Perfil químico e atividade antimicrobiana de geoprópolis de abelhas nativas

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO – UFRPE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E

INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS – PPgDITM
PERFIL QUÍMICO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (Candida spp.) DE

GEOPRÓPOLIS COLETADA PELAS ABELHAS Melipona subnitida Ducke
E Melipona mandacaia Smith: FORMULAÇÕES DE GEL E SABONETE
LÍQUIDO
UMBERTO PEREIRA SOUZA JÚNIOR
Recife, 2018.
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO – UFRPE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E

INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS – PPgDITM

LÍQUIDO
Tese apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Desenvolvimento
e Inovação Tecnológica em
Medicamentos como requisito para
obtenção do grau de Doutor em
Desenvolvimento e Inovação
Tecnológica em Medicamentos.
Profa. Dra. Tania Maria Sarmento da Silva

Orientadora
Recife, 2018.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE
Biblioteca Central, Recife-PE, Brasil
S729p Souza Júnior, Umberto Pereira

Perfil químico e atividade antimicrobiana (Candida spp.)
de geoprópolis coletada pelas abelhas Melipona subnitida
Ducke e Melipona mandacaia Smith: formulações de gel e
sabonete líquido./ Umberto Pereira Souza Júnior. – 2018.
127 f. : il.
Orientadora: Tania Maria Sarmento da Silva.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e
Inovação Tecnológica em Medicamentos, Recife, BR-PE, 2018.
Inclui referências e anexo(s).
1. Abelha - Produtos 2. Própole 3. Candidíase 4. Sabonete

5. Medicamentos ginecológicos I. Silva, Tania Maria Sarmento da,
orient. II. Título
CDD 615.19
LÍQUIDO
A presente tese foi julgada para obtenção do título de Doutor em

Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos, sendo aprovada
em 30/08/2018 pelo Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e
Inovação Tecnológica em Medicamentos, em sua forma final.
Dra. Tania Maria Sarmento da Silva

UFRPE – Orientadora / Presidente
Dra. Daniella Carla Napoleão

UFPE – Membro titular
Dra. Magda Rhayanny Assunção Ferreira

UFPE – Membro titular
Antônio Cláudio da Silva Lins

UFRPE – Membro titular
Dra. Girliane Regina da Silva

FAST – Membro titular
Minha família: O motivo.
A vocês, dedico!
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Dra. Tânia Maria Sarmento da Silva: Obrigado pelos

ensinamentos, paciência e acima de tudo, pela oportunidade de crescimento
profissional.
À Profa. Dra. Eva Mônica Sarmento da Silva pela coleta das amostras de
geoprópolis na região de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA).
Minha família: Beto, Graça, Binha, Gau, Eduardo, e minhas crias: sem o
apoio de vocês, nenhum trabalho em minha vida teria se concretizado.
Obrigado, essa conquista também é de vocês!
Amigos queridos: Francisco Rodrigo e Débora Munique. Obrigado pelas

contribuições e acima de tudo, pelos momentos compartilhados, nas
expectativas, angústias e conquistas!
À turma BIOFITO, pessoas nas quais descobri o valor de uma parceria.

Mesmo em pouco tempo de convívio, ficou a admiração, respeito e amizade.
Girliane, Telma, Amanda, Ayalla, Rogélio, Sônia, Hélter, Maria: Vocês são
notáveis! Gratidão por tudo!
À empresa HEBRON, aos diretores e time gerencial, que a mim

permitiram que um projeto virasse realidade, me suportando tempo para
estudos, estrutura física, equipamentos, materiais e, sobretudo autonomia
nessa fase de crescimento e aprendizado. À vocês, minha eterna gratidão!
Aos amigos tão especiais, sem os quais, nada teria se concretizado:

Edna, Melissa, Wérika, Wéverton, Jéssica, Daysiane, Flavinho: Obrigado por
sonharem comigo, acreditar que seria possível, me apoiar e contribuir para que
minhas atividades de doutorado não prejudicassem minhas obrigações
corporativas. A vocês, meu muito obrigado!
À equipe dos laboratórios da INFAN, que contribuíram de maneira ímpar

para realização dos experimentos de microbiologia e desenvolvimento de
formulações: Dayanna, Adriana, Lucimere, Dona Ana e Dona Val, Thiago,
Tatiana, Ernestina, Nelson, Fátima: Obrigado!
À Universidade Estadual da Paraíba, nas pessoas das professoras Ana
Cláudia e Jozinete Pereira, pelo fornecimento das cepas ATCC das espécies
de Candida spp., utilizadas nesta pesquisa, agradeço!
Tati, Thalita e Thamires, grandes pessoas as quais tenho a ousadia de

chamar Amigas, agradeço todo o apoio prestado durante essa caminhada!
Sem a ajuda de vocês, tudo teria sido bem mais difícil.
Danielle, uma grande amiga, que tive a honra de ganhar ainda durante
minha graduação. Agradeço as palavras de ânimo, e o material de pesquisa
fornecido prontamente, quando mais precisei.
Simoninha, uma amiga especial: Obrigado por abrir-me as portas da

Biblioteca da UFPE – Campus Agreste, contribuindo ricamente com minha
pesquisa bibliográfica e importantes momentos de estudos.
Aos amigos de jornada, durante a caminhada deste doutorado,

companheiros de viagens, hospedagem, noites de estudos, momentos de
descontração. Agradeço as boas energias!
Ao CENAPESQ da UFRPE, pelo apoio prestado, para as análises em

UHPLC/MS.
“Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma
humana, seja apenas outra alma humana”.
Carl Jung
RESUMO
Perfil químico e atividade antimicrobiana (Candida spp.) de geoprópolis coletada pelas abelhas Melipona
subnitida Ducke e Melipona mandacaia Smith: formulações de gel e sabonete líquido.
Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos

Umberto Pereira Souza Júnior (umbertociencias@gmail.com)
As abelhas nativas ou abelhas sem ferrão são importantes polinizadores para a flora nativa local,
principalmente na região Nordeste do Brasil. São produtoras de mel, pólen (saburá) e geoprópolis. A
geoprópolis é uma mistura de resina de plantas, ceras, barro e misturas salivares das abelhas. As abelha-
sem-ferrão Melipona subnitida (jandaíra) e Melipona mandacaia (mandaçaia) são nativas e endêmicas do
Nordeste brasileiro. As geoprópolis destas duas espécies foram coletadas nos estados da Paraíba e
Pernambuco, respectivamente. As amostras foram submetidas às análises por cromatografia líquida de
ultra eficiência acoplada com detectores de arranjo de diodo e espectrômetro de massas tipo
triploquadrupolo e tempo de voo (UHPLC-DAD-qTOF-MS/MS), atividade antifúngica frente a cepas do
gênero Candida (Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guillermondii e C. parapsilosis)
e formulação de dois produtos farmacêuticos: um gel para uso tópico vaginal (geoprópolis de jandaíra) e
sabonete líquido para higienização íntima da mulher (geoprópolis de mandaçaia). Três diferentes
formulações de gel foram preparadas utilizando extrato de geoprópolis, carbômero, propilenoglicol e água.
Realizou-se testes físicos, visuais, pH, viscosidade e de liberação in vitro para as formulações propostas.
Foram realizados testes antifúngicos com o extrato etanólico da geoprópolis frente a seis espécies de
Candida. O perfil químico do extrato da geoprópolis e da formulação do gel após o teste da liberação foi
analisado. As formulações apresentaram pH entre 4,6 e 4,8, viscosidade entre 535.600 e 920.400 cPs. O
extrato de geoprópolis apresentou excelente atividade antifúngica para as leveduras testadas. Estudos de
liberação em membrana semipermeável de celulose mostraram que as formulações compostas por
propilenoglicol entre 5% a 10% apresentaram melhor liberação. Tanto o extrato etanólico da geoprópolis
como o líquido obtido do teste de liberação mostraram a presença de flavonoides (flavonol/flavona,
flavanona e chalconas). A formulação de sabonete líquido contendo o extrato etanólico da geoprópolis de
mandaçaia foi acompanhado pelos ensaios de pH, viscosidade, densidade relativa e análises
microbiológicas. Os parâmetros de controle de qualidade que caracterizaram a formulação de sabonete
líquido com o ativo extrato de geoprópolis (produto terminado) foram: aspecto visual do produto sendo
líquido viscoso, coloração marron, perolado, pH preferencialmente entre 4,5 e 5,0; viscosidade entre
2.000 cps a 20.000 cps, densidade compreendida entre 1.000 g/mL e 1.120 g/mL. A formulação de
sabonete líquido contendo extrato etanólico de geoprópolis de mandaçaia para higienização dos órgãos
genitais poderá ser utilizado como forma adjuvante no tratamento de infecções vaginais causadas por
leveduras do gênero Candida. Caracteriza-se por um produto inovador, onde os constituintes de sua
formulação apresentam-se ideais para limpeza da pele e mucosa com ações comprovadas in vitro frente
a diversas cepas de leveduras do gênero Candida.
Palavras-chave: Geoprópolis. Candida spp. Candidíase vaginal. Gel. Sabonete líquido.

ABSTRACT
Chemical profile and antimicrobial activity (Candida spp.) from geopropolis collected by Melipona subnitida
Ducke and Melipona mandacaia Smith bees: gel and liquid soap formulations.
Development and Technological Innovation in Medicines Postgraduate Program

Umberto Pereira Souza Júnior (umbertociencias@gmail.com)
Native bees or stingless bees are important pollinators for local native flora, mainly in the northeastern
region of Brazil. They are producers of honey, pollen (saburá) and geopropolis. The geopropolis is a resin
blend of plants, waxes, clay and salivary mixtures of bees. The stingless bees Melipona subnitida
(jandaíra) and Melipona mandacaia (mandaçaia) are native and endemic to the Brazilian Northeast. The
geoprópolis of these two species were collected in the states of Paraíba and Pernambuco, respectively.
The samples were submitted to ultra-high performance liquid chromatography coupled with diode array
detectors and triploquadrupolo mass spectrometers and flight time (UHPLC-DAD-qTOF-MS / MS),
antifungal activity against strains of the genus Candida (Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C.
tropicalis, C. guillermondii and C. parapsilosis) and formulation of two pharmaceutical products: a gel for
topical vaginal use (jandaíra’s geoprópolis) and liquid soap for women intimate hygiene (mandaçaia’s
geoprópolis). Three different gel formulations were prepared using geopropolis extract, carbomer,
propylene glycol and water. Physical, visual, pH, viscosity and in vitro release tests were performed for the
proposed formulations. Antifungal tests with the geopropolis ethanolic extract were performed against six
Candida species. The geopropolis extract and the gel formulation chemical profile after the release test
were analyzed. The formulations presented pH between 4.6 and 4.8, viscosity between 535,600 and
920,400 cPs. The geopropolis extract presented excellent antifungal activity against the yeasts tested.
Cellulose semipermeable membrane release studies presented better release rates for formulations
composed between 5% and 10% propylene glycol. Both the geopropolis ethanolic extract and the liquid
obtained from the release test showed the presence of flavonoids (flavonol / flavone, flavanone and
chalcones). The liquid soap formulation containing the mandaçaia’s geoprópolis ethanolic extract of was
followed by the pH, viscosity, relative density and microbiological analyzes. The final characteristic quality
control parameters of the active geopropolis extract liquid soap formulation (finished product) consisted of:
brown, pearlescent, viscous liquid visual aspect; pH preferably between 4.5 and 5.0; viscosity between
2,000 cps at 20,000 cps; density ranging from 1,000 g/ml to 1120 g/ml. The liquid soap formulation
containing mandaça’s geoprópolis ethanolic extract intended for topical genital hygiene could be used as
adjuvant treatment for yeast (genus candida) vaginal infections. Characterizing itself as an innovative
product, with a formulation ideal for the cleansing of the vaginal skin/mucosa potentialized with an in vitro
action against several Candida strains.
Keywords: Geopropolis; Candida spp ., Vaginal yeast infection; Gel; Liquid soap.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURAS:
Figura 1 – Mapa de distribuição geográfica dos Meliponíneos:........................ 17

Figura 2 – Diferentes subespécies das abelhas Mandaçaia encontradas no
Brasil: 1: Melipona Quadrifasciata quadrifasciata, 2: Melipona quadrifasciata
anthidioides e 3: Melipona mandacaia Smith. .................................................. 18
Figura 3 – Melipona subnitida. As manchas “sub-nitidas”. O nome científico da
jandaíra, Melipona subnitida, deve-se as manchas amarelas, visíveis apenas
em operárias jovens (imagem à esquerda), mas não em operarias mais velhas
(imagem à direita): ........................................................................................... 19
Figura 4 – Geoprópolis produzida pela abelha sem ferrão, jandaíra (Melipona
subnitida Ducke) coletada no Sítio Riacho, Vieirópolis-PB-Brasil. ................... 20
Figura 5 – Mapa localizando os municípios de Juazeiro-BA-Brasil, e Petrolina-
PE-Brasil, onde foram coletadas as amostras de geoprópolis da abelha
mandaçaia. ....................................................................................................... 38
Figura 6 – Mapa localizando o município de Vieirópolis-PB-Brasil onde foram
coletadas as amostras de geoprópolis da jandaíra. ......................................... 39
Figura 7 – Fotografia de espécie de Senna (Senna obtusifolia) sendo visitada
por uma espécie de abelha Exomalopsis sp., na região da caatinga brasileira.
......................................................................................................................... 69
Figura 8 – UPLC-DAD (340 nm) do extrato etanólico de geoprópolis da abelha
mandaçaia e cromatograma obtido por MSE (UPLC-qTOF/MSE) em modo
negativo. Amostra M1. ..................................................................................... 71
Figura 12 – Efeito da permeabilidade de geoprópolis da abelha jandaíra (J11)
sobre membrana celular de Candida albicans (ATCC 18804), demonstrado
através do ensaio do cristal violeta. ................................................................. 85
Figura 13 – Fotografia de formulação de gel com geoprópolis (1%) da abelha
jandaíra (Melipona subnitida Ducke). ............................................................... 89
Figura 14 – Espalhabilidade de formulações de gel contendo extrato de
geoprópolis. ...................................................................................................... 91
Figura 15 – Tempo de adesão das formulações de gelk contendo extrato de
geoprópolis, em tampão citrato (pH 4,5). ......................................................... 91
Figura 16 – Distância de “fuga” (vazamento) das formulações de gel contendo
extrato de geoprópolis. ..................................................................................... 92
Figura 17 – Estudos de libertação in vitro do extrato, no gel de geoprópolis,
através da membrana de celulose em solução salina tamponada com fosfato
pH 5,0. .............................................................................................................. 93
Figura 18– Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) do estudo de
liberação de extrato de geoprópolis da formulação de gel. Revelado em NP
(ácido difenilbórico etanolamina – Metanol) e detecção por irradiação
ultravioleta 254 e 366 nm. ................................................................................ 95
Figura 19– Cromatogramas UPLC-DAD (340 nm) de extrato de geoprópolis (A)
utilizado na formulação de gel. Cromatograma de íons de pico de base (BPI)
obtido por um método de técnica de coleta de dados MSE (UPLC-qTOF / MSE)
em modo negativo (B) para o citado extrato. ................................................... 96
Figura 20– Cromatogramas UPLC-DAD (340 nm) de meio receptor (A) após
liberação de extrato de geoprópolis da formulação de gel, através de
membrana semipermeável. Cromatograma de íons de pico de base (BPI)
obtido por um método de técnica de coleta de dados MSE (UPLC-qTOF / MSE)
em modo negativo (B) para o mesmo meio receptor. ...................................... 97
Figura 21– Formulação de sabonete líquido de geoprópolis (esquerda) e
própolis vermelha (direita). ............................................................................. 101
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
QUADROS:
Quadro 1 – Produtos naturais com atividade antifúngica, utilizados no

tratamento de candidíases: .............................................................................. 29
Quadro 2 – Composição da formulação de gel para uso vaginal contendo
extrato de geoprópolis. ..................................................................................... 49
Quadro 3 – Limites microbiológicos permitidos para preparações vaginais, de
acordo com a ANVISA: .................................................................................... 57
Quadro 4 – Composição para formulação de sabonete líquido para uso vaginal
contendo extrato de geoprópolis. ..................................................................... 60
Quadro 5 – Limites microbiológicos permitidos para produtos cosméticos tipo I
(que entram em contato com mucosas), de acordo com a ANVISA: ............... 63
Quadro 6– Resultados para as análises microbiológicas, conforme a ANVISA,
para preparações vaginais. .............................................................................. 92
Quadro 7– Resultados das análises físico-químicas e microbiológicas para
formulação de sabonete líquido. .................................................................... 102
LISTA DE TABELAS
Tabela 1– Rendimento dos extratos etanólicos de geoprópolis da Melipona

subnitida Ducke. ............................................................................................... 42
mandacaia Smith.............................................................................................. 43
Tabela 3– Rendimento da fração fenólica obtido por SPE de meio receptor. .. 56
Tabela 4 – Teor de fenólicos totais para as amostras de geoprópolis da abelha
mandaçaia ........................................................................................................ 64
jandaíra: ........................................................................................................... 65
Tabela 6 – Origem botânica para geoprópolis dos meliponíneos mandaçaia e
jandaíra, de acordo com estudos de Silva (2015) 1 e Souza (2016) 2. ............. 68
Tabela 7 – Caracterização de compostos em geoprópolis coletada da abelha
mandaçaia (Melipona mandacaia Smith) por UPLC/QTOF-MSE (continua): .... 75
Tabela 8– Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida
Mínima (CFM) de geoprópolis da abelha jandaíra frente a cepas de Candida
albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilermondii, C. parapsilosis: 82
Tabela 9– Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida
Mínima (CFM) de geoprópolis da abelha mandaçaia frente a cepas de Candida
albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilermondii, C. parapsilosis: 84
Tabela 10– Análises visuais e físico-químicas para o gel de geoprópolis da
abelha jandaíra (Melipona subnitida Ducke) .................................................... 90
Tabela 11– Dados cinéticos do estudo de liberação para o gel de geoprópolis
da abelha jandaíra. ........................................................................................... 93
Tabela 12– Caracterização dos compostos por UPLC/QTOF-MSE para o meio
receptor, no estudo de liberação de extrato de geoprópolis do gel. ................. 98
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABS Absorbância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
BPF Boas Práticas de Fabricação
CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CFM Concentração Fungicida Mínima
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical & Laboratory Standards Institute
DMSO Dimetilsulfóxido
DP Desvio Padrão
EDTA Ácido Etileno Diamino Tetra-Acético
ESI Electrospray Ionization
EAG Equivalente em Ácido Gálico
MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
PEG Polietilenoglicol
PVP Polivinilpirrolidona
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RPM Rotações Por Minutos
SPE Solid-Phase Extraction
TSB Tryptic Soy Broth
UV-Vis Ultravioleta-Visível
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16
1.1. Abelhas sem ferrão: Meliponíneos ...................................................... 16
1.2. Geoprópolis ......................................................................................... 20
1.3. Candida spp. e candidíase vulvovaginal ............................................. 23
1.3.1. Candidíase vulvovaginal ............................................................... 25
1.3.2. Tratamento das candidíases vulvovaginais .................................. 26
1.4. Gel para uso vaginal ........................................................................... 30
1.5. Sabonete líquido para uso vaginal ...................................................... 32
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 36
2.1. Objetivo Geral ..................................................................................... 36
2.2. Objetivos específicos .......................................................................... 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 38
3.1. Coleta das amostras de geoprópolis ................................................... 38
3.3. Obtenção dos extratos de geoprópolis ................................................ 42
3.3.2. Extração em fase sólida (SPE) ..................................................... 43
3.4. Análise do perfil químico da geoprópolis ............................................. 44
3.4.1. Determinação do teor de fenólicos totais ...................................... 44
3.4.2. Análise cromatográfica por UPLC/QTOF-MSE.............................. 45
3.5. Avaliação da atividade antifúngica in vitro e determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM)........................................................... 45
3.5.1. Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) ........... 47
3.5.2. Ensaio do cristal violeta ................................................................ 48
3.6. Desenvolvimento de formulação de gel .............................................. 49
3.6.1. Processo de formulação: manipulação do gel .............................. 49
3.6.2. Avaliação das formulações de Géis.............................................. 50
3.7. Desenvolvimento de formulação de sabonete líquido para uso vaginal
3.7.1. Processo de formulação: manipulação do sabonete líquido ......... 59
3.7.2. Avaliação das formulações de sabonete líquido ........................... 61
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 64
4.1. Teor de fenólicos totais para geoprópolis............................................ 64
4.3. Análise química por ultra cromatografia (UPLC/QTOF-MSE) .............. 70
4.4. Atividade antifúngica in vitro dos extratos de geoprópolis frente
leveduras do gênero Candida ....................................................................... 81
4.4.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima – CIM e
Concentração Fungicida Mínima – CFM ................................................... 81
4.4.2. Ensaio do Cristal violeta ............................................................... 85
4.5. Formulação de gel............................................................................... 89
4.5.1. Obtenção do gel: .......................................................................... 89
4.5.2. Avaliação das formulações de gel de geoprópolis ........................ 89
4.6. Formulação de sabonete líquido para uso vaginal ............................ 101
4.6.1. Obtenção do sabonete líquido: ................................................... 101
4.6.2. Avaliação das formulações de sabonete líquido ......................... 101
5. CONCLUSÕES ....................................................................................... 107
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 109
ANEXO 1 – Patente depositada: Processo BR 10 2018 008156 0 ............. 127
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Abelhas sem ferrão: Meliponíneos
Abelhas sem ferrão, meliponas ou meliponíneos são pertencentes ao

reino Animalia, filo Arthropoda, classe Insecta, ordem Hymenoptera, subordem
Apocrita, superfamília Apoidea, família Apidae, subfamília Meliponinae, tribo
meliponini. São assim conhecidas por apresentar seu acúleo (ferrão) atrofiado,
e tem hábitos sociais mais avançados (ABREU, 2016; KERR; CARVALHO;
NASCIMENTO, 1996; NOGUEIRA-NETO, 1997).
Estas abelhas são criadas de maneira racional, para fins de pesquisa ou

atividades agro comerciais, sendo uma atividade desenvolvida por pequenos e
médios produtores (SOUZA et al., 2009). A criação de meliponíneos de
maneira racional gera renda sustentável, evita a perda de colônias e contribui
para a manutenção da biodiversidade, através da polinização de espécies de
plantas nativas (CORTOPASSI-LAURINO et al., 2006; SLAA et al., 2006;
VENTURIERI, 2012).
Os meliponíneos constroem seus ninhos com materiais que podem ser

obtidos na natureza como as resinas vegetais, o barro, fibras vegetais,
sementes etc. Outros materiais utilizados na construção são produzidos ou
processados no interior da colônia, como a cera, cerume, batume e o
geopropólis (WITTER; NUNES-SILVA, 2014).
Abelhas da tribo meliponini são consideradas especializadas por possuir

hábitos extremamente dependentes das características climáticas e florísticas
de suas respectivas regiões de origem, quando comparadas a outras abelhas
consideradas menos exigentes (KERR; CARVALHO; NASCIMENTO, 1996).
Estas abelhas apresentam-se em maior diversidade nos trópicos

americanos (neotrópicos), com aproximadamente 400 espécies descritas, onde
em muitos locais são as abelhas mais abundantes, e possivelmente, os
polinizadores mais importantes. Elas ocorrem naturalmente também no sudeste
asiático, Norte da Austrália e África, conforme demonstrado na figura 1
(CAMARGO; PEDRO, 2007; MICHENER, 2013; NOGUEIRA-NETO, 1997).
17
Figura 1 – Mapa de distribuição geográfica dos Meliponíneos:
Fonte: Oliveira et al., 2013
De acordo com Souza e colaboradores (2009) nas Américas as espécies

de meliponíneos ocorrem do sul da América do Sul, até as montanhas do norte
do México, na América Central.
No Brasil, os meliponíneos são abundantes, com mais de 200 espécies

conhecidas, sendo que muitas ainda não foram descritas (SILVEIRA;
ALMEIDA; MELO, 2002). Essa diversidade de espécies é atribuída ao fato dos
ecossistemas brasileiros apresentarem características que possibilitam a
criação das abelhas, tanto pelas condições climáticas favoráveis quanto pela
oferta abundante de alimento como néctar e pólen (VENTURIERI, 2008).
O tipo de vegetação xerófila e flora variada, características da região

