composto
398 majoritário foi encontrado o Benzaldeido. Em relação a atividade antimicrobiana os micro-
399 organismos se mostraram suscetíveis quando avaliados frente aos extratos vegetais aquoso,
400 etanolico e acetato de etila e óleo essencial, demonstrando potencial efeito antimicrobiano
401 da Prunus myrtifolia. Quanto à atividade antioxidade, os extratos alcoolico, aquoso e de
402 acetato de etila expressaram valores significativos comparáveis a antioxidantes sintéticos.
403
404
405 AGRADECIMENTO (S)
406 A Capes, a Fundação Araucária e CNPq pelo financiamento e ao Parque Tecnológico
407 Itaipú pela bolsa.
408
409
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531
532
533
534

27
535 4. CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies
536 Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária.
537
538 Revista Brasileira de Plantas Medicinais
539 Atividade antimicrobiana de extratos vegetais de seis espécies nativas do Brasil no
540 controle de Salmonella de origem aviária.
541 [Antimicrobial activity of extracts from plants native to Brazil control of Salmonella
542 as avian origin]
543
544 RESUMO
545 Avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos vegetais de seis plantas
546 nativas brasileiras frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de origem avícola. A
547 Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos
548 extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa),
549 Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-
550 branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle
551 L. (aroeira) foram determinadas por meio da técnica de microdiluição em caldo. Observou-
552 se a atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais
553 eficazes quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e
554 P.guajava, apresentaram as maiores atividades inibitórias. As CIMs variaram entre 1,56-
555 100 mg.mL-1 e a CBM entre 3,13-100 mg.mL-1. Esses resultados confirmaram o potencial
556 antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua
557 possível adição na alimentação de aves.
558
559 ABSTRACT
560 It was evaluated in vitro antimicrobial activity of extracts of six native Brazilian
561 plants against 36 serotypes of Salmonella from poultry products. The Minimum Inhibitory
562 Concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the ethanolic and
563 aqueous extracts of Maytenus aquifolium Mart. (thorn-saint), Myrciaria cauliflora (Mart.)
564 O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (cinnamon-white), Psidium guajava
565 L. (guava), Ricinus communis L. (castor) and Schinus molle L. (mastic-white) were
28
566 determined by broth microdilution technique. It was observed antimicrobial activity of all
567 the extracts tested, ethanol being the most effective when compared to aqueous. Ethanol
568 extracts of M. cauliflora and P. guajava showed the highest inhibitory activity. The MIC
569 ranged from 1.56 to 100 mg.mL-1 and CBM from 3.13 to 100 mg.mL-1. These results
570 confirmed the antimicrobial potential from these plant extracts, which deserve further
571 research addressing a possible addition in poultry feed.
572
573 Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático.
574
575 Key words: Salmonella, plant extracts, microdilution, bactericidal, bacteriostatic.
576
577 INTRODUÇÃO
578 O gênero Salmonella é um patógeno de difícil controle e comumente encontrado
579 em toda a cadeia de produção avícola e, consequentemente, na carne de frango, podendo
580 causar surtos de intoxicação alimentar em humanos e prejuízos econômicos à indústria
581 avícola (SHINOHARA et al., 2008). Fatores que contribuem para a patogenicidade de
582 Salmonella spp. são seu grande número de sorotipos, a capacidade de adaptação a vários
583 hospedeiros, além de sua predisposição de adquirir e transmitir alelos de resistência aos
584 antimicrobianos (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008a).
585 Uma vez que o uso intensivo de agentes antimicrobianos conduziu a seleção de
586 Salmonella spp. resistentes, bem como a presença de resíduos destes agentes
587 antimicrobianos na carne e derivados podem causar problemas ambientais e à saúde
588 humana (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008b), a utilização de produtos
589 naturais como potencial agente antimicrobiano chama a atenção das industrias na busca de
590 novos compostos que não agridam o meio ambiente (MESA-ARANGO et al., 2009).
591 Neste contexto, os extratos vegetais vêm ganhando espaço nas pesquisas para o
592 controle de diferentes micro-organismos patogênicos (NASCIMENTO et al., 2000;
593 LOGUERCIO et al., 2005; USHIMARU et al., 2007; GONÇALVES et al., 2005;
594 CARVALHO et al., 2009) e, por isso, tem-se buscado novas plantas, a fim de que os
595 extratos sejam considerados como um produto sanitário alternativo, seguro e saudável
596 quando comparado aos antimicrobianos sintéticos (DUARTE et al., 2004; LOVATTO et
29
597 al., 2012).
598 Não há dúvidas de que as plantas possuem propriedades biológicas, devido à rica
599 presença de princípios ativos, além de serem biodegradáveis e, o mais importante, serem
600 também abundantes e renováveis (GONÇALVES et al. 2005).
601 O Brasil ganhou destaque neste aspecto, por apresentar a maior biodiversidade do
602 planeta, e consequente potencial para o desenvolvimento de novos produtos de origem
603 vegetal. Além disso, muitas plantas têm sido utilizadas e testadas há dezenas de anos com
604 as mais diversas finalidades por populações do mundo inteiro (FERRONATO et al. 2007).
605 Contudo, grande parte das pesquisas realizadas mencionam testes de extratos frente
606 aos micro-organismos referência, sendo necessário o estabelecimento de parâmetros mais
607 precisos quanto ao real potencial antimicrobiano de extratos em diferentes sorotipos de
608 Salmonella, uma vez que se tem relatados de diversos sorotipos como responsáveis por
609 casos e surtos de salmonelose humana no Brasil e no exterior, muitos deles envolvendo
610 alimentos de origem avícola. (KOTTWITZ et al. 2008).
611 Nesta pesquisa, objetivou-se verificar o perfil de resistência dos diferentes
612 sorovares de Salmonella frente aos antimicrobianos sintéticos comumente utilizados na
613 avicultura, avaliar a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos e aquosos de seis
614 espécies vegetais nativas do Brasil e verificar a eficiencia dos diferentes extratores
615 testados.
616
617 MATERIAL E MÉTODOS
618 Micro-organismos
619 Cento e dezoito amostras de Salmonella provenientes de frango de corte de
620 diferentes aviários da região Oeste do Paraná foram obtidas em um Laboratório de
621 Sanidade Avícola no Paraná, credenciado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
622 Abastecimento (MAPA), durante o período de 2006 a 2010. A sorotipagem foi realizada
623 pelo Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil.
624 As amostras coletadas estavam distribuídas em trinta e seis sorotipos, e um
625 representante de cada sorotipo foi selecionado aleatoriamente para avaliar a suscetibilidade
626 aos extratos vegetais. Como cepa referência, utilizou-se a Salmonella Typhimurium ATCC
627 14028 (American Type Culture Collection).
30
628
629 Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos
630 A suscetibilidade aos antimicrobianos foi avaliada através da técnica de disco-
631 difusão de Kirby-Bauer conforme recomendações do “Clinical and Laboratory Standards
632 Institute” (CLSI, 2007) utilizando-se os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico (30
633 µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), cefalotina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg),
634 enrofloxacina (10 µg), estreptomicina (10 µg), imipenem (10 µg), gentamicina (10 µg),
635 norfloxacina (10 µg), sulfazotrin (25 µg), tetraciclina (30 µg) e tobramicina (10 µg).
636 Plantas utilizadas
637
638 Planta utilizadas
639 As plantas de Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa), Myrciaria cauliflora
640 (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-branca), Psidium
641 guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle L. (aroeira)
642 foram coletadas sempre pela manhã em diferentes localidades na região Oeste do Paraná,
643 sendo selecionadas baseando-se em suas atividades inibitórias reportadas anteriormente
644 (SANCHES et al., 2005; FENNER et al.. 2006; CAFFARINI et al., 2008; MACEDO-
645 COSTA et al., 2009; SANTOS-OLIVEIRA et al., 2009). Todas as plantas foram
646 identificadas e incorporadas no Herbário da Universidade Estadual do Oeste do Paraná
647 (UNOP).
648
649 Preparo extratos
650 As folhas coletadas foram secas a 40 ºC e moídas em moinho de facas até
651 granulometria inferior a 0,42 mm para obtenção do pó. Para a realização do extrato
652 etanólico, adicionou-se ao material vegetal triturado álcool etílico P.A. na proporção de
653 2:10 (p/v) para maceração por 24 h em agitador rotativo a 23 ºC. A concentração do extrato
654 realizou-se em evaporador rotativo a 40 ºC. O extrato obtido foi diluído com água destilada
655 estéril na concentração de 200 mg.mL-1 e filtrado em papel de filtro. Para a obtenção do
656 extrato aquoso, a maceração foi realizada utilizando-se como solvente extrator a água
657 destilada estéril, seguindo o mesmo padrão de concentração e filtragem do extrato
658 etanólico. Para ambos os extratos, uma última filtração a vácuo foi realizada, utilizando
31
659 uma membrana filtrante com porosidade de 0,45mm. As soluções foram armazenadas à 5
660 °C (BONA, 2012).
661
662 Determinação das concentrações inibitórias mínimas
663 As suspensões bacterianas foram diluídas a fim de se obter um inóculo na
664 concentração de 1 × 105 UFC.mL. A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da
665 microdiluição em caldo proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (15 µL) da diluição
666 foram distribuídas em placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo
667 Mueller Hinton (MH) (concentração dupla), com a adição anterior dos extratos. Os extratos
668 foram diluídos em concentrações entre 0,04 e 100 mg.mL-1. As placas foram incubadas a
669 36 °C por 24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de
670 10 µL de cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM
671 foi definida como a menor concentração do extrato em mg.mL-1 capaz de impedir o
672 crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004).
673
674 Determinação das concentrações bactericidas mínimas
675 A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al.
676 (2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM,
677 anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do
678 ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a
679 menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e
680 CBM foram realizados em triplicata.
681
682 RESULTADOS E DISCUSSÃO
683 No teste de suscetibilidade a antimicrobianos, 10 sorotipos de Salmonella
684 apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, sendo eles: Lexington (AMP-
685 CEF), Typhimurium e Infantis (GEN-NAL), Hadar (TET-NAL), Minnesota (NAL),
686 Cubana, Mbandaka, Newport, Enterica e Derby (TET). Porém, não foi estabelecida uma
