Tese Com Ficha Catalografica - Clarissa

Universidade Federal do Amapá - UNIFAP
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação

Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical - PPGBIO
Mestrado e Doutorado
UNIFAP / EMBRAPA-AP / IEPA / CI-BRASIL
CLARISSA SILVA LIMA
ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS

AO TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei Dwyer
(SUBCRÔNICO E REPRODUTIVO)
Macapá - AP
2014
CLARISSA SILVA LIMA
ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Biodiversidade Tropical, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor em
Biodiversidade Tropical.
Área de concentração: Uso sustentável da
biodiversidade
Orientador: Prof. Tit. José Carlos Tavares

Carvalho.
Macapá - AP
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca Central da Universidade Federal do Amapá
615.32
L732e Lima, Clarissa Silva
Estudo da toxidade não clínico em ratos submetidos ao tratamento
com óleoresina de Copaifera duckei Dwyer (subcrônico e reprodutivo) /
Clarissa Silva Lima; orientador, José Carlos Tavares Carvalho. -- Macapá,
2014.
265 f.
Tese (doutorado) – Fundação Universidade Federal do Amapá,

Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical, 2014.
1. Copaíba. 2. Óleoresina de copaíba. 3. Creme vaginal. 4. Toxidade

subcrônica e reprodutiva. I. Carvalho, José Carlos Tavares, (orient). II.
Fundação Universidade Federal do Amapá. III. Título.
CLARISSA SILVA LIMA
ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLINICO EM RATOS SUBMETIDOS

Aprovada em: 30/05/2014
Banca Examinadora:
_________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Bezerra de Oliveira (UFOPA)
________________________________________________
Profa. Dra. Dayse de Sousa Dantas (UNIFAP)
__________________________________________________
Prof. Dr. Caio Pinho Fernandes (UNIFAP)
__________________________________________________
Prof. Dr. Madson Ralide Fonseca Gomes (UNIFAP)
Orientador:
__________________________________________________
Prof. Tit. José Carlos Tavares Carvalho (UNIFAP)
Dedico este trabalho a minha filha Luana Beatriz,
que precisou suportar minhas ausências no Lar.
AGRADECIMENTOS
À Deus.
A Universidade Federal do Amapá, através do Programa de Pós Graduação em
Biodiversidade Tropical.
Ao Prof. Tit. José Carlos Tavares Carvalho, meu orientador, por confiar no meu
potencial para realização deste trabalho e, principalmente, pela compreensão e apoio na etapa
final deste trabalho.
Aos meus ex e atuais alunos de iniciação científica (Monique Kawakami, Uriel Davi,
Clarice Flexa, Charles Barros, Jimaine Nascimento, Ícaro Sarquis e Ruan Felipe) e os demais
IC´s que ajudaram no projeto, se dedicando dia a dia com as atividades desenvolvidas no
Laboratório de Pesquisa em Fármacos. Obrigada, sem vocês este trabalho não teria sido
realizado.
Ao CNPq pela bolsa de doutorado concedida.
Ao Governo do Estado do Amapá, por meio da Fundação de Amparo a Pesquisa
(FAPEAP), pelo apoio financeiro através do auxílio tese.
Ao Dr. Didier Stien pelo estágio de doutoramento concedido no Centre National de la
Recherche Scientifique – Gif-Sur Yvette (Fr.).
Ao Laboratório farmacêutico Almeida Prado Ltda, pela parceria na produção e obtenção
dos cremes vaginais.
A Professora Dra. Tânia Toledo (Laboratório de Biofármacos, Viçosa/MG) pela
parceria na realização do teste subcrônico.
A Dra. Nelma Rocha, pela leitura das lâminas da análise histopatológica.
Ao Prof. Dr. Alexander Florentino, pela ajuda na análise estatística dos dados.
A amiga Profa. Msc. Mayara Tânia pelo incentivo, apoio e ajuda nas micrografias da
análise histopatológica.
Ao aluno Anderson Pena, pela ajuda na elaboração dos abstracts.
As profas. Beatriz Sá, Ms. Caroline Miranda e Dra. Elizabeth Vianna, pelo apoio e
incentivo, principalmente nos momentos mais difíceis.
Ao Breno William pelo apoio nesta jornada da pós-graduação desde longa data.
Aos colaboradores, principalmente equipe do Laboratório de Pesquisa em Fármacos, e
amigos que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho, meu muito
obrigada.
“Todas as vitórias ocultam uma abdicação”.
(Simone de Beauvoir)
RESUMO
As infecções do trato genital feminino têm sido a causa mais frequente de consulta
ginecológica e em contrapartida, nas últimas décadas têm-se observado a revalorização do
emprego das preparações fitoterápicas. No entanto, muitos dos produtos derivados de plantas
utilizados no Brasil não possuem estudos não clínicos de toxidade reprodutiva. O óleo de
copaíba é um importante produto que vem sendo utilizada na medicina tradicional, desde o
tempo da colonização. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade não
clínica em ratos submetidos ao tratamento com óleoresina Copaifera duckei Dwyer (ORCD) e
creme vaginal contendo este óleoresina (CVORCD), em níveis subcrônico e reprodutivo. Para
a caracterização fitoquímica do ORCD, utilizou-se cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas (CG-EM). Para avaliar os efeitos tóxicos em fase de tratamento
subcrônico do ORCD do CVORCD foram utilizados ratos (Rattus norvegicus), linhagem
wistar (machos e fêmeas) que foram tratados por via oral (v.o) e intravaginal (i.v). Os grupos
receberam por 22 dias a dose de 320 mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com
ORCD (v.o - ORCD), ORCD (i.v - ORCDV) e creme vaginal com ORCD (i.v - CVORCD).
Os grupos controles foram receberam com 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg do creme
vaginal base (i.v). Para avaliar a toxidade reprodutiva, utilizou-se ratas prenhas submetidas ao
tratamento com ORCD nos períodos de pré-implantação e pós-implantação do blastocisto no
útero (análise da teratogenicidade), desenvolvimento fetal e lactação. O ORCD foi
administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50 (3758,16 mg/kg)
e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: Grupo
controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e Tratado G3
(1874 mg/kg de ORCD). O estudo da toxidade reprodutiva compreendeu quatro ensaios:
Experimentos (E1, E2, E3 e E4), de acordo com os segmentos I, II e III dos estudos de
toxicologia reprodutiva. Para tanto, 80 animais foram utilizados, sendo 60 fêmeas (n=5/grupo
experimental) e 20 machos reprodutores. Na caraterização fitoquímica, o ORCD apresentou
teor de cariofileno em torno de 500 ng/mL (0,5%), representando uma faixa adequada para
quantificação pelos métodos propostos. O tratamento subcrônico com ORCDV e o CVORCD
não provocou sinais clínicos de toxicidade, nenhuma morte foi registrada e não alterou o
desenvolvimento ponderal dos animais. As fêmeas tratadas com ORCD apresentaram maior
ingestão de água, mas o consumo de ração não foi diferente em machos e em fêmeas. O uso
do CVORCD não alterou a ingestão de água das fêmeas, mas alterou o consumo de ração. O
ORCDV foi capaz de provocar efeito hipoglicemiante e elevação dos níveis séricos de
creatinina. Os parâmetros hematológicos dos animais (machos e fêmeas) não foram alterados
pelo uso oral do ORCD (320 mg/kg). O uso do CVORCD alterou o hematócrito, os linfócitos
e a concentração de hemoglobina. O uso do CVORCD e ORCDV, não alteraram os
parâmetros bioquímicos das ratas. Com relação à toxidade reprodutiva, no E1, o ORCD
administrado no período de pré-implantação não provocou sinais clínicos de toxidade no
grupo E1G2. Contudo, no grupo E1G3 foram observados alguns sinais clínicos de toxidade
aguda (diarréia, piloereção, estresse, agitação, tremores, hemorragia nasal e vaginal). Além
disso, houve registro de um óbito, no d5 de prenhez (6º dia de tratamento). O ORCD (366,89
mg/kg e 1874 mg/kg), demonstrou não alterar o processo de sincronização, com êxito nas
implantações do blastocisto no útero. Quanto as perdas pós-implantação, estas foram
avaliadas mesmo não compreendendo o período de tratamento com ORCD. No E2, o
tratamento com ORCD no período pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade aguda
causando diarréia e agitação após o tratamento, tanto no grupo E2G2 como no grupo E2G3.
Porém outros sinais clínicos de toxidade ocorreram apenas com o tratamento com a maior
dose (1874 mg/kg), tal como estresse, piloereção, sialorréia, apatia, desidratação, hemorragia
nasal e vaginal, caracterizando aborto espontâneo. Na análise da teratogenicidade, o ORCD
nas doses administradas não causou nenhum tipo de alteração ou malformação, tanto
externamente como internamente (esquelética e visceral). No E3, período de desenvolvimento
fetal, o ORCD, provocou sinais clínicos de toxidade aguda (agitação, sangramento e estresse)
em 2 animais no E3G2. Com o aumento da dose, de 366,89 mg/kg para 1874 mg/kg, além
desses sinais, diarréia e piloereção também foram relatados nas progenitoras do E3G. Após o
tratamento com ORCD 1874 mg/kg, todas as ratas vieram a óbito. O ORCD 366,89 mg/kg
apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e razão sexual, com
diferença estatística (p<0,05). O ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de parto, mas o
E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada (8.80 ± 0.66). No
E4, as lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação e estresse após o tratamento,
sendo ainda relatado piloereção em uma lactante do grupo E4G2 que recebeu a menor dose
(366,89 mg/kg) e sangramento nasal e uma das ratas do E4G3. Esses sinais clínicos foram
detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação), E2 (pós-implantação) e E3
(desenvolvimento fetal). O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89 mg/kg) não causou
aumento do tempo de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de nascimento, de
viabilidade e tamanho da ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão sexual diferiram
(p<0,05) do grupo controle E4G1. No exame histopatológico, todos os animais tanto do grupo
controle (E4G1) como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram integridade tecidual dos rins
analisados, e os achados na avaliação histopatológica hepática não diferiram dos do grupo
controle. Assim, ORCD e o CVORCD demonstrou segurança de uso na maior parte dos
ensaios realizados, toxidade subcrônica e reprodutiva. Além disso, as doses testadas
correspondem a supradoses das possíveis a serem usadas na terapêutica.
Palavras-chave: óleoresina de copaíba, creme vaginal, toxidade subcrônica e reprodutiva

ABSTRACT
The infections of the female genital tract have been the most frequent cause of gynecological
consultation, and in compensation, in the last decades it has been observed the use of the
phytotherapeutic preparations. However, many of the derived products of plants used in
Brazil do not present non-clinical studies of reproductive toxicity. Copaiba oil is an important
product that has been used in the traditional medicine, since the colonization period. This
way, this study had as objective to evaluate the non-clinic toxicity in mice submitted to the
treatment with C. duckei oleoresin Dwyer (ORCD) and vaginal cream containing this
oleoresin (CVORCD), in subchronic and reproductive levels. For the phytochemical
characterization of ORCD, gas chromatography coupled with mass spectrometry was used
(CG-MS). Rats were used in order to evaluate the poisonous effects in phase of subchronic
treatment of ORCD of CVORCD (Rattus norvegicus), Wistar lineage (males and females)
that were treated orally (v.o) and intravaginal (i.v). The groups received for 22 days the dose
of 320 mg/kg, 40 mg/kg and 28 mg/kg, respectively, with ORCD (v.o - ORCD), ORCD (i.v -
ORCDV) and vaginal cream with ORCD (i.v - CVORCD). The control groups received 0,5
mL of distilled water (v.o) and 220 mg of vaginal cream base (i.v). To evaluate the
reproductive toxicity, pregnant female rats were used, in order to submit the treatment with
ORCD in the pre-implantation periods and post-implantation of the blastocyst in the uterus
(analysis of the teratogenicity), fetal development and lactation. ORCD was administered
orally (v.o), in the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and 50% of DL50.
This way, the groups were submitted to the following treatments: Control groups G1 (0,5 mL
of distilled water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3 (1874 mg/kg of
ORCD). The study of the reproductive toxicity developed four samples: Experiments (E1, E2,
E3 and E4), according to the segments I, II and III of the studies of reproductive toxicology.
80 animals were used, 60 female (experimental n=5/grup) and 20 reproductive males. In the
phytochemical characterization, ORCD presented caryophyllene content of 0.5 µg/mL
(0,5%), representing an appropriate rate for quantification, through the proposed methods.
The subchronic treatment with ORCDV and CVORCD did not cause clinical signs of toxicity,
no death was recorded and it did not change the weight development of the animals. The
female rats treated with ORCD showed a higher ingestion of water, but the ration
consumption was not different in males and in females. The use of CVORCD did not change
the ingestion of water of the females, but it changed the ration consumption. ORCDV was
capable to cause hypoglycemic effect and rose the levels of serum creatinine. The
hematological parameters of the animals (males and females) were not changed by the oral
use of ORCD (320 mg/kg). The use of CVORCD changed the hematocrit, the lymphocytes
and the hemoglobin concentration. The use of CVORCD and ORCDV, did not change the
biochemical parameters of the female rats. Regarding to the reproductive toxicity, in E1,
ORCD administered in the pre-implantation period did not cause clinical signs of toxicity in
the group E1G2. However, in the group E1G3 some clinical signs of acute toxicity were
observed (diarrhea, piloerection, stress, agitation, tremors, and nasal and vaginal hemorrhage).
Furthermore, there was one death, in the pregnancy d5 (6th day of treatment). ORCD (366,89
mg/kg and 1874 mg/kg), showed not to change the synchronization process, with success in
the implantation of the blastocyst in the uterus. About the loss post-implantation, they were
evaluated even because they were not used during the treatment period with ORCD. In E2,
the treatment with ORCD in the period post-implantation (d6-d15) it evidenced an acute
toxicity causing diarrhea and agitation after the treatment, both in the group E2G2 and in the
group E2G3. However other clinical signs of toxicity just happened with the treatment with
the highest dose (1874 mg/kg), such as stress, piloerection, sialorrhea, apathy, dehydration,
nasal and vaginal hemorrhage, and characterizing spontaneous abortion. In the analysis of the
teratogenicity, ORCD in the administered doses did not cause any change, such as
malformation, both externally and internally (skeletal and visceral). In E3, period of fetal
development, ORCD, caused clinical signs of acute toxicity (agitation, bleeding and stress) in
2 animals in E3G2. Because of the increase of the dose, of 366,89 mg/kg for 1874 mg/kg,
beyond of those signs, diarrhea and piloerection they were also recorded in the progenitors of
E3G. After the treatment with ORCD 1874 mg/kg, all the female rats died. ORCD 366,89
mg/kg showed effect over the viability rate, weaning rate and sexual reason, with statistical
difference (p <0,05). ORCD 366,89 mg/kg did not change the labor, but E3G2 showed a
higher period of pregnancy (23.0 ± 0.31) and size of the brood (8.80 ± 0.66). In E4, the lactic
ones treated with ORCD presented agitation and stress after the treatment, and was recorded
piloerection in a lactic one of the group E4G2, that received to smallest doses (366,89 mg/kg)
and nasal bleeding in one of the female rats of E4G3. Those clinical signs were observed in
the experiments, E1 (pre-implantation), E2 (post-implantation) and E3 (fetal development).
ORCD in the used doses (1874 and 366,89 mg/kg) they caused neither increase of time in the
pregnancy, nor decrease of the rate of birth, of viability and size of the brood. Although the
rate of weaning and the sexual reason were different (p <0,05) of the control group E4G1. In
the histopathology exam, all the animals, not only from the control groups (E4G1) but also
from the treated ones (E4G2 and E4G3) presented tissue integrity of the analyzed kidneys,
and the records in the hepatic histopathologic evaluation hepatic were not different from those
in control groups. Accordingly, ORCD and CVORCD showed safety use in most of the
accomplished samples, subchronic toxicity and reproductive. Besides, the tested doses
correspond to the supradose of the possible ones to be used in the therapeutics.
Keywords: copaiba oleoresin, vaginal cream, subchronic and reproductive toxicity.

LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA

DE Copaifera duckei Dwyer E DO CREME VAGINAL CONTENDO O ÓLEORESINA
Tabela 1. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei 130

(ORCD 320 mg/kg) e água destilada (Controle) sobre os parâmetros
bioquímicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.
Tabela 2. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de 130
C. duckei (CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV
40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre os parâmetros
bioquímicos de ratas, linhagem Wistar.
Tabela 3. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei 131
(ORCD 320 mg/kg) e água destilada (Controle) sobre os parâmetros
hematológicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.
Tabela 4. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de
C. duckei (CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 132
40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre os parâmetros
hematológicos de ratas, linhagem Wistar.
CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C. duckei NOS
PERÍODOS DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO E PÓS-IMPLANTAÇÃO E ANÁLISE DA
TERATOGENICIDADE
Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance 172
reprodutiva materna de ratas prenhas tratadas no período de pré-
implantação (d0-d5).
Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance 180
reprodutiva materna de ratas prenhas tratadas no período de pós-
implantação (d6-d15).
Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós- 184
implantação (d6-d15), sobre a frequência das anomalias e malformações
externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas e recém-
nascidos.
implantação (d6-d15), sobre o percentual das anomalias e malformações
externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas e recém-
nascidos.
implantação (d6-d15), sobre os pontos de ossificação em recém-nascidos.
CAPÍTULO 4 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O
TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei NOS PERÍODOS
PERINATAL E PÓS-NATAL
Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros 222
reprodutivos maternos de ratas tratadas no período de pós-implantação
(d16-d20).
Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento 226
geral da progênie de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal
(d16-d20).
Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo 227
estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no
período de desenvolvimento fetal (d16-d20).
Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase 227
do ciclo estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas
tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).
Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da 228
progênie (F0) de ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).
reprodutivos maternos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-
dpn19).
bioquímicos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
hematológicos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
Tabela 9. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os órgãos de ratas 239
tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
Tabela 10. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento 250
geral da progênie de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
Tabela 11. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo 251
estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no
período de lactaão (dpn13-dpn19).
Tabela 12. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase 252
do ciclo estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas
Tabela 13. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da 253
progênie (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representção esquemática dos períodos críticos do desenvolvimento nos três 54

períodos (implantação, embrionário e fetal).
Figura 2. Esquema geral. Segmentos I, II e III dos estudos de toxicologia reprodutiva 59
Figura 3. Formação de terpenóides via condensação de unidades de isoprenílicas 66
derivadas de duas rotas bioquímicas: Ácido mevalônico ou Metileritritol
fosfato.
CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

Copaifera duckei Dwyer POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM)
Figura 1. Cromatograma do padrão trans-cariofileno obtido em Cromatógrafo Gasoso 97

6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Figura 2. Perfil de fragmentação do padrão trans-cariofileno, obtido em Cromatógrafo 98
Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-
EM).
Figura 3. Curva de calibração do padrão trans-cariofileno, coeficiente de correlação 99
0,997975237; inclinação da reta 3,58189E-05.
Figura 4. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificada pelo 103
método H&L, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a
Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Figura 5. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificado pelo 103
método IUPAC, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado
a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Figura 6. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (RF 3340) não esterificado, obtido 104
em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de
Massa 5973 (CG-EM).
Figura 7. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, esterificado pelo método 106
IUPAC, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a
Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Figura 8. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, não esterificado, obtido em 106
Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa
5973 (CG-EM).
Figura 9. Cromatograma do Branco utilizado no método de esterificação IUPAC, 107
obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro
de Massa 5973 (CG-EM).
Figura 10. Cromatograma e análise quantitativa do óleoresina de C. duckei, obtido em 108
Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa
5973 (CG-EM).
CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA
DE Copaifera duckei Dwyer E DO CREME VAGINAL CONTENDO O ÓLEORESINA
Figura 1. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 126

mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o desenvolvimento ponderal de
ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média
± E.P.M (n=5/grupo).
mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o consumo diário de água de ratos
(machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média ±
E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05.

mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o consumo diário de ração de
ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média
± E.P.M (n=5/grupo).
Figura 4. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei 128
(Tratado CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. duckei (Tratado
ORCDV 40 mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o
desenvolvimento ponderal de ratas, linhagem Wistar. Os valores
representam a média ± E.P.M (n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo
Controle CVB, **p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.
(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e
creme vaginal base (Controle CVB) sobre o consumo diário de água de
ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M
(n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05
grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.
(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e
creme vaginal base (Controle CVB) sobre o consumo diário de ração de
ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M
(n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05
grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.

TERATOGENICIDADE
Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 1 e 2 para avaliar a toxicologia 154

reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de
acordo com os segmentos I (pré-implantação e pós-implantação) e II
(teratogenicidade).
Figura 2. Esfregaço vaginal confirmando o indicativo de prenhez pela presença de 154
espermatozóides e células queratinizadas (fase estro).
Figura 3. Análise das anomalias e/ou malformações externas dos RNs. 156
Figura 4. Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas 160
dos RNs.
Figura 5. Processamento dos RNs e secções seriadas de Wilson (1965) 161
Figura 6. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) 162
septo nasal e (2) palato.
coana, (2) lentes, (3) cristalino, (4) bulbo olfatório e (5) retina.
ventrículos laterais e (2) 3º ventrículo. 163
Figura 9. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) 163
Timo, (2) Traquéia, (3) Esôfago e (4) Medula espinhal.
Arco da aorta, (2) Traquéia, (3) Esôfago, (4) Veia cava superior, (5) Veia
pulmonar, (6) átrios e (7) Pulmões.
átrios direito e esquerdo, (2) Aorta ascendente, (3) Artéria pulmonar (4)
brônquios após bifurcação da traquéia, (5) Aorta descendente, (6) Lobos
pulmonares e (7) Esôfago.
Septo interventricular, (2) Ventrículos direito e esquerdo (3) Veia cava
inferior (4) os quatro lobos do pulmão (5) Aorta descendente, e (6)
Esôfago.
Figura 13. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) 164
Diafragma, (2) Veia cava inferior e (3) pulmões.
Figura 14. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) 165
Fígado, (2) Ápice do estômago e (3) Diafragma.
Figura 15. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve. (1) 165
Papila renal (2) Pelve renal e (3) Rin direito.
Figura 16. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve e Análise 165
dos órgãos reprodutores. (A) Macho. (1) Testículos, (2) Epidídimo, (3)
Canal deferente, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto. (B) Fêmea. (1) Útero
(cornos uterinos direito e esquerdo), (2) Ovários direito e esquerdo abaixo
dos (3) rins, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto.
Figura 17. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E1G3) no 167
período de pré-implantação (d0-d5). Sinal clínico de Toxidade aguda
(hemorragia nasal).
Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e 168
ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de
ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) e após o
tratamento (d14). No grupo controle (E1G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e
valores com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E1G1) e
b
(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de Variância
(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).
ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas
prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) [1] e após o
tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e
valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E1G1)
e b(E1G3 em relação ao E1G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o
tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste
de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).
ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas
prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5). No grupo
controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os
pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão
indicados pelos índices a(em relação ao E1G1) e b(E1G3 em relação ao
E1G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de
tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).
ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas
prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) [1] e após o
tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e
valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao
E1G1), b(E1G3 em relação ao E1G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o
ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o consumo diário de ração (g) de ratas
prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5). No grupo
tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).
período de pós-implantação (d6-d15). Sinal clínico de toxidade aguda e
aborto espontâneo.
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de
ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) e após o
tratamento (d21). No grupo controle (E2G1) foi administrada água
valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E2G1)
e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de Variância
(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas
prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o
tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada
água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e
de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas
prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo
dados representam a média ± Erro Padrão da Média e resultados com p <
0,05, estatisticamente significativos, são representados pelos índices a(em
relação ao E2G1), b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de
variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas
prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o
tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada
água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e
tratamento). Foi aplicado Análise de Variância (ANOVA) seguido do
teste de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão diária de ração (g) de ratas
prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo
tukey (n= 5/grupo).
período de pós-implantação (d6-d15). (A) Útero normal com fetos e
placentas (E2G1) e (B) Útero de rata com reabsorções tardias no corno
esquerdo (E2G3) (ponta da seta).
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre recém-nascidos de progenitoras
tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo controle
(E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras
representam a média dos grupos. PIP: Pequeno para Idade de Prenhez.
AIP: Adequado para Idade de Prenhez, GIP: Grande para Idade de
Prenhez. O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os percentuais não
diferiram entre si ao nível de 5% (p>0,05).
período de pós-implantação (d6-d15). (A) Fontanela normal (E2G1) e (B)
Fontanela com anomalia de grau moderado – Ossificação incompleta
(E2G3) (ponta da seta).
Figura 32. Malformação esquelética (Agenesia de esternébrio) A. Esterno nomal de 189
um RN do grupo controle (E2G1) e B. Ausência de esternébrio do grupo
tratado (E2G2) (ponta da seta).
Figura 33. Alteração esquelética (Falanges com ossificação incompleta) A. Falanges 189
inferiores de um RN do grupo controle (E2G1) e B. Falanges inferiores
com ossificação incompleta (E2G3) (ponta da seta).
Figura 34. Malformação visceral A. ventrículos laterias e 3º ventrículo normais 190
(E1G3) e B. ventrículos laterais e 3º ventrículo malformado - hidrocefalia
leve (E2G2) (ponta da seta).
Figura 35. Alteração visceral A. Rins normais (E1G3) e B. Rin direito alterado – 190
hipoplasia renal (ponta da seta).
CAPÍTULO 4 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei NOS PERÍODOS
PERINATAL E PÓS-NATAL
Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 3 e 4 para avaliar a toxicologia 211

reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de
acordo com o segmento III (perinatal e pós-natal).
ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre a massa de ratas prenhas, tratadas no
período perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal
(d16-d20). No grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada
(0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados
com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E3G1) e
b
(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado Análise de variância
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão de água de ratas prenhas,
tratadas no período perinatal, correspondente ao período de
desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi
administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a
média ± E.P.M. Os valores não diferiram entre si ao nível de 5%
(p>0,05). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste
ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração de ratas prenhas,
tratadas no período perinatal, correspondente ao período de
desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi
média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices
a
(em relação ao E3G1) e b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado
Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey e Teste t não
pareado (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal
(lactação) da progênie de ratas tratadas no período perinatal,
correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No
grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal).
Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi aplicado Teste t não
pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).
ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (pós-
lactação) da progênie de ratas tratadas no período perinatal,
correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No
grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal).
Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi aplicado Teste t não
pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).
ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa de ratas lactantes, tratadas no
final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi
média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices
a
Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a ingestão de água de ratas lactantes,
tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1)
foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam
a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices
a
Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre o consumo de ração de ratas
lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo
pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são
indidados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em relação ao
tukey (n= 5/grupo).
Figura 10. Aspecto microscópico de rin (corte longitudinal) de rata lactante que 240
recebeu água destilada (5mL) do dpn 13 - dpn 19 (E4G1). A. Região
cortical - glomérulos renais e cápsulas Bawman, sem alteração tecidual e
túbulos contorcidos proximais íntegros. B. Região cortical - células sem
alterações citoplasmáticas e nucleares (ponta da seta). C. Região
glomerular, sem alterações tecidual (HE, 20x).
Figura 11. Aspecto microscópico de rin (corte transversal) de rata lactante que 241
recebeu ORCD (366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região
cortical – ducto coletor cortical evidenciando núcleos e citoplasmas
íntegros (ponta da seta) B. Região cortical evidenciando glomérulo e
capsula de Bowman sem alteração tecidual (ponta da seta) (HE, 40x).
Figura 12. Aspecto microscópico de rin de rata lactante que recebeu ORCD (1874 242
mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G3). A. Região cortical com ductos
proximais evidenciando a presença de células cubóides simples íntegras
com núcleos e citoplasma íntegros (ponta da seta - HE, 40x). B. Região
medular – ductos longitudinais com células íntegras (ponta da seta - HE,
20x). C. Presença de dois glomérulos integros e capsula bawman sem
alterações (ponta da seta - HE, 20x).
Figura 13. Aspecto microscópico do fígado de rata lactante que recebeu ORCD 243
(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Hepatócitos normais sem
grandes alterações celulares (ponta da seta) (HE, 20x). B. Hepatócitos
com microvacuolização citoplasmática intensa (ponta da seta) (HE,
20x). C. Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa
(HE, 40x).
(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). Colestase extra-hepática
(ponta da seta - HE, 20x).
(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região centrolobular
normal (ponta da seta - HE, 20x). B. Necrose focal em região
centrolobular (ponta da seta - HE, 10x).
ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa corporal da progênie
(período de lactação), de ratas lactantes tratadas no final da lactação
(dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água
resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao
E2G1), b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância
ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa corporal da progênie
(período de pós-lactação), de ratas lactantes tratadas no final da lactação
(dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água
resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao
E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de
variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
1874 mg/kg (E4G3) sobre o descolamento do pavilhão auricular de
lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Pavilhão auricular antes do descolamento
(B) Pavilhão auricular após descolamento (ponta da seta).
1874 mg/kg (E4G3) sobre a abertura palpebral ocular bilateral de
lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Palpebras antes da abertura (B) Palpebras
após a abertura (ponta da seta).
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

Quadro 1. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano 100

Quadro 2. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano 100
Quadro 3. Pontos da curva de calibração e suas correspondentes concentrações 100
Quadro 4. Composição do óleo-resina de C. duckei e os respectivos tempo de 105
retenção (TR) conforme o tratamento da amostra: esterificado (H&L),
esterificado (IUPAC) e não esterificado.

TERATOGENICIDADE
Quadro 1. As quatro fases do ciclo estral, mediante exame de citologia vaginal. 155
LISTA DE ABREVIATURAS
OECD Organization for Economic Cooperation and Development

OMS Organização Mundial de Saúde
FDA Food and Drugs Administration
US EPA U.S. Environmental Protection Agency
REACH Registration, Evaluation, and Authorization af Chemicals
ICH International Conference on Harmonisation of technical requirements for
registration of Pharmaceuticals for human use
NCI National Cancer Institute
WHO World Health Organization
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
CGAR Cromatografia Gasosa de Alta Resolução
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectômetria de Massas
min Minutos
mL Mililitros
ORCD Óleoresina de Copaifera duckei
°C Graus Celsius
m Metros
mm Milímetros
µm Micrômetros
µL Microlitros
TR Tempo de Retenção
H&L Hartman e Lago
n Número
mg Miligrama
g Grama
ng Nanograma
spp. Espécie
UFV Universidade Federal de Viçosa
kg Kilograma
v.o Via oral
v.v Via vaginal
i.p Intraperitoneal
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid
AST aspartato aminotransferase
ALT alanina aminotransferase
HDL High Density Lipoprotein
CHCM hemoglobina corpuscular média
VCM Volume corpuscular médio
EPM Erro padrão da média
CVORCD creme vaginal do óleoresina de C. duckei
ORCDV óleoresina de C. duckei via vaginal
CVB Creme vaginal base
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em
Animais de Laboratório
UNICAMP Universidade de Campinas
LACEN-AP Laboratório Central do Amapá
DL50 Dose Letal 50%
RNs Recém-nascidos
AIP Adequado para Idade de Prenhez
PIP Pequeno para Idade de Prenhez
GIP Grande para Idade de Prenhez
SNC Sistema Nervoso Central
dpn Dia pós-natal
rpm Rotações por minuto
HE Hematoxilina-eosina
dL Decilitro
U/L Unidade por litro
MPV Volume Plaquetário Médio
PDW Amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................................... 8
ABSTRACT ............................................................................................................................ 10
1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 30
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 32
2.1 BIODIVERSIDADE E OS PRODUTOS NATURAIS ................................................................... 32
2.2 ENSAIOS DE TOXIDADE NÃO CLÍNICO DE PRODUTOS NATURAIS ................ 36
2.3 O USO DE MEDICAMENTOS NA GESTAÇÃO ......................................................... 40
2.3.1 Embriologia humana e comparada ...................................................................... 47
2.3.2 Toxicologia reprodutiva e legislação .................................................................... 54
2.4 O GÊNERO COPAIFERA .............................................................................................. 62
2.4.1 Copaifera duckei Dwyer......................................................................................... 70
3 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 72
4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 88
3.1 GERAL ........................................................................................................................... 88
3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 88
CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE
COPAIFERA DUCKEI DWYER POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) ................................................................... 89
RESUMO................................................................................................................................. 90
ABSTRACT ............................................................................................................................ 91
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 92
2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 96
2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL...................................................................................... 96
2.2 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA
(CG-EM)............................................................................................................................... 96
2.2.1 Parâmetros do equipamento CG-EM .................................................................. 96
2.2.1.1 Dados do equipamento ..................................................................................... 96
2.2.1.2 Condições da análise ........................................................................................ 97
2.2.1.3 Identificação dos compostos ............................................................................. 97
2.2.2 Preparo da amostra ............................................................................................... 98
2.2.2.1 Quantidade de partida ....................................................................................... 99
2.2.2.2 Construção da curva de calibração ................................................................... 99
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 102
4 CONCLUSÃO.................................................................................................................... 110
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 111
CAPÍTULO 2: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA E
DO DO CREME VAGINAL DE C. DUCKEI DWYER.................................................... 115
RESUMO............................................................................................................................... 116
ABSTRACT .......................................................................................................................... 117
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 118
2 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 122
2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 122
2.2 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................................... 122
2.2.1 Animais ................................................................................................................. 122
2.2.2 Vias de administração e doses utilizadas ........................................................... 123
2.2.3 Grupos experimentais ......................................................................................... 123
2.3 AVALIAÇÃO DA TOXIDADE EM FASE DE TRATAMENTO SUBCRÔNICO DO
ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL) .............................................. 123
2.3.1 Desenvolvimento ponderal e consumo de água e ração ................................... 123
2.3.2 Coleta da amostra ................................................................................................ 124
2.3.3 Avaliação dos parâmetros bioquímicos ............................................................. 124
2.3.4 Avaliação dos parâmetros hematológicos ......................................................... 124
2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 124
3.1 AVALIAÇÃO DA TOXIDADE EM FASE DE TRATAMENTO SUBCRÔNICO
DO ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL) .................................. 126
3.1.1 Desenvolvimento ponderal, consumo de água e ração ..................................... 126
3.1.2 Avaliação dos parâmetros bioquímicos ............................................................. 129
3.1.3 Avaliação dos parâmetros hematológicos ......................................................... 131
4 CONCLUSÃO.................................................................................................................... 136
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 137
CAPÍTULO 3: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS
SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C. DUCKEI NOS
TERATOGENICIDADE ..................................................................................................... 143
RESUMO............................................................................................................................... 144
ABSTRACT .......................................................................................................................... 145
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 146
2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 152
2.2 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................................... 152
2.3 ANIMAIS ..................................................................................................................... 152
2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS.............................................. 152
2.5.1 Seqüência experimental ...................................................................................... 155
2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal) ......................................................... 155
2.5.3 Período de Acasalamento .................................................................................... 155
2.5.4 Experimento 1 (E1).............................................................................................. 156
2.5.4.1 Tratamento no período pré-implantação (d0-d5) E1 ...................................... 156
2.5.4.2 Toxidade aguda nas progenitoras E1 .............................................................. 157
2.5.4.3 Avaliação da performance reprodutiva E1 ..................................................... 157
2.5.4.3.1 Teste para confirmação dos sítios de implantações e de reabsorções E1
................................................................................................................................ 158
2.5.5 Experimento 2 (E2).............................................................................................. 158
2.5.5.1 Tratamento no período pós-implantação (d6-d15) E2 .................................... 158
2.5.5.3 Avaliação da performance reprodutiva E2 ..................................................... 158
................................................................................................................................ 159
2.5.6 Avaliação da Embriofetotoxidade E2 ................................................................ 159
2.5.6.1 Peso e classificação dos recém-nascidos (RNs) E2 ........................................ 159
2.5.7 Teratogenicidade E2 ............................................................................................ 160
2.5.7.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas E2 ................................. 160
2.5.7.2 Análise das anomalias e/ou malformações internas E2 .................................. 160
2.5.7.2.1 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas
E2 ............................................................................................................................ 160
2.5.7.2.2 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações viscerais E2
................................................................................................................................ 161
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E1 E E2 ............................................................................. 166
3.1 EXPERIMENTO 1 (E1) ............................................................................................... 167
3.1.1 Toxidade aguda nas progenitoras E1 ................................................................ 167
3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E1 ....................................... 168
3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E1 .................................................... 169
3.1.2 Performance reprodutiva materna E1 .............................................................. 171
3.2 EXPERIMENTO 2 (E2) ............................................................................................... 174
3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E2 ....................................... 175
3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E2 .................................................... 176
3.2.2 Performance reprodutiva materna E2 .............................................................. 179
3.2.3.1 Embriofetoxidade E2 ...................................................................................... 182
3.2.4 Teratogenicidade E2 ............................................................................................ 183
3.2.4.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas e internas (esqueléticas e
viscerais) E2 ............................................................................................................... 183
3.2.4.1.1 Contagem dos pontos de ossificação E2 ................................................. 191
4 CONCLUSÃO.................................................................................................................... 193
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 194
CAPÍTULO 4: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O
TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE C. DUCKEI NOS PERÍODOS PERINATAL
E PÓS-NATAL ..................................................................................................................... 202
RESUMO............................................................................................................................... 203
ABSTRACT .......................................................................................................................... 204
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 205
2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 209
2.2 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................................... 209
2.3 ANIMAIS ..................................................................................................................... 209
2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS.............................................. 209
2.5 DESENHO EXPERIMENTAL .................................................................................... 210
2.5.1 Seqüência experimental ...................................................................................... 212
2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal) ......................................................... 212
2.5.3 Período de Acasalamento .................................................................................... 212
2.5.4 Experimento 3 (E3).............................................................................................. 212
2.5.4.1 Tratamento no período perinatal in útero (d16-d20) E3 ................................. 212
2.5.4.2.1 Avaliação de massa corporal das progenitoras E3 ................................ 213
2.5.4.2.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3 ................ 213
2.5.4.3 Avaliação da progênie exposta no período perinatal (in útero) E3 ................ 213
2.5.4.3.1 Massa da progênie E3 ............................................................................. 213
2.5.4.3.2 Avaliação do desenvolvimento geral e sexual da progênie E3 ............... 214
2.5.4.3.2.1 Descolamento dos pavilhões auriculares E3........................................ 214
2.5.4.3.2.2 Surgimento de pelos E3 ........................................................................ 214
2.5.4.3.2.3 Abertura palpebral ocular bilateral E3 ............................................... 214
2.5.4.3.2.4 Manifestações das características sexuais E3 ..................................... 214
2.5.4.3.2.5 Avaliação da atividade motora E3 ....................................................... 214
2.5.5 Experimento 4 (E4).............................................................................................. 215
2.5.5.1 Tratamento no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4 ..................................... 215
2.5.5.2 Toxidade aguda nas lactantes E4 .................................................................... 215
2.5.5.2.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4 ....................... 215
2.5.5.2.2 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4 ....................... 215
2.5.5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4
................................................................................................................................ 216
2.5.5.2.4 Análise histopatológica das lactantes E4 ................................................ 216
2.5.5.3 Avaliação dos lactentes expostos no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4 ... 217
2.5.5.3.1 Toxidade aguda dos lactentes E4 ............................................................ 217
2.5.5.3.2 Massa dos lactentes E4............................................................................ 217
2.5.5.3.3 Avaliação do desenvolvimento geral da progênie ................................... 217
2.5.5.3.4 Descolamento dos pavilhões auriculares ................................................ 218
2.5.5.3.5 Surgimento de pêlos ................................................................................ 218
2.5.5.3.6 Abertura palpebral ocular bilateral ........................................................ 218
2.5.5.3.7 Manifestações das características sexuais .............................................. 218
2.5.5.3.8 Avaliação da atividade motora................................................................ 218
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E3 E E4 ............................................................................. 218
3.1 EXPERIMENTO 3 (E3) ............................................................................................... 219
3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das progenitoras E3.......................... 219
3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3 ......................... 220
3.1.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos de progenitoras expostas no período
perinatal (in útero) (E3) .............................................................................................. 222
3.1.2 Toxidade na progênie de progenitoras tratadas no período perinal in útero
(d16-d20) E3 .................................................................................................................. 223
3.1.2.1 Desenvolvimento ponderal progênie (Lactação) ............................................ 223
3.1.2.2 Desenvolvimento ponderal da progênie (pós-lactação) E3 ............................ 225
3.1.2.3 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E3 ............................................ 225
3.1.2.3.1 Avaliação da atividade motora E3 .......................................................... 228
3.1 EXPERIMENTO 4 (E4) ............................................................................................... 229
3.2.1 Toxidade aguda das lactantes E4 ....................................................................... 229
3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4................................ 229
3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das lactantes E4 ............................... 230
3.2.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos das lactantes E4 ............................... 232
3.2.1.4 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4 ........ 234
3.2.1.5 Análise histopatológica das lactantes E4 ........................................................ 238
3.2.2 Toxidade aguda nos lactentes E4 ....................................................................... 246
3.2.2.1 Sinais clínicos de toxidade aguda E4 ............................................................. 246
3.2.2.2 Desenvolvimento ponderal dos lactentes durante a lactação (tratamento) E4
.................................................................................................................................... 247
3.2.2.3 Desenvolvimento ponderal dos descendentes após lactação (pós-tratamento)
E4 ................................................................................................................................ 248
3.2.2.4 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E4 ............................................ 249
3.2.2.4.1 Avaliação da atividade motora E4 .......................................................... 252
4 CONCLUSÃO.................................................................................................................... 254
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 256
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 262
APÊNDICE............................................................................................................................266
30
1 INTRODUÇÃO GERAL
O conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos naturais advindos da

biodiversidade amazônica, tem se tornado um importante instrumento no desenvolvimento de
novos produtos farmacêuticos. O óleo de copaíba é um importante produto natural utilizado
na medicina tradicional, desde o tempo da colonização do Brasil, pois a população indígena já
utilizava este óleo para cicatrizar o umbigo dos recém-nascidos. Há tempos vem sendo,
comumente, indicado como anti-inflamatório, antisséptico e cicatrizante, principalmente, das
vias aéreas superiores e urinárias.
Apesar da existência de vários anti-inflamatórios, analgésicos e antissépticos no
mercado farmacêutico, os óleos de copaíba nunca deixaram de ser utilizado pela população
brasileira, principalmente na região amazônica. Além disso, existem várias formulações e
formas farmacêuticas (cápsulas, óvulos e xaropes compostos com mel e copaíba) disponíveis
nas prateleiras de farmácias e drogarias. É reconhecido como um dos produtos naturais mais
utilizados pela população amazônica, onde tem uma grande representação econômica e social,
principalmente, por ser uma espécie nativa e ter várias comunidades que dependem do seu
extrativismo.
No contexto histórico as copaibeiras já foram, comumente, derrubadas, obtendo-se
uma extração de óleo não racional. Isso ocorre devido aos desmatamentos crescentes na
Região Amazônica, com interesse na madeira, que acaba transformando o óleo de copaíba em
subproduto da indústria madeireira. Contudo, já foi descrito na literatura que é possível extrair
o óleoresina de copaíba de maneira ecologicamente sustentável, com uma recuperação
máxima de 100 % do óleoresina em apenas um ano, dependedo do tamanho da árvore.
As ações anti-inflamatória e antimicrobiana do óleo de copaíba já foram comprovadas,
no entanto, ainda há dificuldades em estabelecer a relação entre a composição química e suas
atividades farmacológicas. É comum a existência de diversas espécies de copaibeiras em uma
mesma região, que acaba por proporcior uma variabilidade química entre os óleos obtidos,
dificultando sua validação como fitoterápico. Neste contexto, é importante ressaltar que o uso
de preparações, mesmo fitoterápicas, não pode ser utilizado de maneira indiscriminada pela
população. Além dos estudos que comprovam a ação farmacológica desses produtos, são
necessários, ainda, estudos toxicológicos para avaliar a segurança, tanto do produto natural (o
óleo de copaíba), como do produto final acabado, o medicamento fitoterápico.
31
A ausência de informações sobre os riscos associados ao uso de alguns produtos,

mesmo o naturais, é um dos principais fatores que levam a intoxicações. Pode parecer trivial
quando comparada com aquela apresentada pelos medicamentos convencionais; entretanto, a
toxidade de plantas medicinais é um problema de saúde pública, devido à crença de que estas
não causam efeitos adversos. É comum sua utilização pelas gestantes e lactantes como recurso
medicamentoso, para fins de aliviar ou curar doenças. Por isso, não se pode considerar que
por se tratar de produtos naturais, essas substâncias sejam inócuas; sendo necessária a
realização de ensaios toxicológicos para fornecer a comunidade dados científicos sobre
segurança e toxidade das mesmas.
Gestantes constituem um grupo populacional que, culturalmente, utiliza as plantas
medicinais, por acreditarem que estas não causam danos ao feto ou ao neonato. A utilização,
mesmo de preparações fitoterápicas, nesse grupo pode gerar riscos a saúde, podendo ocorrer
graves conseqüências, tanto para a mãe como para o feto. Nesse caso, embora raros, os
estudos toxicológicos bem controlados são necessários, inclusive durante o período
gestacional.
A grande maioria dos produtos derivados de plantas utilizados, culturalmente, no
Brasil não possui estudos pré-clínicos de toxidade reprodutiva, e o efeito desses produtos
sobre o sistema reprodutivo é desconhecido. Devem-se utilizar os mesmos cuidados dos
medicamentos alopáticos para comprovar a sua segurança. A política de plantas medicinais e
medicamentos fitoterápicos foram aprovados em 2006 objetivando inserir terapias alternativas
e práticas populares (incluindo a fitoterapia) no sistema único de saúde (SUS). Por isso, há
necessidade de estudos toxicológicos e a implantação de políticas de fitofarmacovigilância
devem ser tomadas como prioridade para a saúde pública.
Os estudos de toxicologia reprodutiva de produtos naturais ainda são incipientes no
Brasil, contudo, são necessários, para que a classe médica possa prescrever o uso desses
produtos naturais. Diante desta problemática, o presente estudo buscou avaliar os possíveis
efeitos tóxicos, após longo período de uso (subcrônico), provocados pelo óleo de copaíba e/ou
pelo medicamento fitoterápico (creme vaginal). Buscou-se ainda, um amplo estudo para
avaliar e a toxidade reprodutiva em diferentes períodos (pré-natal e pós-natal).
32
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 BIODIVERSIDADE E OS PRODUTOS NATURAIS
Os componentes da biodiversidade podem fornecer uma ampla gama de produtos de

importância econômica. Dentre eles destacam-se os fitoterápicos e os fitofármacos, originados
dos recursos genéticos vegetais (GUERRA et al. 1998). O Brasil é considerado o primeiro em
megadiversidade, tanto em número de espécies quanto em níveis de endemismo (ALBAGLI,
2001). Estima-se entre 10 e 20% do número total de espécies do planeta (DIAS, 2001). A
biodiversidade existente nos vários biomas brasileiros (Caatinga, Cerrado, Pantanal, Mata
Atlântica, Amazônia e Pampa) permite que o país desenvolva ciência e tecnologia na
produção de medicamentos de origem vegetal (VILLAS BOÂS; GADELHA, 2007). Existem
mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000,
consideran-se, ainda, que mais da metade dessas espécies se encontram nas florestas tropicais,
cuja área corresponde a apenas 7% da superfície da terra (MARQUES, 2000; GUERRA et al.,
1998).
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos,
muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos.
Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se impressionados pelo fato desses
produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade
em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (GUERRA et., 1998).
Os produtos naturais são micromoléculas ou metabólitos secundários, com estruturas
complexas, baixo peso molecular, marcantes atividades biológicas e, diferentes dos obtidos do
metabolismo primário. São encontrados em concentrações relativamente baixa e em
determinados grupos de plantas (POSER; MENTZ, 2004). Esses produtos desempenham um
papel fundamental, pois servem como ponto de partida para a pesquisa e desenvolvimento de
novos fármacos. Algumas triagens são empregadas para selecionar os produtos naturais que
contém atividades biológicas, tal como os estudos randômicos, quimiotaxinômicos,
etnobotânicos, etnofarmacológicos, e etológicos (MCCHESNEY et al., 2007).
Na abordagem randômica, a coleta de plantas se dá ao acaso. Pode-se randomizar uma
coleta em área genérica, com diversidade taxonômica reconhecida para triagens fitoquímicas
e farmacológicas; preferencialmente em regiões com alto grau de diversidade e endemismo. O
estudo quimiotaxonômico ou filogenético consiste na seleção de espécies de uma família ou
33
gênero, para as quais se tenha algum conhecimento fitoquímico de ao menos uma espécie do
grupo. Um bom exemplo são as espécies do gênero Bauhinia que possuem algumas
substâncias químicas em comum como glicosídeos, triterpenos, lactonas e flavonóides
(SILVA; CECHINEL FILHO, 2002). Outro exemplo são as espécies do gênero Hypericum,
notadamente H. perforatum L, que tem a hipericina como principal constituinte. Em H.
barbatum Jacq. encontrou-se conteúdo de hipericina 3.9 vezes maior que em H. perforatum
(SMELCEROVIC; SPITELLER, 2006).
Apesar de a indústria farmacêutica empregar as mais diferentes técnicas, tal como, a
biologia molecular, química combinatória e a química computacional, a investigação da
atividade biológica de produtos naturais com base no uso tradicional é o ponto chave na busca
de novas moléculas. Isso por duas razões básicas: o tempo e o baixo custo envolvido na
chegada de um medicamento ao mercado (PETROVICK et al., 1997; ALVES, 2005).
O resgate dos conceitos locais que são desenvolvidos com relação às plantas e ao uso
que se faz delas podem ser identificados através dos estudos etnobotânicos. Segundo
Albuquerque et al. (2007), estuda a inter-relação direta entre pessoas e plantas, incluindo
todas as formas de percepção e apropriação dos recursos vegetais. Indo mais além do que o
registro dessas drogas utilizadas, a etnofarmacologia inclui uma avaliação experimental
obtidas informações etnomédicas, avaliando a eficácia das técnicas “tradicionais” fazendo uso
de um grande número de modelos farmacológicos (WALLER, 1993; DI-STASI, 2005;
ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006). Não obstante, na abordagem etológica os estudos
são feitos com base na observação do comportamento animal para avaliar a utilização de
metabólitos secundários por esses animais, ou outras substâncias não nutricionais dos
vegetais, com a finalidade de combater doenças ou controlá-las (HUFFMAN, 2003; CARRAI
et al., 2003; KRIEF et al., 2004).
Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem os produtos de origem
natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função biológica. A diversidade molecular
dos produtos naturais é muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar
dos avanços consideráveis, ainda é limitada. Desde o final do século XIX, os avanços na
química orgânica possibilitaram a modificação da estrutura dos produtos naturais, tendo em
vista um aumento na atividade ou seletividade e a redução dos efeitos colaterais ou a
toxidade. Apesar da criação e modificação de novas moléculas em laboratório, para
Chechinel-Filho e Yunes (2001) os produtos naturais são sintetizados mediante um processo
de química combinatória inigualável, a seleção natural e a evolução biológica, que
34
proporcionam uma diversidade estrutural de moléculas em diferentes alvos biológicos.