Nordeste do Brasil, denomina-se “caatinga”, e apresenta precipitação baixa e
irregular, além de altas temperaturas durante todo o ano (DRUMOND, et al.,
2000) sendo possível se observar uma baixa variedade de espécies de
meliponíneos quando comparada ao cerrado e a mata atlântica (CARVALHO,
1999; CASTRO, 2001). A caatinga é predominante na área que abrange a
região do Vale do Submédio São Francisco (BEDOR et al., 2009).
18
Dentre as abelhas nativas da região da caatinga brasileira, quatro

espécies conhecidas pertencem ao gênero Melipona. São elas: Melipona
subnitida, Melipona marginata, Melipona asilvai e Melipona mandacaia
(ZANELLA, 2000).
Para os meliponíneos conhecidos como mandaçaia são relatadas três

subespécies que ocorrem em diferentes ambientes no Brasil (conforme
ilustrado na figura 2): Na região Sul ocorre a forma Melipona quadrifasciata
quadrifasciata, que possui menor tamanho entre as três. Caracteriza-se por
suas listras amarelas contínuas, e menores quando comparadas as demais.
Elas habitam regiões mais altas e mais frias. Da região Sul até o sul do
Nordeste ocorre a forma Melipona quadrifasciata anthidioides, que apresenta o
tamanho maior, e vive em temperaturas mais altas que a anteriormente citada,
apresentando listras interrompidas no meio do abdômen. Por fim, na região
Nordeste e Norte do país ocorre a forma Melipona mandacaia Smith que por
sua vez tem o abdômen com listras amarelas mais largas que nas
outras subespécies e está adaptadas as regiões semi-áridas.
Estudos baseados em modelagem de nicho ecológico sugerem que a

espécie Melipona Mandacaia Smith é restrita ao bioma da caatinga ao longo do
Rio São Francisco (BATALHA-FILHO; WALDSCHMIDT; ALVES, 2011).
Figura 2 – Diferentes subespécies das abelhas Mandaçaia encontradas no

Brasil: 1: Melipona Quadrifasciata quadrifasciata, 2: Melipona quadrifasciata
anthidioides e 3: Melipona mandacaia Smith.
1 2 3
Fonte: Nogueira-Neto, 1997.

19
No Nordeste do Brasil é conhecida também a espécie Melipona subnitida

Ducke, comumente chamada de jandaíra, que é considerada endêmica da
Caatinga (FREITAS, 1999). Segundo Villas-Bôas (2012) espécies de Melipona
subnitida Ducke ocorrem nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão,
Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte e Sergipe.
Melipona subnitida Ducke foi descrita pela primeira vez em 1910 no

Maranhão, sendo que o clima semiárido da região Nordeste do Brasil por
milhares de anos resultou, ao longo do tempo, na evolução de características
fisiológicas e comportamentais que permitem à essas espécies a sobrevivência
em condições consideradas hostis para muitos animais e plantas
(IMPERATRIZ-FONSECA; KOEDAM; HRNCIR, 2017). A figura 3 ilustra a
espécie citada.
Figura 3 – Melipona subnitida. As manchas “sub-nitidas”. O nome científico da

jandaíra, Melipona subnitida, deve-se as manchas amarelas, visíveis apenas
em operárias jovens (imagem à esquerda), mas não em operarias mais velhas
(imagem à direita):
Fotos: Michael Hrncir. Fonte: Imperatriz-Fonseca; Koedam; Hrncir, 2017.

20
1.2. Geoprópolis
As substâncias resinosas, produzidas pelas abelhas Apis mellifera, são

chamadas de própolis, e tem sua origem a partir da coleta em brotos e
exsudatos vegetais, misturados a enzimas das próprias abelhas em seu
metabolismo. É utilizada pelas abelhas para vedar suas colmeias, protegendo-
as de invasores, também para embalsamar insetos mortos dentro da colmeia.
Além disso, a diversidade química em sua constituição permite a proteção
desses insetos contra microrganismos invasores, como fungos e bactérias
(BANKOVA, 2005; VIUDA-MARTOS et. al., 2008).
Já a geoprópolis (figura 4) é produzida a partir de uma mistura de resinas

vegetais, secreções salivares, cera, grãos de pólen e barro (NOGUEIRA-
NETO, 1997) e é utilizada de modo semelhante à própolis produzida pelas
abelhas Apis mellifera (SOUZA et al., 2009).
Figura 4 – Geoprópolis produzida pela abelha sem ferrão, jandaíra (Melipona

subnitida Ducke) coletada no Sítio Riacho, Vieirópolis-PB-Brasil.
Fonte: Tania M. S. da Silva.
O barro coletado por meliponíneos é utilizado principalmente para fechar

as aberturas na construção da entrada e do batume divisório, misturado com
21
resinas e própolis, formando a geoprópolis. Esta geoprópolis é de consistência

dura e coloração característica do barro da região. As abelhas utilizam ainda a
geoprópolis, para a mumificação de inimigos ou competidores por espaço,
como os coleópteros, que nidificam na madeira (ALVES; SOUZA; CARVALHO,
2007).
Nos últimos anos, a geoprópolis produzida por diferentes espécies de

abelhas sem ferrão tem mostrado atividades terapêuticas como anticancer
(BARTOLOMEU et al., 2016), antioxidante (DUTRA et al., 2014; SOUZA et a.,
2013; 2014), antinflamatoria (FRANCHIN et al., 2012; 2013; SOUZA et al.,
2014) gastroprotetora (RIBEIRO-JUNIOR et al., 2015), antiviral (COELHO et
al., 2015) e antimicrobiana (CUNHA et al., 2013).
A geoprópolis tem sido utilizada na medicina popular para vários fins

terapêuticos (CASTALDO; CAPASSO, 2002) sendo algumas de suas
atividades biológicas já comprovadas (CUNHA et al., 2013; FRANCHIN et al.,
2012; LIBERIO et al., 2011; VELIKOVA et al., 2000).
Bankova e colaboradores (1998a) identificaram mais de cinquenta

compostos, principalmente fenólicos e terpênicos da geoprópolis brasileira
produzida pelas abelhas Melipona compressipes, Melipona quadrifasciata
anthidioides e Tetragona clavipes. Compostos como diterpenos, triterpenos e
ácido gálico foram encontradas em 21 amostras de geoprópolis brasileira de
meliponíneos.
Para amostras de geoprópolis coletadas na região da baixada fluminense

no Maranhão, de meliponíneos da espécie Melipona fasciculata Smith, foram
encontrados compostos fenólicos para todas as amostras estudadas, além de
triterpenos e saponinas (DUTRA et al., 2008).
Investigações realizadas por Freitas e colaboradores (2008) em

geoprópolis de meliponíneos da espécie Trigona spinipes no Nordeste
brasileiro, permitiu o isolamento dos triterpenos cicloartanos ácido
magniferólico e ácido 3-β-hidroxi-24-metilenocicloartan-26-óico, além dos
22
flavonoides 3’-metil-quercetina, sakuranetina, éter 7-metil kaempferol, tricetina

e éter 7-metil aromadendrina como compostos majoritários.
Análises químicas para geoprópolis da abelha Melipona subnitida Ducke

tem demonstrado alto teor de compostos fenólicos totais, onde a análise
fitoquímica revelou a presença de taninos hidrolisáveis, flavonoides das classes
das flavonas e flavonóis, xantonas e triterpenos pentacíclicos livres (DE
SOUSA et al., 2015), ácidos fenólicos como o ácido gálico (SOUZA et al.,
2014).
A geoprópolis da Melipona subnitida Ducke vem sendo estudada pelo

nosso grupo de pesquisa e as análises químicas têm demonstrado a presença
de compostos fenólicos como galloil hexosídeos, ácido elágico, acil-
(cinnamoil/coumaroil)-hexosídeos, acil-(cinnamoil/coumaroil)-galloil-
hexosídeos, além de flavonoides (agliconas e acilados-O-glicosídeos) (DE
SOUZA et al., 2018; DE SOUZA et al., 2013). Dois compostos (1,6-di-O-(E)-
coumaroil-2-O-galoil--D-glucopiranosídeo e 1-O-cinamoil-6-O-(E)-coumaroil-2-
O-galloil--D-glicopiranosídeo) foram isolados como novos compostos (DE
SOUZA et al., 2018).
Não foram encontradas informações de produtos apícolas a base de

geoprópolis registrados no Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
(MAPA).
Atualmente, produtos contendo geoprópolis não estão especificamente

regulamentados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) nem
pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA).
No ano de 2011, a ANVISA publicou a RDC 24 de 14 de Junho de 2011,

dispondo sobre o registro de medicamentos específicos, dentre os quais
àqueles a base de própolis, se enquadravam. De acordo com a citada
legislação, medicamentos a base de própolis são enquadrados como
medicamentos específicos opoterápicos, definidos como preparações obtidas a
partir de glândulas, tecidos, outros órgãos e secreções animais, destinada a fim
terapêutico ou medicinal (BRASIL, 2011). Esse é o primeiro relato que legisla
23
sobre medicamentos formulados a partir da própolis, no entanto, nada foi

encontrado na literatura sobre o registro de medicamentos a base de
geoprópolis.
Para ANVISA, o registro de um medicamento opoterápico deve

apresentar um relatório técnico, contendo as seguintes informações: Relatório
de estabilidade de medicamentos; dados do opoterápico; layout da embalagem
primária e secundária, conforme legislação vigente; documento referente ao
local de fabricação; relatórios de produção e controle de qualidade e relatório
técnico com informações de segurança e eficácia (BRASIL, 2011).
O MAPA estabelece a partir da Instrução Normativa número 3 de 19 de

Janeiro de 2001, critérios de identidade e qualidade da própolis, no entanto, a
mesma legislação não refere-se a geoprópolis (BRASIL, 2001).
1.3. Candida spp. e candidíase vulvovaginal
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância sanitária – ANVISA

(BRASIL, 2004a), dentre centenas de espécies de fungos já descritos na
literatura, as leveduras do gênero Candida são os maiores agentes de infecção
hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com
doenças graves e àqueles em período pós-operatório.
Leveduras do gênero Candida apresentam colônias com textura variada,

lisa ou rugosa, úmida, brilhante e de coloração branca ao creme amarelado.
Microscopicamente, são células pequenas, com aproximadamente 2 a 5 x 3 a 7
μm), com formato esférico ou ovóide e parede fina, se reproduzindo de forma
assexuada principalmente pelo mecanismo de brotamento. Algumas espécies
podem apresentar a formação de hifas verdadeiras, e mais frequentemente de
pseudohifas (KURTZMAN; FELL; BOEKHOUT, 2011; SILVA et al., 2012).
A candidíase é uma micose causada por leveduras do gênero Candida,

podendo causar lesões brandas ou severas, agudas ou crônicas, superficiais
ou profundas, sendo sua manifestação clínica bastante variável. O principal
24
agente causador das candidíases é a espécie Candida albicans, a qual

constitui cerca de 60% dos isolados em amostras clínicas. No entanto,
espécies como Candida tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii,
C. glabrata, C. kefyr, C. lusitaniae, C. viswanathii C. famata, dentre outras, têm
sido isoladas em achados clínicos (CHAVES; CAVALCANTI; PORTO, 2003;
MENEZES et. al, 2004).
Espécies de Candida são comensais no organismo humano, e faz parte

da microbiota normal de indivíduos sadios. Tais microrganismos tornam-se
patogênicos, quando há uma ruptura no equilíbrio normal dessa microbiota, ou
sistema imunológico do hospedeiro, tornando as espécies de Candida
agressivas em suas manifestações (MONGE et al., 2006).
De acordo com Barbedo e Sgarbi (2010) a origem dessa doença pode ser
endógena, quando originada da manifestação de microrganismos comensais
do próprio hospedeiro, ou exógena, quando adquiridos, como no exemplo de
uma Doença Sexualmente Transmissível (DST).
Numerosos fatores contribuem para as infecções fúngicas por espécies

de Candida, dentre os quais se podem destacar: o rompimento das barreiras
cutânea e mucosa, disfunção dos neutrófilos, defeito na imunidade mediada
por células, desordens metabólicas, exposição direta aos fungos, extremos de
idade (recém-nascidos e idosos), desnutrição aguda, tratamentos prolongados
com antibióticos e corticosteroides, quimioterapia, transplantes, resistência a
antifúngicos, dentre outros (PFALLER; DIEKEMA, 2007).
25
1.3.1. Candidíase vulvovaginal
As infecções que acometem o aparelho geniturinário são consideradas

problemas de saúde pública, e tem relação direta com as condições sócio
econômicas da população (MASCARENHAS et al., 2012). São manifestações
características de tais infecções, as vulvovaginites, balanopostite e candidúria,
podendo acometer homens e mulheres (ACHKAR; FRIES, 2010).
A candidíase vulvovaginal consiste num processo inflamatório, com

secreção espessa e esbranquiçada, prurido vulvar, disúria e dispaurenia
(LOPEZ-MARTINEZ, 2010). É um distúrbio ocasionado pelo crescimento
anormal de fungos leveduriformes na mucosa do trato genital feminino,
causando infecção da vulva e vagina (ZIARRUSTA, 2002).
Vulvovaginites causadas por Candida spp. acomete 75% das mulheres,

pelo menos uma vez durante sua vida, ocorrendo com maior frequência em
idade fértil (ADESIJI et al., 2011; GANDHI et al., 2015; MEDEIROS et al.,
2017).
Um grupo menor de mulheres (entre 6 e 9%) apresenta a recorrência

dessa doença, denominando-se assim candidíase vulvovaginal recorrente e
caracteriza-se pelo aparecimento dos sintomas, por pelo menos três vezes na
mesma mulher, em período inferior a um ano (FOXMAN et al., 2013; JACK;
SOBEL, 2016).
Para candidíases vulvovaginais, Candida albicans é o agente etiológico

predominante, responsáveis pelos casos de 85% a 95% dessas infecções
(BEHZADI, et al., 2015; HONG et al., 2014).
Os casos mais simples de candidíase vulvovaginal geralmente apresenta

a espécie Candida albicans como único agente etiológico, no entanto em casos
mais graves da doença outras espécies do mesmo gênero têm sido
detectadas, principalmente quando o quadro clínico do paciente envolve
gravidez, diabetes e imunossupressão (LI et al., 2014).
26
Sinais e sintomas relacionados às candidíases vulvovaginais inclui

ardência, ressecamento, edema e eritema, além de leucorreia e presença de
placas esbranquiçadas na mucosa vaginal (ANDRIOLI et al., 2009; BRANDOLT
et al., 2017).
As candidíases vulvovaginais são consideradas como a segunda causa

mais comum de infecções genitais em mulheres com idade reprodutiva, e
caracteriza-se com um problema de saúde pública a nível mundial
(RODRIGUES, SIMÕES, DINIZ, 2009; WHO, 2013; BRANDOLT et al., 2017).
1.3.2. Tratamento das candidíases vulvovaginais
O tratamento das candidíases vulvovaginais inclui a utilização de

medicamentos antifúngicos, de uso tópico e sistêmico, sendo três principais
classes utilizadas: os polienos (como a anfotericina B e nistatina), os imidazóis
(como clotrimazol e miconazol) e os triazóis (exemplo: fluconazol e itraconazol)
(PAIVA et al., 2009).
De forma geral, a maioria dos pacientes deve responder bem ao

tratamento com antifúngicos disponíveis na prática clínica, todavia esse tipo de
tratamento vem se mostrando ineficaz, principalmente pelo alto índice de
resistência dos fungos, sobretudo as substâncias azólicas, que requer um
tratamento complementar com a utilização de creme vaginal a base de
anfotericina B e óvulos ou géis de flucitosina (DENNING; HOPE, 2010).
Os fármacos azólicos são contra indicados durante a gravidez devido ao

risco de desenvolvimento de teratogênese fetal, portanto, torna-se altamente
prejudicial para mulheres que estejam em idade fértil e que queiram engravidar
(SOBEL, 2007). Nestes casos, cremes vaginais a base de anfotericina B são
empregados, porém, a utilização em longo prazo apresenta riscos à saúde da
mulher, visto os efeitos nefrotóxicos atribuídos a este tipo de substância (CHAI
et al., 2013).
27
O itraconazol demonstra boa atividade no tratamento de infecções em

mucosas por espécies do gênero Candida, no entanto, são escassos os
estudos que comprovem sua eficiência no tratamento de infecções sistêmicas
por espécies de Candida. O Voriconazol é um agente antifúngico triazólico, que
pode ser utilizado para tratar infecções graves invasivas por espécies de
Candida e candidemias e candidíases esofágica, sendo ativo inclusive frente a
algumas cepas resistentes ao fluconazol (PAPPAS et al., 2004).
A caspofungina foi o primeiro agente antimicótico licenciado, pertencente

a classe dos equinocandinos de uso parenteral, também utilizado nos
tratamentos de infecções invasivas por Candida (PAPPAS et al., 2004;
SHEEHAN; HITCHCOCK; SIBLEY, 1999). Os antifúngicos da classe dos
equinocandinos atuam sobre a parede celular dos fungos, que apresenta
constituição peculiar, diferenciando-os dos mamíferos, tornando-os assim
medicamentos seletivos em tratamentos de candidíases (FORTUN-ABETE,
2009).
Diversos outros antifúngicos presentes no mercado são indicados no

tratamento de candidíases oral e vaginal, no entanto a literatura tem
demonstrado a ocorrência de cepas com sensibilidade diminuída e outras
resistentes in vivo e in vitro a determinados agentes quimioterápicos
(CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 1999). Além disso, as espécies de Candida
podem apresentar diferentes perfis de sensibilidade a diferentes antifúngicos,
em diferentes populações e situações (LYON, 2008).
De acordo com estudos realizados por Dalazen et al. (2011), no

tratamento das candidíases de manifestações orais ou vaginais, existe um alto
índice de resistência ao fluconazol e a anfotericina B, principalmente em
pacientes que apresentam recidivas a essas infecções. Segundo Ribeiro et al.
(2004), nenhum dos antifúngicos disponíveis no mercado representa a droga
ideal para o tratamento de candidíases.
Com base nas citadas limitações na terapêutica para os quadros clínicos

de candidíase, estudos com produtos naturais vem sendo triados in vitro frente
a leveduras do gênero Candida spp. (ABÍLIO, et al., 2014).
28
Produtos naturais vêm se mostrando atrativos no desenvolvimento de

pesquisas clínico-farmacológicas, com o objetivo de controlar e até mesmo
erradicar formas microbianas associadas com o desenvolvimento de patologias
que atingem o homem moderno (SALEEM, 2010).
A busca de atividade antimicrobiana de produtos naturais se justifica pela

sua riqueza de constituintes químicos bioativos. Os principais grupos destes
constituintes, que são responsáveis pela atividade antimicrobiana de produtos
naturais incluem compostos fenólicos, quinonas, saponinas, flavonoides,
taninos, fenazinas, cumarinas, lignanas, neolignanas, terpenóides e os
alcalóides (HAYEK; GYAWALI; IBRAHIM, 2013).
Raimundo e Toledo (2017) realizaram levantamento bibliográfico sobre os

principais produtos naturais utilizados atualmente no Brasil, com atividade
frente a microrganismos do gênero Candida spp. O quadro 1 apresenta as
principais espécies vegetais, bem como propriedades farmacológicas e
constituintes químicos levantados:
29
Quadro 1 – Produtos naturais com atividade antifúngica, utilizados no tratamento de candidíases:

Planta medicinal / Nome
Propriedades farmacológicas Principais constituintes Referências
Origem popular
Cinnamomum
Canela Morte celular de fungos Eugenol CASTRO, 2010.
Zeylanicum
CASTRO, 2006;
Punica granatum Romã Inibição do crescimento fúngico Alcaloides, taninos gálicos. SILVA, 2012;
LORENZI, MATOS, 2008;
Rosmarinus officinalis Aumenta a permeabilidade da CASTRO, 2006;
Alecrim Terpenos, cineol, α-pineno e cânfora.
L. parede celular dos fungos CLEFF et al., 2012;
Boldo do LIMA et al., 2006;
Peumus boldus Benth Inibição do crescimento fúngico Barbatusina, ciclobarbatusina, cariocal.
chile LORENZI, MATOS, 2008;
Óleo volátil rico em bisaboleno, MENEZES et al., 2009;
Psidium guajava Goiabeira Inibição do crescimento fúngico
sesquisterpenos e ácido linoleico. LORENZI, MATOS, 2008;
Tanino, flavonoides, saponinas, cânfora,
LORENZI, MATOS, 2008;
Ocimum Basilicum Manjericão Inibição do crescimento fúngico no óleo essencial a presença de eugenol,
ALMEIDA et al., 2011;
cineol, pireno e linalol.
ABRANTES et al., 2013
Tem ação no metabolismo do Óleo essencial com presença de
Origanun vulgare L. Orégano LORENZI, MATOS, 2008;
fungo. carvacol, borneal, cineol e terpineno.
CLEFF, 2008;
Limão Flavonoides rutina, óleo essencial rico em ABRANTES et al., 2013
Citrus limon Inibição do crescimento fúngico
siciliano limoneno, linalol, citral e furanocumarinas. LORENZI, MATOS, 2008;
Inulina, óleo essencial, lapatina, GLEHN, RODRIGUES, 2012;
Arctium lappa L. Bardana Inibição do crescimento fúngico
fuquinona e glicosídeos. LORENZI, MATOS, 2008;
Óleo essencial, carotenoides, flavonoides, GLEHN, RODRIGUES, 2012;
Calêndula officinalis L. Calêndula Inibição do crescimento fúngico
mucilagens, saponinas e resinas. LORENZI, MATOS, 2008;
Propolis Inibe a divisão celular e a ALMEIDA et al., 2012;
Apis mellifera Flavonoides
Vermelha replicação do DNA dos fungos ABREU, 2008;
Ação anti-inflamatória, cicatrizante Taninos, bioflavonoides, ácidos
Schinus terebinthifolia DIAS, et al., 2006;
Aroeira e antimicrobiana para fungos e triterpenicos e óleo essencial formado por
raddi LORENZI, MATOS, 2008;
bactérias. sequiterpenos.
Schinopsis brasiliensis Taninos, flavonoides, fenóis, triterpenos,
Braúna Inibição do crescimento fúngico GUIMARÃES, 2010.
Engl. esteroides e polifenois.
Fonte: Raimundo; Toledo (2017).
30
1.4. Gel para uso vaginal
Entre as formas farmacêuticas utilizadas no tratamento tópico de

condições e patologias da área vulvovaginal estão as pomadas, cremes,
espumas e géis (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
Géis são formas farmacêuticas semissólidas destinadas à aplicação

tópica, podendo ser utilizados sobre a pele, na superfície do olho ou ainda por
via nasal, vaginal ou retal. Os géis são considerados dispersões de pequenas
ou grandes moléculas, em um veículo líquido aquoso, que adquire consistência
semelhante às geleias pela adição de um agente gelificante (ALLEN JR;
POPOVICH; ANSEL, 2013).
Entre os agentes gelificantes utilizados estão as macromoléculas

sintéticas, como carbômero, polivinilpirrolidona (PVP) e o poloxamer, os
derivados da celulose como a carboximetilcelulose e as gomas naturais e as
argilas (PRISTA et al., 2014).
De acordo com Aulton (2005), a principal característica do gel é sua

estrutura contínua, que lhes confere propriedades semelhantes à de sólidos,
onde um agente gelificante constrói uma matriz tridimensional através da
incorporação de um líquido hidrofílico, apresentando uma importante função
em veicular substâncias ativas como fármacos.
Assim, essas formulações apresentam-se eficazes, quando o fármaco

não se liga aos agentes gelificantes, permitindo que substâncias bioativas
sejam liberadas em seus sítios de ação, por permitir a difusão relativamente
livre de moléculas menores (PRISTA et al., 2014).
Substâncias ou complexos bioativos com características apolares,

incorporadas aos géis, terão uma maior afinidade pelo fluido receptor
(mucosas) do que pela base polimérica, contribuindo para uma melhor
liberação nesses sítios de ação. Assim, durante o desenvolvimento desse tipo
de formulação deve-se considerar sua afinidade pela base, para predizer o
perfil de liberação de um agente ativo a partir de um veículo (CHORILLI et al.,
2007).
31
A superfície da vagina é revestida com células escamosas epiteliais e

muco, produzido por várias glândulas. Os produtos tópicos vaginais são
utilizados em contato direto com os tecidos propensos a infecções, por isso
devem estar livres de agentes patogênicos como bactérias e fungos, devendo
ser acondicionados em tubos e embalagens específicas, e devem ser aplicados
na vagina através de ponteiras aplicadoras específicas (ALLEN JR;
De acordo com a Farmacopeia brasileira publicada pela ANVISA, uma

contaminação microbiana de um produto não estéril, seja ela especialidade ou
matéria-prima farmacêutica, pode conduzir não somente à sua deterioração,
com as mudanças físicas e químicas associadas, mas também, ao risco de
infecção para o usuário. Assim, os produtos farmacêuticos tópicos que não são
estéreis, devem ser submetidos aos controles da contaminação microbiana
(BRASIL, 2010).
Por isso, a garantia da qualidade e os controles de produção devem ser

tais, que os microrganismos capazes de proliferar e contaminar o produto,
estejam dentro dos limites, que devem ser adequados às várias categorias de
produtos, bem como a via de administração, o consumidor final (neonatos,
crianças, idosos, debilitados), e outros fatores. Ao avaliar os resultados dos
testes microbiológicos, o número e os tipos de microrganismos presentes
devem ser considerados no contexto do uso do produto proposto (BRASIL,
2010).
O polímero utilizado na formulação do gel tem direta relação com o

comportamento reológico do produto, podendo influenciar a sua estabilidade
física e seu comportamento sobre a pele, como a liberação do ativo pelo
veículo. As características reológicas são importantes propriedades
consideradas para esses produtos de uso tópico (LEONARDI; MAIA CAMPOS,
2001), pois o tipo de polímero utilizado, sua concentração na fórmula e a
temperatura de armazenamento influenciam as propriedades reológicas dos
géis (CORRÊA et al., 2005).
32
Embora exista na literatura estudos de desenvolvimento de formulações

de géis contendo extratos de produtos naturais diversos, não foi encontrado
esse tipo de formulação contendo geoprópolis.
As formulações constantes na literatura compreendem: Gel de

Thripodanthus acutifolius (Corpo), com atividade anti-inflamatória (ALICIA, et
al., 2012), gel de Aloe vera (KHAN et al., 2013), gel contendo extrato de
acerola e ameixa (CEFALI et al., 2018), gel com extrato de folhas de
Antirrhinum majus (SHAHTALEBI et al., 2018), gel contendo mistura de
extratos de ervas tailandesas (JANTARAT et al., 2018) para aplicações
antiacnes, e gel com atividade antimicrobiana, contendo extratos de ervas das
seguintes espécies vegetais: Azadirachta indica, Curcuma longa, Allium
sativum, Ocimum sactum, Cinnamomum zeylanicum e Tamarindus indica
(BHINGE et al., 2017).
É relatado também o desenvolvimento de gel contendo extrato de própolis

(BALATA; EL NAHAS; RADWAN, 2014).
Assim, géis contendo extrato de geoprópolis, torna esse tipo de

formulação inovadora para área de desenvolvimento de produtos
farmacêuticos.
1.5. Sabonete líquido para uso vaginal
A ocorrência de doenças vaginais ocasionados por microrganismos

patogênicos como leveduras de Candida é frequente na prática clínica da
ginecologia. Além do tratamento de infecções, através de medicamentos de
uso tópico e sistêmico, para melhora do quadro clínico, é imprescindível que
haja uma higienização adequada da região vulvovaginal. A higienização com
produtos não adequados pode causar desequilíbrios na acidez vaginal,
provocando mau cheiro, irritação, e ainda outras infecções, uma vez que o
interior da vagina é habitado naturalmente por microrganismos que formam a
flora vaginal, responsáveis pelo combate a organismos patogênicos invasores
(GARCIA et al., 2009; MARINO, 2005).
33
O tratamento adjuvante com o uso de sabonetes íntimos é utilizado como

forma de higienização adequada, para controlar a proliferação microbiana na
região vaginal. Assim, a utilização de sabonete líquido para essa finalidade
constitui-se uma excelente alternativa terapêutica, devido ser constituído por
uma mistura de tensoativos, adicionados de substâncias emolientes,
antissépticas, aromatizantes, quelantes, conservantes e tampões, que devem
promover um equilíbrio físico, químico e microbiológico da região vaginal
(FERREIRA, 2002).
Os sabonetes líquidos são formulações inovadoras das últimas décadas,

e tem ganhado o mercado de produtos para cuidados pessoais, dado a suas
características de cremosidade, detergência, tecnologias associadas a sua
produção, e a veiculação de aditivos com funções diversas e específicas,
incluindo as substâncias bioativas, como antissépticos e anti-inflamatórios, que
fazem dessas formulações cosméticas, interessantes alvos de aquisição pela
população (CORREA; KUREBAYASHI; ISSAC, 2012).
No Brasil, a fabricação de cosméticos e produtos de higiene pessoal é

regulamentada pela ANVISA, através da Resolução RDC número 48/2013, que
aprova o regulamento técnico de Boas Práticas de Fabricação (BPF) para
produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes, e dá outras providências,
e a Resolução RDC número 7/2015, que dispõe sobre os requisitos técnicos
para regularização de produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes, e
dá outras providências (BRASIL, 2013; BRASIL, 2015).
De acordo com a ANVISA, produtos de higiene pessoal, cosméticos e

perfumes são preparações constituídas por substâncias naturais ou sintéticas,
de uso externo nas diversas partes do corpo humano, pele, sistema capilar,
unhas, lábios, órgãos genitais externos, dentes e membranas mucosas da
cavidade oral, com o objetivo exclusivo ou principal de limpá-los, perfumá-los,
alterar sua aparência e ou corrigir odores corporais e ou protege-los ou mantê-
los em bom estado (BRASIL, 2015).
Para a agência reguladora, a fabricação desse tipo de produto no país

deve seguir rigorosamente um conjunto de normas de BPF, que devem refletir
34
os requisitos mínimos necessários a serem cumpridos pelas empresas durante

a fabricação, embalagem e armazenamento, bem como o controle de
qualidade desses produtos. Os produtos de higiene pessoal e cosméticos
devem ser seguros nas condições normais ou previsíveis de uso (BRASIL,
2013; BRASIL, 2015).
Os sabonetes líquidos para uso íntimo podem apresentar alterações em

sua formulação, principalmente aquelas relacionadas à sua estabilidade,
condições de processamento e armazenamento. Por isso, ensaios de Controle
de Qualidade devem ser eficientes em detectar tais alterações, através de
ensaios físicos, químicos e microbiológicos, tanto das matérias primas, material
de embalagem e produto a granel, quanto para o produto terminado,
considerando seus fatores intrínsecos e extrínsecos (CRONEMBERGER;
PAULA; MEIRELLES, 2015).
Segundo Correa e colaboradores (2012), a maioria dos sabonetes

líquidos não está distante dos verdadeiros sabões, sendo, porém compostos
pela associação destes com detergentes, como sulfonatos de olefina, os
alquilsulfatos e os anfóteros betaínicos. Para abrandar o efeito exagerado de
desengraxante durante as lavagens, as formulações de sabonete líquido têm
incluído alguns tipos de reengordurantes ou sobreengordurantes ou
emolientes, como por exemplo: o octil-hidroxiestearato e o PEG-7 glicerol
cocoato.
Com relação aos detergentes utilizados para esse tipo de formulação, o

lauril sulfato de sódio e o lauril éter sulfato de sódio são detergentes sintéticos
mais utilizados no preparo de sabonetes líquidos, e as alcanolamidas de ácido
graxo de coco são comumente incluídas a essas formulações com o objetivo
de melhorar suas qualidades espumógenas, além de ajudar a espessar a
composição. Tradicionalmente são utilizados ainda agentes opacificantes, para
transformar as preparações transparentes em peroladas, podendo para isso
utilizar o etilenoglicol ou copolímeros derivados do estireno, acrilato ou
poliestireno (CORREA; KUREBAYASHI; ISSAC, 2012).
35
Não existe no mercado nenhuma formulação de sabonete líquido

contendo extrato de geoprópolis em sua composição. Dessa forma, a
formulação proposta, constitui-se num produto totalmente inovador, que
associa as características de excelente higienização de um sabonete íntimo
equilibrado, com propriedades bioativas da geoprópolis durante o tratamento
de candidíase vaginal.
36
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Estudar a geoprópolis, coletada pelas abelhas Melipona subnitida Ducke

(jandaíra) e Melipona mandacaia Smith (mandaçaia) quanto ao seu perfil
químico e atividade antifúngica frente a leveduras do gênero Candida,
propondo duas formulações: Um gel para aplicação tópica e um sabonete
líquido, adjuvantes ao tratamento de quadros clínicos de candidíase vaginal.
2.2. Objetivos específicos
 Obter extratos etanólicos da geoprópolis das abelhas jandaíra e

mandaçaia, bem como frações fenólicas, através da técnica de
microextração em fase sólida, para análises e formulações.
 Determinar o teor de fenólicos totais dos extratos de geoprópolis das

abelhas mandaçaia e jandaíra.
 Identificar os principais constituintes químicos dos extratos de

geoprópolis da mandaçaia, através da técnica UPLC/QTOF-MSE.
 Analisar a atividade antifúngica dos extratos de geoprópolis da

mandaçaia e jandaíra, frente a cepas ATCC de leveduras do gênero
Candida (Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C.
guilermondii, C. parapsilosis), determinando sua Concentração
Inibitória Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima (CFM),
prevendo o efeito da permeabilidade celular, através dos ensaios do
cristal violeta.
 Obter um gel contendo extrato de geoprópolis da abelha jandaíra,

avaliando parâmetros de controle de qualidade físico químicos e
microbiológicos.
37
 Estudar in vitro a liberação do gel de geoprópolis em membrana

artificial de celulose, conhecendo assim a cinética de liberação da
formulação proposta.
 Analisar os principais constituintes químicos da geoprópolis da abelha

jandaíra, liberados da formulação de gel, através das técnicas
UPLC/QTOF-MSE e Cromatografia em Camada Delgada Analítica
(CCDA).
 Obter um sabonete líquido contendo extrato de geoprópolis da abelha

mandaçaia, analisando parâmetros físicos, químicos e microbiológicos
de Controle de Qualidade.
38
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Coleta das amostras de geoprópolis
As amostras de geoprópolis das abelhas mandaçaia (Melipona

mandacaia Smith) foram coletadas na região do Rio São Francisco, nas
cidades de Juazeiro (BA) e Petrolina (PE) (Figura 5), pela professora Dra. Eva
Mônica Sarmento da Silva, do departamento de zootecnia da Universidade do
Vale do São Francisco (UNIVASF). As amostras foram acondicionadas em
frascos plásticos, sendo mantidas a 4 ºC até o início dos procedimentos de
análise.
As amostras foram coletadas no ano de 2012, identificadas como M1

(Abril 2012, campus da UNIVASF, Petrolina); M2, M3 e M4 (Abril 2012,
Juazeiro).
Figura 5 – Mapa localizando os municípios de Juazeiro-BA-Brasil, e Petrolina-

PE-Brasil, onde foram coletadas as amostras de geoprópolis da abelha
mandaçaia.
Fonte: O autor
39
Amostras de geoprópolis das abelhas jandaíra (Melipona subnitida Ducke)

foram coletadas ao longo de seis anos, em diferentes meses, no sítio Riacho,
localizado no município de Vieirópolis, Paraíba, Brasil (Figura 6), nos meses de
março de 2010 (J1); junho de 2011(J2); janeiro de 2012 (J3); abril de 2012 (J4);
junho de 2012 (J5); abril de 2013 (J6); maio de 2013 (J7); dezembro de 2013
(J8); setembro de 2014 (J9); janeiro de 2015 (J10); abril de 2015 (J11); maio de
2015 (J12) e setembro de 2015 (J13).
Figura 6 – Mapa localizando o município de Vieirópolis-PB-Brasil onde foram

coletadas as amostras de geoprópolis da jandaíra.
Fonte: Souza, 2016.

40
3.2. Equipamentos e Reagentes
Para obtenção dos extratos etanólicos utilizou-se um sonicador sem

aquecimento (Unic 1600A, Unique, São Paulo, Brasil) para um melhor
rendimento de extração.
Para a extração em fase sólida foi utilizado cartucho Strata C18 (SPE,
strata 1g, Phenomenex-Allcrom, São Paulo, Brasil). Foram utilizados os
solventes etanol (EtOH), (Cinética, São Paulo, Brasil), metanol (MeOH)
(J.T.Baker, Phillipsburger, EUA), água deionizada, obtida por osmose reversa,
acetato de etila (AcOEt) (Dinâmica, São Paulo, Brasil).
O teor de fenólicos totais foi determinado em espectrofotômetro UV-visível

(LAMBDA 45 UV/Vis, Perkin Elmer, São Paulo, Brasil). Para os citados testes
foram utilizados os reagentes Folin-Ciocalteu, ácido gálico (Sigma-Aldrich,
Sternheim, Alemanha), carbonato de sódio (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) e
água deionizada obtida por osmose reversa.
Para a Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) foram

utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha) e
como reveladores foram utilizados, os reagentes Liebermann e NP (ácido
difenilbórico etanolamina-MeOH), detectado por irradiação ultravioleta 254 e
366 nm (LUB01, Boitton, Porto Alegre, Brasil).
Para as análises cromatográficas por UPLC/QTOF-MSE utilizou-se um

cromatógrafo líquido de ultra-eficiência ACQUITY UPLC H-Class (Waters
Corporation, Milford, MA, EUA), acoplado a um espectrômetro de massas
Quadrupolo-TOF (Xevo G2-XS QTOF, Waters, EUA) com ionização por
eletrospray (ESI). A coluna utilizada foi do tipo ACQUITY UPLCTM BEH C18
(2,1 x 50 mm, 1,7μm, Waters, EUA). Os reagentes de fase móvel foram água
deionizada, ácido fórmico e acetonitrila (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil). Como
substância padrão utilizou-se Leucinaencefalina. A aquisição e análise dos
dados foi realizada utilizando o software Waters MassLynx 4.1.
41
Padrões de pureza conhecida, previamente isolados (3-O-methyl-

quercetin, naringenin, Isorhamnetin, 7-O-methyl naringenin) (Souza et al.,
2013) foram utilizados.
Para os testes microbiológicos utilizaram-se os seguintes meios de

cultura: Agar Sabouraud 4%, Ágar Nutriente (Merck), e os meios líquidos água
peptonada (Merck), DMSO (Dimetilsulfóxido) (Vetec química fina), caldo
Sabouraud dextrose (Merck), revelador resazurina sódica e cetoconazol como
controle positivo (Piramal Healthcare, India). Utilizou-se ainda estufa
bacteriológica (Fanem, São Paulo, Brasil) para incubação. Nos ensaios de
cristal violeta foram utilizados EDTA, cristal de violeta (Merck), e os resultados
foram lidos por espectrofotometria (Espectrofotômetro Lambda 25 UV/VIS,
PERKIN ELMER, São Paulo, Brasil).
As formulações de gel e sabonete líquido foram analisadas com auxílio de

centrífuga (Centrífuga, Baby-I, 206 BL, FANEM, São Paulo, Brasil) pHmetro
(PG 1800 Gehaka, São Paulo – Brasil) e viscosímetro (Modelo LVT, Brookfield
Engineering Lab., Inc., Middleboro, MA). Para os testes de espalhabilidade das
formulações de gel utilizou-se placas de vidro, papel milimetrado. Para testes
de adesão dos géis e vazamento, foram utilizados meio de cultura (ágar em
tampão fosfato pH 4,5) e equipamento de desintegração (Desintegrador DIST-
3, Pharma-Test, Hainburg, Germany) especificamente para os testes de
adesão.
Para os testes de liberação in vitro da formulação de gel utilizou-se

membrana artificial de acetato de celulose para diálise em forma de tubo
(MWCO 12000 - 14000 - 5M, Serva, Germany) e aparelho de dissolução
(ERWEKA DT808 LH, Germany). Os dados foram analisados através de
espectrofotometria (Espectrofotômetro LAMBDA 25 UV/VIS - PERKIN ELMER).
42
3.3. Obtenção dos extratos de geoprópolis
3.3.1. Obtenção dos extratos etanólicos de geoprópolis das abelhas

mandaçaia e jandaíra
Para obtenção dos extratos, as amostras brutas foram previamente

pulverizadas, e submetidas à extração com etanol sob agitação, com auxílio de
sonicação em banho ultrassônico sem aquecimento (Unic 1600A, Unique, São
Paulo, Brasil), para uma melhor eficiência de extração, durante 30 minutos.
As amostras de geoprópolis permaneceram em repouso para decantar a

terra. Após filtração, as soluções extrativas foram concentradas em
rotaevaporador sob pressão reduzida a 40 °C para remoção do solvente
orgânico. Este procedimento foi repetido cinco vezes para obtenção de uma
maior quantidade de extratos etanólicos.
As treze amostras de geoprópolis da abelha jandaíra apresentaram

rendimento de extração que variaram de 1,6% a 9,2 %. A tabela 1 apresenta os
valores de partida, e os valores de rendimento:

subnitida Ducke (continua).
Extrato de geoprópolis (jandaíra)

Amostra de
Rendimento de
geoprópolis Amostra bruta (g) Extrato EtOH (g)
extração (%)
J1 200 17,8 8,9
J2 200 18,4 9,2
J3 200 16,09 8,0
J4 200 12,02 6,0
J5 200 8,9 4,4
J6 200 2,7 1,4
J7 200 8,5 4,2
J8 200 5,6 2,8
J9 439,6 27,89 6,3
J10 454,15 18,09 3,9
43
Tabela 1 – Rendimento dos extratos etanólicos de geoprópolis da Melipona

subnitida Ducke (conclusão).
J11 527,8 8,5 1,6
J12 388,39 27,18 7,0
J13 536,4 15,34 2,8
Conforme observado na tabela 2, para as amostras de geoprópolis da

abelha mandaçaia os rendimentos variaram entre 10% e 25%.