687 relação entre o perfil de resistência destes sorotipos com a suscetibilidade aos extratos
688 (Tabela 1).
689 Informações sobre os sorotipos de Salmonella presentes no ambiente avícola,
32
690 quanto à prevalência, resistência a antimicrobianos e procedência são importantes fatores
691 para o controle de contaminação e transmissão. A verificação de que a atividade dos
692 extratos é independente da suscetibilidade aos antimicrobianos testados, é uma importante
693 constatação para incentivar a futura utilização dos extratos vegetais em substituição aos
694 antimicrobianos comerciais usados na alimentação de aves.
695 O extrato etanólico de M. cauliflora apresentou o maiores valores de CIM e CBM,
696 capaz de inibir o crescimento de todos os sorotipos, com a CIM variando entre 1,56 e 3,13
697 mg.mL-1 e CBM entre 3,13 e 6,25 mg.mL-1 (Tabela 1). Já o extrato aquoso apresentou CIM
698 e CBM entre 12,5 e 50 mg.mL-1 promovendo a inibição dos sorotipos Kentucky,
699 Corvallis, Cerro, Albany e Morehead a 12,5 mg. mL-1 (Tabela 2).
700 A atividade inibitória (bacteriostática e/ou bactericida) dos extratos da folha de M.
701 cauliflora pode estar relacionada à presença de compostos da classe do seu principal
702 constituinte, os taninos e em menores quantidades os flavonoides (SOUZA, 2007).
703 Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a
704 compostos ativos presentes nos extratos vegetais. Nas bactérias, a atividade antimicrobiana
705 dos taninos levam à formação de complexos entre os mesmos e a parede celular ou
706 enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a inibição do transporte de
707 nutrientes para a célula, consequentemente retardando o crescimento do micro-organismo
708 (McSWEENEY et al., 2001). Já os flavonoides possuem atividade antimicrobiana
709 decorrente da desestruturação da parede celular e consequentemente destruição bacteriana,
710 destacando-se componentes como a quercetina e rutina, intimamente empregados como
711 fitoterápicos (TAGURI te al., 2004). Como também sua atividade antimicrobiana pode se
712 dar devido à inibição da atividade da DNA girasse e inibição do metabolismo energético da
713 bactéria (CUSHNIE; LAMB, 2006). Os flavonoides possuem como característica a
714 capacidade de atuarem na relação entre planta e micro-organismo devido ao fato de que a
715 ingestão dos mesmos pode interferir em diversos processos fisiológicos, bem como
716 apresentar atividade antimicrobiana (MENEZES, 2005; DJERIDANE et al., 2006).
717 Para S. molle o extrato etanólico apresentou CIM de 50 mg.mL-1 frente aos
718 sorotipos Morehead e Panamá e de 100 mg.mL-1 para os demais, não sendo detectados
719 valores de CBM. Os valores de CIM para extrato aquoso foram de 100 mg.mL-1 para todos
720 sorotipos e novamente não foram detectados os valores de CBM.
33
721 Não foram encontradas na literatura pesquisas sobre as propriedades
722 farmacológicas dos extratos aquosos ou etanólicos de S. molle. Porém, CARVALHO et al.
723 (2013) relataram que os compostos presentes em maior frequência na família
724 Anarcadiaceae são terpenoides e flavonoides.
725 Os terpenóides são considerados importantes alternativas no controle de patógenos
726 multirresistentes aos antimicrobianos convencionais (ZHANG; BASU, 2003). Sabe-se que
727 estes compostos possuem efeitos prejudiciais a parede celular bacteriana provocando sua
728 lise celular (TURINA et al., 2006).
729 O extrato etanólico de R. communis apresentou valores de CIM entre 12,5 e 25
730 mg.mL-1 para a maioria dos sorotipos, exceto para Rissen que apresentou CIM de 50
731 mg.mL-1, Albany e Gallinarum de 100 mg.mL-1. A CBM variou de 25 mg.mL-1 a 100
732 mg.mL-1, e para 20 sorovares não foi detectável (Tabela 1). O extrato aquoso não
733 apresentou atividade inibitória para os sorotipos testados (Tabela 2).
734 A atividade inibitória de R. communis pode estar relacionada aos seus constituintes
735 como ricina e flavonoides como a rutina, antimicrobianos que atuam na inibição de
736 atividade enzimática dos micro-organismos (HENRIQUES et al., 2002). Um dos
737 problemas associados à utilização do extrato de mamona refere-se a presença de proteínas
738 tóxicas encontradas na mesma, das quais destaca-se a ricina. (JACKSON et al, 2006).
739 Sabe-se que esta é venenosa a humanos e insetos (LER, et al, 2006) podendo ser um fator
740 agravante para a utilização do extrato da mamona em ração de aves, sugerindo o
741 isolamento de compostos ou detoxicação do extrato.
742 Em relação ao extrato etanólico de P. guajava, observou-se inibição frente a todos
743 os sorotipos, sendo a CIM entre 3,13 e 6,25 mg.mL-1 e CBM 3,13 e 25 mg.mL-1 (Tabela
744 1). No entanto, o extrato aquoso apresentou atividade bacteriostática somente nas
745 concentrações mais elevadas (50-100 mg.mL-1) e atividade bactericida foi de 100 mg.mL-1
746 frente a aproximadamente 50% dos sorotipos, exceto Albany que apresentou CMB de 50
747 mg.mL-1 (Tabela 2).
748 A presença de compostos como cumarinas, flavonoides como quercetina,
749 terpenoides e taninos justifica a atividade inibitória de P. guajava (GUTIÉRREZ et al.,
750 2008; VARGAS-ALVAREZ et al., 2006). Foram encontradas na literatura relatos sobre a
751 atividade antimicrobiana de cumarinas (BASILE et al., 2009; CHIMENTI et al., 2010;
34
752 RAJA et al., 2011). Sua atividade antimicrobiana pode ser atribuída ao fato do anel de
753 cumarina levar à inibição da síntese do ácido nucleico bacteriano (ROSSELLI et al., 2007).
754 Provou-se que a adição de um grupo prenilo ao anel de cumarinas facilita a sua passagem
755 pela membrana bacteriana (STAVRI; GIBBONS, 2005).
756 Apenas o extrato etanólico de O. spixiana apresentou atividade antimicrobiana com
757 valores da CIM em 25 mg.mL-1 para todos os sorovares, exceto Senftenberg, que
758 apresentou CIM de 50 mg.mL-1. Em relação à CBM, 50% dos sorovares apresentaram
759 concentrações entre 50-100 mg.mL-1 (Tabela 1). Já o extrato aquoso não apresentou
760 atividade inibitória dentro do limite de detecção (Tabela 2).
761 Não foram encontrados estudos fitoquímicos de extratos de O. spixiana, entretanto,
762 ZANIN; LORDELLO (2007) reportaram a presença de compostos alcaloides em cinquenta
763 e quatro espécies do gênero Ocotea. Segundo SAWER et al. (2005), alguns alcaloides
764 inibem a ação de bactérias gram-negativas causando lise celular e mudanças morfológicas.
765 Contudo, a atividade antimicrobiana pode ter outro mecanismo de ação uma vez que o
766 composto é conhecido por ser inibidor de síntese de DNA através da inibição da
767 topoisomerase (GUITTAT et al., 2003).
768 Para M. aquifolium, seu extrato etanólico também apresentou atividade
769 bacteriostática frente a todos os sorotipos de Salmonella, variando de 25 a 6,25 mg.mL-1.
770 Contudo, a CBM foi determinada para menos de 40% dos sorotipos com valor de 100
771 mg.mL-1 exceto para S. Corvallis, pois, somente este sorotipo obteve a atividade
772 bacteriostática e bactericida nas concentrações de 6,25 mg.mL-1 e 12,5 mg.mL-1
773 respectivamente (Tabela 1). O extrato aquoso exibiu CIM de 50 a 100 mg.mL-1 para todos
774 os sorotipos e CBM maior do que o limite de detecção.
775 Embora não tenham sido encontrados na literatura trabalhos que explorem a
776 atividade de M. aquifolium, OLIVEIRA et al. (2009) afirmaram que o gênero Maytenus
777 possui propriedades fitoquímicas como a presença de terpenoides, taninos, alcaloides e
778 flavonoides, sendo compostos que podem atuar tanto na parede como na membrana da
779 célula.
780 Considerando os valores da CIM, foi possível verificar um potencial inibidor
781 decrescente dos extratos, sendo ele: M. cauliflora etanólico > P. guajava etanólico> M.
782 aquifolium etanólico > R. communis etanólico > M. cauliflora aquoso > O. spixiana
35
783 etanólico > M. aquifolium aquoso> P. guajava aquoso > S. molle etanólico > S. molle
784 aquoso.
785 De maneira geral, os extratos etanólicos apresentaram maior atividade inibitória
786 frente aos sorotipos de Salmonella quando comparados aos extratos aquosos. Devido à
787 diferença de polaridade, a extração aquosa e etanólica podem conferir a extração de
788 diferentes metabólitos, sendo a água capaz de extrair antocioninas, amidos, taninos,
789 saponinas, terpenoides, polipeptídeos e lecitinas, já o álcool, por sua vez, é responsável
790 pela extração além de taninos e terpenóides também de polifenois, poliacetilenos, esteróis,
791 alcaloides e os flavonoides (COWAN, 1999). Isto explica o fato de que em uma mesma
792 planta, diferentes extratos apresentarem resultados distintos. Como por exemplo, O.
793 spixina que devido à possível presença de alcaloides, que em sua maioria são extraídos
794 pelo etanol, justificando assim o fato da mesma não ter apresentado atividade no extrato
795 aquoso.
796 Além disso, a composição dos extratos pode também variar de acordo com as
797 condições ambientais, estações do ano em que foram coletadas, bem como, às diferentes
798 técnicas empregadas para avaliação da atividade, por não haver uma padronização
799 internacional para avaliação de extratos vegetais (ALVES et al., 2008; SANTURIO et al.,
800 2011). Desta forma, é notória a necessidade da padronização de técnicas para avaliar a
801 atividade de extratos vegetais com o intuito de corroborar e assegurar os resultados
802 encontrados.
803 A sensibilidade aos antimicrobianos e aos extratos testados variou dependente do
804 sorotipo, conforme descrito anteriormente por CARRAMIÑANA et al., (2004), que
805 testaram a suscetibilidade de Salmonella spp., frente a diferentes antimicrobianos e
806 relacionam essa variação, também, à origem dos sorotipos. A explicação pode ser devido
807 às pressões seletivas que os sorotipos podem sofrer de acordo com a utilização de
808 diferentes antimicrobianos desenvolvendo resistência (WHO, 2000).
809 Sugere-se a realização de testes de toxicidade para atestar a segurança no uso dos
810 extratos vegetais com potencial antimicrobiano. RIZZO et al. (2010) relatam que dietas de
811 frango de corte contendo misturas de extratos vegetais promovem desempenho semelhante
812 ao obtido com dietas contendo antibióticos, sem qualquer efeito sobre as características de
813 carcaça e a utilização da energia e da proteína das dietas, demonstrando a seguridade da
36
814 sua utilização em substituição aos antimicrobianos convencionais.
815 Com isso, espera-se que o presente estudo contribua para busca de produtos
816 alternativos que assegurem a produção avícola, baseados em um cultivo sustentável, que
817 respeite o meio ambiente e que reduza as contaminações produzidas por Salmonellas no
818 ambiente de criação aviário.
819
820 CONCLUSÃO
821 Os extratos testados apresentaram atividade inibitória em diferentes concentrações
822 sobre os sorotipos de Salmonella variando de acordo com o solvente extrator. A
823 suscetibilidade aos extratos variou entre os sorotipos de Salmonella, independente da
824 resistência apresentada aos antimicrobianos testados.
825
826 AGRADECIMENTO (S)
827 Ao Dr. Alberto Bach por ter cedido os sorovares de Salmonella, a Capes, a Fundação
828 Araucária e CNPq pelo financiamento e ao Parque Tecnológico Itaipú pela bolsa.
829
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978

