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LAGARTO, SERGIPE
Março, 2018.
MARIA NAIANE BARBOZA DE LIMA
LAGARTO, SERGIPE
Março, 2018.
DEDICATÓRIA
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 8
2.3.1 Maceração................................................................................................... 22
2.3.2 Ultrassom.................................................................................................... 22
2.3.3 Turbólise ..................................................................................................... 23
2.4 Compostos fenólicos ..................................................................................... 23
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 25
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 52
8 ANEXOS ................................................................................................................ 62
8
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um país privilegiado por possuir muitos recursos vegetais que são
considerados como alimentos e como auxiliares nos tratamentos de saúde. Os
produtos naturais advindos de plantas são amplamente utilizados no
desenvolvimento de novas drogas terapêuticas. Isto reflete a necessidade de
pesquisas inovadoras que explorem a capacidade terapêutica da vasta
biodiversidade brasileira (SAMPAIO, 2014). No Brasil, à vista disso, um conjunto de
resoluções e portarias delineia os instrumentos necessários à implantação da
Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, destacando-se a Relação
Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS - RENISUS (BRASIL, 2009).
al., 2001), dentre elas, estão os compostos fenólicos que podem possuir a
capacidade de inibir o crescimento de diversos microrganismos (KALEMBA;
KUNICKA, 2003). Esses compostos também podem contribuir para a prevenção da
carcinogênese devido a redução da lesão oxidativa relacionada a sua atividade
sequestradora de radicais livres, impedindo a propagação das reações e
consequente dano tecidual (XU; CHANG, 2007).
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A forma de erva daninha pode ter sido trazida junto com sementes de outras
culturas e transformaram-se em um problema em plantações por todo o mundo. É
tolerante a um número variável de ambientes e pode crescer em climas tropicais e
subtropicais (FERREIRA, 2008). É uma planta daninha bastante frequente em
pomares, cafezais, sobre cercas e entulhos de terrenos abandonados (LORENZI,
2000). No Brasil, atualmente, é encontrada em todas as regiões habitadas do país,
sendo facilmente observado nos trópicos e no Nordeste brasileiro em grande
abundância (BATRAN et al., 2006).
CH3 HO OH
H CH3
OH
HO OH HO OH
H3C CH3 H3C CH3
I O II
H3C CH2
CH3 CH3
O O OH
OHC
HO
HO OH
CH3
OH
HO OH
H3C CH3
III
H3C CH3
A BH3C CH3
CH3 CH3 CH3
O OH CH3
CH3
CH3
HO OH
H3C CH3 GLUCOSE
H3C O
A B
CH3
H3C CH3
CH3
CH3
CH3
HOH₂C
H3C O O
HO OH CH3
HO
A CH3
H3C
CH3
CH2
CH3
HOH₂C
H3C O O
HO OH
HO
et al., 2005). Além disso, Coutinho et al. (2010) demonstraram que extrato etanólico
de M. charantia L. exibe acentuada atividade antibacteriana contra uma cepa de
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). E foi demonstrado um efeito
potencializador entre este extrato e os aminoglicosídeos testados.
Kikuchi et al. (2012) testaram oito compostos glicosídicos (da classe dos
triterpenos) isolados a partir da fração metanólica do extrato das folhas de M.
charantia em cultura celular de melanoma, desencadeando mecanismos que
culminaram na inibição do desenvolvimento destas células ou na eliminação deste
tipo celular quando já desenvolvido.
2.2.6 Toxicidade
2.3.1 Maceração
2.3.2 Ultrassom
2.3.3 Turbólise
R1
OH
HO
O
O
R2
OH
B C
A CH3
OH
+
HO O
5 4
2
1 OH R R
8
O O OH R1
D E F
.
Figura 6. Estruturas químicas dos principais compostos fenólicos, A- flavonoide, B- ácido
fenólico, C- fenol simples, D - cumarina, E - tanino condensado e F- lignina.
Fonte: Elaborado pelo autor.
25
3 OBJETIVOS
4 MATERIAL E MÉTODOS
fim da secagem foi realizado em capela, a temperatura ambiente, até atingir massa
constante. Os extratos obtidos foram pesados e armazenados.