mandacaia Smith.
Extrato de geoprópolis (mandaçaia)

Amostra de
Rendimento de
geoprópolis Amostra bruta (g) Extrato EtOH (g)
extração (%)
M1 50,4132 10,5587 20,9443
M2 49,9789 4,99989 10,00
M3 25,6327 6,5150 25,4167
M4 25,2533 3,5668 14,1241
3.3.2. Extração em fase sólida (SPE)
Todas as amostras de geoprópolis da abelha mandaçaia foram ainda

extraídas, a partir dos extratos etanólicos, utilizando cartucho de extração em
fase sólida C18 (SPE, 1g, Phenomenex). As amostras (100 mg) dos extratos
etanólicos foram solubilizadas em 2 mL de metanol : água deionizada
(proporção de 1,5 : 0,5) e a solução foi ajustada para pH 2,0 por adição de
ácido clorídrico concentrado enquanto era agitada em agitador magnético
durante 10 minutos.
Os cartuchos de C18 foram sequencialmente condicionados com 6 mL de

metanol e 6 mL de água destilada deionizada, respectivamente, de modo que
os mesmos não permanecessem secos. As amostras foram aplicadas nos
cartuchos, lavadas com 10 mL de água e eluídas com 10 mL de metanol para
obtenção de compostos fenólicos. A solução foi evaporada sob pressão
44
reduzida a 40 °C produzindo a fração fenólica. As frações fenólicas tiveram um

rendimento de 53% a 57%.
3.4. Análise do perfil químico da geoprópolis
3.4.1. Determinação do teor de fenólicos totais
Fenólicos totais foram determinados para todas as amostras de

geoprópolis da abelha mandaçaia (M1 a M4), e para as amostras J9, J10, J11,
J12 e J13 da abelha jandaíra.
O teor de fenólicos totais dos extratos e frações foi determinado,

utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu de acordo com o método de Slinkard e
Singleton (1977) com pequenas modificações, sendo o ácido gálico utilizado
como composto fenólico padrão.
Foram preparadas soluções em etanol (1,0 mg/mL) de todas as amostras

dos extratos e frações fenólicas. Para os ensaios, foram colocados em
eppendorf, 100 µL da amostra (concentração final 100 µg/mL), 820 µL de água
ultrapura e 20 µL do reagente de Folin-Ciocalteu homogeneizando com
vigorosa agitação manual, durante 1 min. Em seguida foi adicionado 60 µL de
uma solução de carbonato de sódio a 15%. A mistura foi agitada e permaneceu
em repouso durante 2 horas, protegida da luz.
Após o período de reação, uma alíquota da mistura (300 µL) foi

transferida para placa de 96 poços e a absorbância foi detectada a 760 nm
contra um branco de leitura (água destilada), em espectrofotômetro UV-visível
(LAMBDA 45 UV/Vis, Perkin Elmer, São Paulo, Brasil). Todas as
determinações foram realizadas em triplicata.
O conteúdo total de fenólicos foi expresso como miligrama equivalente ao

ácido gálico por grama de extrato seco da amostra (mg EAG/g), considerando-
se o desvio padrão (DP), utilizando uma equação obtida a partir da curva
analítica do padrão ácido gálico.
45
3.4.2. Análise cromatográfica por UPLC/QTOF-MSE
Para as análises cromatográficas em UPLC/QTOF-MSE, o espectrômetro

de massas foi operado em modo negativo de Ionização (ESI -) no modo
sensibilidade. A detecção foi implementada no modo centróide MSE em uma
faixa de massa de 50-1200 Da. Todas as análises foram realizadas utilizando o
lockspray para garantir a precisão e reprodutibilidade dos valores de massas.
Leucinaencefalina (5 ng ml-1) foi utilizada como padrão/referência para

calibração.
A aquisição e análise dos dados foi realizada utilizando o software Waters

MassLynx 4.1.
A identificação dos compostos para geoprópolis foi baseada na

similaridade de dados como tempo de retenção, espectro de ultravioleta (UV-
VIS) e massas encontrados na literatura, além da utilização de padrões de
pureza conhecida (3-O-methyl-quercetin, naringenin, Isorhamnetin, 7-O-methyl
naringenin) bem como investigação no software Metlin.
3.5. Avaliação da atividade antifúngica in vitro e determinação da

Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Para avaliação da atividade antifúngica dos extratos etanólicos das

diversas amostras de geoprópolis, foram testadas as cepas ATCC (American
Type Culture Collection), dos seguintes microrganismos: Candida albicans
(ATCC 18804), Candida krusei (ATCC 34135), Candida glabrata (ATCC 2001),
Candida tropicalis (ATCC 13803), Candida guilliermondii (ATCC 6260) e
Candida parapsilosis (ATCC 22019).
As cepas foram adquiridas, a partir da coleção de leveduras, do

Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos da Universidade do Estado
da Paraíba. Previamente aos testes, as linhagens de leveduras foram
inoculadas em meio sólido Ágar Nutriente (Merck), e mantidas a 32,5ºC + 2,5ºC
em estufa bacteriológica, durante 24 horas, como forma de pré-cultivo.
46
Em seguida, procedeu-se a padronização do inóculo (CLSI, 2002), que

consistiu no preparo de uma suspensão das leveduras em água peptonada
(Merck) 0,1% estéril, com turvação correspondente a 0,5 da escala McFarland,
correspondente a aproximadamente 1,0 X 10 6 UFC/mL (para leveduras).
Posteriormente, essa suspensão fúngica foi diluída em água peptonada 0,1%
(Merck) a 1:100, seguida de outra diluição 1:20 da suspensão padrão, onde
obteve-se uma suspensão de 2,5 x 103 UFC/mL, que foram utilizados nos
ensaios.
As soluções testes das amostras de geoprópolis foram preparadas

utilizando-se 10 mg das amostras solubilizas em 1 mL de DMSO, obtendo-se
uma concentração inicial de 10 mg/mL. A partir dessa concentração, foram
realizadas diluições em água purificada e estéril, para obtenção de uma
solução estoque a 1 mg/mL, numa proporção de até 10% de DMSO.
A Concentração Inibitória Mínima foi determinada através da técnica de

microdiluição em placas, contendo 96 poços em forma de “U”, de acordo com a
metodologia descrita pelo CLSI, especificamente a norma M27-A2 (CLSI, 2002;
VIRIATO, 2014).
A cada um dos 96 poços em forma de “U” foi adicionado 80 µl de caldo

Sabouraud dextrose. Para a primeira linha da placa acrescentou-se 100 µl das
soluções testes (extratos de geoprópolis) e a partir dessas foram realizadas
diluições sucessivas para determinação da Concentração Inibitória Mínima
(CIM). Por último, em cada um dos 96 poços da placa, foram adicionados 20 µl
da suspensão de microrganismo. As placas foram fechadas, envolvidas com
plástico filme, e incubadas a 32,5ºC + 2,5ºC durante 24 horas em estufa
bacteriológica, para leitura dos resultados.
As concentrações finais das amostras em meio de cultura foram 500; 250;

125; 62,5; 31,25; 15,62 e 7,8 μg/mL, diluídas no próprio caldo Sabouraud
dextrose em cada fila dos poços nas placas.
Como revelador, foi adicionado em cada um dos poços, 25 μL de

resazurina sódica, conforme orientações de Punithavathy e colaboradores
47
(2012), preparada em água destilada estéril na concentração de 0,01% (p/v).

Logo após, as placas foram incubadas por duas horas a 32,5ºC + 2,5ºC para
análise.
Cetoconazol foi utilizado como controle positivo. Essa substância foi

cedida por um laboratório farmacêutico nacional, e armazenados conforme
orientações do fabricante (Piramal).
Como controles negativos, foram utilizadas as soluções diluentes, nas

mesmas condições de diluição das amostras. Foram realizados ainda controle
da esterilidade dos meios de cultura, bem como controle de viabilidade dos
microrganismos.
A Concentração Inibitória Mínima foi definida como a menor concentração

do agente antimicrobiano capaz de impedir o crescimento visível dos
microrganismos testados nas placas de microdiluição, seguindo-se a
metodologia proposta pelo CLSI (2002).
3.5.1. Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A Concentração Fungicida Mínima (CFM) foi realizada de acordo com

metodologia descrita por Baron, Peterson e Finegold (1994) e modificações
(LIMA, 2014). Alíquotas de 5µL foram retiradas, de forma asséptica, dos poços
usados para determinar a CIM, que não apresentarem turvação visível e foram
semeadas pelo método da gota, na superfície de placas de petri com meio de
cultura Sabouraud 4% dextrose ágar com cloranfenicol.
Após incubação durante 24 horas a 35 °C foi realizada a contagem das

colônias crescidas sobre a superfície do meio sólido. Aquela concentração
onde não houve crescimento microbiano nas placas de Petri foi considerada
como a CFM. Os experimentos foram realizados em triplicata.
48
3.5.2. Ensaio do cristal violeta
Ensaios para predição de alterações na membrana celular de Candida

albicans tratada com extrato de geoprópolis foram realizados, seguindo
metodologia descrita por Devi e colaboradores (2010) e Lima (2014).
Foram preparadas suspensões de Candida albicans em caldo Sabouraud

dextrose (Merck), com turvações ajustadas à escala de McFarland 0,5. As
suspensões foram centrifugadas a 3.600 RPM durante 5 min. As células foram
lavadas duas vezes e ressuspensas em água peptonada 0,1% (Merck).
Concentrações dos extratos de geoprópolis, equivalentes a CIM, CFM e 2 x
CFM foram adicionadas à suspensão de leveduras, e incubadas a 37 ºC
durante 30 min. EDTA (0,25 M) foi utilizado como controle positivo. As
amostras de controle negativo foram preparadas de forma semelhante, sem
tratamento.
As células foram centrifugadas (Centrífuga, Baby-I, 206 BL, FANEM, São

Paulo, Brasil) em 4.500 RPM durante 5 min. Depois, as culturas foram
ressuspensas em água peptonada 0,1% (Merck) contendo 10 µg/mL de cristal
de violeta (Merck). A suspensão de leveduras foi incubada durante 10 min a
37oC. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 9.000 RPM durante 15 min e
a absorbância do sobrenadante foi mensurada por espectrofotometria
(Espectrofotômetro Lambda 25 UV/VIS, PERKIN ELMER, São Paulo, Brasil) a
590 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata. O valor médio da
solução de cristal violeta que foi utilizada no ensaio foi considerada 100%. A
percentagem de captação de cristal violeta de todas as amostras foi calculada
usando a fórmula apresentada abaixo:
(ABS590nm da amostra/ ABS590nm da solução de cristal violeta) × 100.

49
3.6. Desenvolvimento de formulação de gel
3.6.1. Processo de formulação: manipulação do gel
Para formulação do gel foram utilizados os insumos listados no quadro 2,

que apresenta as composições e proporções dos constituintes, bem como a
função farmacotécnica dos mesmos para a formulação. A composição base
para o gel compreende o carbômero, um polímero sintético de alto peso
molecular (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2006) em base aquosa, mais
conservante, neutralizante e cossolventes, onde foi incorporado o extrato de
geoprópolis.
A formulação do gel compreendeu uma etapa preliminar de estudos de

pré-formulação, seguida por uma seleção da base polimérica, concentração de
uso, processo de preparo e correção de pH.
Quadro 2 – Composição da formulação de gel para uso vaginal contendo

extrato de geoprópolis.
Quantidade
Composição Função do composto na formulação
(%)
Polímero. Agente gelificante,
Carbômero 980 1,5
modificador de reologia*
Metilparabeno 0,1 a 0,18* Conservante, antimicrobiano*
Propilparabeno 0,02 – 0,10*Conservante, antimicrobiano*
Hidróxido de Sódio q.s.p*** Neutralizante*
Propilenoglicol** 5, 10, 40% Cossolvente*
Extrato de geoprópolis 1 a 10% Complexo bioativo
Água purificada q.s.p*** Veículo
*Fonte: ROWE; SHESKEY; QUINN, 2006.
** Foram testadas diferentes concentrações de Propilenoglicol para avaliação
do efeito de liberação.
*** Quantidade suficiente para o volume desejado.
Foram manipuladas três formulações diferentes de gel, contendo a

mesma concentração de extratos: Formulação de gel de carbômero com 10%
de propilenoglicol como cossolvente (F1), formulação de gel de carbômero com
50
40% de propilenoglicol como cossolvente (F2) e formulação de gel de

carbômero com 5% de propilenoglicol como cossolvente (F3), para avaliação
da eficácia de liberação em diferentes concentrações de cossolvente na
formulação.
Foram propostas formulações com percentual de 1 a 10% de extrato de

geoprópolis, que apenas poderá se definidido em caráter final após futuros
estudos clínicos, onde poderá se predizer segurança e eficácia da formulação
in vivo.
O extrato utilizado como complexo bioativos das formulações foi a

amostra J11 (da abelha jandaíra), justificado pelos resultados de sua atividade
frente a cepas de leveduras testadas.
O processo de manipulação do gel compreendeu as seguintes etapas:

pesou-se o polímero carbômero 980, transferindo-o para um becker,
acrescentando em seguida parte da água purificada e agitando durante 10 a 15
minutos com o auxílio de um agitador mecânico com hélice de três lâminas, em
velocidade de 1000 RPM até obtenção homogênea do gel. Em seguida, os
conservantes metilparabeno e propilparabeno foram solubilizados em parte do
cossolvente propilenoglicol, sendo acrescentada à formulação, juntamente com
o restante de água purificada. Então, os extratos de geoprópolis foram
solubilizados no restante do cossolvente propilenoglicol, e adicionados aos
poucos na formulação, sob agitação a 600 RPM por 10 minutos. Por último,
corrigiu-se o pH e a viscosidade dos géis (de maneira a permanecer na faixa
de 4,5 a 5,0), utilizando-se o hidróxido de sódio.
As formulações foram acondicionadas em bisnagas específicas de

alumínios, devidamente tampadas.
3.6.2. Avaliação das formulações de Géis
Depois de formulados, os géis foram submetidos a: Análises visuais de

aspecto e cor, ensaios de separação de fases por centrifugação, ensaio de pH
e viscosidade, além de investigações microbiológicas, conforme orientações da
51
ANVISA, através da Farmacopeia Brasileira 5ª edição (BRASIL, 2010a;

BRASIL, 2010b).
As formulações obtidas foram ainda submetidas a ensaios de cinética de

liberação in vitro, para avaliação do perfil de liberação dos compostos bioativos,
presentes na rede polimérica do gel, em seus possíveis sítios de ação
(BALATA; EL NAHAS; RADWAN, 2014).
3.6.2.1. Análise física visual das formulações
As formulações foram analisadas visualmente. Os parâmetros físicos

envolveram o aspecto e a cor.
3.6.2.2. Ensaios de separação de fases por centrifugação
Os ensaios de centrifugação das formulações de gel foram realizados de

acordo com as orientações da ANVISA (BRASIL, 2004b; BRASIL, 2007), com o
objetivo de avaliar a qualidade da formulação de gel.
Para realização dos ensaios, tubos de ensaios contendo os géis foram

disponibilizados numa centrífuga (Centrífuga, Baby-I, 206 BL, FANEM, São
Paulo, Brasil), sendo centrifugados a 3000 RPM durante 30 minutos. Passado
esse tempo, as amostras foram analisadas visualmente para verificação de
possíveis separações de fases ou formação de precipitados. Os testes foram
realizados em triplicata.
3.6.2.3. Análise de pH
Para análise de pH utilizou-se um pHmetro (PG 1800 Gehaka, São Paulo

– Brasil). As amostras de géis foram disponibilizadas em um béquer de vidro, e
nele foi mergulhado o eletrodo. A leitura foi realizada após estabilização do
52
valor de pH mostrado pelo instrumento. Os testes foram realizados em

triplicata.
3.6.2.4. Ensaios de viscosidade
Para análise da viscosidade das formulações, utilizou-se um viscosímetro

(Modelo LVT, Brookfield Engineering Lab., Inc., Middleboro, MA) com leitura de
viscosidade em cPs. Foi utilizado o spindle haste do tipo “E”, medindo 0,604
mm de comprimento em temperatura de 25 oC a 0,3 RPM. Os testes foram
3.6.2.5. Ensaio de espalhabilidade dos géis
A determinação da espalhabilidade foi realizada de acordo com

metodologia descrita por Borghetti e Krnost (2006). Para o teste, utilizou-se
uma placa molde circular, de vidro (diâmetro = 20 cm; espessura = 0,2 cm),
com orifício central de 1,2 cm de diâmetro, sobre o qual foi colocada uma placa
suporte de vidro (20 cm x 20 cm), posicionada sobre uma escala milimetrada e
uma fonte luminosa. 1,0 grama de gel foi introduzida no orifício da placa-molde
e a superfície foi nivelada com espátula. A placa-molde foi cuidadosamente
retirada e sobre a amostra, foi colocada uma placa de vidro de peso conhecido
(Placa 1= 73,793 g). Após um minuto, foi realizada a leitura dos diâmetros
abrangidos pela amostra, em duas posições opostas, com auxílio da escala do
papel milimetrado. Posteriormente, foi calculado o diâmetro médio. Este
procedimento foi repetido, acrescentando-se sucessivamente outras placas
(Placa 2= 73,616 g; Placa 3= 72,456 g; Placa 4= 72,880 g; Placa 5= 74,196 g;
placa 6= 75,602 g; Placa 7= 74,842 g; Placa 8= 73,977 g; Placa 9= 72,357 g e
Placa 10= 74,368 g) (1 minuto cada). Os resultados foram expressos em
espalhabilidade da amostra em função do peso aplicado, de acordo com a
equação abaixo, sendo que os mesmos correspondem à média de três
determinações.
53
Ei = d2 . π / 4
Onde:
Ei = espalhabilidade da amostra para um determinado peso i (mm 2);
d = diâmetro médio (mm).
3.6.2.6. Teste de adesão do gel
O potencial bioadesivo do gel de geoprópolis foi avaliado em comparação

com um gel vaginal comercialmente disponível (Kronel gel). Este teste foi
realizado de acordo com método proposto por Bachhav e Patravale (2009). 50
mg de amostra foram colocados no centro de uma placa de ágar (1,0% p/p de
ágar em tampão citrato a pH 4,5). Após 5 min, a placa de ágar foi fixada a um
aparelho de teste de desintegração (Desintegrador DIST-3, Pharma-Test,
Hainburg, Germany) e movida para cima e para baixo em tampão 37 ºC ± 1 ºC.
A placa permaneceu imersa na solução, durante todo o teste. O tempo de
permanência dos géis na placa (tempo de adesão) foi determinado
visualmente.
3.6.2.7. Teste de vazamento do gel
O teste de vazamento foi realizado de acordo com Ochoa Andrade e

colaboradores (2014). 80 mg de gel de geoprópolis (diluído em solução
fisiológica, pH 4,5) foram sinterizados em uma extremidade de uma lâmina de
ágar (1,0% p/p ágar). A lâmina de ágar foi fixada a uma das paredes internas
de uma câmara transparente, que foi mantida a 37°C em banho maria. A
lâmina permaneceu na posição vertical, em um ângulo de 90 ° em relação a
base horizontal por 2 horas. A distância de corrida do gel ao longo da lâmina foi
medida em relação ao papel milimetrado.
54
3.6.2.8. Estudos de liberação in vitro das formulações de gel
Para os estudos de liberação in vitro de extrato de geoprópolis da

formulação de gel, utilizou-se metodologia proposta por Balata, El Nahas e
Radwan (2014). Utilizou-se membrana artificial de acetato de celulose para
diálise em forma de tubo (MWCO 12000 - 14000 - 5M, Serva, Germany). As
membranas foram previamente imersas no meio receptor por um período de 24
horas. O meio receptor consistiu num tampão fosfato salino, pH 4,5 a 5,0 e
metanol na proporção (90:10). O metanol foi adicionado ao meio receptor para
manutenção da condição sink. Dois gramas de cada formulação de gel (a 1%)
foram aplicados uniformemente no interior da membrana (medindo cerca de 9
cm2), a qual foi devidamente fechada e acoplada ao aparato de cesta do
dissolutor (ERWEKA DT808 LH, Germany) de forma que a superfície externa
da membrana permanecesse com maior superfície de contato com o meio
receptor.
As membranas acopladas ao aparato de cestas foram conectadas ao

dissolutor, e submersas ao meio receptor numa velocidade fixa de 50 RPM. O
compartimento receptor consistiu em 500 mL de meio, mantido a uma
temperatura de 37 ºC + 0,5 ºC durante todo o período de execução do
experimento. Alíquotas de 10 mL foram retiradas nos tempos 10 minutos, 30
minutos e 45 minutos, depois a cada 1 hora em intervalos regulares por um
período de 8 horas, sendo analisadas por espectrofotometria
(Espectrofotômetro LAMBDA 25 UV/VIS - PERKIN ELMER) a 270 nm para o
conteúdo de geoprópolis liberado.
O meio receptor foi utilizado como branco de leitura, e as alíquotas

coletadas a cada tempo foram comparadas a concentração da solução padrão
preparada, correspondente a 100% da concentração de geoprópolis na
formulação de gel.
Após cada análise em espectrofotometria, os meios foram repostos na

cuba, de forma que a quantidade acumulada de extrato liberado no tempo t
fosse igual à quantidade mensurada no tempo t, acrescida do somatório das
55
quantidades retiradas do compartimento (quantidade acumulada). Os

experimentos foram realizados em triplicata.
Para investigação da cinética de liberação foram realizadas as seguintes

análises: % cumulativa de liberação de extrato versus tempo (modelo cinético
de ordem zero), log de % cumulativa de liberação de extrato versus tempo
(modelo cinético de primeira ordem) e % cumulativa de liberação de extrato
versus raiz quadrada do tempo (modelo de Higuchi). Os dados foram
analisados estatisticamente pelo método de regressão linear dos mínimos
quadrados, e o gráfico que apresentou coeficiente de correlação linear (r) mais
próxima de 1 definiu a cinética de liberação (COSTA; LOBO, 2001).
O material liberado no meio receptor foi ainda submetido a procedimento

de extração em fase sólida (SPE), para avaliação qualitativa dos constituintes
químicos presentes no extrato, que foram liberados da formulação durante os
estudos de cinética. Para isso, o meio receptor (t = 8 horas) foi extraído através
de cartucho de extração em fase sólida C18 (SPE, 1g, Phenomenex). Os
cartuchos de C18 foram condicionados com 6 mL de metanol e 6 mL de água
destilada deionizada, de modo que os mesmos não permanecessem secos. As
amostras (cumulativo de meio liberado, para as formulações) foram aplicadas
nos cartuchos, lavadas com 10 mL de água e eluída com 10 mL de metanol
para obtenção de compostos fenólicos liberados no meio receptor. A solução
foi evaporada sob pressão reduzida a 40 °C.
Ressalta-se que a citada técnica de extração em fase sólida é inédita na

literatura para esse tipo de análise de um líquido (meio receptor), obtido de um
estudo cinético de liberação.
A tabela 3 apresenta o rendimento de compostos fenólicos, obtido pela

técnica de SPE para o meio receptor no estudo de liberação in vitro.
56
Tabela 3– Rendimento da fração fenólica obtido por SPE de meio receptor.