42
 Tabela 1 – CIM e CBM de extratos vegetais etanólicos frente à sorotipos de Salmonell, isolados de
aviários no Oeste do Paraná.
EXTRATO ETANÓLICO CIM/CBM (mg.mL-1)
Perfil de
SOROTIPOS Resistência Mc Sm Rc Pg Os Ma
Morehead Sensível 3,13/6,25 50/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/100
Lexington AMP-CEF 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Give Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/100
Panamá Sensível 3,13/6,25 50/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/100
Typhimurium GEN-NAL 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Rissen Sensível 3,13/6,25 100/>LD 50/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/100
Albany Sensível 3,13/6,25 100/>LD 100/100 3,13/3,13 25/50 12,5/100
Gallinarum Sensível 1,56/6,25 100/>LD 100/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/100
Cerro Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/100
Infantis GEN-NAL 3,13/3,13 100/>LD 12,5/50 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Schwarzengrund Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Worthington Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Saintpaul Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Braenderup Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Montevideo Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Mbandaka TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Ohio Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/25 3,13/12,5 25/50 12,5/>LD
Agona Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/25 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Senftenberg Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 50/100 12,5/>LD
Corvallis Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 6,25/12,5
Hadar TET-NAL 1,56/3,13 100/>LD 50/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Grumpensis Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Gafsa Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 3,13/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Orion Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Tennessee Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/100 6,25/25 25/50 12,5/>LD
Cubana TET 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 6,25/6,12 25/>LD 25/>LD
Kentucky Sensível 1,56/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 25/>LD
Bareilly Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 3,13/12,5 25/50 25/>LD
Livingstone Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/50 25/>LD
Minnesota NAL 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Branderburg Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Enteritidis Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/25 6,25/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Newport TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Entérica TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Derby TET 1,56/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Heidelberg Sensível 3,13/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 2550 12,5/>LD
Typhimurium
ATCC Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/>LD
979 AMP: Ampicilina; CEF: Cefalotina; GEN: Gentamicina; NAL: Ácido Nalidixico; TET: Tetraciclina; >LD:
980 Maior que o limite de detecção; Mc: Myrciaria cauliflora; Sm: Schinus molle; Rc: Ricinus communis; Pg:
981 Psidium guajava; Os: Ocotea spixiana; Ma: Maytenus aquifolium.
982

