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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E MANEJO DE RECURSOS NATURAIS NÍVEL MESTRADO

LAÍS DAYANE WEBER

Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

CASCAVEL-PR

Agosto/2013

LAÍS DAYANE WEBER

Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo de Recursos Naturais Nível Mestrado, do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Conservação e Manejo de Recursos Naturais

Área de Concentração: Conservação e Manejo de

Recursos Naturais

CASCAVEL-PR

Agosto/2013

"Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles." (Augusto Cury)

DEDICATÓRIA

A minha família e ao meu namorado, por todo amor e constante incentivo, com gratidão, dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus por iluminar meu caminho e permitir que eu realizasse essa conquista. A minha mãe pela fé, carinho, amor e incentivo, serei eternamente grata. A minha orientadora Professora Fabiana Gisele da Silva Pinto por sua disponibilidade, empenho, apoio e confiança. Serei eternamente grata por oportunizar esse trabalho. Ao Professor Luis Francisco Angeli Alves, pelas sugestões recebidas na elaboração deste trabalho. A Professora Tereza Cristina Marinho Jorge, por ceder o Laboratório de Farmacognosia e apoiar o desenvolvimento desta pesquisa. A professora Lívia Godinho Temponi pela disponibilização do Herbário (UNOP) e identificação de todas as plantas. Aos colegas do laboratório de Biotecnologia Agrícola, pela amizade e pelo apoio durante esses anos. A Universidade Estadual do Oeste do Paraná, pela oportunidade de realização desta pesquisa. Ao PTI pela disponibilidade da bolsa de mestrado. Enfim, obrigado a todos, mesmo àqueles que não tenham sido citados, mas que de alguma forma colaboraram para o desenvolvimento desta pesquisa.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

p.1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

p.2

2.1 Resistência bacteriana e antimicrobianos sintéticos

p.2

2.2 Antimicrobianos alternativos

p.3

2.3 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana

p.5

2.4 Cromatografia

p.5

2.5 Atividade antioxidante

p.6

3. CAPÍTULO 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de

 

óleo essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb

p.

8

4. CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies

Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária

p. 28

5. REFERÊNCIAS

p.44

6. ANEXOS

p.53

Anexo 1 Nomas Revista Journal of Food, Agriculture & Environment

p.54

Anexo 2 Nomas Revista Brasileira de Plantas Medicinais

p.65

RESUMO:

A propriedade antimicrobiana das plantas pode ser explicada pela produção de compostos ativos gerados durante o metabolismo secundário como também por compostos voláteis. Atualmente os conhecimentos, as vezes empíricos, desta propriedade têm sido confirmados cientificamente, revelando assim o enorme potencial das plantas no controle de doenças infecciosas, enquanto verifica-se um aumento nos casos de micro-organismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos conhecidos. Extratos e óleos essenciais de plantas têm mostrado efeitos sobre desenvolvimento de microrganismos em inúmeras situações, o que sugere uso prático destes produtos. No presente estudo voltado à pesquisa de plantas como fonte natural e alternativa de substâncias antimicrobianas, determinou-se a composição química de diferentes extratos vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem fitoquímica e CG/MS respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro- organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtillis (CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação dos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica dos extratos verificou-se a presença de metabolitos secundários como, flavonoides, taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram ativas em diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido de 3-hexen-1-ol (0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o efeito antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta tendência de maior susceptibilidade para a cepas Gram positivas. Os resultados apontam o extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre o extrato aquoso, etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante dos mesmos. Em outro estudo, também voltado à pesquisa de plantas como fonte natural e alternativa de substâncias antimicrobianas, teve por objetivo comparar a ação inibitória de extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa), Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela- branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle L. (aroeira) de extratos vegetais (aquoso e etanolico) através da determinação da

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) por meio da técnica de microdiluição em caldo frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de origem avícola e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. De maneira geral verificou-se a atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais eficazes quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e P.guajava, apresentaram as maiores atividades inibitórias. Esses resultados confirmaram o potencial antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua possível adição na alimentação de aves.

Palavras-chave: Ação antimicrobiana, Plantas nativas, Patógenos, Extrato Vegetal, Óleo

Essencial.

1. Introdução

As doenças infecciosas representam uma importante causa de morbidade e mortalidade entre humanos, especialmente nos países em desenvolvimento. Assim, as indústrias farmacêuticas têm sido motivadas para o desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas nos últimos anos, especialmente em função da ocorrência de resistência microbiana a tais medicamentos. Em geral, bactérias têm habilidade genética de transmitir e adquirir resistência a drogas usadas como agentes terapêuticos (NASCIMENTO et al. 2000), pois são frequentes os relatos sobre isolamentos de bactérias que eram reconhecidamente sensíveis às drogas de uso na rotina, mas que se tornam resistentes a todos, ou a quase todos, fármacos disponíveis no mercado (SAKAGAMI; KAJAMURA,

2002).

Assim, no momento em que os antimicrobianos estão sendo substituídos, os produtos alternativos se constituem numa alternativa importante. Neste contexto, os extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos alternativos. Os princípios ativos dos óleos e extratos vegetais podem ser encontrados em todo tecido vivo de plantas, geralmente concentrados na casca, flores, folhas, frutos, sementes e quimicamente são constituídos frequentemente por um grupo de compostos distintos como os hidrocarbonetos, alcoóis e compostos carbonílicos (aldeídos e cetonas), etc. A exploração da atividade biológica de substâncias químicas de plantas brasileiras constitui uma forma potencial de controle alternativo de doenças, zoonoses e resistência microbiana gerando o desenvolvimento de modelos que viabilizem sistemas de produção sustentáveis e a conservação da biodiversidade e recursos naturais. Os principais compostos naturais com propriedades antimicrobianas encontrados nas plantas são geralmente fenóis simples, ácidos fenólicos, quinonas, flavonas, flavonóis e flavonóides, assim como o tanino, cumarina, terpenóides, alcalóides, lectinas e polipeptídios (GONÇALVES et al., 2005). Visto que os extratos vegetais e óleos essenciais têm um papel de destaque como eficientes antimicrobianos, torna-se importante o estudo do efeito desses compostos alternativos para o controle da salmonelose em aviários a fim de substituir os produtos sintéticos que diminuem a qualidade dos alimentos e degradam o meio ambiente como também em patógenos comumente relacionados a doenças hospitalares.

2. Revisão Bibliográfica

2.1 Resistencia bateriana e antimicrobianos sintéticos As doenças infeciosas afetam milhões de pessoas em todo o mundo e ao longo da história da humanidade, sempre representaram uma das principais causas de morte. Segundo dados da Organização Mundial da Sáude (OMS), as doenças infeciosas representam 26% da mortalidade global estimando-se que cerca de 50.000 pessoas morra a cada dia em todo o mundo por estas doenças (BECKER et. al., 2006; CHANDA; RAKHOLIYA, 2011). O problema tem se agravado devido o surgimento de micro- organismos multirresistentes, presentes em infecções hospitalares e comunitárias, diminuindo as opções de antibioticoterapia (LEVY, 2005; ANDRADE et al., 2006; REYNOLDS, 2009; ANURADHA et al., 2010).

Segundo critério mais usado, bactérias multirresistentes são os micro-organimos que apresentam resistência à maioria dos antimicrobianos, para os quais são originalmente sensíveis (COUTO, 2003). O uso inteso e inadequado de antibióticos, terapêutica ou profilaticamente, humano ou veterinário, a dificuldade dos pacientes em seguir o tratamento prescrito, o transporte de bactérias resistentes a novas áreas em função das viagens no mundo tem favorecido a pressão seletiva e predominância de espécies bacterianas cada vez mais resistentes a diversos princípios ativos, bem como causam diversos problemas ambientais (DEL FIOL et al., 2010; SAKARIDIS et al., 2011). Segundo NGOWKE et al. (2011), a epidemiologia da resistência aos antibióticos varia de região e de país. Enquanto alguns países estão registrando um declínio, outros estão experimentando um aumento da resistência bacteriana. No entanto, esta evidente que

o aumento ou a diminuição tem sempre uma ligação com o uso indiscriminado de

antibióticos (TACCONELLI et al., 2009). Elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos são registradas em estudos realizados no mundo todo e na medicina humana e veterinária (MOTA et al., 2005). Para

Salmonella, também, há registros de alta resistência aos principais antimicrobianos normalmente utilizados em avicultura (RIBEIRO et al., 2008).