Newman e Grag (2007) fizeram um levantamento sobre as novas drogas inseridas no
mercado nos últimos 25 anos. Os dados demonstraram que 6 % dessas drogas foram
originárias, exclusivamente, de produtos naturais e 28 % foram derivadas desses produtos
(semissíntese). Se juntarmos com mais 5 % de drogas obtidas a partir de síntese (com grupo
farmacofórico oriundo de um produto natural), mais 12 % de drogas que mimetizam a partir
de síntese um produto natural (incluindo grupo farmacofórico obtido de um produto natural) e
12 % de drogas sintéticas (que mimetizam produtos naturais), temos um total de 63 % versus
37 % daqueles obtidos, somente, a partir de síntese química com screening farmacológico
randomizado.
Dentre as espécies vegetais brasileiras, inúmeras são possuidoras de propriedades
farmacológicas relevantes, importantes não só como alternativa terapêutica, mas também
como fonte econômica para o país (MARINHO et al., 2007). A grande dificuldade esbarra na
escassa inovação tecnológica em pesquisa e exploração de produtos naturais, apesar da
abundância desses produtos nos países em desenvolvimento. No Brasil, as inovações têm sido
de baixa ou média intensidade, sendo que os fitoterápicos mais vendidos no mercado
brasileiro são produzidos a partir de espécies estrangeiras (WAGNER, 2002). Por outro lado,
grandes empresas sediadas em países industrializados, como Alemanha, França, Estados
Unidos e Japão, vêm aplicando competências científicas e tecnológicas no desenvolvimento
de produtos derivados de plantas medicinais, muitas vezes oriundas dos países em
desenvolvimento e com emprego tradicional, e se consolidando como líderes neste crescente e
promissor mercado (YUNES; PEDROSA; CECHINEL-FILHO, 2001).
Segundo Funari e Ferro (2005), as populações dos países em desenvolvimento reúnem
cerca de 80% da população mundial, entretanto, são compradores de apenas 20% de
medicamentos a nível mundial. Não obstante, os fitoterápicos vêm sendo amplamente
utilizados, com crescimento em torno de 10 % a 20 % de suas vendas em vários países. Cerca
de ¼ do mercado brasileiro de medicamentos corresponde ao uso de produtos de origem
natural (SANT’ANA, 2002). Como exemplo, nos últimos 10 anos as florestas tropicais foram
responsáveis por fornecer matéria prima que resultou na produção de 60 % das novas drogas
utilizadas para o tratamento do câncer (NEWMAN; GRAG, 2007; MCCHESNEY et al.,
2007).
O custo de um medicamento originado a partir de plantas medicinais gira em torno de
35 milhões de dólares. Já a descoberta de um novo medicamento sintético varia de 500 a 800
35
milhões de dólares, podendo levar entre sete a vinte anos de pesquisa para chegar ao mercado
(SANT’ANA, 2002; MCCHESNEY et al., 2007). Diante disso, revela-se a necessidade de se
buscar alternativas na geração dos fitoterápicos para superar a dependência externa dos
medicamentos sintéticos, principalmente quando se confrontam os preços médios praticados
no Brasil em comparação com aqueles praticados nos países desenvolvidos. Nesse quadro,
confronta-se um hemisfério norte rico em tecnologia, mas pobre em recursos genéticos e
hemisfério sul pobre em tecnologia, mas riquíssimo em diversidade biológica (GUERRA et
al. 1998).
A utilização da medicina informal ou popular realizada por indivíduos que se valiam
de seus diferentes saberes é bastante difundida no Brasil onde algumas plantas consideradas
medicinais são comercializadas livremente (BOCHNER et al., 2012). Isso pode ser devido,
dentre outros fatores, ao alto custo dos medicamentos industrializados como também ao
difícil acesso à assistência médica. Por meio disto, tradições terapêuticas por meio das plantas
contribuíram para a formação da medicina popular. Segundo Calixto (2005), este fato deve-se
à pobreza e ao pouco acesso à medicina moderna. É nesse contexto social que as plantas
medicinais adquirem importância como agentes terapêuticos. A OMS (Organização Mundial
de Saúde) define que planta medicinal é “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais
órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores
de fármacos semissintéticos” (WHO, 2002).
No Brasil, sabe-se que várias comunidades dependem da medicina tradicional para
tratar diversas doenças infecciosas e parasitárias como as tropicais, contudo, a maioria das
pesquisas, em termo global, tem dado pouca importância os dados epidemiológicos, das
doenças endêmicas, dos países em desenvolvimento (doenças tropicais), no que diz respeito à
descoberta de um novo fármaco. Isso porque as grandes indústrias farmacêuticas não se
interessam em produzir medicamentos para as ditas “Doenças Negligenciadas”, tal como,
tuberculose, malária, esquistossomose, leishmaniose e tripanossomose entre outras
(TROUILLER et al., 2001). Apesar da flora exuberante e da enorme variedade de espécies
nativas, o mercado brasileiro de medicamentos fitoterápicos caracteriza-se,
predominantemente, pela utilização de plantas europeias e asiáticas. Isso se devia,
principalmente, ao incipiente desenvolvimento do seguimento farmacêutico no país, com
poucos investimentos em pesquisas na área de fitoterapia (CHECHINEL-FILHO; YUNES,
2001).
36
No entanto, nos últimos anos, segundo Klein e seus colaboradores (2009), o mercado
de medicamentos derivados de plantas, os fitoterápicos, tem atraído a atenção da indústria
farmacêutica, setor para o qual são destinados bilhões de dólares e que possui ascendente
expansão. Diante deste cenário, cabe ressaltar o considerável número de artigos publicados no
Brasil com o termo “copaíba”, associado à sua elevada biodiversidade, o que atribui à flora
nativa amplo potencial de aplicação farmacológica e medicinal (AZEVEDO, 2003).
2.2 ENSAIOS DE TOXIDADE NÃO CLÍNICO DE PRODUTOS NATURAIS
O uso de plantas medicinais no alívio de qualquer moléstia é uma prática antiga das
atividades humanas. A Organização Mundial de Saúde traz recomendações à difusão dos
conhecimentos necessários ao uso das plantas medicinais, embora sejam popularmente
consideradas terapêuticas, frequentemente possuem propriedades tóxicas desconhecidas pela
população. Entretanto, a utilização da medicina informal ou popular realizada por indivíduos
que se valiam de seus diferentes saberes é bastante difundida no Brasil onde algumas plantas
consideradas medicinais são comercializadas livremente (BOCHNER et al., 2012). Isso pode
ser devido, dentre outros fatores, ao alto custo dos medicamentos industrializados como
também ao difícil acesso à assistência médica, fato que contribui para a continuidade da
medicina tradicional.
Sabe-se que muitas destas plantas apresentam substâncias que podem desencadear
reações adversas e inúmeros trabalhos científicos têm relatado efeitos tóxicos principalmente
sobre o fígado, e em escala menor sobre os rins, sangue, pele, sistema nervoso, cardiovascular
e reprodutor, bem como efeitos mutagênicos e carcinogênicos (SOARES, 2008). A literatura
tem demonstrado numerosos estudos de extratos de plantas com algum efeito terapêutico, o
que torna cada vez mais necessário estabelecer parâmetros de toxicidade (SHAHJAHAN,
2004; TCHAMADEU et al., 2011). Segundo Calixto (2000), dois tipos de efeitos adversos
podem ser atribuídos ao uso de plantas medicinais. O primeiro é considerado intrínseco a uma
determinada planta e pode ser relacionada à sua toxidade, a uma super dosagem e/ou a
interação com outros fármacos. O segundo, extrínseco, está relacionado a erros de
identificação, falta de padronização no preparo, contaminação, substituição, adulteração de
plantas e dosagem incorreta.
Toxidade é a propriedade potencial de uma determinada substância química de instalar
um estado patológico em conseqüência de sua introdução ou interação com o organismo
37
(OGA, 2008). A toxicidade de plantas medicinais constitui hoje um problema sério de saúde
pública. O Surgimento do conceito de “natural”, em muito contribuiu para o aumento do uso
das plantas medicinais nas últimas décadas. Para muitos, esse conceito significa “ausência de
substâncias químicas”, que são aquelas que podem causar dano ou, de outra forma,
representam perigo. Assim, os produtos naturais passaram a ser sinômino de produtos
saudáveis, seguros e benéficos. Esse conceito é extremamente equivocado, já que muitas
plantas contêm substâncias capazes de exercer ação tóxica sobre organismos vivos
(MENGUE; MENTZ; SCHENKEI, 2001). Por esse motivo há uma preocupação crescente
nos meios científicos que envolvem estudos fitoterápicos, pois tem sido comum a ocorrência
de adulterações e toxidez dos mesmos.
A propriedade de cada planta em causar toxidade pode ser verificada através da
avaliação toxicológica, obtendo-se dados como dosagem, sinais, efeitos provocados que irão
determinar o potencial de toxicidade. Uma das formas de proceder à avaliação toxicológica é
através da administração de quantidade do composto em estudo ou doses do extrato em
animais podendo ser realizada a toxicidade aguda, subcrônica ou crônica. A toxicidade aguda
provoca uma resposta rápida num curto período de tempo (por convenção de poucas horas ou
poucos dias), provocando geralmente uma elevada mortalidade. Na toxicidade crônica, os
efeitos se manifestam num longo período de tempo (de semanas a meses) (DIAS et al, 2002).
Assim, a investigação do potencial tóxico de plantas medicinais pode elucidar

importantes aspectos farmacológicos de seus princípios naturais, permitindo uma utilização
segura, respeitando seus possíveis riscos toxicológicos (MENGUE; MENTZ; SCHENKEI,
2001). Os testes de toxicidade em geral são utilizados para avaliar ou para prever os efeitos
tóxicos nos sistemas biológicos ou para averiguar a toxicidade relativa das substâncias
(FORBES; FORBES, 1994). Os principais objetivos da avaliação da segurança nos ensaios
não clínicos é caracterizar os efeitos tóxicos relacionados ao órgão alvo, dose dependência,
tempo de exposição, reversibilidade dos efeitos e tempo em que os sinais de toxidade
aparecem e desaparecem (FDA, 2010).
A toxidade aguda está relacionada à exposição a uma substância química por
menos de 24 horas, mesmo sendo realizada apenas uma administração e seus efeitos durante
14 dias após a administração (KLAASSEN; WATKINS, 2012). Esses ensaios são utilizados
para classificar e rotular apropriadamente as substâncias de acordo com o seu potencial de
toxidade ou letalidade e devem ser usadas em estudos subsequentes de toxidade prolongada
38
(VALADARES, 2006; BRASIL, 2013). A toxidade subaguda está relacionada a exposição

repetida de a uma determinada substância química em um organismo, por um período de um
mês ou menos, o que pode levar a toxidade sistêmica do organismo, dependendo do seu grau
de exposição (KLAASSEN; WATKINS, 2012).
A toxidade sistêmica pode ser identificada através da diminuição do peso corporal
dos animais e por alterações no consumo de água e ração (CUNHA et al., 2009), além de
sinais comportamentais como prostração, apatia e a presença de pelos eriçados. Segundo Lapa
et al. (2010), a toxidade sistêmica também pode ser identificada por meio das alterações
relacionadas a massa relativa dos órgãos, sendo importante para a avaliação da toxidade de
uma determinada substância nociva ao organismo.
O teste de toxidade prolongada analisa e caracteriza todos os efeitos provocados
por uma determinada substância quando administrada diariamente a animais experimentais,
em doses previamente estabelecidas e por períodos prolongados. Os principais parâmetros que
devem ser observados durante o período de tratamento são modificações na atividade motora
e no comportamento, no consumo de água e ração, no peso dos animais na cor e textura dos
pelos e na frequência cardiorrespiratória. Ao fim dos experimentos, os animais devem ser
sacrificados para a coleta de sangue (estudo bioquímico e hematológico) e remoção dos
órgãos para análise macro e microscópica (BRASIL, 2013).
A toxidade subcrônica avalia a exposições, variando de 21 a 90 dias em roedores
e um ano para animais de grande porte. A avaliação da toxidade reprodutiva devem
contemplar avaliações nas seguintes fases: (Fertilidade e desenvolvimento embrionário
inicial; desenvolvimento pré e pós-natal, incluindo função materna; desenvolvimento embrio-
fetal e avaliação do potencial de toxidade reprodutiva) (OECD, 2001; BRASIL, 2013).
Inúmeros trabalhos envolvendo estudos não clínicos in vivo de produtos naturais, utilizam
parâmetros bioquímicos, hematológicos e anatomopatológicos para avaliar possíveis sinais de
toxicidade (LEMÔNICA et al., 1996; LYRA et al., 2005; VALADARES et al. 2006;
ARAGÃO et al., 2006).
Os testes não clínicos são apenas regulatórios, durante a sua realização existe a
oportunidade de descobrir novas potencialidades do medicamento, corrigir problemas de
efeitos colaterais e toxicidade. Apesar de muitos dos fitoterápicos utilizados no nosso país se
mostrarem eficazes ao longo de anos de utilização, uma boa parte dessas substâncias são
isentas de estudos que comprovem sua segurança e eficácia, e aquelas indústrias que as
comercializam e almejam continuar com seu registro do Ministério da Saúde deverão
39
comprovar cientificamente em animais e em seres humanos tais propriedades (FUNARI;

FERRO, 2005; BENT, 2008).
Assim, os estudos não clínicos dos medicamentos fitoterápicos passaram a ser
exigidos. Esse fato levou diversos paises à edição de normas legais, subsidiando o
desenvolvimento de estudos científicos para comprovar a eficácia e a segurança desses
medicamentos (BRASIL, 2004a; BRASIL, 2004b). A norma estipula que os testes de
avaliação de risco sejam realizados em duas espécies de mamíferos, uma roedora e uma não
roedora, machos e fêmeas de linhagem isogênica, em número suficiente para garantir a
análise estatística dos resultados, sem exageros que infrinjam os “Princípios Éticos da
Experimentação Animal” (SCHNAIDER; SOUZA, 2013). Estabelece ainda a via de
administração a ser usada, doses e duração de tratamento, tendo por base os preconizados para
o uso do fitoterápico em humanos (BRASIL, 2014).
Em 2006, foi publicado o decreto que aprova a Política Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos e dá outras providências, que tem o objetivo de garantir à
população brasileira o acesso seguro às plantas medicinais e fitoterápicos, promover seu uso
racional, o uso sustentável da biodiversidade, desenvolver a cadeia produtiva e a indústria
nacional. A Política foi formulada para atender a demandas dos setores públicos e privados e
traz importantes contribuições para a indústria farmacêutica, pois promove a utilização de
plantas medicinais e fitoterápicos no SUS. A política de fitoterápicos propõe as diretrizes
relacionadas: (i) ao fomento à pesquisa, desenvolvimento tecnológico e inovação, (ii) à busca
pela garantia da segurança, eficácia e qualidade dos produtos, (iii) à implantação de
plataformas tecnológicas com integração de cultivos e produção e (iv) à adoção de Boas
Práticas de Fabricação no processo Produtivo (BRASIL, 2006).
Segundo o Ministério da Saúde, plantas medicinais “são aquelas que possuem
uma história de uso tradicional como agente terapêutico. E o fato de uma planta ter entre seus
constituintes precursores químicos de fármacos não necessariamente a caracteriza como
planta medicinal. Possuir precursores de síntese não significa que a planta pode ser utilizada
na produção de medicamentos”. Os fitoterápicos são definidos como medicamentos cujos
componentes terapeuticamente ativos são exclusivamente plantas ou derivados vegetais
(extratos, sucos, óleos, ceras, etc.) (BRASIL, 2004b). A diferença entre planta medicinal e
fitoterápico reside no processo de elaboração que a planta sofre, no qual a elaboração
privilegia uma formulação específica, que o caracterizado como um fitoterápico. De acordo
com a Resolução RDC Nº. 48, de 16 de março de 2004, fitoterápico é “todo medicamento
40
tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais

com finalidades profiláticas, curativas ou para fins de diagnóstico, com benefício para o
usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como
pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade” (BRASIL, 2004b).
No Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160 milhões por ano.
E o fato de atração é o ritmo do crescimento das vendas internamente, mais de 15% anuais,
contra 4% dos medicamentos sintéticos (CARVALHO et al., 2008). O uso e o comércio
destes recursos foram estimulados pelas necessidades de uma crescente população que
demanda cada vez mais das plantas medicinais para o cuidado de sua saúde e para seus cultos
e tradições religiosas; em especial pela facilidade de acesso, devido aos custos elevados da
medicina ocidental, aos efeitos colaterais provocados pelos fármacos sintéticos, além do
crescente interesse nacional e internacional pelo potencial terapêutico e econômico que
representam e a demanda de novos produtos pela indústria farmacêutica (HOLTEZ et al.,
2002).
A segurança deve ser o principal critério na escolha de um fitoterápico. Com
relação aos fitoterápicos, a seleção criteriosa, análises químicas, ensaios clínicos e medidads
regulatórias restritivas devem ser seguidos e respeitados (SILVEIRA et al., 2008). Ensaios
clínicos controlados devem confirmar se esses medicamentos são realmente seguros para uso
a curto, médio e longo prazo. Não é eticamente aceitável, nem moralmente justificável
prescrever fitoterápicos sem a evidência científica de sua qualidade, eficácia e segurança.
Portanto, a pesquisa clínica cientificamente conduzida é necessária para proporcionar
informações adicionais aos pacientes (VEIGAJÚNIOR; MELO, 2008; BENT, 2008).
2.3 O USO DE MEDICAMENTOS NA GESTAÇÃO
A gestação é uma condição fisiológica na qual o metabolismo materno pode ser

influenciado por xenobióticos, que de alguma forma podem afetar o sucesso da implantação,
desenvolvimento e crescimento do feto (DARUICH et al, 2001). Nesse período, os
mecanismos metabólicos de alguns órgãos os tornam mais susceptíveis a lesões, de forma que
a função materna normal é indispensável para o desenvolvimento adequado do feto. As
características do concepto e sua capacidade de desenvolvimento e maturação são expressões
da capacidade de fertilização de células germinativas, concepção bem-sucedida e o
subseqüente desenvolvimento intrauterino. O desenvolvimento peri e pós-natal depende do
41
potencial de desenvolvimento do indivíduo e de sua habilidade de enfrentar variadas

circunstâncias ambientais (MELLO; LANGELOH, 2006).
A cada ano, em torno de 10 a 20 novos compostos químicas são lançadas no mercado.
Embora estas drogas sejam testadas em animais, normalmente, há pouca ou nenhuma
experiência na gravidez humana. A ausência de quaisquer dados humanos aumenta o risco.
Os agentes químicos aos qual o concepto está exposto durante o período de desenvolvimento
representam um risco potencial para a ocorrência de toxidade. O risco pode variar ou não só
em função da natureza e concentração do agente. Esse fator é dependente da interação do
mesmo com outros fatores como espécie, estado nutricional, e especialmente, susceptibilidade
individual. O agente pode ser embriotóxico levando a alteração reversível, sem consequências
tardias ao indivíduo, ou teratogênico, levando a alteração irreversível, podendo ou não causar
consequências que limitem a sobrevivência do indivíduo (HARBIRSON, 1980).
Cerca de 2-4% dos recém-nascidos nascem com anomalias congênitas (OAKLEY,
1986). Essa incidência é independente do uso de drogas durante a gravidez, pois menos de 1%
de anomalias congênitas são atribuídas à exposição de medicamentos prescritos na gestação
(BECKMAN; BRENT, 1987). Destes 99% restantes, cerca de 9% deve-se às condições
maternas, tais como diabetes, infecções ou o abuso de álcool, e em torno de 20-25% pode ser
genético e 65% de origem desconhecida (HANSEN; HARRIS, 2013).
Atualmente, dentre as milhares de drogas terapêuticas disponíveis no mercado, apenas
20 fármacos ou grupos de droga são "universalmente reconhecidos como teratógenos
humanos" (SCHARDEIN, 2000). Destes, um total de onze estão incluídos em apenas dois
grupos de drogas, os agentes anticancerígenos e anticonvulsivantes. O misoprostol quando
utilizado em doses elevadas podem ser abortivos (PIZZOL; KNOP; MENGUE, 2006), e
talvez o agente antifúngico fluconazol (PURSLEY et al., 1996). Os achados mais comuns em
estudos teratológicos são morte embrião/feto (abortos), retardo do crescimento fetal, e um
aumento da incidência de aberrações menores em estrutura e variações na ossificação do
esqueleto, mas nenhum aumento de malformações estruturais (WEBESTER; FREEMAN,
2001).
Aborto recorrente é definido como aquela gravidez em que ocorre mais ou menos 3
três perdas consecutivas, e tem uma incidência de 1% a 3%. Em 50% dos casos, os as causas
podem ser identificadas, os 50% restantes, no entanto, não apresenta uma causa definida
(RAI; REGAN, 2006) embora estudos tenham apontado um papel de estresse oxidativo na
etiologia da perda gestacional recorrente (AGARWAL et al., 2008). O aborto espontâneo
42
menciona a rescisão não intencional de uma gravidez antes da viabilidade fetal de 20 semanas
de gestação ou quando o peso fetal form menor que 500 g. Isso ocorre em 8% a 20% das
gestantes. (GUPTA et al., 2007). A etiologia é constituída principalmente de anormalidades
cromossômicas, que representam cerca de 50% de todos os abortos. Com relação aos defeitos
congênitos causas genéticas parecem ser responsáveis por 15-20% destes, fatores ambientais
são reconhecidamente responsáveis por 7%, 20% são de etiologia multifatorial mas em mais
de 50% dos casos a causa permanece desconhecida (RAI; REGAN, 2006).
No início dos anos 60, mais de 10 mil crianças, no mundo, nasceram com defeitos
congênitos graves devido ao uso da talidomida no início da gravidez (KOREN et al., 1989). A
gravidade dos efeitos da talidomida e os sistemas de órgãos afetados foram dependentes do
dia exposição na gestação. Por exemplo, exposição à talidomida em dias de gestação 34-38
causada polidactilia e anotia, mas a exposição em dias de gestação 42-47 focomelia
produzidos dos membros inferiores (HANSEN; HARRIS, 2013). Estes resultados
demonstram a importância do tempo de exposição aos agentes teratogênicos. Por outro lado,
estudos epidemiológicos têm contribuído pouco, pois somente a carbamazepina (ROSA,
1991) e o ácido valpróico foram descobertos a partir de um registo de defeitos congênitos
(ROBERT; GUIBAUD, 1982). A maneira acidental que os teratógenos humanos têm sido
descobertos não expressa a certeza que todos os teratógenos já tenham sido identificados.
Berkovitch et al. (2000) relataram os efeitos fetais da metoclopramida, comumente usados no
primeiro trimestre da gravidez para tratar náuseas e vômitos. A indicação, a exemplo da
talidomida, também era para tratar os sintomas de náuseas, durante a gravidez.
A segurança da talidomida não tinha sido devidamente testada, e os testes posteriores
em roedores, em sua maioria, não conseguiu demonstrar o potencial da talidomida para causar
defeitos de nascimento (SCHARDEIN, 2000). O fabricante negou responsabilidade e diante
disso, a população, em geral, ainda desconfia, no que concerne, a segurança apresentadas
pelos fabricantes de produtos farmacêuticos, o que acaba envolvendo um certo ceticismo
sobre a importância dos testes dos medicamentos em animais.
Nos estudos em animais, os teratógenos não demonstram efeito da dose (BRENT,
1983). Assim, a dose e tempo exato de exposição, bem como a duração da exposição são
considerações importantes. Agentes teratogênicos com altas taxas de efeito podem ser
rapidamente detectados. A talidomida foi detectada somente após quatro anos no mercado e a
isotretinoína após um ano. Cerca de 40 anos depois, ainda não se sabia, exatamente, como a
talidomida causava defeitos ao nascimento (STEPHENS; FILLMORE, 2000) e por que os
43
roedores não eram afetados. Por isso que, atualmente, as nova drogas são testadas tanto na
prenhez de roedores como na prenhez de coelhos, para melhor identificar o potencial
teratogênico. No entanto, a adequação dos testes e seus usos para prever se a droga é ou não
teratógeno humano, ainda permanece controverso. Isso deve-se, principalmente as diferenças
genéticas (SCHÜLER-FACCINI et al., 2001).
Há numerosos exemplos de animais experimentais e vários casos suspeitos em seres
humanos que demonstram existir diferenças genéticas na resposta a um teratógeno. A
fenitoína, por exemplo, é um teratógeno humano bem conhecido. Entre 5% e 10% dos
embriões expostos este anticonvulsivante apresenta a síndrome da hidantoína fetal.
Entretanto, cerca de um terço dos embriões expostos tem somente algumas anomalias
congênitas, e mais da metade do genótipo do embrião não é afetada. Parece, portanto, que o
genótipo do embrião não é afetado e este determinará se um agente teratogênico pertubará ou
não o seu desenvolvimento (HANSEN; HARRIS, 2013).
Normalmente, os roedores são utilizados nestes estudos, entretanto, devido às
diferenças genéticas entre as espécies, alguns estudos não foram bem sucedidos na
identificação de teratógenos humanos. Por exemplo, os corticóides, potentes teratógenos em
roedores, são considerados seguros para o homem, por outro lado, a talidomida, um
teratógeno potente para o homem, é seguro para a maioria dos animais. Desta forma, a
evidência definitiva de uma droga ser ou não teratogênica para os humanos só pode ser
comprovada no próprio homem (SCHÜLER-FACCINI et al., 2001).
Para se provar que um agente é um teratógeno, é necessário demonstrar que, nas
gestações nas quais as mães foram expostas ao agente (abordagem prospectiva), a frequência
de anomalias é maior do que a porcentagem de casos espontâneos, ou que crianças
malformadas tenham um histórico de exposição materna ao agente maior do que as crianças
normais (abordagem retrospectiva). É difícil obter ambos os tipos de dados de uma forma não
preconcebida. Os relatos de casos não são convincentes, exceto quando tanto o agente quanto
o tipo de anomalia são tão raros que sua associação em vários casos pode ser considerada uma
não coincidência (WEBSTER; FREEMAN, 2001).
O uso de medicamentos prescristos ou não durante a gravidez é surpreendentemente
alto. A maioria das mulheres grávidas consome pelo menos um medicamento durante a
gravidez. Apesar de somente 7% a 10% das anomalias serem causadas por teratógenos
identificados, novos agentes continuam a ser identificados. Com relação aos medicamentos
utilizados na gestação, as tetraciclinas que cruzam a membrana placentária e se depositam nos
44
ossos e nos dentes do embrião nos locais de calcificação ativa. Pode causar defeitos dos
dentes, por exemplo hipoplasia do esmalte e diminuição do crescimento dos ossos longos.
Foram relatados mais de 30 casos de deficiência auditiva e de danos ao oitavo nervo craniano
em crianças expostas a derivados da estreptomicina no útero (MOORE; PERSAUD, 2008).
A penicilina tem sido amplamente utilizada durante a gravidez, parecendo não causar
danos ao embrião e ao feto. A warfarina é indubitalvemente um teratógeno. O período de
maior sensibilidade fica entre 6 e 12 semanas após fertilização. Já a heparina não cruza a
mambrana placentária, por isso é a droga preferencial para as mulheres grávidas que
necessitam de tratamento com anticoagulantes (MOORE; PERSAUD, 2008).
Aproximadamente uma a cada 200 mulheres grávidas são epilépticas e necessitam de
tratamento com anticonvulsivante. A fenitoína é indubitavelmente um teratógeno. A síndrome
da hidantoína fetal ocorre 5% a 10% das crianças nascidas de mães tratadas com
anticonvulsivantes fenitoína ou hidantoína. O ácido valpróico era a droga preferencial para o
tratamento de diferentes tipos de epilepsia; entretanto, seu uso por mulheres grávidas tem
levado a um padrão de anomalias composto por defeitos craniofaciais, do coração e dos
membros. Há, também, um aumento do risco de defeitos do tubo neural. O fenobarbital é
considerado uma droga antiepiléptica segura para ser usada durante a gravidez (MOORE;
PERSAUD, 2008).
Os compostos químicos inibidores de tumores são altamente teratogênicos, pois estes
agentes inibem a mitose nas células que se dividem rapidamente. É recomendado que sejam
evitados, especialmente nos três primeiroas meses de gravidez. A isotretionina, usada para o
tratamento da acne cística grave, é um teratógeno humano, mesmo em doses muito baixas. O
período crítico para a exposição parece ser da 3ª a 5ª semana. É alto o risco de aborto
espontâneo e de defeitos congênitos após exposição ao ácido retinóico. O acompanhamento
pós-natal de crianças expostas no útero à isotretionina revelou deficiências neuropsicológicas
significativas. A talidomida é totalmente contra-indicada para mulheres em idade fértil.
Atualmente, com cuidados apropriados, a talidomida é utilizada para o tratamento da
hanseníase e as outras doenças por causa de suas atividades imunossupressoras (MOORE;
PERSAUD, 2008).
Estudo conduzido, recentemente por Hansen e Harris, (2013) demonstrou que algunas
teratógenos humanos induzem efeitos deletérios através de mecanismos envolvendo a geração
de espécies reativas de oxigênio (EROS) e estresse oxidativo, entretanto, as definições
clássicas do estresse oxidativo não coincidem totalmente com os princípios fundamentais
45
básicos da teratologia. Esse artigo de revisão demonstra exemplos de teratógenos que

induzem EROS e lesão oxidativa, e descrevem os mecanismos teratogênicos relacionados ao
estresse oxidativo, fornecendo justificativa aos períodos de desenvolvimento da sensibilidade
e susceptibilidade das espécies. Outro atigo de revisão também buscou na literatura disponível
os papéis de espécies reativas e estresse oxidativo nos processos fisiológicos reprodutivos
normais e anormais. No entanto, as investigações realizadas em animais ou em estudos in
vitro produziram resultados muito divergentes (AGARWAL et al., 2012).
Deve-se ressaltar que o uso de medicamentos na gestação, envolve uma
responsabilidade coletiva entre o médico (prescritor), o laboratório farmacêutico (fabricante),
os órgãos reguladores e, inclusive, a mulher gestante. Por exemplo, uma mulher, que durante
a gestação continua usando inibidores da ECA (enzima conversora de angiotensina) no
tratamento da hipertensão durante o segundo e terceiro trimestresa. Se ela engravidou, durante
o pré-natal, ela precisará mudar para um anti-hipertensivo não fetotóxicos antes do segundo
trimestre (CLAYTON, 1994). Para os medicamentos com suspeita de toxicidade conhecida na
gravidez, é de responsabilidade das empresas farmacêuticas, previsto em lei, informar, para
que os médicos possam avaliar o risco/benefício e informar ao paciente. “O medicamento só
deve ser usado durante a gravidez se os benefícios superam os riscos." Por exemplo, a malária
por ser uma doença letal, deve ser tratada durante a gravidez independente do potencial
teratogênico do medicamento (CLARK et al., 2004).
Bendectin foi retirado do mercado em 1983 com a empresa enfrentando mais de 300
ações judiciais que reivindicam os potenciais defeitos de nascimento 900 mil defeitos de
nascimento (BRENT, 1983; BRENT, 1995). Inibidores da ECA são os únicos teratógenos
humanos que parece exercer seu efeito apenas no segundo e terceiro trimestres, quando eles
afetam a função do rim fetal. Na verdade, inibidores da ECA não são realmente teratogênicos,
mas são fetotóxicos com efeitos farmacológicos conhecidos (hipotensão), causando danos
renais no feto. Existem medicamentos, que se tomados durante o primeiro trimestre, são tão
propensos a causar desenvolvimento anormal que o aborto torna-se a opção preferida
(WEBSTER; FREEMAN, 2001). A talidomida e isotretinoína são, provavelmente, os
teratógenos humano mais perigoso, afetando pelo menos 30% dos embriões expostos durante
o período suscetível; fármacos citotóxicos também podem afetar uma elevada proporção de
embriões. Para outros teratógenos humano, o risco é muito mais baixo, aumentando a taxa
normal de defeitos congênitos de 2-4% para 4-9% (WEBSTER; FREEMAN, 2001).
46
No entanto, nas bulas de medicamentos observa-se, frequente, o conflito entre

informações das bulas dos medicamentos e evidências científicas sobre o uso dos mesmos
durante a gestação e, também, no aleitamento (ANDERSON et al., 2003). Os medicamentos
oriundos de plantas são amplamente utilizados pela população mundial e possuem uma
extensa história no emprego à prevenção e tratamento de doenças, desde antes de Cristo
(OUEDRAOGO et al., 2012). Considerando que gestantes e lactantes constituem um grupo
populacional que culturalmente recorre ao uso de plantas medicinais, riscos para a gestante e
para o feto têm tornado constante a preocupação com o uso de fitoterápicos, não apenas no
período periconcepcional, mas durante toda a gravidez.
Nas últimas décadas observou-se a revalorização do emprego de preparações
fitoterápicas. Assim, alguns grupos farmacêuticos passaram a desenvolver esforços voltados
para o aprimoramento de medicamentos fitoterápicos e sua produção em escala industrial. O
novo avanço desses medicamentos, longe de ser volta ao passado, caracteriza-se pela busca de
produção em escala industrial, diferentemente das formas artesanais que caracterizavam os
estágios iniciais de sua utilização (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). A Organização
Mundial de Saúde (OMS) reconhece a importância do uso tradicional, mas para a utilização
de uma planta com finalidade terapêutica, em nível de saúde pública, é fundamental o
estabelecimento de sua segurança, eficácia e garantia de qualidade das preparações (RATES,
2001; WHO, 2002; LAPA et al., 2010).
A utilização dos produtos naturais e preparações fitoterápicas por gestantes, também,
podem gerar riscos a saúde, com graves conseqüências, tanto para a mãe como para o feto
(HANCOCK et al, 2008). Desta forma, embora raros, os estudos não clínicos de toxicologia
reprodutiva são importantes, devendo-se utilizar os mesmos cuidados, tanto para
medicamentos alopáticos como para fitoterápicos (WU et al., 2008). O período de gestação é
uma das fases mais sensíveis do ciclo reprodutivo e que resulta em repostas importantes.
Hoje, sabe-se que, nesse período, a maioria dos agentes atravessa facilmente a placenta e,
dessa maneira, pode-se considerar que a exposição materna a agentes externos, entre esses os
agentes químicos (xenobióticos), podem resultar em efeitos importantes sobre um organismo
passivo, alvo secundário desses agentes, que é o organismo embriofetal (DAMASCENO et
al., 2008).
Na utilização de qualquer medicamento durante a gestação, deve sempre ser levado
em conta a relação risco-benefício. Esse mesmo cuidado deve ser aplicado ao uso de plantas
medicinais. Assim, para cada situação específica, deve ser estabelecida uma relação risco-
47
benefício própria. Se para muitos medicamentos as informações disponíveis são escassas,

para as plantas medicinais essa escassez de dados é ainda mais acentuada. Na presença de
alguma informação que sugira risco para a gestação, medicamentos ou mesmo plantas
medicinais devem ser evitadas, até que evidências garantam seu uso seguro (MENGUE;
MENTZ; SCHENKEI, 2001).
Mengue et al., (2001) fizeram um levantamento na literatura sobre plantas com relatos
de ação abortiva ou com suspeita de qualquer outro risco para a gestação. Foram encontrados
relatos sobre Boldo (Coleus barbatus), Poejo (Cunila platyphylla), comigo-ninguém-pode
(Dieffenbachia picta), feto-macho (Dryopteris filix-mas), algodoeiro (Gossypium
barbadense), carapanauba (Himatanthus drasticus), agoniada (Himatanthus lancifolius), louro
(Laurus nobilis), bucha, bucha-do-norte, bucha-paulista, buchinha (Luffa operculata), melão-
de-são-caetano (Momordica charantia), pariparoba (Potomorphe umbellata), arruda (Ruta
graveolens), catinga-de-mulata (Tanacetum vulgare).
O levantamento de dados, divulgação das informações e estudos de toxidade ssão
ferramentas importantes para apresentar a população e diminuir, pelo menos em parte, a
crença que produtos naturais são desprovidos de efeitos tóxicos ou adversos (LAPA, 2001;
MARLIÉRE et. al., 2008; SILVEIRA et al., 2008; CUNHA et al., 2009; LAPA, 2010). Testes
realizados em roedores detectaram efeito carcinogênico e hepatotóxico dos vegetais ricos em
cumaria (LACY; O’KENNEDY, 2004). Com efeito, a escassez de dados sobre avaliação de
toxicidade reforça a necessidade de estudos dessa natureza que trazem grande contribuição
para utilização segura dos fitoterápicos pela população humana, além de detectar diferenças
significativas no pefil farmacocinético e farmacológico/tóxico, bem como os efeitos
sinérgicos/aditivos (WEBSTER; FREEMAN, 2001; OUEDRAOGO, 2012; WILLS et al.,
2012).
Em complemento aos estudos de toxicidade em animais, estudos epidemiológicos e
laboratoriais têm demonstrado que produtos vegetais podem exercer efeitos tóxicos pela
produção de metabólitos secundários, causando desde resistência vascular até
teratogenicidade em embriões de roedores (LATHER, 2011; OUEDRAOGO, 2012).
2.3.1 Embriologia humana e comparada
Segundo Almeida et al. (2000), fecundidade é a capacidade para a reprodução, ao

passo que fertilidade refere-se à concretização da reprodução, que pode ser avaliada pelo
48
produto final (número de indivíduos). Na mulher, a duração máxima da fertilidade é de varia

de 24 a 48 horas e a motilidade dos espermatozoides, após o coito, dura de 48 a 60 horas.
Enquanto isso, na rata a duração máxima da fertilidade é de 14 horas e a da motilidade de 17
horas. Na camundonga, a duração máxima da fertilidade é estimada em cerca de 6 horas e a
da motilidade em 13 horas. Tais dados demonstram o quanto é variável a duração da
fertilidade e da motilidade nas vias genitais das fêmeas das diferentes espécies (ALMEIDA,
2009).
A função reprodutora feminina pode ser dividida em duas fases principais: primeira, a
preparação do corpo feminino para a concepção e gestação; segunda, o período da própria
gestação (GOPINATH, 2013). A capacidade reprodutiva de uma fêmea envolve aspectos
variados de fisiologia reprodutiva, tal com, produção hormonal equilibrada, capacidade de
produção de gametas adequados, produção hormonal equilibrada, alterações morfológicas e
bioquímicas do oviduto e do útero, compatíveis com os processos de transporte
(espermatozóides e zigoto) e fases (precoces e tardias) do desenvolvimento do concepto
(GUERRA, 2002). Já o sucesso da gestação em mamíferos depende da manutenção de níveis
adequados de duas classes de hormônios esteróides sexuais, os progestogênios e os
estrogênios. As gestações em ratos e seres humanos exibem certas similaridades que não são
compartilhadas por todas as espécies de mamíferos. O intervalo entre o coito e a implantação
do blastocisto no útero tem duração similar, de quatro a seis dias, embora a gestação para o
primeiro seja de aproximadamente 22 dias, e para os seres humanos seja de aproximadamente
270 dias (ALMEIDA, 2009).
O útero humano apresenta um estreitamento inferior, o colo uterino ou cérvix, que se
abre na vagina. A única barreira física entre a vagina e o útero é um rolhão de muco cervical.
A abertura vaginal localiza-se posteriormente à abertura uretral (GOPINATH, 2013). O útero
nos roedores é um órgão em forma de Y. Ele consiste num par de alongados cornos uterinos
independentes entre si. Caudalmente, esses cornos são rodeados por musculatura, formando
um pequeno corpo uterino e logo abaixo deste corpo, encontra-se a cervix uterina (WALKER;
HOMBERGER, 1997). Os ovários constituem-se de uma massa sólida de células e tecidos,
dividindo-se em medula (no centro do ovário, e constituído de tecido conjuntivo altamente
vascularizado) e córtex (constituído por tecido conjuntivo denso e folículos, que envolvem os
oócitos) (GOPINATH, 2013).
Na mulher, logo após a ovulação, o folículo ovariano sofre colapso. Sob a influência
do LH, as paredes do folículo se desenvolvem em uma estrutura glandular, o corpo lúteo, que
49
secreta progesterona e alguma quantidade de estrogênio (STOUFFER, 2006). Se o ovócito é

fecundado, o corpo lúteo aumenta de tamanho e forma o corpo lúteo gravídico, aumentando
sua produção hormonal. A degeneração do corpo lúteo é impedida pela gonadotrofina
cariônica humana (hCG). No entanto, se o ovócito não é fecundado, o corpo lúteo involui e
degenera cerca de 10 a 12 dias após a ovulação, quando é chamado de corpo lúteo da
menstruação. Posteriormente o corpo lúteo é transformado em uma cicatriz branca no ovário,
formando o corpo albicans (corpo lúteo degenerado) (MOORE; PERSAUD, 2008).
Na mulher as variações cíclicas na secreção de gonadotrofinas estão na base das
transformações que ocorrem no ovário durante um ciclo mensal (ciclo menstrual). O ciclo
ovárico faz-se acompanhar de variações cíclicas na secreção de estradiol e progesterona que,
interactuando com o hipotálamo e hipófise, regulam a secreção de gonadotrofinas
(STOUFFER, 2006). A duração de um ciclo menstrual típico é de 28 dias, podendo variar
entre os 21 e os 35 dias. Já as fêmeas são animais poliéstricos, e o ciclo reprodutivo tem a
duração de cerca de 4 a 5 dias, e entre 4 a 12 oócitos são ovulados por ciclo (WALKER;
HOMBERGER, 1997).
O período gestacional varia nas diferentes espécies. Na mulher o período gestacional é
estimado em 9 meses ou 10 meses lunares, tendo início a fecundação e formação do zigoto e
término com o parto. A esse período é chamado de gravidez na mulher e de prenhez nos
animais. Embora os termos sejam sinônimos, no caso humano o primeiro se aplica com mais
propriedade. Assim, destaca-se o tempo de prenhez de alguns mamíferos utilizados em
estudos experimentais, roedores (camundonga – 19 a 21 dias; rata – 21 a 23 dias) e não roedor
(coelha – 30 a 32 dias) (ALMEIDA, 2009).
O desenvolvimento de mamíferos pode ser dividido em quatro fases: (1) período do
ovo. Inicia-se na fecundação e vai até à implantação, ocorrendo antes da segunda semana de
desenvolvimento em humanos e até o 6º dia em ratos (2) período embrionário, é o período
de pico em relação à divisão celular, diferenciação e morfogênese do embrião (período
principal de organogênese), com ínício da segunda à oitava semana pós-fecundação em
mulheres e 15º dia em ratas, (3) período fetal, correponde ao período em que o feto está
completamente formado, porém ainda há diferenciação do sistema nervoso central (SNC),
bem como crescimento ponderal do feto,compreende oito semanas completas pós-fertilização
até o término em mulheres e em ratas correponde do 16ª ao término, aproximadamente 23º
dias e por fim, o (4) neonatal, que ocorre apenas crescimento e maturação fisiológica. Vai do
até o 28º após o nascimento em humanos e até o 10º dia em ratos.
50
No contexto da biologia do desenvolvimento, é importante a compreensão dos

processos, detalhadamente, tanto em humanos como nos roedores. Na espécie humana, o sítio
de fecundação, normalmente, é a ampola da tuba uterina. Se o ovócito não for fecundado
neste local, ele passará lentamente pela tuba uterina em direção à cavidade do útero, aonde irá
se degenerar. Se houver fecundação (união de um espermatozóide e um ovócito), uma
complexa sequência de eventos moleculares, coordenados, ocorrem e termina com a mistura
dos cromossomos maternos e paternos na metáfase da primeira divisão mitótica do zigoto
(célula totipotente altamente especializada) (MOORE; PERSAUD, 2008).
O processo de divião mitótica que ocorre no zigoto denomina-se clivagem ou
segmentação (cerca de 30 horas após a fecundação). Dele resultam, inicialmente, duas células
filhas chamadas blastômeros. Continuando a clivagem, de duas células inicias originam-se
quatro. Após o estágio de oito células, os blastômeros mudam sua forma e se agrupam
firmemente uns com os outros, formando uma bola compacta e passa a ser chamado de
mórula (12 a 32 blastômeros) (MOORE; PERSAUD, 2008; ALMEIDA, 2009). Cerca de
quatro dias após a fecundação a mórula alcança o útero e após esse estágio, o concepto passa
a ser chamado de blastocisto. Cerca de seis dias após a fecundação, o blastocisto adere ao
epitélio endometrial.
No fim da primeira semana, o blastocisto está superficialmente implantado na camada
compacta do endométrio e obtém sua nutrição dos tecidos maternos. Após a liberação de
enzimas proteolíticas que erodem o tecido conjuntivo do endométrio, ocorre a implantação do
blastocisto dentro do endométrio, que se completa durante a segunda semana do
desenvolvimento embrionário (MOORE; PERSAUD, 2008). No rato, camundongo, e macaco,
o período de implantação compreende a primeira semana de prenhez (ALMEIDA, 2009). A
formação da placenta em humanos inicia-se no finl da primeira semana do desenvolvimento,
com a nidação. A placenta discoidal é o tipo encontrado nos primatas e nos roedores
(ALMEIDA, 2009).
Após, segue a gastrulação, processo formativo pelo qual o disco embrionário
bilaminar é convertido em um disco embrionário trilaminar. Esse processo é o início da
morfogênese (desenvolvimento da forma e estrutura de vários órgão e partes do corpo), que se
inicia com a formação da linha primitiva. Cada uma com três camadas germinativas
(ectoderma, mesoderma e endoderma) do disco embrionário dá origem a tecidos e ógãos
específicos: O ectoderma dá origem à epiderme, ao sistema nervoso, à retina e a muitas outras
estruturas e endoderma é a fonte de revestimentos epiteliais das vias respiratórias e do trato
51
gastrointestinal. Das células glandulares originam órgãos associados, tais como o fígado e o
pâncreas. Já o mesoderma, este, dá origem ao revestimento do músculo liso, aos tecidos
conjuntivos e aos vasos associados a tecidos e órgãos. Forma a maior parte do sistema
cardiovascular e dá origem às células sanguíneas e à medula óssea, aos ossos, aos músculos
estriados e a órgãos do sistema reprodutor e secretor (MOORE; PERSAUD, 2008).
O desenvolvimento embrionário é, essencialmente, um processo de crescimento e de
aumento crescente da complexidade estrutural e funcional. No final do período
organogenético, os principais sistemas de órgãos já começam a se desenvolver e todas as
principais estruturas internas e externas se estabelecem da quarta à oitava semana em
humanos e do 5º ao 15º dia de prenhez nas ratas. Esse período é marcado por uma série de
processos, definidos seqüencialmente, que vai desde a proliferação (reprodução somática das
células), a diferenciação e migração celular até a organogênese propriamente dita. É o período
de formação de órgãos rudimentares e a exposição a teratógenos durante esse período pode
causar grandes anomalias congênitas (MOORE; PERSAUD, 2008) (Figura 1).
No fim da oitava semana, o embrião apresenta características nitidamente humanas,
entretanto, a cabeça ainda é desproporcionalmente grande, constituindo quase a metade do
embrião. As pálpebras estão se fechando e, no fim da oitava semana, começam a uni-se em
fusão epitelial. Os pavilhões auriculares começam a assumir sua forma final, mas ainda
representa implantação baixa. O período fetal, que se estende da nona semana até o
nascimento, é caracterizado pelo crescimento e desenvolvimento das estruturas. Na rata se
estabelece do 16º dia de prenhez até o nascimento. Nos humanos, o sexo é claramente
distinguível na 12ª semana e os fetos são viáveis 22 semanas após a fecundação, mas suas
chances de sobrevivência não são boas até varias semanas mais tarde.
Para extrapolar efeitos do rato para o ser humano, é necessário usar as informações
disponíveis na literatura para reconhecer as semelhanças e também as diferenças da função
endócrina e reprodutiva entre mamíferos (GRAY et al., 2004). Durante a gestação, há
mudanças no sistema neuroendócrino com o intuito de se manter a saúde da mãe e de fornecer
condições ideais para o desenvolvimento fetal. Para que a gestação seja bem-sucedida, é
necessário que uma complexa seqüência de eventos adaptativos e mudanças hormonais, sejam
bem coordenadas (NOGUEIRA; LIBERMAN, 2002).
Os teratógenos só parecem ser capazes de causar anomalias após o início da
diferenciação celular; entretanto, suas ações iniciais podem causar morte do embrião, por
exemplo, durante as duas primeiras semanas do desenvolvimento. Ainda são obscuros os
52
mecanismos exatos pelos quais drogas, compostos químicos e outros fatores ambientais
perturbam o desenvolvimento do embrião e induzem anormalidades (WEBSTER; FREEMN,
2001). É errôneo presumir que as anomalias sempre resultam de um único evento ocorrido
durante o período crítico, ou que, usando tabelas, seja possível determinar o dia no qual a
anomalia foi produzida. Tudo o que se pode afirmar é que a perturbação do desenvolvimento
pelo teratógeno tem que ocorrer antes do término do período crítico do tecido, parte ou órgão
envolvido.
Ao considerar a possível teratogenicidade de um agente, como uma droga ou um
composto químico, três princípios importantes devem ser considerados: (1) os períodos
críticos do desenvolvimento humano, (2) a dosagem da droga ou composto químico e (3) o
genótipo (constituição genética) do embião (MOORE; PERSAUD, 2008).
53
Figura 1. Representação esquemática dos períodos críticos do desenvolvimento nos três períodos (implantação, embrionário e fetal).
Fonte: Retirado de Moore e Persaud (2008).
54
2.3.2 Toxicologia reprodutiva e legislação
Durante algum tempo, acreditou-se que o útero era intransponível a agentes externos e
que a placenta constituía-se em uma verdadeira barreira entre os organismos materno e fetal.
O conceito de “barreira placentária” foi abalado no início dos anos 60, pela “Tragédia da
Talidomida”, um medicamento comercializado como sedativo moderado, usado para diminuir
náuseas em mulheres grávidas. Defeitos significativos nos fetos foram causados com a
ingestão de uma única dose durante a gestação (SMITHELLS; NEWMAN, 1992).
Anomalias congênitas, defeitos ao nascimento e malfarmações congênitas são termos
usados frequentemente para descrever perturbações do desenvolvimento presentes no
nascimento. Defeitos ao nascimento é a principal cauda de mortalidade infantil e podem ser
estruturais, funcionais, metabólicas, comportamentais ou hereditárias. Uma anomalia
congênita é uma anomalia estrutural de qualquer tipo; entretanto, nem todas as variações são
anomalias. Variações anatômicas são comuns e a anomalias congênitas são classificadas em
quatro tipos: malformações, dirupção, deformação e displasia (MOORE; PERSAUD, 2008).
Essas anomalias podem ser resultantes de fatores genéticos ou ambientais, podendo ser
também, pela combinação destes dois fatores, apresentando uma etiologia multifatorial.
Podem existir dois fatores genéticos: o gênico, envolvendo a herança dos genes que causam a
anomalia e o cromossômico, abordando as aberrações cromossômicas representadas pelo
número anormal de cromossomos. Entre os fatores ambientais existem os agentes infecciosos,
como por exemplo, o vírus da rubéola, citomegalovírus e o parasita Toxoplasma gondii; os
agentes químicos, envolvendo fármacos, por exemplo, talidomida, ácido retinóico, álcool e
ácido valpróico; e os agentes físicos, como raios-X e radiação atômica (FAVERO, 2006).
O interesse pelas malformações congênitas data tempos históricos, desde a antiga da
civilização. Naquele tempo, a explicação para tal fato seria que estas “teras”, designados de
monstros, estavam relacionadas a um evento mitológico ou, principalmente, à punição dos
pecados (GILDEN; BODEWITZ, 1991). No entanto, as malformações nunca despertaram
interesse pela comunidade científica, pois os cientistas se detinham, praticamente, à
incidência de malformações em condições de laboratório e, só esporadicamente, estas
alterações eram associadas às situações cotidianas, por exemplo, com a exposição ao vírus da
rubéola e à radiação. Foi o desastre da talidomida que alterou o curso dessas pesquisas e,
desde então são muitos os laboratórios e pesquisadores mobilizados no estudo destes efeitos
tóxicos (ROGERS; KAVLOCK, 2001).
55
Toxicologia reprodutiva é um termo é recente, uma área do conhecimento

relativamente nova, que tem suas raízes fortemente relacionadas à teratologia. É uma das
áreas mais complexas da toxicologia preditiva. A complexidade se deve, em parte, à própria
natureza e duração do processo reprodutivo. Entende-se por reprodução o processo biológico
que assegura a continuidade das espécies, possibilitando que o material genético existente seja
passado às gerações seguintes. Portanto, o ciclo reprodutivo não consiste apenas na
concepção, gravidez e nascimento, mas tem início com a produção de gametas nos pais (ainda
no período pré-natal do organismo parenteral), seguindo pela fertilização e desenvolvimento
embriofetal, nascimento e desenvolvimento pós-natal até a maturidade sexual, quando o
descendente adulto torna-se capaz de procriar (MOORE; PERSAUD, 2008).
A toxicologia reprodutiva avalia os efeitos toxicológicos de determinadas substâncias
sobre a prole. Por exemplo, busca identificar se um medicamento, utilizado por mulheres
gestantes, poderá causar danos à saúde da mãe ou do feto. A Food and Drugs Administration
(FDA) preconiza a realização de testes de toxidade reprodutiva para avaliar os efeitos de uma
substância química sobre o processo de reprodução dos mamíferos. Esses ensaios, geralmente,
compreendem a exposição de animais sexualmente maduros antes da concepção, durante o
desenvolvimento pré-natal e após o nascimento e, continuadamente até sua maturação sexual,
dependendo do protocolo experimental.
Os estudos nesta área incluem malformações estruturais, retardo no crescimento, dano
no desenvolvimento e a morte do organismo, se preocupa também, com o estudo da cinética,
mecanismo de ação tóxica, patogênese e as conseqüências da exposição aos agentes tóxicos
ou condições que levem ao desenvolvimento anormal do animal (ROGERS; KAVLOCK,
2001). O processo de caracterização de muitos dos mecanismos de teratogênese incluem
mutação, aberração cromossomal, interferência na mitose, alteração da integridade e da
função do ácido nucleico, falta de precursores do metabolismo, alterações do metabolismo
intermediário, inibição enzimática, alteração do equilíbrio osmolar e mudanças nas
características das membranas (BRENT; BECKMAN, 1990).
A toxicologia reprodutiva se subdivide em toxicologia pré e pós-natal (PETERS,
1998). Desta forma os estudos nessa área têm que ser igualmente abrangentes para que se
possam detectar diferentes tipos de agravos nas diferentes fases do ciclo reprodutivo. No
Brasil, a RE nº 90 da ANVISA, de 16 de março de 2004, regulamentou os testes não clínicos,
inclusive o de toxidade reprodutiva (BRASIL, 2004; BRASIL, 2013). Em 31 de janeiro de
2013 foi publicado um novo guia, “Guia para a condução de estudos não clínicos de
56
toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos”, que

trata dos ensaios a serem realizados, tais como toxidade de longo prazo (carcinogenicidade),
efeitos na reprodução e prole em duas gerações sucessivas (teratogênese, neurotoxidade
tardia, entre outros). Esse guia estipula que os testes de toxidade para avaliação de risco de
um novo medicamento sejam realizados em no mínimo duas espécies mamíferos, sendo uma
delas não-roedora (BRASIL, 2013). Os estudos em reprodução são considerados de longo
prazo e em geral, a positividade de um destes testes, em qualquer espécie, exclui a utilização
do produto na espécie humana, durante a gravidez (LAPA et al., 2010).
Os estudos de toxidade reprodutiva consistem em ensaios realizados em animais,
objetivando verificar o potencial de um xenobiótico provocar efeitos adversos sobre o
processo reprodutivo, incluindo a fertilidade, o desenvolvimento embriofetal,
desenvolvimento pós-natal dos descendentes até a maturidade sexual. Desta forma os estudos
de toxidade reprodutiva têm que ser igualmente abrangentes para que se possam detectar
diferentes tipos de agravos nas diferentes fases do ciclo reprodutivo (ROGERS;
KALVLOCK, 2001).
A gestação em mamíferos pode ser dividida em três períodos: pré-implantação,
organogênese e fetal (FRITZ; GIESE, 1990). A fase de pré-implantação compreende o
período que vai desde a fecundação até a implantação do blastocisto no útero, na espécie
humana, esse período vai até o 17º dia pós-fecundação, enquanto que em ratos e
camundongos, até o 6º dia (FRITZ; GIESE, 1990). Esta fase é caracterizada pela presença de
células totipotentes em divisão e a exposição a um agente tóxico pode impedir a implantação
do blastocisto no útero (ROGERS; KALVLOCK, 2001). A redução do número de células no
embrião, durante essa fase, pode induzir retardo na formação do blastocisto (KOLA; FOLB,
1986) e, conseqüentemente, aumento nas perdas pré e pós-implantação (LEMÔNICA et al.,
1996). Segundo Almeida e Lemônica (2000), a taxa de perda pré-implantação é a correlação
entre o número de ovos liberados e aqueles que, depois de fecundados, conseguiram ser
implantados no útero. Já a perda pós-implantação refere-se à relação entre o número de
blastocistos implantados e aqueles que não conseguiram se desenvolver. Ao blastocisto
implantado, que não conseguiu se desenvolver dá-se o nome de “reabsorção” e isso indica
falha no desenvolvimento do embrião.
Após a implantação, inicia-se a fase de organogênese, que na espécie humana vai do
18º ao 57º dia de gestação, e no rato, do 7º ao 14º. Esse período é caracterizado por uma
intensa proliferação e migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das
57
estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade, à ação de agentes teratogênicos e

embriofetotóxicos, no qual o maior número de malformações pode ser induzido, sendo
considerado o período teratogênico clássico (BRENT, 1993). Após esta fase, dá-se início a
terceira fase, conhecida como fase fetal, caracterizada por diferenciação e crescimento
tissular, maturação fisiológica dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto.
Compreende o período que vai do 57º dia pós-fertilização até o término em humanos, e do 16º
ao 21º em ratos (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Nesse período, a
sensibilidade frente a malformações anatômicas é extremamente baixa, porém a exposição a
agentes químicos pode produzir morte celular e inibição da divisão celular. Essas alterações
podem interferir com a formação dos sistemas nervoso, endócrino e imunológico,
promovendo desordens funcionais e de comportamento (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS;
KALVLOCK, 2001).
O guia da ANVISA (BRASIL, 2013) foi criado baseando-se em documentos de
agências reconhecidas pela vigilância sanitária de medicamentos (FDA, EMEA), instituições
de Harmonização (ICH, OECD) e de interesse na área (NCI, WHO), visando a orientação de
empresas/pesquisadores sobre como realizar estudos não clínicos de segurança, durante o
desenvolvimento de medicamentos. A EMA (European Medicines Agency) e a FDA
apresentam notória experiência internacional na área de regulação e vigilância sanitária de
medicamentos, sendo o FDA o órgão responsável pelo controle de alimentos e drogas no
território americano e a A EMA responsável pela proteção e promoção da saúde pública e
animal na União Européia. A seleção das instituições de harmonização deve-se ao fato de
seus guias serem reconhecidos, introduzidos e referenciados por agências reguladoras de
vários países (como Canadá, Austrália, Estados Unidos, União Européia). A ICH
(International Conference on Harmonisation), que é umas conferências de harmonização
agências reguladoras e indústrias dos Estados Unidos, Europa e Japão, discutem cientifica e
tecnicamente procedimentos necessários à avaliação da segurança, qualidade e eficácia dos
medicamentos. A OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) é um
grupo composto por trinta países membros que produz acordos, decisões e recomendações
internacionais em áreas onde acordos multilaterais são necessários para que países, na esfera
individual, possam contribuir para a progressão da economia globalizada.
Os estudos mais utilizados para essas avaliações são divididos em três segmentos e são
adaptados de normas da US EPA (Environmental Protection Agency) e recomendados pela
FDA e OECD (Figura 2).
58
Figura 2. Esquema geral. Segmentos I, II e III dos estudos de toxicologia reprodutiva.
O segmento I refere-se à toxidade crônica, avaliando os efeitos sobre a fertilidade de

machos e fêmeas, sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as fêmeas
durante a gestação e lactação; o segmento II avalia a teratogenicidade, como possíveis
alterações no desenvolvimento da progênie exposta durante a fase de organogênese; segmento
III, de toxidade peri e pós-natal, avalia efeitos sobre o desenvolvimentos pré e pós-natal de
progênies expostas durante as fases de desenvolvimento fetal e lactação.
Os testes de avaliação da toxidade reprodutiva, geralmente, compreendem a exposição
de animais sexualmente maduros antes da concepção, durante o desenvolvimento pré-natal e
após o nascimento e, continuadamente até sua maturação sexual (LEMÔNICA, 2001). Os
estudos podem avaliar uma ou mais gerações, dependendo da carasterística química do agente
(OECD, 2001; BRASIL, 2013).
Os sinais clínicos, evidentes, de toxidade materna, resultante da morte ou redução no
ganho de peso corporal também são avaliados (CALLIARI-MARTIN, 1998). A avaliação
ponderal da gestante é um dos parâmetros mais relevante, isso porque, avalia de modo
indireto o grau de comprometimento materno e fetal. Segundo Lyra et al. (2005) a perda de
massa corporal é um dos principais indicadores de toxidade materna, pois o ganho de peso
insuficiente pode acarretar a restrição de crescimento intra-uterino (SCHWAREZ et al.,
59
1996). Com relação à escolha da dose, alguns critérios deverão ser seguidos: utiliza-se uma
dose que produza efeitos tóxicos, outra em que os animais não manifestem qualquer alteração
de toxidade e outra, intermediária entre estas. A substância a ser testada deverá ser
administrada, no mínimo, da implantação à cesariana. Um dia antes do parto, as fêmeas são
submetidas à cesariana, avaliando-se o número de corpos lúteos, nº de implantações, com
fetos e placentas pesados e, a seguir, metade da prole utilizada para avaliação esquelética e a
outra metade para pesquisa de anomalias viscerais (OECD, 1996; US EPA, 1996; OECD,
2001).
A avaliação da performance reprodutiva materna é um dos principais parâmetros
utilizados nos protocolos convencionais de avaliação de toxidade do desenvolvimento. Esta
avaliação permite verificar com maior precisão e profundidade, se a subatância avaliada e o
seu principal metabólito produz efeitos tóxicos, não só diretamente no organismo fetal, mas
também na fisiologia reprodutiva da fêmea, o que poderia levar aos efeitos tóxicos no feto
(US EPA, 1996). A maior limitação de muitos protocolos de avaliação de toxidade é que não
há exame de filhotes, em nenhuma fase pós-natal, o que, na maioria das vezes, poderá levar a
erros no julgamento sobre o efeito teratogênico da substância testada (CLAUDIO et al. 1999).
Por exemplo, algumas substâncias podem causar aumento de morte pós-natal, depois
de algumas semanas de nascimento, podendo produzir outro efeitos, que serão visualizados
somente após o nascimente, como a catarata, por exemplo, que se manifesta somente após o
21º dia de vida (NAROTSKY; KAVLOCK, 1995). Além disso, há outra crítica relevante aos
protocolos de avaliação de toxidade do desenvolvimento, refere-se à carência de dados
toxicocinéticos, antes de se realizar estes testes, ficando bastante subjetiva a escolha das três
doses do xenobiótico a ser avaliado, bem como do comportamento cinético da substância em
estudo (CLAUDIO et al. 1999).
Por outro lado, segundo os dados da REACH (Registration, Evaluation, and
Authorization of Chemicals) da União Européia, estima-se que 54% dos custos dos
medicamentos são utilizados em ensaios de toxicidade reprodutiva e do desenvolvimento
(PIERSMA, 2006). Os maiores custos estão associados com ensaios de duas gerações em
ratos, que custa na faixa de 500 a 750 mil dólares. Os ensaios que envolvem apenas
toxicidade do desenvolvimento são relativamente mais baratos, em cerca de um décimo do
custo, que os estudos que envolvem duas gerações (SCIALLI, 2008). O cumprimento dos
requisitos dos testes com animal poderia resultar no uso de quase 22 milhões de animais
vertebrados para o registo de produtos químicos existentes e um custo de até várias centenas
60
mil dólares por substância registada. Os gastos e o uso de animais poderiam ser reduzido pelo
uso de testes in vitro, modelos quantitativos da relação estrutura- atividade, e agrupamento
substâncias de relacionados. No entanto, embora a REACH incentive, intensamente, os
métodos que evitem os testes em animal vertebrado os testes in vitro ou análise quantitativa
da relação estrutura-atividade não são capazes de substituir a toxidade reprodutiva e do
desenvolvimento do animal (SCIALLI, 2008).
Enquanto novas informações surgem sobre a origem das desordens do
desenvolvimento, resultante da exposição perinatal de substâncias químicas, há uma grande
preocupação relativa à adequação dos protocolos existentes ao aferir os potenciais riscos da
exposição às diversas substâncias químicas, durante o desenvolvimento. Embora existam
pequenas variações nos protocolos de avaliação de risco de toxicologia pré-natal, entre as
agências de regulamentação, de maneira geral, estas requerem, para o teste, um grupo de
animais controle, e no mínimo, outros três, nos quais receberão as diferentes doses da
substância química a ser avaliada (US EPA, 1996; OECD, 2001; BRASIL, 2013).
O leite materno é uma mistura complexa cuja composição é dependente das
atividades de secreção da glândula mamária e dos processos de transporte nela existente,
refletindo as necessidades nutricionais dos neonatos mamíferos (MCMANAMAN;
NEVILLE, 2003). No entanto, o leite pode também ser uma via de excreção materna de
substâncias tóxicas (BEGG et al., 2002). De fato, diversas substâncias químicas são capazes
de serem transferidas pelo leite, representando uma importante fonte de intoxicação do
neonato. Como exemplos, estão algumas toxinas encontradas em plantas, como alcaloides
pirrolizidínicos e ptaquilosídeos (MEDEIROS; GÓRNIAK; GUERRA, 1999) e alguns
contaminantes ambientais como o mercúrio e o chumbo (ROZMAN; KLAASSEN, 2001).
Por outro lado, a despeito da grande importância da excreção de vários xenobióticos
no leite e suas prováveis consequências na saúde do neonato, surpreendentemente, muito
pouca atenção tem sido dada à toxicologia do desenvolvimento pós-natal e a exposição aos
diferentes agentes tóxicos pelo leite (FLEISHKER, 2002). De fato, Loebstein, Lalkin e Koren
(1997) apontam que há grandes lacunas nas informações sobre a transferência para o leite, em
humanos e animais, de substâncias químicas, bem como a extensão da exposição do lactente
aos xenobióticos.
A toxidade de plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos é um grave problema
de saúde pública. Os efeitos adversos, possíveis alterações e toxidez, bem como a ação
sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. As pesquisas realizadas para a
61
avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes,
assim como o controle da comercialização pelos órgãos oficiais em feiras livres, mercados
públicos ou lojas de produtos naturais (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005). O uso popular e
mesmo o tradicional, não são suficientes para validar, eticamente, os produtos naturais como
eficazes e seguros. Nesse sentido, eles não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico
sintético. Sua preconização ou autorização oficial do seu uso medicamentoso deve ser
fundamentada em evidências experimentais comprobatórias e a segurança do seu uso deve ser
comprovada, inclusive, durante o período gestacional (SIMÕES et al., 2000).
Alguns estudos de toxicologia reprodutiva tem sido realizados no Brasil, como o
estudo realizado por Lyra et al. (2005), que avaliaram o efeito tóxico, em ratas prenhas, do
óleo de sementes de neem (Azadiracha indica A. Juss), utilizado na medicina popular como
repelente. Esse estudo não demonstrou toxidade materna e efeito anti-implantação; contudo,
houve a redução de massa corporal fetal, que pode indicar possível embriofetotoxidade.
Almeida e Lemônica (2000) observaram que o tratamento com 880 mg/kg de Coleus
barbatus durante o período de pré-implantação apresenta efeitos que justificam o uso popular
da referida planta, de efeito abortivo. A exposição neste período também interfere no
deenvolvimento embriofetal. Aragão et al. (2009) avaliaram a toxidade reprodutiva, em ratas
wistar prenhes, tratadas por via oral, nas doses de 250 mg/kg e 500 mg/kg, com extrato seco
de Cassia occidentalis L., não sendo observado diferenças estatísticas significativas, contudo,
foi observado a presença de natimortos nas duas doses utilizadas, indicando que sua utilização
não deve ser recomendada durante o período gestacional.
Borges et al. (2005) avaliaram a toxidade do Hypericum perforatum (erva de São
João), administrado em ratas, no período de organogênese, não sendo apresentadas
manifestações tóxicas para ratas prenhas, nesse período. Uma preparação fitoterápica, Kava
Kava® (Piper methysticum Forst) também foi avaliada quanto a sua toxidade sistêmica e
reprodutiva, não sendo observado, hepatotoxidade, toxidade sistêmica, reprodutiva nem o
aparecimento de teratogenicidade na dose de 35 mg/kg (PINTO, 2004).
A diferença genética, entre as espécies, faz com que se torne necessário, a utilização
de mais de uma espécie nos ensaios de toxicologia reprodutiva (MENGUE et al., 2001;
BRASIL, 2009d). O estudo realizado por Van-Cauteren et al. (1987) utilizou três diferentes
espécies de animais (ratos, coelhos e camundongos) nos ensaios, possibilitou observar as
diferentes respostas toxicológicas a cada espécie. Outro fator importante é o período
gestacional exposto a esse agente, pois, a susceptibilidade de cada órgão a uma determinada
62
anomalia ou malformação dependerá da etapa em que se encontra o desenvolvimento, de

forma que o concepto seja sensível a diferentes períodos (CALLIARI-MARTIN, 1998;
ROGERS; KAVLOCK, 2001).
2.4 O GÊNERO COPAIFERA
As árvores de copaíba são nativas da região tropical da América Latina e também da