43
 Tabela 2 – Perfil de resistência antimicrobiana, CIM e CBM de extratos vegetais aquosos frente
à sorovares de Salmonella, isolados de aviários no Oeste do Paraná.
EXTRATO AQUOSO CIM/CBM (mg.mL-1)
SOROTIPOS CLO Mc Sm Pg Ma
Morehead 0,04 12,5/12,5 100/>LD 50/50 50/>LD
Lexington 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Give 0,04 12,5/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Panamá 0,04 25/50 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Typhimurium 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Rissen 0,04 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Albany 0,09 12,5/12,5 100/>LD 50/50 50/>LD
Gallinarum 0,09 50/50 100/>LD 50/100 50/>LD
Cerro 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 50/>LD
Infantis 1,5 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Schwarzengrund 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Worthington 0,09 25/50 100/>LD 100/100 100/>LD
Saintpaul 0,04 25/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Braenderup 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Montevideo 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Mbandaka 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Ohio 0,04 25/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Agona 0,09 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Senftenberg 1,5 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Corvallis 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 100/>LD
Hadar 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Grumpensis 0,09 12,5/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Gafsa 0,09 50/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Orion 0,09 50/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Tennessee 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Cubana 0,04 25/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Kentucky 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 50/>LD
Bareilly 0,09 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Livingstone 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Minnesota 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Branderburg 0,15 25/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Enteritidis 0,15 25/50 100/>LD 50/100 50/>LD
Newport 0,04 25/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Entérica 0,04 25/25 100/>LD 50/100 100/>LD
Derby 0,15 12,5/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Heidelberg 0,15 25/25 100/>LD 50/100 50/>LD
Typhimurium
ATCC 0,15 12,5/25 100/>LD 50/100 50/>LD
983 >LD: Maior que o limite de detecção; CLO: cloranfenicol; Mc: Myrciaria cauliflora; Sm: Schinus molle; Rc:
984 Ricinus communis; Pg: Psidium guajava; Os: Ocotea spixiana; Ma: Maytenus aquifolium.
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49
4
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PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A.
Produtos naturais: Atualidade, desafios e pespectivas. Quimica Nova, v. 25, p. 45-61,
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50
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SINDIAVIAPAR. Sindicato e Associação dos Abatedouros e Produtores Avícolas do

Paraná. Ed. nº 34 Mai/Jun 2013. Disponível em: <
http://www.sindiavipar.com.br/pdfs/34-edicao.pdf> Acesso 09 junho 2013.

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TACCONELLI, E.; DE ANGELIZ, G.; CATALDO, M.A.; MANTENGOLI, E.; SPANU,

T.; PAN, A.; CORTI, G.; RADICE, A.; STOLZUOLI, L.; ANTINORI, S.; PARADISI, F.;
CAROSI, G.; BERNABEI, R.; ANTONELLI, M.; FADDA, G.; ROSSOLINI, G.M.;
CAUDA, R. Antibiotic Usage and Risk of Colonization and Infection with Antibiotic-
Resistant Bacteria: a Hospital Population-Based Study. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v.53, n.10, p.4264-4265, 2009.

TAVARES, E. S; JULIÃO, L. S; LOPES, D; BIZZO, H. R; LAGE, C. L. S; LEITÃO, S.

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VAN DUIJKEREN, E.; WANNET, W.J.; HOUWERS D.J.; VAN PELT, W..
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chickens in the Netherlands from 1984 to 2001. Journal of Clinical Microbiology, v.41,
n.8, p.3574–3578, 2003.

51
5
1
YUNES, R. A.; PEDROSA, R. C.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a
necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil.
Química Nova,v. 24, n. 01, p.147-152, 2001.

52
5
2
ANEXOS

53
5
3
Anexo 1 - Normas da Revista Cap. 1

Journal of Food, Agriculture & Environment

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Tamanho
Normalmente, um manuscrito não deve exceder 30 páginas, espaçamento 1,5, 12
fontes, incluindo todos os materiais relevantes. Qualquer manuscrito submetido que é
muito longo pode ser devolvido ao autor correspondente para reformulação.
Texto datilografado
A cópia do manuscrito deve ser digitado em espaçamento 1,5 em um lado do A4 ou
8 ½ paper "× 11" com 2,5 cm de largura na margem esquerda, direita, superior e inferior.
Sublinhando para indicar o tipo itálico (ou o uso de itálico no original) deve ser restrito a
nomes de espécies em geral e, e descritores químicos (por exemplo, cis, trans, etc.). Não
sublinhar quaisquer títulos. As notas de rodapé devem ser mantidas a um mínimo e
indicado por *. Não use pontos finais após as abreviaturas, a não ser essencial para
entendimento. Abreviaturas dos nomes químicos e outros devem ser definidos quando
mencionado pela primeira vez no corpo do trabalho, a não ser comumente usado e
internacionalmente conhecido e aceito.

Unidades e nomenclatura
Use unidades SI de acordo com as recomendações da Organização Internacional de
Normalização (ISO). Utilize o formulário g kg-1ETC (não%) para especificar o conteúdo /
composição / concentração. Use %, apenas para expressar a mudança proporcional. Note-
se que a forma g 100g-1, etc não é correto. Evite o uso de g por 100 g, por exemplo, na
composição de alimentos / alimentação, em vez disso usar g kg-1. As doses de fertilizantes
deverão ser apresentados em termos do elemento aplicado. Mais informações sobre as
recomendações da ISO pode ser obtido a partir da seguinte publicação emitida pelo British
Standards Institution, Londres: Especificação para unidades SI e recomendações para o uso
de seus múltiplos e de algumas outras unidades, BS 5555:1993 ISO 1000:1992.