Genes resistentes, adquiridos por micro-organismos, podem ser facilmente transferidos para organismos de diferentes ecossistemas, sendo levados da água para o solo

e vice-versa (BILA; DEZOTTI, 2003). No meio aquático, o contato físico entre as

bactérias possibilita alta freqüência de troca de plasmídeos codificadores de resistência aos

antimicrobianos (RHODES et al., 2000). A resistência pode ocorrer pela inativação do composto por enzimas desintoxicantes, redução da permeabilidade celular ou expulsão da droga por bombas específicas ou não-específicas e modificação dos alvos dos antimicrobianos. Além disso, as bactérias podem adquirir um fenótipo de resistência via reguladores transcricionais globais ou específicos. Estes mecanismos podem ser induzidos pelo antibiótico em si ou por sinais ambientais (BOERLIN; REID-SMITH, 2008). Apesar da disponibilização de novos antibióticos, a resistência bacteriana ocorre em ritmo crescente nos diferentes patógenos Gram positivos e Gram negativos e representa um grande desafio terapêutico (ROSSI; ANDREAZII, 2005). Nas últimas décadas o enfoque dado para o controle das infecções por bactérias Gram negativas, pode ter contribuído para o surgimento de bactérias Gram positivas multirresistentes, principalmente Staphylococcus resistentes a meticilina, Pneumococcus resistente à penicilina e eritromicina, Enterococcus resistentes à vancomicina e também as Gram negativas Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae resistentes a β-lactâmicos e carbapenens (LOW; NADLER, 1997; SANTOS FILHO et al. 2002). Ressalta-se a importância de compreender o mecanismo de resistência microbiana, bem como na busca de novos compostos antimicrobianos, sintéticos ou naturais, no intuito de controlar a ação de micro-organismos patogênicos (CASTRO et al., 2002).

2.2 Antimicrobianos alternativos As propriedades farmacológicas das plantas têm sido reconhecidas empiricamente durante séculos, mas foram cientificamente confirmadas apenas nas últimas décadas. Filtrados, infusões, macerados, sucos e extratos de plantas com propriedades medicinais são utilizados no tratamento de diversas doenças, desde a antiguidade (COUTINHO et al., 2008). O interesse por esses metabólitos extraídos de plantas se deve, principalmente, à capacidade de produção de compostos biologicamente ativos que podem servir de modelos para a síntese de novos fármacos e por possuírem propriedades terapêuticas utilizadas como tratamento alternativo no cuidado de saúde tradicional (GIBBONS, 2005). Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos, as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos

vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais (NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006; BONA et al., 2010). A forma de ação dos princípios ativos de extratos vegetais sobre as células bacterianas são muito similares ao dos antimicrobianos convencionais. Os efeitos positivos dos extratos vegetais estão associados aos princípios ativos, componentes químicos presentes em todas as partes das plantas ou em áreas específicas que conferem às plantas a capacidade de inibir a atividade de bactérias e de outros micro-organismos (DUARTE, 2004; RIZZO et al., 2010). Além dos extratos desempenharem um importante papel, garantindo a sobrevivência das espécies no ecossistema, metabólitos secundários são utilizados em escala industrial para a produção de inseticidas, corantes, flavorizantes, aromatizantes e medicamentos (MARASCHIN; VERPOORTE, 1999). Existem vários trabalhos que reportam a constituição fitoquímica de extratos vegetais, mas poucos estudos reportam quais são as substancias responsáveis pelas atividades antimicrobianas destes compostos. Portanto, é fundamental conhecer a classe dos componentes ativos através de técnicas espectrométricas (MOREIRA et al., 2007). Óleos essenciais são substâncias com alta volatilidade, odoríferas, líquidas e lipofílicas, resultantes do metabolismo secundário das plantas e apresentam um elevado potencial biológico, principalmente quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. Do ponto de vista farmacológico podem conter mais de 100 compostos orgânicos, sendo terpenos e fenilpropenos os mais encontrados (CASTRO et al., 2004). Seu uso como agentes medicinais é conhecido desde a antiguidade, em geral os óleos essenciais podem apresentar propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória, antisséptica, antioxidantes, antifúngica, anticarcinogênicos entre outros, sendo produtos purificados e de alto efeito comercial nas indústrias farmacêuticas, alimentícia, entre outras (SKOCIBUSI´C; BEZIC; DUNKIC, 2006). O Brasil, detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, possui uma grande diversidade genética vegetal ainda pouco explorada. Dados revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (PINTO et al, 2002). Essa grande diversidade genética vegetal que representa aproximadamente um terço da flora mundial é promissora em compostos com potencial bioativo (YUNES et al, 2001). Essa riqueza necessita ser mais explorada, pois compostos potencialmente úteis podem ser perdidos, deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas espécies (PATINÕ; CUCA, 2011).

A Organização Mundial de Saúde, desde 1977, incentiva estudos que avaliem

cientificamente os benefícios e riscos do uso tradicional de plantas como medicamentos. São necessárias evidências laboratoriais e clínicas a respeito da eficácia dessas plantas medicinais utilizadas tradicionalmente pela população (LOGUERCIO et al, 2005). Metabólitos secundários, produzidos por algumas espécies de plantas, são alvos de maior interesse, pois agem como substâncias de defesa contra micro-organismos patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem composição química variada com presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que apresentam, com freqüência, atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007). Com esta perspectiva, é fundamental avaliar, a partir de técnicas microbiológicas modernas e padronizadas, a atividade de extratos vegetais e óleos essenciais sobre diferentes sorotipos de Salmonella e diferentes patógenos comumente relacionados com

doenças hospitalares.

2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antimicrobiana e antifúngica dos extratos vegetais e óleo essencial, sendo que os mais conhecidos incluem:

método de difusão em ágar e o método de diluição em caldo (OSTROSKY et al., 2008). São técnicas usualmente aceitas internacionalmente para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano, sendo estas técnicas padronizadas para o uso de antimicrobianos comerciais (CLSI, 2003; CLSI, 2006). Pesquisas realizadas anteriormente por diversos autores com o objetivo de avaliar

métodos de avaliação de extratos vegetais e óleo essencial, sugerem uso de diferentes metodologias para que os resultados possam ser comparados com estudos de diferentes grupos de pesquisas (OSTROSKY et al., 2008; OTHMAN et al., 2011).

2.4 Cromatografia

Os óleos essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e

nas mais variadas concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise dos óleos essenciais requer a aplicação de métodos analíticos atuais e instrumentação adaptada que permitam avaliar a qualidade do óleo essencial e garantir a identificação de seus constituintes.

A cromatografia pode ser acoplada a diferentes sistemas de detecção, e trata-se de

uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor desempenho. O acoplamento do cromatógrafo com um espectrômetro de massas (CG-EM) associa as vantagens da cromatografia, que é a alta seletividade e eficiência de separação, com as vantagens da

espectrometria de massas, que é obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento adicional da seletividade. Esta técnica permite a separação dos constituintes pela cromatografia gasosa, que são introduzidos individualmente em ordem de eluição na câmera de ionização do espectrômetro de massas. O espectro de massas obtido para cada um dos constituintes geralmente indica a massa molecular e o seu padrão de fragmentação. O padrão de fragmentação pode ser comparado eletronicamente com aqueles constantes da biblioteca de espectros de massas (AVATO et al., 2005). Desse modo, é possível resolver picos cromatográficos parcialmente superpostos. Assim, a espectrometria de massas acoplada à cromatografia gasosa fornece as fragmentações dos componentes individuais separados (TAVARES et al., 2005). A CG-EM é aplicável a compostos voláteis (como os óleos essenciais) e termicamente estáveis nas temperaturas relativamente elevadas empregadas durante o processo de separação cromatográfica (ARDREY, 2003).