Meio receptor do estudo de liberação
Quantidade de extrato Quantidade de Rendimento
Amostra presente na formulação fração SPE obtida de extração
(mg) (mg) (%)
100 25,23 + 4,5 25
O conteúdo obtido da técnica SPE foi analisado através de Cromatografia

em Camada Delgada Analítica (CCDA). Para isso foram utilizadas
cromatofolhas de sílica gel 60F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha) onde foram
aplicadas as amostras, eluídas com diclorometano + metanol, em proporção de
(9:1). Como revelador utilizou-se o reagente NP (ácido difenilbórico
etanolamina – metanol) e detecção por irradiação ultravioleta 254 e 366 nm
(LUB01, Boitton, Porto Alegre, Brasil). O mesmo conteúdo também foi
analisado através da técnica de UHPLC-PDA-TOF-MS.
Estas amostras foram ainda analisadas por cromatografia líquida de ultra-

eficiência acoplada ao espectrômetro de massas (UHPLC-PDA-TOF-MS),
conforme metodologia já descrita.
3.6.2.9. Análises microbiológicas do gel
As análises microbiológicas foram realizadas, para verificação da carga

microbiana de produtos farmacêuticos, seguindo as orientações da ANVISA,
através da Farmacopeia Brasileira 5ª edição (BRASIL, 2010b) que estabelece
limites microbiológicos para produtos farmacêuticos de uso vaginal. O quadro 3
especifica os limites microbiológicos seguidos para este estudo.
57
Quadro 3 – Limites microbiológicos permitidos para preparações vaginais, de

acordo com a ANVISA:
MICRORGANISMOS PESQUISADOS LIMITES ESPECIFICADOS
Contagem total de bactérias aeróbias Máximo 102 UFC/g ou mL
Contagem total de fungos / leveduras Máximo 101 UFC/g ou mL
Staphylococcus aureus Ausentes em 1g ou 1mL
Pseudomonas aeruginosa Ausentes em 1g ou 1mL
Candida albicans Ausentes em 1g ou 1 mL
Fonte: BRASIL, 2010b.
Para as análises microbiológicas, 10 g de gel foi pesado em um

erlenmeyer, no qual foi acrescentado 90 mL de caldo TSB (Tryptic Soy Broth,
Merck), mais 0,2 mL de polissorbato 80 (Tween) estéril, sendo identificado
como “diluição estoque” (10-1), aquecendo-a em banho-maria a 40 a 45 ºC até
completa solubilização.
Dessa “diluição estoque”, pipetou-se 1 mL para um segundo tubo de

ensaio contendo 9 mL de caldo TSB (segunda diluição: 10 -2), e dessa diluição,
transferiu-se mais 1 mL para um terceiro tubo contendo 9 mL de caldo TSB
(terceira diluição: 10-3), totalizando três diluições para cada uma das amostras
analisadas.
Para cada uma das diluições supracitadas, prepararam-se duas placas de

petri (ensaios realizados em duplicata) através do método pour plate,
transferindo-se 1 mL de cada uma das diluições para placa de petri, nas quais
foram acrescidas 15 a 20 mL de meio de cultura Ágar caseína soja, ainda
liquefeito a 45 ºC, seguido de leve homogeneização nas placas, e aguardo
para solidificação dos meios durante resfriamento. As mesmas foram
devidamente tampadas e identificadas. As placas foram incubadas em estufa
bacteriológica (32,5+ 2,5 ºC) por 03 dias, para contagem das colônias. A
contagem das colônias foi realizada através de um contador de colônias,
respeitando-se as diluições das amostras para expressão dos resultados.
O mesmo procedimento foi realizado em placas de petri com meio de

cultura Sabouraud 4% Dextrose ágar com cloranfenicol, liquefeito a 45 oC, para
pesquisa de possíveis fungos e leveduras contaminantes. As placas foram
incubadas em estufa (20 a 25 ºC) por 05 dias, para contagem das colônias
58
contaminantes. A contagem dos fungos e leveduras foi realizada através de um

contador de colônias, respeitando-se as diluições das amostras para expressão
dos resultados.
Para pesquisa de Staphylococcus aureus nas amostras de géis, foi

semeada uma alçada da diluição mãe (10-1) da amostra em caldo TSB em
meio de cultura ágar sal manitol, através da técnica de esgotamento, com
finalidade de se obter colônias isoladas no meio para posterior investigação. As
placas foram incubadas a 32,5 ºC ± 2,5 °C durante 24 horas. Após o período
de incubação, analisaram-se as colônias, onde colônias amareladas, ou
brancas com zonas amareladas indicam possível presença de bactérias
Staphylococcus aureus, devendo ser confirmadas por provas bioquímicas.
Como nesta pesquisa não houve crescimento de colônias com características
suspeitas de Staphylococcus aureus em meio de cultura ágar sal manitol, não
foi necessária realização de provas complementares para identificação.
Para pesquisa de Pseudomonas aeruginosa foi semeada uma alçada da

diluição mãe (10-1) da amostra em caldo TSB em meio de cultura Ágar
cetrimida, através da técnica de esgotamento, com finalidade de se obter
colônias isoladas no meio para posterior investigação. As placas foram
incubadas a 32,5 ºC ± 2,5 °C durante 24 horas. O crescimento de colônias em
meio cetrimida, de coloração verde azulada (pigmento piocianina) indica
possivelmente a presença de microrganismos da espécie Pseudomonas
aeruginosa, devendo ser confirmada por testes complementares. Como testes
complementares, são realizadas coloração de Gram e provas bioquímicas de
identificação (BRASIL, 2010a). Como nesta pesquisa não houve crescimento
de colônias com características suspeitas de Pseudomonas aeruginosa em
meio cetrimida, não foi necessária provas complementares para identificação.
Não foram realizadas pesquisas de Candida albicans para este produto,

uma vez que a ação contra esse microrganismo foi demonstrada em estudos
de atividade antimicrobiana e Concentração Inibitória Mínima (CIM) para o
presente trabalho.
59
As análises microbiológicas foram realizadas em triplicata, sob fluxo

laminar grau B (BRASIL, 2010c), em operação, e todas as vidrarias citadas
foram previamente esterilizadas. Foram realizados ainda como controle de
qualidade do laboratório de microbiologia, testes de promoção de crescimento
e testes de esterilidade dos meios de cultura, de acordo com protocolos
internos do laboratório de microbiologia da INFAN (Indústria Química e
Farmacêutica Nacional).
3.7. Desenvolvimento de formulação de sabonete líquido para uso

vaginal
3.7.1. Processo de formulação: manipulação do sabonete líquido
Para formulação do sabonete líquido contendo extrato de geoprópolis,

foram utilizados os insumos listados no quadro 4, que apresenta as
composições e proporções dos constituintes, bem como a função
farmacotécnica dos mesmos para a formulação.
A composição dos sabonetes líquidos para uso íntimo compreende

detergentes, surfactantes, tensoativos e espessantes, além de conservantes e
corretor de pH, criando assim uma base específica para sabonete líquido, onde
foi incorporado o extrato da geoprópolis.
60
Quadro 4 – Composição para formulação de sabonete líquido para uso vaginal

contendo extrato de geoprópolis.
Quantidade Função do composto na

Composição
(%) formulação
Base específica para sabonete
1ª Mistura 1 43 - 45
líquido.
Surfactante aniônico; detergente;
Lauril sulfato de sódio 21 - 23 agente emulsificante; Penetrante da
pele*.
Conservante, umectante,
Propilenoglicol 21 - 23
cossolvente e agente estabilizante*.
Tensoativo anfótero. Detergente
Cocoamidopropilbetaína 2 5-7
suave. Espessante.
2ª Mistura 3 3-5 Codetergente e surfactante
Modificador de reologia.
Copolímero de acrilatos q.s.p
Espessante.
Corretor de pH. Agente
Ácido lático q.s.p
acidificante*.
Metilparabeno 0,1 – 0,18* Conservante, antimicrobiano*
Propilparabeno 0,02 – 0,10* Conservante, antimicrobiano*
Extrato de geoprópolis 2 – 10 Complexo bioativo
Fragrância - Perfume
Água purificada q.s.p Veículo
*Fonte: ROWE; SHESKEY; QUINN, 2006.
1: Dispersão de Diestearato de Etilenoglicol em tensoativos aniônicos e
anfótero, com efeito perolado, de aplicação a frio e de que facilita incorporação.
2: Derivado de óleo de coco e do dimetilaminopropilamina. Agente anfotérico
surfactante suave, um detergente que pode atuar como um ácido ou uma base.
3: Composto específico, desenvolvido para base de sabonete líquido.
O processo de manipulação dos sabonetes líquidos compreendeu as

seguintes etapas: A base (mistura 1) foi colocada em recipiente de vidro, e
agitado com o auxílio de um agitador mecânico com hélice de três lâminas, a
600 RPM durante 15 minutos, de forma a alcançar uma boa homogeneização.
Ainda sob agitação, acrescentou-se o Sodium Lauryl Sulfate e aos

poucos, parte da água. Em seguida, acrescentou-se o Propylene Glycol, mais o
Cocoamidopropilbetaína e a 2ª Mistura, juntamente com o restante da água.
Continuou-se a agitação durante 30 a 40 minutos, a 600 RPM, intervalo

no qual se adicionou aos poucos o restante da água purificada até quantidade
suficiente para o volume total manipulado (q.s.p).
61
Todo esse processo de manipulação foi realizado em condições de

temperatura de 20 a 25 oC, não havendo necessidade de aquecimento e/ou
resfriamento da formulação.
Em seguida, o extrato da geoprópolis foi solubilizado em até 1% de

polisorbato 80 e homogeneizado junto ao sabonete que se encontrava em
agitação. Acrescentou-se os conservantes metilparabeno e propilparabeno e
ainda sob agitação constante, se adicionou o corretor de pH (Ácido Lático) até
obtenção de parâmetro constante de pH (entre 4,5 e 5,0). Por último, realizou-
se a correção da viscosidade para que ficasse compreendida entre 1.000 cps a
20.000 cps, acrescentando-se aos poucos, e em constante agitação, o acrilato
de copolímero até alcance do parâmetro desejado. Foi adicionada a essência
na formulação final.
O extrato de geoprópolis utilizado na formulação de sabonete líquido foi a

amostra M3 da abelha Mandaçaia, dado sua forte bioatividade frente as
leveduras testadas.
As formulações foram propostas com a variação da quantidade de

extrato, para ser definido após realização de testes de avaliações de risco
cosmético (como irritação, sensibilização, sensação de desconforto e efeito
sistêmico), conforme o Guia para Avaliação de Segurança de Produtos
Cosméticos da ANVISA (BRASIL, 2012).
3.7.2. Avaliação das formulações de sabonete líquido
Depois de formulados, os sabonetes líquidos contendo extrato de

geoprópolis foram submetidos a análises físico químicas, como ensaios de pH,
viscosidade, densidade relativa (BRASIL, 2007), e análises microbiológicas
(BRASIL, 1999).
62
3.7.2.1. Ensaios para análise de pH
Para análise de pH (potencial hidrogeniônico) utilizou-se um equipamento

pHmetro modelo PG 1800 da marca Gehaka. As amostras de sabonete líquido
a ser analisada foram disponibilizadas em um béquer de vidro, e nele foi
mergulhado o eletrodo. A leitura foi realizada após estabilização do valor de pH
mostrado pelo instrumento.
3.7.2.2. Ensaios para análise de viscosidade
Para análise da viscosidade do sabonete líquido utilizou-se um

viscosímetro (Modelo LVT, Brookfield Engineering Lab., Inc., Middleboro, MA)
com leitura de viscosidade em cPs. Foi utilizado o spindle cilíndrico do tipo LV-
3, diâmetro de 1,0 cm e em temperatura de 25 oC a 0,3 RPM. Os testes foram
3.7.2.3. Ensaios para análise da densidade relativa
Para análise da densidade das formulações foi utilizado o método do

picnômetro. A amostra de sabonete líquido foi transferida para um picnômetro
de 5 mL, calibrado, limpo e seco. Em seguida o picnômetro contendo o produto
foi pesado, sendo a balança tarada previamente. Então, a densidade relativa foi
calculada determinando-se a razão entre a massa da amostra líquida e a
massa de água para o volume de 5 mL do picnômetro (BRASIL, 2010a).
3.7.2.4. Análises microbiológicas
As análises microbiológicas foram realizadas seguindo as orientações da

ANVISA (BRASIL, 1999), que estabelece limites microbiológicos para produtos
de higiene pessoal, cosméticos e perfumes. Então, os parâmetros
estabelecidos foram para cosmético tipo I, por se tratar de sabonetes líquidos
63
para uso vaginal (que entram em contato com mucosas). O quadro 5 especifica
os limites microbiológicos seguidos para este estudo.
Quadro 5 – Limites microbiológicos permitidos para produtos cosméticos tipo I

(que entram em contato com mucosas), de acordo com a ANVISA:
MICRORGANISMOS PESQUISADOS LIMITES ESPECIFICADOS

Contagem de microrganismos mesófilos totais Máximo 5 x 102 UFC/g ou mL
Pseudomonas aeruginosa Ausentes em 1g ou 1mL
Staphylococcus aureus Ausentes em 1g ou 1mL
Coliformes totais ou fecais Ausentes em 1g ou 1 mL
Fonte: BRASIL, 1999.
Para as análises microbiológicas, os ensaios seguiram conforme citados

no ítem 3.5.2.6 (análise microbiológica do gel), para pesquisa de bactérias,
fungos e leveduras, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.
Para pesquisa de coliformes totais ou fecais, realizou-se o seguinte

procedimento: Nas amostras formuladas, tomou-se 1 mL da diluição mãe (10-1)
da amostra em caldo TSB (conforme descrito anteriormente), adicionando em
tubo de ensaio contendo 9 mL de caldo lactose, incubando-o por um período
de 24 a 48 horas a 32,5 ºC ± 2,5 °C para verificação de turvação. Após
visualização de turvação, pipetou-se 1 mL dessa diluição em lactose (diluição
10-2) para um tubo contendo 9 mL de caldo verde brilhante, incubando-os por
um período de 24 a 48 horas a 32,5 ºC ± 2,5 °C. Após período de incubação,
foram analisadas turbidez e presença de bolhas no meio. A ausência de
turvação e bolhas no citado meio caracteriza ausência de microrganismos do
grupo coliformes.
64
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Teor de fenólicos totais para geoprópolis
Para as amostras de geoprópolis da abelha mandaçaia (Melipona

mandacaia Smith) os teores de fenólicos totais, avaliados pelo reagente de
Folin-Ciocalteu, variaram entre 54,51 + 0,34 a 77,59 + 3,8 mg EAG/g para os
extratos etanólicos, e 67,84 + 1,1 a 112,43 + 1,8 mg EAG/g para as frações
fenólicas (SPE).
A tabela 4 apresenta os resultados obtidos para os valores de fenólicos

totais de geoprópolis da abelha mandaçaia, encontrados a partir das médias
obtidas nos testes em triplicata e respectivo desvio padrão.

mandaçaia
Fenólicos totais a
Amostra de
(mg EAG/g ± D.P)
geoprópolis
Extrato etanólico Fração SPE
M1 54,51 + 0,34 67,84 + 1,1
M2 77,59 + 3,8 83,39 + 7,4
M3 67,69 + 8,9 73,24 + 0,7
M4 63,44 + 1,1 112,43 + 1,8
a
Os dados são expressos como a média ± desvio padrão, n = 3 e os resultados
apresentaram diferenças estatísticas (p˂ 0,05).
Para geoprópolis da abelha jandaíra (Melipona subnitida Ducke), avaliou-

se o teor de fenólicos totais das amostras J9, J10, J11, J12 e J13 (tabela 5).
Para essas amostras, os extratos etanólicos apresentaram teor de fenólicos
totais que variaram entre 110,11 + 4,9 e 176,32 + 3,3 mg EAG/g.
65

jandaíra:
Fenólicos totais a
Amostra de geoprópolis (mg EAG/g ± D.P)
Extrato etanólico
J9 110,11 + 4,9
J10 122,64 + 5,0
J11 132,43 + 5,0
J12 176,32 + 3,3
J13 114,25 + 1,9
a
Os dados são expressos como a média ± desvio padrão, n = 3 e os resultados
apresentaram diferenças estatísticas (p˂ 0,05).
Fenólicos totais das demais amostras de geoprópolis desta abelha,

apresentadas neste trabalho (J1, J2, J3, J4, J5, J6, J7, J8), foram analisadas
por Souza (2016).
Conforme observado, geoprópolis da abelha jandaíra, coletada no sítio

Riacho, da cidade de Vieirópolis – PB apresenta um maior teor de compostos
fenólicos, quando comparado a geoprópolis produzida pela abelha mandaçaia,
coletada na região do rio São Francisco, nos estados de Pernambuco e Bahia.
Para demais amostras de geoprópolis da jandaíra, coletadas na mesma

região, Souza (2016) encontrou valores de fenólicos totais semelhantes,
variando entre 92,6 ± 8,1 mg EAG/g e 201,6 ± 4,2 mg EAG/g para extratos
etanólicos.
O alto teor de fenólicos em geoprópolis tem atribuído a essas substâncias

importantes atividades biológicas, como atividade antioxidante e
antimicrobiana, possuindo um alto teor de flavonoides, quando comparadas
com a própolis das abelhas Apis mellifera (DUTRA et al., 2014; FERREIRA et
al., 2017; SANTOS et al., 2017a).
Amostras de geoprópolis da abelha Scaptotrigona postica (Mandaguari)

no estado do Rio Grande do Norte – Brasil apresentaram teores de fenólicos
totais de 111,5 + 5,4 mg/g (FERREIRA et al., 2017). Para geoprópolis
produzida pela abelha Melipona quadrifasciata anthidioides foi encontrado teor
66
de fenólicos de 118,7 ± 2.8 mg EAG/g (DOS SANTOS et al., 2017). Fenólicos

totais foram determinados também para geoprópolis da abelha Melipona
mondury, coletado no estado da Bahia, Brasil, e apresentou um teor de 144,4 ±
0.01 mg EAG/g para seu extrato etanólico (SANTOS et al., 2017a). Amostras
de geoprópolis coletadas dos meliponíneos Melipona orbignyi apresentaram
um teor de fenólicos de 121 ± 0,6 mg EAG/g (SANTOS et al., 2017b). Todos
esses teores de fenólicos referem-se a extratos etanólicos, determinados para
diferentes abelhas da tribo melipona, e se assemelham com os achados do
presente estudo.
Em um estudo inédito para geoprópolis da abelha sem ferrão Plebeia aff.

flavocincta, do estado do Rio Grande do Norte, Silva e colaboradores (2016)
encontraram alto teor de fenólicos totais, em percentuais por volta de 9,4%
para algumas amostras de determinadas épocas do ano.
Os compostos fenólicos apresentam hidroxilas e anéis aromáticos, nas

formas simples ou de polímeros, que os confere o poder antioxidante. Esses
compostos podem ser naturais ou sintéticos. Quando presentes em vegetais
podem estar em formas livres ou complexadas a açúcares. Dentre eles,
destacam-se os flavonoides, os ácidos fenólicos, os taninos e os tocoferóis,
como os antioxidantes fenólicos mais comuns de fonte natural (ANGELO;
JORGE, 2007). Compostos fenólicos são originados do metabolismo
secundário das plantas, sendo importantes para sua proliferação e reprodução,
além disso, se formam em condições de estresse como, infecções, ferimentos,
radiações UV, dentre outros (NACZK; SHAHIDI, 2004).
As plantas superiores e seus constituintes são naturalmente fontes de

antioxidantes naturais, tais como compostos fenólicos, abundantemente
encontrados em especiarias como ervas, frutas, legumes, cereais, grãos,
sementes e óleos (AHMAD et al., 2016). Ao longo dos processos evolutivos, a
cooperação entre as abelhas e as plantas tornou-se essencial para a
diversificação natural destes organismos, bem como para o surgimento de
produtos utilizados pelo homem com fins nutricionais e até mesmo medicinais,
desde os primórdios aos dias atuais (PEREIRA et al., 2003).
67
Os compostos fenólicos são responsáveis pela caracterização dos

produtos apícolas, como o mel, pólen e própolis, como alimentos funcionais,
sendo que essa característica pode ser atribuída ao se quantificar o teor de
fenólicos totais presentes nas amostras (NEVES; ALENCAR; CARPES, 2009).
4.2. Relação entre fenólicos de geoprópolis e origem botânica
Os fenólicos presentes na geoprópolis são característicos da origem

botânica e as diferenças observadas para seus teores podem ser
correlacionadas com a época da colheita, tempo e a vegetação próxima ás
colmeias (SAWAYA et al., 2002).
As amostras de geoprópolis da abelha mandaçaia apresentadas neste

trabalho, tiveram sua origem botânica estudada por Silva (2015). De acordo
com o citado autor, o tipo polínico Senna (Leguminoseae) é o predominante na
entre as amostras de geoprópolis, representando de 3,2% a 50,0% do total de
polens.
Já a origem botânica de geoprópolis da abelha jandaíra apresentadas

neste trabalho, estudada por Souza (2016), demonstrou a presença de 22 tipos
polínicos diferentes, dentre os quais, os tipos Myrcia, Mimosa, Parapiptadenia,
Poincianella e Senna, estão presentes em quase todas as amostras. A espécie
Senna foi a única que esteve presente para 100% das amostras, e apresentou
frequência polínica igual para aquela encontrada em análises palinológicas de
geoprópolis da abelha mandaçaia.
A tabela 6 apresenta as espécies vegetais predominantes nas amostras

de geoprópolis de Melipona subinitida Ducke e Melipona mandacaia Smith.
68
Tabela 6 – Origem botânica para geoprópolis dos meliponíneos mandaçaia e

jandaíra, de acordo com estudos de Silva (2015) 1 e Souza (2016) 2.
Origem botânica Frequência