Símbolos

54
5
4
 Escrever todos os símbolos, fórmulas e equações com muito cuidado. Símbolos
usuais (incluindo letra grega) deve ser definido em palavras na margem esquerda, na
primeira menção.

Os nomes científicos
Dê os nomes científicos (com autoridade) para plantas, animais, micro-organismos,
com nomes genéricos, na íntegra, a primeira menção, por exemplo, Myzus persicae
(Sulzer). Seguidamente, abreviar-los neste texto, por exemplo, M. persicae, dar-lhes na
íntegra (sem autoridade) nos títulos das seções, tabelas, figuras e palavras-chave. Sempre
que necessário, as cultivares devem ser especificados.

Nomenclatura enzima
Identificar cada enzima, juntamente com o seu número CE, se disponível, na primeira
menção, seguindo as recomendações da última edição da nomenclatura enzimática.

Nomenclatura química
Use a atual sistemática nomenclatura IUPAC por toda parte.

As análises estatísticas
Um cuidado especial deve ser tomado para garantir que as análises estatísticas
apropriadas foram realizadas. Os métodos utilizados devem ser descritas de forma concisa,
ainda informação suficiente para explicar como os métodos escolhidos tenham sido
aplicados aos dados. A forma de todos os erros experimentais e sua significância estatística
deve ser dada de forma clara. As análises estatísticas devem ser utilizados na discussão
para justificar inferências feitas no contexto de variação biológica normal.

Traçado
O corpo principal do trabalho deve ser dividido em seções não numeradas, e cada
um de um título apropriado. Principais títulos devem ser na esquerda sobre o texto (11
fontes, negrito). Escolha das posições vai depender do conteúdo, mas o seguinte é
recomendado para trabalhos de investigação:

55
5
5
Título: deve ser conciso, curto, específico e explicar a natureza da obra.

Título do manuscrito (14 fontes, negrito, como "Food conssumption na Finlândia")

3 espaço de linha
O autor (s) nome (s) de (começando com nome próprio, depois da família, 11 fontes,
negrito).
Os nomes dos autores, cada um deve ter o apelido habitual na íntegra e iniciais (por
exemplo, William. B. Jain). Indicar o endereço completo (es) onde o trabalho foi feito, e
incluem todos os endereços do autor correspondente e todos os co-autor (es), se possível
por e-mail.

Para facilitar a correspondência, por favor manter o escritório Editorial JFAE informado de
quaisquer alterações em seu endereço, e-mails e telefone ou número de fax.

2 espaço de linha

Resumo
O resumo deve ser informativo ou conciso, dando uma visão geral e informações
essenciais, tais como o fim do trabalho, os dados dele derivados e sua significância
estatística, e ser inteligível sem referência ao próprio papel. Ele não deve normalmente
exceder 400 palavras, mas não menos do que 250 palavras. Os autores devem se lembrar
que o resumo é muitas vezes a única parte de um artigo lido, como na abstração revistas,
bem como a utilização de siglas ou abreviaturas incomuns devem ser evitados.

2 espaço de linha (para o resto das subseções)

Palavras-chave:

56
5
6
Liste os principais temas incorporados no papel, incluindo qualquer dado já no título.
(Preferencialmente mais do que 10 palavras-chave)

Introdução
Incluir uma descrição clara dos objetivos do inquérito (sem resumindo o trabalho em si), e
uma breve exposição dos trabalhos anteriores relevantes com referências. Para artigos de
revisão, indicam claramente o âmbito da análise, tais como áreas temáticas, área geográfica
ou período coberto na revisão.

Material e métodos
Descrever claramente em detalhes suficientes para permitir que o trabalho possa ser
repetido. Só as novas técnicas e modificações aos métodos conhecidos necessitam serem
descritos em detalhe, mas deve ter métodos conhecidos e referências adequadas. Incluir o
nome, cidade, país e código do fornecedor ou fabricante de qualquer produto químico ou o
aparelho não estiver em uso comum. Dê o delineamento estatístico (incluindo replicação)
de cada experimento onde apropriado.

Resultados
Apresentá-los de forma concisa, o uso de tabelas e ilustrações, para maior clareza,
não repetir a lista dos resultados no texto. Indicar claramente a forma do erro experimental
e a significância estatística dos resultados. Não exagerar a precisão das medições. Gráficos
histogramas ou barras, a menos preparada cuidadosamente, são inferiores às tabelas. Só em
circunstâncias excepcionais será ambas as tabelas e ilustrações com base no mesmo
conjunto de dados / ser aceito medições. As seções experimentais e os resultados podem
ser combinados quando apropriado.

Discussão

57
5
7
 Os resultados devem seguir uma seção concisa para discutir e interpretá-los. Por
favor, não basta repetir os resultados. Um combinado de resultados e seção de discussão às
vezes simplifica a apresentação.

Conclusões
Não se limitam a repetir o conteúdo das secções anteriores. As seções de discussão
e as conclusões não podem ser mescladas.

Agradecimentos
Mantenha-os ao mínimo absoluto.

Referências
Verifique cuidadosamente para precisão e seguir o estilo correto. Referem-se a
trabalhos inéditos apenas no texto (William MN não publicado), (Brown CD pers comm).
Indicar referências bibliográficas no local apropriado no texto utilizando números
sobrescritos, na ordem em que eles aparecem e uma lista numérica completa deve aparecer
no final do artigo, dando a todos os autores com as iniciais após o respectivo apelido.
Certifique-se de que todas as referências da lista são citados no texto e vice-versa. Dê a
data e o título completo do artigo no idioma em que ele apareceu ou uma tradução exata
Inglês. Abreviar todos os títulos de periódicos, como no Chemical Abstracts ou Biological
Abstracts e o BIOSIS, sem usar pontos finais após a abreviatura. Se a revista não está
incluída, dar o seu título na íntegra. Números de volume deve ser em negrito.

Observe o seguinte estilo e ordem para citação:

Um artigo com um ou mais autores

1
Hiilovaara-Teijo, M., Hannukkala, A., Griffith, M., Yu, X.-M., e Pihakaski-Maunsbach,
K. 1999. Proteínas apoplástica Snow-molde induzidas pelo centeio de inverno deixa
actividade anticongelante falta. Plant Physiol. 121: 665-674.

Um artigo publicado em um livro

58
5
8
2
Bradfort, ML, Kangas L., e Nordlund, G. 1990. Cálculos do modelo de enxofre e
deposição de nitrogênio na Finlândia. In: Kauppi, P. et ai. (Eds.). Acidificação na
Finlândia. Berlin: Springer-Verlag. p. 167-197.

Um livro com um ou mais autores

3
ARC 1984. As exigências nutricionais dos ruminantes. Suplemento No. 1. Técnico
revisão por um partido de Pesquisa Agropecuária Conselho de trabalho, Commonwealth
Agricultural Bureaux, Slough, Reino Unido. 45 p.
4
Lominadze, D.G. 1981. Cyclotrone ondas no plasma. 2nd ed. Oxford: Pergamon Press.
206 p.
5
Møller, J., Th ¸ Gersen, R., Kjeldsen, AM, Weisbjerg, MR; øegaard, K., Hvelplund, T., e
6
Børsting, CF 2000. Fodermiddeltabel. Sammensætning og foderværdi af fodermidler til
7
kvæg. Rapport 91. Århus: Landbrugets Rådgivningscenter. 52 p.
8
Senauer, B., Asp, E., e Kinsey, J. 1991. Tendências de alimentos e os consumidores a
mudar. St. Paul, MN: Eagan Press.