A identificação de componentes de óleos voláteis tem feito o uso de CG e de CG-

MS em associação com a determinação do índice de Kovats. Este procedimento vem sendo aplicado com sucesso na identificação de substâncias de estruturas conhecidas porque, em

sua maioria, os dados gerados podem ser comparados diretamente com os valores de tempo de retenção (índice de retenção) obtidos em colunas de polaridades diferentes e com os espectros de massas dos constituintes voláteis publicados (ADAMS, 2007).

2.5 Atividade Antioxidante Um antioxidante é uma substancia sintética ou natural acrescida em produtos para prevenir ou retardar a deterioração desses produtos através da ação do oxigênio presente no ar. Para bioquímica e a medicina, os antioxidantes são enzimas ou substancias orgânicas, como vitamina E ou β-caroteno, capazes de atuar contra os danos da oxidação nos tecidos animais. Os antioxidantes naturais ou sintéticos interferem na participação do oxigenio e atuam como inibidores de reação, fazendo papel ou de doadores de hidrogênio ou de receptores de raicais livres dos ádicos graxos. (HUANG et al., 2005).

Os antioxidantes podem ser classificados em dois grupos: primários e secundários.

Os primários são aqueles que interrompem a cadeia de reações envolvidas na oxidação

lipídica através da doação de elétrons ou hidrogênio aos radicais livres, fazendo assim a conversão deles em produtos mais estáveis. Os secundários são compostos que reduzem ou diminuem a taxa de iniciação da oxidação, através da decomposição de hidroperóxidos (SHAHIDI; NACZK, 2004).

A medida da habilidade antioxidante reflete a ação acumulada de todos os

antioxidantes que estiverem presentes em um extrato ou amostra biológica, proporcionando, desta forma, uma analise de parâmetros associados. A capacidade antioxidante pode ser considerada um marcador sensível e confiável para detectar mudanças no estresse oxidativo in vivo, provendo ajuda no esclarecimento de fatores fisiológicos e nutricionais importantes, e ainda, suprindo informações sobre absorção e biodisponibilidade de compostos antioxidantes (GHISELLI et al., 2000). Portanto, o interesse pela pesquisa sobre novos antioxidantes naturais tem aumentado nos últimos anos, levando as indústrias de alimentos, de cosméticos e farmacêuticos a ter maior atenção em novas fontes, principalmente às de origem vegetal. Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os compostos fenólicos têm sido apontados como responsáveis por maior capacidade antioxidante, sendo representados pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas, xantonas e outros (RAZAVI et al.,

2008).

São várias as metodologias utilizadas para determinar a capacidade antioxidante de uma amostra, portanto estão sujeitas a interferências e também se baseiam em diversos fundamentos. Um método frequentemente utilizado para avaliar a capacidade antioxidante se dá através da medição do sequestro de radicais livres. Ele se fundamenta na habilidade de antioxidantes, que estão presentes na amostra, se ligarem com o DPPH, um radical orgânico e estável. É um método tecnicamente rápido e não detecta agentes pró oxidantes, sendo que determina apenas o poder redutor dos compostos analisados (BRAND- WILLIANS et al 1995). Este método foi primeiramente descrito por Brand-Willians (1995) e baseia-se na capacidade redutora dos antioxidantes presentes em uma amostra sobre o DPPH, radical orgânico e estável, através de uma reação de transferência de elétrons, a qual é medida através do decréscimo da absorbância a 515nm.

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3. Capítulo 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo

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essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

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Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo

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essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.

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Journal of Food, Agriculture & Environment

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Laís Dayane Weber, Fabiana Gisele da Silva Pinto, Mayara Camila Scur, Juliete Gomes de

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Lara de Souza, Willian Ferreira da Costa

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Weber, L.D.; Pinto, F.G.S.; Scur, M.C.; Souza, J.G.L.; Costa, W.F.

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RESUMO

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No presente estudo determinou-se a composição química de diferentes extratos

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vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do óleo essencial de Prunus

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myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem fitoquímica e CG/MS

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respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro-organismos

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patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella Typhimurium (ATCC

22

14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883),

23

Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus

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epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtillis

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(CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação dos valores de

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Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)

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utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade

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antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais

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livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica

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dos extratos verificou-se a presença de de metabolitos secundários como, flavonoides,

31

taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram

32

ativas em diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico

33

ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de

34

compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido

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de 3-hexen-1-ol (0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o

36

efeito antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta

37

tendência de maior susceptibilidade para as cepas Gram positivas. Os resultados apontam o

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extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao

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óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma

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terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre os extratos aquoso,

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etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico

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e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana

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dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante

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dos mesmos.

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Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático.

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INTRODUÇÃO

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O Brasil possui a maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta e

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consequentemente uma grande diversidade genética vegetal pouco explorada. Em relação

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ao potencial medicinal, apenas aproximadamente 17% das plantas foram estudadas

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(PINTO et al, 2002). Devido essa grande diversidade o Brasil ganhou destaque na busca

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por compostos com potencial bioativo (YUNES et al, 2001). Sendo necessária a

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exploração desses vegetais, pois compostos potencialmente úteis podem ser perdidos,

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deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas espécies (PATINÕ; CUCA,

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2011).

60

A família Rosaceae compreende cerca de 100 gêneros e 3.000 espécies, sendo uma

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das principais famílias do ponto de vista econômico, concentrada no Hemisfério Norte,

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com poucas espécies nativas no Brasil (SOUZA; LORENZI, 2005). Fornece espécies que

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detêm grande potencial nutricional e farmacológico sendo utilizadas na medicina popular

64 para o tratamento de diversas enfermidades e para a manutenção de boas condições de

65 saúde. O gênero Prunus é constituído por aproximadamente 130 espécies que ocorrem nas

66 regiões Norte, Sul e Sudeste do Brasil. Diversas frutas introduzidas e consumidas no Brasil

67 pertencem ao gênero Prunus, encontram-se o pêssego (P. persica), nectarina (P. persica

68 var. nucipersica), ameixa (P. domestica), amêndoa (P. dulcis) e a cereja (P. avium, P.

69 cerasus) (JUDD et al., 2002; SOUZA; LORENZI, 2005).

70 Quanto às espécies nativas do gênero Prunus, merece destaque Prunus myrtifolia

71 (L.) Urb. por ser uma espécie de ampla distribuição geográfica, (SOUZA; LORENZI,

72 2005), que possui como sinonimos Prunus sphaerocarpa Hook e Prunus sellowii Koehne.

73 P. myrtifolia é conhecida popularmente como pessegueiro-bravo, pessegueiro-do-mato,

74 miguel-pintado, coração-de-negro, marmelo-do-mato, coração-de-bugre, varova, varoveira

75 (LORENZI, 1992).

76 Nos últimos anos, a composição química, propriedades antibacterianas e

77 antioxidantes dos vegetais ganharam interesse na busca por produtos alternativos. Os óleos

78 essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e nas mais variadas

79 concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise requer a aplicação de métodos analíticos

80 atuais e instrumentação adaptada que permitam avaliar a qualidade do óleo essencial e

81 garantir a identificação de seus constituintes. Os metabólitos secundários, produzidos por

82 algumas espécies de plantas, são alvos de maior interesse, pois agem como substâncias de

83 defesa contra micro-organismos patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem

84 composição química variada com presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que

85 apresentam, com frequência, atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007).

86 Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos,

87 as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de

88 produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os

89 extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir

90 disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos

91 vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais

92 (NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006).

93 A busca por novos antioxidantes naturais tem aumentado nos últimos anos, levando

94

as indústrias de alimentos, de cosméticos e farmacêuticos voltar pesquisas para material de

95

origem vegetal. Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os

96

compostos fenólicos têm sido apontados como responsáveis por maior capacidade

97

antioxidante, sendo representados pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas,

98

xantonas e outros (RAZAVI et al., 2008).

99

No presente estudo, determinou-se a composição química dos extratos vegetais e do

100

óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), bem como seu efeito

101

antimicrobiano contra micro-organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa ATCC

102

27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus mirabilis ATCC 25933,

103

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus

104

faecalis ATCC 19433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus

105

ATCC 25923, Bacillus subtillis CCD-04 e Candida albicans ATCC 10231; e por fim

106

buscou-se avaliar a atividade antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial.