Meliponíneo
predominante (%)
Senna 3,2 a 50,0
Melipona mandacaia Smith 1
Mimosa 6,4 a 42,8
Senna 3,2 a 50
Myrcia 3,3 a 44,5
Melipona subinitida Ducke 2 Poincianella 11,1 a 42,9
Mimosa 6,3 a 14,3
Parapiptadenia 3,3 a 12,5
As abelhas realizam visitas às flores, para suprirem as suas necessidades

nutricionais, onde coletam o pólen e o néctar como fontes de alimentos. Ao
conjunto de plantas que oferecem pólen e/ou néctar às abelhas, denomina-se
“flora apícola” (ALMEIDA et al., 2003).
A diversidade de espécies vegetais visitadas pelas abelhas parece surgir

de adaptações e modificações evolutivas de suas flores, ocorrendo grande
diversificação de formas, cores, odores o que facilita seu reconhecimento por
esses insetos (BARTH, 1991).
A presença de pólen em amostras de própolis ou geoprópolis remonta

diversas origens: Podem ser trazidas pelo vento, aderindo à resina das
exsudações vegetais. Pode também entrar na confecção da própolis ou
geoprópolis como contaminante, colhido em separado pelas abelhas para
armazenamento dentro da colmeia. O terceiro modo de entrada de pólen na
fabricação de própolis ou geoprópolis tem origem no pólen aderido ao corpo
das abelhas, durante os seus trabalhos de campo e nas colmeias. Assim, a
identificação de táxons vegetais através da morfologia de seus grãos de pólen,
permite a inferência, através de associações polínicas, sobre o tipo de
vegetação de onde foi recolhida a própolis ou geoprópolis pelas abelhas
(BARTH; DUTRA; JUSTO, 1999).
69
Conforme observado na tabela 3, a leguminoseae Senna foi

predominantemente encontrada, tanto para geoprópolis da abelha mandaçaia,
quanto para aquele coletado pela abelha jandaíra.
Espécies do gênero Senna (figura 7) são comumente encontradas na

caatinga do Brasil (MAIA-SILVA et al., 2012), sendo que a essa leguminosae
(Caesalpiniaceae) parece ser importante fonte de pólen para abelhas nessa
região (AGUIAR et al., 2003).
Figura 7 – Fotografia de espécie de Senna (Senna obtusifolia) sendo visitada

por uma espécie de abelha Exomalopsis sp., na região da caatinga brasileira.
Fonte: MAIA-SILVA et al., (2012).
Em estudos palinológicos para tipos polínicos visitados por abelhas

mandaçaia na região caatinga da Bahia, Alves, Carvalho e Souza (2006)
também verificaram a presença de espécies vegetais Senna, mais em pequena
quantidade (1,0%) para produção de mel.
Dentre as espécies de meliponíneos, a mandaçaia (Melipona mandacaia

Smith, 1863) é uma das mais conhecidas no Nordeste brasileiro, sendo um
inseto de convivência constante na zona rural. Entretanto, existem poucas
informações sobre as plantas nectaríferas visitadas por essas abelhas (ALVES;
CARVALHO; SOUZA, 2006).
70
Para geoprópolis coletada pela abelha jandaíra observadas nesta

pesquisa, pode-se inferir que as plantas da família Fabaceae (Senna, Myrcia,
Poincianella, Mimosa e Parapiptadenia) são as mais visitadas.
O fluxo de pólen e néctar na caatinga apresenta pico durante a estação

chuvosa, caindo abruptamente na estação seca. Dessa forma, a estação
chuvosa constitui-se a época apropriada tanto para a exploração de pólen,
quanto de néctar, pelos meliponíneos (FREITAS, 1996).
Além da possibilidade de exploração dos seus produtos, os meliponíneos

formam um grupo importante de agentes polinizadores das diferentes espécies
vegetais, contribuindo para o equilíbrio das populações de plantas e animais
que vivem em ecossistemas naturais (JANZEN, 1980).
4.3. Análise química por ultra cromatografia (UPLC/QTOF-MSE)
As análises por cromatografia líquida de ultra eficiência, acoplada ao

espectrômetro de massas (Figuras de 8 a 11), revelaram a presença de
numerosos compostos, conforme apresentados na tabela 7, para as amostras
de geoprópolis da abelha mandaçaia (Melipona mandacaia Smith).
Os compostos marjoritários encontrados para geoprópolis da abelha

mandaçaia foi o flavonoide catequina, além de compostos glicosilados
coumaroil-galoil-glicose, cinamoil-galoil-glicose, digaloil-cinamoil-glicose,
cinamoil-coumaroil-glicopiranosídeo e compostos derivados terpenos diversos.
71

negativo. Amostra M1.
72

73

74

75

mandaçaia (Melipona mandacaia Smith) por UPLC/QTOF-MSE (continua):
- Amostra
Composto TR (min) λ max (nm) [M-H] (m/z) Calculado Tentativa de identificação
encontrada
01 0,35 270 331,0654 331,0670 galoil-glicose M2
02 0,37 280 483,0771 483,0780 di-galoil-glicose M1, M2, M4
03 0,44 270 169,0114 169,0147 ácido gálico M2, M4
kaempferol-p-coumaroil-
04 0,73 280 577,1350 577,1352 M4
ramnosideo
kaempferol-p-coumaroil-
05 0,87 280 577,1337 577,1352 M4
ramnosideo
06 1,06 311 325,0930 325,0929 1-O-p-coumaroil-beta-D-glicose M1
07 1,10 280 289,0701 289,0718 catequina M2, M4

08 1,18 311 325,0916 325,0929 1-O-p-coumaroil-beta-D-glicose M1
M1, M2, M3,
09 1,80 308 163,0383 163,0401 ácido fenilpirúvico
M4
10 2,18 280 300,9979 300,9990 ácido elágico M1
1 M1, M2, M3,
11 2,72 296 477,1023 477,1039 coumaroil-O-galoil-glicose
M4
di-galoil-coumaroil- M1, M2, M3,
12 2,90 286 629,1120 629,1148
glicopiranosídeo M4,
1 M1, M2, M3,
13 3,11 290 287,0560 287,0561 Aromadendrina
M4
di-galoil-coumaroil-
14 3,25 278 629,1130 629,1148 M1
glicopiranosídeo
15 3,29 280 435,0918 435,0933 taxifolin arabinose M2, M4
M1, M2, M3,
16 3,62 288 471,1306 471,1297 dicoumaroil-glicose
M4
1 M1, M2, M3,
17 3,79 278 461,1082 461,1089 cinnamoil-O-galloil-glucose
M4
tetrahidroxi-flavanona-O-
18 3,98 294 595,1463 595,1457 M1, M2
coumaroil-glicose
19 4,11 280 595,1449 595,1457 M1, M2
coumaroil-glicose
20 4,21 283 595,1440 595,1457 M1, M2
coumaroil-glicose
1 M1, M2, M3,
21 4,33 281 461,1080 461,1089 cinnamoil-O-galloil-glicose
M4
1 M1, M2, M3,
22 4,42 278 613,1184 613,1199 di-O-galloil O-cinnamoil-glicose
M4
M1, M2, M3,
M4
M1, M2, M3,
M4
1 M1, M2, M3,
25 4,73 308 623,1382 623,1406 di-O-coumaroil O-galloil-glicose
M4
M1, M2, M3,
26 4,81 288 271,0616 271,0612 Narigenina
M4
76

mandaçaia (Melipona mandacaia Smith) por UPLC/QTOF-MSE (conclusão):
1 M1, M2, M3,

27 5,00 295 623,1403 623,1406 di-O-coumaroil O-galloil-glicose
M4
28 5,07 288 581,1268 581,1301 2-O-vanilloil-vitexina M1, M2, M4
M1, M2, M3,
29 5,24 312 429,1181 429,1191 Metil-apigenina
M4
M1, M2, M3,
30 5,45 289 301,0719 301,0717 trihidroxi-metoxi-flavanona
M4
aromadendrina metil eter- M1, M2, M3,
31 5,62 291 609,1589 609,1614
coumaroilglicose M4
Aromadendrina-cinnamoil- M1, M2, M3
32 5,73 279 579,1503 579,1508
glicopiranose
6-O-cinnamoil 1-O-p-coumaroil- M1, M2, M3,
33 5,97 286 455,1339 455,1348 2
β-D-glicopiranose M4
6-O-cinnamoil 1-O-p-coumaroil- M1, M2, M3,
34 6,08 285 455,1346 455,1348 2
β-D-glicopiranose M4
coumaroil O-cinnamoil O-galloil- M1, M2, M3,
35 6,26 283 607,1457 607,1457
glicose M4
aromadendrina metil eter- M1, M2, M3,
36 6,39 288 609,1587 609,1614
coumaroilglicose M4
coumaroil O-cinnamoil O-galloil- M1, M2, M3,
37 6,52 286 607,1429 607,1457
glicose M4
metil-aromadendrina-cinnamoil- M1
38 6,88 281 593,1635 593,1512
glicopiranose
7-O-metil narigenina M1, M3,
39 6,94 287 285,0772 285,0768
(sakuranetin)
M1, M2, M3,
40 7,14 290 421,1294 421,1293 multijugin
M4
41 7,31 360 299,0565 299,0561 trihidroxi metoxi flavona M3
M1, M2, M3,
42 7,57 290 421,1276 421,1293 multijugin
M4
43 8,63 ND 485,3273 485,3272 Derivado do ácido terpênico M3
44 10,01 ND 471,3505 471,3480 Derivado do ácido terpênico M2, M3, M4
45 10,11 ND 385,2392 385,2384 Derivado do ácido terpênico M3
46 10,21 ND 471,3473 471,3480 Derivado do ácido terpênico M2, M4
TR= Tempo de Retenção; ND= Não detectado.

1. Corrobora com achados de Santos et al., 2017a;
2. Corrobora com achados de De Souza et al., 2013.
Conforme observado, diferentes espécies, como Melipona subnitida

Ducke e Melipona mandacaia Smith, em posições geográficas também
diferentes (sítio Riacho, município de Vieirópolis, Paraíba e região do Rio São
Francisco ao longo dos municípios de Juazeiro (BA) e Petrolina (PE)
respectivamente), produzem geoprópolis com perfil químico semelhante.
77
Para Torres e colaboradores (2008), o surgimento de diferenças

observadas no perfil de composição química de própolis, quando estas são
obtidas de regiões tropicais, está relacionado à ampla gama de espécies
botânicas existentes nestas regiões e dependem, principalmente, das
condições edafoclimáticas e dos hábitos alimentares das abelhas.
Nas regiões de clima tropical, por exemplo, existem algumas diferenças

na composição das frações voláteis da própolis, obtida a partir de diferentes
localidades. Isto se deve, principalmente, à presença de várias plantas
utilizadas pelas abelhas como fontes para a elaboração da própolis, bem como
a sua produção ocorrer durante quase todo o ano, podendo haver mudanças
nas fontes botânicas quando mudam as estações do ano (BANKOVA et al.,
1998b).
Uma vez que mesmas espécies vegetais foram visitadas por ambas as
espécies de abelhas (tabela 6), essa semelhança no perfil químico encontrado
condiz com estudos, que sugerem a influência das formações vegetais
associadas aos biomas e ecótonos, onde as amostras foram coletadas
(TORRES et al., 2008).
A geoprópolis da Melipona subnitida Ducke vem sendo estudada pelo

nosso grupo de pesquisas, e sua análise química tem demonstrado a presença
de compostos fenólicos galoil hexosídeos, ácido elágico, acil-(cinamoil /
coumaroil)-hexosídeos, acil-(cinamoil / coumaroil)-galoil-hexosídeos e
flavonoides (agliconas e O-glicosídeos acilados) (DE SOUZA et al., 2013; DE
SOUZA et al., 2018). Dois compostos (1,6-di-O-(E)-coumaroil-2-O-galoil--D-
glucopiranosideo e 1-O-cinamoil-6-O-(E)-coumaroil-2-O-galoílo--D-
glucopiranosideo) foram isolados como novos compostos (DE SOUZA et al.,
2018).
Em avaliação da composição química por UPLC/QTOF-MSE, para

geoprópolis da abelha jandaíra (Melipona subnitida Ducke), Souza (2016)
demonstrou a presença de compostos aromáticos como digaloil glicose, 6-O-p-
coumaroil-D-galactopiranose, coumaroil-galoil-glicopiranosídeo, di-galoil-
78
coumaroil-glicopiranosídeo, cinamoil-galoil-glicopiranosídeo, o flavanonol

aromadendrina, e a flavanona narigenina.
Estudos de composição química têm sido realizados para a geoprópolis.

Bankova e colaboradores (1998a) identificaram mais de cinquenta compostos,
principalmente fenólicos e terpenos da geoprópolis brasileira produzida pelas
abelhas Melipona compressipes, Melipona quadrifasciata anthidioides e
Tetragona clavipes. Compostos como diterpenos, triterpenos e ácido gálico
foram encontradas em 21 amostras de geoprópolis brasileira de abelhas sem
ferrão.
Para sete amostras coletadas na região da baixada fluminense no

Maranhão, de abelhas sem ferrão da espécie Melipona fasciculata Smith, foram
encontrados compostos fenólicos para todas as amostras estudadas, além de
triterpenos e saponinas, para algumas delas (DUTRA et al., 2008).
Investigações realizadas por Freitas e colaboradores (2008) em

geoprópolis de abelhas sem ferrão da espécie Trigona spinipes no Nordeste
brasileiro, permitiu o isolamento dos triterpenos cicloartanos ácido
magniferólico e ácido 3-β-hidroxi-24-metilenocicloartan-26-óico, além dos
flavonoides 3’-metil-quercetina, sakuranetina, éter 7-metil campferol, tricetina e
éter 7-metil aromadendrina como compostos majoritários.
Avaliações químicas realizadas para geoprópolis da abelha jandaíra

(Melipona subnitida Ducke) tem demonstrado alto teor de compostos fenólicos
totais, onde a análise fitoquímica revelou a presença de taninos hidrolisáveis,
flavonoides das classes das flavonas e flavonóis, xantonas e triterpenos
pentacíclicos livres (DE SOUSA et al., 2015), ácidos fenólicos como o ácido
gálico (SOUZA et al., 2014).
Amostras de geoprópolis de abelhas da espécie Scaptotrigona postica

coletadas no estado do Maranhão – Brasil, analisadas UPLC acoplado ao
espectrômetro de massas, tem demonstrado presença de Catechins, Caffeoyl
glucoside, 7-methoxi-5-hydroxy-8-C-flavone rhamnoside, Acacetin-di-C-acetyl
dirhamnoside, Apigenins, Vicenin, Luteolin-8-C-caffeoyl rhamnoside (COELHO
79
et al., 2015). Geoprópolis de abelhas sem ferrão da espécie Melipona

fasciculata Smith foi investigada por Dutra e colaboradores (2014),
demonstrando a presença de ácidos fenólicos e taninos hidrolisáveis.
Geoprópolis produzida pela abelha sem ferrão Scaptotrigona postica

(Mandaguari) no estado do Rio Grande do Norte – Brasil foi analisado,
demonstrando alto teor de fenóis e flavonoides, além de excelente atividade
antioxidante. Os constituintes químicos caracterizados foram principalmente a
quercetina, éteres de metila e metoxichalconas (FERREIRA et al., 2017).
Frações obtidas a partir do extrato etanólico de geoprópolis das abelhas

nativas Melipona scutellaris, permitiram o isolamento de duas novas moléculas
(4-propil-cumarina, 4-fenil cumarina), além de cinco moléculas conhecidas de
Cumarinas (Mammeigin, Hydroxymammeigin, mammeisin,
cinnamoyloxymammeisin, mammein), e uma benzofenona (ent-nemorosone).
As estruturas foram determinadas por análise espectroscópica, incluindo as
experiências 1D e 2D RNM (COZY, HSQC e HMBC) e HRESIMS. As
estruturas dos compostos conhecidos foram determinadas comparando seus
dados espectroscópicos com a literatura (DA CUNHA et al., 2016).
Substâncias triterpênicas têm sido detectadas em própolis tropicais de

Apis mellifera e geoprópolis (BANKOVA et al., 2000; SILVA et al., 2005). De
acordo com estes autores, compostos nitrogenados não são
caracteristicamente encontrados em própolis ou geoprópolis.
A composição química da própolis pode ter origem de três diferentes

fontes, a citar: os exsudatos das espécies vegetais visitadas, as substâncias
secretadas pelo próprio metabolismo das abelhas, além de materiais
introduzidos durante a elaboração do produto final (MARCUCCI, 1995).
Acredita-se ainda que as abelhas incorporem maiores quantidades de

cera na própolis produzida, durante períodos (estações do ano) em que as
resinas vegetais são mais escassas, ou difíceis de coletar (MEYER, 1956).
Esse fator, aliado com as variações sazonais e composição das espécies
vegetais, faz com que a estação do ano também influencie consideravelmente
80
a complexa composição química da própolis (BANKOVA et al., 1998a;

TEIXEIRA et al., 2005).
Além dos fatores mencionados, a composição química da própolis é

extremamente influenciada pela variabilidade genética das abelhas rainhas, já
que essa composição está diretamente interligada às substâncias do próprio
metabolismo desses insetos (KOO, PARK, 1997; BANKOVA et al., 1998a).
81
4.4. Atividade antifúngica in vitro dos extratos de geoprópolis frente

leveduras do gênero Candida
4.4.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima – CIM e

Concentração Fungicida Mínima – CFM
Todas as cepas de leveduras do gênero Candida testadas apresentaram-

se sensíveis aos extratos de geoprópolis das abelhas Jandaíra (Melipona
subnitida Ducke) (conforme tabela 8) e Mandaçaia (Melipona mandacaia Smith)
(expressos na tabela 9), em concentrações inferiores a 1000 μg / mL.
A atividade antimicrobiana dos produtos é considerada ativa, ou não ativa,

conforme os seguintes critérios: 50 a 500 µg/mL= forte/ótima atividade; 600 a
1500 µg/mL= moderada atividade; acima de 1500 µg/mL= fraca atividade ou
produto inativo (HOLETZ et al., 2001; SARTORATTO et al., 2004; HOUGHTON
et al., 2007). Assim, os resultados para atividade antimicrobiana, obtidos no
presente trabalho foram excelentes, quando comparados às classificações
supracitadas.
As amostras de geoprópolis provocam letalidade em todas as espécies de

Candida testadas, em concentrações superiores a CIM. A tabela 8 apresenta
os valores para as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM), frente às leveduras testadas para os extratos
etanólicos de geoprópolis da abelha Jandaíra.
82
Tabela 8– Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) de geoprópolis da abelha jandaíra frente
a cepas de Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilermondii, C. parapsilosis:
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

CONCENTRAÇÃO FUNGICIDA MÍNIMA (CFM)
μg / mL
Candida
Amostra de Candida albicans Candida krusei Candida glabrata Candida tropicalis Candida guillermondii
parapsilosis
geoprópolis da ATCC 18804 ATCC 34135 ATCC 2001 ATCC 13803 ATCC 6260
ATCC 22019
jandaíra
CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM
J1 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
J2 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 125 1000
J3 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
J4 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
J5 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
J6 62,5 500 62,5 500 31,2 500 62,5 500 125 1000 125 1000
J7 62,5 500 62,5 500 31,2 500 62,5 500 125 1000 125 1000
J8 62,5 500 15,6 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 125 1000
J9 62,5 500 250 1000 125 1000 15,6 250 125 1000 125 1000
J10 62,5 500 250 1000 250 1000 15,6 250 250 1000 125 1000
J11 62,5 500 250 1000 250 1000 15,6 250 125 1000 250 1000
J12 15,6 500 125 1000 125 1000 15,6 250 62,5 1000 125 1000
J13 62,5 1000 125 1000 62,5 500 15,6 250 62,5 1000 62,5 1000
Cetoconazol
< 15,6 62,5 < 15,6 62,5 < 15,6 62,5 < 15,6 31,2 31,2 62,5 < 15,6 62,5
(Controle positivo)
83
A tabela 9 apresenta os resultados dos estudos in vitro (Concentração

Inibitória Mínima – CIM, e Concentração Fungicida Mínima CFM) dos extratos
de geoprópolis da abelha mandaçaia frente a cepas do gênero Candida.
Todas as cepas testadas apresentaram-se sensíveis aos extratos

testados, inibindo o crescimento de Candida albicans, Candida krusei, Candida
glabrata, Candida tropicalis, Candida guillermondii e Candida parapsilosis em
Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) de até 62,5 μg / mL, constituindo
interessantes achados científicos. As amostras de geoprópolis da mandaçaia
provocam letalidade em todas as espécies de Candida testadas, em
concentrações superiores a CIM.
84
Tabela 9– Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) de geoprópolis da abelha mandaçaia
frente a cepas de Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilermondii, C. parapsilosis:
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

CONCENTRAÇÃO FUNGICIDA MÍNIMA (CFM)
μg / mL
Candida Candida
Amostra de Candida albicans Candida krusei Candida glabrata Candida tropicalis
guillermondii parapsilosis
geoprópolis da ATCC 18804 ATCC 34135 ATCC 2001 ATCC 13803
ATCC 6260 ATCC 22019
mandaçaia
CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM
M1 62,5 500 15,62 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
M2 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 250 1000
M3 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 500 1000
M4 62,5 500 62,5 500 62,5 500 62,5 500 125 1000 500 1000
Cetoconazol
< 15,6 62,5 < 15,6 62,5 < 15,6 62,5 < 15,6 31,2 31,2 62,5 < 15,6 62,5
(Controle positivo)
85
4.4.2. Ensaio do Cristal violeta
Conforme observado na figura 12, após tratada com extrato de geoprópolis da

abelha jandaíra (J11), a mesma utilizada para formulação de gel, a captação do
cristal de violeta por Candida albicans foi de 45% (+ 3,6), quando tratada com a
concentração correspondente a CIM, 70,6% (+ 1,5), após tratamento com CFM, e
90,6% (+ 1,5) quando tratada com a concentração correspondente a 2 x CFM.
Como controle positivo utilizou-se EDTA dissódico, 0,25 M, cujo grupo

experimental apresenta captação de 63,66% (+ 1,5) de cristal violeta.
Ausência de geoprópolis foi considerada como controle negativo, apresentado

captação do cristal violeta de 27,66% (+ 2,5).
Os resultados observados sugere que a geoprópolis causa alterações

estruturais na membrana plasmática de Candida albicans.
Figura 12 – Efeito da permeabilidade de geoprópolis da abelha jandaíra (J11) sobre

membrana celular de Candida albicans (ATCC 18804), demonstrado através do
ensaio do cristal violeta.
*** p<0,01 em relação ao CIM. ANOVA oneway seguido de Tukey.