Documentos de conferências
1
Petit, M., Garel, JP, D'Hour, P., e Agabriel, J. 1995. O uso de forragens pelo rebanho de
bovinos de corte. In: Journet, M. et ai. (Eds.). Desenvolvimentos recentes na nutrição dos
herbívoros. Anais do IV Simpósio Internacional sobre a Nutrição de herbívoros. Paris:
edições do INRA. p. 473-496.
2
Niskanen, M. 1990. A adsorção de zinco e aumento da concentração de zinco planta após
a aplicação de zinco em solos minerais da Finlândia. Transações do 15 º Congresso
Mundial de Ciência do Solo, Acapulco, México. 5b: 395-396.
Ao citar patentes dar o nome do candidato, o ano de publicação, o título, o país e de
patentes ou número do pedido, por exemplo:
3
Hilton MS e Williams ML. 1980. Método de classificação de sementes. A Patente UK
1.777.888.

Abreviaturas
O Sistema Internacional de Unidades (SI) deve ser usado. Nomes comuns aceitos
dos ingredientes ativos de formulações químicas devem ser usados de preferência a nomes

59
5
9
comerciais, e confirmou a códigos internacionalmente reconhecidos de nomenclatura.
Nomes latinos genéricas e específicas devem ser digitados em itálico.

Tabelas
As tabelas com dados numéricos deve ser mantido a um mínimo, e deve incluir
apenas a informação essencial (com o nível de erros significativos). Todas as tabelas,
gráficos ou fotos devem ser inseridas no corpo do texto. Cada tabela deve ter um título
auto-explicativo conciso e abreviaturas utilizadas devem ser definidos diretamente abaixo
das tabelas. Pontos finais, mas não vírgulas, devem ser utilizados como pontos decimais.
Ao preparar tabelas com um processador de texto, por favor, note que a chave de
tabulação, e não a barra de espaço, devem ser utilizados para alinhar as colunas.
Procedimentos mesa de decisões também pode ser usado.

Figuras (desenhos e fotografias)

As figuras devem ser selecionados tendo em consideração o formato da folha
impressa, para permitir o efeito de um potencial de redução (menos do que 33%) no
tamanho. Caracteres alfabéticos ou numéricos deve ser de pelo menos 1,5 mm de altura na
impressão. As figuras devem ser numeradas consecutivamente em algarismos arábicos, ea
sua posição deve ser indicada na margem. Todas as legendas de figuras devem ser
impressos na mesma folha para cada figura. Desenhos reproduzidos com uma impressora
laser de alta qualidade são os preferidos. Fotografias, se usada, deve ser de bom contraste e
impressos em papel brilhante. Todas as figuras, fotografias ou tabelas deve ser apresentado
no corpo do texto. Por favor, não use utilizar quaisquer ilustrações digitalizadas.

Por favor, use 300 dpi para 600 dpi na digitalização de suas fotos ou gráficos para
evitar a má qualidade de impressão. Por favor, reduzir o tamanho do seu arquivo.
Sempre que possível, ilustrações também devem ser enviados pelo correio aéreo e
apresentada em formato eletrônico (salvo em CD, juntamente com o texto da cópia
impressa) ou enviadas como (email / MSword.version). Também salvar cada figura como
um arquivo separado, em formato TIFF ou EPS de preferência, e incluir o arquivo de
origem. Escrever no disco o software usado para criar os arquivos. Use pacotes de
ilustração dedicadas em detrimento de ferramentas como Excel ou PowerPoint.

60
6
0
 Desenhos de linhas e figuras devem estar em um formato adequado para
reprodução direta, não maior do que A4 ou 8 ½ "x 11", em tinta preta, com letras
estampado (evitar o uso de transferência seca, datilografada ou lettering manuscrito), todos
na proporção da quantidade de detalhe. Diagramas de computador desenhados devem ser
preparados em um laser de alta qualidade ou impressora jato de tinta ou plotter, e não em
uma impressora matricial ou equivalente.
Use apenas caracteres essenciais e inserir esses e quaisquer outros símbolos
claramente, explicar todos os símbolos usados, e onde é necessária uma chave para os
símbolos, por favor, inclua isto no trabalho artístico, e não na legenda da figura. Em
gráficos, incluem rótulos e unidades nos eixos. Apresente com escalas logarítmicas
aritmética numeração 0,1, 1, 10, 100, em vez de -1, 0, 1, 2. Evite desnecessariamente
longos eixos que levam a grandes espaços em branco em gráficos.
Linhas de desenho e figuras devem todos requerem o mesmo grau de redução e de
todos os caracteres devem ser escolhidos de modo que, após a redução que são pelo menos
1,5 mm de altura. A área tipo do Jornal são de 172 mm de largura x 249 milímetros de
profundidade, em duas colunas cada 81 milímetros de largura, e os personagens devem,
portanto, ser grande o suficiente para ser legível após a redução das ilustrações para caber
na página ou a largura da coluna.
Fotografias (meios-tons) deve ser fornecido como impressões brilhantes (quatro cópias
originais de cada) de bom contraste, fotocópias não são aceitáveis. Não permitir que sejam
danificadas por clipes de papel, etc dobragem Alguma perda de clareza pode ocorrer
durante a reprodução.

As estruturas químicas
Prepare-se estes em folha separada, tal como descrito para as ilustrações eo número
fórmulas indivíduo com algarismos romanos (I, II). Todas as obrigações, encargos e
radicais livres deve ser posicionado com precisão. Indique sistemas heterocíclicos
aromáticos e insaturados, utilizando ligações duplas. De preferência use estruturas gerais,
distinguindo compostos relacionados por substituintes R1, R2, etc.

O texto deve ser escrito em Inglês gramaticalmente correta e bem estruturada em termos de
estilo e conteúdo. Manuscritos mal escrito, não serão considerados para publicação.

61
6
1
 Primeiro você deve enviar-nos por e-mail um pequeno resumo de seu artigo, então
vamos decidir se o papel se encaixa no escopo da revista JFAE (leia mais).
Se o artigo é adequado um manuscrito de corpo inteiro devem ser enviadas a pelo
menos dois ou três revisores externos (falante nativo Inglês) antes de enviá-lo para a
revista JFAE.
Nomes completos e endereços, incluindo e-mails dos dois ou três revisores devem
ser mencionados na carta final. Documentos sem revisão adequada será rejeitada.
Uma vez que o manuscrito está totalmente revisto, melhorado e corrigido, você
pode enviá-lo primeiro por e-mail (MS Word), por favor, verifique o seu manuscrito
(linguagem, símbolos, equações, referências, teste estatístico, utilize 300 dpi para 600 dpi
na digitalização de fotos Mas não digitalizar figuras ou tabelas, basta usar os originais).
Se o seu manuscrito contém símbolos, gráficos ou tabelas complicadas equações etc, nós
convidamo-lo a enviar por correio aéreo, uma versão eletrônica salva em um CD em um
formato compatível com o MS Word, mais uma cópia do manuscrito. Isto irá permitir-nos
de verificar cuidadosamente todos os símbolos, equações, sinais etc usados em seu texto
(incluir cópias originais de fotografias, etc.) Por favor, inclua todas as tabelas ou fotos
dentro do corpo do texto.