107

108

MATERIAL E MÉTODOS

109

Material Vegetal

110

Folhas de Prunus myrtifolia foram coletadas na região Oeste do Paraná, Brasil. As

111

coletas foram realizadas de janeiro a fevereiro de 2013, sempre pelo período da manhã, de

112

acordo com a distribuição natural e disponibilidade da espécie. O material foi identificado

113

pela profª Drª Livia Godinho Temponi e incorporado no Herbário da Universidade

114

Estadual do Oeste do Paraná (UNOP).

115

As folhas coletadas foram secas em estufa com circulação de ar a 40 °C por 48h e

116

trituradas em moinho elétrico de facas. O pó da planta foi armazenado em recipiente

117

escuro, hermeticamente fechado, até ser usado para produção dos extratos e triagem

118

fitoquímica.

119

Obtenção do extrato aquoso

120

20 g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de água destilada e mantido

121

em agitador rotativo a 220 x g durante 24 h. Em seguida o material foi filtrado em papel de

122

filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi

123

recolhido, obtendo-se, desta forma, o extrato na concentração final de 200 mg/mL. Os

124

extratos obtidos foram armazenados em frascos hermeticamente fechados, sob abrigo da

125 luz a uma temperatura de 4º C (BONA et al., 2010).

126 Obtenção dos extratos orgânicos

127 Os extratos orgânicos foram obtidos segundo a metodologia descrita por Ceyahn et

128 al. (2012). Etanol (95%), acetato de etila e hexano foram utilizados como solventes

129 orgânicos. A partir de 10g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de solvente

130 orgânico e levado a um agitador rotativo a 220 x g por 24 h. Em seguida foi filtrado em

131 papel filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 minutos. O sobrenadante

132 foi recolhido e submetido a roto-evaporadoção a temperatura máxima de 40ºC (Laboratório

133 de Farmacognosia, UNIOESTE), a fim de se retirar o solvente. O extrato obtido foi diluído

134 com água destilada estéril seguindo a proporção do seu peso, resultando em uma

135 concentração final de 400 mg/mL. Os extratos obtidos foram armazenados em frascos

136 hermeticamente fechados, sob abrigo da luz a uma temperatura de 4ºC.

137 Triagem fitoquímica

138 Os principais metabólitos secundários foram detectados de acordo com

139 metodologia desenvolvida por Wall et al (1954); Barbosa-Filho et al (1984) e Agra et al

140 (1990) na classificação química de 4.000 plantas diferentes, com modificações.

141 Extração óleo essencial

142 70 g de folhas frescas de Prunus myrtifolia foram submetidos a metodologia padrão

143 de arraste por vapor d’água durante 3 horas utilizando o equipamento tipo Clevenger. O

144 óleo foi recolhido diretamente sem a adição de qualquer solvente, e armazenado em frascos

145 escuros a 4 ° C.

146 Análise da composição química

147 Os constituintes do óleo essencial foram identificados através da cromatografia em

148 fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e pela determinação de seus

149 índices de retenção de Kovats (IK).

150 Cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas

151 As análises de GC-MS foram realizadas no Laboratório de Cromatografia Gasosa

152 acoplada à Espectrometria de Massas COMCAP, Universidade Estadual de Maringá

153 (UEM), Paraná, Brasil.

154 A análise do óleo da Prunus myrtifolia foi realizada empregando um sistema CG-

155 MS Thermo-Finigan, sendo realizadas em um sistema composto por um cromatógrafo em

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

fase gasosa FOCUS GC (Thermo Electron), acoplado a um espectrômetro de massas DSQ

II (Thermo Electron), empregando um detector com fonte de ionização por impacto de

elétrons de 70V e analisador de massas do tipo quadrupolo. As amostras foram injetadas

por um sistema automático de injeção modelo Triplus (Thermo Electron). O programa

“Xcalibur” (“Thermo Electron”) foi empregado para à aquisição e processamento dos

dados.

A separação cromatográfica foi realizada por uma coluna capilar de sílica fundida

DB-5ms da “J&W Scientific” (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25

µm de fase estacionária de composição de 5% fenil e 95% dimetilpolissiloxano). O gás de

arraste empregado foi o gás hélio 5.0.

A temperatura do injetor foi de 250 °C e a vazão do gás de arraste foi mantida

constante a 1,0 mL.min

split com na razão de 1:25. A programação de temperatura empregada foi: temperatura

inicial 50

. A interface entre o

CG e o EM foi mantida em 270 °C e a temperatura da fonte de ionização do espectrômetro

de massas foi de 250 °C. A faixa da razão massa/carga monitorada foi de 50-500 m/z.

Índice de retenção de Kovats

O cálculo do índice de retenção de Kovats foi baseado no emprego de uma mistura

de padrões de alcanos (C7 a C28). As amostras foram diluídas em n-hexano e analisada.

Os índices de retenção dos compostos foram determinados com a equação proposta por

(VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963):

A identificação dos componentes foi baseada na comparação de seus espectros de

massas com os obtidos através dos espectros de massas da biblioteca espectral “NIST MS

Search 2.0” contida no software “Xcalibur” que acompanha o equipamento e pela

comparação dos seus índices de retenção de Kovats, obtidos experimentalmente, com os

dados de índice de retenção de Kovats obtidos na literatura para os mesmos compostos

analisados empregando a mesma coluna.

Micro-organismos utilizados

Para a realização do teste da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extratos

vegetais de Prunus myrtifolia foram utilizados 5 patógenos Gram negativo, sendo eles,

-1

. A amostra e os padrões dos alcanos foram injetados no modo

o C a uma razão de 2,0

-1

o C mantida por 2 min, aumento da temperatura para 180

seguida de aumento para 290 o C a uma razão de 5,0 o C.min

o

C.min

-1

187 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus

188 mirabilis ATCC 25933, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC

189 25922; 4 patógenos Gram positivo, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus

190 epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Bacillus subtillis CCD-

191 04 e Candida albicans ATCC 10231 como levedura.

192 Os micro-organismos previamente mantidos a -20 °C foram recuperadas em meio

193 enriquecido, “Brain Heart Infusion” (BHI) e incubados a 36 °C por 24h. Após esse

194 período, foram ressuspensas em solução salina estéril a 0,9% (p/v) para se obter o inóculo

8 UFC/mL na escala de MacFarland. Posteriormente

196 foram realizadas diluições em solução salina estéril (0,9% p/v) a fim de se obter um

UFC/mL. Com exceção da Candida albicans que é

198

199 Determinação da Concentração inibitória mínima (CIM)

200 Óleo essencial

201 A CIM do óleo essencial foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo

202 proposta por Santurio et al. (2011) com modificações. Após pesagem de 70 mg do óleo

203 essencial foi diluído com metanol até atingir a concentração de 70 mg.mL

204 seguir, foi diluído na proporção de 1:10 em Caldo Muller-Hinton (MH) para todos os

(solução I). A

197

195 padrão a uma concentração de 1x10

5

inóculo final na concentração de 1x10 utilizada na concentração final de 1x10

6

UFC/mL.

-1

205 micro-organimos exceto Candida albicas que utilizou-se RPMI, obtendo-se a concentração

(solução II). Com base no documento M31-A3 do CLSI (2008), volumes

207 de 100 µL da solução II foram adicionados ao primeiro poço e, após homogeneização,

208 realizou-se diluições sucessivas obtendo-se concentrações finais de 13.67 a 3500 µg.mL -1 .

209 Alíquotas (10 µL) da diluição dos micro-organismos foram distribuídas em cada poço já

210 contendo o óleo essencial em suas diluições finais. As placas foram incubadas a 36 °C por

211 24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de 10 µL de

212 cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM foi

capaz de impedir o

214 crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004).

215 Extratos vegetais

216 A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da microdiluição em caldo

217 proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (10 µL) da diluição foram distribuídas em

213 definida como a menor concentração do extrato em mg.mL

206 de 7000 µg.mL

-1

-1

218 placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo MH (concentração dupla),

219 com a adição anterior dos extratos. Os extratos foram diluídos em concentrações entre 0,04

para o extrato etanólico e

221 acetato de etila entre 0,0012 e 3 mg/mL

222 incubadas a 36 °C por 24 h. Após avaliação visual seguiu-se os mesmos padrões de

223 avaliação que óleo essencial.