África Ocidental. Na América Latina são encontradas espécies na região que se estende do
México ao norte da Argentina (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002). O gênero Copaifera possui
106 espécies, sendo 24 destas endêmicas do Brasil (THE PLANT LIST, 2013; QUEIROZ,
MARTINS-DA-SILVA, COSTA, 2014). Entre as espécies mais abundantes, destacam-se: C.
officinalis L. (norte do Amazonas, Roraima, Colombia, Venezuela e San Salvador), C.
guianensis Desf. (Guianas), C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne (Amazônia), C.
confertiflora Benth (Piauí), C. langsdorffii Desf. (Brasil, Argentina e Paraguay), C. coriacea
Mart. (Bahia), C. cearensis Huber ex Ducke (Ceará) (PIO-CORRÊA, 1931; MORS; RIZZINI,
1966).
São árvores de crescimento lento, que podem viver até 400 anos. Medem de 25 a 40
metros de altura com casca aromática, folhagem densa, flores pequenas, frutos secos, do tipo
vagem monospérmica e deiscente. O tronco é áspero, de coloração escura, medindo de 0,4 a 4
metros de diâmetro e os canais secretores estão presentes na região cortical dos caules,
dispostos de modo que se prolonguem até o lenho, tornando-se abundante e formando bolsas
(SILVA et al., 2008). As folhas são alternadas, pecioladas e penuladas e os frutos contêm uma
semente ovóide, envolvida por um arilo amarelo, rica em lipídios (RIGAMONTE-
AZEVEDO, 2004). As flores são pequenas, apétalas, hermafroditas e arranjadas em panículos
axilares, com floração a partir dos cinco anos de idade, em plantios (SILVA et al., 2008). A
identificação botânica utilizando as características das flores da copaíba é difícil, dado o curto
período em que ocorrem e a elevada altura das árvores (TAPPIN et al., 2004).
Todas as espécies de copaifera spp. produzem um óleoresina no interior do tronco,
chamada de óleo de copaíba (SALGADO et al., 2001; FERREIRA et al., 2004; ISAIAS et al.,
2008). Por esse motivo, a árvore é popularmente conhecida como pau-de-óleo, árvore do óleo
diesel, árvore de depósito, bálsamo de copaíba (MACIEL et al., 2002; ALMEIDA et al.,
2006), copaíba vermelha, copaibeira, oleiro, podoi, cupaúba, cupiúva (FREITAS;
OLIVEIRA, 2002; FERREIRA et al., 2004; PINTO et al., 2004; LIMA NETO et al., 2008),
63
copaibeira de minas ou copaíba da várzea (GUERRA et al., 2006; MARTINS et al., 2008).
Chamada pelos indígenas de copaíva ou copahu, a origem do nome copaíba vem do tupi,
Kupa’iwa e kupa’u, que significa a árvore de depósito, ou que tem jazida, em alusão ao óleo
que guarda em seu interior (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002).
Esse produto é de grande destaque pela larga indicaçäo popular e tradição de uso, com
açäo anti-inflamatória e cicatrizante, sendo sua administração, principalmente por via oral. No
entanto, na literatura diversos estudos já foram realizados sobre a composição e conservação
de sementes das espécies C. multijuga (FAÇANHA; VARELA, 1986; GARCIA; LIMA,
2000) e C. langsdorfii (OLIVEIRA; QUEIROZ, 1995) e, atualmente, diversos trabalhos de
investigação fitoquímica têm sido realizadas em outras partes da planta, tal como semente e
folhas (VEIGA-JÚNIOR et al., 2006; CHEN et al., 2009.; SOUZA et al., 2012; SENEDESE
et al., 2013; TRINDADE et al., 2013).
Alves et al. (2012) estudaram o extrato hidroalcoólico da folha de C. lansdorffii
avaliado quanto ao potencial genotóxico e a sua influência sobre a genotoxicidade induzida
pelo quimioteráico doxorubicina usando o teste do micronúcleos no sangue periférico de
ratos Swiss. A análise por HPLC quantificou os dois principais heterosídeos flavonóides,
quercitrina e afzelina . Os resultados demonstraram que o extrato da folha de C. Lansdorffii
não foi genotóxico, e sugeriram que a atividade antioxidante deve-se existência de um ou
mais compostos ativos no extrato.
No entanto, o conhecimento tradicional é atribuído principalmente ao óleo da copaíba,
que vem desde o Brasil seiscentista com o Padre José de Anchieta citando seu efeito
cicatrizante. Após, passou a constar na farmacopéia britânica em 1677 e na americana em
1820, dada a tamanha importância deste óleo pelos pesquisadores da época. Em 1929 foi
publicada a primeira edição da Farmacopéia Oficial Brasileira, formalizada em uma
convenção médica, e nela foram incluídas algumas espécies nativas descritas por naturalistas,
que observaram suas propriedades (MAIMOM, 2000). Atualmente, esse óleo é
comercializado em farmácias e lojas de produtos naturais de todo o país, com indicações
diversificadas, sendo muito utilizado no contexto da medicina natural.
O óleo de copaíba provém de canais esquizolizígeos, que são secretores, localizados
em todas as partes da árvore. São canais formados pela dilatação de espaços intercelulares
(meatos). O caráter mais saliente desse aparelho está no lenho, onde os canais longitudinais,
distribuídos em faixas concêntricas, nas camadas de crescimento demarcadas pelo
parênquima terminal, reúnem-se com traçados irregulares em camadas lenhosas muitas vezes
64
sem se comunicarem (CASCON, 2004). É produzido e secretado por glândulas especiais

localizadas no caule, sendo armazenado em cavidades intercelulares da árvore (OLIVEIRA et
al., 2006; ANDRADE, 2008; ISAIAS et al., 2008).
Alencar (1982) afirma que algumas árvores praticamente não exudam óleo ou o fazem
em quantidades muito pequenas para coleta (o que os mateiros chamam de “árvores macho”).
Nas espécies de Copaifera spp. as concentrações das substâncias podem variar em função da
temperatura, radiação solar, precipitação pluviométrica, quantidade de nitrogênio no solo e
outros. No entanto, Langenheim (1994) afirma que a composição química parece ser mais
sensível a fatores bióticos externos, tal como: a injúria provocada por insetos ou fungos do
que a própria luminosidade.
No entanto, estudo recente conduzido por Barbosa et al. (2012) demonstrou que a
variação na composição parece também depender do tipo de solo. Os outros fatores
(sazonalidade, diâmetro à altura do peito- DAP) estudados não demontraram nenhuma
influência significativa sobre a composição química e os fatores abióticos dos óleos de
dezesseis amostras de óleoresina Copaifera multijuga Hayne. Oliveira et al. (2006) e Ramos
(2006) afirmam que diversos fatores podem ser atribuídos a variações na composição
química, como a coexistência de várias espécies no mesmo local de coleta, fatores biológicos
como insetos e fungos, ou fatores abióticos (luminosidade, solo e concentrações de
nitrogênio).
Segundo Brito et al. (2005), em condições patológicas, há exudação das árvores de
Copaifera, o qual funciona como defesa da planta contra animais, fungos e bactérias.
Vasconcelos et al. (2008) afirma que do ponto de vista biológico, é um produto de excreção
ou desintoxicação do organismo vegetal. Do ponto de vista químico, é um produto do
metabolismo secundário do vegetal (terpenóides) (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). Os
isoprenoides (isopreno e os terpenoides) protegem a planta contra agentes abióticos, tais como
a oxidação, ao extinguir espécies de oxigênio reativas e ao reagir com o ozônio (O3) da at-
mosfera (LORETO et al., 2001). Além disso, protegem a planta do calor ao reduzir espécies
de oxigênio reativas produzidas por altas temperaturas, protegem as plantas de
microorganismos e repelem insetos (COPOLOVICI, et al., 2005; HUANG et al., 2012;
PINTO-ZEVALLOS et al., 2013).
Estes constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo este termo
empregado para designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva da unidade do
isopreno (pirofosfato de isopentila = IPP). A unidade isoprênica, por sua vez, origina-se a
65
partir do ácido mevalônico ou do metileritritol fosfato. Os esqueletos carbônicos dos

terpenóides, por sua vez, são formados pela condensação cabeça-cauda de um número
variável de unidades isoprênicas (SANTOS, 2004) (Figura 3).
Figura 3. Formação de terpenóides via condensação de unidades de isoprenílicas derivadas de duas

rotas bioquímicas: Ácido mevalônico ou Metileritritol fosfato.
Fonte: DEWICK, 2009.
No citoplasma, a rota do mevalonato (MVA) produz IPP a partir de moléculas

utilizando a acetil coenzima A. A enzima farnesil pirofosfato sintase catalisa a formação de
duas moléculas de IPP e uma de DMAPP para formar farnesil pirofosfato (FPP), o precursor
dos sesquiterpenos (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). O óleo de copaíba é uma exudato
constituído por ácidos resinosos e compostos voláteis, tendo como designação óleoresina
(VEIGA-JUNIOR et al., 2005). A fração de óleo essencial é composta basicamente de
66
sesquiterpenos, predominante na maioria deles, e a fração resina de ácidos diterpênicos

(VEIGA-JÚNIOR. et al., 1995). É produzido e secretado por glândulas especiais localizadas
no caule, sendo armazenado em cavidades intercelulares da árvore (OLIVEIRA et al., 2006;
ANDRADE, 2008; ISAIAS et al., 2008).
A existência d e mais de 20 espécies de Copaifera no Brasil, facilita a
ocorrência de um mistura de óleoresinas, decorrentes de diversas espécies presentes na área
de coleta. Na literatura é descrito a ocorrência de variabilidade na composição química dos
óleoresinas (VEIGA-JÚNIOR, 2002; CASCON; GILBERT, 2000). Essa variação pode
decorrer em relação à concentração e natureza dos diterpenos e sesquiterpenos presentes
(VEIGA-JUNIOR et al., 2005; RAMOS, 2006). Entre os sesquiterpenos α-copaeno e δ-
cadineno foram os principais compostos de oleoresina de C. martii (ZOGHBI et al, 2007. ); β-
cariofileno, β-selineno e β-bisaboleno em C. duckei (LAMEIRA et al., 2009), β-bisaboleno,
trans-α-bergamoteno em C. reticulata do estado Pará (ZOGHBI et al., 2009a,b), β-cariofileno,
β-selineno e β-bisaboleno em C. reticulata do estado do Amapá (ZOGHBI et al., 2009a ,b), β-
cariofileno, trans -α- bergamoteno e β- bisaboleno em C. reticulata do Estado do Pará
(HERRERO- JÁUREGUI et al., 2011). α- copaeno foi o principal sesquiterpeno detectado em
C. paupera e C. piresii (ZOGHBI et al. , 2009a ,b) , e β-caryophyllene foi destaque na espécie
C. pubiflora (ZOGHBI et al., 2009a,b) e C. multijuga (CASCON; GILBERT, 2000) . Em
relação com o óleo essencial da folha de C. langsdorffii β- cariofileno também foi detectado
elevadas quantidades em C. Trapezifolia (VEIGA-JÚNIOR et al. , 2006).
Dias et al. (2012) descreveram a otimização e validação de um método SPME -
GC para análisar o β-cariofileno nas nanoemulsões e indicar a estabilidade produzidas por
homogeneização de alta pressão. O método proposto sugere um efeito protetor da formulação
quanto às concentrações de β-cariofileno, uma vez que não foi observado produtos de
degradação e o tempo de retenção do β-cariofileno não foi alterado, que demonstrou a
especificidade do método e aplicabilidade para quantificar o teor de β-cariofileno nas
formulações desenvolvidas .
Desta forma, o óleo de copaíba é um dos produtos naturais mais utilizados pela
população da Amazônia brasileira, onde tem uma grande representação econômica e social,
por ser nativo e ter várias comunidades dependentes de seu extrativismo (SANTOS et al.,
2001). Nexte contexto, vale ressaltar que a disseminação da indústria de produtos naturais em
todo mundo e no Brasil, nos últimos anos, levou à comercialização extensiva do óleoresina de
copaíba pelos laboratórios farmacêuticos. Das pequenas cidades do interior da Amazônia,
67
esses produtos são transportados para as cidades de Manaus e Belém, de onde são exportados
para a Europa e América do Norte ou enviados para a região sudeste para serem vendidos
pelas farmácias que comercializam produtos naturais. É um produto extrativo de relativo
valor na economia regional da Amazônia, uma vez que este produto encontra várias
aplicações na indústria. Os óleos podem ser encontrados nas farmácias de todo o país em
diversas apresentações, sendo as mais comuns cápsulas ou pequenos frascos de 30 mL
(VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002).
Apesar da existência de métodos de coleta de forma sustentável, ainda nos dias de
hoje, essas árvores acabam sendo derrubadas, obtendo-se uma extração irracional. Isso ocorre
devido ao crescente desmatamento na Região Amazônica, com interesse na madeira,
transformando o óleo resina de copaíba em subproduto da indústria madeireira (VEIGA-
JÚNIOR; PINTO, 2002; PINTO; MADURO, 2003). A época mais indicada para extração de
óleo é a das chuvas, principalmente devido à maior quantidade de água e maior fluidez do
óleo. As extrações realizadas no período seco apresentam a produção de um óleo bem mais
denso. Se uma mesma árvore for explorada em períodos diferentes, poderá produzir óleos de
qualidade diferente, inclusive de cor, densidade e componentes químicos (VEIGA-JÚNIOR;
PINTO, 2002).
Newton et al. (2011) avaliaram a sustentabilidade de extração, de árvores de C.
multijuga, por três anos e observaram que fatores morfológicos e ambientais restringem a
produtividade total de populações de Copaifera. Essas considerações auxiliarão na realização
de práticas de gestão sustentável. Foram estudadas a extração de oleoresina de quatro espécies
(C. guyanensis, C. multijuga, C. piresii e C. paupera) de duas reservas extrativistas no estado
do Amazonas (RESEX Médio Juruá e RDS Uacari). Foram coletadas 179 árvores de áraeas
de várzea e de terra firme. C. multijuga foi a única espécie que produziu regularmente o
óleoresina, com volumes de rendimento variados de C. multijuga (restrito a floresta de terra
firme) teve o maior rendimento, média de 505 mL, enquanto C. guyanensis produziu volumes
menores, 139 ml, porém, este valor foi mais elevado na várzea que na floresta de terra firme,
com rendimento de, apenas, 15 ml.
Como produto florestal primário, a exploração do óleoresina de copaíba apresenta
algumas características originárias de seu manejo que vão definir, em última instância, as
possibilidades de suas aplicações industriais e, portanto, estabelecer o seu padrão de qualidade
para o mercado (LEITE et al., 2001). Mesmo considerando a exploração racional e a coleta
organizada a partir de bolsões florestais contendo, muitas vezes, uma única espécie de
68
copaibeira, para evitar a mistura de óleos de diversas procedências é necessário, ainda, o

estabelecimento de procedimentos controlados, desde o momento em que o produto extraído é
acondicionado para transporte até sua comercialização. Este é um dos aspectos mais
importantes relacionados ao controle de qualidade do insumo bruto extraído e já constitui um
dos focos de atenção e iniciativa por parte de algumas cooperativas extrativistas florestais
(NEWTON et al., 2012).
Na literatura já foram descritas várias outras aplicações farmacológicas, tais
como, antimicrobiana e antibacteriana (OPDYKE, 1976; MIRANDA et al., 2000; TINCUSI
et al., 2002; SANTOS et al., 2007; SANTOS et al., 2008; IZUMI et al., 2012; IZUMI et al
2013), anti-helmíntico (PELLEGRINO, 1967; GILBERT et al., 1972), analgésico
(FERNANDES et al., 1992; CARVALHO et al., 2005), anti-inflamatório (BASILE et al.,
1988; FERNANDES et al., 1992; VEIGA- JÚNIOR et al., 2001; CARVALHO et al., 2005),
cicatrizante (BRITO et al, 1999), gastroprotetora (PAIVA et al., 1998), antitumoral (OHSAKI
et al., 1994; LIMA et al., 2003); tripanomicida (CASCON et al., 1998; IZUMI et al., 2012;
IZUMI et al., 2013) contra diversas formas de Leishmania spp. (SANTOS et al., 2010;
RONDON et al., 2012).
Costa-Lotufo et al. (2002) verificaram o potencial embriotóxico e citotóxico do
ácido caurenóico (diterpeno abundante nas espécies de Copaifera) no desenvolvimento
embrionário de ouriços do mar. Brito et al. (1999) observaram que ratos submetidos ao
tratamento por sonda orogástrica de óleorresina de copaíba tiveram seu o comportamento
alterado, concomitantemente, a ocorrência de diarréia e diminuição da curva ponderal dos
animais. Em outro estudo, Brito et al. (2000) observaram alterações gastroplégicas em ratos,
após o tratamento com oleorresina de copaíba (0,63 mL/kg), por via oral.
Devido sua suposta ação anti-inflamatória (VEIGA-JÚNIOR et al., 2007),
cicatrizante (CARVALHO et al., 2005) e bactericida (VENEZIANI et al., 2010; ZIECH et
al., 2013) é comumente embrocado via vaginal para tratamento de leucorréia, sífilis e
blenorragia e por isso Brito et al. (2001) estududaram os efeitos macroscópicos do óleo de
copaíba sobre a mucosa vaginal de ratas onde o mesmo promoveu a formação de grumos
esbranquiçados e aderidos à parede vaginal em toda sua extensão. Lima et al (2011)
realizaram um estudo de sobre a performance reprodutiva de ratas prenhas submetidas ao
tratamento com um creme vaginal a base do óleoresina de C. duckei. Os resultados deste
estudo demonstraram ausência de toxidade materna e embriofetotoxidade na dose
administrada, correspondente a 10 vezes preconizada para uso em mulheres.
69
Veiga-júnior et al. (2007) fizeram um estudo comparativo entre a composição e

atividade anti-inflamatória de C. cearenses e o perfil cromatográfico demonstrou que o
composto principal entre os sesquiterpenos foi β- cariofileno ( 57,5 , 49,7 e 40,9 % ,
respectivamente ) , seguido de α- humuleno , α- copaeno , α- bergamoteno , δ- cadineno, com
diferentes concentrações em cada oleorresina. Entre os diterpenos, ácido copálico foi o
principal componente de C. multijuga Hayne (6,2%) e foi encontrado em todas as oleorresinas
estudados. Em C. cearensis Huber ex Ducke , clorechinic (11,3% ) e ácidos hardwickiic
(6,2%) foram os principais diterpenos enquanto caurenóico (3,9% ) e ácidos kolavenic (3,4%)
predominou em C. reticulata. Os efeitos farmacológicos dos três oleorresinas foram avaliados
in vitro por meio da medição da produção de NO (óxido nítrico) por macrófagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos. O óleoresina de copaíba
C. multijuga (100 mg / kg ) foi a mais potente , tanto inibir a produção de NO e a pleurisia
induzida pelo zimosan . As oleoresinas de C. cearensis e C. reticulata também foram capazes
de inibir a produção de NO e a pleurisia, no entanto com menos intensidade.
Lima et al. (2003), demonstraram que o óleo de C. multijuga apresenta atividade
tumoricida em células de melanoma, tanto in vivo quanto in vitro. Em outro modelo
experimental, indução de colite por ácido acético em ratos, observou-se que o ácido
caurenóico, aplicado junto com o ácido acético, diminuiu o infiltrado de células inflamatórias
e edema da mucosa intestinal sugerindo seu efeito anti-inflamatório (PAIVA et al., 2003). A
presença da atividade mutagênica e tóxica do óleoresina de C. langsdorfii foi demonstrada
pelo teste do micronúcleo em eritrócitos policromáticos da medula óssea de camundongos em
estudo feito por Chen-Chen e Sena (2002). Semelhentemente, Maistro et al. (2005) avaliaram
as atividades citotóxicas e mutagênicas, em reticulócitos de sangue periférico e medula óssea,
através de constituintes químicos do óleoresina de C. duckei em aplicação cutânea em rato, e
provaram que, em doses elevadas, a óleoresina de C. duckei foi atividade citotóxica.
A atividade antineoplásica do óleo de Copaifera multijuga e de suas frações,
hexânica e clorofórmica, foram investigadas em tratamento crônico para a avaliação da
evolução do tumor de Ehrlich. Segundo os autores, o efeito antineoplásico foi confirmado e a
presença de alguns sesquiterpenos encontrados como, β-cariofileno, bisaboleno e γ-
cariofileno, também foram citada em outros trabalhos quanto à atividade antitumoral
(GOMES et al., 2008). A atividade contra formas evolutivas de espécies do gênero
Leishmania sp. foram testas com oito tipos diferentes de óleoresina de copaíba, apresentando
níveis variados contra formas promastigotas, sendo que a espécie que a C. reticulata
70
apresentou maior atividade para promastigotas, amastigotas axênicas e formas amastigotas

intracelulares, respectivamente. A avaliação citotóxica obtida do óleo de C. reticulada
apresentou atividade significativa na espécie Leishmania amazonense, entretanto seu
potencial terapêutico não foi estudado (SANTOS et al., 2008a).
2.4.1 Copaifera duckei Dwyer
Cascon e Gilbert (2000) compararam as composições de oleorresinas de C.

Guianensis, C. duckei e C. multijuga, todos de ocorrência comum na Amazônia brasileira,
mostra que a variação química significativa ocorre não só entre espécies, mas também dentro
de uma mesma espécie e em uma fonte de árvore individual. Lameira et al. (2009) analisaram
oleoresinas de três árvores de C. duckei colhidas no início de Setembro de 2003 ao final de
setembro de 2004, e a fração volátil foi analisda em GC- FID e GC / MS e observaram
alterações nas quantidades coletadas por influência da estação chuvosa. No entanto não houve
tanta diferença quanto ao percentual dos principais componentes encontrados, contrastando-se
com a terceira amostra, o qual mudou consideravelmente. Os constituintes majoritários da
fração sesquiterênica dos óleos de diversas espécies β-trans-cariofileno e seu óxido
(LEANDRO et al., 2012).
Carvalho et al., (2005) investigaram as atividades analgésica e anti-inflamatória
tópicas do óleoresina de C. duckei, cuja composição química terpenoidal foi avaliada em ratos
utilizando carragenina, para induzir o edema de pata, e os testes de granulomas, determinaram
que na indução do edema por carragenina e teste de granuloma. O óleoresina inibiu o edema
em 18% e granuloma em 42%, este último resultado é semelhante ao observado com a
administração de dexametasona, sugerindo assim que a óleo resina de C. duckei teve atividade
antiinflamatória e analgésica. Castro e Silva et al. (2004) avaliaram a atividade
antiproliferativa do óleoresina de C .duckei oleoresina na regeneração hepática em ratos e
observaram que este óleoresina foi capaz de desacoplar a fosforilação oxidativa em
mitocôndrias, e sugeriram que a inibição da proliferação hepatocelular observada no grupo
tratado com o óleoresina.
Lima et al. (2011), no estado do Amapá, realizaram o primeiro estudo na área de
toxicologia reprodutiva. Esse estudo consistiu na avaliação da performance reprodutiva de
ratas prenhas, submetidas ao tratamento com creme vaginal a base do óleo de copaíba (C.
duckei) e os resultados deste estudo demonstraram ausência de toxidade materna e
71
embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a dose preconizada para

uso humano. É importante ressaltar que neste estudo, o creme de copaíba a 2,5% foi usado
aplicação tópica (via vaginal).
72
3 REFERÊNCIAS
AGARWAL, A.; APONTE-MELLADO, A.; PREMKUMAR, B.J.; GUPTA, A.S.A.S. The

effects of oxidative stress on female reproduction: a review Reproductive Biology and
Endocrinology, v.10, n.49, 2012.
ALBAGLI, S. AMAZÔNIA: Fronteira geopolítica da biodiversidade. Revista Parceiras

Estratégicas., n.12, p.6-19, 2001.
ALBUQUERQUE, U. P.; MEDEIROS, P. M.; ALMEIDA, A. L. S.; MONTEIRO, J. M.;

NETO, E. M. F. L.; MELO, J. G.; SANTOS, J. P. Medicinal plants of the caatinga (semi-
arid) vegetation of NE Brazil: a quantitative approach. Journal of Ethnopharmacology, v.
114, n.1, p. 325-354, 2007.
ALBUQUERQUE, U.P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na descoberta de novos

fármacos de interesse médico e farmacêutico: fragilidades e perspectivas. Revista Brasileira
de Farmacognosia. v.16, p.678-689, 2006.
ALENCAR, J. C.; Acta Amazonica, v.12, p.72, 1982.
ALMEIDA, F. C. G.; LEMONICA, I. P. The toxic effects of Coleus barbatus B. on the

different periods of pregnancy in rats. J. Etnnoph., v. 73, p. 53-60, 2000.
ALMEIDA, J.M, Embriologia veterinária comparada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2009).
ALMEIDA, R. N. Psicofarmacologia: fundamentos práticos. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, p. 357, 2006.
ALVES, F. N. R. Desafio para a Inovação em fitomedicamentos no contexto da Indústria

Farmacêutica Nacional. Rev. Fitos., v. 1, n. 1, p. 18-29, 2005.
ALVES, J.A., et al. "Inhibitory effect of Copaifera langsdorffii on 1,2-Dimethylhydrazine

induced genotoxicity in rat colon." Planta Med. v.78, n.11, p. 1076-1076, 2012.
ANDRADE, L.F.; CAMPOS.J.M.S & DAVIDE, L.C. Cytogenetic alterations induced by

SPL (spent poliners) in meristematic cells of plant bioassay. Ecotoxicology and
Enviromental Safety, v.71, p.706-710, 2008.
ARAGAO TP, LYRA MM, SILVA MG, ANDRADE BA, FERREIRA PA, ORTEGA LF,
DA SILVA SD, DA SILVA JC, FRAGA MC, WANDERLEY AG, LAFAYETTE SSJ.
Toxicological reproductive study of Cassia occidentalis L. in female Wistar rats.
Ethnopharmacol, v. 123, n. 1, p. 163-166, 2009.
AUGUSTIN, H. G. Vascular morphogenesis in the ovary. Baillières Clinical Obstetrics and

Gynaecology, v. 14, n. 6, p. 867 – 882, 2000.
AZEVEDO, C.M.A. Bioprospecção: Coleta de material biológico com finalidade de

explorar os recursos genéticos. Caderno, n 17 (2Ed). Revisada. CETESB, São Paulo, 2003.
73
BARBOSA, P. C. S., et al. Influence of Abiotic Factors on the Chemical Composition of

Copaiba Oil (Copaifera multijuga Hayne): Soil Composition, Seasonality and Diameter at
Breast Height. Journal of the Brazilian Chemical Society, v.23, n.10, p.1823-1833, 2012.
BASILE, A. C. et al. Anti-inflammatory activity of oleoresin from Brazilian Copaifera. J.

Etnnoph., v. 22, p. 101, 1988.
BECKMAN, D.A.; BRENT, R.L Prenatal, and perinatal biology, and medicine. In:
Kretchmer N, Quilligan EJ, Johnson JD, editors. Harwood Switzerland: Academic Publishers,
v. 2, p. 121–54, 1987.
BEGG, E. J.; DUFFULL, S. B.; HACKETT,L.P.; ILETT, K. F. Studying drugs in human

milk: time to unify the approach. Journal of Human Lacting, v. 18, p. 323-332, 2002.
BOCHNER, R.; FISZON, J.T.; ASSIS, M.A.; AVELAR, K.E.S. Problemas associados ao uso
de plantas medicinais comercializadas no Mercadão de Madureira, município do Rio de
Janeiro, Brasil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v.14 n.3, p. 537-547,
2012.
BORGES, L. V. et al. A Toxicidade do Hypericum perforatum administrado a Ratas Prenhes.

Rev. Assoc. Med. Bras., v.51, n.4, p.2006-2008, 2005.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Legislação.

Sistema de Legislação em Vigilância Sanitária (VISALEIS). Resolução RDC n. 48 de 16 de
março de 2004a. Disponível em: <http://e-legis.bvs.br/leisref/public/search.php>. Acesso em:
10 mar. 2014.

10 mar. 2014.

Sistema de Legislação em Vigilância Sanitária (VISALEIS). Resolução RE n. 90 de 16 de
março de 2004b. Disponível em: <http://e-legis.bvs.br/leisref/public/search.php>. Acesso em:
10 mar. 2014.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos.

Departamento de Assistência Farmacêutica. Política nacional de plantas medicinais e
fitoterápicos / Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos,
Departamento de Assistência Farmacêutica. – Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 60 p.
Acesso em: 10 mar. 2014.
BRENT RL. The Bendectin saga: another American tragedy. Teratology, v. 27, p. 283–6,
1983.
BRENT, R. L; BECKMAN, D. A. A Environmental Teratogens. The Bulletin of the New

York Academy of Medicine, V. 66, n.2, p. 123-163, 1990.
74
BRENT, R.L. BENDECTIN: Review of the medical literature of a comprehensively studied

human nonteratogen and the most prevalent tortogen-litigen. Reproductive Toxicology, v.9,
n.4. 1995.
BRENT, R.L. Definition of a teratogen, and the relationship of teratogenicity to

carcinogenicity. Teratology, v. 34, p. 359–60, 1986.
BRENT, R.L. The Bendectin saga: another American tragedy. Teratology, v.27, p. 283–286,
1983.
BRITO, M.V.H. et al. Copaiba oil effect on urea and creatinine serum levels in rats submitted
to kidney ischemia and reperfusion syndrome. Acta Cirúgica Brasileira, v.20, n.3, p.243-6,
2005.
BRITO, M.V.H.; TAVARES, M.L.B.; MOURA, L.G.S.; LIMA, J.T.; Efeito do óleo de
copaíba na função renal de ratos. Rev Para Med., v. 15, p. 28-32, 2001.
BRITO, N. M. B. et al. Aspectos microscópicos da cicatrização de feridas abertas tratadas

com óleo de copaíba em ratos. Rev. Paraense Med., v.13, p. 12-17, 1999.
BRITO, N.M.B. et al. Aspectos morfológicos e morfométricos do colo uterino de ratas

ooforectomizadas após aplicação de óleo de copaíba. Revista Brasileira de Ginecologia e
Obstetrícia, v.22, n.8, p.489-93, 2000.
CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for
herbal medicines (phytotherapeutic agents). Braz. J. Med. Biol. Res. v. 33, p. 179-189,
2000.
CALIXTO, J. B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin America A

personal view. Journal of Ethnopharmacology, v. 100, p. 131–134, 2005.
CALLIARI-MARTIN, R. T. Effects of prenatal exposure to restraint stress and

monocrotophos on behavioral and physical development in the rat. Gen. Molecular Biol., v.
21, n. 3, p. 171, 1998.

monocrotophos on behavioral and physical development in the rat. Gen. Molecular Biol. ,
v.21, n.3, p. 171, 1998.
CARRAI, V.; BORGOGNINI-TARLI, S.M.; HUFFMAN, M.A.; BARDI M. Increase in

tannin consumption by sifaka (Propithecus verreauxi verreauxi) females during the birth
season: a case for self medication in prosimians? Primates, v. 44, p.61-66, 2003.
CARVALHO, A.C.B.; BALBINO, E.E.; MACIEL, A.; PERFEITO, J.P.S. Situação do

registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Rev Bras Farmacog, v.18, n.2, p.314-319,
2008.
CARVALHO, J. C. T., et al. Topical Antiinflammatory and analgesic activities of Copaifera

duckei Dwyer. Phytotherapy Research, v.19, n.11, p.946-950, 2005.
75
CASCON, V. Copaíba - Copaifera spp. In: CARVALHO, J.C.T. Fitoterápicos

antiinflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ribeirão
Preto: Tecmedd, 480 p, 2004.
CASCON, V.; FERNANDEZ-FERREIRA, E.; SOARES, R.O.A.; GIBALDI, D.; GILBERT,

B.; SANTOS, R.R. Avaliação da composição química e da atividade tripanosomicida in
vitro de óleo-resinas de Copaifera spp. In: XV SIMPÓSIO DE PLANTAS MEDICINAIS
DO BRASIL. RESUMOS, Águas de Lindoia, SP, Brasil, p.199, 1998.
CASCON, V.; GILBERT, R. Characterization of the chemical composition of oleoresins of

Copaifera guianensis Desf., Copaifera duckei Dwyer and Copaifera multijuga Hayne.
Phytochemistry, v.55, p.773–778, 2000.
CHECHINEL-FILHO, V.; E YUNES, R.A. Estudo químico de plantas medicinais

orientado para a analise biológica. Obtenção, determinação e modificação estrutural de
compostos bioativos. In YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Plantas Medicinais: sob a ótica da
química medicinal moderna. Chapecó. Argos, p. 47-76, 2001.
CHEN, F., et al. Within-plant distribution and emission of sesquiterpenes from Copaifera
officinalis. Plant Physiology and Biochemistry, v.47, p. 1017-1023, 2009.
CHEN-CHEN, L.; SENA, A.M. Atividade Tóxica e Mutagênica do óleo de Copaíba
(Copaífera langsdorfii Desfon) em camundongos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
v.5, n.1, p.37-40, 2002.
CLAUDIO, L.; BEARER, C.F.; WALLINGA, D. Assessment on the U.S enviromental

protection agency methods for identification of hazards to developing organisms, part II: the
developing toxicity testing guideline. American Journal of industrial Medicine, v. 35, n. 6, p.
555-563, 1999.
CLAUDIO, L.; BEARER, C.F; WALLINGA, D. Assessment of the U.S Environmental

Protection Agency methods for identification of hazards to developing organisms, prt I: The
reproduction and fertility testing guidelines. American Journal of Industrial Medicine, v.
35, p. 543-553, 1999.
CLAYTON, E.W. Liability exposure when offspring are injured because of their
parents’ participation in clinical trials. In: Women and Health research: Ethical and Legal
issues of Including women in Clinical Trials. National Academy Press., v. 2, p. 103–112,
1994.
COSTA-LOTUFO, L.V., et al. The cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a
diterpene isolated from Copaifera langsdorffii oleo-resin. Toxicon, v.40, n.8, p. 1231-1234,
2002.
CUNHA, L. C. Ç.; AZEREDO, F. S. Ç.; MENDONCA, A. C. V.; VIEIRA, M. S. Ç.; PUCCI,

L. L. Ç.; VALADARES, M. C.; FREITAS, H. O. G.; SENA, A. A. S.; LINO JUNIOR, R. S.
Avalição da toxidade aguda e subaguda, em ratos, do extrato etanólico das folhas e do látex
de Synadenium umbellatum Pax. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 19, n. 2A, p. 403-
411, 2009.
76
DEWICK, P.M. The mevalonate and methylerythritol phosphate patways:

Terpenóidesand steroids. In: Medininal Natural Products: A biosynthetic Approach, 3ª ed.,
2009.
DIAS, A; AIRES, C; SILVA, M; CATARINO, R. Teste de toxicidade em Artemia salina:

contaminantes (K2CrO7) e efluentes químicos (tratados e não tratados). Universidade do
Algarve, 2002.
DIAS, B.F.S. Balanço da biodiversidade na Amazônia: uma introdução ao desconhecido.

Seminário Especial: “A Biodiversidade como Estratégia Moderna de Desenvolvimento da
Amazônia”. Estudos e Pesquisas, INAE – Instituto Nacional de Altos Estudos, Rio de
Janeiro, n.17, set. 2001.
DIAS, D. D., et al. Optimization of headspace solid-phase microextraction for analysis of

beta-caryophyllene in a nanoemulsion dosage form prepared with copaiba (Copaifera
multijuga Hayne) oil. Anal Chim Acta, v.721, p. 79-84, 2012.
DI-STASI, L.C. An integrated approach to identifi cation and conservation of medicinal

plants in the tropical foresta Brazilian experience. Plant Genetic Resources, v. 3, p.199-205,
2005.
EMBIRUÇUI, E. K. et al. Risco teratogênico a percepção em diferentes segmentos da

população. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v. 4, n.3, p. 201-7, 2005.
EMBIRUÇUI, E.K. et al. Risco teratogênico: a percepção em diferentes segmentos da

população. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v.4, n.3, p.201-7, 2005.
FAÇANHA, J.G.V.; VARELA, V.P. Resultados preliminares de estudos sobre a conservação

e composição bioquímica de sementes de copaíba (Copaifera multijuga Hayne)
Leguminosae. Acta Amazonica, v.16, p.377-382, 1986.
FAVEIRO, A. M. Efeitos da exposição materna ou paterna ao disseleneto de difenila sobre o

desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas wistar. Dissertação, Universidade Federal de
Santa Maria, 2006.
FAVERO, A. M. Efeitos da exposição materna ou paterna ao disseleneto de difenila

sobre o desenvolvimento intra-uterino da prole de ratas wistar. Dissertação, Universidade
Federal de Santa Maria, 2006.
FERNANDES, R.M.; PEREIRA, N, A.; PAULO, L. G. Anti-inflammatory activity of copaiba

balsam (Copaifera cearensis Huber). Rev. Bras. Farm., v. 73, n. 3, p. 53-56, 1992.
FERREIRA, P.M.; OLIVEIRA, C.V.; OLIVEIRA, A.B, LOPES, M.J.; ALZAMORA, F.;
VIEIRA, M.A.R. A lyophilized aqueous extract of Maytenus ilicifolia leaves inhibits
histamine-mediated acid secretion in isolated frog gastric mucosa. Planta, v.219, p.319-324,
2004.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). Guidence for industry: M3(R2)

nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials for pharmaceuticals
77
FDA, 2010. Disponível em:

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidance
s/ucm073246.pdf. Acesso em: Dez. 2013.
FREITAS, C.V.; OLIVEIRA, P.E. BIOLOGIA REPRODUTIVA DE Copaifera langsdorffi

Desf. (Leguminosae, Caesalpinioedeae). Revista Brasileira de Botãnica, São Paulo, v.25,
n.3, p.311-321, 2002.
FRITZ, H.; GIESE K. Evaluation of the Teratogenic Potential of Chemicals in the Rat.
Pharmacol., v. 40, n. 1, p. 1-28, 1990.
FUNARI, C.S.; FERRO, V.O. Uso ético da biodiversidade brasileira: necessidade e

oportunidade. Rev. Bras Farmacog, v. 15, n.12, p. 178-182, 2005.
GARCIA, L.C.; LIMA, D. Comportamento de sementes de Copaifera multijuga durante

armazenamento. Acta Amazônica, v.30, p. 369-375, 2000.
GILBERT B. et al. A atividade anti-helmíntica de óleos essenciais e de seus componentes

químicos. An. Acad. Bras. Ciên., v. 44, p. 423-428, 1972.
GOMES, N. D., et al. Antineoplasic activity of Copaifera multijuga oil and fractions against
ascitic and solid Ehrlich tumor." J Ethnopharmacol, v.119, n.1, p.179-184, 2008.
GOPINATH, C. Toxicology and pathology off emale reproductive tract. Cell Biol Toxicol.,
v.29, p.131-141, 2013.
GRAY. L. E. e col. Use of the Laboratory Rat as a Model in Endócrine Disruptor Screening
and Testing. ILAR Journal, v. 45, n. 4, p. 425 – 437, 2004.
GUERRA, M.E.C.; FILHO, S.M.; TEÓFILO, E.M. Efeito da temperatura e da luz nas
sementes de Copaifera langsdorffii Desf. Revista caatinga. Mossoró, v.19, n.1, p.39-43,
2006.
GUERRA, M.P.; NODARI, R.O.; REIS, M.S.; SCHMIDT, W. Agricultura, Biodiversity, and
“Appropriate Biotechnologies” in Brazil. Ciência e Cultura, v. 50, p. 408-416, 1998.
HERRERO-JAUREGUI, C. et al. Chemical Variability of Copaifera reticulata DUCKE
Oleoresin. Chem Biodivers, v.8, n.4, p.674-685, 2011.
HUFFMAN, M.A. Animal self-medication and ethnomedicine: exploration and exploitation

of the medical properties of plants. P Nutr Soc, v.63, p.371-381, 2003.
ISAIAS, R.M.S.; CARNEIRO, R.G.S.; OLIVEIRA, D.C.; SANTOS, J. C. Illustrated and

Annotated Checklist of Brazilian Gall Morphotypes. Neotrop Entomol. v.42, p. 230-239,
2013.
IZUMI, E., et al. Terpenes from Copaifera Demonstrated in Vitro Antiparasitic and Synergic
Activity. J Med Chem, v.55, n.7, p. 2994-3001, 2012.
78
IZUMI, E., et al. Toxicity of Oleoresins from the Genus Copaifera in Trypanosoma cruzi: A
Comparative Study. Planta Med , v. 79, n.11, p. 952-958, 2013.
KARNOFSKY DA. Drugs as teratogens in animals and man. Annual Review of

Pharmacology, v. 10, p. 447–72, 1965.
KLAASSEN, C. D.; WATKINS, J. B. Fundamentos em toxicologia de Casarett e Doull

(Lange). 2ª ed. São Paulo: Artmed, 2012.
KLEIN, T.; LONGHINI, R.; BRUSCHI, M. L.; MELLO, J. C. P. Fitoterápicos: um Mercado

promissor. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 30, n. 3, p. 241-248,
2009.
KOLA, I.; FOLB, P. Chlorpromazine inibtis the mitotic índex, cell number, and the formation
of blastocyst, and delays implantation of CBA mouse embryos. J. Reprod. Fert., v. 76, p.
527-536, 1986.
KOREN G, BOLOGA M, LONG D, FELDMAN Y, SHEAR N. Perception of teratogenic

risk by pregnant women exposed to drugs and chemicals during the first trimester. Am J
Obstet Gynecol., v. 160, p. 1190–1194, 1989.
KOREN, G.; BOLOGA, M.; LONG ,D.; FELDMAN, Y.; SHEAR, N. Perception of
teratogenic risk by pregnant women exposed to drugs and chemicals during the first trimester.
Am J Obstet Gynecol., v.160, p. 1190-1194, 1989.
KRIEF, S.; MARTIN, M.; GRELLIER, P.; KASENENE, J.; SÉVENE,T. T. Novel
antimalarial compounds isolated in a survey of self-medicative behavior of wild chimpanzees
in Uganda. Antimicrob Agents Ch., v.48, p.3196-3199, 2004.
LAMEIRA, O. A., et al. Seasonal Variation in the Volatiles of Copaifera duckei Dwyer
Growing Wild in the State of Para - Brazil. Journal of Essential Oil Research, v.21, n.2, p.
105-107, 2009.
LANGENHEIM, J. H. Higher plant terpenoids: a phytocentric overview of their ecological

roles. J. Chem. Ecol., v.20, p. 1223-1280, 1994.
LAPA, A. J. et al. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C. M. O,

SHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R
(org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6.ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora
da UFRGS/Editora da UFSC, p. 247-262, 2010.
LEITE, A. et al. Recomendações para o manejo sustentável do óleo de copaíba, UFAC/

SEFE: Rio Branco, 2001.
LEMONICA, L. P; DAMASCENO, D. C; DI-STASI, I. C. Study the embryotoxic effects of

na extract of Rosemary (Rormarinus officinalis L.). Braz. J Med. Biol. Res. v. 29, p. 223-
227, 1996.
79
LIMA, C.S.; DE MEDEIROS, B.J.L.; FAVACHO, H.A.S.; DOS SANTOS, K.C.; DE

OLIVEIRA, B.R.; TAGLIALEGNA, J.C.; DA COSTA, E.V.M.; DE CAMPOS, K.J.;
CARVALHO, J.C.T. Pre-clinical validation of a vaginal cream containing copaiba oil
(reproductive toxicology study). Phytomedicine, v.18, p. 1013– 1023, 2011.
LIMA, S. R. M. et al. In vivo and in vitro studies on the anticancer activity of Copaifera
multijuga Hayne and its fractions. Phytother. Res., v. 17, p. 1048–1053, 2003.
LIMA-NETO, J.S.; GRAMOSA, N.V.; SILVEIRA, E.R. Constituintes químicos dos frutos de
Copaifera langsdorffii Desf. Revista Química Nova, v. 31, n. 5, p. 1078-1080, 2008.
LYRA, M.M.A., COSTA-SILVA, J.H., LIMA, C.R., ARRUDA, V.M., ARAÚJO, A.V.,
RIBEIRO E RIBEIRO, A., et al. Estudo toxicológico reprodutivo da Azadirachta indica A
JUSS. (Neem). Rev. Fitos, v. 1, p. 53–57, 2005.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA-JÚNIOR, V.F.; GRYNBERG, N.F.;

ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Revista
Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429- 438, 2002.
MAIMOM, D. Estudo de mercado de matéria-prima: Corantes naturais (cosméticos,

indústria de alimentos), conservantes e aromatizantes, bioinsetisidas e óleos vegetais
essenciais (cosméticos e oleoquímica). Belém/PA: SUDAM/PNUD, 2000. (Relatório Final).
MAISTRO, E. L., et al.In vivo evaluation of the mutagenic potential and phytochemical
characterization of oleoresin from Copaifera duckei Dwyer. Genetics and Molecular
Biology, v. 28, p.4833-838, 2005.
MARINHO, M. L.; ALVES, M. S.; RODRIGUES, M. L. C.; ROTANDANO, T. E. F.;

VIDAL, I. F.; SILVA, W. W.; ATHAYDE, A. C. R. A utilização de plantas medicinais em
medicina veterinária: um resgate do saber popular. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais, v. 9, n. 3, p. 64-69, 2007.
MARQUES, M.B. Patentes Farmacêuticas e acessibilidade aos medicamentos no Brasil. Hist.

ciênc. saúde – Manguinhos, v.7, p.7-21, 2000.
MARTINS-DA-SILVA, R.C.V.; PEREIRA, J.F.; LIMA, H.C. O gênero Copaifera

(Leguminosae-Caesalpinioideae) na Amazônia brasileira. Rodriguésia, v.59, p. 455–476,
2008.
MCCHESNEY, J. D.; VENKATARAMAN, S. K.; HENRI, J. T. Plant natural products: Back

to the future or into extinction? Phytochem., v. 68, p. 2015–2022, 2007.
MEDEIROS R.M.T.; GÓRNIAK S.L.; GUERRA J.L. Effects of milk from goat
fed Crotalaria spectabilis seeds on growing rats. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.36, n.2,
p.97-100, 1999.
MENGUE, S. S.; MENTS, L. A.; SCHENKEL, E. P. Uso de plantas medicinais durante a

gravidez. In: SANSEVERINO, M. T. V; SPRITZEL, D. T.; SCHÜLER-FACCINI, L.
Manual de Teratogênese. Porto Alegre: Ed. Universidade/UFRGS, p. 423-450, 2001.
80
MIRANDA, R. C. M. et al. Atividade Antimicrobiana do Óleo de Copaíba (Copaifera spp.)

de Diferentes Procedências. In: SIMPÓSIO DE PLANTAS MEDICINAIS DO BRASIL, 16,
2000, Recife, Brasil. Anais do 16º Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil. Recife, 2000,
p. 223.
MORRE, K.L.; PERSAUD, T.V.N. Embriologia Básica. Elsevier, 7ª Ed., 2008.

MORS, W.; RIZZINI, C. T.; Useful Plants of Brazil; Holden-Day Inc.: San Francisco, 1966,
p. 45.
NEWMAN, D. J.; GRAG, G. Natural Products as Sources of a New Drugs over the last 25
years. J. Nat. Prod., v. 70, p. 461-477, 2007.
NEWTON, P., et al. Determinants of yield in a non-timber forest product: Copaifera oleoresin
in Amazonian extractive reserves. Forest Ecology and Management, v. 261, n.2, p. 255-264,
2011.
NEWTON, P., et al. Spatial, Temporal, and Economic Constraints to the Commercial
Extraction of a Non-timber Forest Product: Copaiba (Copaifera spp.) Oleoresin in Amazonian
Reserves. Economic Botany, v. 6, n. 2, 165-177, 2012.
OAKLEY GP. Frequency of human congenital malformations. Clin Perinatol, v 13,p. 545–
54, 1986.
OECD. Guideline for testing of Chemicals: Acute Oral Toxicity- Acute Toxic Class Method
Guideline: 423. Organization for economic co-operation and development (OECD), 2001.
OHSAKI, A. et al. The isolation and in vivo potent antitumor activity of a clerodane
deterpenoid from the oleoresin of the Brazilian medicinal plant, Copaifera langsdorfii Desf.
Bio. Med. Chem. Letters, v.4, n. 24, p. 2889-2892, 1994.
OLIVEIRA, E. C. P.; LAMEIRA, O. A.; ZOGHBI, M. G. B. Identificação da época de coleta

do óleo-resina de copaíba (Copaifera spp.) no município de Moju, PA. Rev. Bras. Pl. Med.,
v. 8, n. 3, p. 14-23, 2006.
OPDYKE, D. L. Inhibition of sensitization reactions induced by certain aldehydes. Food

Cosmet. Toxicol., v. 14, p. 197-198, 1976.
PAIVA, L. A. et al. Anti-inflamatory effect of kaurenoic acid, a diterpene from Copaifera
langsdorffi on acetic acid-induced colits in rats. Vascul. Pharmacology, v. 39, p. 303-307,
2003.
PAIVA, L. A. et al. Gastroprotective effect of Copaifera langsdorffii oleoresin on

experimental gastric ulcer models in rats. J. Ethnopharmacol., v. 62, p. 73-78, 1998.
PELLEGRINO, J. Protection against human Schistosome cercariae. J. Exper. Parasitol., v.

21, p. 12, 1967.
PETROVICK, P.R., ORTEGA, G.G., BASSANI, V.L. From a medicinal plant to a

pharmaceutical dosage form. A (still) long way for the Brazilian medicinal plants. Cieˆncia e
81
Cultura. Journal of the Brazilian Association for the Advancement of Science, v. 49, p.364–
369, 1997.
PINTO, A. A. C.; MADURO, C. B. Produtos e subprodutos da medicina popular

comercializados na cidade de Boa Vista, Roraima. Acta Amaz., v. 33, p. 281-290, 2003.
PINTO, V. M. Avaliação toxicológica da preparação fitoterápica contendo Piper

methysticum Forst, Piperaceae (Kava Kava®) sobre o desenvolvimento pré-natal em
ratos Wista, 2004.. 71p. Dissertação – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, 2004.
PIO-CORRÊA, M. Dicionário das Plantas Úteis do Brasil; Ministério da Agricultura; Rio

de Janeiro, p. 37, 1931.
PIZZOL, T.S.D.; KNOP, F.P.; MENGUE, S.S. Prenatal exposure to misoprostol and
congenital anomalies: Systematic review and meta-analysis. Reproductive Toxicology, v. 22,
p. 666–671, 2006.
POSER, G.L.; MENTZ, L.A. Diversidade biológica e sistemas de classificação. In:

SIMÕES, C.M.O, SCHENKEL, E.P.; GOSMAN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A;
PETROVICK, P.R (editores). Farmacognosia: da planta ao medicamento (1ed). Porto Alegre
(RS): UFRGS, 2004: 61-74.
PURSLEY TJ, BLOMQUIST IK, ABRAHAM J, ANDERSEN HF, BARTLEY JA.

Fluconazole-induced congenital anomalies in three infants. Clin Inf Dis, v. 22, p. 336–40,
1996.
QUEIROZ, L.P.; MARTINS-DA-SILVA, R.C.V.; COSTA, J. Copaifera in Lista de Espécies

da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em:
<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB22895>. Acesso em: 16 Out. 2014.
RAMOS, M.F.S. Desenvolvimento de microcápsulas contendo a fracão volátil de copaíba

por spray-drying: estudo de estabilidade e avaliação farmacológica. 132p. Tese
(Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
RATES, S. M. K. Plants as source of drugs. Toxicon., v. 39, p. 316–603, 2001.

RIGAMONTE-AZEVEDO, O. C. et al, Variabilidade química e física do óleo-resina de
Copaifera spp. no sudoeste da amazônia brasileira, Rev. bras. ol. fibros., v. 8, n. 2/3, p. 851-
861, 2004.
ROBERT L. BRENT. Bendectin: review of the medical literature of a comprehensively

studied human nonteratogen and the Most prevalent tortogen-litigen. Reproductive
Toxicology, v. 9, n. 4, 1995.
ROBERT, E.; GUIBAUD, P. Maternal valproic acid and congenital neural tube defects.
Lancet, v. 2, p. 937, 1982.
82
ROGERS, J. M.; KAVLOCK, R. J. Developmental toxicology. In: Cassarett and Doulls’s

Toxicology: The basic science of poisons. KLAASEN, C. D. (Ed.): 7th ed. McGraw-Hill.
New York: NY, 301-331, 2007.
RONDON, F. C. M., et al. In vitro efficacy of Coriandrum sativum, Lippia sidoides and
Copaifera reticulata against Leishmania chagasi. Revista Brasileira De Parasitologia
Veterinaria, v.21, n.3, p. 185-191, 2012
ROSA, F.W. Spina bifida in infants of women treated with carbamazepine during pregnancy.
N. Engl J Med, v. 324 p. 674–77, 1991.
SALGADO, M.A.S.; REZENDE, A.V.; FELFILI, J.M.; FRANCO, A.C.; SOUSA-SILVA,

J.C. Crescimento e repartição de biomassa em plântulas de Copaifera langsdorffii Desf.
submetidas a diferentes níveis de sombreamento em viveiro. Bras. Florestal, n. 70. 2001.
SANT’ANA, P.J. Bioprospecção no Brasil- Contribuições para uma Gestão Ética. 1ª

Edição. Brasilia, Paralelo 15 Editores, 2002.
SANTOS, A. O. et al. Antimicrobial activity of Brazilian copaíba oils obtained from different
species of the Copaifera genus. Mem. Inst. Osvaldo cruz, v. 103, n. 3, p. 277-281, 2008.
SANTOS, A., et al. In vivo study of effect of copaiba oil obtained from Copaifera martii, on
lesions caused by Leishmania amazonensis. Planta Med , v.76, n.12, p. 1314-1314, 2010.
SANTOS, O., et al. Antimicrobial activity of copaiba oils obtained from different species of
Copaifera in Brazil. Planta Med, v.73, n.9, p. 860-860, 2007.
SCHARDEIN J, editor. Chemically-induced birth defects. New York: Marcel Dekker,

2000.
SCHWAREZ, R. L.et al. Relato Del crecimiento intrauterino. In:____. Obstetrícia. Buenos
Aires: El Ateneo, 1996, p. 232-244, 1996.
SCIALLI, A, R. The challenge of reproductive and developmental toxicology under REACH

Regulatory. Toxicology and Pharmacology , v.51, p. 244–250, 2008.
SENEDESE, J. M., et al. Chemopreventive effect of Copaifera langsdorffii leaves

hydroalcoholic extract on 1,2-dimethylhydrazine-induced DNA damage and preneoplastic
lesions in rat colon. BMC Complement Altern Med, v.13, 2013,
SILVA, M.L.; CECHINEL FILHO, V. Plantas do gênero Bauhinia: composição química e

potencial farmacológico. Quim nova, v. 25, p.449-454, 2002.
SILVA, R. C.; PEREIRA. J. F; LIMA, H. C. O Gênero Copaifera (Leguminosae-

cesalpinoideae) na Amazônia Brasileira. Rodriguésia, v. 59, n. 3, p. 45-476, 2008.
SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto

Alegre/Florianópolis: Universidade/UFRGS/UFSC, 2000.
83
SMELCEROVIC, A.; SPITELLER, M. Phytochemical analysis of nine Hypericum L. species

from Serbia and the F.Y.R. Macedonia. Pharmazie, v.61, p.251-252, 2006.
SOARES, J. A. B. Ervas medicinais: é preciso ter cuidado! Disponível em:

http://www.geocities.com/paraciencia/fitoterapia.html Acessado em: 12/09.
SOUZA BARBOSA, P. C., et al. Phytochemical Fingerprints of Copaiba Oils (Copaifera

multijuga HAYNE) Determined by Multivariate Analysis. Chem Biodivers v. 10, n. 7, p.
1350-1360, 2013.
SOUZA, A. B., et al. Antimicrobial Activity of Terpenoids from Copaifera langsdorffii Desf.
Against Cariogenic Bacteria. Phytotherapy Research, v. 25, n. 2, p. 215-220, 2011.
STEPHENS TD, FILLMORE BJ. Hypothesis: thalidomide embryopathy - proposed

mechanism of action. Teratology, v. 61, p. 189–95, 2000.
STOUFFER, R.L. Structure, function and regulation of the corpus luteum. In: Neill JD,
editor. Knobil and Neill’s physiology of reproduction. 3rd ed. San Diego: Elsevier, p. 475,
2006.
STUPP, T., et al. Characterization and potential uses of Copaifera langsdorfii seeds and seed
oil. Bioresour Technol, v. 99, n. 7, p. 2659-2663, 2008.
TAPPIN, M. R. R. et al. Análise química quantitativa para a padronização do óleo de copaíba

por cromatografia em fase gasosa de alta resolução. Quim. Nov., v. 27, n. 2, p. 236-240,
2004.
THE PLANT LIST (2013). Version 1.1. Published on the Internet; Disponível em:
http://www.theplantlist.org/ (accessed 1st January). Acesso em 17/10/2014.
TINCUSI B. M. et al. Antimicrobial terpenoids from the oleoresin of the Peruvian medicinal
plant Copaifera paupera. Plant. Med., v. 68, p. 808- 812, 2002.
TRINDADE, F. T. T., et al. Copaifera multijuga ethanolic extracts, oil-resin, and its
derivatives display larvicidal activity against Anopheles darlingi and Aedes aegypti (Diptera:
Culicidae). Revista Brasileira De Farmacognosia-Brazilian Journal of Pharmacognosy,
v. 23, n.3, p. 464-470, 2013.
TUROLLA, M.S.R.; NASCIMENTO, E.S. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos

utilizados no Brasil. Rev. Bras. Ciên. Farm., v. 42, n. 2, p. 289 – 306, 2006.
VALADARES, M.C. Avaliação de toxicidade aguda: Estratégias após a “Era do Teste

DL50”. Rev Eletôn Farm, v.3, p.93-98, 2006.
VAN-CAUTEREN, H. The toxicological properties of itraconazole. In: FROMTLING, R.A.