Por favor, note que o manuscrito inadequada ou incorreta serão rejeitadas. O Inglês do
manuscrito devem ser verificados por pelo menos dois cientistas ingleses nativos ou três
especialistas em linguagem.
 Os autores receberão por e-mail um aviso de recepção de seu trabalho (s).
 Manuscrito só aceito (s) será publicado dentro de um curto período de
tempo. O período estimado varia entre 3 e 6 meses.
 A prova galera só será enviado por e-mail (arquivo pdf) para o autor
correspondente. Pedimos a todos os seus e-mails e endereços postais
completos em seu manuscrito.
 Nosso escritório deve receber pelo correio aéreo (sem e-mails) a forma de
direitos de autor e assinado a taxa de publicação antes do prazo, caso
contrário, vamos adiar a publicação do texto (s).
 Quando o escritório do editor recebe os documentos solicitados antes do
prazo, vamos enviar pelo correio aéreo a cópia impressa da revista ao autor
correspondente (reprints se pago, será enviado anteriormente), apenas. No

62
6
2
 entanto, co-autores poderão adquirir cópia extra da revista (s) ou algumas
reimpressões.
Ao preparar um manuscrito, os autores devem se referir a uma edição recente da
revista (versão impressa ou on-line ou em um artigo de amostra que pode ser baixado a
partir de www.world-food.net). Mencione o nome das seções em que seu artigo deve ser
considered.Check área sujeita revista.
O manuscrito deve ser acompanhado por uma carta de transmissão (enviada por e-
mail ou pelo correio aéreo), no qual o autor pode especificar o nome de usuários que
revisaram o manuscrito mais três ou mais potenciais árbitros, incluindo os seus endereços
completos, telefone e números de fax , endereços de e-mail, e áreas de especialização.
As instruções detalhadas para a preparação do manuscrito são apresentados abaixo.
O autor correspondente deve obter o consentimento de todos os co-autores para a
apresentação do manuscrito. Também é necessário um formulário de submissão do
manuscrito. (Por favor, adicionar endereços de correio completo e todos os e-mails dos co-
autores). Os trabalhos somente serão aceitos no entendimento de que os conteúdos não
foram publicados nem estão sendo considerados para publicação em outros lugares.
O autor correspondente (s) deve fazer muito certo de que todos os apresentados
originais de pesquisa artigos, comentários ou notas foram revisadas por cientistas ingleses
nativos. Assim que recebermos o seu contributo, os nossos especialistas vai passar por isso
mais uma vez. O manuscrito aceito ou outras contribuições serão publicadas tanto na
versão impressa e on-line da revista. O conselho Editorial da revista pode pedir autores
para apresentar informações ou ilustrações adicionais, tais como fotos em GIF ou JPEG
para a revista on-line, eo formato TIFF para a revista impressa.
O texto deve ser escrito em Inglês gramaticalmente correta e bem estruturada em
termos de estilo e conteúdo. Manuscritos mal escrito, não serão considerados para
publicação.
Uma vez que o manuscrito for aceito para publicação, o autor correspondente será
solicitado para enviar ou atribuir direitos sobre o artigo para WFL Editor Oy antes do
prazo. Caso contrário, a publicação do documento, que será adiada.

Taxas
Os autores serão informados por e-mail uma vez que seus manuscritos chegaram a
nossa redação. Depois de um processo de revisão (entre 3 e 6 meses), nós lhe enviaremos

63
6
3
por e-mail uma nota de aceitação ou não aceitação para publicação do manuscrito. Se o
manuscrito for aceito, nós lhe enviaremos por e-mail a carta de aceitação, a forma de
direitos de autor e os pub.fees.
Cobramos as taxas de publicação pelo número de páginas (excluindo impostos,
custos de envio ou taxas de manipulação). A fatura será enviada por e-mail.
Antes da revista ser impressa, só aqueles que pagaram as taxas de publicação
receberão por e-mail (arquivo PDF) a prévia para uma verificação rápida e final. Nós,
portanto, pedimos para nos enviar todos os seus e-mails. Por favor, certifique-se que seu
endereço postal esteja completo e correto, de modo que você vai receber uma cópia
impressa da revista. Nós não podemos voltar a enviar duas vezes a mesma revista por
causa do alto custo de impressão e postagem.
Por favor, encurtar o seu manuscrito, porque se o comprimento é mais do que cinco
páginas, um custo adicional de € 25 / € 15 (desenvolvidos / países em desenvolvimento)
por página (excluindo o custo de envio) será adicionado.
Autor (es) cuja biblioteca ou departamento subscreve a revista (ou comprado alguns
livros da editora WFL) beneficiarão de um desconto.
Um tamanho de página A4: espaço duplo, fonte 12, margens: 2,5 carga da página:
Manuscritos aceitos serão publicados com o entendimento de que o autor irá pagar uma
taxa que abrange: manuscrito publicação, análise entre pares, edição de texto, design,
administração e envio.
Países desenvolvidos pagam a taxa de € 60 e países em desenvolvimento € 40 - Um
tamanho de página A4: espaço duplo, fonte 12, margens: 2,5.
Manuscritos apenas aceitos serão publicados entre 3 e 6 meses.
O JFAE promove a rápida publicação de trabalhos de pesquisa ou revisão. Durante
os últimos anos, o tempo total para análise entre pares, edição de texto e publicação
reduziu drasticamente. Para rápida avaliação, os autores podem submeter seus manuscritos
por meio de e-mail.
Nosso objetivo é informar os autores da decisão sobre o seu manuscrito a primeira
hora. Após a aceitação do manuscrito, sob a forma de direitos de autor assinado juntamente
com a cópia das taxas de publicação devem ser enviadas por correio registado antes do
prazo e do papel normalmente será publicado no próximo número disponível (§: política
revista).

64
6
4
Anexo 2 - Normas da Revista Cap. 2

Revista Brasileira de Plantas Medicinais

Normas Editoriais
A Revista Brasileira de Plantas Medicinais - RBPM é publicação trimestral,
exclusivamente eletrônica a partir de 2012, e destina-se à divulgação de trabalhos
científicos originais, revisões bibliográficas, e notas prévias, que deverão ser inéditos e
contemplar as grandes áreas relativas ao estudo de plantas medicinais. Manuscritos que
envolvam ensaios clínicos deverão vir acompanhados de autorização da Comissão de
Ética pertinente para realização da pesquisa. Os artigos podem ser redigidos em português,
inglês ou espanhol, sendo obrigatória a apresentação do resumo em português e em inglês,
independente do idioma utilizado. Os artigos devem ser enviados por e-
mail: rbpm.sbpm@gmail.com, com letra Arial 12, espaço duplo, margens de 2 cm, em
"Word for Windows". Os artigos, em qualquer modalidade, não devem exceder 20
paginas. No e-mail, enviar telefone para eventuais contatos urgentes.

Para a publicação, os artigos aprovados submetidos à RBPM a partir de 1º de

Abril de 2013 (inclusive), terão custo de tramite de 300 reais (trezentos reais) a ser
efetivado pelos autores/responsáveis somente na ocasião do recebimento da carta de
aceitação do artigo, quando receberão o respectivo boleto e instruções para o pagamento.

Forma e preparação de manuscritos

ARTIGO CIENTÍFICO

Os artigos deverão ser organizados em:

TÍTULO: Deverá ser claro e conciso, escrito apenas com a inicial maiúscula, negrito,
centralizado, na parte superior da página. Se houver subtítulo, deverá ser em seguida ao
título, em minúscula, podendo ser precedido de um número de ordem em algarismo
romano. Os nomes comuns das plantas medicinais devem ser seguidos pelo nome
científico (binômio latino e autor) entre parênteses.