224 Determinação da Concentração bactericida mínima (CBM)

225 A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al.

226 (2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM,

227 anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do

228 ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a

229 menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e

230 CBM foram realizados em triplicata.

231 Água destilada, etanol, acetato de etila e hexano foram usados como controle

232 negativo. Gentamicina foi utilizada como controle positiva para as bactérias e Nistatina

233 para C. albicans (Tabela 1). Os antimicrobianos sintéticos foram testados nas

234 concentrações de 0.78 a 100 mg/mL.

para o extrato hexânico. As placas foram

220 e 100 mg/mL para o extrato aquoso, entre 0,035 e 75 mg/mL

Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) de água destilada, solventes orgânicos e antimicrobianos referência frente a micro- organismos patogênicos.

CIM/CBM (mg/mL)

Água

Acetato de

Micro-organimos

Etanol

Hexano

Gentamicina

Nistatina

 

Destilada

etila

P.

aeruginosa ATCC 27853

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

S.

Typhimurium ATCC 14028

Na

Na

Na

Na

3.125/6.25

Nt

P.

mirabilis ATCC 25933

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

K.

pneumoniae ATCC 13883

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

E.

coli ATCC 25922

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

E.

faecalis ATCC 19433

Na

Na

Na

Na

3.125/6.25

Nt

S.

epidermidis ATCC 12228

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

S.

aureus ATCC 25923

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

B.

subtillis CCD-04

Na

Na

Na

Na

6.25/6.25

Nt

C.

albicans ATCC 10231

Na

Na

Na

Na

Nt

6.25/6.25

*Na: Sem atividade; Nt: não foi testado

235 Atividade antioxidante

236

237 DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil) baseado na metodologia preconizada por Scherer e

238 Godoy (2009) com modificações. Para a análise das amostras, 0,1 mL de cada diluição das

239 amostras ou padrões foram adicionados em tubos de ensaio que continham 3,9 mL do

240 radical DPPH (0,2 mM) diluído em metanol e homogeneizados em agitador de tubos. Para

241 o controle negativo, foi utilizado 0,1 mL de solução controle (álcool metílico, acetona e

242 água) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizados. Como controle positivo utilizou-se

243 o antioxidante sintético BHT (butil hidroxi tolueno) e seguiu-se o mesmo procedimento do

244 controle negativo. Como branco foi utilizado álcool metílico, afim de calibrar o

245 espectrofotômetro. Todas as análises foram realizadas em triplicata. As leituras (λ = 515

246 nm) foram monitoradas a cada 30 minutos, até a estabilização da absorbância.

247

248 x100, onde Abs

]

A atividade antioxidante foi determinada pelo método de captura de radicais livres

O índice DPPH foi calculado através da equação 1: I (%) = [(Abs

0

0 é a absorbância do branco e Abs

1 é a absorbância da amostra.

-Abs ) /Abs

1

0

249 Para o cálculo dos valores de IC

250 reduzir 50% do radical DPPH), utilizou-se as equações

251

252

253 RESULTADOS E DISCUSSÃO

254 Os testes realizados, na triagem fitoquímica (Tabela 2), revelaram que o extrato

255 aquoso apresenta apenas a classe dos taninos e flavonoides. O extrato etanolico foi o que

256 revelou maior número de classes de substâncias: taninos, saponinas, terpenos e

257 flavonoides. O extrato com o solvente acetato de etila revelou apenas a classe de

258 substancias dos flavonoides e o extrato hexânico não apresentou resultado positivo para as

259 classes de substanciais testadas.

260 Tabela 2. Classes de metabólitos secundários identificados nos diferentes

261 extratos de Prunus myrtifolia

50 (concentração do óleo/extrato necessário para

EXTRATOS

Classes de

Aquoso

Etanolico

Acetato de

Hexânico

metabólitos

Etila

Taninos

+

+

-

-

Alcaloides

-

-

-

-

Cumarinas

-

-

-

-

Saponinas

-

+

-

-

Antocianinas

-

-

-

-

Antocianidinas

-

-

-

-

Flavonoides

+

+

+

-

Triterpenoides

-

+

-

-

Esteroides

-

-

-

-

262

*- ausente + presente

263

264

Sabe-se que a constituição química de Rosaceae inclui especialmente taninos (OKUDA

265

et al., 1992), flavonóides (HARBONE, 1988; CHALLICE et al., 1972), além de triterpenos

266

e esteróides (WALLAART, 1980).

 

267

A maior classe de compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia

268

pertence aos aldeidos os quais representaram cerca de 97% da área total de picos. Em

269

sequência foram identificados em porcentagens inferiores as classes de álcoois (3-hexen-1-

270

ol) e ésteres (Benzil e Benzoato) com 0,07 e 0,09% de área total de pico, respectivamente.

271

(Tabela 3).

272

Tabela 3. Composição química do óleo essencial de Prunus myrtifolia

 

Componentes

Area (%)

IK*

IK**

TR*

3-Hexen-1-ol

0.07

852

845 (1)

5.74

Benzaldeido

96.96

964

962 (2)

10.22

Benzil, benzoato

0.09

1759

1765 (3)

57.22

273

* IK índice de Kovats calculado

** IK índice de Kovats literatura

*Tempo de retenção

274

275

A principal classe de compostos voláteis no óleo do gênero Prunus é aldeídos,

276

tendo como composto majoritário Benzaldeido em sua composição química (MAIA;

277

GODOY, 1984; IBARRA-ALVARADO et al., 2009). O benzaldeído é resultado da

278

hidrólise enzimática de amigdalina, que ocorre com a liberação de cianeto de hidrogênio e

279

duas moléculas de glicose (TATSUMA et al., 1998). Além disto, o benzaldeido é um dos

280

principais componentes responsáveis pelo odor característico dos óleos essenciais

281

(KERDOGAN-ORHAN e KARTAL, 2011). Diversas atividades biológicas, como

282

antimicrobiana e antifúngica, são atribuídas a presença de compostos como benzaldeido

283

(DU et al., 2002; FUJI et al., 2005).

 

284 Os resultados presentes na Tabela 4 indicam que o óleo essencial e extratos

285 apresentaram atividade antimicrobiana para todas as cepas testadas, embora para o extrato

286 hexânico a CBM foi maior do que o limite de detecção.

Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) de óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia frente a micro-organismos patogênicos.

CIM/CBM (mg/mL)

Óleo

Acetato de

 

Micro-organimos

essencial

Aquoso

Etanolico

Etila

Hexânico

 

(µg/mL)

P.

aeruginosa ATCC 27853

3500/3500

12.5/12.5

9.38/18.75

37.5/75

3/>LD

S. Typhimurium ATCC 14028

1750/3500

12.5/25

18.75/37.5

150/150

3/>LD

P.

mirabilis ATCC 25933

3500/7000

12.5/12.5

18.75/18.75

37.5/75

3/>LD

K. pneumoniae ATCC 13883

3500/7000

12,5/12,5

18.75/37.5

37.5/37.5

3/>LD

 

E.

coli ATCC 25922

1750/7000

12.5/25

9.38/37.5

37.5/75

3/>LD

E. faecalis ATCC 19433

1750/7000

12.5/25

9.38/18.75

9.38/18.75

3/>LD

S.

epidermidis ATCC 12228

3500/7000

1.56/1.56

1.18/2.35

4.69/9.38

3/>LD

S. aureus ATCC 25923

3500/7000

0.04/0.09

0.07/0.15

2.34/4.68

3/>LD

B.

subtillis CCD-04

3500/7000

3.13/6.25

4.69/4.69

4.69/9.38

3/>LD

C.

albicans ATCC 10231

3500/7000

6.25/6.25

4.69/9.37

9.38/9.38

3/>LD

>LD: Maior que o limite de detecção

287 O óleo essencial apresentou atividade bacteriostática de 1750 a 3500 µg/mL

288 enquanto sua atividade bactericida foi em sua maioria de 7000 µg/mL, sendo que apenas P.