(Ed.), Recent Trends in the Discovery, Development, and Evaluation of Antifungal
Agents. JR Prous, Barcelona, p. 263–271, 1987.
84
VEIGA JUNIOR, V.F.; ROSAS, E.C.; CARVALHO, M.V.; HENRIQUES, M.G.M.O.;

PINTO, A.C. Chemical composition and anti-inflammatory activity of copaiba oils from
Copaifera cearensis Huber ex Ducke, Copaifera reticulata Ducke and Copaifera multijuga
Hayne. A comparative study. J. Ethnopharmacol., v.112, p. 248–254, 2007.
VEIGA JUNIOR, V.F.; ZUNINO, L.; PATITUCCI, M.L.; PINTO, A.C.; CALIXTO, J.B.
The inhibition of paw oedema formation caused by the oil of Copaifera multijuga Hayne and
its fractions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v.58, p.1405–1410, 2006.
VEIGA-JÚNIOR, V. F, et al. Phytochemical and antiedematogenic studies of commercial

copaiba oils available in Brazil. Phytot. Res. v. 15, p. 476-480, 2001.
VEIGA-JÚNIOR, V. F. et al. Utilização de cromatografia gasosa de alta resolução na

detecção de classes de terpenos em extratos brutos vegetais. Quim. Nov., v. 18, n. 03, p. 262-
266, 1995.
VEIGA-JÚNIOR, V. F.; PINTO, A. C. O gênero Copaifera L. Quím. Nov., v. 25. n. 2, p.

273-286, 2002.
VEIGA-JÚNIOR, V. F; PINTO, A. C. Plantas medicinais: cura segura? Quim. Nov., v. 28, n.

3, 519-528, 2005.
VENEZIANI, R. S., et al. Antibacterial actvity and synergistic effect investigation of

terpenoids from Copaifera langsdorffii Desf. against cariogenic bacteria." Planta Med, v.76,
n.12, p. 1321-1321, 2010.
VILLAS BÔAS, G.K.; GADELHA, C.A.G. Oportunidades na indústria de medicamentos e a

lógica do desenvolvimento local baseado nos biomas brasileiros: bases para a discussão de
uma política nacional. Cadernos de Saúde Pública, v.23, n.6, 2007.
WAGNER, J.D.A. A importância dos produtos de origem natural no atendimento à saúde.

Fórum de Debates– Fitomedicamentos e Produtos Naturais. São Paulo, Brasil, 2002.
WALLER, D.P. Methods in ethnopharmacology. J Ethnopharmacol, v.38, p.189-195, 1993.

WEBSTER, W.S.; FREEMAN, J.A.D. Is this drug safe in pregnancy? Reproductive
Toxicology., v. 15, p. 619–629, 2011.
WHO (World health organization) 2002. Traditional medicine strategy 2002-2005.

http://whqlibdoc.who.int/hq/2002/ WHO_EDM_TRM_2002.1.pdf. Acesso em out de 2013.
WU, K. M; GHANTOUS, H.; BIRNKRANT. Current regulatory toxicology perspectives on

the development of herbal medicines to prescription drug products in the United States. Food
Drug Toxicol., v. 46, n. 46, p. 2606-2610, 2008.
YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a

necessidade do desenvolvimento da indústria de fi toterápicos e fi tofármacos no Brasil.
Quím. Nova, v.24, p.147-152, 2001.
85
ZIECH, R. E., et al. Antimicrobial activity of copaiba oil (Copaifera reticulata) against
coagulase positive Staphylococcus of canine otitis. Pesquisa Veterinaria Brasileira, v.33,
n.7, p. 909-913, 2013.
ZOGHBI, M.G.B.; ANDRADE, E.H.A.; MARTINS-DA-SILVA, R.C.; TRIGO, J.R.

Chemical variation in the volatiles of Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae) growing
wild in the States of Pará and Amapá, Brazil. J. Essent. Oil Res., v.21, p. 501–503, 2009b.
ZOGHBI, M.G.B.; LAMEIRA, O.A.; OLIVEIRA, E.C. Seasonal variation of oleoresin and
volatiles from Copaifera martii Hayne growing wild in the State of Pará, Brazil. J. Essent.
Oil Res., v.19, p. 504–506, 2007.
ZOGHBI, M.G.B.; MARTINS-DA-SILVA, R.C.V.; TRIGO, J.R. Volatiles of oleoresins of

Copaifera paupera (Herzog) Dwyer, C. piresii Dwyer and C. pubiflora Benth. (Leguminosae).
J. Essent. Oil Res., v.21, p. 403–404, 2009a.
FORBES, V.E.; FORBES, T.L. Ecotoxicology in Thory and Practice. Chapman and Hall.
Londres, p 247. 1994.
FRITZ, H.; GIESE, K. Evaluation of the Teratogenic Potential of Chermicals in the rat.
Pharmacology, v.40, p.1-28, 1990.
GILDEN, N.; BODEWITZ, H. Regulating teratogenicity as a health risk. Social Science &
Medicine, v.32, n.10, p.1191-1198, 1991.
HOLTEZ, F. B.; PESSINI, G.L.; SANCHES, N.R.; CORTEZ, D.A.G.; NAKAMURA, C.V.;
DIAS FILHO, B.P. Screening of somo plants used in the Brazilian folk medicine for the
tratment of infectious diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 97, p. 1027-1031, 2002.
KOLA, I; FOLB, P. Chlorpromazine inibtis the mitotic índex, cell number, and the formation
of blastocyst, and delas implantation of CBA mouse embryos. J, Reprod. Fert., v. 79, p.527-
537, 1986.
LACY, A,; O’KENNEDY, R. Studies on Coumarins and Coumarins-Related Compounds to

Determine their Therapeutic Role in the Treatment of Cancer. Curr Pharm Des. , v.10, n.30,
p. 3797-811, 2004.
LAPA, A.J.; CADEN, S.; LIMA-LANDMAN, M.T.R.; LIMA, T.C.M. Métodos de avaliação
da atividade farmacológica de plantas medicinais. Salvador: Sociedade Brasileira de
farmacologia e Terapêutica Experimental (SBFTE), p.74, 2001.
LATHER, A.; VALECHA, R.; SHARMA, K.; GARG, M. World wide potential of plants
causing teratogenicityan overview. Spatula DD., v.1 n.2, 101-106, 2011,
LEMÔNICA, I.P. Teratogênese experimental e sua aplicação em humanos. In: SPRITZER,

D.T.; SANSEVERINO, M.T.V.; SCHÜLER-FACCINI, L. (Eds). Manual de teratogênese.
Porto Alegre: UFRGS, p.19-39, 2001.
LOEBSTEIN, R.; LALKIN, A.; KOREN, G. Pharmacokinetic changes during pregnancy and
their clinical relevance. Clin Pharmacokinet., v. 33, n. 5, p. 328-323.
86
MARLIÉRE, L.D.P.; RIBEIRO, A.; BRANDÃO, M.G.L.; KLEIN, C.H.; ACURCIO, F.A.
Utilização de fitoterápicos por idosos: resultados de um inquérito domiciliar em Belo
Horizonte (MG), Brasil. Rev. Bras. Farmacogn., v. 18, p. 754-760, 2008.
MCMANAMAN, J.L.; NEVILLE, M.C. Mammary physiology and milk secretion. Advanced
Drug Delivery Revies, v. 55, n. 5, p. 629-641, 2003.
MELLO, J.R.B.; LANGELOH, A. avaliação da toxidade reprodutiva e teratogenicidade. In

RHODEN, E.L.; RHODEN, C.R (Eds). Princípios e técnicas em experimentação animal.
Porto Alegre: UFRGS, p. 455-464, 2006.
MOORE, K.L; PERSAUD, T.V.N. Embriologia Básica. Ed. Elsevier Brasil, 2008.
NAROTSKY, M.G.; KAVLOCK, R.J. A multidisciplinar approach to toxicological

screening: II developmental toxicity. Journal of Toxicology Enviromental Health, v. 45, n. 2,
p. 145-171, 1995.
OUEDRAOGO, M.; BAUDOUX, T.; STÉVIGNY, C.; NORTIER, J.; COLET, J.M.;
EFFERTH, T. FAN, Q.U.F.; ZHOG, J.; CHAN, K.; SHAW, D.; PELKONEN, O.; DUEZ, P.
Review of current and “omics” methods for assessing the toxicity (genotoxicity,
teratogenicity and nephrotoxicity) of herbal medicines and mushrooms. J. Ethnopharmacol.,
v. 140, n. 3, p. 492-512, 2012.
PETERS, P.W.J. Developmental toxicology: adequacy of current meyhods. Food Additives

and Contaminants, v.15, n.1, p.55-65, 1998.
PIERSMA, A.H. Alternative Methods for Developmental Toxicity Testing. Basic & Clinical
Phamacology & Toxicology, v. 98, n.5, p. 427-431, 2006.
ROZMAN, K.K.; KLAASSEN, C.D. Absorption, distribution, and excretion of toxicants.

In: KLAASSEN, C.D. (Ed) Casarett and Doll’s toxicology: the basic Science of poisons 6th
ed, New York: Mc Graw-Hill, p. 107-132, 2001.
SCHÜLER-FACCINI.; LAVÍNIA.; SCHWARTZMAN.; LUIZA.; CECCHIN, CLAUDIA

RAFAELA. Teratogênese humana e o SIAT. In: Sanseverino MTV, Spritzer DT, Schuler-
Faccini L. (org). Manual de Teratogênese. Porto Alegre: Editora da
Universidade/UFRGS,p.11-17, 2001.
SHAHJAHAN, M.; SABITHA, K.E.; JAINU, M.; DEVI, C.S.S. Effect of Solanum
trilobatum against carbono tetrachloride induced hepatic damage in albimo rats. Indian J
Med Res., v. 120, n.1, p.194-198, 2004.
SILVEIRA, P.F.; BANDEIRA, M.A.M.;ARRAIS, P.S.D. Farmacovigilância e reações

adversas às plantas medicinais e fitoterápicos: Uma realidade. Rev. Bras Farmacogn., v.18,
p. 618-626, 2008.
SMITHELLS, R.W.; NEWMAN, C.G.H. Recognition of thalidomide defects. J. Med.
Genet., v.29, p. 716-723, 1992.
87
TCHAMADEU, M.C; DZEUFIET, P.D.D.; NANA, P.; KOUAMBOU, N. C.C.;

NGUEGUIM, T.F. ALLARD, J.; BLAES, S.N.R.; ZAPFACK, L.; GIROLAMI, J.P.; TACK,
I.; KAMTCHOUING, P.; DIMO, T. Acute and sub-chronic oral toxicity studies of na aqueus
stem bark extract of Pterocarpus soyauxii Taub (Papilionaceae) in rodents. J
Ethnopharmacol., v. 133, n.2, p. 329-3, 2011.
WILLS, P.J.; ASHA, V.V. Acute and subacute toxicity of Lygodium flexuosum extracts in
rats. Asian Pacific J Trop Biom, v.2, n.1, p. 200-202, 2012.
88
4 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Avaliar toxidade subcrônica e reprodutiva, em ratos (Linhagem Wistar), do óleoresina

de copaíba (Copaifera duckei Dwyer) e do creme vaginal contendo o óleoresina.
3.2 ESPECÍFICOS
- Identificar o perfil cromatográfico do óleoresina por CG-EM;

- Quantificar o marcador presente no óleoresina;
- Análisar as variáveis que indiquem toxidade subcrônica (machos e fêmeas);
- Comparar os efeitos da formulação e das diferentes vias de administração;
- Investigar variáveis que indiquem toxidade aguda nas progenitoras e nas lactantes;
- Avaliar a performance reprodutiva materna;
- Avaliar os efeitos do óleoresina no período pré-natal (pré-implantação, pós-
implantação e desenvolvimento fetal);
- Avaliar os efeitos do óleoresina no período pós-natal (lactação);
- Investigar variáveis que indiquem embriofetotoxidade;
- Comparar os efeitos das diferentes doses administradas;
- Analisar a teratogenicidade (anomalias e/ou malformações externas e internas);
- Avaliar o desenvolvimento geral e sexual das progênies expostas ao óleoresina no
período perinatal (in útero) e pós-natal (lactação);
89
CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

90
RESUMO
A padronização da matéria-prima de origem vegetal que constituirá o produto final, quanto

aos constituintes fitoquímicos e a caracterização de seus marcadores, é de suma importância
para que seja garantida a ação terapêutica. Portanto, este estudo teve como objetivo
caracterizar fitoquímicamente o óleoresina de Copaifera duckei Dwyer (ORCD) por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Utilizou-se
Cromatógrafo Gasoso 6850 Agilent® acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Avaliou-se dois métodos de esterificação, um descrito por Hartman e Lago (H&L) e outro
pela IUPAC, com algumas adaptações do Manual de Métodos Analíticos do Instituto Adolfo
Lutz. Utilizou-se 100 mg do ORCD, submetida a esterificação pelo método IUPAC. As
amostras esterificadas foram comparadas com uma amostra não esterificada, diluída apenas
em hexano, para avaliar se ocorrem perdas ou degradações das substâncias pelo método
empregado. O método de esterificação descrito por H&L apresentou baixa resolução para o
trans-cariofileno e de acordo com os dados da espectroteca Wiley, a amostra esterificada pelo
método H&L difere quanto à composição das amostras não esterificadas e das esterificadas
pelo método IUPAC, as quais possuem composição muito semelhante. Portanto, o Método
H&L foi descartado para o preparo de amostra do ORCD, pois se mostrou insatisfatório
quanto ao isolamento do marcador e existem indícios que tal método cause degradação dos
componentes. Já o método IUPAC, apesar de aparentemente não causar alterações nos
componentes da amostra e apresentar ótima resolução do marcador, foi necessário avaliar sua
interferência sobre o marcador trans-cariofileno. No presente estudo, as técnicas empregadas
foram eficazes, uma vez que possibilitaram a separação dos componentes do ORCD. A
espectrômetria de massas forneceu o perfil de fragmentação, que possibilitou identificar os
constituintes presentes no ORCD, e a partir das análises obtidas, definiu-se como marcador
fitoquímico/farmacológico, o cariofileno, por estar disponível comercialmente, e por ser
utilizado como padrão em diversos trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba, e por
ser responsável por várias ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba. A amostra
do ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5%), o que representa uma
faixa adequada para quantificação pelos métodos propostos.
Palavras-chave: óleoresina de Copaifera duckei, cromatografia gasosa acoplada a

espectrometria de massas (CG-EM), esterificação, cariofileno.
91
ABSTRACT
The standardization of the raw material of vegetable origin that will constitute the final
product, the phytochemical content and the characterization of their markers, it plays an
important role so that the therapeutic action can be assured. Therefore, this study had as
objective to characterize phytochemically the C. duckei oleoresin Dwyer (ORCD) through gas
chromatography coupled with mass spectrometry (CG-IN). It was used Gas Chromatograph
6850 Agilent® coupled to the Mass Spectrometer 5973 (CG-IN). Two esterification methods
were evaluated, one described by Hartman and Lake (H&L) and the other one by IUPAC,
with some adaptations from Analytical Methods Guideline of the Instituto Adolfo Lutz. 100
mg of ORCD was used, submitted to the esterification by the method IUPAC. The esterified
samples were compared with a non-esterified sample, which was only diluted in hexane, in
order to evaluate if there are losses or degradations of the substances because of the employed
method. The esterification method described by H&L showed low resolution for the trans-
caryophyllene, according to the data of the espectroteca Wiley, the esterified sample by the
method H&L differs for the composition, in comparison to the non-esterified samples and of
the esterified ones through the method IUPAC, which have very similar composition.
Therefore, the Method H&L was discarded for the preparation of the ORCD sample, because
it was shown unsatisfactory for the isolation of the marker and indications, that such method
causes degradation of the components. Although the method IUPAC, apparently did not cause
changes in the components of the sample and it showed a great resolution of the marker, it
was necessary to evaluate its interference on the trans-caryophyllene marker. In the present
study, the employed techniques were effective, once it was possible the separation of the
components of ORCD. The spectrometry of masses provided the fragmentation profile, which
enabled to identify the present constituents in ORCD, and from these analyses, the
caryophyllene was defined as phytochemical / pharmacological marker, once it is available
commercially, and because it is used as pattern for several studies of quantification of the
copaiba oleoresin, and it is responsible for several pharmacological actions described to the
copaiba oleoresin. The sample of ORCD presented caryophyllene content around 0.5 µg/mL
(0,5%), what represents an appropriate strip for quantification for the proposed methods.
Keywords: C. duckei oleoresin, gas chromatography coupled with mass spectrometry (CG-
IN), esterification, caryophyllene.
92
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais têm sido utilizadas desde a antiguidade para o tratamento de

uma variedade de doenças e com o passar do tempo, algumas delas tiveram suas propriedades
terapêuticas identificadas (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005). Esse conhecimento passou a ser
propagado de geração em geração, fazendo parte da cultura popular. O óleo de copaíba, por
exemplo, vem sendo utilizado tradicionalmente pelas comunidades da região amazônica como
cicatrizante, antisséptico e anti-inflamatório, apresentando elevado valor econômico (VEIGA-
JÚNIOR; PINTO, 2002; NEWTON et al., 2012). Suas propriedades terapêuticas já vêm sendo
descritas nas farmacopéias britânica e americana desde longa data (MAIMOM, 2000).
Atualmente o conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos da
novos produtos farmacêuticos (STUPP et al., 2008). Neste contexto, diversas áreas do
conhecimento estão envolvidas na pesquisa de novas substâncias ativas oriundas de plantas,
tal como a fitoquímica, que isola, purifica e caracteriza os princípios ativos; a etnobotânica e a
etnofarmacologia, que buscam informações a partir do conhecimento de diferentes povos e
etnias; e a farmacologia e toxicologia, que estudam os efeitos fisiológicos causados pelos
constituintes químicos nos organismos, sejam eles benéficos e/ou maléficos.
A investigação fitoquímica é uma área de estudo de grande importância, pois o
isolamento de princípios ativos e a modificação química destes podem resultar na descoberta
de novos compostos com aplicação terapêutica. Outro aspecto é que o estudo fitoquímico
pode contribuir na classificação das plantas, em função dos seus constituintes químicos,
fornecendo subsídios nos estudos de quimiotaxonomia (POSER; MENTZ, 2004). A
identificação botânica das copaibeiras, utilizando as características das flores, é difícil, dado o
curto período em que ocorrem e a elevada altura das árvores (TAPPIN et al., 2004).
As árvores pertencem ao gênero Copaifera L., família Fabaceae Lindl, subfamília
Caesalpiniodea Kunth. No território brasileiro ocorrem mais de vinte espécies do gênero
Copaifera, podendo predominar uma espécie em determinada região, no entanto, comumente
coexistem várias que são adaptadas aos diversos climas brasileiros (CASCON; GILBERT,
2000; LEITE et al., 2001; VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002). Essas árvores exudam um
óleoresina chamado de óleo de copaíba, cujas propriedades biológicas são amplamente
descritas na literatura (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002; VEIGA JUNIOR et al., 2001; LIMA
et al., 2003). Óleoresinas são soluções naturais de resinas dissolvidas em óleos essenciais,
93
acumuladas em um tipo de aparelho secretor constituído por bolsas e/ou canais secretores
esquizógenos (MACEDO; LANGENHEIM 1989). Em espécies de Copaifera a fração de óleo
essencial é composta basicamente de sesquiterpenos, predominante na maioria deles, e a
fração resina de ácidos diterpênicos (VEIGA-JÚNIOR. et al., 1995).
A composição fitoquímica da fração sesquiterpênica é bastante variável, no entanto,

geralmente o β-cariofileno e seu óxido são os constituintes majoritários (LEANDRO et al.,
2012). A variação dessa fração está relacionada a fatores bióticos externos, tais como a injúria
provocada por insetos ou fungos (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). Um exemplo seria a
produção de β-cariofileno, que é particularmente efetivo contra lepidópteros, e do óxido de
cariofileno, que atua diretamente na inibição de fungos (HUANG et al., 2012; PINTO-
ZEVALLOS et al., 2013). Além dos sesquiterpenos são relatados trinta e cinco diterpenos que
possuem esqueletos caurano (6 compostos), labdano (16 compostos) e clerodano (13
compostos). Desses compostos, vinte e três são encontrados na forma ácida e doze como
álcoois e diterpenos neutros (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005).
Apesar da extensa literatura sobre óleos de copaíba, poucas referências discriminam a

espécie de Copaifera que está sendo estudada. Somente oito espécies tiveram seus óleo-resina
estudados: C. multijuga Hayne, C. duckei Dwyer, C. cearenses Huber ex Ducke, C.
langsdorfii Desf., C. officinalis L., C. reticulata Ducke, C. paupera e C. guianensis Desf.,
destas apenas as três primeiras são endêmicas do Brasil (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005).
Oliveira et al. (2006) relatam que as maiores produções de óleo de C. reticulata e C. duckei
coincidem com o período de menor precipitação pluviométrica e a menor produção ocorre,
principalmente, no período mais chuvoso. Variações sazonais e a variabilidade química inter e
intra-espécies apontam para a necessidade de se estabelecer padrões de controle deste
óleoresina (VEIGA-JÚNIOR, 1997; CASCON; GILBERT, 2000). Segundo Langenhein
(2003), a variação na composição química do óleoresina de Copaifera pode influenciar a ação
farmacológica e a toxidez dos produtos que o utilizam em suas composições, podendo
comprometer o controle de qualidade.
Veiga-Júnior et al. (1997) desenvolveram métodos analíticos, baseados no uso das

técnicas de Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) e Cromatografia Gasosa de
Alta Resolução acoplada à Espectrometria de Massa (CG-EM), para controle da autenticidade
do óleoresina de copaíba. Teores totais dos sinais majoritários de diversas amostras estudadas
por Tappin et al. (2004) totalizaram pouco menos de 50% da composição do óleo. Isso indica
94
a complexidade da composição das amostras desse óleoresina quanto às substâncias

minoritárias, detectadas, mas de difícil quantificação.
Nos diversos óleoresinas de copaíba estudados, os sesquiterpenos predominantes são

-copaeno, -cariofileno, -bisaboleno,  e -selineno, -humuleno, δ e γ-cadineno, β-
bisabolol e α- elemeno (WENNINGER et al., 1967; FERRARI et al., 1971; CRAVEIRO et
al., 1981; VEIGA-JÚNIOR, 1997; VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002; MACIEL et al., 2002;
CARVALHO et al., 2005). O -cariofileno possui comprovada ação anti-inflamatória,
antibacteriana, antifúngica e antiedêmica e o -bisaboleno com propriedades descritas como
anti-inflamatórias e analgésicas (VEIGA-JUNIOR; PINTO, 2002; OLIVEIRA et al., 2006;
OLIVEIRA et al., 2006; RAMOS, 2006).
Estudo realizado por Lameira et al. (2009), com C. duckei, detectou o β-cariofileno,
variando de 13,0-15,5%, 25,1-50,2% e 50,1-61,8%, nas amostras de óleosresina de três
árvores. Apesar deste estudo ter demonstrado uma variação sazonal, na composição química
da fração volátil dessa espécie, este composto está presente em todas as espécies de
Copaifera. Carvalho et al. (2005) realizaram análise cromatográfica do óleo resina de C.
duckei, sendo 63.6 % composta por sesquiterpenos (2,2 % β-elemeno, 5,0 % β-cariofileno,
14,7 % α-bergamoteno e 27,4 % β-bisaboleno) e 36,4 % por ácidos diterpênicos (13,5 % kaur-
16-en-19-óico, 8,3 % kauran-19-óico, 4,1 % copálico, 6,9 % poliáltico e 2,6 % ácido eperu-
8(17)-en-15,18-dióico). Considerando a estrutura dos ácidos diterpênicos, 22,8 % foram
ácidos tetracíclicos da série dos cauranos e 13,6 % da série dos labdanos bicíclicos (6,9 %
furano labdano).
Maistro et al. (2005) também analisaram a proporção de distribuição dos terpenos no

óleo resina desta espécie. Foi detectada a presença de 7,2 % de hidrocarbonetos
sequiterpenos, 1,8 % de diterpernos neutros não identificados e 92,2 % de ácidos diterpênicos.
Entre os componentes sesquiterpenicos destacou-se o trans-β-cariofileno (4.5%), trans-α-
bergamotene (1,0 %), α-humuleno (0,7 %), e β-bisabolene (1,0 %) e entre os diterpenos os
ácidos copálico (3,7 %), polialtico (27,1 %) e hardwickiic (59,3 %).
Dentro do aspecto de desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos, com
finalidade terapêutica, a tríade qualidade, segurança e eficácia são imprescindíveis (BRASIL,
2004a; ANVISA; RATES, 2001; WHO, 2002; LAPA et al., 2010). A análise do óleoresina
em CG-EM auxilia na identificação dos constituintes de relevância farmacológica e
toxicológica presentes no óleoresina. Além disso, respalda ,analiticamente, a formulação
95
quanto a qualidade do produto. Os objetivos deste estudo foram analisar e padronizar o

óleresina de Copaifera duckei (ORCD) por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria
de massas (CG-EM) para submeter ao desenvolvimento farmacotécnico e aos ensaios de
toxidade subcrônica (capítulo 2) e toxidade reprodutiva (capítulo 3 e 4).
96
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL
O óleoresina de copaíba usado nesta análise, para o desenvolvimento da formulação e

nos ensaios de toxidade subcrônica (capítulo 2) e toxidade reprodutiva (capítulos 3 e 4), foi
obtido da empresa Beraca, situada em Ananindeua, no estado do Pará, que tem como foco o
uso dos produtos da biodiversidade Amazônica. A pesquisa e o desenvolvimento de seus
produtos são realizados em parceria com universidades localizadas na região. Segundo o
laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).
2.2 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA

(CG-EM)
A análise do óleoresina foi realizada em São Paulo, no Laboratório Farmacêutico

Almeida Prado Ltda, situado na cidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. Para a determinação
dos componentes deste ORCD, utilizou-se cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM), segundo o método descrito por Adams (1995).
Para fins de controle de qualidade do ORCD foi necessário definir um marcador para
ser monitorado e poder garantir a qualidade do produto em questão. O marcador utilizado no
monitoramento da qualidade do produto foi a substância, que segundo dados da literatura
(LEANDRO et al., 2012; SOUZA-BARBOSA et al., 2013), é a substância responsável pela
ação farmacológica preconizada e ainda, que tem disponibilidade de padrões comerciais.
A substância considerada marcadora do óleoresina é o sesquiterpeno trans-cariofileno
(C15H24; PM 204).
2.2.1 Parâmetros do equipamento CG-EM
2.2.1.1 Dados do equipamento
Cromatógrafo Gasoso 6850 Agilent® acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-

EM).
97
2.2.1.2 Condições da análise
Gás carreador Hélio, fluxo de 1,5 mL/min., temperatura do injetor 270º C, forno 120º
C, detector 300º C. Coluna capilar DB -1,25 m x 0,32 mm, 0,25 µm. Volume de injeção de
1,0 µL, modo split 20:1. Rampa de aquecimento: 120º C por 2 min., aquecimento de 3º C por
min até 160º C, e 8º C/min até 290º C mantendo-se por 5 min. A amostra foi lida em modo
Scan, com 40 - 600 AMU.
Para se chegar a estes valores, foram testados empiricamente vários valores de rampa
de aquecimento e volume de injeção, divisão de amostra, até se obter um cromatograma com
os picos bem resolvidos e com reprodutibilidade de abundância entre as injeções.
2.2.1.3 Identificação dos compostos
Após a injeção da amostra foi gerado um cromatograma que relaciona tempo e

abundância do sinal obtido, ou seja, do pico cromatográfico. O tempo em que cada pico foi
gerado é referido como tempo de retenção (TR) e é característico para cada composto em
condições constantes de análise. Utilizando o detector espectrômetro de massas, obteve-se o
perfil de fragmentação dos compostos.
As figuras 1 e 2 representam o cromatograma do padrão de trans-cariofileno e seu
respectivo espectro de fragmentação.
A b u n d a n c e
T IC : B 2 .D \ d a ta .m s
6 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0
4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0
T im e - - >
Figura 1. Cromatograma do padrão trans-cariofileno obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850

(Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
98
A b u n d a n c e
S c a n 4 6 1 (6 .0 1 3 m in ) : B 2 . D \ d a t a . m s
1 3 3
9 0 0 0
9 3
8 0 0 0
7 0 0 0
6 0 0 0
1 0 5
1 6 1
5 0 0 0 7 9 1 2 0 1 4 7
4 1
4 0 0 0
3 0 0 0
1 8 9
5 5 6 7
2 0 0 0
1 7 5
2 0 4
1 0 0 0
2 6 3 2 7 8
0
4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0
m / z -->
Figura 2. Perfil de fragmentação do padrão trans-cariofileno, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850

(Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
2.2.2 Preparo da amostra
Os produtos naturais necessitam de um preparo prévio antes de ser injetado no CG-

EM, pois é necessário que a substância seja volátil e apolar para que seja arrastada pela fase
móvel, caso contrário, ficará retida na coluna do equipamento. No caso do ORCD, os
sesquiterpenos já possuem volatilidade e característica apolar adequada à análise, porém os
ácidos diterpênicos, que representam a fração resinosa do óleo, necessitam ser esterificados
para se tornarem mais voláteis e apolares. Geralmente as técnicas de preparo de amostra
visam uma pré-purificação que direciona a análise ao composto alvo, concentrando-o ou
eliminando interferentes ou produtos que possam causar danos ao equipamento. Ao mesmo
tempo, é necessário que o preparo da amostra não interfira no composto alvo, ou seja, que
preserve o marcador trans-cariofileno.
No presente estudo foram avaliados dois métodos de esterificação, um descrito por
Hartman e Lago (1973) (H&L) e outro pela IUPAC, n. 2.301 (1987), com algumas adaptações
descritas no Método 2 do Manual de Métodos Analíticos do Instituto Adolfo Lutz (2005).
Para quantificar o ORCD, foi adotada a técnica de “padrão externo”, utilizando como
marcador o padrão de trans-cariofileno, grau analítico (análise quantitativa) obtido da
empresa Sigma Aldrich®. A quantificação foi realizada pelo método de padronização externa,
que consiste na construção de uma curva de calibração com um padrão de um composto
presente na amostra, e assim determinar a concentração do determinado composto na amostra
através de cálculos matemáticos.
99
2.2.2.1 Quantidade de partida
Utilizou-se 100 mg de ORCD (0,100 g), submetida a esterificação pelo método

IUPAC. O volume final obtido foi de 25 mL, que corresponde, teoricamente, a uma
concentração de 4 mg/mL do ORCD. Essa análise foi realizada em triplicata, e o resultado
final foi expresso pela média das leituras obtidas.
2.2.2.2 Construção da curva de calibração
Para construção da curva de calibração, foram realizadas seis diluições com o padrão
trans-cariofileno, como se segue:
Foram preparadas quatro “soluções estoques” com o padrão de trans-cariofileno
(Quadro 1). A partir destas soluções foram preparadas outras diluições denominadas
“soluções de trabalho” (Quadro 2). Tanto as “soluções estoque” quanto as ”soluções de
trabalho” foram utilizadas na construção da curva de calibração (Quadro 3).
As concentrações propostas para construção da curva de calibração apresentaram
linearidade adequada (Figura 3). Estas concentrações também estão dentro do limite de
quantificação do método, que foi de 2,5 ng/mL.
30000000
Abundância (área do pico)
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Concentração µg/mL
Figura 3. Curva de calibração do padrão trans-cariofileno, coeficiente de correlação 0,997975237;

inclinação da reta 3,58189E-05.
100
Quadro 1. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano
Padrão de trans- [ ] em µL de trans-

Solução estoque de Hexano
cariofileno puro cariofileno padrão
trans-cariofileno (a ser adicionado)
(a ser adicionado) por mL de hexano
A 1 µL 1,000 µL 1 mL 1,00 µL/mL
B 1 µL 10,000 µL 10 mL 0,10 µL/mL
C 1 µL 5,000 µL 5 mL 0,20 µL/mL
D 1 µL 2,000 µL 2 mL 0,50 µL/mL
Quadro 2. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano

Tipo e quantidade de Hexano [ ] em µL de trans-
Soluções de
Solução estoque a ser cariofileno padrão
trabalho (a ser adicionado)
adicionada por mL de hexano
1 A 10 µL 1 mL 0,01 µL/mL
2 B 1 mL 1 mL 0,05 µL /mL
3 B B B 0,10 µL/mL
Quadro 3. Pontos da curva de calibração e suas correspondentes concentrações

[ ] de trans- [ ] µL de trans-
Pontos da
Soluções cariofileno em cariofileno padrão
curva
nL/mL por mL de hexano
1 1 10,0 0,010 µL/mL
2 2 50,0 0,050 µL /mL
3 3 ou B 100,0 0,10 µL/mL
4 C 200,0 0,2 µL/mL
5 D 500,0 0,5 µL/mL
6 A 1000,0 1,0 µL/mL
Estas soluções foram armazenadas em refrigerador (4º C) até o momento da análise.

As diluições do padrão foram preparadas em triplicata e injetadas. Com os valores das médias
101
de cada ponto, construiu-se a curva utilizando o software chemstation, que integra os picos
cromatográficos (correlacionando à área obtida com a concentração correspondente do
padrão) e a partir daí, calculou-se a concentração do marcador na amostra. Os dados da
relação área/concentração ficam a disposição para serem utilizados em outras bases de dados
para cálculos mais específicos, como análise estatística.
102
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Óleoresinas de copaíba, quimicamente, podem ser definidos como soluções de ácidos

diterpênicos em um óleo essencial constituído majoritariamente por sesquiterpenos
(CASCON; GILBERT, 2000). Do ponto de vista biológico, é um produto de excreção ou
desintoxicação do organismo vegetal, e funciona como defesa da planta contra animais,
fungos e bactérias (VEIGA JR.; PINTO, 2002).
A cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) é uma das
técnicas mais importantes que se dispõe para análise de misturas complexas voláteis e de
baixo peso molecular. Segundo Siqueira (2003), a CG-EM está cada vez mais presente nas
análises de rotina dos laboratórios de química de produtos naturais e no setor de controle de
qualidade dos laboratórios farmacêuticos. Este fato deve-se, principalmente, ao método ser
rápido e reprodutível.
Na literatura, a utilização da técnica de CG-EM para análise qualitativa e quantitativa
do óleoresina de copaíba tem-se tornado rotineira (VEIGA-JR, 1997; RIGAMONTE-
AZEVEDO, 2004; TAPPIN, 2004; BIVALTI, 2006; LEANDRO et al.,2012; SOUZA-
BARBOSA et al., 2013). As amostras esterificadas foram comparadas com uma amostra não
esterificada, diluída apenas em hexano, para avaliar se ocorrem perdas ou degradações das
substâncias pelo método empregado. Na Figura 4, está representado o cromatograma obtido
pelo método H&L. O marcador cariofileno está evidenciado em um pico de baixa resolução e
pouca abundância em relação aos outros componentes da amostra.
A Figura 5 representa o cromatograma da amostra esterificada pelo método IUPAC e a
Figura 6 a amostra ORCD sem esterificar. É possível observar que as aparências destes dois
cromatogramas são muito semelhantes e ambos apresentam como pico mais abundante e bem
resolvido, o cariofileno.
103
A b u n d a n c e
T IC : C O P A IB A 1 0 M I - 1 M L .D \ d a ta .m s
1 4 0 0 0 0 0
1 3 0 0 0 0 0
1 2 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
CARIOFILENO
5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0
T im e - - >
Figura 4. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificada pelo método H&L, obtido
em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Abundance
T I C : C E M 2 S P 5 0 -1 . D \ d a t a . m s
8000000
7000000
CARIOFILENO
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0
T im e -->
Figura 5. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificado pelo método IUPAC,
obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
104
A b u n d a n c e
T I C : C O P N E S P 5 0 - 1 . D \ d a t a . m s
8 0 0 0 0 0 0
7 5 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
6 5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 CARIOFILENO
5 5 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0
T im e - - >
Figura 6. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (RF 3340) não esterificado, obtido em

Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
O método de esterificação descrito por H&L apresentou baixa resolução para o trans-
cariofileno e de acordo com os dados da espectroteca Wiley, a amostra esterificada pelo
método H&L difere quanto à composição das amostras não esterificadas e das esterificadas
pelo método IUPAC, as quais possuem composição muito semelhante (Quadro 4). Portanto, o
Método H&L foi descartado para o preparo de amostra do ORCD, pois se mostrou
insatisfatório quanto ao isolamento do marcador e existem indícios que tal método cause
degradação dos componentes. Já o método IUPAC, apesar de aparentemente não causar
alterações nos componentes da amostra e apresentar ótima resolução do marcador, foi
necessário avaliar sua interferência no marcador trans-cariofileno.
Para isto foi submetido 1 µL do padrão de trans-cariofileno à esterificação por tal
método, sendo comparado o cromatograma obtido com o cromatograma do padrão diluído
apenas em hexano. Este ensaio revelou que o padrão de trans-cariofileno não sofreu alteração
significativa quando submetido a esterificação pelo método IUPAC (Figuras 7 e 8).
105
Quadro 4. Composição do óleoresina de C. duckei e os respectivos tempos de retenção (TR)

conforme o tratamento da amostra: esterificado (H&L), esterificado (IUPAC) e não esterificado.
Óleo-resina - H&L Óleo-resina – IUPAC Óleo-resina - Não esterificado
RT COMPOSTO RT COMPOSTO RT COMPOSTO
5,027 Benzene 4,544 Cyclohexene 4,556 Cyclohexene
β- ememeno
5,422 4,754 α -Cubebene 4,766 α-Cubebene
/ciclohexano
1R,3Z,9S-
2,6,10,10-
6,179 Tetramethylbicyclo 5,218 α-Copaene 5,231 α-Copaene
[7.2.0]undeca-2,6-
diene
6,402 Caryophyllene 5,422 Cyclohexane 5,434 Cyclohexane/ β-elemene
6,624 γ-1-cadinene 5,651 3H-3a,7-Methanoazulene, 5,670 α-Gurjunene
7,076 Naphthalene 5,842 Trans-Caryophyllene 5,861 Trans-Caryophyllene
α.-Muurolene;
7,140 5,988 Caryophyllene 6,007 Caryophyllene
Naphthalene
1-ethenyl-1-methyl-2-
α.-Muurolene; (1-methylethenyl)-4-(1-
7,591 6,185 6,204 γ-Elemene
Naphthalene methylethylidene)-
bicyclogermacrene
β-Bisabolene;
7,833 6,293 trans-α-Bergamotene 6,312 trans-.α.-Bergamotene
Cyclohexene
1H-
7,967 6,624 α -Caryophyllene 6,643 α.-Humulene
Benzocycloheptene
δ-Cadinene;
8,107 6,777 1H-Cycloprop[e]azulene 6,789 1H-Cycloprop[e]azulene
Naphthalene
8,418 δ-Selinene 7,076 Naphthalene 7,095 Naphthalene
8,622 cis-α-bisabolene 7,171 Germacrene D 7,197 Germacrene-D
1H-Cycloprop[e]azulene,
decahydro-
9,156 - 7,286 α-Selinene 7,311
1,1,7-trimethyl-4-
methylene
4,5-dimethyl-11-
9,875 - 7,521 4,7-Methanoazulene 7,540 methylenetricyclo[7.2.1.0(
4.9)]dodecane
1,251 - 7,846 β-Bisabolene 7,629 α-Muurolene
10,524 - 8,126 δ -Cadinene 7,871 δ -Bisabolene
10,759 - 8,635 cis-α-bisabolene 8,151 γ-Cadinene
11,179 γ -Cadinene 8,921 Germacrene B 8,666 cis-α-bisabolene
Patchoulene /α-
11,873 9,366 Caryophyllene oxide 8,953 Germacrene B
Copaene
12,025 - 10,384 - 9,398 Caryophyllene oxide
12,738 - 21,225 Palmitic acid-methyl Ester 10,422 Fonenol
14,519 28,687 Linoleic acid, methyl Ester
Palmitic acid-
21,002
methyl Ester
106
A b u n d a n c e
T IC : P C M 2 .D \ d a ta .m s
8 0 0 0 0 0 0 6 .0 1 9
7 5 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 CARIOFILENO
6 5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
ÓXIDO DE CARIOFILENO
1 5 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
9 .4 3 7
5 0 0 0 0 0
5 .8 7 0
8 .7 0 1
4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0 3 2 .0 0
T im e - - >
Figura 7. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, esterificado pelo método IUPAC, obtido em

A b u n d a n c e
T IC : P C 1 U L 5 M L .D \ d a ta .m s
7 5 0 0 0 0 0 5 .9 9 4
7 0 0 0 0 0 0
CARIOFILENO
6 5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
ÓXIDO DE
1 5 0 0 0 0 0
CARIOFILENO
1 0 0 0 0 0 0
9 .3 8 5
5 0 0 0 0 0
5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0
T im e - - >
Figura 8. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, não esterificado, obtido em Cromatógrafo

Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
107
As possíveis interferências do método de esterificação IUPAC foram analisadas, pela

leitura de uma amostra branco do mesmo, ou seja, procedendo a metodologia de esterificação
sem adicionar nenhum componente e realizando a leitura da fração hexânica no cromatógrafo.
Este ensaio demonstrou que não existem substâncias do método que interferem na análise
cromatográfica (Figura 9).
A b u n d a n c e
T I C : B R A N C O M E T 2 . D \ d a t a . m s
8 5 0 0 0
8 0 0 0 0
7 5 0 0 0
7 0 0 0 0
6 5 0 0 0
6 0 0 0 0
5 5 0 0 0
5 0 0 0 0
4 5 0 0 0
4 0 0 0 0
3 5 0 0 0
3 0 0 0 0
2 5 0 0 0
2 0 0 0 0
1 5 0 0 0
1 0 0 0 0
5 0 0 0
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0
T im e -->
Figura 9. Cromatograma do Branco utilizado no método de esterificação IUPAC, obtido em

O ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5 %), o que
representa uma faixa adequada para quantificação pelo método proposto. Na Figura 10 pode
ser observado o cromatograma e a análise quantitativa de uma das amostras. No presente
estudo, a técnica de análise foi eficaz, uma vez que possibilitou a separação dos componentes
da amostra. O espectrômetro de massas forneceu o perfil de fragmentação, que possibilitou
identificar os constituintes presentes no óleoresina C. duckei (ORCD). Dados da literatura já
relataram a descrição de, aproximadamente, cem sesquiterpenos e trinta e sete ácidos
diterpênicos, desconsiderando duplicidades ocasionadas pelo uso de nomes IUPAC e usual
(VEIGA JR.; PINTO, 2002; LEANDRO et al., 2012). O marcador utilizado neste estudo, o β-
cariofileno, além de estar disponível comercialmente, é utilizado como padrão em diversos
trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba. Esse composto é responsável por várias
108
ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002;

TAPPIN 2004; LEANDRO et al., 2012; SOUZA-BARBOSA et al., 2013).
A b u n d a n c e
T I C : D I L 2 5 A 1 . D \ d a t a . m s
6 5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
5 5 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0
T im e - - >
Figura 10. Cromatograma e análise quantitativa do óleoresina de C. duckei, obtido em Cromatógrafo

Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).
Segundo a pesquisa realizada por Rigamonte-Azevedo (2004), o cariofileno é o

terpenóide encontrado com maior freqüência (100%) nos óleos de copaíba estudados. Por
isso, o teor de cariofileno nos óleos de copaíba deve ser monitorado, para certificar a
qualidade desse produto. Neste estudo, o teor encontrado foi de 0,5 % (0,5 µg/mL), que
corresponde a um teor adequado, tanto para ser utilizada como marcador do fitomedicamento
como para ser detectado pelo método proposto, o de esterificação da IUPAC. A análise do
óleoresina em CG-EM, portanto, certifica a qualidade desse produto (CASCON; GILBERT,
2000).
Souza-Barbosa et al. (2013) analisaram a composição fitoquímica de 22 amostras de
óleoresina de C. multijuga Hayne por GC-FID e GC-EM e um total de 35 compostos
componentes foram identificados, sendo o sesquiterpeno β-cariofileno e óxido de cariofileno
encontrados em maiores quantidades. Estudo realizado por Lameira et al. (2009), com C.
duckei, detectou o β-cariofileno, variando de 13,0-15,5%, 25,1-50,2% e 50,1-61,8%, nas
109
amostras de óleoresinas de três árvores. Apesar desse estudo ter demonstrado uma variação
sazonal, na composição química da fração volátil dessa espécie, este composto está presente
em todas as espécies de Copaifera, sendo assim, foi escolhido como marcador de qualidade
do produto aqui estudado.
O β-cariofileno é um sesquiterpeno bicíclico natural que está presente, como maior
constituinte, em diversos óleos essenciais, utilizados na medicina tradicional, tal como o óleo
de cravo (GOIRIS et al., 2002; GRAMOSA; SILVEIRA, 2005). Esses óleos essenciais
inibem o crescimento de algumas bactérias, leveduras e fungos (ALMA et al., 2003; HONG
et al., 2004; LOURENS et al., 2004; SABULAL et al., 2006; SAROGLOU et al., 2007).
Quanto aos demais compostos, as ações terapêuticas já foram descritas, tal como, atividade
antifúngica do óxido de cariofileno, antitumoral do ácido hardwickiico e atividade
antitripanossômica do ácido copálico (LEANDRO, 2012; VEIGA JR.; PINTO, 2002) e,
portanto, têm sido usados em uma variedade de produtos farmacêuticos e alimentares
(GOIRIS et al., 2002).
Pieri et al., (2009) descreveram que os componentes sesquiterpênicos, β-bisaboleno e
β-cariofileno, e outros hidrocarbonetos têm ação cicatrizante, potencial anti-séptico,
antibacteriano, germicida, expectorante, diurético e analgésico. Outras ações, também, têm
sido atribuídas ao óleoresina de Copaifera spp. tal como, vasorrelaxante, citotóxica e
embriotóxica.
110
4 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos nas análises realizadas, pode-se sugerir as seguintes
conclusões:
 No presente estudo, a técnica de esterificação H&L foi eficaz, uma vez que possibilitou
a separação dos componentes da amostra. A espectrômetria de massas forneceu o perfil
de fragmentação, que possibilitou identificar os constituintes presentes no óleoresina C.
duckei (ORCD);
 A partir das analises obtidas, definiu-se como marcador fitoquímico/farmacológico, o
β-cariofileno, por estar disponível comercialmente, e por ser utilizado como padrão em
diversos trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba, e por ser responsável por
várias ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba;
 A amostra do ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5 %), o
que representa uma faixa adequada para quantificação pelos métodos propostos.
111
5 REFERÊNCIAS
ALMA, M. H. et al. Screening chemical composition and in vitro antioxidant and

antimicrobial activities of the essential oils from Origanum syriacum L. growing in Turkey.
Biol. PharmBull, v. 26, p. 1725–1729, 2003.
ADAMS R.P. Identification of essential oil components by gas chromatography/ion trap

mass spectrometry. Carol Stream: Allured Pub., 1995. 469p.
BIAVATTI, M. W et al. Análise de óleos-resinas de copaíba: contribuição para o seu controle

de qualidade, Rev. Bras. Farmacog. v. 16, n. 2, p. 230-235, 2006.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia para a

condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessários ao
desenvolvimento de medicamentos. Brasília, versão-2, 31 de janeiro de 2013. Disponível em:
www.anvisa.gov.br. Acesso em: 07 de março de 2014.

10 mar. 2014.

10 mar. 2014.
CARVALHO, J.C.T. et al. Topical antiinflammatory and analgesic activities of Copaifera

duckei dwyer. Phytoth. Research, v. 19, p. 946-950, 2005.
CASCON, V.; GILBERT, B. Characterization of the chemical composition of oleoresins of

Phytochem., v. 55, n. 7, p. 773-778, 2000.
CRAVEIRO, A. A.; ALENCAR, J. W.; MACHADO, M. J. W. Óleos Essenciais de Plantas

do Nordeste: UFC, Fortaleza, 1981, p. 79.
FERRARI, M. et al. Terpenoids from Copaifera langsdorffii. Phytochem., v. 10, p. 905-907,

1971. Geneva: World Health Organization, 74 p.
GOIRIS, K. et al. The oxygenated sesquiterpenoid fraction of hops in relation to the spicy hop
character of beer. J. Inst. Brew., v. 108, p. 86–93, 2002.
GRAMOSA N. V.; SILVEIRA, E. R. Volatile constituents of Copaifera langsdorffii from the

Brazilian Northeast. J. Essent. Oil. Res., v. 17, p. 130–132, 2005.
HARTMAN, L.; LAGO, R.C.A. Rapid preparation of fatty acid methyl esters from lipids.
Lab. Pract., v.22, p.475-476, 1973.
112
HONG, E. J. et al. Antibacterial and antifungal effects of essential oils from coniferous trees.
Boil. PharmBull., v. 27, p. 863–866, 2004.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos Físico-Químicos para Analise de Alimentos. 4ª

ed. 2005.
LAMEIRA, O. A.; MARTINS-DA-SILVA, R. V. C.; ZOGHBI, M.G.B; OLIVEIRA, E. C. P.

Seasonal Variation in the Volatiles of Copaifera duckei Dwyer Growing Wild in the State of
Pará –Brazil. J. Essen. Oil Res., v. 21, p. 105-107, 2009.
LANGENHEIN, J. H. Plant resins: chemistry, evolution, ecology and ethnobotany. Timber

Press, Portland, p. 586, 2003.
LAPA, A. J. et al. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C. M. O,

SHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R
(org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6.ed. Porto Alegre/Florianópolis:
Editora da UFRGS/Editora da UFSC, p. 247-262, 2010.
LEANDRO, L.M.; VARGAS, F.S.; BARBOSA, P.C.S.; NEVES, J.K.O.; SILVA, J.A.;
VEIGA JUNIOR, V.F. Chemistry and biological activities of terpenoids from copaiba
(Copaifera spp.) oleoresins. Molecules, v. 17, p. 3866-3889, 2012.
LEITE, A. et al. Recomendações para o manejo sustentável do óleo de copaíba, UFAC/

SEFE: Rio Branco, 2001.
LIMA, S. R. M. et al. In vivo and in vitro studies on the anticancer activity of Copaifera
multijuga Hayne and its fractions. Phytother. Res., v. 17, p. 1048–1053, 2003.
LOURENS, A. C. et al. In vitro biological activity and essential oil composition of four
indigenous South African Helichrysum species. J. Ethnopharmacol., v. 95, p. 253–258,
2004.
MACEDO, C. A.; LANGENHEIM, J. H. Intrand inter-plant sesquiterpene variability in

Copaifera langsdorfii: elation to microlepidopteran herbivory. Biochem. System. Ecol., v.
17, p. 551–557, 1989.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA-JÚNIOR, V.F.; GRYNBERG, N.F.;

ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Revista
Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429- 438, 2002.
MAIMOM, D. Estudo de mercado de matéria-prima: Corantes naturais (cosméticos,

indústria de alimentos), conservantes e aromatizantes, bioinsetisidas e óleos vegetais
essenciais (cosméticos e oleoquímica). Belém/PA: SUDAM/PNUD, 2000. (Relatório Final).
MAISTRO, E. L. et al. In vivo evaluation of the mutagenic potential and phytochemical

characterization of oleoresin from Copaifera duckei Dwyer. Gen. Mol. Biol., v. 28, n. 4, p.
833-838, 2005.
113
OLIVEIRA, E. C. P.; LAMEIRA, O. A.; ZOGHBI, M. G. B. Identificação da época de coleta

do óleorresina de copaíba (Copaifera spp.) no município de Moju, PA. Rev. Bras. Pl. Med.,
v. 8, n. 3, p. 14-23, 2006.
PIERI, F.A.; MUSSI, M.C.M.; MOREIRA, M.A.S. Óleo de copaiba (Copaifera sp.):
histórico, extração, aplicações industriais e propriedades medicinais. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, v. 11, p. 465-472, 2009.
RAMOS, M.F.S. Desenvolvimento de microcápsulas contendo a fracão volátil de copaíba por

spray-drying: estudo de estabilidade e avaliação farmacológica. 132p. Tese (Doutorado em
Ciências Farmacêuticas) - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
RATES, S. M. K. Plants as source of drugs. Toxicon., v. 39, p. 316–603, 2001.
RIGAMONTE-AZEVEDO, O. C. et al, Variabilidade química e física do óleorresina de

Copaifera spp. no sudoeste da amazônia brasileira, Rev. bras. ol. fibros., v. 8, n. 2/3, p. 851-
861, 2004.
SABULAL, B. et al. Caryophyllene-rich rhizome oil of Zingiber nimmonii from South India:
chemical characterization and antimicrobial activity. Phytochem., v. 67, p. 2469–2473, 2006.
SAROGLOU, V. et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of six
Hypericum species from Serbia. Biochem. Syst Ecol., v. 35, p. 146–52, 2007.
Souza, B. P. C. ; MOREIRA, W. L. S. ;DA SILVA, M. R. ;DE TARSO, B. S. P. ;VIEIRA,

G. ; FLORÊNCIO, V.J.V. Phytochemical fingerprints of copaiba oils (Copaifera multijuga
Hayne) determined by multivariate analysis. Chem Biodivers v. 10, n. 4, p. 1350-60, 2013.
TAPPIN, M. R. R. et al. Análise química quantitativa para a padronização do óleo de copaíba

por cromatografia em fase gasosa de alta resolução. Quim. Nov., v. 27, n. 2, p. 236-240,
2004.
VEIGA JÚNIOR, V.F.; PINTO, A.C. O gênero Copaifera L. Quím. Nov., v. 25. n. 2, p. 273-
286, 2002.
VEIGA-JÚNIOR, V. F, et al. Phytochemical and antiedematogenic studies of commercial

copaiba oils available in Brazil. Phytot. Res. v. 15, p. 476-480, 2001.
VEIGA-JÚNIOR, V. F. et al. Utilização de cromatografia gasosa de alta resolução na

detecção de classes de terpenos em extratos brutos vegetais. Quim. Nov., v. 18, n. 03, p. 262-
266, 1995.
VEIGA-JÚNIOR, V. F.; PATITUCCI, M. L.; PINTO A. C. Controle de autenticidade de

óleos de copaíba comerciais por cromatografia gasosa de alta resolução. Quim. Nov., v. 20, n.
6, p. 612-615, 1997.
VEIGA-JÚNIOR, V.F. Controle de Qualidade de Óleos de Copaíba por Cromatografia

Gasosa de Alta Resolução. 1997. 89 p. Dissertação (Mestrado em química orgânica) -
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, 1997.
114
WENNINGER, J. A.; YATES, R. L.; DOLINSKY, M. Sesquiterpene hydrocarbons of

commercial copaiba balsam and American cedarwood oil. J. Amer. Oil. Chem. Soc., v. 50,
p. 1304-1313, 1967.
WHO. World Health Organization. 2002. Traditional Medicine Strategy 2002 - 2005.
115
CAPÍTULO 2: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO

ÓLEORESINA E DO DO CREME VAGINAL DE C. duckei Dwyer
116
RESUMO
As infecções do trato genital baixo têm sido a causa mais frequente de consulta ginecológica.
Com base na aplicação do óleoresina de copaíba C. duckei (ORCD) e do creme vaginal do
óleoresina de copaíba (CVORCD), esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos tóxicos
em fase de tratamento subcrônico desses produtos. Foram utilizados ratos (Rattus
norvegicus), linhagem wistar (machos e fêmeas), com peso médio de 145 a 220g que foram
tratados por via oral (v.o) e intravaginal (i.v). Os grupos tratados receberam a dose de 320
mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com ORCD (v.o - ORCD), ORCD via vaginal
(i.v - ORCDV) e creme vaginal do ORCD (i.v - CVORCD). Os grupos controles foram
tratados com 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg do creme vaginal base (i.v - CVB). O
tratamento subcrônico por 22 dias com ORCD e o CVORCD não provocou sinais clínicos de
toxicidade, nenhuma morte foi registrada e não alterou o desenvolvimento ponderal dos
animais. As fêmeas tratadas com ORCD, por via oral, apresentaram maior ingestão de água,
mas o consumo de ração não foi diferente em machos e em fêmeas. O uso do CVORCD não
alterou a ingestão de água das fêmeas, mas alterou o consumo de ração. O ORCDV foi capaz
de provocar efeito hipoglicemiante e elevação dos níveis séricos de creatinina. Os parâmetros
hematológicos dos animais (machos e fêmeas) não foram alterados pelo uso oral do ORCD
(320 mg/kg). O uso do CVORCD alterou o hematócrito, os linfócitos e a concentração de
hemoglobina. O uso do CVORCD e ORCDV, por via intravaginal, não alteraram os
parâmetros bioquímicos das ratas. As fêmeas tratadas, por via oral, com ORCD (320 mg/kg)
apresentaram algum tipo de suscetibilidade específica ao uso (elevação do colesterol total,
HDL e FA). A elevação dos níveis séricos das enzimas AST e ALT não foi atribuída ao uso
do ORCD por via oral e intravaginal e o uso do CVORCD, bem como os produtos presentes
na formulação do creme vaginal base (CVB).
Palavras-chave: Óleoresina, Copaifera duckei, creme vaginal, toxicidade subcrônica, não

clínico.
117
ABSTRACT
The infections of the lower genital tract have been the most frequent cause of gynecological
consultation. Based on the application of the oleoresin of copaiba C. duckei (ORCD) and of
the vaginal cream of the copaiba oleoresin (CVORCD), this study had as objective to evaluate
the toxicity in the subchronic treatment phase of these products. Mice were used (Rattus
norvegicus), wistar lineage (males and females), with a medium weight of 145 to 220g which
were treated orally (v.o) and intravaginal (i.v). The treated groups received a dose of 320
mg/kg, 40 mg/kg and 28 mg/kg, respectively, with ORCD (v.o - ORCD), ORCD vaginally
(i.v - ORCDV) and vaginal cream of ORCD (i.v - CVORCD). The control groups were
treated with 0,5 mL of distilled water (v.o) and 220 mg of the cream vaginal base (i.v - CVB).
The subchronic treatment for 22 days with ORCD and CVORCD did not cause clinical signs
of toxicity, no death was registered and it did not change the weight development of the
animals. The female rats treated with ORCD, orally, presented a higher ingestion of water, but
the ration consumption was not different among male and female rats. The use of CVORCD
did not alter the ingestion of water of the female ones, but it changed the ration consumption.
ORCDV was capable to cause effect hypoglycemic effect and rising of the serum creatinine
levels. The hematological parameters of the animals (male and female) were not changed by
the oral use of ORCD (320 mg/kg). The use of CVORCD changed the hematocrit, the
lymphocytes and the hemoglobin concentration. The use of CVORCD and ORCDV, through
intravaginal, did not change the biochemical parameters of the female rats. The female rats,
which were treated orally, with ORCD (320 mg/kg) presented some type of specific
susceptibility to the use (elevation of the total cholesterol, HDL and FA). The rising of the
serum levels of the enzymes AST and ALT was not related to the use of ORCD orally and
intravaginal and the use of CVORCD, as well as the present products in the formulation of the
vaginal cream base (CVB).
Keywords: Oleoresin, Copaifera duckei, vaginal cream, subchronic toxicity, non-clinical.