O estudo da extração por ultrassom foi realizado com 5 g das folhas moídas
da M. charantia L. e 100 mL de líquido extrator, onde o tempo de extração foi de 30
minutos a 50°C no banho ultrassônico modelo USC-1450A da UNIQUE® (BRUNI et
al., 2014). Depois de feita a filtração do líquido extrativo foi posto em rotaevaporador,
sob pressão reduzida, a temperatura de banho-maria de 40°C, até quase a secura.
Após rotaevaporação, os extratos obtidos foram pesados e armazenados.
O teor de compostos fenólicos totais dos extratos obtidos foi determinado pelo
método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau segundo metodologia proposta por
Sousa et al. (2011) com modificações. Este método é baseado na redução do
reagente Folin pelos compostos fenólicos das amostras com formação de um
complexo azul. Foi utilizado o ácido gálico como padrão de referência para
construção da curva padrão. Para a avaliação do teor de fenólicos totais nas
amostras, as alíquotas dos extratos foram diluídas com os seus respectivos
solventes usados na extração para o preparo de soluções com concentração de 2,5
mg/mL. Foram adicionados 400 μL de extrato, 8100 μL de água destilada e 500 μL
do reagente de Folin-Ciocalteu no tubo de ensaio; a mistura foi levemente agitada e
deixada em repouso por 3 minutos. Após esse período, 1000 μL da solução de
carbonato de sódio (Na₂COᴈ) 10% (m/v) foram adicionados, agitado em vortex por
29
alguns segundos e deixados no escuro, à temperatura ambiente por 1 hora. Por fim,
foram mensuradas as absorbâncias das amostras utilizando um espectrofotômetro
modelo SP-2000UV num comprimento de onda (λ) igual a 720 nm, usando água
destilada como branco, de acordo com a Figura 8. Os resultados foram
apresentados como g de equivalentes de ácido gálico por mL do extrato das folhas
de M. charantia L. (EAG/mL).
mielóide crônica), onde foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com
10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37C e
atmosfera contendo 5% de CO2. As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril,
testadas na concentração única de 50 µg/mL. Após o tratamento, as células foram
plaqueadas nas concentrações de 0,1 x 106 cél/mL para linhagens PC3 e NCIH460,
0,3 x 106 e 0,7 x 105 cél/mL para as linhagens K562 e HCT-116, respectivamente
com tempo de incubação de 72h. Ao término deste, as mesmas foram centrifugadas
e o sobrenadante foi removido. Em seguida, foram adicionados 150 µL da solução
de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram incubadas por 3h. A absorbância foi
lida após dissolução do precipitado com 150 µL de DMSO puro em
espectrofotômetro de placa a 595 nm. Os resultados foram expressos mediante
avaliação da porcentagem de inibição do crescimento celular. Esta análise foi
realizada em colaboração com os pesquisadores do Laboratório de Oncologia
Experimental da Universidade Federal do Ceará.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0,9
0,8
Absorbância (720 nm)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,1
0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01
Compostos fenólicos
4 a4 a
(ug EAG/ml) b
(ug EAG/ml)
3 b 3 c
2 c 2
1 1
0 0
T
M
T
M
Métodos de extração Métodos de extração
III IV
5 8
a
Compostos fenólicos
Compostos fenólicos
4
6
(ug EAG/ml)
b b
(ug EAG/ml)
3 c c
4
2
2
1
0 0
T
U
M
M
Figura 12. Compostos fenólicos (µg EAG/mL) de extratos obtidos por diferentes métodos e
diferentes solventes - (I) hexano, (II) diclorometano, (III) acetato de etila e (IV) etanol/água
70:30, v/v. M – Maceração; U – Ultrassom; T – Turbólise. Diferentes letras sobre as colunas indicam
diferença significativa (p<0,05).
Fonte: Elaborado pelo autor – Prisma 5.0.
8
Compostos fenólicos
a
6
(ug EAG/ml)
b c
4
0
U
T
M
Métodos de extração
Figura 13. Compostos fenólicos (µg EAG/mL) de extratos etanólicos obtidos por diferentes
métodos. M – Maceração; U – Ultrassom; T – Turbólise. Diferentes letras sobre as colunas indicam
diferença significativa (p<0,05).