289 aeruginosa e S. Typhimurium apresentaram CBM de 3500 µg/mL. A atividade encontrada

290 no óleo pode ser devido à presença em sua composição do benzaldeido. Segundo Alanri et

291 al. (2012) derivados de benzaldeido são amplamente utilizados como compostos

292 antimicrobianos de modo ambientalmente seguro, considerando seu amplo espectro de

293 efeito inibidor, que são empregados como agente bactericida e fungicida. Benzaldeídos

294 assemelham fenóis na atividade antibacteriana interagindo com a superfície da célula e

295 levando a morte celular por meio da desintegração da membrana celular e liberação de

296 componentes intracelulares (ALANRI et al., 2012).

297 Em relação a atividade antimicrobiana encontrada nos extratos verificou-se uma

298 variação frente aos diferentes extratores utilizados. Para extrato aquoso observou-se

299 variação na CIM de 0.04 a 12.5 mg/mL e CBM de 0.09 a 25 mg/mL. O extrato etanolico

300 apresentou atividade bacteriostática variando entre 0.07-18.75 mg/mL e bactericida entre

301 0.15-37.5 mg/mL. O extrato de acetato de etila apresentou valores de CIM de 2.34 a 150

302 mg/mL e CBM de 4.68 a 150 mg/mL. E por fim, para o extrato hexânico todas as cepas

303 apresentaram valores de CIM de 3 mg/mL contudo a atividade bactericida não foi

304 detectada na concentração testada.

305 Yigit, et al. (2009) reportaram antibacteriana para os extratos etanolicos e aquosos

306 de Prunus armeniaca L. kernels frente a Gram negativa e positiva e a leveduras como

307 Candida albicans, corroborando com os dados encontrados em nossa pesquisa.

308 A atividade antibacteriana observada nos extratos aquoso, etanolico e acetato de

309 etila (Tabela 2) pode estar relacionada a presença de metabolitos secundários como,

310 flavonoides, taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se

311 mostraram ativas em diferentes estudos descritos na literatura (RECIO et al., 1989). Em

312 relação ao extrato hexânico a não detecção da atividade bactericida pode ser devido à

313 ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana.

314 Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a

315 compostos ativos presentes nos extratos vegetais. TALEB-CONTINI et al (2003)

316 avaliaram a atividade antimicrobiana de flavonoides isolados e constataram sua atividade

317 antibacteriana, principalmente frente a micro-organismos Gram positivos. Os flavonoides

318 agem na célula bacteriana através de complexos entre proteínas e a parede celular

319 bacteriana, ocasionando seu rompimento (TAGURI et al., 2004). Os taninos agem nos

320 micro-organismos impedindo seu crescimento, através da formação de complexos entre o

321 mesmo e a parede celular ou enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a

322 inibição do transporte de nutrientes para a célula (McSWEENEY et al., 2001). Estudos

323 sugerem que o mecanismo de ação dos triterpenos nos micro-organismos está relacionado

324 ao rompimento de compostos lipofílicos das membranas microbianas (BAGAMBOULA et

325 al., 2004). As saponinas são compostos que também possuem atividades biológicas como,

326 antilevadura e antibacteriano, agindo nos esteróis da membrana ativamente (KILLEEN et

327

al., 1998; SPARG et al., 2004)

328

No geral, os extratos aquoso e etanolico apresentaram melhores valores em

329

relação a CIM e CBM frente a todas as cepas testadas. Já o extrato acetato de etila

330

apresentou uma variação frente a atividade antimicrobiana em relação a Gram negativa,

331

onde apresentaram altos valores de CIM e CBM e em contrapartida as cepas Gram

332

positivas e leveduras quando analisados a CIM e CBM apresentaram maior suscetibilidade

333

ao extrato. A membrana externa tem constituição diferente conforme a bactéria seja Gram

334

negativa ou positiva. Entretanto, todas tem uma camada comum, o peptideoglicano que

335

serve como barreira de penetração para macromoléculas e compostos hidrofóbicos, e

336

consequentemente as tornam menos suscetíveis aos agentes antimicrobianos (TADEG et

337

al., 2005). Sendo justificada pela presença de flavonoides que possuem atividade

338

antimicrobiana principalmente em Gram positiva (TALEB-CONTINI et al., 2003).

339

O teste químico utilizado para a detecção de atividade antioxidante através do

340

sequestrador de radical DPPH, através do cálculo do índice de DPPH (Figura 1) e do IC 50

341

(Tabela 5).

342

342

343

Figura 1. Índice de DPPH do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia

344

nas diferentes concentrações testadas

345

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363

364

365

Tabela 4. IC

concentrações testadas

50 do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia nas diferentes

Testes

IC 50

Controle BHT Oleo 1 Oleo 2 Oleo 3 Aquoso 1 Aquoso 2 Aquoso 3 Etanolico 1 Etanolico 2 Etanolico 3 Acetato de etila 1 Acetato de etila 2 Acetato de etila 3 Hexano 1 Hexano 2 Hexano 3

191,5

11,54

167,36

179,11

184,72

14,45

21,9

23

15,9

15,27

13,54

14,27

53

62,09

186,36

186,45

187,18

Quanto ao índice de DPPH o extrato aquoso e etanolicos nas diferentes

concentrações testadas apresentaram porcentagem de sequestro de DPPH aproximadas as

porcentagens encontradas para o BHT, antioxidante sintético comercializado, utilizado

como controle positivo. Variando de 89.73 a 94.77%, enquanto o índice de sequestro para

o BHT foi de 95.83%. Em relação ao extrato de acetato de etila houve uma redução

significativa no índice de sequestro quando comparadas as diferentes concentrações

avaliadas.

Segundo GAO (1999), os compostos fenólicos, como flavonoides, triterpenos e

taninos são polares e doadores de elétrons, portanto excelentes antioxidantes. Compostos

estes que foram encontrados na triagem fitoquímicas dos extratos testados (Tabela 2). O

flavonoides podem bloquear em grande escala efeitos enzimáticos, inclusive os que estão

associados a divisão celular (HOLLMAN, 1999). Foram relatados dados

etnofarmacológicos na literatura do gênero Prunus sobre a relação da atividade

antioxidante correlacionada com a presença de flavonoides (WANG et al., 1999;

NAKATANI et al., 2000). YGIT et al. (2012) reportaram atividade antioxidante bastante

366

367

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391

392

393

394

395

396

significativa com valores de índice sequestro de DPPH iguais ou superiores aos

encontrados no BHT e extratos aquoso e etanolico.

O óleo essencial e extrato hexânico nas diferentes concentrações testadas

presentaram índice de DPPH relativamente baixos, não podendo ser detectada atividade.

Os valores encontrados no óleo essencial se devem a presença do seu composto

majoritário, benzaldeido, que conforme citado na literatura apresenta atividade

antioxidante de moderada a fraca (THANH; HOEI, 2012). Já o extrato hexânico

justificasse a ausência da atividade antioxidante devido à inexistência de metabolitos

secundários presentes no extrato que exerçam tal função.

50 estão diretamente relacionados à porcentagem de sequestro do

DPPH, sendo inversamente proporcional (quanto maior o índice de sequestro menos o

IC

Gênero Prunus apresenta importância econômica na área de alimentos e

fitofármacos, sendo reportados na literatura mais de 100 patentes envolvendo diferentes

espécies de Prunus em sua formulação, com diversas finalidades: cosméticos clareadores

da pele (YAGI; NAGARUMA, 1998); protetores solares (HEO et al., 2001), como

alimento na pecuária (KHANAL, 2001), antimalárica (MUNOZ et al., 2000) e

hipotensivo (PIERONI, 2000).

Destaca-se a importância dos estudos fitoquímicos uma vez que através dos

mesmos justificam-se as atividades biológicas encontradas. Vale ressaltar a importância de

estudos preliminares para determinar a atividade desses compostos afim de que sirvam

como base para estudos posteriores a fim de isolar diferentes compostos com atividade

antimicrobiana. Em relação à atividade antioxidante ressalta-se a importância na

determinação da mesma uma vez que há necessidade de que o composto seja

Os valores do IC

50 ), portanto a relação dos dados permanece a mesma.

antimicrobiano e antioxidante ao mesmo tempo.