118
1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais - os metabólitos secundários das plantas - tornaram-se agentes

terapêuticos e/ou profiláticos úteis na prática medicinal (CARVALHO, 2004). Segundo
alguns autores, os vegetais possuem um sistema imunológico rudimentar que proporciona o
desenvolvimento de meios de defesa química contra o ataque de bactérias, fungos,
protozoários, insetos e outros animais (ALENCAR, 1982; CARVALHO, 2004). O óleo de
copaíba tem sido utilizado na medicina tradicional popular e silvícola para diversas
finalidades, desde a época da chegada dos portugueses ao Brasil. Há na literatura estudos que
comprovam propriedades antinflamatórias, cicatrizantes, antissépticas e mesmo bactericidas,
sendo, entretanto, referidos efeitos adversos como náuseas, vômitos e diarreia se utilizado,
principalmente, em doses elevadas.
As copaibeiras são árvores comuns à América Latina e África Ocidental
(FRANCISCO, 2005). No Brasil são encontradas nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e
Amazônica. A altura dessas árvores varia entre 25 e 40 metros (ARAÚJO-JÚNIOR et al.,
2005) e o diâmetro entre 0,4 e 4 metros. Possuem folhagem densa, casca aromática, flores
pequenas e frutos secos. As sementes são pretas e ovóides com um arilo amarelo, rico em
lipídeos. Do tronco da árvore da copaíba é extraído um óleoresina, de cor que varia,
dependendo da espécie, de amarelo a marrom (ALENCAR, 1982; XENA; BERRY, 1998).
O óleo de copaíba é um produto natural, composta de uma parte sólida, resinosa não
volátil, formada por ácidos. Esses ácidos são responsáveis por 55 a 60 % do óleo, diluída na
outra parte, um óleo essencial, composto de sesquiterpenos, que podem ser divididos em
sesquiterpenos oxigenados (álcoois) e hidrocarbonetos sesquiterpênicos (CASCON;
GILBERT, 2000; MACIEL et al., 2002; RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004). Por ser um
exudato constituído por ácidos resinosos e compostos voláteis, a designação correta para o
óleo de copaíba é a de óleoresina (VEIGA-JUNIOR et al., 2005).
A concentração e natureza dos diterpenos e sesquiterpenos presentes no óleoresina
extraído pode variar de acordo com as variações de espécies, fatores biológicos, como insetos
e fungos, ou fatores abióticos (VEIGA-JUNIOR et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2006;
RAMOS, 2006). A época de coleta também pode influenciar na concentração de seus
constituintes, embora alguns estudos com o uso da Copaifera duckei não tenham apresentado
diferença significativa na composição de óleos extraídos das mesmas árvores, em épocas
sazonais diferentes (CASCON; GILBERT, 2000).
119
As infecções do trato genital baixo têm sido a causa mais frequente de consulta
ginecológica (50-70% das queixas). Acredita-se que toda mulher sexualmente ativa já tenha
tido pelo menos um episódio de vaginose bacteriana e/ou vulvovaginite. Diversas doenças
microbianas (bacteriana, viral ou fúngica) são relatadas na literatura. Em muitos casos, os
responsáveis pelas infecções, bacterianas e fungicas, adquirem resistência ao medicamento
administrado, e por este motivo grande número de antibióticos e/ou quimioterápicos tem sido
desenvolvido (KOSHI; CHERIAN, 1995).
O aumento da resistência das bactérias e fungos aos antibióticos/quimioterápicos
convencionais tem estimulado intensos esforços para desenvolver novos agentes
antimicrobianos eficazes. Desta forma, os produtos naturais podem ser usados como
alternativa aos antimicrobianos atuais. Este cenário tem despertado o interesse da classe
científica e da indústria farmacêutica, sobretudo, nas moléculas de origem vegetal, já que as
plantas possuem grande potencial em sintetizar substancias químicas com estruturas
diversificadas, como sistema de defesa contra os agentes patogênicos (RODRIGUES et al.,
1997). Contudo, para que sejam efetivas como agentes antimicrobianos, as substâncias
precisam ser produzidas e acumuladas em concentrações suficientes nos órgãos e sítios
intracelulares, e se são efetivas em tecidos vegetais poderão ser efetivas em tecidos animais
(SANTOS, 1998).
O óleoresina de copaíba é um dos mais conhecidos produtos fitoterápicos amazônicos,
sendo reconhecido pela sua grande utilização na medicina popular, devido à sua propriedade
de restaurar mucosas, principalmente no caso de inflamações ginecológicas (FRANCISCO,
2005) e ação desinfectante de secreções no trato pulmonar humano. Tem propriedades
diuréticas, o que explica seus efeitos benéficos nas cistites (BRITO et al, 2001). Assim,
também é utilizado no tratamento da leucorréia e blenorragia por via tópica (cápsulas
vaginais) e por via oral, pois o óleo é eliminado por via renal e tem trânsito uretral (BRITO et
al., 2001). Atualmente, o conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos da
novos produtos farmacêuticos. Apesar da existência de vários cremes vaginais no mercado, o
óvulo de copaíba nunca deixou de ser utilizado pela população (LIMA et al., 2011).
Na literatura já foram descritos ao óleoresina de copaíba, efeito anti-inflamatório
(CARVALHO et al., 2005; BIAVATTI et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2008;
KOBAYASHI et al., 2011), analgésico (VEIGA-JUNIOR; PINTO, 2002; OLIVEIRA et al.,
2005; CARVALHO et al., 2005; PACHECO et al., 2006), antimicrobiano (VEIGA-JÚNIOR
120
et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2006; PACHECO et al., 2006; NAKAMURA et al., 2008;
SANTOS et al., 2009; PIERI et al., 2012), antibacteriano e bacteriostático (VEIGA-JUNIOR;
PINTO, 2002; DRUMOND et al., 2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005; FREIRE et al., 2006;
SOUZA et al., 2011; PIERI, 2012), anti-helmíntico e tripanomicida (CAVALCANTI NETO
et al., 2005; BIAVATTI et al., 2006; IZUMI et al., 2012), antifúngico, antineoplásico
(VEIGA- JÚNIOR; PINTO, 2002; PEDREIRA, 2007; SANTOS et al., 2009), antitetânico
(BRITO et al., 2000), cicatrizante (EURIDES et al., 1998; BRITO et al., 1999; ESTEVÃO et
al., 2009), antitumoral (MACIEL et al., 2002; LIMA et al., 2003; RIGAMONTE-AZEVEDO
et al. 2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005; OLIVEIRA et al, 2006; PACHECO et al., 2006),
germicida (BLOISE, 2003), expectorante (BRITO et al., 2000; MACIEL, et al., 2002;
RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004; BRITO et al., 2005; FREIRE et al., 2006; RAMOS,
2006) e diurético (MACIEL et al., 2002; FREIRE et al., 2006; SILVA et al., 2006).
Outras indicações também são conhecidas e citadas, como a ação antiviral (VEIGA-
JUNIOR; PINTO 2002), repelente, larvicida e inseticida (MACIEL et al., 2002; GERIS et al.,
2008; PROPHIRO et al., 2012; KANIS et al., 2012), sífilis (PACHECO et al., 2006),
antiblenorrágico, antileucorréico e cercaricida (MACIEL et al., 2002; RIGAMONTE-
AZEVEDO et al., 2004). Outras ações referentes aos óleos de copaíba também têm sido
descobertas, como a de vasorelaxante, citotóxico e embriotóxico (COSTA-LOTUFO et al.,
2002), com o isolamento do diterpeno, ácido caurenóico, também capaz de acumular além de
atividade anti-inflamatória e protetora de colite induzida por ácido acético (PAIVA et al.,
2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005).
Lima-Silva et al. (2009) pesquisaram o efeito do óloresina de C. langsdorffii, na
isquemia e reperfusão de retalhos cutâneos ranzomizados no dorso de ratos e, notaram
discreta ação anti-lipoperoxidativa, intensa ação anti-oxidante e atividade anti-inflamatória. A
ação farmacológica dos óleos de Copaifera sp. é atribuída à estrutura química de seus
constituintes (LIMA-NETO et al., 2008, SANTOS et al., 2009), que tem como principais
componentes responsáveis os hidrocarbonetos sesquiterpênicos, especialmente o β-bisaboleno
e β-cariofileno (VEIGA-JUNIOR; Pinto, 2002; OLIVEIRA et al., 2005; VEIGA-JUNIOR et
al., 2005; RAMOS, 2006). Porém, o exato mecanismo de ação desses compostos ainda não
está bem elucidado (BRITO et al., 2001; WESTPHAL et al., 2007; SOUZA et al., 2011).
Desta forma, é importante ressaltar que a população já utiliza este óleoresina para
diversos fins terapêuticos, contudo, existe a necessidade de trabalhos que esclareçam melhor a
segurança deste fitoterápico. Lima et al (2011) realizaram um estudo, performance
121
reprodutiva, de ratas prenhas submetidas ao tratamento com o creme vaginal de ORCD

(óleoresina de Copaifera duckei). Os resultados deste estudo demonstraram ausência de
toxidade materna e embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a
dose que será usada em humanos. Estudos de toxicologia reprodutiva dessa magnitude são
importantes dar subsídios à prescrição médica para mulheres gestantes. Com base na
aplicação desse creme vaginal do ORCD, esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos
tóxicos em fase de tratamento subcrônico.
122
2.1 MATERIAL
Foi obtido da empresa Beraca, situada em Ananindeua, no estado do Pará, que tem
como foco o uso dos produtos da biodiversidade Amazônica. A pesquisa e o desenvolvimento
de seus produtos são realizados em parceria com universidades localizadas na região.
Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD). A
análise do ORCD em CG-EM está descrito no capítulo 1.
O creme vaginal de copaíba (CVORCD) e o creme base (CVB) foram obtidos no
Laboratório Farmacêutico ALMEIDA PRADO LTDA, situado na cidade de São Paulo, São
Paulo, Brasil, na concentração de 2,5% e disponibilizado em frascos de polietileno.
2.2 ASPECTOS ÉTICOS
Antes do início das atividades no Biofármacos do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), o projeto de tese foi
submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Amapá,
recebendo o número 008A/2011 (APÊNCIDE A).
2.2.1 Animais
Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus), linhagem wistar (machos e fêmeas), com
peso médio de 145 a 220g, provenientes do Biotério da Universidade Federal de Juiz de Fora,
Minas Gerais. Após a chegada dos animais no laboratório Biofármacos do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), estes passaram
por um período de adaptação e foram mantidos em sala com umidade e temperatura
controlada, em torno de 23oC ± 2oC, com ciclo de 12 horas de claro/escuro, com água e ração
ad libitum.
123
2.2.2 Vias de administração e doses utilizadas
Para o estudo da toxidade em fase de tratamento subcrônico (22 dias de tratamento) foi
empregada a via oral (v.o com cânula para gavagem) e via vaginal (v.v com micropipeta). Os
grupos tratados receberam a dose de 320 mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com
óleoresina de C. duckei (v.o), óleoresina de C. duckei (v.v) e creme vaginal do óleoresina de
C. duckei (v.v). Para os grupos controles foi utilizado 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg
do creme vaginal base (v.v).
2.2.3 Grupos experimentais
Os 35 animais foram divididos, aleatoriamente, de acordo com o tipo de tratamento.

Assim, 20 animais foram divididos em dois grupos (n=10/grupo, sendo 5 machos e 5 fêmeas)
e tratados via oral, com o óleoresina de C. duckei e água destilada (ORCD e Controle). Os
outros 15 animais (fêmeas) foram divididos em três subgrupos (n=5/grupo), que receberam
tratamento via vaginal, o creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD), outro
somente com o óleoresina de C. duckei (ORCDV) e o grupo controle apenas com o creme
vaginal base (Controle CVB).

ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL)
2.3.1 Desenvolvimento ponderal e consumo de água e ração
Os animais foram pesados a cada 5 dias (d1, d5, d10, d15, d20), utilizado balança
Gehaka BG4000, com capacidade de 4200 g e precisão de 0,1 g. O consumo de água e ração
foi mensurado, diariamente, desde o início do tratamento até o d20, utilizando-se proveta e a
balança, respectivamente. Diariamente, foi oferecido 100g de ração e 250 mL de água ao
grupo.
124
2.3.2 Coleta da amostra
Após o término do tratamento, os animais foram submetidos ao jejum de 12 horas, e

após, foram anestesiados com tiopental sódico (35 mg/kg, i.p). A coleta de 5 mL de sangue foi
realizada pela veia porta-hepática, sendo acondicionado em dois tipos de tubos: um com
anticoagulante EDTA para determinação dos parâmetos hematológicos e outro, sem
anticoagulante, para obtenção do soro e avaliação dos parâmetros bioquímicos.
Posteriormente, procedeu-se a eutanásia por deslocamento cervical.
2.3.3 Avaliação dos parâmetros bioquímicos
Para análise bioquímica, o material foi centrifugado a 3.500 rpm durante 10 minutos,
para separar o soro dos elementos figurados do sangue. Posteriormente, procedeu-se a
dosagem das enzimas plasmáticas, como aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT), do colesterol total e a fração HDL, triglicérides, fosfatase alcalina,
albumina, glicose e creatinina, utilizando kits BIOCLIN® (ensaios enzimáticos colorimétricos
e cinéticos colorimétricos) e o equipamento multiparamétrico (Alizé) da Biomérieux.
2.3.4 Avaliação dos parâmetros hematológicos
Para análise hematológica, fez-se o hemograma completo, determinando os

valores de hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, plaquetas e os índices
hematimétricos, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e
concentração de hemoglobina corpuscular média (HCM), utilizando analisador automático de
células hematológicas HumaCount Plus. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em
extensões coradas com May-Grunwald-Giemsa, em cada ensaio, 100 células foram analisadas
e contadas.
2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos nas diversas análises foram expressos em média  erro padrão da
média (média ± E.P.M) de cada grupo experimental. Para comparar os dados do consumo de
água, ração e desenvolvimento ponderal, empregou-se o teste “t” de Student (não pareado).
125
Para a análise bioquímica e hematológica, aplicou-se o teste de Mann-Withney. Para análise

dos grupos tratados por via vaginal, foi utilizado ANOVA, seguido do teste de Tukey. O nível
de significância considerado foi de 5% (p< 0.05). Os softwares utilizados foram o Instat
GraphPad® e Prism GraphPad®.
126

ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL)
3.1.1 Desenvolvimento ponderal, consumo de água e ração
Durante o tratamento, não foram observados sinais clínicos de toxidade e

nenhuma morte foi registrada. O ORCD não alterou o desenvolvimento ponderal dos animais
(machos e fêmeas) nos 22 dias de tratamento, pois não houve diferença estatística
significativa entre os grupos controle e tratados com o óleoresina pela via oral (ORCD 320
mg/kg) (Figura 1).
300
Controle (Machos)
ORCD 320 mg/Kg (machos)
massa corporal (g)
250 Controle (fêmeas)

ORCD 320 mg/Kg (Fêmeas)
200
150
1 5 10 15 20
Tempo (dias)
Figura 1. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e água
destilada (Controle) sobre o desenvolvimento ponderal de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.
Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo).
A ingestão diária de água foi maior nos grupos tratados com óleoresina (ORCD 320
mg/kg) por via oral, tanto nos machos como nas fêmeas, contudo foi significativo somente
entre as fêmeas (Figura 2). O consumo diário de ração foi maior nos grupos controles
(machos e fêmeas), mas não houve significância estatística entre os grupos (Figura 3).
127
40
Controle (machos)
* ORCD 320 (machos)
30
Controle (fêmeas)
Água (mL)
ORCD 320 mg/Kg (Fêmeas)

20
10
destilada (Controle) sobre o consumo diário de água de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os
valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05.
25
Controle (machos)
20 ORCD 320 mg/Kg (machos)
Controle (fêmeas)
Ração (g)
15 ORCD 320 mg/Kg (Fêmeas)
10
0
destilada (Controle) sobre o consumo diário de ração de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os
valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo).
Apesar da ingestão diária de água ser maior nos grupos tratados com ORCD (machos e
fêmeas), somente no grupo das fêmeas este fato pode estar relacionamento ao tratamento,
apontando, talvez, maior suscetibilidade específica das fêmeas. Sachetti et al. (2009) ao
estudar a toxidade, aguda oral, do óleoresina de C. reticulata (300 e 2000 mg/kg) em ratas
Wistar, não observaram diminuição no peso corpóreo e sinais clínicos de toxidade, assim
como alteração no consumo de ração. Em relação ao tratamento subcrônico do CVORCD por
via vaginal, não houve alteração no desenvolvimento ponderal das fêmeas tratadas CVORCD,
somente do grupo tratado com ORCDV, sem significância estatística (Figura 4).
128
230
Controle CVB
220 Tratado CVORCD 28 mg/Kg
massa corporal (g)
210 Tratado ORCDV 40 mg/Kg
200
190
180
170
1 5 10 15 20
Tempo (dias)
Figura 4. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (Tratado

CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. duckei (Tratado ORCDV 40 mg/kg) e creme vaginal base
(Controle CVB) sobre o desenvolvimento ponderal de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam
a média ± E.P.M (n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05 grupo
ORCDV comparado ao grupo CVORCD.
O consumo diário de água não foi diferente entre os grupos tratados (CVORCD 28
mg/kg e ORCDV 40mg/kg) e Controle CVB (Figura 5). Todavia, a ingestão de ração foi
maior no grupo tratado (CVORCD 28 mg/kg). Foi observado, também, diferença entre o
grupos CVORCD 28 mg/kg e tratado, unicamente, com o óleoresina de copaíba (ORCDV
40mg/kg) (Figura 6).
30
Controle CVB
CVORCD 28 mg/Kg
20 ORCDV 40 mg/Kg
Água (mL)
10
Figura 5. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD 28

mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o
consumo diário de água de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M
(n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao
grupo CVORCD.
129
20
Controle CVB
* CVORCD 28 mg/Kg
15
ORCDV 0.04 mg/Kg
Ração (g)
**
10
0
Figura 6. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD 28
mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o
consumo diário de ração de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M
(n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao
grupo CVORCD.
3.1.2 Avaliação dos parâmetros bioquímicos
O tratamento subcrônico com o óleoresina de C. duckei, por via oral, demonstrou

alterações na dosagem de alguns parâmetros bioquímicos nas fêmeas (colesterol total = 76.8 ±
2.2, HDL = 37.1 ± 1.5 e FA = 112.6 ± 16.6). Estes parâmetros estiveram mais elevados, se
comparados ao grupo controle. Observou-se, nos grupos tratados, diminuição da glicemia
(83.3 ± 4.2 e 52.7 ± 10.0) e aumento significativo, dos níveis séricos de creatinina (0.5 ± 0.0 e
1.2 ± 0.3), repectivamente, em machos e fêmeas (Tabela 1). O ORCDV e o CVORCD, não
alteram os parâmetros bioquímicos das ratas, pois não houve diferença significativa, se
comparadas ao grupo Controle CVB (Tabela 2).
130
Tabela 1. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e água
destilada (Controle) sobre os parâmetros bioquímicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.
FÊMEAS MACHOS
Controle ORCD 320 mg/kg Controle ORCD 320 mg/kg
AST (U/L) 241.6 ± 50.0 304.0 ± 9.2 193.2 ± 27.6 198.4 ± 29.3
ALT (U/L) 83.6 ± 22.1 95.0 ± 21.7 53.0 ± 4.8 50.6 ± 6.0
Colesterol total
66.5 ± 1.8 76.8 ± 2.2* 61.6 ± 3.3 67.8 ± 8.0
(mg/dL)
Colesterol HDL
27.9 ± 1.0 37.1 ± 1.5* 31.6 ± 1.2 30.0 ± 2.0
(mg/dL)
Triglicerídeos
82.0 ± 4.5 75.0 ± 7.2 55.5 ± 2.3 56.9 ± 12.4
(mg/dL)
FA (U/L) 23.6 ± 2.4 112.6 ± 16.6* 90.8 ± 8.9 114.4 ± 9.4
Albumina (g/dL) 3.5 ± 0.0 3.6 ± 0.0 3.7 ± 0.0 3.7 ± 0.0
*
Glicose (mg/dL) 111.7 ± 20.9 52.7 ± 10.0 154.5 ± 6.7 83.3 ± 4.2*
Creatinina (mg/dL) 0.5 ± 0.0 1.2 ± 0.3* 0.4 ± 0.0 0.5 ± 0.0*
Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05 (Teste de Mann-Whitney). AST: aspartato
aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina.
Tabela 2. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei

(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle
CVB) sobre os parâmetros bioquímicos de ratas, linhagem Wistar.
FÊMEAS
Controle CVB CVORCD 28 mg/kg ORCDV 40mg/kg
AST (U/L) 435.6 ± 83.8 325.0 ± 13.9 505.4 ± 56.1
ALT (U/L) 106.2 ± 25.5 63.6 ± 11.3 134.6 ± 26.8
Colesterol total (mg/dL) 77.4 ± 3.9 82.0 ± 5.5 79.9 ± 3.8
Colesterol HDL (mg/dL) 35.6 ± 2.2 34.0 ± 1.4 33.5 ± 2.0
Triglicerídeos (mg/dL) 79.6 ± 3.1 67.6 ± 7.8 78.3 ± 1.8
FA (U/L) 36.2 ± 6.6 28.8 ± 4.8 28.2 ± 5.0
Albumina (g/dL) 3.8 ± 0.1 3.7 ± 0.0 3.7 ± 0.0
Glicose (mg/dL) 95.6 ± 9.5 133.9 ± 17.1 110.3 ± 6.8
Creatinina (mg/dL) 0.6 ± 0.0 0.6 ± 0.0 0.6 ± 0.0
Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05
grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD (ANOVA, seguido do teste de Tukey). AST: aspartato
aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina.
131
3.1.3 Avaliação dos parâmetros hematológicos
Os parâmetros hematológicos (hemograma completo e contagem total e diferencial de

leucócitos) foram avaliados no 23o dia, após o término do tratamento com o ORCD (v.o e v.v)
e o CVORCD (v.v). O tratamento, via oral, não ocasionou interferências (machos e fêmeas),
pois as os parâmetros sanguíneos estiveram dentro da faixa de normalidade (CLIFFORD;
GIKNIS, 2008), exceto as plaquetas das fêmeas tratadas (1400.3 ± 130.7) (Tabela 3).
Tabela 3. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e
água destilada (Controle) sobre os parâmetros hematológicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem
Wistar.
FÊMEAS MACHOS
Controle ORCD 320 ORCD 320
mg/kg Controle mg/kg
Hm (x106/mm3) 7.9 ± 0.1 7.9 ± 0.1 9.2 ± 0.0 8.9 ± 0.2
Hb (g/dL) 14.8 ± 0.1 14.7 ± 0.2 15.7 ± 0.1 15.7 ± 0.1
Ht (%) 41.3 ± 0.4 40.4 ± 0.6 48.0 ± 0.3 46.7 ± 1.1
VCM (fl) 52.2 ± 0.6 51.2 ± 0.4 52.0 ± 0.3 52.6 ± 0.5
HCM (pg) 18.6 ± 0.1 18.5 ± 0.2 17.0 ± 0.1 17.6 ± 0.4
CHCM (g/dL) 35.7 ± 0.3 36.3 ± 0.3 32.7 ± 0.1 32.9 ± 0.4
Leucócitos
3.7 ± 0.6 6.1 ± 1.9 3.6 ± 0.6 4.0 ± 0.6
(x103/mm3)
Linfócito (%) 56.2 ± 3.8 66.6 ± 3.5 63.8 ± 2.1 68.4 ± 2.8
Monócito (%) 2.4 ± 0.6 2.2 ± 0.5 1.6 ± 0.4 2.4 ± 0.6
Neutrófilo seg. (%) 40.0 ± 3.5 28.4 ± 2.7 32.6 ± 2.2 27.8 ± 2.7
Eosinófilo (%) 1.4 ± 1.4 2.8 ± 0.9 2.0 ± 0.8 1.2 ± 0.8
1069.0 ± 1026.3 ±
Plaquetas (x103/mm3) 1400.3 ± 130.7 1059.6 ± 62.4
35.5 159.0
Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05 comparado ao grupo controle (Teste de Mann-
Whitney). Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM:
Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média.
No tratamento CVORCD 28 mg/kg, foi observado valores estatisticamente diferente

em relação ao Controle CVB (hemoglobina, hematócrito e linfócitos). Os valores de
Monócitos (Controle CVB = 7.0 ± 3.6 e Tratado CVORCD = 12.4 ± 4.5), eosinófilos
(Controle CVB = 6.0 ± 1.7; CVORCD = 9.6 ± 4.5 e ORCDV = 7.4 ± 2.2) e plaquetas
(CVORCD = 1256.4 ± 64.8) estão acima dos valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS,
2008). No grupo ORCDV 40mg/kg, observou-se diminuição do índice hematimétrico HCM
(18.9±0.3) e hemácias (8.1 ± 0.0) se comparadas ao grupo tratado com creme vaginal
(CVORCD 28 mg/kg), todavia estão dentro da faixa de normalidade (CLIFFORD; GIKNIS,
2008) (Tabela 4).
132
Tabela 4. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei

(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle
CVB) sobre os parâmetros hematológicos de ratas, linhagem Wistar.
Controle CVB CVORCD 28 mg/kg ORCDV 40mg/kg
Hm (x106/mm3) 7.9 ± 0.2 7.4 ± 0.1 8.1 ± 0.0**
Hb (g/dL) 15.4 ± 0.2 14.6 ± 0.1* 14.8 ± 0.0
Ht (%) 41.5 ± 1.3 38.8 ± 0.7* 42.2 ± 0.4
VCM (fl) 52.4 ± 0.5 52.2 ± 0.3 51.2 ± 0.2
HCM (pg) 19.4 ± 0.5 19.7 ± 0.3 18.9 ± 0.3**
CHCM (g/dL) 37.1 ± 0.7 37.7 ± 0.5 35.2 ± 0.5
Leucócitos (x103/mm3) 6.1 ± 2.8 3.3 ± 0.5 2.3 ± 0.1
Linfócitos (%) 64.8 ± 5.1 45.4 ± 5.9* 58.8 ± 3.0
Monócitos (%) 7.0 ± 3.6 12.4 ± 4.5 2.2 ± 0.8
Neutrófilos segmentados (%) 22.2 ± 2.5 32.6 ± 4.2 31.6 ± 3.4
Eosinófilos (%) 6.0 ± 1.7 9.6 ± 4.5 7.4 ± 2.2
Plaquetas (x103/mm3) 1078.6 ± 140.4 1256.4 ± 64.8 1005.2 ± 71.2
∗p< 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **p < 0.05 grupo CVORCD comparado ao grupo CVORCD
(ANOVA, seguido do teste de Tukey). Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume
Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina
Corpuscular Média.
Na avaliação dos parâmetros hematológicos, o óleoresina de ORCD, administrado por

via oral, não interferiu nos valores do hemograma completo (eritrograma e leucograma) em
ratos (machos e fêmeas). O uso subcrônico do CVORCD alterou a hemoglobina, hematócrito
e linfócitos. Os valores de VCM e CHCM, comumente usados na classificação morfologica
das anemias, estiveram dentro da faixa de normalidade neste estudo (CLIFFORD; GIKNIS,
2008). A insuficiência renal e hepática crônica podem ocasionar anemias, do tipo normocítica
normocrômica, isto é, quando o VCM e CHCM estão dentro dos valores de referência.
Todavia, apesar do decréscimo da concentração de hemoglobina das ratas tratadas com
CVORCD, a hipótese de anemia pode ser descartada; pois embora a diferenças entre os
grupos tenha sido significativa, os valores da hemoglobina e do hematócrito estão dentro da
faixa de normalidade (CLIFFORD; GIKNIS, 2008).
133
De maneira inversa, os valores dos monócitos, eosinófilos e plaquetas dos grupos

controle e tratados (CVORCD e ORCDV) encontram-se acima dos valores de referência
(CLIFFORD; GIKNIS, 2008), mas este resultado é aceitável, visto que, variações em diversos
parâmetros, tanto hematológicos como bioquímicos podem existir em ratos e camundongos.
Segundo Pinheiro et al. (2003), as diferenças podem estar relacionadas com o gênero, a
linhagem, o genótipo e, também, podem ser influenciados pelo ambiente, manuseio, dieta,
idade, entre outros fatores.
A elevação do colesterol total (76.8 ± 2.2) e colesterol-HDL (37.1 ± 1.5) nas fêmeas
tratadas ORCD 320 mg/kg foi pouco expressivo, pois os valores encontram-se dentro da faixa
de referência (DANTAS, 2006; CLIFFORD; GIKNIS, 2008). Por isso, não deve ser atribuído
como alteração clínica importante, porém o uso subcrônico ORCD, por via oral, pode estar
associado à algum tipo de suscetibilidade específica das fêmeas, já que não houve
manifestações equivalentes nos machos.
Os níveis séricos de aminotransferases indicam alteração funcional ou estrutural da
célula hepática, podendo ser utilizado para avaliar a função hepática de maneira confiável. A
maior parte da AST está localizada nas mitocondrias dos hepatócitos, enquanto a ALT
localiza-se principalmente no citoplasma (HESSEL, 1996). A lesão hepática hepatocelular é
designada se ALT for duas vezes maior que o valor limítrofe ou se a razão ALT/FA ≥ 5;
colestática se FA for duas vezes maior que o valor limítrofe ou a proporção ALT/FA ≤ 2; e
mista (hepatocelular e colestática) se a proporção ALT/FA variar de 2 a 5 (KAPLOWITZ,
2001).
A FA também esteve elevada nas fêmeas tratadas ORCD (112.6 ± 16.6), todavia,
também não deve ser considerado como indicativo de alteração clínica importante, pois os
níveis séricos encontram-se dentro dos valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS, 2008).
Por outro lado, Botelho et al. (2010) também notaram aumento no soro da FA, após
tratamento subagudo com óleoresina de C. officinalis. Neste estudo, os níveis séricos das
enzimas (AST e ALT) não foram diferentes, estatisticamente, entre os grupos controles e
tratados, tanto por por via oral (machos e fêmeas), como pela via vaginal (CVORCD, CVB e
ORCDV). É importante ressaltar que em todos os grupos, os valores estiveram acima dos
valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS, 2008), a exceção da ALT do grupo CVORCD
(63.6 ± 11.3).
A elevação de ALT e AST, bem como a proporção de ALT/FA ≤ 2 (lesão hepática
colestática) (KAPLOWITZ, 2001), parece não estar associado ao uso do óleoresina de C.
134
duckei e do creme vaginal. Contudo, estudos adicionais, tal como a análise histopatológica do
fígado seria necessário, visando esclarecer melhor a existência ou não de lesão hepática.
Araújo-Júnior et al. (2005) corrobora os resultado obtidos neste estudo, pois o óleoresina de
C. officinalis, também, não foi capaz de alterar os níveis séricos de AST e ALT após
tratamento agudo (7 dias), sem danos relevantes nos hepatócitos de ratos wistar (machos).
Não obstante, Noguchi et al. (2002) observaram diminuição dos níveis séricos das enzimas
hepáticas AST e ALT, após o tratamento com óleoresina de C. reticulata. Um estudo
conduzido por Castro-e-Silva et al. (2004) foi levado a efeito ao identificar atividade
antiproliferativa, durante a regeneração hepática em ratos, após o uso do óleoresina de C.
duckei. Segundo o autor, este óleoresina pode alterar a função mitocondrial, desacoplando e,
causando uma relativa diminuição da regeneração e da função do fígado.
Os níveis séricos de creatinina e a concentração sanguínea da uréia são dois
importantes fatores para se avaliar o índice de filtração glomerular, níveis estes que podem
estar elevados ou diminuídos em determinadas situações. A creatinina é um composto
endógeno, obtido por meio do metabolismo muscular da creatina, sendo constante a sua
produção pelo organismo. O valor sérico desse metabólito, além da função renal, depende da
massa muscular, nutrição e ocorrência de edema (PASUPATHY et al., 2011). Neste estudo,
os níveis séricos de creatinina (machos e fêmeas) estiveram elevados em relação ao grupo
controle. Entretanto, nos machos os valores mantiveram-se dentro dos valores de referência
(CLIFFORD; GIKNIS, 2008), não sendo associado qualquer alteração clínica importante,
mas nas fêmeas sugere-se algum tipo de suceptibilidade neste gênero. Esse achado, pode estar
associado ao uso subcrônico de ORCD, porém estudos adicionais, tal como a dosagem de
uréia e análises morfológica e histopatológica dos rins, devem ser realizados para comprovar
essa alteração na função renal e/ou lesão renal.
Brito et al (2001) avaliaram a função renal de ratos, dosando uréia e creatinina, após
tratamento oral, subagudo (14 dias), com óleoresina de C. reticulata (0.06 ml/kg e 0.63
ml/kg), e concluíram que esse óleoresina não é capaz de alterar a função renal de ratos wistar.
Em outro estudo (BRITO et al. 2005), observaram a melhora da função renal de ratos
submetidos à síndrome de isquemia e reperfusão renal, após administração, por sete dias, do
óleoresina de C. multijuga (0.63 ml/kg).
Por outro lado, o uso do óleoresina de C. officinalis provocou vasocongestão
glomerular difusa, fato que pode alterar patologicamente a função renal; entretanto, as
dosagens de uréia e creatinina não foram realizadas no referido estudo (BOTELHO et al.
135
2010). Segundo Alves (2007), níveis plasmáticos alterados de uréia, em ratos, não são bons
indicadores de lesão renal, porém alterações nos níveis de creatinina podem ser um indicador
confiável para avaliar a presença da lesão, pois seu nível sérico não é influenciado pela dieta,
idade e sexo.
O tratamento, via oral, com ORCD causou um efeito hipoglicemiante, tanto em
machos como em fêmeas. Esta ação farmacológica pode estar associada à presença, neste
óleoresina, do ácido caurenóico. Este constituínte, é um ácido diterpênico presente na fração
resinosa dos óleos de Copaifera sp. (CASCON; GILBERT, 2000; VEIGA-JR; PINTO, 2002;
CARVALHO et al., 2005; LEANDRO et al., 2012). Segundo Bresciani et al. (2004), o
potencial hipoglicêmico de Wedelia paludosa pode estar associada, em parte, ao ácido
caurenóico presente em diversas partes desta planta.
O uso subcrônico com CVORCD não alterou os parâmetros bioquímicos analisados.
Não obstante, os resultados confirmam ausência de toxidade sistêmica, pois a maioria dos
parâmetros esteviveram dentro dos limites de normalidade, provavelmente, por não ocorrer
absorção do fármaco. O uso de medicamentos tópicos visa ação local, por exemplo, na pele e
mucosas, e em geral apresentam baixa toxidade. Segundo Robert e Scialli (1994), a pele pode
funcionar como depósito de substâncias ativas; Contudo, se a pele estiver íntegra, raramente o
fármaco será absorvido em quantidades significativas.
136
4 CONCLUSÃO
 O tratamento subcrônico com ORCD na dose de 320 mg/kg não provocou

toxidade sistêmica (machos e fêmeas) pelos parâmetros avaliados (massa corporal, consumo
de água e ração, dosagens bioquímicas e hematológicas);
 O tratamento subcrônico com o creme vaginal contendo o óleoresina de C. duckei
(CVORD) 28 mg/kg e o óleoresina (ORCDV 40 mg/kg) não causou toxidade sistêmica,
sugerindo apenas ação local;
 Sugere-se segurança de uso do óleoresina de C. duckei, na vias de administração e
doses empregadas.
137
5 REFERÊNCIAS
ALENCAR, J. C. Estudos silviculturais de uma população natural de Copaifera multijuga

Hayne – Leguminosae, na Amazônia Central. Acta Amaz., v. 1, p. 75-89, 1982.
ALVES, N. M. Estudo farmacognóstico e da Toxidade experimental (aguda e subaguda)

do extrato etanólico da casca do guatambu (Aspidosperma subincanum Mart.). 2007.
73f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Universidade de Brasília, Brasília, 2007.
ARAÚJO-JÚNIOR, F.A.; BRAZ, M.N.; ROCHA NETO, G. Efeito do óleo de copaíba nas
aminotransferases de ratos submetidos à isquemia e reperfusão hepática com e sem pré-
condicionamento isquêmico. Acta Cirúrgica Brasileira, v. 20, p. 93-99, 2005.
BIAVATTI, M. W et al. Análise de óleos-resinas de copaíba: contribuição para o seu controle

de qualidade. Rev. Bras. Farmacog., v. 16, n. 2, p. 230-235, 2006.
BLOISE, M.I. Óleos vegetais e especialidades da floresta amazônica. Cosmetics &

Toiletries, v.15, n.5, p. 46-49, 2003.
BOTELHO, N.M.; CARVALHO, R.K.V.; MATOS, L.T.M.B.; LOBATO, R.C.; CORRÊA,

S.C. Efeito subagudo de altas doses do óleo de copaíba nos níveis de enzimas hepáticas em
soro de ratos. Rev. para. med., v. 24, 2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos.

Departamento de Assistência Farmacêutica. Política nacional de plantas medicinais e
fitoterápicos / Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos,
Departamento de Assistência Farmacêutica. – Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 60 p.
Acesso em: 10 mar. 2014.

10 mar. 2014.

10 mar. 2014.
BRESCIANI, L.F.; YUNES, R.A.; BÜRGER, C.; DE OLIVEIRA, L. E.; BÓF, K.L.;
CECHINEL-FILHO V. Seasonal variation of kaurenoic acid, a hypoglycemic diterpene
present in Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Z Naturforsch C., v. 59, n.
3-4, p. 229-232, 2004.
BRITO, M.V.H. et al. Copaiba oil effect on urea and creatinine serum levels in rats submitted
to kidney ischemia and reperfusion syndrome. Acta Cirúgica Bras., v. 20, n.3, p. 243-246,
2005.
138
BRITO, M.V.H.; TAVARES, M.L.B.; MOURA, L.G.S.; LIMA, J.T.; Efeito do óleo de
copaíba na função renal de ratos. Rev Para Med., v. 15, p. 28-32, 2001.
BRITO, M.V.H; MANESCHY, R.B; ALBUQUERQUE, B.C.M; BRAZ, M.N; ROCHA-

NETO, O.G; ARAÚJO-JÚNIOR, F.A. Efeito do óleo de copaíba nas aminotransferases de
ratos submetidos à isquemia e reperfusão hepática. Revista Paraense de Medicina, v. 18, n.
3, p. 23-28, 2004.
BRITO, N. M. B. et al. Aspectos microscópicos da cicatrização de feridas abertas tratadas

com óleo de copaíba em ratos. Rev. Paraense Med., v.13, p. 12-17, 1999.
BRITO, N.M.B. et al. Aspectos morfológicos e morfométricos do colo uterino de ratas

ooforectomizadas após aplicação de óleo de copaíba. Rev. Bras. de Ginec. e Obst., v.22, n.8,
p.489-493, 2000.
CARVALHO J.C.T. Considerações gerais sobre fitoterápicos. In: CARVALHO, J.C.T.

Fitoterápicos anti-inflamatórios: Aspectos químicos, farmacológicos e aplicações
terapêuticas. São Paulo: Tecmedd, p. 43-47, 2004.
CARVALHO, J.C.T. et al. Topical antiinflammatory and analgesic activities of Copaifera

duckei dwyer. Phytoth. Research, v. 19, p. 946-950, 2005.
CASCON, V.; GILBERT, B. Characterization of the chemical composition of oleoresins of

Phytochem., v. 55, n. 7, p. 773-778, 2000.
CASTRO-E-SILVA, O. JR.; ZUCOLOTO, S.; RAMALHO, F.S.; RAMALHO, L.N.; REIS,

J.M.; BASTOS, A.A.; BRITO, M.V. Antiproliferative activity of Copaifera duckei oleoresin
on liver regeneration in rats. Phytother Res., v. 18, n. 1, p. 92-94, 2004.
CAVALCANTI-NETO, A.T.; ARRUDA T.E.P.; ARRUDA, T.T.P.; PEREIRA, S.L.S.

Análise comparativa entre o óleo – resina de copaíba e o digluconato de clorexidina no
processo de cicatrização tecidual. Estudo histológico em dorso de ratos. Revista de
Odontologia da UNESP, v. 34, n. 2, p. 107-112, 2005.
COSTA-LOTUFO, L. V. et al. The cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a

diterpene isolated from Copaifera langsdorffii oleo-resin. Toxicon., v. 40, p. 1231–1234,
2002.
DANTAS, J.A.; AMBIEL, C.R.; CUMAN, R.K.N.; BARONI, S.; BERSANI-AMADO, C.A.
Valores de referência de alguns parâmetros fisiológicos de ratos do Biotério Central da
Universidade Estadual de Maringá, Estado do Paraná. Acta Sci. Health Sci., v. 28, n. 2, p.
165-170, 2006.
DRUMOND, M.R.S.; CASTRO, R.D.; ALMEIDA, R.V.D.; PEREIRA, M.S. V.; PADILHA,
W. W.N. Estudo comparativo in vitro da atividade antibacteriana de produtos fitoterápicos
sobre bactérias cariogênicas. Revista Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e Clínica
Integrada, v. 4, n. 1, p. 33-38, 2004.
139
ESTEVÃO, L.R.M.; MEDEIROS, J.P.; SCOGNAMILLO-SZABÓ, M.V.R.; BARATELLA-

EVÊNCIO, L.; GIMARÃES, E.C.; CÂMARA, C.A.G.; EVÊNCIO-NETO, J.
Neoangiogênese de retalhos cutâneos em ratos tratados com óleo de copaíba. Revista
Agropecuária Brasileira, v. 44, n. 4, p. 406-412, 2009.
EURIDES, D.; MAZZANTI, A.; GONÇALVES, G.F.; BELLETI, M.E.; SILVA, L.A.F.;
FIORAVANTE, M.C.S.; CHAVES, N.S.T.; BOMBONATO, P.P.; CAMPOS, V.A.;
OAGATA, A.S. Aspectos morfológicos, morfométricos e histológicas da reparação tecidual
de feridas cutâneas de camundongos tratadas com óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii).
Revista Veterinária Notícias, v. 4, n. 1, p. 35-40, 1998.
FRANCISCO, S.G. Uso do óleo de resina de Copaíba (Copaifera officinalis L.) em

inflamação ginecológica. Femina, v. 33, n. 2, p. 89-93, 2005.
FREIRE, D.B. et al. Efeito dos óleos vegetais de andiroba (Carapa sp.) e copaíba (Copaifera
sp.) sobre forídeos, pragas de colméias, (Díptera: Phoridae) na Amazônia central. Acta
Amazônica, v.36, n.3, p.365-368, 2006.
GERIS, R.; SILVA, I. G.; SILVA, H. H. G.; BARISON, A.; RODRIGUES – FILHO, E.;
FERREIRA, A. G. Diterpenoids from Copaifera reticulata Ducke with larvicidal activity
against Aedes aegypti (Díptera, Culicidae). Revista do Instituto de Medicina Tropical de
São Paulo, v. 50, n. 1, p. 25-28, 2008.
GIKNIS, M.; CLIFFORD, C. Clinical laboratory parameters for Crl:WI(Han) Rats.

Charles River Laboratories, 2008.
HESSEL, G.; DE SANTI-NETO, D., COLLARES, E.F. Correlation between the severity of
acute hepatic necrosis induced by acetaminophen and serum aminotransferase levels in rats
fasted and sucrose-fed rats. Brazilian J Med Biol Res., v. 29, p. 793-79, 1996.
IZUMI, E.; UEDA-NAKAMURA, T.; VEIGA-JR, V.F.; PINTO, A.C.; NAKAMURA, C.V.
Terpenes from Copaifera demonstrated in vitro antiparasitic and synergic activity. J Med
Chem., v. 55, n. 7, p. 2994-3001, 2012.
KANIS, L.A.; PROPHIRO, J.S.; VIEIRA EDA, S.; NASCIMENTO, M.P.; ZEPON, K.M.;
KULKAMP-GUERREIRO, I.C.; SILVA, O.S. Larvicidal activity of Copaifera sp.
(Leguminosae) oleoresin microcapsules against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae.
Parasitol Res., v. 110, n. 3., p. 1173-1178, 2012.
KAPLOWITZ. Causality Assessment Versus Guilt-by-Association in Drug Hepatotoxicity.

Hepatology, v. 33, n. 1, p. 308-310, 2001.
KOBAYASHI, C.; FONTANIVE, T.O.; ENZWEILER, B.G.; DE BONA, L.R.; MASSONI,

T.; APEL M.A.; HENRIQUES, A.T.; RICHTER, M.F.; ARDENGHI, P.; SUYENAGA, E.S.
Pharmacological evaluation of Copaifera multijuga oil in rats. Pharm Biol. v. 49, n. 3, p.
306-13, 2011.
KOSHI, G.; CHERIAN, K.M. Aspergillus terreus, na uncommon fungus causing aortic root
abscess and pseudoaneurysm. Indian Heart Journal, v.47, p. 265-267, 1995.
140
LEANDRO, L.M.; VARGAS, F. S.; BARBOSA, P.C.; NEVES, J.K.; DA SILVA, J.A.;
VEIGA-JUNIOR, V.F. Chemistry and biological activities of terpenoids from copaiba
(Copaifera spp.) oleoresins. Molecules, v. 17, n. 4, p. 3866-89, 2012.
LIMA, C.S.; DE MEDEIROS, B.J.; FAVACHO, H.A.; DOS SANTOS, K.C.; DE

OLIVEIRA, B.R, TAGLIALEGNA, J.C, DA COSTA, E.V.; DE CAMPOS, K.J.;
CARVALHO, J.C. Pre-clinical validation of a vaginal cream containing copaiba oil
(reproductive toxicology study). Phytomedicine. v. 18, n. 12, p. 1013-1023, 2011.
LIMA, S.R.M. et al. In vivo and in vitro studies on the anticancer activity of Copaifera
multijuga Hayne and its fractions. Phytother. Res., v. 17, p. 1048-1053, 2003.
LIMA-NETO, J.S.; GRAMOSA, N.V.; SILVEIRA, E.R. Constituintes químicos dos frutos de
Copaifera langsdorffii Desf. Revista Química Nova, v. 31, n. 5, p. 1078-1080, 2008.
LIMA-SILVA, J.J.; GUIMARÃES, S.B.; SILVEIRA, E.R.; VASCONCELOS, P.R.; LIMA,

G.G.; TORRES S.M.; VASCONCELOS, R.C. Effects of Copaifera langsdorffii Desf. on
ischemia-reperfusion of randomized skin flaps in rats. Esthetic Plast Surg. v. 33, n. 1, p. 104-
109, 2009.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A. C.; VEIGA-JÚNIOR, V. F. Plantas medicinais: a necessidade

de estudos multidisciplinares. Quím. Nov. v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002.
NAKAMURA, C.V.; PINTO, A.C.; VEIGA-JÚNIOR, V.F.; FILHO, B.P.D.; UEDA-

NAKAMURA, T.; SANTOS, A.O. Antimicrobial activity of Brazilian copaiba oils obtained
from different species of the Copaifera genus. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.
103, n. 3, p. 277-281, 2008.
NOGUCHI, A.; BRITO, M.V.H; DOS REIS, J.M.C; DIAS, C.S; EPAMINONDAS, W.A;
AZEVEDO, P.S.R. Níveis séricos de aminotransferases, bilirrubinas e gama-glutamil
transpeptidase após a administraçäo de óleo de copaíba em ratos. Acta Cirúrgica Brasileira.,
v., n. 2, p. 130-134, 2002.
OLIVEIRA, E.C.P. et al. Identificação da época de coleta do óleo-resina de copaíba

(Copaifera spp.) no município de Moju-PA. Revista Brasileira de Plantas medicinais, v.8,
n.3, p. 14-23, 2006.
OLIVEIRA, U.D. et al. Avaliação do ciclo celular de Aspergillus nidulans exposto ao extrato
da planta Copaifera officinalis L. Revista Saúde e Biologia, v.1, n.2, p.42-7, 2005.
PACHECO, T.A.R.C.; BARATA, L.E.S.; DUARTE, M.C.T. Antimicrobial activity of

copaiba (Copaifera spp.) balsams. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 2, n. 8, p.
123-124, 2006.
PAIVA, L.A.F. et al. Protective effect of Copaifera langsdorffii oleo-resin against acetic acid-
induced colitis in rats. Journal of Ethnopharmacology, v.93, n.1, p.51- 56, 2004.
PASUPATHY, P.; DHANALAKSHMI, G.; PONNUSHA, B.D.; AMBIKA, A. Cystatin C: A

novel marker for renal failure. Int J Cur Bio Med Sci., v. 1, n. 3, p. 120-125, 2011.
141
PEDREIRA, E. N. Avaliação do efeito inibidor tumoral do óleo resina de copaíba in

natura (Copaifera reticulata) e manipulado artesanalmente no modelo de carcinogênese
bucal experimental DMBA induzida. 107f. Tese (Doutorado em Patologia Bucal) –
Faculdade de Odontologia de Bauru (FOB), Bauru – SP, 2007.
PIERI, F.A.; MUSSI, M.C.; FIORINI, J.E.; MOREIRA, M.A.; SCHNEEDORF, J.M.;
Bacteriostatic effect of copaiba oil (Copaifera officinalis) against Streptococcus mutans. Braz
Dent J., v. 23, n. 1, p. 36-38, 2012.
PINHEIRO, D.C.S.N.; FAVALI, C.B.F.; FILHO, A.A.S.; SILVA, A.C.M.; FILGUEIRAS,

T.M.; LIMA M.G.S (2003). Parâmetros hematológicos de camundongos e ratos do biotério
central da Universidade Federal do Ceará. In: Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA). Disponível em: <http://www.cobea.org.br/artigos5.htm>. Acesso em Março/2014.
PROPHIRO, J.S.; DA SILVA, M.A.; KANIS, L.A.; DA SILVA. B.M.; DUQUE-LUNA, J.E.;
DA SILVA, O.S. Evaluation of time toxicity, residual effect, and growth-inhibiting property
of Carapa guianensis and Copaifera sp. in Aedes aegypti. Parasitol Res. V. 110, n. 2, p. 713-
719, 2012.
RAMOS, M.F.S. Desenvolvimento de microcápsulas contendo a fracão volátil de copaíba

por spray-drying: estudo de estabilidade e avaliação farmacológica. 132p. Tese
(Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
RIGAMONTE-AZEVEDO, O. C. et al, Variabilidade química e física do óleo-resina de

copaifera spp. no sudoeste da amazônia brasileira, Rev. bras. ol. fibros., v.8, n. 2/3, p. 851-
861, 2004.
ROBERT, E.; SCIALLI., A.R. Topical medications during pregnancy. Rep. Toxicol., v. 8, n.
3, p. 197-202, 1994.
RODRIGUES, E.A.C. Infecções hospitalares: prevenção e controle. São Paulo: Sarvier, p.

28, 1997.
SACHETTI, C. G. et al. Avaliação da Toxidade aguda e potencial neurotóxico do óleo-resina

de copaíba (Copaifera reticulata Ducke, Fabaceae). Rev. Bras. Farmacogn., João Pessoa, v.
19, n. 4, p. 937- 941, 2009.
SANTOS, A.O. et al. Antimicrobial activity of Brazilian copaíba oils obtained from different
species of the Copaifera genus. Mem. Inst. Osvaldo cruz, v. 103, n. 3, p. 277-281, 2008.
SANTOS, A.S. et al. Volatile constituents of fruits of Annona glabra L. from Brazil. Flavour
and Fragrance Journal, v.13, p. 148-50, 1998.
SANTOS, A.S.; DEUS, R.J.A.; CARVALHO, A.S.C.; BANNA, D.A.D.S.; ARRUDA,

M.S.P.; ALVES, C.N. Efeito fungitóxico in vitro do óleo resina e do óleo essencial de
copaíba (Copaifera multijuga Hayne). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 11, n. 3,
p. 347-353, 2009.
142
SILVA, F.H. et al. Estudo do óleo essencial e extrato hidrometanólico de Copaifera

langsdorffii Desf (Caesalpinaceae) do cerrado e mata atlântica. In: REUNIÃO NACIONAL
DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 29., 2006. Águas de Lindóia. Anais
eletrônicos... São Paulo: Instituto de Química da USP, 2006. Disponível em:
<http://www.sbq.org.br/29ra>. Acesso em: 12 mar. 2014.
SOUZA, A.B.; MARTINS, C.H.G.; SOUZA, M.G. M.; FURTADO, N.A.J.C.; HELENO,
V.C. G.; SOUSA, J.P.B.; ROCHA, E.M.P.; BASTOS, J.K.; CUNHA, W.R.; VENEZIANI,
R.C.S.; AMBRÓSIO, S.R. Antimicrobial activity of terpenoids from Copaifera langsdorffii
Desf. against cariogenic bacteria. Phytotherapy Research, v. 25, n. 1, p. 215-220, 2011.
TUROLLA, M.S.R.; NASCIMENTO, E.S. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos

utilizados no Brasil. Rev. Bras. Ciên. Farm., v. 42, n. 2, p. 289 – 306, 2006.
VASCONCELOS, K.R.F.; JÚNIOR, V.F.V.; ROCHA, W.C.; BANDEIRA, M.F.C.L.

Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de um cimento odontológico à base de óleo-
resina de Copaifera multijuga Hayne. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, p. 733-
738, 2008.
VEIGA JÚNIOR, V.F.; PINTO, A.C. O gênero Copaifera L. Quím. Nov., v. 25. n. 2, p. 273-
286, 2002.
VEIGA-JÚNIOR, V.F. Controle de Qualidade de Óleos de Copaíba por Cromatografia

Gasosa de Alta Resolução. 1997. 89 p. Dissertação (Mestrado em química orgânica) -
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, 1997.
VEIGA-JÚNIOR, V.F; PINTO, A.C. Plantas medicinais: cura segura? Quim. Nov., v. 28, n.
3, 519-528, 2005.
WESTPHAL, F.L.; LIMA, L.C.; GUIMARÃES, R.A.; SOUZA, R.F.S.; COUTO, S.B.;
NAKAJIMA, S.R. Avaliação das alterações pleuropulmonares após a injeção de óleo de
resina de copaíba, extrato aquoso de crajiru e polivinilpirrolidona (PVPI) na pleura e
parênquima pulmonar de ratos. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, v. 34, n. 3, p.
170-176, 2007.
WORLD HEALTH ORGANIZATION, Council for International Organizations of Medical

Sciences (CIOMS). International ethical guidelines for biomedical research involving
human subjects. Geneva, p. 63, 1993.
XENA, N.; BERRY, P.E. Copaifera L. In: STEYERMARK, J.A. et al. Flora of the
Venezuelan Guyana. Missouri: Botanical Garden Press, p.45-47, 1998.
143
CAPÍTULO 3: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM

RATAS SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C.
duckei NOS PERÍODOS DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO E PÓS-
IMPLANTAÇÃO E ANÁLISE DA TERATOGENICIDADE
144
RESUMO
A toxicologia experimental desenvolve estudos para elucidar os mecanismos de ação dos

agentes tóxicos nos diversos sistemas biológicos e a avaliação dos efeitos decorrentes dessa
ação. Estudos de toxidade reprodutiva revelam o efeito de uma ou mais substâncias ativas na
reprodução de mamíferos. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade
reprodutiva em ratas submetidas ao tratamento com óleoresina de Copaifera duckei (ORCD)
nos períodos de pré-implantação e pós-implantação e analisar a teratogenicidade. Para tanto,
foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, isogênicas, e machos. O
ORCD foi administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50
(3758,16 mg/kg) e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes
tratamentos: Grupo controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de
ORCD) e Tratado G3 (1874 mg/kg de ORCD). Este estudo foi dividido em dois ensaios,
Experimento 1 (E1) e o Experimento 2 (E2), de acordo com os segmentos I e II dos estudos
de toxicologia reprodutiva, adaptados de normas da Environmental Protection Agency e
recomendados pela Food and Drugs Administration e Organization for Economic
Cooperation and Development. O E1 compreendeu o segmento I, avaliando-se apenas as
fêmeas durante a gestação no período de pré-implantação. Já o E2 compreendeu os
seguimentos I (fêmeas no período pós-implantação) e II (teratogenicidade). Para tanto, dos 40
animais, 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E1G1, E1G2 e E1G3) e 5 machos reprodutores
no E1 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E2G1, E2G2 e E2G3) e 5 machos reprodutores
no E2. O tratamento com ORCD no período pré-implantação (d0-d5) não provocou sinais
clínicos de toxidade no grupo E1G2 (366,89 mg/kg). Contudo, no grupo E1G3 (1874 mg/kg)
foi observado alguns sinais clínicos de toxidade aguda, tal como, diarréia, piloereção,
estresse, agitação, tremores, hemorragia nasal e vaginal. Além disso, houve registro de um
óbito, no d5 de prenhez, que correpondeu ao 6º dia de tratamento. O ORCD (366,89 mg/kg e
1874 mg/kg), administrado neste período crítico do densenvolvimento, pré-implantação,
demonstrou não alterar esse processo de sincronização, com êxito nas implantações do
blastocisto no útero. Quanto as perda pós-implantação, estas foram avaliadas mesmo não
compreendendo o período de tratamento com ORCD. Não foi observada diferença entre os
grupos, o que poderia descartar a hipótese de perda pós-implantação por metabólitos do
ORCD ainda presentes no sangue materno. No entanto houve alterações significativas no peso
fetal (nas duas doses) e índice placentário (na maior dose), sugerindo a presença de
metabólitos do ORCD, no entanto estudos adicionais, de toxicocinética devem ser realizados
para melhor definição e compreensão desses efeitos. O tratamento com ORCD no período
pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade aguda, provocando diarréia e agitação após o
tratamento, tanto no grupo E2G2 (366,89 mg/kg) como no grupo E2G3 (1874 mg/kg). Porém
outros sinais clínicos de toxidade ocorreram apenas com o tratamento com a maior dose, tal
como estresse, piloereção, sialorréia, apatia, desidratação, hemorragia nasal e vaginal,
caracterizando aborto espontâneo. No presente estudo, não houve abortos espontâneos no
grupo controle (E2G1), e os casos registrados estão associados à toxidade materna sistêmica
do ORCD 1874 mg/kg. Quanto a análise da teratogenicidade, o ORCD nas doses
administradas, 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, não causou nenhum tipo de alteração ou
malformação, tanto externamente como internamente (esquelética e visceral).
Palavras-chave: Copaifera duckei, óleoresina, toxidade reprodutiva, pré e pós-implantação e

teratogenicidade.
145
ABSTRACT
The experimental toxicology develops studies to elucidate the mechanisms of the toxic agents'
action in the several biological systems and the evaluation of the current effects of this action.
Studies of reproductive toxicity reveal the effect of one or more active substances in the
reproduction of mammals. Therefore, this study had the objective to evaluate the reproductive
toxicity in female rats submitted to the treatment with oil resin of Copaifera duckei (ORCD)
in the pre-implantation periods and post-implantation and to analyze the teratogenicity. Wistar
Mice were used (Rattus norvegicus albinus), females, isogenical, and males. ORCD was
administered orally (v.o), in the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and
50% of DL50. This way, the groups were submitted to the following treatments: Control
Groups G1 (0,5 mL of distilled water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3
(1874 mg/kg of ORCD). This study was divided in two samples, Experiment 1 (E1) and the
Experiment 2 (E2), according to the segments I and II of the studies of reproductive
toxicology, adapted from the rules of Environmental Protection Agency and recommended by
the Food and Drugs Administration and Organization for Economic Cooperation and
Development. E1 was accomplished in the segment I, which were evaluated only the female
rats during the gestation in the pre-implantation period. E2 was accomplished the segments I
(female rats in the post-implantation period) and II (teratogenicity). 40 animals, 15 females
(experimental n=5/grupo, E1G1, E1G2 and E1G3) and 5 reproductive males in E1 and 15
females (experimental n=5/grupo, E2G1, E2G2 and E2G3) and 5 reproductive males in E2.
The treatment with ORCD in the pre-implantation period (d0-d5) did not cause clinical signs
of toxicity in the group E1G2 (366,89 mg/kg). However, in the group E1G3 (1874 mg/kg) it
was observed some clinical signs of acute toxicity, such as, diarrhea, piloerection, stress,
agitation, tremors, nasal and vaginal hemorrhage. Besides, there was one death, in the
pregnancy d5, which corresponds to the 6th day of treatment. ORCD (366,89 mg/kg and 1874
mg/kg), administered in this critical period of the development, pre-implantation, it showed
not to change that synchronization process, with success in the implantation of the blastocyst
in the uterus. About the loss post-implantation, these were evaluated even out of the treatment
period with ORCD. No difference was observed among the groups, what could discard the
hypothesis of loss post-implantation for metabolites of ORCD presents in the maternal blood.
However there were significant changes in the fetal weight (in the two doses) and placental
rate (in the largest dose), suggesting the presence of metabolites of ORCD, however
additional studies, of toxicokinetics should be accomplished for better definition and
understanding of those effects. The treatment with ORCD in the post-implantation period (d6-
d15) showed acute toxicity, causing diarrhea and agitation after the treatment, both in the
group E2G2 (366,89 mg/kg) and the group E2G3 (1874 mg/kg). However other clinical signs
of toxicity just happened when the treatment with the largest dose was administered, such as
stress, piloerection, sialorrhea, apathy, dehydration, nasal and vaginal hemorrhage, and
characterizing spontaneous abortion. In the present study, there were not spontaneous
abortions in the control group (E2G1), and the registered cases are associated to the systemic
maternal toxicity of ORCD 1874 mg/kg. About the analysis of the teratogenicity, ORCD in
the administered doses, 366,89 mg/kg and 1874 mg/kg, did not cause any change or
malformation, neither externally nor internally (skeletal and visceral).
Keywords: Copaifera duckei, oleoresin, reproductive toxicity, pre and post-implantation and
teratogenicity.
146
1 INTRODUÇÃO
O estudo das plantas medicinais iniciou-se, praticamente, no início da evolução do

homem sobre a terra. A percepção de que certas espécies de plantas eram capazes de curar e
que outras não serviam nem mesmo para o consumo alimentício, foi, sem dúvida, o primeiro
passo na descoberta sobre a potencialidade dos produtos naturais. Segundo Bendazzoli
(2000), esse conhecimento foi adquirido pelo homem primitivo, e deu-se, provavelmente, a
partir de um processo de tentativa e erro. Assim, a descoberta das propriedades
farmacológicas e a identificação da toxidade das plantas são processos que caminham juntos
ao longo da história.
A toxicologia experimental desenvolve estudos para elucidar os mecanismos de ação
dos agentes tóxicos nos diversos sistemas biológicos e a avaliação dos efeitos decorrentes
dessa ação. Dessa forma, estudos relacionados à composição química e aos seus efeitos
podem contribuir de modo efetivo na busca e potencial utilização de vegetais na produção de
novas drogas com segurança e eficácia (OGA, 2008). O objetivo dos estudos de toxidade
reprodutiva é revelar os efeitos de uma ou mais substâncias ativas na reprodução de
mamíferos. Por este propósito, investigações e interpretações dos resultados devem ser
relacionadas com outros dados farmacológicos e toxicológicos disponíveis, para determinar
situações em que riscos potenciais para a reprodução humana são maiores, menores ou iguais
àqueles relativos a outras manifestações toxicológicas (BRASIL, 2013).
Um defeito ao nascimento, ou defeito congênito, pode ser definido como uma
anormalidade estrutural, funcional ou do metabolismo presente no nascimento, que pode levar
às anormalidades físicas, deficiências mentais ou morte (SCHARDEIN, 2000). Cerca de 30%
das internações pediátricas estão relacionados a problemas de saúde relacionados com
malformações congênitas. Nos Estados Unidos, a cada ano, aproximadamente 120.000 bebês
nascem com uma malformação estrutural, sendo um para cada 33 nascidos vivos (HANSEN;
HARRIS, 2013). No Brasil, as malformações ocupam o segundo lugar entre as causas de
mortalidade infantil, determinando 11, 2% dos óbitos (GEREMIAS; ALMEIDA; FLORES,
2009).
Segundo Embiruçui et al. (2005), os teratógenos constituem agentes ambientais,
químicos, físicos e biológicos, que podem causar anormalidades obstétricas e (ou) fetais. A
classificação ds anomalias congênitas estão baseadas na gravidade dos achados anormais, que
podem ser classificadas como maiores ou menores. As maiores são as que resultam em graves
147
defeitos anatômicos, funcionais ou estéticos, que podem, às vezes, levar a óbito. Como
exemplo, anencefalia, fenda labial ou palatina, hidrocefalia, cardiopatia, entre outros. Já as
menores, geralmente, têm importância cirúrgica, médica ou estética e podem ser únicas ou
múltiplas e associar-se a malformações maiores, por exemplo, a prega simiesca, polidactilia e
clinodactilia do quinto dedo (FERNANDEZ et al., 2005).
A ciência que trata do estudo das anomalias e/ou malformações congênitas é a
teratologia. Wilson (1977) definiu a teratologia como “a ciência interessada em determinar as
causas, mecanismos e as manifestações dos erros no desenvolvimento, sejam eles estruturais
ou funcionais, que podem ser iniciados em qualquer período entre a fertilização e a maturação
pós-natal”. O termo toxicologia reprodutiva é recente, refere-se a uma área do conhecimento
relativamente nova, que tem suas raízes fortemente relacionadas à teratologia. Estudos
envolvendo toxicologia reprodutiva incluem malformações estruturais, retardo no
crescimento, dano no desenvolvimento e a morte do organismo (ROGERS; KAVLOCK,
2001). Esta área da toxicologia também se preocupa com o estudo da cinética, mecanismo de
ação tóxica, patogênese e as conseqüências da exposição aos agentes tóxicos ou condições
que levem ao desenvolvimento anormal do animal (ROGERS; KAVLOCK, 2001).
Estudos de toxidade do desenvolvimento pré-natal devem ser conduzidos em animais
de laboratório, para prevenir tragédias como a da talidomida. Estudos não clínicos de
toxicologia reprodutiva fornecem informações quanto aos perigos, tanto para a saúde materna
como riscos e/ou danos à saúde fetal (DASTON; SEED, 2007). Os fetos que foram expostos à
talidomida, por exemplo, apresentaram intestinos malformados, defeitos na audição, ausência
de orelhas, anomalias renais e oculares. Todavia, o fenótipo que mais chamou a atenção foi a
focomelia, uma síndrome caracterizada pela aproximação ou encurtamentos dos membros ao
tronco do feto (SMITHELLS; NEWMAN, 1992).
Os estudos de toxidade reprodutiva consistem em ensaios realizados em animais,
objetivando verificar o potencial de um xenobiótico provocar efeitos adversos sobre o
processo reprodutivo, incluindo a fertilidade, o desenvolvimento embriofetal,
desenvolvimento pós-natal dos descendentes até a maturidade sexual. Diante disso, torna-se
fundamental o conhecimento das etapas do desenvolvimento embrionário, pois alguns
estágios do desenvolvimento são mais vulneráveis que outros (ROGERS; KALVLOCK,
2001).
A exposição pré-natal e a pós-natal a tóxicos podem produzir mudanças que não
podem ser previstas a partir dos efeitos observados em adultos, e esses efeitos são muitas
148
vezes irreversíveis. Resultados adversos no desenvolvimento, em ambos os sexos, podem

resultar de exposição a agentes tóxicos no útero ou no leite (GIUSTI et al., 1995). Nas fases
pré e pós-natal, os órgãos sexuais e o sistema nervoso central que ainda estão se diferenciando
podem ser atingidos por substâncias presentes no sangue materno através da placenta, durante
a gestação, ou através do leite, durante a lactação. Além disso, indivíduos expostos durante
períodos críticos de desenvolvimento são mais vulneráveis à ação de substâncias químicas em
função da menor capacidade metabólica e excretora e da ausência de muitos mecanismos de
retroalimentação do sistema endócrino (ZENICK; CLEGG, 1989).
A prenhez de ratos pode ser dividida em três períodos: pré-implantação, organogênese
e fetal (FRITZ; GIESE, 1990). A fase de pré-implantação compreende o período que vai
desde a fecundação até a implantação do blastocisto no útero, que ocorre até o 6º dia (FRITZ;
GIESE, 1990). Esta fase é caracterizada pela presença de células totipotentes em divisão e a
exposição a um agente tóxico pode impedir a implantação do blastocisto no útero (ROGERS;
KALVLOCK, 2001). A redução do número de células no embrião, durante essa fase, pode
induzir retardo na formação do blastocisto (KOLA; FOLB, 1986) e, conseqüentemente,
aumento nas perdas pré e pós-implantação (LEMÔNICA et al., 1996). Segundo Almeida e
Lemônica (2000), a taxa de perda pré-implantação é a correlação entre o número de ovos
liberados e aqueles que, depois de fecundados, conseguiram ser implantados no útero. Já a
perda pós-implantação refere-se à relação entre o número de blastocistos implantados e
aqueles que não conseguiram se desenvolver. Ao blastocisto implantado, que não conseguiu
se desenvolver dá-se o nome de “reabsorção” e isso indica falha no desenvolvimento do
embrião.
Após a implantação, inicia-se a fase de organogênese, do 7º ao 14º. Esse período é
caracterizado por uma intensa proliferação e migração celular, remodelamento tissular e
formação rudimentar das estruturas e órgãos do corpo. É o período de maior susceptibilidade,
à ação de agentes teratogênicos, com indução de malformações, considerado o período
teratogênico clássico (BRENT, 1993). Após esta fase, dá-se início a terceira fase, conhecida
como fase fetal, caracterizada por diferenciação e crescimento tissular, maturação fisiológica
dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto, compreendendo o 16º ao 21º dia de
prenhez (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Nesse período, a
sensibilidade frente a malformações anatômicas é extremamente baixa, porém a exposição a
agentes químicos pode produzir morte celular e inibição da divisão celular. Essas alterações
podem interferir com a formação dos sistemas nervoso, endócrino e imunológico,
149
promovendo desordens funcionais e de comportamento (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS;

KALVLOCK, 2001).
A diferença genética, entre as espécies, faz com que se torne necessário, a utilização
de mais de uma espécie nos ensaios de toxicologia reprodutiva (MENGUE et al., 2001;
BRASIL, 2013). O estudo realizado por Van-Cauteren et al. (1987) é levado a efeito, pois a
utilização de três diferentes espécies de animais (ratos, coelhos e camundongos) nos ensaios,
possibilitou observar as diferentes respostas toxicológicas a cada espécie. Outro fator
importante é o período gestacional exposto a esse agente, pois, a susceptibilidade de cada
órgão a uma determinada anomalia ou malformação dependerá da etapa em que se encontra o
desenvolvimento, de forma que o concepto seja sensível a diferentes períodos (CALLIARI-
MARTIN, 1998; ROGERS; KAVLOCK, 2001).
Poucos estudos experimentais têm sido realizados para testar os efeitos teratogênicos
de plantas medicinais, embora a extrapolação desses dados tenha fundamental importância
para a prevenção de riscos tóxicos, tanto para a gestante como para o concepto. Um exemplo
de efeito tóxico ao concepto, foi descrito no estudo com extrato aquoso de boldo (Coleus
barbatus) administrado em ratas prenhes, nas doses de 440 e 880 mg/kg/dia, durante o
período de organogênese, resultando em alterações vertebrais e diminuição do número de
centros de ossificação (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000). A utilização de qualquer
medicamento na gestação, mesmo que seja fitoterápico, deve-se considerar a relação risco-
benefício. Uma preparação fitoterápica, Kava Kava® (Piper methysticum Forst) foi avaliada
quanto a sua toxidade sistêmica e reprodutiva, não sendo observado, hepatotoxidade, toxidade
sistêmica, reprodutiva e teratogenicidade na dose de 35 mg/kg (PINTO, 2004).
Neste sentido, embora existam pequenas variações nos protocolos de avaliação de
risco de toxicologia pré-natal, entre as agências de regulamentação, de maneira geral, estas
requerem nos testes, um grupo de animais controle, e no mínimo, outros três, nos quais
receberão as diferentes doses da substância química a ser avaliada. Em geral, a escolha destas
doses está baseada nos seguintes critérios: uma que produza efeitos tóxicos, outra em que os
animais não manifestem qualquer alteração de toxidade e a outra, intermediária entre estas
(OECD, 2001a). Esta substância a ser testada deverá ser administrada, no mínimo, da
implantação à cesariana. Para avaliar a performance reprodutiva, um dia antes do parto, as
fêmeas são submetidas à cesariana, avaliando-se o número de corpos lúteos, nº de
implantações, com fetos e placentas pesados. A seguir, metade da prole é utilizada para
150
avaliação esquelética e a outra metade para pesquisa de anomalias viscerais, avaliando-se,

então, a teratogenicidade (OECD, 1996; US EPA, 1991).
Os estudos em teratologia, geralmente, apresentam baixas incidências de defeitos
congênitos. Para melhor atender a necessidade dos protocolos experimentais, a dose utilizada
deve ser tóxica, objetivando uma exposição sistêmica maior do que a esperada no humano
(WEBSTER; FREEMN, 2001). Embora a preconização dos estudos não clínicos seja a
realização da mesma via de administração a ser usada em humanos, a via oral é uma
importante via a ser investigada, principalmente, pela melhor visualização de seus efeitos
sistêmicos, pois determinados agentes químicos podem atravessar a placenta e atingir o feto.
As substâncias endógenas e exógenas que atravessarem a placenta penetram na circulação
fetal através da veia umbilical e passam pelo fígado do feto antes de atingirem o coração e a
circulação sistêmica (ADAMSON et al., 2002, CROSS, 2005).
O líquido amniótico é o principal reservatório de substâncias exógenas do feto, sendo
também a maior via de excreção de substâncias por ele deglutidas, as quais são filtradas pelo
rim fetal, retornando à mãe pela artéria umbilical (BURDON et al., 2007). Alguns
medicamentos podem ser transformados em metabólitos polares no fígado fetal e aí se
acumularem, por outro lado mesmo os agentes lipossolúveis que não sofreram
biotransformação entram em contato com ele, podendo causar diversas anomalias
ADAMSON et al., 2002, CROSS, 2005). O acúmulo de substâncias exógenas no
compartimento fetal pode acontecer, principalmente, devido à ausência de enzimas de
biotransformação, que dificulta a detoxificação pelo próprio feto (COX et al., 2009).
O óleoresina de copaíba, por ser um importante produto natural utilizado na medicina
tradicional, principalmente na região amazônica, é comumente, usado como anti-inflamatório,
analgésico e antisséptico, além de muitas outras ações farmacológicas já descritas. Várias
formulações e formas farmacêuticas estão disponíveis em farmácias e drogarias em todo
Brasil (Pieri et al., 2009).
Lima et al. (2011) realizaram um estudo de sobre a performance reprodutiva de ratas
prenhas submetidas ao tratamento com um creme vaginal a base do óleo de copaíba
(Copaifera duckei). Os resultados deste estudo demonstraram ausência de toxidade materna e
embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a dose terapêutica
preconizada para o uso em mulheres. Estudos de toxicologia reprodutiva dessa magnitude são
importantes para dar subsídio ao clínico quanto à segurança de uso nesse grupo de mulheres,
as gestantes. Este capítulo teve como objetivo avaliar a toxidade reprodutiva do óleoresina de
151
C. duckei em dois períodos críticos da prenhez de ratas: o período de pré-implantação e o

período de pós-implantação do blastocisto, bem como a análise da teratogenicidade.
152
2.1 MATERIAL
Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).
Antes do início das atividades no LABORATÓRIO DE PESQUISA EM

FÁRMACOS/UNIFAP, o projeto de tese foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal do Amapá, recebendo o número 008A/2011 (APÊNDICE).
2.3 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), 30 fêmeas, isogênicas,

provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em
Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade de Campinas – UNICAMP e 10 machos
provenientes do Laboratório Central do Amapá (LACEN-AP). Após a chegada dos animais,
os mesmo passaram por um período de adaptação, e foram mantidos em estantes climatizadas
com temperatura controlada (23±2º C), obedecendo a um ciclo claro/escuro de 12 horas
(período claro das 7:00 h da manhã às 19:00 h da noite) e receberam água e ração (Labina®) à
vontade até o início dos ensaios.
2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS
A DL50 do ORCD, em ratos por via oral, é 3,79 ml/kg, que correponde a 3758,16
mg/kg (CASCON, 2004). A via de administração utilizada foi a via oral (v.o), gavagem,
objetivando-se avaliar alterações sistêmicas. Neste estudo optou-se em utilizar doses que
correspondem a 10% da DL50 para o grupo tratado G2 e 50% da DL50 para o grupo tratado
G3. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: O grupo controle
153
G1 (0,5 mL de água destilada), o tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e tratado G3 (1874

mg/kg de ORCD).
2.5 DESENHO EXPERIMENTAL
Este estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 1 (E1) e o Experimento 2 (E2),
de acordo com os segmentos I e II dos estudos de toxicologia reprodutiva, adaptados de
normas da Environmental Protection Agency e recomendados pela Food and Drugs
Administration e Organization for Economic Cooperation and Development. O E1
compreendeu o segmento I, avaliando-se apenas as fêmeas durante a gestação no período de
pré-implantação. Já o E2 compreendeu os seguimentos I (fêmeas no período pós-implantação)
e II (teratogenicidade). Para tanto, dos 40 animais, 15 fêmeas (n=5/grupo experimental,
E1G1, E1G2 e E1G3) e 5 machos reprodutores no E1 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental,
E2G1, E2G2 e E2G3) e 5 machos reprodutores no E2 (Figura 1).
154
ENSAIOS
TOXICOLOGIA
REPRODUTIVA
SEGMENTOS I e II
SEGMENTO I Pós-implantação
Pré-implantação Teratogenicidade
EXPERIMENTO 1 EXPERIMENTO 2
CONTROLE CONTROLE TRATADO 10% DL50 TRATADO 50% DL5

TRATADO 10% DL50 TRATADO 50% DL5 0
0
0,5 mL água 0,5 mL água 366,8 mg/kg
366,8 mg/kg 1874 mg/kg
1874 mg/kg
E1G1 (n=5) E1G2 (n=5) E1G3 (n =5) E2G1 (n=5) E2G2 (n=5) E2G3 (n =5)
Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 1 e 2 para avaliar a toxicologia reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de
acordo com os segmentos I (pré-implantação e pós-implantação) e II (teratogenicidade).
155
2.5.1 Seqüência experimental
2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal)
Após o período de adaptação e ao atingirem a maturidade sexual, aproximadamente

250 g, iniciou-se o exame de esfregaço vaginal, diariamente, pela manhã. Uma micropipeta,
contendo 10μL de soro fisiológico 0,9%, era introduzinda no canal vaginal e, posteriormente,
aspirando juntamente com as células, que eram visualizadas em microscopia óptica, para
detectar a fase do ciclo estral, segundo a técnica descrita por Marcondes et al. (2002) (Quadro
1).
Quadro 1. As quatro fases do ciclo estral, mediante exame de citologia vaginal.

Fase
Caracterização do esfregaço
Duração
Grande número de células epiteliais nucleadas, algumas células epiteliais

Proestro
12 h
queratinizadas (sem núcleo) e ausência total de leucócitos. Fase estrogênica

máxima.
Presença de células queratinizadas e ausência total de leucócitos. Também

Estro
14 h
conhecida como fase estrogênica ou proliferativa.

Metaestro
Inúmeros leucócitos, filamentos de muco e resíduos de células epiteliais

21 h
queratinizadas. É conhecida como fase progesterônica ou secretora.
Período de repouso em que a mucosa vaginal apresenta-se delgada, com

Diestro
57 h
leucócitos e algumas células nucleadas. Também é conhecida como fase

secretora.
2.5.3 Período de Acasalamento
Após a detecção da fase proestro, as fêmeas nulíparas, foram separadas em gaiolas de

polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho ao final da tarde. Nesta
fase ocorre distensão uterina, pico de LH (hormônio luteinizante) e o comportamento de
cópula. É caracterizada como fase estrogênica máxima e a ovulação ocorre espontaneamente
na metade do ciclo escuro durante esta fase.
156
Na manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais foram

coletados. Foi considerada como indicativo de prenhez a presença de espermatozóides,
associado ao diagnóstico da fase estro do ciclo estral, na qual são encontradas apenas células
queratinizadas (COOPER et al., 1993) (Figura 2). Confirmada a prenhez, esse dia foi
considerado como o dia zero (d0) e as fêmeas prenhas foram mantidas em caixas individuais
de polipropileno (414 x 344 x 168 mm). Os acasalamentos foram repetidos até a obtenção do
número suficiente de progenitoras em cada grupo (E1G1, E1G2, E1G3, E2G1, E2G2 e
E2G3). Após, deu-se início a sequência experimental, de acordo com cada protocolo
experimental (E1 e E2).
Figura 2. Esfregaço vaginal confirmando o indicativo de prenhez pela presença de espermatozóides e

células queratinizadas (fase estro).
2.5.4 Experimento 1 (E1)
2.5.4.1 Tratamento no período pré-implantação (d0-d5) E1
Neste ensaio fêmeas prenhas dos grupos E1G1, E1G2 e E1G3 foram tratadas na fase
de pré-implantação do blastocisto no útero, que acontece cinco a seis dias após a fecundação
(ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000; BERNARDI et al., 2002). Desta forma, a duração do
tratamento correspondeu do d0 ao d5 de prenhez, uma vez ao dia.
157
2.5.4.2 Toxidade aguda nas progenitoras E1
Durante o tratamento, as ratas foram avaliadas quanto à presença de manifestações de

sinais de toxidade aguda, tal como: diarréia, piloereção, estresse, tremores, salivação e
hemorragia. Para a avaliação da massa corporal das fêmeas, foi utilizada balança Gehaka
BG4000, com capacidade de 4200 g e precisão de 0,1 g, com registros no d0, d2, d3, d5, d14
e d21 de prenhez. O ganho de massa corporal foi calculado pela diferença entre o final do
tratamento em relação ao início (d5 – d0) e do final da prenhez em relação ao início (d21 –
d0).
O consumo de água e ração foi mensurado, diariamente, após o início do tratamento
até o final da gestação, e utilizou-se a mesma balança citada anteriormente. Diariamente, era
oferecido 50g de ração para cada rata prenha. A ingestão de água também foi medida, com
disponibilidade de 250 mL diariamente.
2.5.4.3 Avaliação da performance reprodutiva E1
No d21 as ratas foram anestesiadas com 50 mg/kg de tiopental sódico (Thiopentax®)

para realização da cesárea, com exposição dos cornos uterinos para observação dos nódulos
de reabsorção e retirada dos ovários para contagem de corpos lúteos com auxílio de uma lupa
Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10x A/22). Após a laparotomia, os implantes foram
contados, fetos e placentas foram retirados, imediatamente, seguindo a eutanásia das
progenitoras em câmara de CO2. As seguintes variáveis foram determinadas.
1. PERDAS PRÉ-IMPLANTES = (no de corpos lúteos – no de implantes/

no de corpos lúteos) x 100.
2. PERDAS PÓS-IMPLANTES = (no de implantes – no de nativivos / no
de implantes) x 100.
3. ÍNDICE DE REABSORÇÕES = (nº reabsorções / nº implantes) x 100;
sendo o nº de reabsorções = (nº implantes) – (nº filhotes nascidos).
4. ÍNDICE PLACENTÁRIO = Peso da Placenta / Peso fetal
5. RAZÃO SEXUAL = (nº machos / nº fêmeas) x 100
158
No caso de ausência de desenvolvimento fetal ou de pontos de implantações visíveis, o

útero foi colocado em solução de NaOH 0,2 % para revelar se houve ou não algum ponto de
implantação naquele útero (LIMA et al, 2011).
2.5.5.1 Tratamento no período pós-implantação (d6-d15) E2
de pós-implantação do blastocisto no útero, que correspondeu do d6 de prenhez ao d15 de
prenhez (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000; BERNARDI et al., 2002), uma vez ao dia.
Idem ao item 2.5.4.2 Contudo, a massa corporal foi registrada no d6, d9, d12, d15 e
d21 e o ganho de ganho de massa corporal foi calculado pela diferença do final do tratamento
ao início do tratamento (d15 – d6) e do final da prenhez ao início da prenhez (d21 – d0). O
consumo de água e ração foi mensurado (idem 2.5.4.2).
2.5.5.3 Avaliação da performance reprodutiva E2
Idem item 2.2.6.3. As seguintes variáveis foram determinadas.

1. PERDAS PRÉ-IMPLANTES = (no de corpos lúteos – no de implantes/
no de corpos lúteos) x 100.
1. PERDAS PÓS-IMPLANTES = (no de implantes – no de nativivos / no
de implantes) x 100.
2. ÍNDICE DE REABSORÇÕES = (nº reabsorções / nº implantes) x 100;
sendo o nº de reabsorções = (nº implantes) – (nº filhotes nascidos).
3. ÍNDICE DE PARTO = (no de fêmeas que pariram / no de fêmeas com
evidência de prenhez) x 100
159
4. ÍNDICE DE NASCIMENTO = (no de nativivos / no de filhotes

nascidos) x 100.
5. RAZÃO SEXUAL = (nº machos / nº fêmeas) x 100
Idem item 2.5.4.3.1.
2.5.6 Avaliação da Embriofetotoxidade E2
2.5.6.1 Peso e classificação dos recém-nascidos (RNs) E2
Após a laparotomia, os RNs foram pesados utilizando-se balança Marte com

capacidade de 500 g e precisão de 0,001 g. Os RNs foram classificados em AIP (Adequado
para Idade de Prenhez), PIP (Pequeno para Idade de Prenhez) e GIP (Grande para Idade de
Prenhez), de acordo com os pesos corpóreos, segundo os parâmetros estabelecidos por
Calderon (1988):
 AIP: Peso corpóreo compreendido entre a média de peso do grupo controle mais ou
menos o desvio-padrão;
 PIP: Peso corpóreo inferior à média de peso do grupo controle menos o desvio-
padrão;
 GIP: Peso corpóreo superior à média do peso do grupo controle mais o desvio-padrão.
Após a pesagem os RNs foram analisados macroscopicamente (Análise Externa) e,

posteriormente, foram processados para as análises Internas (Análise Esquelética e Visceral),
segundo as metodologias descritas por Staples e Schnell (1964) e Wilson (1965),
respectivamente.
160
2.5.7 Teratogenicidade E2
2.5.7.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas E2
Após a pesagem, os RNs foram examinados externamente, com análise minuciosa dos
olhos, boca, implantação das orelhas, conformação craniana, membros anteriores e
posteriores, perfuração anal e cauda (WILSON, 1965) (Figura 3).
Figura 3. Análise das anomalias e/ou malformações externas dos RNs.
2.5.7.2 Análise das anomalias e/ou malformações internas E2
2.5.7.2.1 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas E2
Imediatamente após a análise externa dos RNs, a metade de cada ninhada foi colocada
em álcool 70% por 12 horas; após, os RNs foram colocados em acetona P.A por 24 horas,
eviscerados, diafanizados e corados com vermelho de alizarina, conforme a metodologia
descrita por Staples e Schnell (1964). As análises foram realizadas com o auxílio de
estereomicroscópio Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10 x A/22) (Figura 4).
161
Figura 4. Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas dos RNs.
Os pontos de ossificação foram observados e contados, segundo método proposto por

Aliverti et al. (1979). Foram avaliados os pontos de ossificação nos seguintes locais: esterno,
falanges anteriores e posteriores, metacarpos, metatarsos e vértebras cervicais e caudais.
A análise esquelética consistiu em uma análise minuciosa dos ossos do crânio (nasal,
frontal, parietal, interparietal, supraoccipital e as fontanelas), cervical, costelas e torácicas,
lombar, sacral, caudal, esterno (manúbrio, esternebrios e xifóide), membros superiores
(clavícula, escápula, húmero, ulna, radio, carpo, metacarpo e falanges) e membros inferiores
(ílio, ísquio, púbis, fêmur, fíbula, tíbia, tarso, metatarso e falanges), seguindo os critérios para
determinação de anomalias (calcificação) ou malformações (número, forma, localização e
tamanho), segundo a harmonização proposta por Solecki et al., 2001.
2.5.7.2.2 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações viscerais E2
A outra metade dos RNs de cada ninhada foi colocada em solução de Bouin por 4 dias
para fixação das estruturas viscerais e descalcificação dos ossos; após, foi colocado em álcool
70% até o dia da análise. O método de secção seriada de Wilson (1965) foi utilizado para
observar anomalias e/ou malformações viscerais. As análises foram realizadas com o auxílio
de estereomicroscópio Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10 x A/22) (Figura 5).
162
Figura 5. Processamento dos RNs e secções seriadas de Wilson (1965)
A análise visceral constituiu de uma análise detalhada das secções da cabeça (palato,
septo nasal, coana, bulbo olfatório, cristalino, retina, ventrículos laterais e 3º ventrículo)
(Figuras 6, 7 e 8).
Figura 6. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) septo nasal e (2)
palato.
4
3
2 5 2
1
Figura 7. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) coana, (2) lentes, (3)
cristalino, (4) bulbo olfatório e (5) retina.
163
1 1
Figura 8. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) ventrículos laterais e
(2) 3º ventrículo.
Secções do tórax (traquéia, esôfago, timo, medula, jugular, veia cava superior, átrios,
arco da aorta, veia pulmonar, pulmões, ventrículos, septos interventriculares) (Figuras 9, 10,
11 e 12), abdômen (diafragma, veia cava inferior e veia hepática) (Figuras 13 e 14), pelve
renal (rins, ureteres, bexiga e reto) (Figura 15) e órgãos reprodutores (macho: testículos,
epidídimo, canal deferente; fêmea: ovários e útero) (Figura 16).
3
2
3
1
Figura 9. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Timo, (2) Traquéia,
(3) Esôfago e (4) Medula espinhal.
23
1 5 7
4
7 6
6
Figura 10. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Arco da aorta, (2)
Traquéia, (3) Esôfago, (4) Veia cava superior, (5) Veia pulmonar, (6) átrios e (7) Pulmões.
164
5
6 7
4 4 6
23
1
1
Figura 11. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) átrios direito e
esquerdo, (2) Aorta ascendente, (3) Artéria pulmonar (4) brônquios após bifurcação da traquéia, (5)
Aorta descendente, (6) Lobos pulmonares e (7) Esôfago.
5
4
4 6 4
3
4 2
2 1
Figura 12. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Septo
interventricular, (2) Ventrículos direito e esquerdo (3) Veia cava inferior (4) os quatro lobos do
pulmão (5) Aorta descendente, e (6) Esôfago.
3
3
2
1
1
Figura 13. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) Diafragma, (2)
Veia cava inferior e (3) pulmões.
165
Figura 14. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) Fígado, (2) Ápice
do estômago e (3) Diafragma.
1
3 2
Figura 15. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve. (1) Papila renal (2) Pelve
renal e (3) Rin direito.
3
5 3
6
3 5 2
2 2
1 1 6 1
1
4
4
A B
Figura 16. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve e Análise dos órgãos
reprodutores. (A) Macho. (1) Testículos, (2) Epidídimo, (3) Canal deferente, (4) Bexiga, (5) Ureter e
(6) reto. (B) Fêmea. (1) Útero (cornos uterinos direito e esquerdo), (2) Ovários direito e esquerdo
abaixo dos (3) rins, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto.
As anomalias e/ou malformações investigadas foram: palatosquese, língua bífida,

alterações do septo nasal, microftalmia e macroftalmia (mono ou bilateral), anoftalmia, retina
166
dobrada, lente degradada, anencefalia, hidrocefalia em diversos graus, fístula

traqueoesofágica, arco da aorta duplo ou voltado à direita, destrocardia, sinistrocardia,
cardiomegalia, comunicação intratrial, alteração no septo interventricular, pulmão pequeno ou
grande, hérnia do diafragma, agenesia renal, ectopia renal, hidronefrose, fusão renal,
hipoplasia ou hiperplasia renal, agenesia de ureter, fusão do ureter, duplicação do ureter,
dilatação do ureter (mono ou bilateral), hiperplasia ou hipoplasia vesical.
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E1 E E2
Para comparação dos valores médios entre os grupos de massa corporal, ingestão de
água, consumo de ração, performance reprodutiva materna e pontos de ossificação, foi
empregada análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey. Para a comparação do
percentual de PIP, AIP e GIP, incidência de malformações ou de anomalias fetais aplicou-se o
teste do qui-quadrado, teste de tendência. Foi considerado, como nível de significância
estatística, o limite de 5 % (p < 0,05). As análises estatísticas foram realizadas empregando-se
software Instat GraphPad® e os gráficos foram construídos no software Prism GraphPad®.
167
3.1 EXPERIMENTO 1 (E1)
3.1.1 Toxidade aguda nas progenitoras E1
O tratamento com ORCD no período pré-implantação (d0-d5) não provocou sinais

clínicos de toxidade no grupo E1G2 (366,89 mg/kg). Contudo, no grupo E1G3 (1874 mg/kg)
foi observado alguns sinais clínicos de toxidade aguda, tal como, diarreia (1/5), piloereção
(3/5), estresse (4/5), agitação (5/5), hemorragia nasal (2/5) e vaginal (1/5) (Figura 17). Além
disso, houve registro de um óbito no d5 de prenhez, que correpondeu ao 6º dia de tratamento.
A toxidade sistêmica é manifestada através das alterações no desevolvimento ponderal
dos animais, redução do consumo de água e ração e alterações comportamentais, tal como,
apatia, sangramento e piloereção (MELLO et al., 1997). Neste estudo, essas alterações
comportamentais foram observadas, inclusive com ocorrência de óbito. Por outro lado,
Sachetti et al. (2009) avaliaram os sinais clínicos de toxidade aguda, após tratamento com C.
reticulata, em ratas prenhas e atribuíram os sinais clínicos encontrados (piloereção, diarreia e
cromodacriorréia) ao stresse durante o experimento, pois os mesmos sinais foram detectados
no grupo controle. No presente estudo, alterações comportamentais não foram observadas no
grupo controle E1G1.
Figura 17. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E1G3) no período de pré-
implantação (d0-d5). Sinal clínico de toxidade aguda (hemorragia nasal).
168
3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E1
Durante o tratamento (d0-d5), as ratas dos grupos E1G1 (controle) e E2G2 (366,89
mg/kg) ganharam massa corporal e sua evolução foi normal. Contudo, o grupo E1G3, que foi
tratado com a maior dose (1874 mg/kg), perdeu massa durante o tratamento e voltaram a
ganhar após o término do tratamento (d14). Asssim, pode-se inferir que o ORCD interferiu na
massa corporal, no entanto, foi significativo (p<0,05) apenas no d5 de prenhez (Figura 18).
340
E1G1
massa corporal (g)
320 E1G2
300 E1G3
280
260 a,b
240
220
d0 d2 d3 d5 d14
Tempo de prenhez (dias)
Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e ORCD 1874 mg/kg
(E1G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação
(d0-d5) e após o tratamento (d14). No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5
mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 são indicados pelos
índices a(em relação ao E1G1) e b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de Variância
(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).
A redução na massa corporal ou redução no ganho de massa deve-se a uma variedade

de respostas, que pode estar associada apenas a uma anorexia induzida pelo tratamento ou
toxidade sistêmica (US EPA, 1996). É importante ressaltar que o d5, dia em que houve
diminuição significativa em relação ao grupo controle (E1G1), correpondeu ao final da
implantação do blastocisto no útero (BERNARDI et al., 2002). Contudo, não foram
observadas no E1G3 diferenças significativas quanto às perdas pré-implantação (dados
descritos na Tabela 1). Por outro lado, estudo conduzido por Lourenço et al. (2009) com
camundongas prenhas que receberam três doses (297,48 mg/kg, 594,96 mg/kg e 892,44
mg/kg) de C. langsdorfii , concluíram que o óleoresina estudado não alterou o ganho de peso
materno.
169
3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E1
O tratamento com ORCD não alterou a ingestão de água, não sendo observadas
diferenças entre o grupo controle e os tratados (E1G2 e E1G3) e entre os períodos de
tratamento (d0-d5) e após o tratamento (d6-d10) (Figura 19).
40
E1G1
35
E1G2
30
E1G3
Água (mL)
25
20
15
10
5
0
1 2 1 2 1 2
(E1G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-
d5) [1] e após o tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada
(0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos
índices a(em relação ao E1G1) e b(E1G3 em relação ao E1G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o
tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo,
sendo E1G3 n=4).
Ao analisar a ingestão diária de água, apenas no período de tratamento (d0-d5), nota-

se que também não foi detectada diferenças significativas entre os grupos em cada dia, a
exceção do d1 no qual o grupo E1G3 diferiu (p<0,05) em relação ao E1G2 (Figura 20).
O ORCD, tanto na menor dose (366,89 mg/kg – E1G2) como na maior dose (1874
mg/kg – E1G3) alterou o consumo de ração. No grupo E1G3 também houve diferença
estatística ao comparar o período 1 que corresponde ao de tratamento (d0-d5) e o período 2
que corresponde o pós-tratamento (d6-d10) (Figura 21).
170
50
E1G1
40 E1G2
E1G3
Água (mL)
30
20 b
10
0
d0 d1 d2 d3 d4 d5
(E1G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação
(d0-d5). No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos
representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao
E1G1) e b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste
30
E1G1
25 E1G2
20 E1G3
Ração (g)
a
a, c
15
10 a, b
0
1 2 1 2 1 2
(E1G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5)
[1] e após o tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5
mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos
índices a(em relação ao E1G1), b(E1G3 em relação ao E1G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o
tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo
E1G3 n=4).
O consumo diário de ração foi alterado pelo tratamento com ORCD. Nos dias d0, d1 e
d2 houve um comportamento semelhante entre os grupos tratados (E1G2 e E1G3), porém o
grupo E1G3 diferiu (p<0,05), tanto do grupo controle (E1G1) como do E1G2 (366,89 mg/kg),
nos dias d0, d1, d2 e d3 de prenhez e, consequentemente, de tratamento (Figura 22).
171
25
E1G1
20 E1G2
E1G3
Ração (g)
15
a,b
10 a,b
a,b
5 a,b
0
d0 d1 d2 d3 d4 d5
(E1G3), sobre o consumo diário de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação
Os toxicologistas têm buscado entender como a mudança no peso corporal pode afetar
a função reprodutiva. De fato, sabe-se que em fêmeas, o peso corporal flutua normalmente
com o estado fisiológico do animal, até mesmo porque os hormônios femininos (estrogênio e
progesterona) influenciam na ingestão de alimentos e no consumo energético; as taxas de
retenção de água e deposição de gordura também são afetadas. O consumo de alimento é
elevado durante a gestação, em parte devido ao elevado nível de progesterona sérica (BAIRD,
2000).
No presente estudo vale ressaltar que houve diminuição do consumo de ração durante
o tratamento com ORCD nas duas doses (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg). No grupo que recebeu
a maior dose (1874 mg/kg) o consumo foi ainda menor e este achado pode ser associado à
perda de massa corpórea neste grupo (E1G3).
3.1.2 Performance reprodutiva materna E1
A performance reprodutiva materna foi avaliada e entre os parâmetros, tal como, nº de

corpos lúteos, implantações, fetos vivos e reabsorções não foi observada diferença entre os
172
grupos. Da mesma forma, também não foi encontrada diferença nos grupos entre as perdas
pré-implantação, pós-implantação, índices de reabsorções e razão sexual. Portanto, o
tratamento com ORCD não foi capaz de interferir nesses parâmetros, contudo, alterou o
ganho de peso materno no período de pré-implantação, que correspondeu ao mesmo período
de tratamento, por conseguinte alterou o peso fetal e o índice placentário no grupo E1G3 e o
peso fetal do E1G2 (Tabela 1).
Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance reprodutiva materna de
ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5).
E1G1 E1G2 E1G3
Fêmeas acasaladas (n) 5 5 5
† durante o tratamento (n) 0 0 1
Corpos lúteos (n) 11.20 ± 0.37 10.80 ± 1.31 11.50 ± 0.64
Implantações (n) 10.60 ± 0.50 10.60 ± 0.67 10.75 ± 0.94
Fetos vivos (n) 10.40 ± 0.50 9.20 ± 1.06 8.00 ± 2.41
Reabsorções (n) 0.20 ± 0.20 1.40 ± 0.67 2.75 ± 1.54
Perda pré-implantação (%) 5.00 ± 5.00 11.49 ± 4.99 9.00 ± 4.12
Perda pós-implantação (%) 1.81 ± 1.81 7.78 ± 5.10 30.39 ± 19.72
Índice de reabsorção (%) 1.81 ± 1.81 13.78 ± 6.97 30.39 ± 19.72
Razão sexual (%) 79.66 ± 36.47 125.50 ± 47.30 26.66 ± 46.18
Ganho de peso materno 14.00 ± 2.72 18.40 ± 3.77 - 19.00 ± 3.14a,b
no tratamento (d0-d5) (g)
Ganho de peso materno 83.80 ± 3.76 80.60 ± 3.64 52.50 ± 19.37
na prenhez (d0-d21)(g)
Peso fetal (g) 4.50 ± 0.08 4.84 ± 0.04a 3.04 ±0.07a,b
Peso placentário (g) 0.53 ± 0.01 0.56 ± 0.01 0.51 ± 0.06
Índice placentário 0.11 ± 0.00 0.11 ± 0.00 0.19 ± 0.01a,b
O grupo controle (E1G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados receberam ORCD 366,89 mg/kg
(E1G2) e ORCD 1874 mg/kg (E1G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e os valores com p < 0,05 estão
indicados pelos índices a(em relação ao E1G1) e b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de variância
(ANOVA) seguido do teste de tukey.
Na rata, o corpo lúteo permanece dominante durante todo o curso da gestação e é a

fonte primária de estrogênios e progestogênios (principalmente progesterona) (GOPINATH,
2013). Neste estudo o ORCD nas doses administradas não alterou o número de corpos lúteos,
perdas pré e pós-implantação. Segundo Gray et al. (2004), a implantação em ratos e seres
173
humanos é também caracterizada por uma pronunciada reação estroma-endométrio, referida

como decidualização (a decídua forma o componente maternal da placenta). A característica
fundamental deste processo é o desenvolvimento sincronizado do embrião para o estágio de
blastocisto e a diferenciação do útero para o estado receptivo. Em seguida ocorrem interações
entre o blastocisto ativado e o epitélio uterino para iniciar a implantação (PARIA e col.,
2000).
A ocorrência de estresse oxidativo no início da gestação pode prejudicar o
desenvolvimento da placenta e /ou acelerar a degeneração do sinciotrofoblasto, culminando
com perdas pré-implantação (GUPTA et al. 2007). O estresse oxidativo é caracterizado como
um distúrbio no estado de equilíbrio dos sistemas pró-oxidantes /antioxidantes em células
intactas. Quando ocorrem eventos oxidativos adicionais, os sistemas pró-oxidantes podem
aumentar com relação aos antioxidantes, resultando em danos oxidativos (SIES; STAHL;
SEVANIAN, 2005). Esses danos causam toxicidade nas células e tecidos, ao afetar a
homeostase do retículo endoplasmático (HANSEN; HARRIS, 2013). A persistência do stresse
oxidadativo pode, eventualmente, aumentar a apoptose das células deciduais e resultar em
perdas pré-implantação (LIU et al. 2011).
O ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg), administrado neste período crítico do
densenvolvimento, pré-implantação, demonstrou não alterar esse processo de sincronização,
com êxito nas implantações do blastocisto no útero. Quanto as perda pós-implantação, estas
foram avaliadas mesmo não compreendendo o período de tratamento com ORCD. Não foi
observada diferença entre os grupos, o que poderia descartar a hipótese de perda pós-
implantação por metabólitos do ORCD ainda presentes no sangue materno. No entanto houve
alterações significativas no peso fetal (nas duas doses) e índice placentário (na maior dose),
sugerindo a presença de metabólitos do ORCD, no entanto estudos adicionais, de
toxicocinética devem ser realizados para melhor definição e compreensão desses efeitos.
No presente estudo, o marcador utilizado foi o β-cariofileno. Liu et al. (2013)
investigaram a biodisponibilidade oral e farmacocinética do β-cariofileno livre e complexado
com a ciclodestrina (β-cariofileno/ciclodextrina) após uma única dose oral de 50 mg/kg em
ratos. GC/MS/SIM foi utilizado para determinar as concentrações de β-cariofileno no plasma,
que demonstrou biodiponibilidade 2,6x maior que o β-cariofileno complexado. Nos resultados
do referido estudo β-cariofileno livre obteve concentração plasmática máxima de 0.12 ± 0.02
µg/mL e o tempo para atingir a concentração máximo de 3.50 ± 0.60 horas, e tempo médio de
de 4.07 ± 0.07 horas.
174
Diversos outros fatores podem ser indicados como responsáveis pelo retardamento do
crescimento fetal. Sabe-se que o crescimento e a diferenciação do feto são determinados
basicamente por informações genéticas contidas no interior das células em fase de divisão e
multiplicação. Superpondo-se ao controle genético, atuam fatores restritivos do crescimento,
que limitam a utilização de nutrientes pelas células, e fatores estimulantes, tais como
hormônios. Do equilíbrio entre esses fatores resultará a curva de crescimento fetal, bem como
o peso do feto ao nascimento. Além disso, o crescimento fetal é influenciado positivamente
ou negativamente pelo estado nutricional materno (DIETZ et al., 2009).
O tratamento com ORCD no período pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade

aguda, provocando diarreia e agitação após o tratamento, tanto no grupo E2G2 (366,89
mg/kg) como no grupo E2G3 (1874 mg/kg). Porém outros sinais clínicos de toxidade
ocorreram apenas com o tratamento com a maior dose, tal como estresse (4/5), piloereção
(4/5), sialorréia (1/5), apatia (1/5), desidratação (1/5), hemorragia nasal (3/5) e vaginal (2/5),
caracterizando aborto espontâneo (Figura 23).
Figura 23. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E2G3) no período de pós-
implantação (d6-d15). Sinal clínico de toxidade aguda e aborto espontâneo.
175
Em estudos de toxidade reprodutiva, o uso de doses elevadas é de fundamental

importância, muito mais que nos outros tipos de estudo de toxidade. Este fato deve-se a
necessidade da compreensão dos feitos tóxicos sistêmicos, por exemplo, os sinais clínicos,
diminuição do ganho de peso corporal (não mais do que 10%) e/ou evidência de toxicidade
em algum órgão alvo (OECD, 2001). Acredita-se que a taxa de aborto espontâneo precoce,
em humanos, seja em torno de 50%. Os abortamentos espontâneos ocorrem por várias razões,
uma delas é a presença de anormalidades cromossômicas, as demais estão relacionados aos
fatores maternos (GUPTA et al., 2007).
No presente estudo, não houve abortos espontâneos no grupo controle (E2G1), e os
casos registrados estão associados à toxidade materna sistêmica do ORCD 1874 mg/kg.
Oestensen et al. (2006) afirmam que algumas substâncias tóxicas podem atravessar a barreira
placentária e interferir no desenvolvimento embriofetal, muitas vezes de forma negativa. A
exposição a agentes químicos e drogas podem gerar um desequilíbrio no processo de oxi-
redução e induzir mudanças nos processos metabólicos (HANSEN; HARRIS, 2013). Por
outro lado, Sotto et al. (2013) publicaram um trabalho que demonstra que o óxido de β-
cariofileno, embora absorvido através das membranas celulares e apesar da sua estrutura
química potencialmente reativo, é desprovido de efeitos genotóxicos, pois não induz pontos
mutações e danos. Este composto, o β-cariofileno está presente no ORCD (0,5 µg/mL), no
entanto, outros constituintes estão presentes no ORCD com ação sinérgica entre seus
constituintes (IZUMI et al., 2012).
3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E2
Houve um comportamento semelhante entre os grupos E2G1 e E2G2 na evolução da

massa corporal durante o tratamento (d6-d15), porém os valores diferiram entre si ao nível de
5%. Já o grupo E2G3, o ORCD alterou a evolução do ganho de massa corporal, pois o gráfico
demonstra uma queda acentuada de massa corpórea durante o tratamento, voltando a evoluir
após o tratamento (d15-d21). A média do grupo que recebeu a maior dose (1874 mg/kg -
E2G3) foi diferente, tanto em relação ao grupo controle (E2G1) como o tratado com a menor
dose (E2G2) (Figura 24).
A alteração da massa coporal é um importante parâmetro utilizado nos ensaios
toxicológicos não clínicos para indicar efeitos adversos de drogas e substâncias químicas
(TEO et al., 2002), sendo importante que os animais sobreviventes não percam mais do que
176
10% do seu peso corporal inicial (KLAASSEN; WATKINS, 2012). A gestação é

caracterizada pelo aumento progressivo da massa corporal materna, decorrente do
crescimento fetal e seus anexos (aproximadamente 40%) e de adaptações próprias do
organismo (os demais 60%), caracterizados por anabolismo no início e catabolismo no final
da gestação (RUDGE; BORGES; CALDERON, 2000). Neste estudo, o tratamento com
ORCD 1874 mg/kg diminuiu mais que 10% da massa corporal das ratas. Não houve o
aumento progressivo esperado na prenhez, em torno de 40%.
400
E2G1
massa corporal (g)
E2G2
350
a
E2G3
a
a
a
300
b a,b
a,b
250 a,b
200
d6 d9 d12 d15 d21
(E2G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de ratas prenhas tratadas no período de pós-
implantação (d6-d15) e após o tratamento (d21). No grupo controle (E2G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão
indicados pelos índices a(em relação ao E2G1) e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise
de Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E2
O ORCD nas doses administradas no período de pós-implantação não foi capaz de

interferir na ingestão hídrica. Embora tenha sido detectado diferenças, significativas, entre os
períodos 1 de tratamento (d6-d16) e o período 2 de pós-tratamento (d16-d20) no grupo E2G2,
este não diferiram, significativamente, do grupo controle (E2G1). No grupo E2G3 houve um
aumento significativo após o período de tratamento, diferindo tanto do grupo controle (E2G1)
como do grupo tratado com a menor dose (366,89 mg/kg - E2G2) (Figura 25). A ingestão
diária hídrica, também não foi alterada pela administração do ORCD, contudo, embora não
177
seja significativo, o grupo E2G3 apresentou um consumo menor quando comparado com os
grupos controle (E2G1) e tratado 366,89 mg/kg (E2G3) (Figura 26).
60
E2G1
50 c E2G2
E2G3
Água (mL)
40 a,b
30
20
10
0
1 2 1 2 1 2
(E2G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-
d15) [1] e após o tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada
(0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos
índices a(em relação ao E2G1), b(E2G3 em relação ao E2G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o
tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
60
E2G1
50 E2G2
Água (mL)
E2G3
40
30
20
10
6 7º 8 9º 10 11 12 13 14 15
(E2G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação
(d6-d15). No grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os dados
representam a média ± Erro Padrão da Média e resultados com p < 0,05, estatisticamente
significativos, são representados pelos índices a(em relação ao E2G1), b(E2G3 em relação ao E2G2).
Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
178
A média do consumo de ração durante o tratamento foi menor no grupo E2G3

(p<0,05). O ORCD nas doses administradas influenciou o consumo de ração, pois houve
diferença na média do consumo durante o período 1 de tratamento (d6-d15) e período 2 de
pós-tratamento (d16-d20) (Figura 27). No entanto, o aumento do consumo de ração também
pode estar associado a evolução da prenhez, pois no final há necessidade de um aumento da
capacidade nutricional e energética, inerentes às alterações fisiológicas e crescimento
ponderal do feto (RUDGE; BORGES; CALDERON, 2000).
30
E2G1
25 c E2G2
20 E2G3
Ração (g)
b, c
15
a,b
10
0
Figura 27. Efeito do 1 2 1 2 1 2 tratamento por via oral com
ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas
prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o tratamento (d16-d20) [2]. No
grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a
média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E2G1), b(E2G3
em relação ao E2G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o tratamento). Foi aplicado Análise de
Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).
A administração, via oral do ORCD 1874 mg/kg (50% DL50) foi capaz de diminuir o
consumo diário de ração das ratas prenhas, com difereças significativas (d9-d15) (Figura 28),
coincidindo com a diminuição da massa corpórea deste grupo. Segundo Fowden et al. (2006)
a nutrição materna exerce um importante papel no desenvolvimento e modulação dos sistemas
fisiológicos do ser em formação.
179
25
E2G1
20 E2G2
E2G3
Ração (g)
15 b
a,b
10 a,b a,b
a
a,b
5
0
d6 d7 d8 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d15
Tempo (dias)
(E2G3), sobre a ingestão diária de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação
O tratamento com ORCD 1874 mg/kg, tanto no período de pré como no pós-
implantação causou toxidade sistêmica. Segundo Mello (2001), a toxicidade sistêmica pode
ser diagnosticada pela diminuição da massa corporal dos animais, diminuição do
desenvolvimento ponderal e pelo aparecimento de alterações comportamentais como apatia,
prostração e piloereção.
3.2.2 Performance reprodutiva materna E2
A tabela 2 mostra que o tratamento com ORCD não alterou de forma estatisticamente
significativa as seguintes variáveis reprodutivas: (nº de corpos lúteos, de implantações, de
reabsorções, perdas pós-implantação, índice de parto, índice de nascimento, peso fetal e peso
placentário). No entando o ORCD 1874 mg/kg demonstrou ter efeito sobre o número de fetos
vivos e o índice placentário e, consequentemente, influência sobre o ganho de peso materno
durante o tratamento e por toda prenhez. É importante ressaltar que houve perda de peso no
grupo E2G3, que diferiu (p<0,05) em relação à dose de 366,89 mg/kg do E2G2 (Tabela 2).
180
Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance reprodutiva materna de
ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15).
E2G1 E2G2 E2G3

Fêmeas acasaladas (n) 5 5 5
† durante o tratamento (n) 0 0 0
nº de corpos lúteos 12.20 ± 0.80 11.40 ± 0.92 12.60 ± 1.47
nº de implantações 9.00 ± 1.61 9.00 ± 1.22 5.80 ± 1.53
nº de fetos vivos 8.80 ± 1.77 8.40 ± 1.56 2.20 ± 1.71a
Reabsorções (n) 0.20 ± 0.20 0.60 ± 0.40 3.60 ± 1.47
Perda pré-implantação (%) 24.73 ± 13.05 15.45 ± 4.74 66.89 ± 13.54
Perda pós-implantação (%) 5.00 ± 5.00 10.22 ± 7.74 54.00 ± 22.21
Índice de parto (%) 100 ± 0.00 100 ± 0.00 80 ± 0.00
Índice de nascimento (%) 100 ± 0.00 100 ± 0.00 100 ± 0.00
Ganho de peso materno 19.00 ± 4.61 27.20 ± 5.94 -49.60 ± 14.46ª,b
no tratamento (d6-d15) (g)
Ganho de peso materno 88.20 ± 10.38 72.40 ± 11.71 -15.40 ± 27.56ª,b
na prenhez (d0-d21) (g)
Peso fetal (g) 4.86 ± 0.08 4.96 ± 0.04 4.63 ± 0.07
Peso placentário (g) 0.50 ± 0.01 0.48 ± 0.01 0.55 ± 0.06
Índice placentário 0.10 ± 0.00 0.09 ± 0.00 0.11 ± 0.01 b
(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e os valores com p < 0,05 estão
indicados pelos índices a(em relação ao E2G1) e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de
Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey.
O peso dos ovários e o número de corpos lúteos na prenhez são capazes de deduzir,
indiretamente, as condições hormonais relativas à progesterona materna. Nível inadequado
desse hormônio interfere na viabilidade do embrião, pois não permite que o endométrio se
torne, adequadamente preparado, para manutenção da prenhez (BAIRD, 2000). No presente
estudo a prenhez foi mantida, com índice de nascimento de 100% em todos os grupos, não
havendo diferença, também, entre o número de corpos lúteos, perdas pré e pós-implantação.
Assim, é possível inferir que, a progesterona esteve em níveis adequados e que o ORCD nas
doses administradas (366,89 e 1874 mg/kg) não foi capaz de alterar seus níveis plasmáticos.
A placenta é um órgão materno fetal pelo qual se dão as trocas de substâncias, tal
como nutrientes e oxigênio. Assim, os vasos do cordão umbilical unem a circulação
placentária à circulação fetal e a placenta sintetiza glicogênio, colesterol e ácidos graxos, que
181
servem de fonte de nutrientes e energia para embrião/feto (KINGDOM; KAUFMANN,