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AUTORES: Começar pelo último sobrenome dos autores por extenso (nomes
intermediários somente iniciais, sem espaço entre elas) em letras maiúsculas, 2 linhas
abaixo do título. Após o nome de cada autor deverá ser colocado um número sobrescrito
que deverá corresponder ao endereço: instituição, endereço da instituição (rua e número
ou Caixa Postal, cidade, sigla do estado, CEP, e-mail). Indicar o autor que deverá receber
a correspondência. Os autores devem ser separados com ponto e vírgula.

RESUMO: Deverá constar da mesma página onde estão o título e os autores, duas linhas
abaixo dos autores. O resumo deverá ser escrito em um único parágrafo, contendo
objetivo, resumo do material e método, principais resultados e conclusão. Não deverá
apresentar citação bibliográfica.

Palavras-chave: Deverão ser colocadas uma linha abaixo do resumo, na margem

esquerda, podendo constar até cinco palavras.

ABSTRACT: Apresentar o título e resumo em inglês, no mesmo formato do redigido em

português, com exceção do título, apenas com a inicial em maiúscula, que virá após a
palavra ABSTRACT.

Key words: Abaixo do Abstract deverão ser colocadas as palavras-chave em inglês,

podendo constar até cinco palavras.

INTRODUÇÃO: Na introdução deverá constar breve revisão de literatura e os objetivos

do trabalho. As citações de autores no texto deverão ser feitas de acordo com os seguintes
exemplos: Silva (1996); Pereira & Antunes (1985); (Souza & Silva, 1986) ou quando
houver mais de dois autores Santos et al. (1996).

MATERIAL E MÉTODO (CASUÍSTICA): Deverá ser feita apresentação completa das

técnicas originais empregadas ou com referências de trabalhos anteriores que as
descrevam. As análises estatísticas deverão ser igualmente referenciadas. Na metodologia
deverão constar os seguintes dados da espécie estudada: nome popular; nome científico
com autor e indicação da família botânica; nome do botânico responsável pela
identificação taxonômica; nome do herbário onde a exsicata está depositada, e o
respectivo número (Voucher Number); época e local de coleta, bem como, a parte da

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6
planta utilizada.

RESULTADO E DISCUSSÃO: Poderão ser apresentados separados, ou como um só

capítulo, contendo a conclusão sumarizada no final.

AGRADECIMENTO: deverá ser colocado neste capítulo (quando houver).

REFERÊNCIA: As referências devem seguir as normas da ABNT 6023 e de acordo com

os exemplos:

Periódicos:
AUTOR(ES) separados por ponto e vírgula, sem espaço entre as iniciais. Título do
artigo. Nome da Revista, por extenso, volume, número, página inicial-página final, ano.

KAWAGISHI, H. et al. Fractionation and antitumor activity of the water-insoluble residue

of Agaricus blazei fruiting bodies. Carbohydrate Research, v.186, n.2, p.267-73, 1989.

Livros:
AUTOR. Título do livro. Edição. Local de publicação: Editora, Ano. Total de páginas.
MURRIA, R.D.H.; MÉNDEZ, J.; BROWN, S.A. The natural coumarins: occurrence,
chemistry and biochemistry. 3.ed. Chinchester: John Wiley & Sons, 1982. 702p.

Capítulos de livros:

AUTOR(ES) DO CAPÍTULO. Título do Capítulo. In: AUTOR (ES) do LIVRO. Título

do livro: subtítulo. Edição. Local de Publicação: Editora, ano, página inicial-página final.
HUFFAKER, R.C. Protein metabolism. In: STEWARD, F.C. (Ed.). Plant physiology: a
treatise. Orlando: Academic Press, 1983. p.267-33.

Tese ou Dissertação:
AUTOR. Título em destaque: subtítulo. Ano. Total de páginas. Categoria (grau e área de
concentração) - Instituição, Universidade, Local.

OLIVEIRA, A.F.M. Caracterização de Acanthaceae medicinais conhecidas como

anador no nordeste do Brasil. 1995. 125p. Dissertação (Mestrado - Área de
Concentração em Botânica) - Departamento de Botânica, Universidade Federal de

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Pernambuco, Recife.

Trabalho de Evento:
AUTOR(ES). Título do trabalho. In: Nome do evento em caixa alta, número, ano,
local. Tipo de publicação em destaque... Local: Editora, ano. página inicial-página
final.
VIEIRA, R.F.; MARTINS, M.V.M. Estudos etnobotânicos de espécies medicinais de uso
popular no Cerrado. In: INTERNATIONAL SAVANNA SYMPOSIUM, 3., 1996,
Brasília. Proceedings… Brasília: Embrapa, 1996. p.169-71.

Publicação Eletrônica:
AUTOR(ES). Título do artigo. Título do periódico em destaque, volume, número,
página inicial-página final, ano. Local: editora, ano. Páginas. Disponível em:
<http://www........>. Acesso em: dia mês (abreviado) ano. PEREIRA, R.S. et al. Atividade
antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Revista de
Saúde Pública, v.38, n.2, p.326-8, 2004. Disponível em:http://www.scielo.br. Acesso em:
18 abr. 2005.

Não citar resumos e relatórios de pesquisa, a não ser que a informação seja muito
importante e não tenha sido publicada de outra forma. Comunicações pessoais devem ser
colocadas no rodapé da página onde aparecem no texto e evitadas se possível. Devem ser
também evitadas citações do tipo: Almeida (1994) citado por Souza (1997).

TABELAS: Devem ser inseridas no texto, com letra do tipo Arial 10, espaço simples. A
palavra TABELA (Arial 12) deve ser em letras maiúsculas, seguidas por algarismo
arábico; já quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas (Tabela).

FIGURAS: As ilustrações (gráficos, fotográficas, desenhos, mapas) devem ser em letras

maiúsculas seguidas por algarismo arábico, Arial 12, e inseridas no texto. Quando citadas
no texto devem ser em letras minúsculas (Figura). As legendas e eixos devem ser em Arial
10, enviadas em arquivos separados, com resolução 300 DPI, 800x600, com extensão JPG
ou TIFF, para impressão de publicação.

Processo de avaliação: Os manuscritos são analisados por, pelo menos, dois pareceristas,

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segundo um roteiro de análise baseado principalmente no conteúdo científico. Os
pareceristas recomendarão a aceitação com ou sem necessidade de retornar; recusa, ou
sugerir reformulações, e que, neste caso, o artigo reformulado retornará ao parecerista até
que a avaliação seja concluída. Quando no mínimo 2 pareceristas aprovarem, sem
necessidade de retornar, o artigo estará pronto para ser publicado e o autor receberá a carta
de aceite bem como as instruções para pagamento dos custos de tramite (R$300 reais)*.
Os nomes dos pareceristas permanecerão em sigilo, omitindo-se também perante estes os
nomes dos autores.

* Somente os artigos aprovados que foram submetidos a partir de 1º de abril de 2013 terão
custo para publicação.

Direitos autorais: Ao encaminhar um manuscrito para a RBPM os autores devem estar

cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos
de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para
as Memórias.

ATENÇÃO: Artigos que não estiverem de acordo com essas normas serão devolvidos.

Observação: São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos

emitidos nos trabalhos. Contudo, reserva-se ao Conselho Editorial, o direito de sugerir ou
solicitar modificações que julgarem necessárias.

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