86
Doenças causadas por leveduras do gênero Candida, têm crescido nos últimos
tempos, e junto a elas as preocupações referentes ao seu tratamento. Problemas
como a toxicidade, o espectro limitado e o surgimento de resistência a agentes
antifúngicos têm sido difundidos na literatura (CAMERON et al., 1993; WHITE;
MARR; BOWDEN, 1998; SARIGUZEL et al., 2016).
Extratos de geoprópolis de diversas abelhas nativas como Melipona subnitida

Ducke, e frações acetato de etila e hexânica, foram testados frente a cepas de
Candida albicans, Candida guillermondii e Candida tropicalis, obtendo atividade
antifúngica em Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) entre 2048 e 1024 µg/mL
(SOUZA, 2016). Em geral, atividades biológicas desses produtos, dependem de
muitos fatores e, portanto, tem sido associada com a região geográfica, a época de
colheita, o tipo de vegetação, espécies de abelha e o solvente usado na extração
(SAWAYA et al., 2002).
Estudos demonstram que geoprópolis da abelha Melipona fasciculata também

apresenta atividade frente à Candida albicans (LIBERIO et al., 2011). Extrato
etanólicos de geoprópolis produzida por Melipona quadrifasciata anthidioides da
região Centro Oeste do Brasil foram testados frente à Candida albicans
apresentando Concentração Inibitória Mínima de 20,5 mg/mL (DOS SANTOS et al.,
2017).
Os resultados obtidos neste estudo, onde a amostra J12 da abelha jandaíra

apresentou melhor atividade antimicrobiana (CIM de até 15,6 µg/mL) sugere que
essa atividade está diretamente relacionada à presença de compostos fenólicos,
pois essa mesma amostra apresentou uma maior concentração de fenólicos totais,
quando comparado às demais.
Em estudos realizados por Nascimento e colaboradores (2014), compostos

fenólicos isolados da pimenta malagueta (Capsicum frutescens) foram testados
frente a cepas de Candida albicans. No citado estudo, os compostos fenólicos
capsaicina, dihidrocapsaicina e o flavonoide crisoeriol apresentaram significativa
atividade antifúngica sobre a citada levedura, apresentando CIM entre 10 e 25
µg/mL. Esses achados confirmam as evidências de que compostos fenólicos
apresentam comprovada bioatividade frente a leveduras do gênero Candida.
87
Faria e colaboradores (2011) estudaram a bioatividade de compostos fenólicos

isolados, bem como o sinergismo entre esses compostos, e drogas utilizadas nos
tratamentos de candidíases. De acordo com seus resultados, derivados do ácido
cinâmico (ácido 2-hidroxicinâmico, ácido 3-hidroxicinâmico, ácido 4-hidroxicinâmico,
bem como vanilina e verataldeído) e derivados do ácido benzoico (3,4,5 trimetoxi-
benzaldeído), além do timol, 2,3-dihidroxi- benzaldeído e 2,5-dihidroxi- benzaldeído
apresentaram omprovada atividade frente a Candida albicans, Candida parapsilosis,
Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida lusitaniae e Candida
neoformans. Esses achados corroboram com os resultados do presente estudo,
onde compostos fenólicos encontrados na geoprópolis das abelhas mandaçaia e
jandaíra apresentam atividade frente às leveduras testadas.
Os compostos fenilpropranóides eugenol, metil-eugenol e estragol são

relatados com atividade antifúngica, frente a cepas do gênero Candida, causando
morte celular por perturbação da sua membrana celular. Investigações realizadas
demonstraram que esses compostos produzem estress oxidativo, o que pode
explicar sua atividade farmacológica sobre as citadas leveduras (KHAN et al., 2011).
Frações fenólicas isoladas da espécie vegetal Uncaria tomentosa (Willd) foram

testadas frente a cepas resistentes de Candida não albicans, por demonstrar ser a
fração mais ativa contra esses microrganismos. Fenólicos da citada planta
provocaram alterações químicas e morfológicas na parede celular das espécies de
Candida parapsilosis, Candida glabrata e Candida krusei (MORAES et al., 2015).
Para Brunmark e Cadenas (1989) a posição das hidroxilas nos anéis

aromáticos, característicos dos compostos fenólicos, pode ser responsável pelas
diferentes atividades desses compostos frente a microrganismos, como por exemplo
Candida albicans (FARIA et al., 2011).
Martinez e colaboradores (2014) estudaram alterações estruturais em Candida

albicans quando tratadas com terpenos. As alterações morfológicas das células
foram avaliadas usando microscopia eletrônica de varredura eletrônica e
microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados demonstram que terpenos
apresentam excelente atividade antifúngica frente à Candida albicans, induzindo
alterações estruturais em sua parede celular, como aumento de tamanho,
88
modificação da forma, perfurações na parede, e desconexões pronunciadas entre a

parede celular e o citoplasma. Estudos realizados por Viriato (2014) demonstraram
também, excelente atividade antifúngica de terpenóides sobre isolados de leveduras
do gênero Candida, as quais apresentaram Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM)
de até 46,87 μg/mL do terpenóide limoneno, sobre Candida krusei.
A transição da forma leveduriforme (formas comensais) para a forma

filamentosa (forma parasitária, no entanto, patogênica) constitui-se um importante
fator de virulência dos fungos do gênero Candida. Assim, estudos têm surgido com o
objetivo de verificar a bioatividade de substâncias frente à formação de hifas
(germinação), relacionadas a lesões nas mucosas orais e vaginais. Haghdoost et al.
(2016) testaram a ação do extrato etanólico da própolis frente a formação de tubos
germinativos, concluindo que tais substâncias reduzem a formação desses tubos,
com eficácia, dependente da dose.
Diferentes tipos de própolis brasileiras foram testadas frente a leveduras de

Candida spp., apresentando ótima atividade antifúngica, com Concentrações
Inibitórias Mínimas (CIM) variando entre 4 µg/mL, 16 µg/mL e 32 µg/mL (FREIRES
et al., 2016), valores estes semelhantes aos obtidos para as CIM do presente
trabalho, realizado para geoprópolis. Freires et al. (2016) demonstraram ainda que
os extratos das própolis testadas, interrompem a formação de estruturas de
biofilmes.
O ensaio do cristal violeta tem sido utilizado para avaliação de danos à

membrana celular de microrganismos testados frente a extratos obtidos de produtos
naturais (DEVI et al., 2010; GONÇALVES et al., 2012). Tal método de investigação
demonstrou que o tratamento de Candida albicans com o cristal violeta aumentou a
captação do mesmo, ao passo que se aumenta a concentração de geoprópolis,
sugerindo assim que este produto apícola, causa alterações na membrana celular da
citada levedura. Cristal violeta apresenta baixa penetrabilidade em células normais,
mais se acumulam em microrganismos que apresentam sua parede celular
lesionada (DEVI et al., 2010).
Para Martinez et al. (2014), alterações e deformidades em membranas

celulares de leveduras, provocadas por terpenos, reduzem a capacidade desses
89
microrganismos aderir em superfícies e mucosas, reduzindo sua virulência e

capacidade de infecção.
Substâncias terpênicas têm demonstrado excelente bioatividade para utilização

sinérgica com cetoconazol, miconazol, fluconazol e itraconazol. Assim, substâncias
ricas em composição terpênica podem caracterizar alternativas na monoterapia
quimioterapia antifúngica para quadros de candidíase vaginal em combinação com
drogas convencionais. Contudo, há necessidade de mais estudos voltados para
correlacionar sua potente atividade antifúngica in vitro e in vivo provando sua
segurança para aplicação clínica. (MEDEIROS et al., 2017)
4.5. Formulação de gel
4.5.1. Obtenção do gel:
Figura 13 – Fotografia de formulação de gel com geoprópolis (1%) da abelha

jandaíra (Melipona subnitida Ducke).
Fonte: o autor.
4.5.2. Avaliação das formulações de gel de geoprópolis
Os géis formulados contendo extrato de geoprópolis apresentaram os

parâmetros físicos e químicos conforme apresentados na Tabela 10. As amostras
90
apresentaram-se visualmente como um gel viscoso, homogêneo, de cor marrom

esverdeado e com odor característico de geoprópolis.
No teste de separação de fases, todas as formulações de gel permaneceram

homogêneas, sem a formação de precipitados, separação de fases, formação de
sedimentos ou coalescências. A força da gravidade atua sobre os produtos, fazendo
com que suas partículas se movam no seu interior. A centrifugação produz estresse
na amostra, simulando um aumento na força de gravidade, aumentando a
mobilidade das partículas e antecipando possíveis instabilidades. Estas poderão ser
observadas na forma de precipitação, separação de fases, formação de sedimento
compacto (caking) e coalescência, entre outras (BRASIL, 2007).
O pH das formulações testadadas apresentaram inicialmente valores em torno

de 3.0, sendo corrigidos para 4.8 (F1), 4.6 (F2) e 4.7 (F3), através da adição de
hidróxido de sódio, mantendo-se dentro da faixa de pH ideal para uso vaginal (4,5 e
5,0) de forma a não impactar na homeostase da microbiota vaginal (ALLEN JR;
As formulações de gel apresentaram viscosidades entre 535.000 cPs e

920.400 cPs. Visualmente, os géis apresentaram-se consistentes.
Tabela 10– Análises visuais e físico-químicas para o gel de geoprópolis da abelha

jandaíra (Melipona subnitida Ducke)
Teste de
Viscosidade
Formulação Aspecto Cor separação de pH
(cp)
fases
Marrom Não ocorreu 748.800 +
F1 1 4.8 + 0.14
esverdeado separação 1.002
F2 1 4.6 + 0.09
F3 1 4.7 + 0.23
1: Gel viscoso, homogêneo, com odor característico de geoprópolis.
91
A espalhabilidade é uma propriedade importante para formulações de uso

tópico, pois assegura uma aplicação uniforme, transferência de dosagem e eficácia
terapêutica. Os diâmetros encontrados nos testes para formulações de gel são
indicativos de boa espalhabilidade, sendo as formulações com 10% e 40% de
propilenoglicol as que apresentam melhores resultados (Figura 14). Nos testes de
adesão e vazamento observou-se que quanto menor a quantidade de propilenoglicol
no gel da geoprópolis, melhor a adesão (Figura 15) e menor vazamento (Figura 16).
É importante realizar a retenção de uma formulação em uma membrana mucosa o
que poderá proporcionar uma ação mais prolongada.
Figura 14 – Espalhabilidade de formulações de gel contendo extrato de geoprópolis.
Figura 15 – Tempo de adesão das formulações de gelk contendo extrato de

geoprópolis, em tampão citrato (pH 4,5).
92
Figura 16 – Distância de “fuga” (vazamento) das formulações de gel contendo

extrato de geoprópolis.
Para as análises microbiológicas (quadro 6) as formulações de géis

apresentaram carga microbiana abaixo dos limites especificados pela ANVISA,
demonstrando o baixo risco de contaminação microbiana durante seu processos de
obtenção.
Quadro 6– Resultados para as análises microbiológicas, conforme a ANVISA, para

preparações vaginais.
Microrganismos Resultados
Limites especificados 1
pesquisados encontrados
Contagem total de bactérias
Menor que 1 UFC/g Máximo 102 UFC/g ou mL
aeróbias
Contagem total de fungos /
Menor que 1 UFC/g Máximo 101 UFC/g ou mL
leveduras
Staphylococcus aureus Ausentes Ausentes em 1g ou 1mL
Pseudomonas aeruginosa Ausentes Ausentes em 1g ou 1mL
Candida albicans Ausentes Ausentes em 1g ou 1 mL

1
BRASIL, 2010b.
93
4.5.2.1. Estudos de liberação in vitro para o gel de geoprópolis
A porcentagem cumulativa de liberação de extrato de geoprópolis das

diferentes formulações, através da membrana de celulose, ao longo do período de 8
horas está representada graficamente na figura 17.
Figura 17 – Estudos de libertação in vitro do extrato, no gel de geoprópolis, através

da membrana de celulose em solução salina tamponada com fosfato pH 5,0.
Os valores cinéticos obtidos a partir de diferentes tipos de gráficos estão

representados na tabela 11.
Os gráficos foram plotados, de acordo com a cinética de ordem zero (aquele

que apresentou coeficiente de correlação linear (r) mais próximo de 1, definindo
assim a cinética de liberação), onde todas as formulações apresentaram-se lineares,
com coeficientes de regressão que variaram entre 0,9635 e 0,9619.
Tabela 11– Dados cinéticos do estudo de liberação para o gel de geoprópolis da

abelha jandaíra.
Modelo de difusão
Ordem zero Primeira ordem
Formulação (Higuchi)
2 2 2
R K0 R K1 R Kh
F1 0,9619 11.59 0,7784 0.56 0,9619 33.2
F2 0,9635 11.67 0,8060 0.56 0,9634 33.2
F3 0,9300 9.63 0,8060 0.54 0,9285 27.5
94
Os resultados demonstram que em 8 horas ocorre a liberação máxima do

extrato de geopropolis da base polimérica, nas formulações testadas. As três
formulações de gel foram liberadas entre 66% e 75% na primeira hora de estudo,
demonstrando assim um importante efeito burst (liberação inicial mais rápida,
seguida de uma liberação mais sustentada), pelo fato do extrato permanecer livre
em sua base polimérica (XIE et al., 2011).
O modelo cinético de ordem zero baseia-se na liberação lenta da substância

ativa a partir de formas farmacêuticas que não se desagregam. Este modelo pode
ser expresso pela seguinte expressão matemática:
Na qual Mt representa a quantidade absoluta de fármaco liberada no tempo t e

M∞ a quantidade total de fármaco liberado num tempo infinito, a qual deverá
corresponder à quantidade total de fármaco incorporado ao sistema polimérico no t =
0; K0 é uma constante cinética e b é a quantidade inicial de fármaco na solução. O
gráfico que representa uma equação de cinética de ordem zero produzirá uma linha
reta, com inclinação igual a k e liberação independente da concentração.
A classificação dos sistemas matriciais (BURI, 1987) leva em consideração

diversos critérios, especificamente a estrutura da matriz, a cinética de liberação
(idealmente de ordem zero), os mecanismos para controlar a liberação (erosão,
difusão, intumescimento), a natureza química e as propriedades dos materiais
utilizados (LOPES; LOBO; COSTA, 2005).
Muitas vezes, esta quantidade inicial do fármaco resulta de uma liberação

imediata (“burst effect”) motivada ou pela liberação do fármaco existente à superfície
do sistema matricial ou por alterações que se verificam na estrutura do sistema com
conseqüente liberação imediata do fármaco seguido de liberação mais lenta. Este
modelo é geralmente utilizado para descrever a liberação por vários tipos de formas
farmacêuticas de liberação controlada, como é o caso dos comprimidos matriciais,
dos sistemas osmóticos e das formas revestidas (VARELAS et al.,1995).
95
Um aumento da liberação de extrato de geopópolis em gel foi observado na

formulação com 10% de propilenoglicol (F1), sendo que a formulação contendo 40%
de propilenoglicol (F2) apresentou um perfil de liberação semelhante a F1. A
diminuição de propilenoglicol a 5% (F3) diminui consideravelmente a liberação de
extrato de geoprópolis no gel.
A análise por Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA), do meio

receptor após oito horas de estudos de liberação, sugere que os compostos
presentes no extrato de geoprópolis são liberados da formulação de gel, sem
retenção de seus principais constituintes. A figura 18 apresenta o perfil
cromatográfico da liberação de compostos fenólicos (analisados em triplicata) em
comparação com o extrato etanólico, o mesmo utilizado para as formulações
testadas.
Figura 18– Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) do estudo de

liberação de extrato de geoprópolis da formulação de gel. Revelado em NP (ácido
difenilbórico etanolamina – Metanol) e detecção por irradiação ultravioleta 254 e 366
nm.
EXTRATO= Utilizado como padrão de comparação com o meio receptor. LIB=

Amostra liberada em meio receptor (triplicata).
Fonte: O autor.
O revelador NP (ácido difenilbórico etanolamina) sob irradiação a 366 nm

permite que se observe fluorescência de flavonoides. Essa fluorescência é
determinada pelo número e substituintes desses metabólitos secundários. A
96
fluorescência de cor verde, por exemplo, indica a presença de um grupo OH na

posição 4’; cor amarela indica a presença do grupo OH nas posições 3´e 4’; já a
presença de três grupos OH nas posições 3’, 4’ e 5’ produz uma fluorescência de cor
alaranjada (PEREIRA, 2002).
A composição química do meio receptor também foi analisada por

cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada ao espectrômetro de massas
(UPLC/QTOF-MSE). Os resultados obtidos estão de acordo com o perfil verificado
através da CCDA onde marjoritariamente, os compostos presentes no extrato
utilizado para formulação do gel, demonstram terem sido liberados através da
membrana de celulose. A tabela 12 apresenta os compostos identificados no meio
receptor para os estudos de cinética de liberação, e as figuras 19 e 20 apresentam
respectivamente os cromatogramas do extrato etanólicos de geoprópolis, utilizado
na formulação de gel, e composição química do meio extrator, obtido após oito horas
de estudo de liberação.
Figura 19– Cromatogramas UPLC-DAD (340 nm) de extrato de geoprópolis (A)

utilizado na formulação de gel. Cromatograma de íons de pico de base (BPI) obtido
por um método de técnica de coleta de dados MSE (UPLC-qTOF / MSE) em modo
negativo (B) para o citado extrato.
97
Figura 20– Cromatogramas UPLC-DAD (340 nm) de meio receptor (A) após
liberação de extrato de geoprópolis da formulação de gel, através de membrana
semipermeável. Cromatograma de íons de pico de base (BPI) obtido por um método
de técnica de coleta de dados MSE (UPLC-qTOF / MSE) em modo negativo (B) para
o mesmo meio receptor.
98
Tabela 12– Caracterização dos compostos por UPLC/QTOF-MSE para o meio

receptor, no estudo de liberação de extrato de geoprópolis do gel.
-
TR max - [M-H] (m/z)
Composto [M-H] (m/z) Tentativa de identificação
(min) (nm) Calculado
1 4.03 287 285,0761 287,0761 Tetrahydroxy-flavanone
2 4.20 345 285,0404 285,0404 Tetrahydroxy-flavone
3* 4.40 356 315,0512 301,0354 3-O-methyl-quercetin
4 4.77 345 345,0615 345,0615 Myricetin dimethyl-ether
5* 4.85 287 271,0610 271,0611 Naringenin
6 4.93 339 269,0455 269,0455 Trihydroxy-flavone
7 5.08 364 285,0405 285,0404 Tetrahydroxy-flavone

8 5.48 346 299,0563 299,0561 Trihydroxy-methoxy-flavone
9* 5.15 346 315,0504 315,0510 Isorhamnetin

10 5.22 346 299,0563 299,0561 Trihydroxy-methoxy-flavone
11 5.54 287 315,0515 315,0510 Tetrahydroxy-methoxy-flavone
12 5.65 345 329,0662 329,0667 Quercetin dimethyl ether

13 5.70 345 329,0660 329,0667 Quercetin dimethyl ether
14 5.87 369 285,0768 285,0768 Hydroxy-methoxy-chalcone

15 6.01 286 301,0718 301,0717 Trihydroxy-methoxy-flavanone
16 6.11 275 269,0826 269,0819 Hydroxy-methoxy-flavanone
17 6.28 333 313,0716 313,0716 Dihydroxy-dimethoxy-flavone

18 6.48 356 315,0513 315,0510 Tetrahydroxy-methoxy-flavone
19 6.64 360 329,0666 329,0667 Pentahydroxy-flavone

20 6.77 339 343,0822 343,0823 Dihydroxy-trimethoxy-flavone
7-O-methyl naringenin
21* 6.98 287 285,0765 285,0768
(sakuranetin)
22 7.15 339 283,0618 283,0612 Dihydroxy methoxy flavone

25 7.87 339 343,0829 343,0823 Dihydroxy-trimethoxy-flavone
26 7.97 363 269,0822 269,0819 Dihydroxy-methoxy-chalcone