1999). A média do peso fetal foi menor no grupo E2G3, no entanto, sem diferenças
significativas entre os grupos. O peso fetal pode ser alterado por fatores ambientais ou agentes
tóxicos com consequência direta destes agentes/fatores sobre o concepto em desenvolvimento
ou ao nível placentário (GOODMAN; JAMES; HARBISON, 1982). Para Aliverti et al.
(1979), o peso fetal não é parâmetro conclusivo em estudos de desenvolvimento porque pode
variar dependendo do tamanho da ninhada.
De acordo com a fórmula aplicada, o peso fetal é inversamente proporcional índice
placentário. Neste estudo o ORCD 1874 mg/kg alterou de maneira significativa o índice
placentário. Este índice (relação peso placenta/peso do feto) é usado como padrão de função
placentária (KINGDOM; KAUFMANN, 1999). Vários autores já observaram que diversos
fatores, tais como hipertensão, desnutrição materna, infecção intra-uterina e fumo, prejudicam
o desenvolvimento placentário, determinando placentas pequenas e com baixo conteúdo de
DNA, RNA e proteínas (KINGDOM; KAUFMANN, 1999; ROSSO, 2006).
O número de reabsorções do grupo E2G3, embora não tenha sido significativo
(p<0,05), notou-se maior ocorrência neste grupo, sendo observadas, inclusive, reabsorções
tardias (Figura 30). A partir da implantação, o embrião pode continuar seu desenvolvimento
normal, desenvolver-se anormalmente ou morrer. Reabsorção é o nome que se dá para a lise
‘in situ’ de um embrião ou feto (KALTER, 1980).
A B
implantação (d6-d15). (A) Útero normal com fetos e placentas (E2G1) e (B) Útero de rata com
reabsorções tardias no corno esquerdo (E2G3) (ponta da seta).
O ORCD nas doses administradas não foi o agente causador das reabsorções
encontradas no útero das ratas tratadas. De modo semelhante, Almeida e Lemônica (2000)
182
encontraram aumento no número de reabsorções com o aumento da dose (440 e 880 mg/kg)
de Coleus barbatus, porém sem diferença estatística significativa. Lourenço et al. (2009)
também não encontraram reabsorções associadas ao tratamento com óleoresina de C.
langsdorfii.
No presente estudo a reabsorção (Figura 29) não ocorreu durante a gastrulação, mas
em período posterior, o de organogênese. No entanto, a exposição de agentes químicos no
útero podem ocasionar falhas no controle do sistema de redox e sinalização. O mecanismo
que envolve a geração de espécies reativas ao oxigênio e estresse oxidativo foi estudado por
Hansen e Harris (2013) para melhor compreensão desses efeitos. Em ratos, se a glutationa
sintetase não for produzida as células morrem durante a gastrulação (SHI et al. 2000), por isso
a glutationa sintetase é tão importante no início do desenvolvimento. Na organogênese, os
períodos de maior sensibilidade dos embriões de ratos a teratógenos é o 10º dia por apresentar
baixa concentração da glutationa sintetase (17 nmol/mg) comparado ao 14.5º dia (45
nmol/mg) (HIRANRUENGCHOK; HARRIS, 1993; LIU; CHAN; KUBOW, 2007). Todavia,
em um outro estudo recente, Abbas et al. (2013) demonstraram que o β-cariofileno causa
regressão significativa no tamanho de cistos e produz apoptose no explante endometrial, sem
interferir na prenhez ou ovulação.
3.2.3.1 Embriofetoxidade E2
Um critério indicativo de embriofetoxidade é avaliar o percentual de RN´s que

nasceram pequenos (PIP), guandes (GIP) ou adequados (AIP) a idade de prenhez. Quanto a
esse critério, o ORCD nas duas doses administradas não foi capaz de interferir no tamanho
desses RN´s, não havendo diferença estatística entre os grupos analisados (Figura 30). Um
suprimento adequado de nutrientes é essencial para o desenvolvimento intra-uterino do feto
(REGNAULT et al., 2002). Distúrbios no suprimento sanguíneo uterino estão associados com
alta morbidade pré-natal e neonatal e restrição de crescimento intra-uterino (AUGUSTIN,
2000; ZYGMUNT e col., 2003). Segundo Khera (1987), estudos com animais avaliam a
embriotoxidade como consequência da toxidade materna (associado à perda de peso materno
durante a prenhez).
Contudo, neste estudo, apesar de evidências quanto à diminuição do ganho de peso
materno e consumo de ração, com diferenças significantes em relação ao controle,
principalmente o E2G3, que recebeu a maior dose (1874 mg/kg); não houve toxidade fetal,
183
que poderia ter ocorrido indiretamente, por meio da toxidade materna encontrada. Estes
resultados são diferentes dos esperados, segundo a literatura (BARROW, 2000; JONG-
CHOON KIM et al., 2001). Portanto, as duas doses administradas de ORCD em ratas prenhaz
no período de organogênese não alterou o crescimento fetal.
100
E2G1
80 E2G2
percentual (%)
E2G3
60
40
20
0
<
PIP AIP GIP
(E2G3), sobre recém-nascidos de progenitoras tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No
grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a
média dos grupos. PIP: Pequeno para Idade de Prenhez. AIP: Adequado para Idade de Prenhez, GIP:
Grande para Idade de Prenhez. O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os percentuais não diferiram
entre si ao nível de 5% (p>0,05).
3.2.4 Teratogenicidade E2
3.2.4.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais)
E2
Quanto a análise da teratogenicidade, o ORCD nas doses administradas, 366,89 mg/kg
e 1874 mg/kg, não causou nenhum tipo de alteração ou malformação, tanto externamente
como internamente (esquelética e visceral). Esse resultado foi observado ao analisar tanto os
RN´s como as ninhadas afetadas (Tabela 3). Apesar do efeito sistêmico do ORCD de toxidade
aguda no período de organogênese, o mesmo não foi capaz de interferir na formação dos
órgãos rudimentares.
184
Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-d15),
sobre a frequência das anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em
ninhadas e recém-nascidos.
E2G1 E2G2 E2G3

Malformações externas
Recém-nascidos afetados 0/44 0/42 0/11
Ninhadas afetadas 0/5 0/5 0/3
Anomalias externas
Malformações esqueléticas
Anomalias esqueléticas
Malformações viscerais
Anomalias viscerais
(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os valores não diferiram entre si
ao nível de 5% (p>0,05).
Segundo Hansen e Harris (2013), teratógenos são substâncias químicas, naturais ou

farmacêuticas, que causam algum defeito específico ao nascimento ou determinados defeitos.
Mais de 1000 teratógenos já foram identificados através de ensaios utilizando animais e
destes, muitos já se apresentaram também teratogênicos em seres humanos (SCHARDEIN,
2000). Os achados comumente encontrados nos estudos de teratologia são morte do
embrião/feto, retardo do crescimento fetal, aumento da incidência de aberrações menores em
estrutura e variações na ossificação do esqueleto, mas nenhum aumento de malformações
estruturais (WEBSTER; FREEMAN, 2001).
185
Os estudos em teratologia, geralmente, utilizam determinado número de ninhadas por

grupo, sendo esta considerada como unidade experimental. A detecção da incidência de
defeitos congênitos é baixa, porém, isto pode ser ajustado, se a dose utilizada for tóxica,
podendo resultar numa exposição sistêmica maior do que a esperada no ser humano. Nessas
condições, é possível detectar teratógenos humanos por afetarem mais ninhadas
experimentais. Diante disso, é importante ressaltar que estudos teratológicos não buscam
detectar pequenas incidências de anormalidades (WEBSTER; FREEMN, 2001). Neste estudo
a dose utilizada foi elevada, possivelmente tóxica, que correponde a 50% e 10 % da DL50,
1874 e 366,89 mg/kg, respectivamente.
Nos últimos 20 anos, diversos trabalhos têm sugerido que o estresse oxidativo é um
fator crítico na teratogênese (FANTEL, 1996; FANTEL; PERSON, 2002; WELLS et al.
2005; HANSEN, 2006; KOVACIC; SOMANATHAN, 2006; DENNERY, 2007; WELLS et
al., 2009; WILFFERT et al. 2011; HANSEN; HARRIS, 2013). No início da organogênese, as
mitocôndrias ainda estão imaturas e a execução de sua função metabólica encontra-se
diminuída (O’HARA et al., 2003). No entanto, esse período coincide com a mudança do
metabolismo anaeróbico para o aeróbio e o embrião passa a depender cada vez mais da
fosforilação oxidativa para atender suas maiores necessidades energéticas (FANTEL;
PERSON, 2002). A diminuição da função antioxidante durante as fases iniciais da
organogênese resulta em maior susceptibilidade, pois a oxidação prolongada pode ser
prejudicial. O estresse oxidativo explica por que alguns eventos são ativados ou desativados,
causando disfunção celular ou morte celular, podendo levar a teratogênese (HANSEN;
HARRIS, 2013).
O estresse oxidativo em uma definição toxicológica baseia-se na toxidade gerada pelo
acumulo espécies reativas ao oxigênio e a perda da capacidade antioxidante, que resulta em
morte celular. Na teratogênese, esses pontos pode não ser apenas o resultado de morte celular
prematura, mas em vez disso, pode ser o resultado da crítica desregulação da sinalização
celular. A sensibilidade dos ratos aos teratógenos varia com a fase de desenvolvimento dos
órgãos que venha a ser mais susceptível em um determinado momento. Por exemplo, no 9º
dia de prenhez os olhos e o cérebro são mais suscetíveis às agressões, mas o paladar e sistema
urogenital são afetados. Por outro lado, no 13º de gestação, o palato e sistema urogenital são
os mais suscetíveis, com os olhos e o cérebro mais resistente a teratógenos (WILSON, 1973).
Neste estudo o ORCD nas doses administradas, 366 mg/kg e 1874 mg/kg, não
induziram efeitos teratogênicos, se comparados ao grupo controle E3G1. Esperava-se que no
186
grupo controle E3G1 houvesse uma incidência menos expressiva de anomalias e/ou
malformações. No entanto, embora expressiva, não apresentou significância estatística entre
os grupos, tanto em relação ao número de filhotes quanto às ninhadas afetadas. Assim, a
equidade de anomalias e/ou malformações nos grupos tratado E3G2 e E3G3 podem estar
associado a um efeito protetor (antioxidante) do ORCD, presença de 0,5% (0,5 µg/mL) de β-
cariofileno. Calleja et al. (2013) testou a inibição da peroxidação lipídica utilizando o β-
cariofileno, e os resultados sugerem que esse sesquiterpeno, presente em numerosas plantas e
alimentos, seja um antioxidante natural.
Outro princípio básico importante da teratogênese é a indução de dismorfogênense nas
espécies sensíveis. Em geral, os períodos de desenvolvimento da susceptibilidade das
malformações estruturais ocorrem, principalmente, durante a organogênese (KARNOFSKY,
1965). A fase de desenvolvimento é conhecida pela especialização dos tipos celulares e suas
funções. O início e a duração da organogênese diferem entre espécies diferentes. Por isso os
estudos envolvem duas espécies de mamíferos, uma roedora e outra não roedora (SCHÜLER-
FACCINI et al., 2001). Este estudo utilizou uma espécie roedora, Rattus novergicus da
linhagem Wistar, e alterações e/ou malformações encontradas não estiveram associadas ao
uso do ORCD no período de organogênese.
No entanto, a exemplo da talidomida, que induz efeitos teratogênicos em humanos e
coelhos, e pequenos efeitos em ratos (PARMAN et al., 1999), sugere-se estudos adicionais
para melhor definir a segurança de uso do ORCD na espécie humana. A talidomida é um
produto sintético e seus efeitos deve-se apenas a ação de uma única molécula e um
determinado alvo-receptor, que difere muito frente a um produto natural, a exemplo do
ORCD, caracterizado, principalmente, por um conjunto de moléculas ativas que atuam em
diversos alvos-receptores. A ação do ORCD não se deve a ativação de uma única molécula
(IZUMI et al., 2012; VENEZIANI et al., 2010), mas a um conjunto de moléculas que atuam
em sinergismo farmacológico, diminuindo respostas exacerbadas de um único receptor
(TYLER, 1997). Todavia, ao analisar o percentual das alterações e/ou malformações, sem
utilizar a ninhada como unidade experimental, o ORCD na dose de 1874 mg/kg (E2G3)
alterou o percentual das anomalias e/ou malformações esqueléticas encontradas, com
diferenças significativas, em relação o tamanho da occipital e na ossificação da fontanela
(Tabela 4) (Figura 31).
187
Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-d15),
sobre o percentual das anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em
ninhadas e recém-nascidos.
E2G1 E2G2 E2G3
Malformações esqueléticas (%)
Presença ou ausência
Agenesia esternébrio 4,54 4,54 0
Agenesia de costela 4,54 4,54 0
Forma
Esternébrio em “borboleta” 18,10 9,09 0
Localização
Vértebra torácica 4,54 0 0
Vértebra lombar 0 4,54 0
Esternébrio 0 4,54 0
Tamanho
Interparietal 0 9,09 0
occipital 0 0 40,0 a
Anomalias esqueléticas (%)
Ossificação incompleta
Vértebra lombar 4,54 0 0
Falanges 31,81 40,90 80,0
Fontanela 4,54 0 60,0 a
Supraociptal 0 13,63 20,0
Interparietal 36,36 18,10 20,0
Membro superior ou inferior 9,09 4,54 40,0
Esternébrio 4,54 0 0
Não ossificado
Vértebra Lombar 4,54 0 0
Malformações viscerais (%)
Retinocele 4,54 0 0
Comunicação intra-ventricular 4,54 9,09 0
Cardiomegalia 0 4,54 0
Hidrocefalia 9,09 4,54 0
Anomalias viscerais (%)
Hipoplasia renal 4,54 0 16,66
(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). O Teste do qui-quadrado foi aplicado e a (p<0,05).
188
A B
implantação (d6-d15). (A) Fontanela normal (E2G1) e (B) Fontanela com anomalia de grau moderado
– Ossificação incompleta (E2G3) (ponta da seta).
A análise percentual, embora tenha mostrado resultados significativos em relação aos

demais grupos experimentais (E3G1 e E3G2) não permite inferir que o ORCD tenha
aumentado a incidência de malformações (tamanho da supraoccipital) e alteração (ossificação
da fontanela), pois o número de filhotes neste grupo (2.20 ± 1.71) foi baixo, dificultando
análise da ninhada, recomendado por Webster e Freemn (2001) para detectar teratógenos.
Apesar do percentual elevado, considerou-se baixa a quantidade (valores absolutos) dessas
alterações e malformações. Esta análise baseia-se nas considerações feitas por Bernardi
(1999) em relação aos agentes teratogênicos que geram apenas uma determinada anomalia,
mas o aumento da frequência com que esta ocorre.
Outras malformações e anomalias também foram investigadas e encontradas, tanto

esqueléticas como viscerais, porém não foram estatisticamente significativas as diferenças
(figuras 33, 34, 35 e 36). O comportamento ósseo pode ser visto através de três
manifestações: deficiência na homogeneidade, redução geral da densidade e redução da área
corada. Nos ratos a manifestação de sinais de ossos incompletos, pobremente calcificado ou
osso não ossificado são indicações de retardo de ossificação do esqueleto fetal. Parece existir
entre os teratologistas um consenso a respeito da manifestação do retardo na ossificação de
fetos, após o processo de coloração com alizarina vermelha (ALIVERT et al, 1979).
189
A B
Figura 32. Malformação esquelética (Agenesia de esternébrio) A. Esterno normal de um RN do grupo
controle (E2G1) e B. Ausência de esternébrio do grupo tratado (E2G2) (ponta da seta).
Nas análises das estruturas esqueléticas dos fetos, também foram verificadas a
ocorrência das manifestações: forma irregular, orifícios e fissuras. A forma irregular de ossos
dos fetos é um sinal de teratogenicidade, enquanto que orifícios e fissuras são considerados
formas variantes normais dos ossos, ou seja, não são considerados sinais de teratogenicidade
(SOLECKI et al., 2001).
A B
Figura 33. Alteração esquelética (Falanges com ossificação incompleta) A. Falanges inferiores de um
RN do grupo controle (E2G1) e B. Falanges inferiores com ossificação incompleta (E2G3) (ponta da
seta).
Ossificações incompletas acompanhadas da diminuição de massas fetais e alterações

na calcificação de outros ossos agregam significado às análises (CHAHOUD;
190
PAUMGARTTEN, 2005). A redução das massas fetais nem sempre é acompanhado de

retardo de ossificação. Para ninhadas com grande número de fetos, as massas fetais podem ser
relativamente menores, mas nas análises esqueléticas podem apresentar padrões de
calcificação iguais encontrados em fetos de maior massa para um mesmo período gestacional.
Figura 34. Malformação visceral A. ventrículos laterias e 3º ventrículo normais (E1G3) e B.

ventrículos laterais e 3º ventrículo malformado - hidrocefalia leve (E2G2) (ponta da seta).
A B
Figura 35. Alteração visceral A. Rins normais (E1G3) e B. Rin direito alterado – hipoplasia
renal (ponta da seta).
Com relação às anomalias e/ou malformações viscerais, as hidrocefalias encontradas

podem ser variantes do normal. É possível à constatação de casos isolados e devido ao acaso,
uma vez que não foi estatisticamente significativo. Portanto, independe de doses
administradas, já que foram observadas essas variações em fetos do grupo controle E3G1.
Segundo Spinosa et al. (2002), as hidrocefalias leves e algumas moderadas podem regredir em
algumas espécies, inclusive em humanos e que as diferenças entre espécies podem ocorrer
devido às possíveis transformações farmacocinéticas que impõe a unidade
materno/placentária/fetal.
191
O presente estudo corrobora com o estudo realizado por Lourenço et al. (2009) com
camundongas prenhas, testando três doses de óleo de copaíba C. langsdorfii (297,48, 594,96 e
892,44 mg/kg. Não detectaram malformações ou alterações externas, viscerais e esqueléticas.
Sachetti et al. (2011) testaram três doses (500, 1000 e 1250 mg/kg) de C. reticulata em ratas
prenhas no período de organogênese e também não encontraram alterações e/ou
malformações associados ao óleresina de copaíba.
3.2.4.1.1 Contagem dos pontos de ossificação E2
O tratamento com ORCD na dose 1874 mg/kg interferiu na ossificação das falanges
anteriores dos RN´s expostos no período de organogênese. No entanto, contagem total dos
pontos de ossificação no E2G1, E2G3 e E2G3 foi, em média, 32.86, 33.04, e 31.40,
respectivamente, sem diferenças estatísticas significativas. Com relação às falanges
anteriores, os centros de ossificação do E2G3 diferiram tanto do controle E2G1 como do
grupo E2G2 que recebeu a menor dose (Tabela 5). Segundo Bernardi (1999), quanto maior o
período crítico de um determinado sistema, mais suscetível este será aos efeitos de um
determinado agente. Por esse motivo, nos testes de teratogênese, as anomalias ósseas dos
animais sempre são avaliadas, pois o período de organogênese do esqueleto é bastante longo.
A maior parte da transferência de cálcio para a mineralização do esqueleto fetal ocorre
no terço final da gestação. A mãe obtém esse cálcio aumentando sua absorção de cálcio na
dieta e reabsorção a partir dos ossos. O aumento da necessidade de cálcio parece ser uma
demanda uniforme para todos os mamíferos durante a gestação e lactação. Nos mamíferos,
essa transferência de cálcio da mãe para a prole ocorre via transporte transplancentário do
cálcio, durante o desenvolvimento fetal, ou através da secreção de cálcio no leite, durante a
lactação (WYSOLMERSKI, 2002).
Durante o desenvolvimento fetal, a maior parte do esqueleto desenvolve-se primeiro
como um padrão ou modelo cartilagíneo, e então a cartilagem deste modelo é gradualmente
substituída por osso. Estudos com humanos revelaram que o retardo da ossificação no período
pré-natal, e logo após o nascimento, predispõe ao desenvolvimento de osteoporose em idades
mais avançadas (TOTHILL; HANNAN, 2002). Estudos realizados com o extrato
hidroalcoolico da planta Lantana câmara demonstraram que esta planta foi capaz de aumentar
a frequência de retardo na ossificação de fetos (MELLO et al., 2005).
192
Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-
d15), sobre os pontos de ossificação em recém-nascidos.
E2G1 E2G2 E2G3

Vértebras cervicais 5.0 0± 0.00 5.00 ± 0.00 5.0 ± 0.00
Esternébrios 5.86 ± 0.13 5.90 ± 0.06 6.00 ± 0.00
Falanges anteriores 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 3.80 ± 0.20 a,b
Metacarpos 3.95 ± 0.04 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00
Falanges posteriores 4.00 ± 0.00 3.90 ± 0.09 4.00 ± 0.00
Metatarsos 4.95 ± 0.04 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00
Vértebras caudais 5.45 ± 0.17 5.22 ± 0.17 5.20 ± 0.20
11Ossificação
1 Total 32.86 ± 0.71 33.04 ± 0.20 31.40 ± 0.97
Resultados expressos em Média ± E.P.M e valores com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao
E2G1) e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey.
Este estudo é uma continuação do estudo já realizado por Lima et al., (2011).
Diferentemente, foi empregada uma formulação e outra via de administração, a via vaginal.
No entanto, também não foram detectadas alterações e/ou malformações externas,
esqueléticas e viscerais, após o uso do creme vaginal contendo o óleoresina de C. duckei no
período de prenhez. O presente estudo buscou avaliar os efeitos sistêmicos do ORCD, o
mesmo utilizado na formulação do creme vaginal (CVORCD). Embasado nos princípios de
toxicologia, qualquer substância pode ser considerada um agente tóxico, dependendo das
condições da exposição como dose, tempo, freqüência da exposição e as mais variadas vias de
administração. Por estas razões, é imprescindível conhecer as condições de uso seguro das
diversas substâncias químicas que podem ser de origem vegetal, animal ou mineral, para que
não ocorram danos à saúde humana ou animal, ou mesmo levando à ocorrência de agravos ao
meio ambiente e de óbitos (VENANCIO, 2006).
193
4 CONCLUSÃO
O tratamento com ORCD nas doses 366,89 mg/kg (10% da DL50) e 1874 mg/kg (50%
da DL50) no período pré natal (pré e pós-implantação) nos permite concluir que:
No período de pré-implantação:
 A dose 366,89 mg/kg não provoca toxidade materna;
 A dose 1874 mg/kg provoca toxidade materna;
 As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alteraram a performance reprodutiva
materna;
No período de pós-implantação:
 As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg provocam toxidade materna;
 A dose 366,89 mg/kg não alterou a performance reprodutiva materna e a dose de 1874
mg/Kg alterou, diminuindo o número de fetos vivos e aumentando os índices placentários;
 As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não foram embriofetotóxicas;
 As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não provocou teratogenicidade;
 Houve efeito da dose (1874 mg/kg em relação 366,89 mg/kg) sobre a diminuição da
ossificação das falanges anteriores;
194
5 REFERÊNCIAS
ABBAS, M.A.; TAHA, M. O.; ZIHLIF, M.A.; DISI, A.M. β-Caryophyllene causes regression
of endometrial implants in a rat model of endometriosis without affecting fertility. European
Journal of Pharmacology, v. 702, p.12–19, 2013.
ADAMSON, S.L.; LU, Y.; WHITELEY, K. J.; HOLMYARD, D.; HEMBERGER, M.

PFARRER, C.; CROSS, J. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal
circulation in the mouse placenta. Dev. Biol., v. 250, n. 4, p. 358-373, 2002.
ALIVERTI, V., BONANOMI, L., GIAVINI, E. et al., The extent of fetal ossification as an
index of delayed development in teratogenic studies on the rat. Teratology, v.20, p. 237–242,
1979.
ALMEIDA, F. C. G.; LEMONICA, I. P. The toxic effects of Coleus barbatus B. on the

different periods of pregnancy in rats. J. Etnnoph., v. 73, p. 53-60, 2000.
AUGUSTIN, H. G. Vascular morphogenesis in the ovary. Baillières Clinical Obstetrics and

Gynaecology, v. 14, n. 6, p. 867 – 882, 2000.
BARROW, P. Reproductive and developmental toxicology safety studies. in: Krinke, G. j.

(Ed.). The handbook of experimental animais: the laboratory rat. San Diego: Academic Press,
p.199-225, 2000.
BENDAZZOLI, W. S. Fitomedicamentos: perspectivas de resgate de uma terapia histórica. O

Mundo da Saúde, v. 24, n. 2, p. 123 – 126, 2000.
BERNARDI, M. M. Exposição aos medicamentos durante o período perinatal. In:

SPINOSA, H.S.; GÓRNIAK, S.L.; BERNARDI, M.M. Farmacologia aplicada a medicina
veterinária. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p.566-574, 1999.

BRENT, R. L. What is the relationship between birth defects and pregnancy bleeding? New
perspectives provided by the NICHD workshop dealing with the association of chorionic
villous sampling and the occurrence of limb reduction defects. Teratol., v. 48, p. 93–95,
1993.
BURDON, C.; MANN, C.; CIDROVA-DAVIES, T.; FERGUSON-SMITH, A.C.; BURTON,

G.J. Oxidative stress and the induction of cyclooxygenase enzymes and apoptoses in the
murine placenta. Placenta, v. 28, n.7, p.724-733, 2007.
CALDERON, I. M. P. Modelo experimental em ratas para estudo do binômio diabete e

gravidez. 125p. Dissertação (Bases Gerais de Cirurgia Experimental) – Medicina,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho/Botucatu, 1988.
195
CALLEJA, M.A.; VIEITES, J.M.; MONTERO-METERDEZ, T.; TORRES, M.I.; FAUS,

M.J.; GIL, A.; SUAREZ, A. The antioxidant effect of b-caryophyllene protects rat liver from
carbono tetrachloride-induced fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation. British
Journal of Nutrition, v. 109, p. 394–401, 2013.

monocrotophos on behavioral and physical development in the rat. Gen. Molecular Biol., v.
21, n. 3, p. 171, 1998.
CHAHOUD, I.E.; PAUMGARTTEN, F.J.R. Relationships between fetal body weight of

Wistar rats at term and the extent of skeletal ossification. Brazilian Journal of Medicinal
Biological Research, v.38, p.565-575, 2005.
COX, B.; KOTLYAR, M.; EVANGELOU, A.L.; IGNATCHENKO, V.; IGNATCHENKO,

A.; WHITELEY, K.; JURISTICA, I.;ADAMSON, S.L.; ROSSANT, I.; KISLINGER, T.
Comparative systems Biology og human and mouse as a tool to guide the modeling of human
placental patology. Mol Syst Biol, v.5, p.279-283, 2009.
CROSS, J.C. How to make a placenta: Mechanisms of trophoblast cell differentiation in mice-
a revew. Trophoblast Rev., v.19, p.54-49, 2005.
DASTON, G. P; SEED, J. Skeletal malformations and variations in developmental toxicity

studies: Interpretation Issues for human risk assessment. Birth Def. Res. (Part B), 2007.
DENNERY, P.A. Effects of oxidative stress on embryonic development. Birth Defects
Research C Embryo Today, v.81, p.155-162, 2007.
DIETZ, P.M.; CALLAGHAN, W.M.; SMITH, R.; SHARMA, A.J. Low pregnancy weight
gain and small for gestational age: a comparison of the association using 3 different measures
of small for gestational age. Am J Obstet Gynecol., v. 201, n. 53, p. 1-7, 2009.
EMBIRUÇUI, E.K. et al. Risco teratogênico: a percepção em diferentes segmentos da

população. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v.4, n.3, p.201-7, 2005.
FANTEL, A.G. Reactive oxygen species in developmental toxicity: review and hypothesis.
Teratology, v.53, p.196-217, 1996.
FANTEL, A.G.; PERSON, R.E. Involvement of mitochondria and other free radical sources
in normal and abnormal fetal development. Annals of the New York Academy of Sciences,
v.956, p. 424–433, 2002.
FERNANDEZ, R.R. et al.Anencefalia : Um estudo epidemiologico de treze anos da cidade de

pelotas. Ciênc saúde coletiva, Rio de Janeiro, v.10, n.1, 2005.
FOWDER, A.L.; GIUSSANI, D.A.; AND FORHEAD, A.J. Intrauterine programming of

physiological systems: causes and consequences. Physiol., v.21, p.29-37, 2006.
FRITZ, H.; GIESE K. Evaluation of the Teratogenic Potential of Chemicals in the Rat.
Pharmacol., v. 40, n. 1, p. 1-28, 1990.
196
GEREMIAS, A.L.; DE ALMEIDA, M.F.; FLORES, L.P.O. Avaliação de nascido vivo como
fonte de informação sobre defeitos congênitos. Rev. Bras. Epidemiol. [periódico na internet].
Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci. Acesso em: 15 Mar 2014.
GIUSTI, R.M.; IWAMOTO, K.; HATCH, E.E. Diethylstilbestrol revisited: a review of the
long-term health effects. Ann. Intern. Med., v.122, p.778-788, 1995
GOODMAN, D.R.; JAMES, R.C.; HARBISON, R.D. Placental Toxicology. Food

Chemistry Toxicology, v.20, p.123-128, 1982.
GRAY. L. E. e col. Use of the Laboratory Rat as a Model in Endócrine Disruptor Screening
and Testing. ILAR Journal, v. 45, n. 4, p. 425 – 437, 2004.
GUPTA, S.; AGARWAL, A.; BANERJEE, J.; ALVAREZ, J.G.; The role of oxidative stress
in spontaneous abortion and recurrent pregnancy loss: a systematic review. Obstet Gynecol
Surv, v.62, p.335–347, 2007.
HANSEN, J.M. Oxidative stress as a mechanism of teratogenesis. Birth Defects Research C

Embryo Today, v.78, p. 293–307, 2006.
HANSEN, J.M.; HARRIS, C. Redox control ofteratogenesis. Reproductive toxicology, v.35,

p.165-179, 2013.
HIRANRUENGCHOK, R.; HARRIS, C. Glutathione oxidation and embryotoxicity elicited

by diamide in the developing rat conceptus in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology,
v.120, p.62–71, 1993.
IZUMI, E., et al. Terpenes from Copaifera demonstrated in Vitro antiparasitic and synergic
activity. J Med Chem, v. 55, n.7, p. 2994-3001, 2012.
KALTER, H. The relationship between congenital malformations and prenatal mortality in

experimental animals. In: Potter I.(ed), Hook EB. Human embryonic and fetal death. New
York: Academic Press, p.29-44, 1980.
KARNOFSKY DA. Drugs as teratogens in animals and man. Annual Review of

Pharmacology, v. 10, p. 447–72, 1965.
KHERA, K.S. Maternal taxicity of drugs and metabolic disorders: a possible etiologia factor
in the metabolic disorders: a possible etiologia factor in the intrauterine death and congenital
malformation: a critique on human data. Crit Rev Toxicol., v.17, p.345-375, 1987.
KIM, J.C.; SHIN, H.C.; CHA, S.W.; KOH, W.S.; CHUNG, M.K., HAN, S.S. Evoluation of
developmental toxicity in rats exposid to the envioronmental estrogen bisphenol a diving
pregnoncy. Life Sciences.,v. 69, n. 22,p. 2611-2625, 2001.
KINGDOM, J.C,; KAUFMANN, P. Oxygen and placental vascular development. Adv Exp
Med Biol, v.474, p. 259-275, 1999.
197
KLAASSEN, C. D.; WATKINS, J. B. Fundamentos em toxicologia de Casarett e Doull

(Lange). 2ª ed. São Paulo: Artmed, 2012.
KOLA, I.; FOLB, P. Chlorpromazine inibtis the mitotic índex, cell number, and the formation
of blastocyst, and delays implantation of CBA mouse embryos. J. Reprod. Fert., v. 76, p.
527-536, 1986.
KOVACIC, P.; SOMANATHAN, R. Mechanism of teratogenesis: electrontransfer, reactive

oxygen species, and antioxidants. Birth Defects Research C Embryo Today, v.78, p. 308-
325, 2006.
LEMONICA, L. P; DAMASCENO, D. C; DI-STASI, I. C. Study the embryotoxic effects of

na extract of Rosemary (Rormarinus officinalis L.). Braz. J Med. Biol. Res. v. 29, p. 223-
227, 1996.
LIMA, C. S; MEDEIROS, B. J. L; FAVACHO, H. A. S; SANTOS, K. C; OLIVEIRA, B. R;

TAGLIALEGNA, J. C; COSTA, E. V. M; CAMPOS, K. J; CARVALHO, J. C. T. Pre-
clinical validation of a vaginal cream containing copaiba oil (reproductive toxicology study).
Phytomed., v. 18, n. 12, p. 1013-1023, 2011.
LIU AX, HE WH, YIN LJ, LV PP, ZHANG Y, SHENG JZ, LEUNG PC, HUANG HF:
Sustained endoplasmic reticulum stress as a cofactor of oxidative stress in decidual cells from
patients with early pregnancy loss. J Clin Endocrinol Metab, v.96, p. E493–E497, 2011.
LIU, J.N.; CHAN, H.M.; KUBOW, S. Oxidative stress status and development of late
organogenesis stage rat whole embryos cultured from gestational days 13.5 to 14.5.
Toxicological In Vitro, v.21, p.53-62, 2007.
LIU, H.; YANG, G.; TANG, Y.; CAO, D.; QI, T.; QI, Y.; FAN, G. Physicochemical
characterization and pharmacokinetics evaluation of β-caryophyllene/β-cyclodextrin inclusion
complex. International Journal of Pharmaceutics, v. 450, p. 304– 310, 2013.
LOURENÇO, A.C.S.; MIGUEL, L.K.; GUARIDO, K.L.; SENSIATE, L.A.; SALLES, M.J.S.
Óleo de copaíba (Copaifera langsdorfii Desf.) em padrões reprodutivos de camundongos e no
desenvolvimento embriofetal Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.11, n.4, p.407-413, 2009.
MELLO, F.B.; JACOBUS, D.; CARVALHO, K.; MELLO, J.R.B. Effects of Lantana camara
(Verbenaceae) on general reproductive performance and teratology in rats. Toxicon, v.45,
p.459–466, 2005.
MELLO, J.R.B.; LANGELOH, A.; HABERMEHL, G.; KREBS, H.C.; BATATINHA,

M.J.M.; ALMAEIDA, C.R.C.; BASTOS, F.C.; BASSANI, M.; BARUFFALDI, C.;
ALVARES, F.; FRANCISCO, D.; KUMMER, R . Avaliação do extracto aquoso dos frutos de
Crotalaria retusa Leguminosae sobre a fertilidade de ratas. Arq. Fac. Vet. UFRGS, v.25,
p.34-42, 1997.
MELO, M.G.D.; DÓRIA, G.A.A.; SERAFINI, M.R.; ARAÚJO, A.A.S. Valores de referência
Hematológicos e Bioquímicos de Ratos (Rattus novergicus linhagem Wistar) provenientes do
biotério central da Universidade Federal de Sergipe. Scientia Plena, v.8, n. 4, 2012.
198
MENGUE, S. S.; MENTS, L. A.; SCHENKEL, E. P. Uso de plantas medicinais durante a

gravidez. In: SANSEVERINO, M. T. V; SPRITZEL, D. T.; SCHÜLER-FACCINI, L.
Manual de Teratogênese. Porto Alegre: Ed. Universidade/UFRGS, p. 423-450, 2001.
O’HARA, M.F.; NIBBIO, B.J.; CRAIG, R.C.; NEMETH, K.R.; CHARLAP, J.H.;
KNUDSEN, T.B. Mitochondrial benzodiazepine receptors regulate oxygen homeostasis in the
early mouse embryo. Reproductive Toxicology., v.17, p.365-375, 2003.
OECD. OECD guideline for testing of chemicals Nº. 422: combined repeated dose toxicity
study withth e reproduction/ developmental toxicity screening test. Original guideline, 1996.
OECD. Test Guideline 416. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Two-generation
reproduction toxicity study; 2001. Available: http:// www.oecd.org/document/22/0,2340,en
2649 34377 1916054 1 1 1 1,00.html. Acesso em: 10 de Abril de 2014.
OESTENSEN, M. et al. Anti-inflammatory and immunosuppressive drugs and reproduction.

Arthritis Research & Therapy, v.8, p.209-27, 2006.
OGA, SEIZE; CAMARGO, Márcia M. A.; BATISTUZZO, José A. O. Fundamentos de

Toxicologia. Editora Atheneu. 3.ed, p.696, 2008.
PARIA, B.C.; LIM, H.; DAS, S.K.; REESE, J.; DEY, S.K. Molecular signaling in uterine
receptinty for inplantation. Semin.Cell Dev Biol., v. 11, p.67-76, 2000.
PARMAN, T.; WILEY, M.J.; WELLS, P.G.; Free radical-mediated oxidative DNA damage
in the mechanism of thalidomide teratogenicity. Nature Medicine, v.5, p. 582–585, 1999.
PIERI, F.A.; MUSSI, M.C.M.; MOREIRA, M.A.S. Óleo de copaiba (Copaifera sp.):
histórico, extração, aplicações industriais e propriedades medicinais. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, v. 11, p. 465-472, 2009.
PINTO, V. M. Avaliação toxicológica da preparação fitoterápica contendo Piper

methysticum Forst, Piperaceae (Kava Kava®) sobre o desenvolvimento pré-natal em
ratos Wista. 71p. Dissertação – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
2004.
REGNAULT, T. R. H. e col. Placental Development in Normal and Compromised

pregnancies – A Review. Placenta (supplement A), Trophoblast Research, v. 23, n.16, p. 119
- 129, 2002.
ROGERS, J. M.; KAVLOCK, R. J. Developmental toxicology. In: KLAASEN, C. D. (Ed.)

Cassarett and Doulls’s toxicology: The basic science of poisons. 6th ed. New York: Mc
Graw-Hill, p. 107-132. 2001.
ROSSO P. Maternal.fetal exchange during protein malnutrition in the rat. Placental transfer of
glucose and a nonmetabolizable glucose analog. J Nutr , v. 107, p. 2006-2010, 1977.
199
RUDGE, M.C.V.; BORGES, V.T.M.; CALDERON, I.M.P. Adaptação do organismo

materno à gravidez. In: Neme, B. Ostetrícia básica. 2ª ed. São Paulo: Sarvier, p. 49, 2000.
SACHETTI, C.G.; DE CARVALHO, R.R.; PAUMGARTTEN, F.J.R.; LAMEIRA, O.A.;

CALDAS, E.D. Developmental toxicity of copaíba tree (Copaifera reticulata Ducke,
Fabaceae) oleoresin in rat. Food and Chemical Toxicology, v.49, p.1080–1085, 2011.
SCHARDEIN, J. Chemically induced birth defects. New York, NY: Marcel Dekker, Inc.;
2000.
SCHARDEIN, J. L. Principles of teratogenesis applicable to drug and chemical exposure. In:

Chemically Induced Birth Defects (Schardein, J. L ed) 3th Rev e ex Marcel Dekker Inc,
NewYork, p. 1-67, 2000.
SHI, Z.Z.; OSEI-FRIMPONG, J.; KALA, G.; KALA, S.V.; BARRIOS, R.J.; HABIB, G.M.;
et al. Glutathione synthesis is essential for mouse development but not for cell growth in
culture. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America, v.
97, p.5101–5106, 2000.
SIES; H.; STAHL, W.; SEVANIAN, A. Nutritional, dietary and postprandial oxidative stress.
Journal of Nutrition, v.135, n.5, p.31S-38S, 2005.
SMITHELLS, R. W.; NEWMAN, C .G. H. Recognition of thalidomide defects. J. Med.

Genet., v. 29, p. 716-723, 1992.
SOLECKI, R. Imidacloprid.In: JOINT MEETING OF THE FAO PANEL OF EXPERTS OF

EXPERTS ON PESTICIDE RESIDUES IN FOOD AND ENVIRONMENT AND THE
WHO CORE ASSESSMENT GROUP. Pesticide residues in food 2001: Toxicological
Evaluations. Geneva, Switzerland: World Health Organization (2002). Disponivel em:
http://www.inchem.org/documents/impr/impmomo/2001pr07.htm. Acesso em: 22 março
2014.
SOTTO, A.D.; MAFFEI, F.; HRELIA, P.; CASTELLI, F.; SARPIETRO, M. G.;
MAZZANTI, G. Regulatory Toxicology and Pharmacology Genotoxicity assessment of β-
caryophyllene oxide. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 66, p. 264–268, 2013.
SPINOSA, H. S.; GORNIAK, S. L.; BERNARDI, M. M. Farmacologia Aplicada à

Medicina Veterinária. 3. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 691-699. 2002.
STAPLES, R.E.; SCHNELL, V.L. Refinements in rapid clearing technic in the KOH-alizarin
red S method for fetal bone. Stain Technol, v.39, p.61-63, 1964.
TEO, S.; STIRLING, D.; THOMAS, S.; HOBERMAN, A.; KIORPES, A.; KHETANI, V. A
90-day oral gavage toxicity study of Dmethylphenidate and D,L-methylphenidate in Sprague-
Dawley rats. Toxicology, v.179, n.30, p.183-196, 2002.
TOTHILL, P.; HANNAN,W.J. Bone mineral and soft tissue measurements by dualenergy x-
ray absorptionmetry during growth. Boné, v.31, p. 429–496, 2002.
200
TYLER, V. E. Chemtec, v.5, p.52, 1997.
US EPA- UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Risk

assessment fórum. Guidelines for developmental toxicity risk assessment. Federal Register,
v.56, n.234, p.63798-63826, 1991.
US EPA. Guidelines for reproductive toxicity risk assessment. EPA/630/R-96/009,

Washington, 1996.
VAN-CAUTEREN, H. The toxicological properties of itraconazole. In: FROMTLING, R.A.

(Ed.), Recent Trends in the Discovery, Development, and Evaluation of Antifungal
Agents. JR Prous, Barcelona, p. 263–271, 1987.
VEIGA-JUNIOR, V.F.; ZUNINO, L.; CALIXTO, J.B.; PATITUCCI, M.L.; PINTO, A.C.
Phytochemical and antioedematogenic studies of commercial copaiba oils available in Brazil.
Phytother Res, v.15, p.476-480, 2001.
VENANCIO, A. M. Toxicidade aguda e atividade antinociceptiva do óleo essencial do

Ocimum basilicum L. (manjericão), em Mus musculus (camundongos).110f. Dissertação
(Mestrado em Ciências da Saúde) – Núcleo de Pós-Graduação em Medicina, Universidade
Federal de Sergipe, Aracajú. 2006.
VENEZIANI, R. S., et al. "Antibacterial actvity and synergistic effect investigation of

terpenoids from Copaifera langsdorffii Desf. against cariogenic bacteria." Planta Med, v.76,
n.12, p. 1321-1321, 2010.
WEBSTER, W.S.; FREEMAN, J.A.D. Is this drug safe in pregnancy? Reproductive

Toxicology, v.15, p.619–629, 2001.
WELLS, P.G, MCCALLUM, G.P.; CHEN, C.S.; HENDERSON, J.T.; LEE, C.J.; PERSTIN,
J. et al. Oxidative stress in developmental origins of disease: teratogenesis,
neurodevelopmental deficits, and cancer. Toxicological Sciences, v.108, p.4–18, 2009.
WELLS, P.G.; BHULLER, Y.; CHEN, C.S.; JENG, W.; KASAPINOVIC, S.; KENNEDY,
J.C.; KIM, P.M.; LAPOSA, R.R.; MCCALLUM, G.P.; NICOL, C.J. et al: Molecular and
biochemical mechanisms in teratogenesis involving reactive oxygen species Toxicol Appl
Pharmacol., v.207, p.354–366, 2005.
WILFFERT, B.; ALTENA, J.; TIJINK, L.; VAN GELDER, M.M.; DE JONG-VAN DEN
BERG, L.T. Pharmacogenetics of drug-induced birth defects: what is known so far?
Pharmacogenomics, v.12, p.547-558, 2011.
WILSON, J. D. Current status of toxicology. In: WILSON, J. D.; FRASER. F. C. Handbook

of teratology. (Ed.), London: Plenun Press, v.1, p.47-74, 1977.
WILSON, J.C. Methods for administering agents and detecting malformations in

experimental animal. In: WILSON, J.C., WARKANI, J. Teratology: principles e techniques.
Chicago: University of Chicago Press, 1965.
201
WILSON, J.G. Mechanisms of teratogenesis. American Journal of Anatomy, v.136, p.129–

31, 1973.
WYSOLMERSKI, J.J. The evolucionary origins of maternal calcium and boné matabolism
during lactation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, v.7, p.267-276, 2002.
ZENICK, H.; CLEGG, E.D. Assessment of male reproductive toxicity: A risk of assessment
approach. In: Principles and methods of toxicology. New York: Raven, p.275-309, 1989.
ZYGMUNT, M.; HERR, F.; MÜNSTEDT, K.; LANG, U.; LIANG, O. D. Angiogenesis and
vasculogenesis in pregnancy. Obstetrics & Ginecology (supplement 1), v.110, p. S10-S18,
2003.
202
CAPÍTULO 4: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE C. duckei NOS PERÍODOS PERINATAL E
PÓS-NATAL
203
RESUMO
Os efeitos da exposição a medicamentos no período perinatal, as mudanças que ocorrem em

um organismo em desenvolvimento podem ser de natureza funcional ou bioquímica,
estrutural ou morfológica. As lesões produzidas podem ser reversíveis ou irreversíveis. O
estudo dessas alterações associados ao exame da prole expostas a medicamentos, sejam estes
de origem sintética ou natural, são importantes. Alterações funcionais ou bioquímicas
somente poderão ser investigadas após alguns dias de nascimento e desenvolvimento da prole.
Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade reprodutiva após o tratamento com
óleoresina de Copaifera duckei (ORCD) nos períodos perinatal e pós-natal. Para tanto, foram
utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, isogênicas, e machos. O ORCD
foi administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50 (3758,16
mg/kg) e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos:
Grupo controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e
Tratado G3 (1874 mg/kg de ORCD). O estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 3
(E3) e o Experimento 4 (E4), de acordo com o segmento III dos estudos de toxicologia
reprodutiva, adaptados de normas da Environmental Protection Agency e recomendados pela
Food and Drugs Administration e Organization for Economic Cooperation and Development.
O E3 compreendeu o segmento III, avaliando-se fêmeas durante no período perinatal (de
desenvolvimento fetal in útero). O E4 também compreendeu o seguimento III, porém o
tratamento compreendeu o período pós-natal (lactação). Para tanto, 40 animais, sendo 15
fêmeas (n=5/grupo experimental, E3G1, E3G2 e E3G3) e 5 machos reprodutores no E3 e 15
fêmeas (n=5/grupo experimental, E4G1, E242 e E4G3) e 5 machos reprodutores no E4 foram
utilizados. Durante o tratamento com ORCD, sinais clínicos de toxidade aguda, tal como
agitação, sangramento e estresse foram relatados em 2 animais no grupo tratado com 366,89
mg/kg (E3G2). Com o aumento da dose, de 366,89 mg/kg para 1874 mg/kg, além desses
sinais, diarréia e piloereção também foram relatados nas progenitoras do E3G3 durante o
tratamento. Durante o tratamento com ORCD 1874 mg/kg todas as ratas vieram a óbito. O
ORCD 366,89 mg/kg apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e
razão sexual, com diferença estatística (p<0,05) entre o grupo tratado E3G2 em relação ao
grupo controle E3G1. O ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de parto, pois não foi
encontrada diferenças significativas ao comparar a média do tempo de prenhez. O grupo
E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada (8.80 ± 0.66). As
lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação e estresse após o tratamento, sendo
ainda relatado piloereção em uma lactante do grupo E4G2 que recebeu a menor dose (366,89
mg/kg) e sangramento nasal e uma das ratas do E4G3 que recebeu a maior dose (1874
mg/kg). Esses sinais clínicos foram detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação), E2
(pós-implantação) e E3 (desenvolvimento fetal). O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89
mg/kg) não causaram aumento do tempo de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de
nascimento, de viabilidade e tamanho da ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão
sexual diferiram (p<0,05) do grupo controle E4G1. No exame histopatológico, todos os
animais tanto do grupo controle (E4G1) como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram
integridade tecidual dos rins analisados, e os achados na avaliação histopatológica hepática
não diferiram dos do grupo controle.
Palavras-chave: Copaifera duckei, óleoresina, toxidade reprodutiva, perinatal e pós-natal,

lactação.
204
ABSTRACT
The effects of the exhibition to medicines in the perinatal period, the changes that happen in
an organism in development can be from functional or biochemical, structural or morphologic
nature. The produced lesions can be reversible or irreversible. The study of these changes
associated to the exam of the offspring exposed to medicines, not only from synthetic but also
from natural origin, they are important. Functional or biochemical changes can only be
investigated from birth after some days and development of the offspring. Therefore, this
study had as objective to evaluate the reproductive toxicity after the treatment with Copaifera
duckei oleoresin (ORCD) in the perinatal and postnatal periods. Wistar rats were used (Rattus
norvegicus albinus), females, isogenical, and males. ORCD was administered orally (v.o), in
the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and 50% of DL50. This way, the
groups were submitted to the following treatments: Control groups G1 (0,5 mL of distilled
water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3 (1874 mg/kg of ORCD). The
study was divided in two samples, Experiment 3 (E3) and the Experiment 4 (E4), according to
the the segment III of the studies of reproductive toxicology, adapted from the rules of
Environmental Protection Agency and recommended by the Food and Drugs Administration
and Organization for Economic Cooperation and Development. E3 was related to the segment
III, being evaluated female rats during in the perinatal period (of fetal development in uterus).
E4 was also related to the continuation III, however the treatment was developed during the
postnatal period (weaning). 40 animals were used, 15 females (experimental n=5/grup, E3G1,
E3G2 and E3G3) and 5 reproductive males in E3 and 15 females (experimental n=5/group,
E4G1, E242 and E4G3) and 5 reproductive males in E4 were used. During the treatment with
ORCD, clinical signs of acute toxicity, such as agitation, bleeding and stress were recorded in
2 animals in the treated group with 366,89 mg/kg (E3G2). Because of the rise of dose, from
366,89 mg/kg to 1874 mg/kg, besides these signs, diarrhea and piloerection were also
reported in the progenitors of E3G3 during the treatment. During the treatment with ORCD
1874 mg/kg all of the female rats died. ORCD 366,89 mg/kg presented effect over the
viability rate, weaning rate and sexual reason, with statistical difference (p <0,05) among the
treated group E3G2 in relation to the control group E3G1. ORCD 366,89 mg/kg did not
change the labor, because it was not found any significant differences when comparing the
average time of pregnancy. The group E3G2 had a higher time of pregnancy (23.0 ± 0.31) and
size of the brood (8.80 ± 0.66). The lactic ones treated with ORCD presented agitation and
stress after the treatment, it also was reported piloerection in lactic one from the group E4G2
that received to smallest doses (366,89 mg/kg) and nasal bleeding and one of the female rats
of E4G3 that received the largest dose (1874 mg/kg). Those clinical signs were recorded in
the experiments, E1 (pre-implantation), E2 (post-implantation) and E3 (fetal development).
ORCD in the used doses (1874 and 366,89 mg/kg) did not cause increase the time of
pregnancy, not even decrease of the rate of birth, of viability and size of the brood. However,
the weaning rate and the sexual reason differed (p <0,05) in relation to the control group
E4G1. In the histopathologic exam, all the animals, both from the control groups (E4G1) and
from treated ones (E4G2 and E4G3) presented tissue integrity of the analyzed kidneys, and
the findings in the evaluation of hepatic histopathologic did not differ from those in the
control groups.
Keywords: Copaifera duckei, oleoresin, reproductive toxicity, perinatal and postnatal,

lactation.
205
1 INTRODUÇÃO
As anomalias congênitas contribuem, significativamente, como a principal causa de

morte (70% do todas as mortes neonatais) no primeiro mês de vida, e um percentual
significativo (22%) das mortes em crianças durante os primeiros 15 meses de vida
(HANSEN; HARRIS, 2013). A exposição a medicamentos no período periconcepcional
representa uma causa fundamental de malforções fetais. Os efeitos teratogênicos de várias
classes de fámacos são conhecidos e resultam de 3 a 5% das anomalias congênitas
(HANSEN; HARRIS, 2013). Nesse conceito, são também incluídas anomalias latentes, que
demoram anos para se expressar, como é o caso dos fetos expostos ao dietilestilbestrol, usado
no tratamento do câncer, com risco aumentado de desenvolverem adenocarcinoma da vagina,
neoplasia, com surgimento apenas a partir da adolescência (ARAÚJO, 2006).
Os efeitos da exposição aos medicamentos no período perinatal pode ser de natureza

funcional ou bioquímica, estrutural ou morfológica (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000). As
lesões produzidas podem ser reversíveis e irreversíveis. As irreversíves não causam nenhuma
conseqüência tardia ao animal, tanto estrutural como funcional, manifestando-se em geral por
diminuição no peso corporal ao nascimento, essas lesões são embriotóxicas. As irreverssíveis
não são compatíveis com a vida, pois produzem embrioletalidade, podendo resultar em
abortos espontâneos, natimortos ou reabsorção. As lesões compatíveis com a vida são
chamadas teratogênicas ou tóxicas, que dependem, exclusivamente, do período de exposição
do animal (WILSON, 1973).
Um medicamento considerado teratogênico é aquele capaz de aumentar a freqüência

de uma anormalidade funcional ou estrutural na prole de determinada espécie animal, quando
administrado nos progenitores antes da concepção ou à mãe durante algum período crítico da
gestação (WILSON, 1973). Nos períodos de desenvolvimento fetal e neonatal, todos os
tecidos estão formados e os animais crescem, no entanto, alguns sistemas ainda sofrem
maturação. No período perinatal, que inclui o período de gestação e o neonatal, observam-se
caracteristicamente histiogênese, maturação funcional e ganho de peso corporal. A exposição
a medicamentos neste período pode produzir redução no peso corporal, desordens funcionais
e carcinogênese (BERNARDI, 2007).
O feto é mais resistente aos efeitos letais do que o embrião, porém apresenta grande
suscetibilidade a agentes carcinogênicos devido a alta replicação celular, ontogenia de
206
enzimas de biotransformação e baixa imunocompetência. A toxidade reprodutiva é a

ocorrência de qualquer interferência causada por alguma substância nas capacidades
reprodutivas de machos e fêmeas, incluindo não só o período perinatal, mas o pós-natal
também (NEUBERT et al., 1992). Atualmente há necessidade de estudos longitudinais,
abrangendo não só alterações estruturais, mas também modificações funcionais, como o
desenvolvimento de características físicas desde os primeiros dias de vida e até estudos de
comportamento animal, conforme sugeriu Bernardi (2007).
A maior parte dos estudos de toxidade reprodutiva utilizam apenas protocolos para
avaliar a toxidade da reprodução, que é amplamente aceito pelas agências regulatórias de
avaliação de toxidade, por exemplo, FDA e ANVISA (US EPA, 1996; BRASIL, 2013). Esses
protocolos consistem na administração da substância a ser avaliada, em fêmeas prenhas desde
a implantação até o final da prenhez (um dia antes do parto), momento em que os fetos são
analisados quanto às malformações esqueléticas e viscerais antes do nascimento. No entanto,
sua grande limitação refere-se ao fato de que estes estudos, não expõem e não examinam os
animais experimentais, em nenhum período pós-natal. Embora algumas agências reguladoras
incluam testes na fase de desenvolvimento pós-natal, esta não é obrigatória, por isso,
geralmente não são conduzidos pelas indústrias (CLAUDIO et al. 1999).
Nas fases pré e pós-natal, os órgãos sexuais e o sistema nervoso central que ainda
estão se diferenciando, podem ser atingidos por substâncias presentes no sangue materno,
através da placenta durante a gestação ou através do leite durante a lactação. Os indivíduos
expostos nesses períodos de desenvolvimento são mais vulneráveis à ação de substâncias
químicas em função de menor capacidade metabólica e excretora e da ausência de muitos
mecanismos de retroalimentação do sistema endócrino (ZENICK; CLEGG, 1989).
A gestação altera alguns processos de biotransformação de medicamentos, afetando
intensamente a excreção renal, que é a via mais importante na eliminação da maioria dos
medicamentos do organismo. O fluxo plasmático renal e a filtração glomerular apresentam-se
aumentados desde o início até o final da gestação, o que facilita o processo de eliminação de
medicamentos. As alterações fisiológicas do sistema materno na prenhez propiciam um
aumento na absorção e distribuição de medicamentos, redução na sua biotransformação e
incremento na excreção (BERNARDI, 2007). No puerpério ou período pós-natal, ocorrem
mudanças fisiológicas e anatômicas, decorrentes da gravidez, que perduram por algumas
semanas (SOUZA, 2007).
207
O estudo dessas alterações associados ao exame da prole expostas a medicamentos,

sejam estes de origem sintética ou natural, são importantes. Alterações funcionais ou
bioquímicas somente poderão ser investigadas após alguns dias de nascimento e
desenvolvimento da prole. Segundo Buschmann (2006), a principal diferença do SNC
humano e dos roedores é o período de desenvolvimento, que no homem ocorre,
principalmente, na fase pré-natal e em roedores após o nascimento.
Embora o conhecimento a respeito de drogas na lactação tenha sido muito ampliado,
ainda não se conhecem os efeitos colaterais para as crianças amamentadas de muitas drogas
utilizadas pela nutriz (BRASIL, 2000). Deve-se ressaltar que a lactação é um período no qual
os RN´s são mais sensíveis que os adultos a efeitos tóxicos das substâncias químicas, já que
que o neonato tem baixa capacidade de biotransformar os xenobióticos pela imaturidade dos
sistemas enzimáticos (ALCORN; MCNAMARA, 2003). Acrescente-se, também, que certos
sistemas irão se desenvolver completamente somente no período pós-natal. Por exemplo, o
SNC no rato se forma completamente ao redor do 21º dia de vida (KAUFMANN, 2000) e,
neste caso, existem claras evidências que este sistema em desenvolvimento é muito mais
sensível, em relação ao SNC de ratos adultos, aos vários xenobióticos (TILSON, 2000).
O leite materno pode ser uma via de excreção materna de substâncias tóxicas (BEGG
et al., 2002). O princípio fundamental da prescrição de medicamentos para mães lactantes
baseia-se no conceito de risco e benefício. Deve-se optar, sempre que possível, por uma droga
já estudada, com pouca excreção no leite materno e sem risco aparente para a saúde do bebê.
Diversos estudos comprovaram que o abandono precoce da amamentação deve-se a exposição
dos lactentes a medicações maternas (AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS, 2001;
LAMOUNIER et al., 2002; ANDERSON; POCHOP, 2003). De fato, diversas substâncias
químicas são transferidas ao leite, representando uma importante fonte de intoxicação para o
neonato. Como exemplos, estão algumas toxinas encontradas em plantas, como alcalóides
pirrolizidínicos e ptaquilosídeos (MEDEIROS; GÓRNIAK; GUERRA, 1999). Os efeitos de
muitas drogas novas ainda não foram devidamente estudados, ou apresentam divergências na
literatura quando utilizados na lactação (BRASIL, 2000). Portanto, surge a necessidade
estudos para melhor compreensão dos efeitos sistêmicos provocados por esses agentes
químicos durante a lactação. Fármacos que apresentam evidências de danos significativos à
saúde do lactente devem ser contra indicados na amamentação. Nesse caso, deve-se suspender
a amamentação, pois o risco do uso do medicamento pela nutriz é maior que os benefícios do
aleitamento materno (NETO, 2006).
208
O período de desenvolvimento fetal e de lactação também aresentam grande

susceptibilidade a exposição de agentes químicos, casando prejuízos tanto a saúde materna
como a fetal e/ou neonatal. Segundo Claudio et al. (1999), a maior limitação dos protocolos
de avaliação da toxidade é a ausência de exame dos filhotes, em fase pós-natal, o que, na
maioria das vezes, poderá levar a erros no julgamento sobre o efeito teratogênico da
substância testada ou aos efeitos tardios provenientes na lactação. Este capítulo teve como
objetivo avaliar a toxidade reprodutiva do óleresina de C. duckei em dois períodos do
desenvolvimento: o final do período pré-natal (in útero) e o período pós-natal (lactação),
avaliando o desenvolvimento geral e sexual da progênie da primeira geração.
209
2.1 MATERIAL
Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).
Antes do início das atividades no LABORATÓRIO DE PESQUISA EM

FÁRMACOS/UNIFAP, o projeto de tese foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal do Amapá, recebendo o número 008A/2011 (APÊNCIDE
A).
2.3 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), 30 fêmeas, isogênicas,

provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em
Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade de Campinas – UNICAMP e 10 machos
provenientes do Laboratório Central do Amapá (LACEN-AP). Após a chegada dos animais,
os mesmo passaram por um período de adaptação, e foram mantidos em estantes climatizadas
com temperatura controlada (23±2º C), obedecendo a um ciclo claro/escuro de 12 horas
(período claro das 7:00 h da manhã às 19:00 h da noite) e receberam água e ração (Labina®) à
vontade até o início dos ensaios.
2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS
A DL50 do ORCD, em ratos por via oral, é 3,79 ml/kg, que correponde a 3758,16
mg/kg (CASCON, 2004). A via de administração utilizada foi a via oral (v.o), gavagem,
objetivando-se avaliar alterações sistêmicas. Neste estudo optou-se em utilizar doses que
correspondem a 10% da DL50 para o grupo tratado G2 e 50% da DL50 para o grupo tratado
210
G3. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: O grupo controle
G1 (0,5 mL de água destilada), o tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e tratado G3 (1874
mg/kg de ORCD).
2.5 DESENHO EXPERIMENTAL
O estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 3 (E3) e o Experimento 4 (E4), de

acordo com o segmento III dos estudos de toxicologia reprodutiva, adaptados de normas da
Environmental Protection Agency e recomendados pela Food and Drugs Administration e
Organization for Economic Cooperation and Development. O E3 compreendeu o segmento
III, avaliando-se fêmeas durante no período perinatal (de desenvolvimento fetal in útero). O
E4 também compreendeu o seguimento III, porém o tratamento compreendeu o período pós-
natal (lactação). Para tanto, 40 animais, sendo 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E3G1,
E3G2 e E3G3) e 5 machos reprodutores no E3 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E4G1,
E242 e E4G3) e 5 machos reprodutores no E4 foram utilizados (Figura 1).
211
ENSAIOS
TOXICOLOGIA
REPRODUTIVA
SEGMENTO III SEGMENTO III

Perinatal Pós-natal
EXPERIMENTO 3 EXPERIMENTO 4
CONTROLE TRATADO 10% DL50 TRATADO 50% DL5 CONTROLE TRATADO 10% DL50 TRATADO 50% DL5
0 0
0,5 mL água 366,8 mg/kg 0,5 mL água 366,8 mg/kg
1874 mg/kg 1874 mg/kg
E3G1 (n=5) E3G2 (n=5) E3G3 (n =5) E4G1 (n=5) E4G2 (n=5) E4G3 (n =5)
Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 3 e 4 para avaliar a toxicologia reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C.
duckei, de acordo com o segmento III (perinatal e pós-natal).
212
2.5.1 Seqüência experimental
2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal)
Após o período de adaptação e ao atingirem a maturidade sexual, aproximadamente

250 g, iniciou-se o exame de esfregaço vaginal, diariamente, pela manhã. Uma micropipeta,
contendo 10μL de soro fisiológico 0,9%, era introduzinda no canal vaginal e, posteriormente,
aspirando juntamente com as células, que eram visualizadas em microscopia óptica, para
detectar a fase do ciclo estral, segundo a técnica descrita por Marcondes et al. (2002)
2.5.3 Período de Acasalamento
Após a detecção da fase proestro, as fêmeas nulíparas, foram separadas em gaiolas de

polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho ao final da tarde. Na
manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais foram coletados. Foi
considerada como indicativo de prenhez a presença de espermatozóides, associado ao
diagnóstico da fase estro do ciclo estral. Confirmada a prenhez, esse dia foi considerado como
o dia zero (d0). Após a confirmação da prenhez, as ratas foram separadas, randomicamente,
em cada grupo (E3G1, E3G2, E3G3, E4G1, E4G2 e E4G3). Após, deu-se início a sequência
experimental, de acordo com cada protocolo experimental (E3 e E4).
2.5.4.1 Tratamento no período perinatal in útero (d16-d20) E3
de desenvolvimento fetal. Esta fase caracteriza-se pela diferenciação e crescimento tissular,
maturação fisiológica dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto, compreendendo
o d16 ao d21 (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Assim, o período de
tratamento foi do d16 ao d20, uma vez ao dia.
A duração da prenhez da rata tem uma duração máxima de 23 dias e, após o parto, que
desta vez ocorrerou sem intervenções cirúrgicas, foram avaliados diversos parâmetros, tal
213
como mortalidade materna, tempo de prenhez, tamanho da ninhada. No dia do desmame as

progenitoras foram sacrificadas em câmera de CO2.
Durante o tratamento, as ratas foram avaliadas quanto à presença de manifestações de

sinais de toxidade aguda, tal como, diarreia, piloereção, agitação, sialorréia e sangramento.
2.5.4.2.1 Avaliação de massa corporal das progenitoras E3
As ratas foram pesadas nos d16, d17, d18 e d20 para avaliar o ganho de massa
corporal foi calculado.
2.5.4.2.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3
O consumo de água e ração foi mensurado nos d16, d17, d18 e d20.
2.5.4.3 Avaliação da progênie exposta no período perinatal (in útero) E3
Alguns parâmetros foram avaliados conforme as fórmulas abaixo:

1. ÍNDICE DE NASCIMENTO (%) = (nº de filhotes nascido vivos/ nº de filhotes
nascidos) x 100
2. ÍNDICE DE VIABILIDADE (%) = (no de filhotes vivos no 4o dia pós-natal / nº de
nativivos) x 100.
3. ÍNDICE DE DESMAME (%) = (nº de filhotes vivos no desmame/ nº de nascidos
vivos) x 100
4. RAZÃO SEXUAL (%) = (nº machos / nº fêmeas) x 100
2.5.4.3.1 Massa da progênie E3
As massas dos filhotes (fêmeas e machos) de todos os grupos de tratamento foram

aferidas após o nascimento (dpn = dia pós-natal), dpn1, dpn 7, dpn 14 e d19 (lactação) e
dpn24, dpn49, dpn59 e dpn 74 (desenvolvimento).
214
2.5.4.3.2 Avaliação do desenvolvimento geral e sexual da progênie E3
2.5.4.3.2.1 Descolamento dos pavilhões auriculares E3

Após o nascimento foi dado início a observação da progênie quanto ao descolamento
bilateral completo dos pavilhões auriculares. As observações foram realizadas, diariamente,
até a detecção da variável.
2.5.4.3.2.2 Surgimento de pelos E3
A progênie foi observada a partir do 6º dia pós-natal quanto ao surgimento de pêlos.