CONCLUSÃO

O estudo químico de Prunus myrtifolia demonstra estar de acordo com relatos

encontrados na literatura no que concerne a química do gênero Prunus. Foram

identificados flavonoides, terpenoides, entre outros metabólitos especiais no extrato

397

vegetal aquoso, etanolico e acetato de etila. Com relação ao óleo essencial como composto

398

majoritário foi encontrado o Benzaldeido. Em relação a atividade antimicrobiana os micro-

399

organismos se mostraram suscetíveis quando avaliados frente aos extratos vegetais aquoso,

400

etanolico e acetato de etila e óleo essencial, demonstrando potencial efeito antimicrobiano

401

da Prunus myrtifolia. Quanto à atividade antioxidade, os extratos alcoolico, aquoso e de

402

acetato de etila expressaram valores significativos comparáveis a antioxidantes sintéticos.

403

404

405

AGRADECIMENTO (S)

406

A Capes, a Fundação Araucária e CNPq pelo financiamento e ao Parque Tecnológico

407

Itaipú pela bolsa.

408

409

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4.

CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies

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565

Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária.

Revista Brasileira de Plantas Medicinais Atividade antimicrobiana de extratos vegetais de seis espécies nativas do Brasil no controle de Salmonella de origem aviária. [Antimicrobial activity of extracts from plants native to Brazil control of Salmonella as avian origin]

RESUMO

Avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos vegetais de seis plantas

nativas brasileiras frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de origem avícola. A

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos

extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa),

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-

branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle

L. (aroeira) foram determinadas por meio da técnica de microdiluição em caldo. Observou-

se a atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais

eficazes quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e

P.guajava, apresentaram as maiores atividades inibitórias. As CIMs variaram entre 1,56-

100 mg.mL

antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua

. Esses resultados confirmaram o potencial

-1

e a CBM entre 3,13-100 mg.mL

-1

possível adição na alimentação de aves.

ABSTRACT

It was evaluated in vitro antimicrobial activity of extracts of six native Brazilian

plants against 36 serotypes of Salmonella from poultry products. The Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the ethanolic and

aqueous extracts of Maytenus aquifolium Mart. (thorn-saint), Myrciaria cauliflora (Mart.)

O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (cinnamon-white), Psidium guajava

L. (guava), Ricinus communis L. (castor) and Schinus molle L. (mastic-white) were

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determined by broth microdilution technique. It was observed antimicrobial activity of all

the extracts tested, ethanol being the most effective when compared to aqueous. Ethanol

extracts of M. cauliflora and P. guajava showed the highest inhibitory activity. The MIC

. These results

confirmed the antimicrobial potential from these plant extracts, which deserve further

research addressing a possible addition in poultry feed.

ranged from 1.56 to 100 mg.mL

-1

and CBM from 3.13 to 100 mg.mL

-1

Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático.

Key words: Salmonella, plant extracts, microdilution, bactericidal, bacteriostatic.

INTRODUÇÃO

O gênero Salmonella é um patógeno de difícil controle e comumente encontrado

em toda a cadeia de produção avícola e, consequentemente, na carne de frango, podendo

causar surtos de intoxicação alimentar em humanos e prejuízos econômicos à indústria

avícola (SHINOHARA et al., 2008). Fatores que contribuem para a patogenicidade de

Salmonella spp. são seu grande número de sorotipos, a capacidade de adaptação a vários

hospedeiros, além de sua predisposição de adquirir e transmitir alelos de resistência aos

antimicrobianos (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008a).

Uma vez que o uso intensivo de agentes antimicrobianos conduziu a seleção de

Salmonella spp. resistentes, bem como a presença de resíduos destes agentes

antimicrobianos na carne e derivados podem causar problemas ambientais e à saúde

humana (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008b), a utilização de produtos

naturais como potencial agente antimicrobiano chama a atenção das industrias na busca de

novos compostos que não agridam o meio ambiente (MESA-ARANGO et al., 2009).

Neste contexto, os extratos vegetais vêm ganhando espaço nas pesquisas para o

controle de diferentes micro-organismos patogênicos (NASCIMENTO et al., 2000;

LOGUERCIO et al., 2005; USHIMARU et al., 2007; GONÇALVES et al., 2005;

CARVALHO et al., 2009) e, por isso, tem-se buscado novas plantas, a fim de que os

extratos sejam considerados como um produto sanitário alternativo, seguro e saudável

quando comparado aos antimicrobianos sintéticos (DUARTE et al., 2004; LOVATTO et

597

al., 2012).

598

Não há dúvidas de que as plantas possuem propriedades biológicas, devido à rica

599

presença de princípios ativos, além de serem biodegradáveis e, o mais importante, serem

600

também abundantes e renováveis (GONÇALVES et al. 2005).

601

O Brasil ganhou destaque neste aspecto, por apresentar a maior biodiversidade do

602

planeta, e consequente potencial para o desenvolvimento de novos produtos de origem

603

vegetal. Além disso, muitas plantas têm sido utilizadas e testadas há dezenas de anos com

604

as mais diversas finalidades por populações do mundo inteiro (FERRONATO et al. 2007).

605

Contudo, grande parte das pesquisas realizadas mencionam testes de extratos frente

606

aos micro-organismos referência, sendo necessário o estabelecimento de parâmetros mais

607

precisos quanto ao real potencial antimicrobiano de extratos em diferentes sorotipos de

608

Salmonella, uma vez que se tem relatados de diversos sorotipos como responsáveis por

609

casos e surtos de salmonelose humana no Brasil e no exterior, muitos deles envolvendo

610

alimentos de origem avícola. (KOTTWITZ et al. 2008).

611

Nesta pesquisa, objetivou-se verificar o perfil de resistência dos diferentes

612

sorovares de Salmonella frente aos antimicrobianos sintéticos comumente utilizados na

613

avicultura, avaliar a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos e aquosos de seis

614

espécies vegetais nativas do Brasil e verificar a eficiencia dos diferentes extratores

615

testados.

616

617

MATERIAL E MÉTODOS

618

Micro-organismos

619

Cento e dezoito amostras de Salmonella provenientes de frango de corte de

620

diferentes aviários da região Oeste do Paraná foram obtidas em um Laboratório de

621

Sanidade Avícola no Paraná, credenciado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e

622

Abastecimento (MAPA), durante o período de 2006 a 2010. A sorotipagem foi realizada

623

pelo Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil.

624

As amostras coletadas estavam distribuídas em trinta e seis sorotipos, e um

625

representante de cada sorotipo foi selecionado aleatoriamente para avaliar a suscetibilidade

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aos extratos vegetais. Como cepa referência, utilizou-se a Salmonella Typhimurium ATCC

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14028 (American Type Culture Collection).

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Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos

A suscetibilidade aos antimicrobianos foi avaliada através da técnica de disco-

difusão de Kirby-Bauer conforme recomendações do “Clinical and Laboratory Standards

Institute” (CLSI, 2007) utilizando-se os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico (30

µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), cefalotina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg),

enrofloxacina (10 µg), estreptomicina (10 µg), imipenem (10 µg), gentamicina (10 µg),

norfloxacina (10 µg), sulfazotrin (25 µg), tetraciclina (30 µg) e tobramicina (10 µg).

Plantas utilizadas

Planta utilizadas

As plantas de Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa), Myrciaria cauliflora

(Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-branca), Psidium

guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle L. (aroeira)

foram coletadas sempre pela manhã em diferentes localidades na região Oeste do Paraná,

sendo selecionadas baseando-se em suas atividades inibitórias reportadas anteriormente

2006; CAFFARINI et al., 2008; MACEDO-

COSTA et al., 2009; SANTOS-OLIVEIRA et al., 2009). Todas as plantas foram

identificadas e incorporadas no Herbário da Universidade Estadual do Oeste do Paraná

(UNOP).

(SANCHES et al., 2005; FENNER et al

Preparo extratos

As folhas coletadas foram secas a 40 ºC e moídas em moinho de facas até

granulometria inferior a 0,42 mm para obtenção do pó. Para a realização do extrato

etanólico, adicionou-se ao material vegetal triturado álcool etílico P.A. na proporção de

2:10 (p/v) para maceração por 24 h em agitador rotativo a 23 ºC. A concentração do extrato

realizou-se em evaporador rotativo a 40 ºC. O extrato obtido foi diluído com água destilada

estéril na concentração de 200 mg.mL

extrato aquoso, a maceração foi realizada utilizando-se como solvente extrator a água

destilada estéril, seguindo o mesmo padrão de concentração e filtragem do extrato

etanólico. Para ambos os extratos, uma última filtração a vácuo foi realizada, utilizando

e filtrado em papel de filtro. Para a obtenção do

-1

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uma membrana filtrante com porosidade de 0,45mm. As soluções foram armazenadas à 5

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°C (BONA, 2012).