* Comparado com amostra padrão.
99
Conforme se pode observar, o extrato de geoprópolis e o meio receptor obtido

do estudo de liberação in vitro apresentam o mesmo perfil cromatográfico,
demonstrando assim a liberação dos seus principais constituintes ativos.
A superfície da vagina é revestida com células escamosas epiteliais e muco,

produzido por várias glândulas. Os produtos tópicos vaginais são usados no
tratamento de infecções, vaginites, condições de atrofia do endométrio, e
contracepção pelo uso de espermicidas. Esses produtos entram em contato direto
com os tecidos propensos a infecções, por isso devem estar livres de agentes
patogênicos como bactérias e fungos, devendo ser acondicionados em tubos e
embalagens específicas, e devem ser aplicados na vagina através de ponteiras
aplicadoras específicas (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
Os carbômeros podem ser utilizados como agentes emulsificantes,

suspensores, aglutinantes de pós e como modificadores de viscosidade. Podem ser
dispersos em água para formar soluções coloidais ácidas de baixa viscosidade,
sendo que quando neutralizadas, as soluções formam um gel viscoso (CORRÊA et
al., 2005). Em concentrações de 0,5 a 2,0% em água os carbômeros são utilizados
como agentes gelificantes, podendo ainda ser acrescidos fármacos, solventes como
propilenoglicol, conservantes antimicrobianos e estabilizantes, sem interferir em
suas propriedades reológicas (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
A utilização do carbômero 980 como base de gel para incorporação do extrato

de geoprópolis se justifica pelo fato que o carbômero em base aquosa apresenta
ótimos parâmetros de viscosidade em concentrações baixas de polímeros,
compatibilidade com diversos complexos ativos, propriedades bioadesivas, boa
estabilidade térmica, boa aceitabilidade por pacientes e ótimas características
organolépticas (GOODRICH, 1997; MOHAMMAD et al., 2004).
A natureza ácida desse tipo de polímero ocasiona a diminuição do pH da

formulação, resultando numa ionização reduzida dos grupos carboxílicos e aumenta
o enrolamento das moléculas de polímero. Esse fato reflete uma redução acentuada
da viscosidade, da resistência do gel e da mucoadesão (MORSI et al., 2017). Por
esse motivo as formulações testadas no presente estudo necessitaram ser
corrigidos o pH e consequentemente sua viscosidade. No caso específico de um
100
produto com aplicação vaginal, o pH deve estar de acordo com este local de
aplicação, para que não interfira nos processos fisiológicos normais da vagina, nem
desequilibre sua microbiota inerente (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
Investigações realizadas por Yao e colaboradores (2014) em estudos de pré-

formulação contendo o flavonoide miricetina, o pH ácido (em torno de 1,2 a 3,0) é
ideal, quanto a estabilidade desses compostos, evitando sua degradação em
formulações.
De acordo com estudos de Lazzari, Sakamoto e Carvalho (2017), quanto maior

a viscosidade de formulações para uso tópico, melhor seu mecanismo de bioadesão
ao local de aplicação, quando comparado com formulações menos viscosas. Para a
formulação de gel proposta neste estudo, a viscosidade final foi especificada em
consequência da quantidade de agente neutralizante aplicado, para correção de pH.
A viscosidade resultante parece ideal, quando comparada a formulações propostas
(CHORILLI et al., 2007), promovendo boa espalhabilidade e robustez para os testes
de separação de fases.
Substâncias ou complexos bioativos com características apolares,

incorporadas aos géis, terão uma maior afinidade pelo fluido receptor (mucosas) do
que pela base polimérica, contribuindo para uma melhor liberação. Assim, durante o
desenvolvimento de formulações de géis deve-se considerar sua afinidade pela
base, para predizer o perfil de liberação de um agente ativo a partir de um veículo
(CHORILLI et al., 2007).
El-Menshawe e colaboradores (2017) estudaram o desenvolvimento de uma

formulação nanoestruturada de gel, observando que o aumento de propilenoglicol
em 20% nessas formulações, diminui o fluxo de liberação de fármacos.
O estudo de cinética de liberação in vitro requer a manutenção da condição

sink. A definição de condição sink apresenta variações, de acordo com a fonte
bibliográfica. Para o Pharmacopeial Forum (1981), essa condição se definia como 3
vezes o volume de saturação dentro de uma faixa de 500 a 1000 mL, sendo que
depois, passou-se a aceitar que um volume de 5 a 10 vezes o necessário para
saturação seja suficiente para manter as condições sink (ABDOU, 1989).
101
Para Abdou (1989), as condições sink in vitro são normalmente obtidas com a
utilização de grande volume de meio de dissolução, existindo relatos na literatura
que mecanismos como a utilização de uma fase orgânica que atue como
“reservatório” para o fármaco seja suficiente para manutenção da citada condição
(GIBALDI, FELDMAN 1967).
4.6. Formulação de sabonete líquido para uso vaginal
4.6.1. Obtenção do sabonete líquido:
Figura 21– Formulação de sabonete líquido de geoprópolis (esquerda) e própolis

vermelha (direita).
Fonte: O autor.
4.6.2. Avaliação das formulações de sabonete líquido
Para as formulações de sabonete líquido foram analisados os parâmetros de

aspecto visual, pH, viscosidade, densidade relativa, além da pesquisa da carga
microbiológica. O quadro 7 apresenta os resultados dos testes físico-químicos e
microbiológicos para a formulação obtida.
102
Quadro 7– Resultados das análises físico-químicas e microbiológicas para

formulação de sabonete líquido.
Testes realizados Resultados obtidos

Líquido viscoso, com aspecto perolado,
Aspecto visual do produto de coloração branca amarelada, isenta
de partículas estranhas.
pH 4,6 + 0,2
Viscosidade 1.400 + 0.100 cPs
Densidade relativa 1,010 + 0,005 g/mL
Valores
Análises microbiológicas Especificações 1
encontrados
Contagem de microrganismos mesófilos
Menor que 1 UFC < 1 UFC
totais
Pseudomonas aeruginosa Ausentes Ausentes
Staphylococcus aureus Ausentes Ausentes
Coliformes totais ou fecais Ausentes Ausentes
1
(BRASIL, 1999)
A utilização de sabonetes íntimos como tratamento adjuvante nos quadros de

candidíase vaginal é adequado, por promover boa higienização, podendo controlar a
proliferação microbiana na região. Dessa forma, a utilização de sabonete líquido
para essa finalidade constitui-se uma excelente alternativa terapêutica, devido ser
constituído por uma mistura de compostos tensoativos, emolientes, antissépticos,
aromatizantes, quelantes, conservantes e tampões, que devem promover um
equilíbrio físico químico e microbiológico da região vaginal (FERREIRA, 2002).
O desenvolvimento de uma formulação cosmética de sabonete líquido, onde

suas propriedades de suavidade e pH estejam de acordo com a região genital
feminina, somado a incorporação do extrato da geoprópolis que apresenta
comprovada bioatividade frente leveduras do gênero Candida, responsáveis por
causar candidíase vaginal, torna-se um produto promissor para o tratamento
adjuvante a esta patologia.
Em consulta a literatura nacional e internacional de patentes não foram

encontradas evidências que existam produtos de higiene (como sabonetes líquidos)
contendo geoprópolis em suas formulações, nem mesmo evidências de registros na
ANVISA nem no MAPA (Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento) para
103
produtos similares, o que torna a citada formulação totalmente inovadora para o

mercado.
Para desenvolvimento das formulações de sabonete líquido foram utilizados

insumos padronizados na literatura (CORREA; KUREBAYASHI; ISSAC, 2012;
ROWE; SHESKEY; QUINN, 2006), com exceção de alguns componentes em
particular, onde foram utilizados preparos específicos, desenvolvidos por
fornecedores, como tecnologias inovadoras das formulações de sabonetes líquidos.
Sobre a concentração de extrato de geoprópolis nesta formulação, foi proposta

uma variação entre 2 a 10%. Essa variação foi necessária nesta etapa de estudos
de formulação, porque a concentração final de extrato de geoprópolis no sabonete
líquido desenvolvido deverá ser confirmada após estudos de riscos, propostos pela
ANVISA (riscos como irritação e sensibilização da mucosa vaginal, sensação de
desconforto e efeito sistêmico), apresentados no “Guia para avaliação de segurança
de produtos cosméticos” (BRASIL, 2012).
A segurança de produtos cosméticos está baseada na avaliação do seu risco,

devendo se considerar os parâmetros toxicológicos de todos os ingredientes,
incluindo os ativos, com base em dados atualizados, observando as condições de
uso do produto cosmético e o perfil do consumidor alvo (ROGIERS; PAUWELS,
2008).
Sobre os demais insumos utilizados para a formulação, o lauril sulfato de sódio

constituiu-se como o detergente propriamente dito. Esta substância está descrita na
Farmacopeia brasileira 5ª edição, e na Farmacopeia dos Estados Unidos da América
(USP), como uma mistura de sulfatos alquílicos de sódio (pelo menos 85%), com pH
em torno de 6,0 (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2006). O lauril sulfato de sódio é um
dos detergentes sintéticos mais utilizados no preparo de sabonetes líquidos
(MIGLIATO et al., 2009).
Apesar de, a prática diária mostrar que o lauril sulfato de sódio não se constitui
um produto tipicamente irritante, estudos são realizados com a finalidade de
desenvolvimento de detergentes com menor potencial de agressão para peles e
mucosas (LOFFLER; HAPPLE, 2003).
104
Outro tipo de detergente foi adicionado à formulação: o cocamido propilbetaína,

que é normalmente associado a este tipo de produto, pois melhora a qualidade
espumógena e auxilia na viscosidade da composição (MIGLIATO et al., 2009).
O cloreto de sódio é o agente espessante mais utilizado em formulações de

sabonetes líquidos. Ele é capaz de aumentar a viscosidade do produto através da
interação com os agentes tensoativos empregados, desde que os níveis salinos não
ultrapassem certos limites (COUTO et al., 2007). Segundo Haag, Pastore Junior e
Faria (2005), a adição de eletrólitos como o cloreto de sódio constitui-se o recurso
mais econômico e eficiente para espessar formulações tensoativas.
Acrilato de copolímero foi utilizado como agente espessante na formulação de

sabonete líquido, em substituição do cloreto de sódio comumente utilizado nesse
tipo de produto. Este tipo de insumo funciona em formulações cosméticas como
aglutinantes, formadores de filme, agentes de suspensão, agentes de aumento de
viscosidade e estabilizadores de emulsão, em concentrações que podem variar de
0,5% a 25%, e apresentam baixa toxicidade (FIUME, 2002).
Para Silva et al., (2007) a escolha de um agente espessante, diferente do

cloreto de sódio constitui-se uma vantagem comercial, devido ao apelo do marketing
em comercializar produtos “livres de sal”, pois o cloreto de sódio propicia o mesmo
efeito espessante, sem interagir com os constituintes.
Por outro lado, a escolha por outros agentes espessantes em uma formulação
pode vir a acrescentar na qualidade do produto, ou seja, além de dar viscosidade,
ela pode apresentar outras funções coadjuvantes, tais como sobreengordurantes,
estabilizantes de espuma, perolizantes, ou ainda ter a característica de formar uma
película protetora, reter água e controlar a reologia.
As características consideradas como parâmetros de qualidade para um bom

sabonete líquido incluem: ser agradável na aplicação cutânea, apresentar aroma e
cor atraente, exibir viscosidade adequada para aplicação, produzir espuma de forma
que promova uma boa limpeza, possuir pH próximo da neutralidade, apresentar
facilidade de uso, não irritar a pele e mucosas, não provocar deslipidação cutânea,
conservar-se bem, além de não precipitar em águas duras (FONSECA; PRISTA,
2000).
105
O aspecto visual do produto é considerado um parâmetro extremamente

importante, uma vez que são características primariamente vistas por quem os
adquire. As análises sensoriais de formulações cosméticas são insubstituíveis, pois
se torna a única maneira de se avaliar e caracterizar um determinado produto no
aspecto sensorial, não havendo instrumento analítico para medidas desses
parâmetros (CHORILLI et al., 2009; MEILGAARD, CIVILLE, CARR, 2000; MUÑOZ,
1992).
A viscosidade é um significante fator no desenvolvimento de produtos

cosméticos e está totalmente relacionada com a aceitação do consumidor final
(CHORILLI et al., 2007). Embora a viscosidade da formulação e a capacidade de
geração de espuma possuam importância relativa na capacidade de limpeza, estes
são parâmetros que definem a escolha do consumidor e, por isto, são essenciais
critérios para avaliação desses produtos (DE FARIA et al., 2012).
Para Vigliola e Rubin (1993), a viscosidade de um sabonete líquido é um dos

principais apelos de marketing do mercado consumidor, estando diretamente
relacionada com a qualidade, concentração e rendimento do produto. Sabonetes
líquidos para uso íntimo que apresentam viscosidade muito elevada, por exemplo,
dificulta seu escoamento através da embalagem, e aqueles produtos relacionados
com a viscosidade muito baixa favorece o desperdício acidental, pelo escoamento
excessivo do produto (BEZERRA et al., 2016).
Dentre as características físico químicas de um sabonete para uso íntimo, o pH

é a principal delas, pois a vagina com características levemente ácidas exige que a
formulação apresente um pH compatível, o que contribui com a saúde e a microbiota
vaginal para que não cause alterações e agressões (BEZERRA et al., 2016).
O pH ácido das formulações de sabonetes líquidos vaginal não interferem em

sua fisiologia, e em algumas situações protegem a flora desta região, ajudando a
combater outros microrganismos que não resistem ao pH ácido (BELLA et al., 2009).
O trato genital feminino possui vários mecanismos de defesa contra agentes

infecciosos que atuam de forma sinérgica e complementar. Os mecanismos iniciais
de defesa compreendem: barreira epitelial, síntese de muco protetor, pH vulvar e
vaginal, microflora vulvar e vaginal e componentes inespecíficos inerentes à
106
imunidade inata (células fagocitárias e reação inflamatória) (FEBRASGO, 2009). Em

condições naturais para vagina (pH em torno de 4,5), constitui-se um meio ácido
ideal e necessário para manter microrganismos como os lactobacilos que vivem
nessa região e que têm como função proteger a mulher de possíveis infecções
bacterianas (JACQUET et al., 1995).
De acordo com a Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e

Obstetrícia (2009), os produtos para higiene vaginal devem possuir detergência,
para emulsificação suave das gorduras, remoção de partículas microscópicas de
papel, células mortas, urina, fezes e sangue, facilitando a limpeza. Além disso, é
importante a manutenção do pH ácido, que deve variar entre 4,2 e 5,6.
Então, o desenvolvimento dessa inovadora formulação de sabonete líquido

para uso vaginal poderá contribuir com a prática clínica no tratamento de patologias
vulvovaginais, causadas por microrganismos Candida spp., e valorizar a
geoprópolis, um excelente produto natural produzido pelos meliponíneos, e ainda
pouco explorado pelas empresas cosméticas e farmacêuticas.
107
5. CONCLUSÕES
 Extratos etanólicos de geoprópolis dos meliponíneos Melipona subnitida

Ducke (jandaíra) e Melipona mandacaia Smith (mandaçaia) apresentam
elevada composição de compostos fenólicos totais, quando comparados com
geoprópolis de outros meliponíneos.
 Análise química de geoprópolis de Melipona mandacaia Smith (mandaçaia)
através de cromatografia de ultra eficiência acoplada ao espectrômetro de
massas demonstra a riqueza de fenólicos e flavonoides presentes nesse
produto, além de terpenos.
 Extrato etanólico da geoprópolis das abelhas Melipona subnitida Ducke
(jandaíra) e Melipona mandacaia Smith (mandaçaia) apresentaram excelente
bioatividade in vitro frente a cepas de fungos do gênero Candida (Candida
albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilermondii, C. parapsilosis).
Esses resultados apresentam grande contribuição científica, já que são
escassas as publicações de atividade antifúngica da geoprópolis frente às
citadas espécies.
 Ensaios realizados com o cristal violeta sugerem que a bioatividade de
geoprópolis de Melipona subnitida Ducke (jandaíra) apresenta relação com
alterações em sua membrana celular. Estudos complementares se fazem
necessários para predição de possíveis mecanismos de ação.
 Formulações de gel utilizando a base polimérica carbômero (1,5%), com
incorporação de extrato etanólico de geoprópolis da jandaíra, solubilizado com
10% de propilenoglicol, apresentam-se como um produto promissor no
tratamento adjuvante de candidíases vaginais, totalmente inovador no
mercado, com excelente liberação in vitro do extrato de sua base polimérica.
 Ensaios de parâmetros de controle de qualidade físico-químicos e
microbiológicos demonstram que o processo de obtenção de gel contendo
extrato de geoprópolis é reprodutível, demonstrando boas perspectivas para
possível produção em escala industrial.
 Ensaios de liberação de extrato de geoprópolis da matriz polimérica do gel
demonstra que essa formulação não retém os seus principais constituintes
bioativos, liberando bem as substâncias como: flavonoides (3-O-methyl-
108
quercetin, Myricetin dimethyl-ether, Naringenin, Isorhamnetin, Quercetin

dimethyl ether, sakuranetin), flavanonas (Tetrahydroxy-flavanone, Trihydroxy-
methoxy-flavanone, Hydroxy-methoxy-flavanone), chalconas (Hydroxy-
methoxy-chalcone, Dihydroxy-methoxy-chalcone) e flavonas (Tetrahydroxy-
flavone, Trihydroxy-flavone, Trihydroxy-methoxy-flavone, Dihydroxy-
dimethoxy-flavone, Tetrahydroxy-methoxy-flavone, Pentahydroxy-flavone,
Dihydroxy-trimethoxy-flavone).
 Formulação de sabonete líquido contendo extrato de geoprópolis da abelha
mandaçaia é um produto totalmente inovador no mercado, que associa as
características de suavidade, detergência e limpeza, com bioatividade
comprovada da geoprópolis, o que torna essa formulação uma excelente
alternativa na terapêutica adjuvante aos quadros clínicos de candidíases
vaginais. Ensaios de controle de qualidade incluindo pesquisa de
contaminantes microbianos demonstram um processo de obtenção viável,
reprodutível e que tem grande potencial no mercado de cosméticos.
6. PERSPECTIVAS
 Ensaios in vivo em animais e humanos são recomendados, tanto para o gel

quanto para o sabonete líquido. Além de serem exigências regulatórias no
país, os citados testes servirão como parâmetros na predição de segurança e
efetividade das formulações propostas, que não foram contempladas neste
estudo.
109
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ANEXO 1 – Patente depositada: Processo BR 10 2018 008156 0

Perfil químico e atividade antimicrobiana de geoprópolis de abelhas nativas

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Perfil químico e atividade antimicrobiana de geoprópolis de abelhas nativas

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO – UFRPE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E

PERFIL QUÍMICO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (Candida spp.) DE

UMBERTO PEREIRA SOUZA JÚNIOR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E

PERFIL QUÍMICO E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA (Candida spp.) DE

UMBERTO PEREIRA SOUZA JÚNIOR

Tese apresentada ao Programa de

Profa. Dra. Tania Maria Sarmento da Silva

S729p Souza Júnior, Umberto Pereira

Orientadora: Tania Maria Sarmento da Silva.

1. Abelha - Produtos 2. Própole 3. Candidíase 4. Sabonete

UMBERTO PEREIRA SOUZA JÚNIOR

A presente tese foi julgada para obtenção do título de Doutor em

Dra. Tania Maria Sarmento da Silva

Dra. Daniella Carla Napoleão

Dra. Magda Rhayanny Assunção Ferreira

Antônio Cláudio da Silva Lins

Dra. Girliane Regina da Silva

À minha orientadora, Dra. Tânia Maria Sarmento da Silva: Obrigado pelos

Amigos queridos: Francisco Rodrigo e Débora Munique. Obrigado pelas

À turma BIOFITO, pessoas nas quais descobri o valor de uma parceria.

À empresa HEBRON, aos diretores e time gerencial, que a mim

Aos amigos tão especiais, sem os quais, nada teria se concretizado:

À equipe dos laboratórios da INFAN, que contribuíram de maneira ímpar

Tati, Thalita e Thamires, grandes pessoas as quais tenho a ousadia de

Simoninha, uma amiga especial: Obrigado por abrir-me as portas da

Aos amigos de jornada, durante a caminhada deste doutorado,

Ao CENAPESQ da UFRPE, pelo apoio prestado, para as análises em

Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos

Palavras-chave: Geoprópolis. Candida spp. Candidíase vaginal. Gel. Sabonete líquido.

Development and Technological Innovation in Medicines Postgraduate Program

Figura 1 – Mapa de distribuição geográfica dos Meliponíneos:........................ 17

Quadro 1 – Produtos naturais com atividade antifúngica, utilizados no

Tabela 1– Rendimento dos extratos etanólicos de geoprópolis da Melipona

1.1. Abelhas sem ferrão: Meliponíneos

Abelhas sem ferrão, meliponas ou meliponíneos são pertencentes ao

Estas abelhas são criadas de maneira racional, para fins de pesquisa ou

Os meliponíneos constroem seus ninhos com materiais que podem ser

Abelhas da tribo meliponini são consideradas especializadas por possuir

Estas abelhas apresentam-se em maior diversidade nos trópicos

Figura 1 – Mapa de distribuição geográfica dos Meliponíneos:

Fonte: Oliveira et al., 2013

De acordo com Souza e colaboradores (2009) nas Américas as espécies

No Brasil, os meliponíneos são abundantes, com mais de 200 espécies

O tipo de vegetação xerófila e flora variada, características da região

Dentre as abelhas nativas da região da caatinga brasileira, quatro

Para os meliponíneos conhecidos como mandaçaia são relatadas três

Estudos baseados em modelagem de nicho ecológico sugerem que a

Figura 2 – Diferentes subespécies das abelhas Mandaçaia encontradas no

Fonte: Nogueira-Neto, 1997.

No Nordeste do Brasil é conhecida também a espécie Melipona subnitida

Melipona subnitida Ducke foi descrita pela primeira vez em 1910 no

Figura 3 – Melipona subnitida. As manchas “sub-nitidas”. O nome científico da

Fotos: Michael Hrncir. Fonte: Imperatriz-Fonseca; Koedam; Hrncir, 2017.

As substâncias resinosas, produzidas pelas abelhas Apis mellifera, são

Já a geoprópolis (figura 4) é produzida a partir de uma mistura de resinas

Figura 4 – Geoprópolis produzida pela abelha sem ferrão, jandaíra (Melipona

Fonte: Tania M. S. da Silva.

O barro coletado por meliponíneos é utilizado principalmente para fechar

resinas e própolis, formando a geoprópolis. Esta geoprópolis é de consistência

Nos últimos anos, a geoprópolis produzida por diferentes espécies de

A geoprópolis tem sido utilizada na medicina popular para vários fins