Fonte: Elaborado pelo autor – Prisma 5.0.
Em relação a Figura 13, pode se notar que o melhor método para extração de
compostos fenólicos das folhas de Momordica charantia L. quando utilizado o
solvente etanol foi a maceração. O solvente hidroalcoólico (Figura 12 IV) e etanólico
(Figura 13) mostraram perfis semelhantes sobre os métodos.
Figura 14. Placas cromatográficas em sílica gel (a) e (b) como fase móvel hexano e acetato
nas proporções 60:40 e 95:5, respectivamente. (c) e (d) placas cromatográficas reveladas
sob luz UV. 1 – Maceração; 2 – Ultrassom; 3 – Turbólise.
Figura 15. Placas cromatográficas em sílica gel (a), da esquerda para direita, com a fase
móvel hexano e acetato nas proporções (90:10) extrato de hexano e diclorometano, (70:30)
extrato de acetato de etila e (50:50) extrato hidroalcoólico, reveladas em vanilina. (b) placas
cromatográficas sob luz UV. 1 – Maceração; 2 – Ultrassom; 3 – Turbólise.
Fonte: Elaborado pelo autor
Esses resultados, contudo, discordam dos observados por Ponzi et al. (2010),
que foram verificados halos de inibição de 12 mm para C. albicans para o extrato da
planta inteira (melão-de-São-Caetano). Enquanto Mada et al. (2013), demonstraram
que o extrato das folhas da mesma planta exibiu atividade antibacteriana
45
S. aureus
Figura 17. Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato hidroalcoólico (EA1) contra
bactéria Staphylococcus aureus.
Fonte: Elaborado pelo autor
Linhagens
Os dados estão apresentados como média dos valores de percentual de inibição do crescimento
celular, quando comparado ao controle, em µg/mL e Erro Padrão da Média (SEM) de experimentos
realizados pelo método do MTT após 72 horas de incubação. Os valores foram calculados a partir de
regressão não linear, utilizando o programa GraphPad Prism versão 6.0. DC2 (extrato
diclorometânico por ultrassom), AE1 (extrato de acetato de etila por maceração), HCT-116 (câncer de
cólorretal), PC3 (câncer de próstata), K562 (leucemia mielóide crônica) e NCIH460 (carcinoma de
pulmão).
Fonte: Elaborado pelo autor
6 CONCLUSÃO
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62
8 ANEXOS
63
ANEXO 1
Parameter
Table Analyzed Data 1
One-way analysis of
variance
P value < 0.0001
P value summary ***
Are means signif.
different? (P < 0.05) Yes
Number of groups 3
F 4377
R squared 0,9993
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between
columns) 9,046 2 4,523
Residual (within columns) 0,006200 6 0,001033
Total 9,052 8
ANEXO 2
Parameter
Table Analyzed Data 1
One-way analysis of
variance
P value < 0.0001
P value summary ***
Are means signif.
different? (P < 0.05) Yes
Number of groups 3
F 1671
R squared 0,9982
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between
columns) 1,726 2 0,8630
Residual (within columns) 0,003099 6 0,0005166
Total 1,729 8
ANEXO 3
Parameter
Table Analyzed Data 1
One-way analysis of
variance
P value < 0.0001
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between
columns) 4,109 2 2,055
Residual (within columns) 0,008483 6 0,001414
Total 4,118 8
ANEXO 4
Parameter
Table Analyzed Data 1
One-way analysis of
variance
P value < 0.0001
P value summary ***
Are means signif.
different? (P < 0.05) Yes
Number of groups 3
F 71,18
R squared 0,9596
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between
columns) 5,530 2 2,765
Residual (within columns) 0,2331 6 0,03885
Total 5,764 8
ANEXO 5
Parameter
Table Analyzed Data 1
One-way analysis of
variance
P value < 0.0001
P value summary ***
Are means signif.
different? (P < 0.05) Yes
Number of groups 3
F 3724
R squared 0,9992
ANOVA Table SS df MS
Treatment (between
columns) 5,616 2 2,808
Residual (within columns) 0,004524 6 0,0007540
Total 5,620 8