Determinação das concentrações inibitórias mínimas

As suspensões bacterianas foram diluídas a fim de se obter um inóculo na

5 UFC.mL. A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da

microdiluição em caldo proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (15 µL) da diluição

foram distribuídas em placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo

Mueller Hinton (MH) (concentração dupla), com a adição anterior dos extratos. Os extratos

foram diluídos em concentrações entre 0,04 e 100 mg.mL

36 °C por 24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de

10 µL de cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM

capaz de impedir o

foi definida como a menor concentração do extrato em mg.mL

crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004).

. As placas foram incubadas a

concentração de 1 × 10

-1

-1

Determinação das concentrações bactericidas mínimas

A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al.

(2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM,

anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do

ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a

menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e

CBM foram realizados em triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No teste de suscetibilidade a antimicrobianos, 10 sorotipos de Salmonella

apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, sendo eles: Lexington (AMP-

CEF), Typhimurium e Infantis (GEN-NAL), Hadar (TET-NAL), Minnesota (NAL),

Cubana, Mbandaka, Newport, Enterica e Derby (TET). Porém, não foi estabelecida uma

relação entre o perfil de resistência destes sorotipos com a suscetibilidade aos extratos

(Tabela 1).

Informações sobre os sorotipos de Salmonella presentes no ambiente avícola,

690 quanto à prevalência, resistência a antimicrobianos e procedência são importantes fatores

691 para o controle de contaminação e transmissão. A verificação de que a atividade dos

692 extratos é independente da suscetibilidade aos antimicrobianos testados, é uma importante

693 constatação para incentivar a futura utilização dos extratos vegetais em substituição aos

694 antimicrobianos comerciais usados na alimentação de aves.

695 O extrato etanólico de M. cauliflora apresentou o maiores valores de CIM e CBM,

696 capaz de inibir o crescimento de todos os sorotipos, com a CIM variando entre 1,56 e 3,13

697 mg.mL

promovendo a inibição dos sorotipos Kentucky,

699 Corvallis, Cerro, Albany e Morehead a 12,5 mg. mL

700 A atividade inibitória (bacteriostática e/ou bactericida) dos extratos da folha de M.

701 cauliflora pode estar relacionada à presença de compostos da classe do seu principal

702 constituinte, os taninos e em menores quantidades os flavonoides (SOUZA, 2007).

703 Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a

704 compostos ativos presentes nos extratos vegetais. Nas bactérias, a atividade antimicrobiana

705 dos taninos levam à formação de complexos entre os mesmos e a parede celular ou

706 enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a inibição do transporte de

707 nutrientes para a célula, consequentemente retardando o crescimento do micro-organismo

708 (McSWEENEY et al., 2001). Já os flavonoides possuem atividade antimicrobiana

709 decorrente da desestruturação da parede celular e consequentemente destruição bacteriana,

710 destacando-se componentes como a quercetina e rutina, intimamente empregados como

711 fitoterápicos (TAGURI te al., 2004). Como também sua atividade antimicrobiana pode se

712 dar devido à inibição da atividade da DNA girasse e inibição do metabolismo energético da

713 bactéria (CUSHNIE; LAMB, 2006). Os flavonoides possuem como característica a

714 capacidade de atuarem na relação entre planta e micro-organismo devido ao fato de que a

715 ingestão dos mesmos pode interferir em diversos processos fisiológicos, bem como

716 apresentar atividade antimicrobiana (MENEZES, 2005; DJERIDANE et al., 2006).

717 Para S. molle o extrato etanólico apresentou CIM de 50 mg.mL

718 sorotipos Morehead e Panamá e de 100 mg.mL

719 valores de CBM. Os valores de CIM para extrato aquoso foram de 100 mg.mL

720 sorotipos e novamente não foram detectados os valores de CBM.

para os demais, não sendo detectados

frente aos

(Tabela 1). Já o extrato aquoso apresentou CIM

698 e CBM entre 12,5 e 50 mg.mL

-1

e CBM entre 3,13 e 6,25 mg.mL

-1

-1

-1

(Tabela 2).

-1

-1

-1

para todos

721 Não foram encontradas na literatura pesquisas sobre as propriedades

722 farmacológicas dos extratos aquosos ou etanólicos de S. molle. Porém, CARVALHO et al.

723 (2013) relataram que os compostos presentes em maior frequência na família

724 Anarcadiaceae são terpenoides e flavonoides.

725 Os terpenóides são considerados importantes alternativas no controle de patógenos

726 multirresistentes aos antimicrobianos convencionais (ZHANG; BASU, 2003). Sabe-se que

727 estes compostos possuem efeitos prejudiciais a parede celular bacteriana provocando sua

728 lise celular (TURINA et al., 2006).

729 O extrato etanólico de R. communis apresentou valores de CIM entre 12,5 e 25

730 mg.mL

731

732 mg.mL

733 apresentou atividade inibitória para os sorotipos testados (Tabela 2).

734 A atividade inibitória de R. communis pode estar relacionada aos seus constituintes

735 como ricina e flavonoides como a rutina, antimicrobianos que atuam na inibição de

736 atividade enzimática dos micro-organismos (HENRIQUES et al., 2002). Um dos

737 problemas associados à utilização do extrato de mamona refere-se a presença de proteínas

738 tóxicas encontradas na mesma, das quais destaca-se a ricina. (JACKSON et al, 2006).

739 Sabe-se que esta é venenosa a humanos e insetos (LER, et al, 2006) podendo ser um fator

740 agravante para a utilização do extrato da mamona em ração de aves, sugerindo o

741 isolamento de compostos ou detoxicação do extrato.

742 Em relação ao extrato etanólico de P. guajava, observou-se inibição frente a todos

(Tabela

743

a 100

, e para 20 sorovares não foi detectável (Tabela 1). O extrato aquoso não

para a maioria dos sorotipos, exceto para Rissen que apresentou CIM de 50

-1

-1

, Albany e Gallinarum de 100 mg.mL

-1

. A CBM variou de 25 mg.mL

-1

-1

mg.mL

os sorotipos, sendo a CIM entre 3,13 e 6,25 mg.mL

-1

e CBM 3,13 e 25 mg.mL

-1

744 1). No entanto, o extrato aquoso apresentou atividade bacteriostática somente nas

745 concentrações mais elevadas (50-100 mg.mL -1 ) e atividade bactericida foi de 100 mg.mL -1

746 frente a aproximadamente 50% dos sorotipos, exceto Albany que apresentou CMB de 50

747

748 A presença de compostos como cumarinas, flavonoides como quercetina,

749 terpenoides e taninos justifica a atividade inibitória de P. guajava (GUTIÉRREZ et al.,

750 2008; VARGAS-ALVAREZ et al., 2006). Foram encontradas na literatura relatos sobre a

751 atividade antimicrobiana de cumarinas (BASILE et al., 2009; CHIMENTI et al., 2010;

mg.mL

-1

(Tabela 2).

752 RAJA et al., 2011). Sua atividade antimicrobiana pode ser atribuída ao fato do anel de

753 cumarina levar à inibição da síntese do ácido nucleico bacteriano (ROSSELLI et al., 2007).

754 Provou-se que a adição de um grupo prenilo ao anel de cumarinas facilita a sua passagem

755 pela membrana bacteriana (STAVRI; GIBBONS, 2005).

756 Apenas o extrato etanólico de O. spixiana apresentou atividade antimicrobiana com

para todos os sorovares, exceto Senftenberg, que

. Em relação à CBM, 50% dos sorovares apresentaram

(Tabela 1). Já o extrato aquoso não apresentou

760 atividade inibitória dentro do limite de detecção (Tabela 2).

761 Não foram encontrados estudos fitoquímicos de extratos de O. spixiana, entretanto,

762 ZANIN; LORDELLO (2007) reportaram a presença de compostos alcaloides em cinquenta

763 e quatro espécies do gênero Ocotea. Segundo SAWER et al. (2005), alguns alcaloides