As observações foram feitas, diariamente, até a detecção de surgimento de pêlos na cabeça,
membros e dorso dos animais.
2.5.4.3.2.3 Abertura palpebral ocular bilateral E3
A progênie foi observada a partir do 12º dia pós-natal quanto à abertura bilateral
completa das pálpebras. As observações foram feitas, diariamente, até a detecção da variável.
2.5.4.3.2.4 Manifestações das características sexuais E3
No dpn6 foi realizada a sexagem dos filhotes, os quais foram mantidos na mesma
caixa com a progenitora. O parâmetro utilizado foi a visualização da distância ano-genital,
sendo maior nos machos em relação às fêmeas.
Para os descendentes machos, foi observada a descida dos testículos à bolsa escrotal e
separação prepucial. Já as fêmeas foram observadas quanto à abertura do canal vaginal e a
regularidade do ciclo estral, pelo exame da citologia vaginal, por um período de quinze dias.
2.5.4.3.2.5 Avaliação da atividade motora E3
Para investigar o possível efeito na atividade motora foi realizado nos 75 dpn o Teste
do Campo Aberto, de acordo com a metodologia caracterizada por Holland e Weldon (1968).
O aparelho para realização deste ensaio consistiu em uma caixa de madeira (40 x 60 x 50 cm)
com o chão dividido em 12 quadrantes. Cada animal foi colocado no centro do campo aberto
215
onde foi registrado, por um período de 5 min, o número de cruzamentos pelos quadrantes
(locomoção horizontal) e o número de rearing (locomoção vertical).
2.5.5.1 Tratamento no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4
Neste ensaio as fêmeas lactantes dos grupos E4G1, E4G2 e E4G3 foram tratadas na
fase de lactação. Nesta fase as células alveolares mamárias são pequenas e o espaço
intercelular é largo, o que faz com que substâncias maternas, incluindo drogas, linfócitos,
imunoglobulinas e proteínas transfiram-se mais facilmente para o leite materno (HALE,
2004). Desta forma, o tratamento foi durante a lactação, do 13dpn ao 19dpn, uma vez ao dia.
2.5.5.2 Toxidade aguda nas lactantes E4
Durante o tratamento, as ratas lactantes foram avaliadas quanto à presença de

manifestações de sinais de toxidade aguda, tal como, diarreia, sialorréia, piloereção, agitação
e sangramento. Após o nascimento dos descendentes, os mesmo parâmetros do E3 foram
avaliados no E4 (mortalidade materna, tempo de prenhez e tamanho da ninhada).
2.5.5.2.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4
As ratas foram pesadas nos dpn13, dpn14, dpn15, dpn16, dpn17, dpn18 e dpn19, para
avaliar o ganho de massa corporal.
2.5.5.2.2 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4
O consumo de água e ração foi mensurado As ratas foram pesadas nos dpn13, dpn14,
dpn15, dpn16, dpn17, dpn18 e dpn19.
No dpn19, dia do desmame, foi realizada a coleta de sangue e processadas para análies
bioquímicas e hematológicas. Posteriormente, essas progenitoras foram sacrificadas em
câmeras de CO2 e seus órgãos (fígado, rins, baço, coração e pulmão) foram examinados e
216
pesados. Após, foram mantidos em formol 10%, para conservação, até o processamento para
análises histopalógicas.
2.5.5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4
Para análise bioquímica, o material foi centrifugado a 3.500 rpm durante 10 minutos,
para separar o soro dos elementos figurados do sangue. Posteriormente, procedeu-se a
dosagem das enzimas plasmáticas, como aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT), e demais parâmetros como bilirrubina total e direta, colesterol total,
fosfatase alcalina, glicose, triglicerídeos, uréia e creatinina, utilizando kits BIOCLIN®
(ensaios enzimáticos colorimétricos e cinéticos colorimétricos) e o equipamento
multiparamétrico (Alizé) da Biomérieux.
Para análise hematológica, fez-se o hemograma completo, determinando os valores de
hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, plaquetas e os índices hematimétricos,
volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (HCM), utilizando analisador automático de células
hematológicas HumaCount Plus. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em
extensões coradas com May-Grunwald-Giemsa, em cada ensaio, 100 células foram analisadas
e contadas.
2.5.5.2.4 Análise histopatológica das lactantes E4
Os órgãos, previamente conservados em formol 10%, foram encaminhados ao Centro

de Diagnóstico de Anatomia Patológica e Citopatologia, para processamento e análise. As
amostras foram fragmentadas em 5 mm de diâmetro para uma boa fixação. Após a completa
fixação, o material foi lavado e deixado em álcool 70% por três horas. Após sucessivas
passagens em álcool 96º e 100º, foram realizadas três passagens em xilol e um banho de
parafina a 60º C por uma hora e um segundo banho de parafina em estufa à vácuo por mais
uma hora, seguindo a inclusão do material.
Para obtenção dos cortes histológicos, os blocos de parafina foram aparados,
objetivando-se retirar o excesso de parafina dos lados da peça emblocada, para evitar o
enrugamento dos cortes. Foram cortados com a espessura de 5µm e com o auxílio de uma
pinça os fragmentos da fita de cortes foram colocados em banho-maria com água destilada a
217
temperatura de 45º a 50ºC e após os cortes serem esticados foram pescados com a lâmina,
previamente limpas e desengorduradas. Em seguida, as lâminas foram secadas em estufa a
55ºC.
As lâminas foram passadas em sequencias de xilol e álcoois para desparafinar e
hidratar os cortes, para posterior coloração com hematoxilina-eosina (HE). Para cada órgão
foram confeccionadas três lâminas. Após, foram analisadas por microscopia óptica pela
Patologista Drª. Nelma Rocha.
2.5.5.3 Avaliação dos lactentes expostos no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4
Alguns parâmetros foram avaliados conforme as fórmulas abaixo:

1. ÍNDICE DE NASCIMENTO (%) = (nº de filhotes nascido vivos/ nº de filhotes
nascidos) x 100
2. ÍNDICE DE VIABILIDADE (%) = (no de filhotes vivos no 4o dia pós-natal / nº de
nativivos) x 100.
3. ÍNDICE DE DESMAME (%) = (nº de filhotes vivos no desmame/ nº de nascidos
vivos) x 100
4. RAZÃO SEXUAL (%) = (nº machos / nº fêmeas) x 100
2.5.5.3.1 Toxidade aguda dos lactentes E4
Durante o tratamento, os filhotes lactentes foram avaliadas quanto à presença de

manifestações de sinais de Toxidade aguda.
2.5.5.3.2 Massa dos lactentes E4
Os filhotes lactentes (fêmeas e machos) de todos os grupos de tratamento foram

pesados no dpn1, dpn 7, dpn 14 e d19 (lactação) e dpn24, dpn49, dpn59 e dpn 74
(desenvolvimento).
2.5.5.3.3 Avaliação do desenvolvimento geral da progênie

218
2.5.5.3.4 Descolamento dos pavilhões auriculares
Idem o item 2.5.4.3.2.1
2.5.5.3.5 Surgimento de pêlos
Idem item 2.5.4.3.2.2
2.5.5.3.6 Abertura palpebral ocular bilateral
Idem item 2.5.4.3.2.3
2.5.5.3.7 Manifestações das características sexuais
Idem item 2.5.4.3.2.4
2.5.5.3.8 Avaliação da atividade motora
Idem o item 2.5.4.3.2.5
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E3 E E4
Para comparação dos valores médios de massa corporal, ingestão de água, consumo de
ração, tempo de prenhez, intervalos entre estros, duração de cada fase do ciclo, dia do 1º estro,
desenvolvimento ponderal da progênie e avaliação da atividade motora foi empregada teste t
não pareado (2 grupos) e e análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey (3
grupos). Com relação aos parâmetros reprodutivos maternos, tal como mortalidade materna,
índice de nascimento, índice de viabilidade, índice de desmame, desenvolvimento geral da
progênie e regularidade do ciclo foi aplicado o qui-quadrado. Para avaliar os parâmetros
bioquímicos, hematológicos e peso dos órgão empregou-se ANOVA, seguido de Tukey. Foi
considerado, como nível de significância estatística, o limite de 5 % (p < 0,05). As análises
estatísticas foram realizadas no software Instat GraphPad® e os gráficos construídos no
software Prism GraphPad®.
219
Durante o tratamento com ORCD, sinais clínicos de toxidade aguda, tal como agitação
(2/5), estresse (2/5) foram relatados no grupo tratado com 366,89 mg/kg (E3G2). Com o
aumento da dose para 1874 mg/kg, além desses sinais, sangramento nasal (2/5) e vaginal
(2/5), diarréia (1/5) e piloereção (2/5) também foram relatados nas progenitoras do E3G3
durante o tratamento.
Souza et al. (2000), semelhantemente, observaram sinais clínicos de toxidade aguda
após administração do óleoresina de C. multijuga. No entanto, Ribeiro et al. (2007) e sachetti
(2009) não detecaram esses sinais de toxidade em ratos após administração do óleoresina de
Copaifera spp (800 mg/kg) e Copaifera reticulata (500, 1000 e 1250 mg/kg),
respectivamente.
3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das progenitoras E3
Durante o tratamento com ORCD no período de desenvolvimento fetal (final da

prenhez) houve uma evolução ponderal da massa corpórea nos grupos controle (E3G1) e
tratado 366,89 mg/kg (E3G2), e devido a toxidade no grupo E3G3, houve diminuição abrupta
da massa corporal entre o segundo e terceiro dia de tratamento, d17 e d18, respectivamente,
culminando com óbito de todas as ratas do grupo E3G3 no terceiro dia (d18) de tratamento
com ORCD 1874 mg/kg (Figura 2).
A taxa de crescimento corporal durante o período fetal é muito grande, principalmente

nas últimas semanas (MOORE; PERSAUD, 2008). Esse crescimento poderia ser
acompanhado pelo aumento da massa corporal materna, de maneira gradual. Neste estudo o
ORCD 1874 mg/kg causou toxidade materna e, consequentemente, toxidade fetal, resultando
em óbitos maternos e fetais. Como a gestação é um estado que demanda aumento das
atividades metabólicas necessárias para suportar, tanto a fisiologia hormonal materna quanto
o desenvolvimento normal do feto. Assim, o excessivo ou inadequado ganho de peso pode
220
acarretar complicações tanto para a saúde materna como para a fetal (HERRERO-
MERCADO et al, 2011).
400
E3G1
E3G2
Massa (g)
350 E3G3
300
a,b
250
16 17 18 20
dia de Prenhez (d)
(E3G3), sobre a massa de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao período de
desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5
mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos
índices a(em relação ao E3G1) e b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado Análise de variância
3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3
Não foi observada diferença estatística significativa entre os grupos controle E3G1 e
os tratados E3G2 e E3G3, nas doses de 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, respectivamente.
Todavia, no gráfico, nota-se a diminuição abrupta da ingestão de água no grupo E3G3 entre o
segundo (d17) e o terceiro (d18) dia de tratamento, que culminou no óbito dessas progenitoras
(Figura 3). A diminuição da ingestão hídrica no grupo E3G3 é compatível com a perda de
massa corporal, citado anteriormente, indicando que a dose de 1874 mg/kg causou toxidade
materna.
O consumo médio de ração das progenitoras que receberam o ORCD (E3G2 e E3G3)
não diferiu do controle (E3G1), exceto no último dia de tratamento (d20) (p<0,05). O
comportamento no gráfico foi semelhante entre os grupos tratados, com aumento do consumo
médio no segundo dia de tratamento (d17), diminuindo no terceiro dia (d18) (Figura 4).
221
55
E3G1
50 E3G2
E3G3
Água (mL)
45
40
35
30
25
16 17 18 20
dias de Prenhez (d)
(E2G3), sobre a ingestão de água de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao
período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Os valores não diferiram entre si
ao nível de 5% (p>0,05). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=
5/grupo).
30
E3G1
E3G2
25
E3G3
Ração (g)
20
a
15
10
16 17 18 20
dias de Prenhez (d)
(E2G3), sobre o consumo de ração de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao
período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi administrada água
destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são
indicados pelos índices a(em relação ao E3G1) e b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado Análise
de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey e Teste t não pareado (n= 5/grupo).
222
3.1.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos de progenitoras expostas no período perinatal

(in útero) (E3)
Durante o tratamento com ORCD 1874 mg/kg todas as ratas vieram a óbito. O ORCD
366,89 mg/kg apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e razão
sexual, com diferença estatística (p<0,05) entre o grupo tratado E3G2 em relação ao grupo
controle E3G1 (Tabela 1).
Para Nepuceno et al. (2005), as condições hormonais maternas também são
necessárias para o bom desenvolvimento embrionário, sendo amplamente conhecido que
níveis sangüíneos de progesterona inadequados interferem com a viabilidade do embrião, por
não permitirem que o endométrio esteja adequadamente preparado para a sustentação da
gestação. A progesterona é um dos principais agentes responsáveis pelo relaxamento uterino
na gestação, e estudos indicam que a redução dos níveis plasmáticos deêm início ao parto
(MOHAN; BINNETT, 2006).
Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros reprodutivos maternos de
ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).
E3G1 E3G2 E3G3

Mortalidade materna (n) 0 0 100
Tempo de Prenhez (dias) 22.2 ± 0.2 23.0 ± 0.31 -
Índice de nascimento (%) 100 ± 0.00 97.77 ± 2.22 -
Índice de viabilidade (%) 100 ± 0.00 72.5 ± 19.52 a -
Índice de desmame (%) 100 ± 0.00 72.5 ± 19.52 a -
Tamanho da ninhada (n) 6.40 ± 1.28 8.80 ± 0.66 -
-
Razão Sexual (M/F) 128.33%±54.11% 165% ±80.15% a
(E3G2) e 1874 mg/kg (E3G3). Os dados representam a média ± E.P.M. As variáveis indicadas como índices ou
percentuais foram aplicadas qui-quadrado e as variáveis com medidas ordinais foi aplicado o teste t não pareado.
a
(p < 0,05).
O parto é o processo pelo qual o feto, a placenta e as membranas fetais são expelidos
do trato reprodutor materno. O trabalho de parto é a sequência de contrações uterinas que
resultam na dilatação do colo uterino, saída do feto e da placenta do útero (MOORE;
PERSAUD, 2008). No presente estudo o ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de
223
parto, pois não foi encontrada diferenças significativas ao comparar a média do tempo de
prenhez. O grupo E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada
(8.80 ± 0.66). Por outro lado, Almeida (2009) considera que o número de filhotes, geralmente,
está associado à variabilidade no tempo da prenhez, de modo que, quanto maior o número,
menor o tempo de prenhez.
O período imediatamente após o nascimento é um período crítico quando o cérebro

imaturo é permanentemente alterado por hormônios esteróides gonadais e da supra-renal
(GOMES et al.,1999). Variações no cuidado maternal têm sido amplamente consideradas
como uma influência crítica no desenvolvimento (CHAMPAGNE et al., 2003). O índice de
viabilidade mostra a presença de alterações estruturais e funcionais que não causam morte no
útero, mas são incompatíveis com a vida enquanto que o índice de desmame avalia as
alterações morfofuncionais incompatíveis com a vida, embora eles apenas causem a morte em
longo prazo (BEDRAN, 1988).
Sachetti et al. (2011) estudaram os efeitos pós-natal do óleoresina de C. reticulata, no

entanto, não avaliram os índices de viabilidade e de desmame. Um estudo conduzido por
Dimech et al. (2006) sobre a performance reprodutiva em ratos machos com o extrato
hidroalcoólico de Mentha crispa (0,5 e 1,0 g/kg) não encontram diferença nos índices de
viabilidade e desmame na progênie. Mentha crispa também apresenta na composição do óleo
essencial cariofileno e humuleno, embora em menor quantidade (PIANOWSKI, 2000),
compostos que também estão presentes nos óleoresinas de Copaifera spp.
3.1.2 Toxidade na progênie de progenitoras tratadas no período perinal in útero (d16-

d20) E3
3.1.2.1 Desenvolvimento ponderal progênie (Lactação)
O desenvolvimento ponderal da progênie foi alterado pela administração do ORCD

366,89 mg/kg no período de desenvolvimento fetal, após observar a evolução durante o
período de lactação. Nota-se diferença estatística no dpn 14 e dpn 19, com valores médios de
massa corporal de 22,12 e 26,24 gramas (g), respectivamente, no grupo E3G2 comparado a,
19,61 e 21,26 g no E3G1 (Figura 5).
224
30
a E3G1
a E3G2
20
Massa (g)
10
0
1 7 14 19
Dia pós-natal (dpn)

(E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (lactação) da progênie de ratas tratadas no período
perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1)
foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi
aplicado Teste t não pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).
A transformação do embrião em feto é gradual. O desenvolvimento durante o período

fetal está basicamente relacionado com o rápido crescimento do corpo com a diferenciação
dos tecidos, órgãos e sistemas. O período de tratamento neste ensaio foi o de desenvolvimento
fetal. Nesta fase, o feto necessita de substratos para crescer e produzir energia. Gases e
nutrientes provenientes da mãe passam livremente pela membrana placentária e chegam ao
feto. Muitos fatores maternos, fetais e ambientais podem influenciar o crescimento pré-natal.
Sabe-se que a desnutrição materna grave resultante de dieta de má qualidade causa uma
redução do crescimento fetal.
Neste estudo, não houve diferença entre os grupos no 1º dpn pós-natal e a evolução
ponderal da progênie seguiu normalmente. É importante ressaltar que durante a evolução, a
progênie de ratas que receberam ORCD 366,89 mg/kg no período fetal, apresentaram maior
ganho de massa corporal. Por outro lado, Sachetti (2011) estudaram a embriotoxidade do
óleoresina de C. reticula e observaram alterações no desenvolvimento embriofetal, com
retardo do crescimento fetal da prole.
O crescimento e o desenvolvimento fetal são determinados, primariamente, tanto pelo
padrão genético do feto quanto pela sua capacidade em produzir seus próprios fatores de
crescimento, os quais influenciarão o crescimento e a diferenciação (VAN ASSCHE et al.,
2001). Entretanto, a regulação gênica do crescimento fetal é influenciada por diferentes
225
fatores externos os quais podem exercer efeitos inibitórios ou estimulatórios. Além disso,
como o embrião dos mamíferos cresce e se desenvolve dentro do útero materno, o
crescimento fetal é dependente do status nutricional materno e da capacidade da placenta em
transferir adequadamente os nutrientes da mãe para o feto (HOLEMANS et al., 2003).
3.1.2.2 Desenvolvimento ponderal da progênie (pós-lactação) E3
O desenvolvimento ponderal da progênie de ratas tratadas com ORCD 366,89 mg/kg

no período fetal também foi afetado após o período de lactação, com diferenças estatísticas
significativas (Figura 6).
250
a E3G1
a
200 E3G2
Massa (g)
150 a
100
a
50
0
24 49 59 74
(E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (pós-lactação) da progênie de ratas tratadas no período
perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1)
foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi
aplicado Teste t não pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).
3.1.2.3 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E3
O ORCD 366,89 mg/kg alterou o tempo de abertura do canal vaginal (p<0,05) (Tabela
2). Em seres humanos a diferenciação sexual do trato reprodutivo ocorre relativamente no
início da gestação (entre sete e quatorze semanas), e a maioria dos eventos de diferenciação
sexual do sistema nervoso central ocorre no período pré-natal. No rato a diferenciação sexual
do trato reprodutivo ocorre no final da gestação (após 15 dias) e a do sistema nervoso só se
226
completa após o nascimento (GRAY et al., 2004). Hollenbach et al. (2010) avaliaram o
desenvolvimento pós-natal de duas preparações fitoterápicas contendo extrato de soja
(Glycine max, família Fabaceae). A descida dos testículos ocorreu entre o 15o e o 19o dia de
vida em todos os animais, a separação prepucial entre o 34o e o 39o dia de vida e a abertura do
canal vaginal, entre o 30o e o 37o dia de vida. Tanto nas características de desenvolvimento
geral quanto do desenvolvimento sexual não ocorreu diferença entre os grupos. No entato, a
análise do tempo de abertura do canal vaginal foi estatisticamente diferente entre os grupos
(E3G1 e E3G2).
Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento geral da progênie de
ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).
E3G1 E3G2
Descolamentos dos pavilhões auriculares 100% 100%
(até o dpn 3)
Aparecimentos de penugem (até o dpn 5) 100% 100%
Erupção dos incisivos (até o dpn 9) 100% 100%
Aparecimentos de pêlos (até o dpn 8) 100% 100%
Abertura dos olhos (até o dpn 14) 46,87% 38,7%
(após o dpn 14) 53,12% 61,2%
Descendentes Machos
Descida bilateral dos testículos (até o dpn 17) 100% 100%
Separação prepucial completa (apartir do dpn 33) 100% 100%
Descendentes Fêmeas
Abertura do Canal Vaginal
(dpn35 ao dpn45) 91,67% 6,67%a
(dpn46 ao dpn57) 8,33% 93,33%a
O grupo controle (E3G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e o tratado recebeu ORCD 366,89 mg/kg
a
(E3G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste qui-quadrado. (p < 0,05).
O ORCD 366,89 mg/kg adiou o aparecimento do 1º estro da progênie, pois a média de

chegada do 1º estro no grupo controle E3G1 foi de 46,66 ± 1,47 dpn comparado com a média
de 55,85 ± 1,60 do grupo E3G2. Não houve diferença estatatística em relação os intervalos
entre estros e a regularidade do ciclo (Tabela 3).
227
Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo estral, período de
15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).
E3G1 E3G2
Intervalos entre estros (dias) 5.5 ± 1.65 5.4 ± 1.50
Dia do 1º estro (dpn) 46.66 ± 1.47 55.85 ± 1.60a
Ciclo regular ( %) 8.33 0.00
(E3G2) e ORCD 1874 mg/kg (E3G3). As variáveis com medidas ordinais foram aplicadas o teste t não pareado
e variáveis com percentual foram aplicadas qui-quadrado. a (p < 0,05).
A vagina responde morfologicamente e funcionalmente em resposta a flutuações nos

níveis de estrogênios. Assim, a abertura do canal vaginal e dados do ciclo estral podem ser
usados como indicadores de início da puberdade (MARTY; CRISSMAN; CARNEY, 1999).
O padrão de eventos do ciclo estral pode ser utilizado como indicador de normalidade das
funções ovarianas e neuroendócrinas reprodutivas em fêmeas não prenhas (US EPA, 1996). A
normalidade do ciclo estral pode ser acompanhada, observando as mudanças citológicas no
esfregaço vaginal. Neste estudo, a duração de cada fase do ciclo não foi diferente ao comparar
os grupos controle E3G1 e tratado E3G2 (Tabela 4).
Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase do ciclo estral,
período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal
(d16-d20).
Fases do Ciclo Estral E3G1 E3G2
Proestro 1.66 ± 0.18 1.40 ± 0.19
Estro 1.50 ± 0.26 1.46 ± 0.19
Metaestro 7.16 ± 0.51 7.13 ± 0.51
Diestro 4.66 ± 0.59 5.00 ± 0.62
(E3G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste t pareado. Os valores não diferiram entre si
ao nível de 5% (p>0,05)
No entanto, os tempos de duração de cada fase estavam alterados nos dois grupos
experimentais (E3G1 e E3G2). Dentro da normalidade, a duração de cada fase corresponde,
repectivamente, diestro (57 h), metaestro (21 h), estro (14 h) e proestro (12 h). Sabe-se que os
228
roedores são animais do tipo poliestro, ou seja, apresentam ciclos estrais regulares e
sucessivos, que duram de quatro a seis dias na rata, estando na dependência dos hormônios
sexuais (GOLDMAN; MURR; COOPER, 2007; GOPINATH, 2013). O controle da
luminosidade do ambiente é um fator importante, pois ciclos ovarianos consistentes ou
regulares podem ser detectados em roedores apenas quando abrigados sobre condições
regulares de luminosidade (COOPER; GOLDMAN; VANDENBERGH, 1993). Alterações
dos fotoperíodos padronizados, 12 ou 14 horas de exposição à luz comum, podem levar a
várias alterações dos ciclos, incluindo inibição da ovulação e manutenção dos esfregaços
vaginais persistentes em estro (BAIRD et al. 1999; GOPINATH, 2013). Neste estudo, embora
esteja alterado o tempo de duração de cada fase, os esfregaços não estavam persistentes em
estro, com diminuição do diestro e persistência em metaestro.
Stouffer et al. (2006) relatam que a formação do corpo lúteo ocorre no estro,
alcançando sua máxima dimensão no diestro, sendo mantido até o metaestro do ciclo seguinte.
No diestro do próximo ciclo, o corpo lúteo regride bruscamente devido à ausência do suporte
luteotrófico. Com isso, a secreção de progesterona declina durante o diestro e uma nova
ovulação ocorre posteriormente (GOPINATH, 2013). Assim, a fase luteal em ratas é atípica.
O corpo lúteo de ratas que não acasalaram secretam baixos níveis de progesterona por pouco
tempo (1-2 dias). Isto serve como base para o curto ciclo dos roedores.
3.1.2.3.1 Avaliação da atividade motora E3
No 75 dpn todos os filhotes foram avaliados quanto a atividade locomotora, com duas
categorias comportamentais. O ORCD na dose de 366,89 mg/kg foi capaz de elevar (p < 0,05)
tanto o número de quadrantes explorados (174,30 ± 6,21) como o “rearing” (45,53 ± 2,70),
que é o ato de permanecer sobre as duas patas traseiras para investigar o ambiente (locomoção
vertical) (Tabela 5).
Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da progênie
(F0) de ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).
E3G1 E3G2
Quadrantes 93,5 ± 8,74 174,30 ± 6,21a
Rearings 28,2 ± 3,70 45,53 ± 2,70a
(E2G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste t pareado. a (p<0,05)
229
Ribeiro et al. (2007) não detectaram alterações comportamentais ao óleoresina de

Copaifera spp. (doses crescentes de 50 a 800 mg/kg). Sachetti et al. (2009) estudaram o
potencial neurotóxico do óleoresina de C. reticulata em ratas Wistar nas doses de 300 e 2000
mg/kg p.c, administrados por via oral, não sendo detectado alteração neurocomportamental.
O ORCD 366,89 mg/kg aumentou a atividade motora da progênie exposta durante a
fase fetal. A função motora e o comportamento de animais expostos a agentes químicos no
período pré-natal são, rotineiramente, avaliados pelo teste de campo aberto. Desta forma a
locomoção caracteriza-se pelo nº de quadrantes explorados, que se for elevado indica efeito
estimulante. O esfeito sedativo pode ser observado quando houver diminuição do tempo de
parada ou “rearing”. Costa-Silva et al. (2006) em estudo com o óleo da Carapa guianensis
(andiroba), sugerem ação central, identificados com o aumento da atividade motora da prole
de ratas tratadas ( 375, 0,75 e 1,5 g/kg).
3.2.1 Toxidade aguda das lactantes E4
As lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação (3/5) e estresse (1/5) após o
tratamento com as duas doses. No grupo E4G2 que recebeu a menor dose (366,89 mg/kg)
houve relatado piloereção (2/5) e no E4G3 sangramento nasal (1/5) ao receber a maior dose
(1874 mg/kg). Esses sinais clínicos foram detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação),
E2 (pós-implantação) e E3 (desenvolvimento fetal). Contudo, estudo realizado por Ribeiro et
al. (2007) não corrobora com nossos achados. Não foi encontrado quaisquer alteração no
padrão de comportamento nos roedores expostos tanto a fração volátil como ao óleoresina de
copaíba (espécie não informada) em doses crescentes de 50 a 800 mg/kg pc.
3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4
A massa corpórea das lactantes dos grupos tratados E4G2 e E4G3 não diferiu (p<0,05)
do grupo controle E4G1. Porém, houve diferença estatística significativa entre os dois grupos
tratados, e os valores variaram de 319 a 329 g no E4G2, enquanto que no E4G3 variou entre
254 a 277 g (Figura 7). A exposição ao ORCD durante a lactação não causou toxidade
materna nas lactantes, no entanto pode-se observar efeitos relacionados a dose administrada,
230
ente a maior e a menor. Sachetti et al. (2011) avaliaram a toxidade reprodutiva e a

embriofetotoxidade do óleoresina de C. reticulata, houve toxidade materna nas doses de 1000
e 1250 mg/kg, evidenciado pela redução de peso corpóreo e pela diminuição no consumo de
ração.
400
E4G1
E4G2
350
E4G3
Massa (g)
300
b b b b b b
250
200
13 14 15 16 17 18 19
dia pós-natal (dpn)
(E4G3), sobre a massa de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo
controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ±
E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em
relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=
5/grupo).
3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das lactantes E4
A ingestão de água das lactantes não foi alterada pelo tratamento com ORCD nas
doses de 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, pois os valores médios dos grupos tratados (E4G2 e
E4G3) foram muito próximo dos valores do grupo controle (E4G1). Não houve difereça
estatística significativa entre o grupo E4G3, tratado com a maior dose (50% da DL50), e
E4G2, tratado com a menor dose (10% da DL50) (Figura 8).
231
150
E4G1
E4G2
E4G3
Água (mL)
100
50 b
0
13 14 15 16 17 18 19
(E4G3), sobre a ingestão de água de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No
grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a
média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3
em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=
5/grupo).
A ingestão hídrica também não foi alterada nos experimentos anteriores (E1, E2 e E3),
sugerindo que o ORCD, nas doses administradas, não seja capaz de interferir neste parâmetro
em nenhum momento do ciclo reprodutivo de ratas. Com relação a ração, O ORCD na dose
de 1874 mg/kg foi capaz de alterar seu consumo de nos 15, 16 e 19 dpn. O gráfico demonstra
um comportamento semelhante entre os três grupos analisados, elevação do consumo de ração
no 18º dpn e decaindo no d19 dpn (Figura 9). Passos et al. (2000), afirmam que a nutrição
materna, durante a lactação, é um fator determinante na programação do peso da prole na
idade adulta.
232
80
E4G1
E4G2
60
E4G3
Ração (g)
40
b
a, b b
a, b a, b
20
0
13 14 15 16 17 18 19
(E4G3), sobre o consumo de ração de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No
grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a
média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indidados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3
em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=
5/grupo).
3.2.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos das lactantes E4
O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89 mg/kg) não causaram aumento do tempo
de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de nascimento, de viabilidade e tamanho da
ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão sexual diferiram (p<0,05) do grupo controle
E4G1 (Tabela 6). No experimento 3, em que a exposição ao ORCD ocorreu na fase de
desenvolvimento fetal houve diminuição significativa da viabilidade, diferentemente do
Experimento 4, não houve alteração na viabilidade dos filhotes até o dpn4. É importante
ressaltar que neste caso, do E4, o ORCD ainda não havia sido administrado, pois o período de
tratamento durante a lactação compreendeu do dpn 13 ao dpn 19, não podendo ser atribuído
ao ORCD, no entanto, nos perimite inferir ação do ORCD 366,89 mg/kg no período fetal.
233
Tabela 6. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros reprodutivos
maternos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3
Mortalidade materna (n) 0 0 0
Tempo de Prenhez (dias) 22.2 ± 0.20 22.8 ± 0.20 22.4 ± 0.24
Índice de nascimento (%) 100 100 97.5 ± 2.50
Índice de viabilidade (%) 98.33 ± 1.66 100 96 ± 2.44
a
Índice de desmame (%) 98.33 ± 1.66 100 83.14 ± 11.14a
Tamanho da ninhada (n) 8.80 ± 0.86 7.40 ± 0.67 8.00 ± 0.94
Razão Sexual (M/F) 161.8 ± 22.91 215% ± 122.37a 69 ± 0.17.42a
(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a média ± E.P.M. As variáveis indicadas como índices ou
percentuais foram aplicadas qui-quadrado e as variáveis com medidas ordinais foram aplicadas ANOVA,
seguido do teste de Tukey a (p < 0,05).
Em mamíferos, é indispensável o desempenho normal das funções maternas para a

saúde dos filhotes. Os cuidados parentais, em especial o maternal, são essenciais para a
sobrevivência e o desenvolvimento dos filhotes já que em várias espécies os filhotes são
imaturos ao nascimento (CASTRO; CHIORATO; PINTO, 2000). Com relação a diferença
encontrada no índice de desmame, não houve um padrão de dose-resposta, pois o grupo
tratado com 366,89 mg/kg (menor dose) o índice foi de 100% e na maior foi em média 83.14
± 11.14%. A diferença na razão sexual neste ensaio também não pode ser atribuída a
administração do ORCD, no entanto serve como parâmetro que pode ser comparado com
experimento 3 e inferir se há ou não determinados padrões de respostas de acordo com o sexo
do animal (toxidade pré-natal ou pós-natal).
Variações no tempo de gestação podem indicar alterações no processo de gestação ou
parto. Um prolongamento significante do tempo de gestação pode ser causado pela falha do
mecanismo de parturição e pode resultar em morte ou prejuízo da ninhada por distocia
(dificuldade de parir) (US EPA, 1996). Segundo Olson (2003), a parturição é composta por
cinco eventos fisiológicos integrados, os quais são: ruptura da membrana fetal, dilatação
cervical, contratilidade do miométrio, separação placental e involução uterina, sendo que as
prostaglandinas têm um papel central em cada um deles. Tanto no experimento 3 como no
experimento 4, não houve diferença entre os grupos em relação ao tempo de prenhez.
234
3.2.1.4 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4
A dose de 1874 mg/kg de ORCD alterou a concentração de creatinina (3.10 ± 1.23).

Não houve diferença estatística, significativa, entre os grupos para os demais parâmetros
analisados (bilirrubina total e direta, colesterol total fosfatase alcalina, glicose, AST, ALT,
triglicerídeos e uréia) e os dados estão representados na Tabela 7.
Tabela 7. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros bioquímicos de
ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3
Bilirrubina total (mg/dL) 0.94 ± 0.09 1.02 ± 0.19 1.20 ± 0.17
Bilirrubina direta (mg/dL) 0.30 ± 0.05 0.49 ± 0.12 0.53 ± 0.08
Colesterol total (mg/dL) 72.40 ± 10.19 72.20 ±9.84 90.00 ± 26.21
Creatinina (mg/dL) 0.84 ± 0.09 1.36 ± 0.23 3.10 ± 1.23a
Uréia (mg/dL) 32.00 ± 6.39 43.00 ± 6.57 75.66 ± 28.76
FA (U/L) 99.40 ± 18.89 60.80 ± 5.63 69.33 ±7.83
Glicose (mg/dL) 143.80 ± 20.03 132.60 ± 23.79 112.00 ± 9.16
AST (U/L) 147.20 ± 19.77 197.40 ± 55.15 84.33 ± 33.93
ALT (U/L) 78.40 ± 8.13 77.00 ± 13.75 64.00 ± 9.60
Triglicerídeos (mg/dL) 155.20 ± 37.10 127.2 ± 22.76 125.66 ± 49.68
AST: aspartato aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina. O grupo controle
(E4G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados receberam ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874
mg/kg (E2G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados pelos
índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado ANOVA, seguido do teste de
Tukey.
Os valores de referência hematológicos e bioquímicos em ratos não-tratados são dados

de grande valor como ponto de partida para diversos estudos, tais como as avaliações de
efeitos farmacológicos e toxicológicos sobre estes parâmetros (MELO et al. 2012). A
princípio, os valores descritos por Giknis e Clifford (2008), provenientes do Laboratório
Charles River, localizado em Montreal, Canadá, foram adotados como refência por utilizarem
ratas Wistar com idade acima de 17 semanas. Bilirrubina total (0.07 – 0.21 mg/dL),
Bilirrubina direta (0.03 – 0.07 mg/dL), colesterol total (23-97 ml/dL), creatinina (0.3 - 0.6
mg/dL), fosfatase alcalina (18-62 U/L), glicose (89 -163 mg/dL), AST (64 – 222 U/L), ALT
(14 – 64 U/L), triglicerídeos 39 - 130 (16-175 mg/dL) e Uréia (11.7 – 25 mg/dL)
235
No entanto, apesar da idade das ratas na referência de Giknis e Clifford (2008) estarem
em maior conformidade com este estudo, os valores de referência adotados por Melo et al.
(2012) também foram considerados por serem provenientes do biotério central de Sergipe,
Brasil, no entanto eram ratas mais jovens, com até 12 semanas de idade. Bilirrubina total
(0,07 – 0,09 mg/dL), Bilirrubina direta (0,01 – 0,03 mg/dL), colesterol total (46 – 101 ml/dL),
creatinina (0,4 - 0,7 mg/dL), fosfatase alcalina (63 – 138 U/L), glicose (61 – 147 mg/dL),
AST (83 – 184 U/L), ALT (26 – 60 U/L), triglicerídeos (39 – 130 mg/dL) e Uréia (30 – 57
mg/dL).
Os valores de bilirrubina total, fosfatase alcalina, ALT e uréia estiveram acima dos
valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008). Além dos parâmetros anteriormente
Bilirrubina direta, AST (E4G2) e triglicerídeos apresentaram valores médios elevados (MELO
et al. 2012). Segundo Melo et al. (2012), os animais experimentais não se comportam do
mesmo modo nas condições a que estão submetidos nos diferentes países onde são mantidos
em cativeiro, sendo também influenciados por vários fatores ecológicos característicos de
cada latitude geográfica do planeta.
O valor médio da creatinina no grupo E4G3, além de estatisticamente significativo,

esteve acima dos valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012).
Análise desse parâmetro bioquímico auxilia na avaliação sobre os potenciais efeitos do
ORCD sobre a filtração glomerular. Assim o aumento das concentrações séricas sugere uma
diminuição da função renal, todavia a creatinina é relativamente insensível aos índices de
filtração glomerular, sendo necessária uma diminuição de 50 – 70% da mesma para que se
note um aumento da creatinina no soro. O aumento deste metabólito no soro não reflete
necessariamente uma lesão renal induzida por um composto químico, mas podem ser
secundários a desidratação, hipovalemia ou catabolismo de proteínas. No presente estudo, a
hipótese de desidratação pode ser descartada, pois não houve diferença quanto à ingestão
hídrica neste grupo.
A uréia no E4G3 apresentou valores elevados, embora sem diferença estatística, os
valores de todos médios em todos os grupos (E4G1, E4G2 e E4G3) estiveram acima dos
valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012). A diminuição da
filtração glomerular, de forma geral, leva ao aumento das concentrações plasmáticas de
creatinina e uréia. Em ratos, níveis plasmáticos alterados para uréia não são bons indicadores
de lesão renal, mas alterações na creatinina podem ser um indicador confiável para avaliar a
236
presença da lesão, pois seu nível sérico não é influenciado pela dieta, idade ou sexo (MOTA,
2003).
Uma alteração significativa nos níveis de uréia sérica poderia ser interpretada como
uma alteração renal, porém os valores observados em todos os grupos estaão alterados, fora
do padrão considerado para a espécie (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012;
SILVA et al. 2005). Alterações da função hepática podem ser detectadas por pela dosagem
sérica de AST e ALT. Essas enzimas estão presentes em altas concentrações no músculo,
fígado e cérebro, e a elevação da sua atividade no sangue pode indicar necrose ou moléstia
especialmente nesses tecidos (MESSIAS et al., 2009).
A análise dos parâmetros hematológicos das ratas lactantes revelou diferenças,

estatísticas significativas, entre os grupos controle E4G1 e tratados E4G2 e E4G3. O ORCD
foi capaz de alterar os valores médios da hemoglobina (15.44 ± 0.29 e 15.96 ± 0.76) e do
hematócrito (48.02 ± 0.84 e 51.06 ± 2.21) nas duas doses administradas, 366,89 mg/kg e 1874
mg/kg, respectivamente. Assim, o ORCD, nas doses administradas melhoraram a função
dessas células. Alterações no volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular
média (HCM) e volume de plaquetas foi observado no grupo que recebeu 366,89 mg/kg de
ORCD (E4G2). No grupo E4G3 as alterações observadas foram: o volume de plaquetas,
plaquetócrito, amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho (MPV) e volume
plaquetário médio (MPV). Diferenças estatísticas importantes foram encontradas entre grupos
tratados, E4G2 e E4G3, respectivamente, no VCM (61.8± 0.86 e 57.00 ± 1.52), HCM (19.9 ±
0.3 e 17.80 ± 0.61), plaquetas (873.4 ± 43.94 e 1093.66 ± 56.13), amplitude de distribuição
das plaquetas com base no tamanho (PDW) (9.66 ± 0.39 e 7.8 ± 0.20) e plaquetócrito (554.2
± 26.67 e 654 ± 30.56) (Tabela 8).
O hemograma é um exame importante que indica o estado fisiológico e patológico dos

homens e animais. A ingestão de substâncias tóxicas, inclusive plantas e outros produtos
naturais, podem alterar as das células sanguíneas (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008).
Baixas concentrações de hemoglobina, hemácias e hematócrito podem indicar anemia,
hemorragia recente ou retenção de líquido, causado hemodiluição (ODUOLA et al., 2007). Já
uma contagem diminuída de plaquetas (trombocitopenia) pode resultar de uma série de
situações patológicas, como a destruição aumentada dessas células, devido ao uso de certas
drogas, a desordens imunes, a coagulação vascular disseminada e até lesões mecânicas. Os
leucócitos são as principais células sanguíneas envolvidas na resposta inflamatória, embora
237
plaquetas e eritrócitos também participem. Os leucócitos são classificados em neutrófilos

(40%-75%), linfócitos (20%-50%), monócitos (2%-10%), eosinófilos (1%-6%) e basófilos
(<1%). Destes, os neutrófilos são os mais importantes na patogênese da inflamação. São as
células predominantes nas primeiras 6 a 24 horas nas inflamações agudas (GOURLAY;
ASIMAKOPOULOS; TAYLOR, 2002).
Tabela 8. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros hematológicos de ratas
Grupos E4G1 E4G2 E4G3
Hm (x106/mm3) 7.09 ± 0.37 7.76 ± 0.06 7.96 ± 1.01
a
Hb (g/dL) 12.42 ± 0.69 15.44 ± 0.29 15.96 ± 0.76 a
Ht (%) 39.34 ± 2.08 48.02 ± 0.84a 51.06 ± 2.21a
VCM (fl) 55.72 ± 0.56 61.8± 0.86a 57.00 ± 1.52b
HCM (pg) 17.52 ± 0.35 19.9 ± 0.3a 17.80 ± 0.61b
CHCM (g/dL) 31.59 ± 0.39 32.18 ± 0.30 31.26 ± 0.12
RDW (%) 16.4 ± 0.18 16.9 ± 0.49 17.6 ± 0.55
3 3
Leucócitos (x10 /mm ) 4.46 ± 0.96 8.42 ± 0.63 7.46 ± 3.48
Linfócitos (%) 85.4 ± 3.40 84.7 ± 4.98 75.23 ± 2.19
Monócitos (%) 9.22 ± 3.29 11.36 ± 3.05 18.6 ± 2.30
Granulócitos (%) 5.38± 2.55 3.94 ± 2.13 6.16 ± 0.31
Plaquetas (x103/mm3) 604.6 ± 55.18 873.4 ± 43.94a 1093.66 ± 56.13a,b
MPV fL(µm3) 6.46 ± 0.14 6.34 ± 0.02 5.96 ± 0.12 a
PDW (%) 9.78 ± 0.39 9.66 ± 0.39 7.8 ± 0.20 a,b
Pct (%) 371 ± 38.48 554.2 ± 26.67a 654 ± 30.56a
Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina
Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, RDW: Distribuição do diâmetro
dos eritrócitos, Pct: plaquetócrito, PDW: amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho e MPV:
volume plaquetário médio. O grupo controle (E4G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados
receberam ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e
resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2).
Foi aplicado ANOVA, seguido do teste de Tukey.
O valores de referência usados neste estudo foram, MPV (6.4-9.5 fL(µm3)), plaquetas
(599-1144 x103/mm3 ), RDW (10,6-14,6 %), CHCM (33,2- 37,8 g/dL), CHM (17,6-20,3 pg),
hematócrito (38,5 – 49,2 %), hemoglobina (13,7 -17,2 g/dL), hemácias (7,16- 9,24
x106/mm3), leucócitos (0,96-7,88 x103/mm3), VCM (50,3- 57 fl), linfócitos (48,9-88,11 %) e
238
monócitos (1- 3,6%) (GIKNIS; CLIFFORD, 2008). De maneira semelhantes aos parâmetros
bioquímicos, levou-se em considerações outros valores de referência, MPV (6,8 – 8,0
fL(µm3)), plaquetas (757 – 1476 x103/mm3 ), RDW (12,7 – 18,2 %), CHCM (29,9 – 34,9
g/dL), CHM (16,6 – 18,9 pg), hematócrito (39,1 – 48,5 %), hemoglobina (13,2 – 15,1 g/dL),
hemácias (7,3 – 8,64 x106/mm3), leucócitos (4,7 – 12,98 x103/mm3), VCM (49,1 – 62,5 fl),
linfócitos (57,9 – 90,0 %) e monócitos (0,6 – 7,9 %) (MELO et al. 2012)
O estudo hematológico demonstrou que o valor médio da hemoglobina foi menor no
grupo controle (E4G1), inclusive com diferença estatística. A hemoglobina baixa no sangue
indica presença de anemia e pode ser causada por perda de sangue, falta de vitaminas ou
destruição dos glóbulos vermelhos. O hematócrito avalia a percentagem das hemácias no
volume total de sangue (ODUOLA et al., 2007). No grupo E4G1, o hematócrito (39.34 ±
2.08), embora estatisticamente significativo dos demais grupos, esteve dentro dos intervalos
de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012). O hematócrito, hemoglobina
e contagem de eritrócitos são usados para avaliar o grau de anemia (ODUOLA et al., 2007).
Os índices hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) determinam se os eritrócitos são,
em média, normocíticos, macrocíticos, microcíticos ou se são hipocrômicos. A avaliação
destes parâmetros no presente estudo revela que, embora estatisticamente diferente do grupo
controle, estes estiveram dos limites de normalidade (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et
al. 2012).
3.2.1.5 Análise histopatológica das lactantes E4
Não foi encontrada diferença estatística no peso dos órgãos de ratas lactantes tratadas
com ORCD nas doses de 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3) em relação ao grupo
controle (E4G1). O peso do coração do grupo E4G3 (0.86 ± 0.10) diferiu (p<0,05) do grupo
E4G2 (1.11 ± 0.04). Com relação ao peso das lactantes no 19º dpn, houve difereças
estatísticas significativas em relação aos grupos controle e grupos tratados com ORCD
(Tabela 9).
A análise do peso corpóreo avalia os possíveis efeitos tóxicos no organismo como um
todo. No entanto, o peso dos órgãos e suas observações macro e microscópicas são utilizadas
para avaliar efeitos tóxicos específicos em algum sistema ou órgão específico (MANSON;
KANG, 1994). A avaliação das massas absolutas dos órgãos não reprodutivos é importante,
pois o fígado e os rins são responsáveis pelo metabolismo e eliminação de substâncias e, em
239
casos de intoxicação, podem ter a massa aumentada ou diminuída (MELLO, 2007). Neste
estudo, a análise macroscópica dos órgãos (fígado e rins) demonstrou pouca variação de
tamanho e de cor entre as peças examinadas, apresentamdo-se com formato e volumes
habituais, superfície externa lisa, brilhante, sem macro ou micronodulações, até mesmo na
superfície de corte.
De maneira semelhante, Sachetti et al. (2009) também não encontraram alterações
macroscópicas de diversos órgãos analisados macroscopicamente (pulmões, traquéia, coração,
estômago, fígado, baço, e rins) após 14 dias de tratamento com óleresina de C. reticulata em
ratas prenhas.
Tabela 9. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os órgãos de ratas tratadas no período de
lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3
Baço 0.65 ± 0.03 0.70 ± 0.04 0.51 ± 0.05
Coração 0.96 ± 0.03 1.11 ± 0.04 0.86 ± 0.10b
Fígado 14.04 ± 2.18 11.33 ± 0.94 10.40 ± 0.93
Pulmão 1.34 ± 0.08 1.49± 0.03 1.26 ± 0.02
Rins 1.96 ± 0.07 1.99 ± 0.11 1.77 ± 0.12
Peso das lactantes (dpn19) 297.40 ± 6.00 293.40± 10.41 224.00 ± 6.11a,b
(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são
representados pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado ANOVA,
seguido do teste de Tukey.
O exame histopatológico dos rins de todos os animais, tanto do grupo controle (E4G1)
como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram integridade tecidual, conforme demonstrado
nas figuras 10, 11 e 12. Em contraste, análise do corte histológico do fígado demonstrou
algumas alterações importantes, como microvacuolizações, contudo, este achado não esteve
associado ao ORCD, pois o fígado de ratas do grupo contole (E4G1) também apresentarm
essas alterações no citoplasma do hepatócito (Figura 13). No entanto, um fígado do E4G2
(366,89 mg/kg) apresentou microvacuolização intensa, com presença de colestase extra-
hepática (Figura 14), tendo sido observada necrose focal (1 foco) em região centrolobular
com afluxo de elementos inflamatórios (Figura 15).
240
Figura 10. Aspecto microscópico de rin (corte longitudinal) de rata lactante que recebeu água
destilada (5mL) do dpn 13 - dpn 19 (E4G1). A. Região cortical - glomérulos renais e cápsulas
Bawman, sem alteração tecidual e túbulos contorcidos proximais íntegros. B. Região cortical - células
sem alterações citoplasmáticas e nucleares (ponta da seta). C. Região glomerular, sem alterações
tecidual (HE, 20x).
241
Figura 11. Aspecto microscópico de rin (corte transversal) de rata lactante que recebeu ORCD
(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região cortical – ducto coletor cortical evidenciando
núcleos e citoplasmas íntegros (ponta da seta) B. Região cortical evidenciando glomérulo e capsula de
Bowman sem alteração tecidual (ponta da seta) (HE, 40x).
242
Figura 12. Aspecto microscópico de rin de rata lactante que recebeu ORCD (1874 mg/kg) do dpn 13
- dpn 19 (E4G3). A. Região cortical com ductos proximais evidenciando a presença de células
cubóides simples íntegras com núcleos e citoplasma íntegros (ponta da seta - HE, 40x). B. Região
medular – ductos longitudinais com células íntegras (ponta da seta - HE, 20x). C. Presença de dois
glomérulos integros e capsula bawman sem alterações (ponta da seta - HE, 20x).
243
Figura 13. Aspecto microscópico do fígado de rata lactante que recebeu ORCD (366,89 mg/kg) do
dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Hepatócitos normais sem grandes alterações celulares (ponta da seta) (HE,
20x). B. Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa (ponta da seta) (HE, 20x). C.
Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa (HE, 40x).
244
dpn 13 - dpn 19 (E4G2). Colestase extra-hepática (ponta da seta - HE, 20x).
O betahidroxibutirato é um corpo cetônico e a produção destes metabólitos acentua-se

na fase final da gestação devido à diminuição consumo de alimentos (HARMEYER;
SCHULUMBOHM, 2006). Desta forma, a colestase hepática detectada somente em uma rata
do grupo E4G2, tratado com a menor dose (366,89 mg/kg) pode ser pontual, pois não foi
observado efeito da dose e número significativo de animais afetados.
Por outro lado, sabe-se que óleoresinas de Copaifera spp. são ricas em diterpenos que
os designa característica apolar. Esses compostos, ao serem metabolizados no fígado
aumentam atividade enzimática do citocromo P-450 (Cyp-450), ao ponto de lesar os
hepatócitos. Diterpenos do tipo neo-clerodano, transformados pelo citocromo P-450 em
metabólitos hepatotóxicos, que apresentavam subunidade epóxido desencadeou casos de
hepatite tóxica na França pelo uso de capsulas de têucrio (Teucrium chamaedrys L. –
Labiateae) (LOEPER et al., 1994). Estudos farmacológicos mostraram que os diterpenóides
furânicos (muitos estão presentes entre os clerodanos) causam apoptose dentro de 2 h em
hepatócitos de ratos (FAU et al. 1997). Assim, estudos adicionais devem ser realizados, para
melhor definir esses efeitos. podem aumentar a exposição do lactente, pela elevação dos
níveis plasmáticos e aumento do tempo em que a droga permanece na circulação (SOUZA,
2007)
245
Sachetti et al. (2011) encontraram uma discreta degeneração hidrópica, caracterizada

pelo acúmulo de água no citoplasma, em todos os grupos experimentais (controles e
Tratados), não sendo associada ao tratamento com óleoresina de C. reticulata. Esse estudo
corrobora com os nossos resultados, pois a microvacuolização citoplasmática encontrada é
decorrente da retenção hídrica (edema), que caracteriza a degeneração hidrópica
dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região centrolobular normal (ponta da seta - HE, 20x). B. Necrose focal
em região centrolobular (ponta da seta - HE, 10x).
As dosagens bioquímicas, principalmente das enzimas AST, ALT e bilirrubina, são

relevantes para investigar a função hepática. No entanro, para Borges (2001), o termo lesão
hepática deve ser usado somente após estudo histológico do fígado; a lesão será então
246
denominada de acordo com os achados histológicos. Assim, o fígado é um dos maiores órgãos
do corpo situado na cavidade abdominal que desempenha muitas e importantes funções como:
metabólicas, excretoras e secretoras, de armazenamento, de proteção, de circulação e de
coagulação sanguínea (MOTTA, 2003).
Estes achados incluem alterações, encontradas nos hepatócitos, como deposição de
gordura, pigmentação, amiloidose e degenerações. A tumefação celular é uma das principais
alterações microscópicas identificáveis após uma lesão de grau leve. Além disso, pode ocorrer
a degeneração gordurosa, que é considerada a manifestação mais importante de doença
hepática tóxica, fibrose e hiperplasia biliar (MACLACHLAN; CULLEN, 1998).
Colestase é definida como toda alteração fisiopatológica caracterizada pela diminuição
ou ausência de fluxo biliar no duodeno (ERLINGER, 1999). No final da prenhez e durante a
lactação há uma diminuição da demanda de glicose e aminoácidos e, consequentemente,
aumento o metabolismo dos lipídios. Segundo Marques e Rademarcher (1999) concentrações
plasmáticas aumentadas de ácidos graxos não insaturados e betahidroxibutirato estão
associados ao acúmulo de triglicerídeos no fígado, que aumentam a incidência de colestase no
início da lactação.
3.2.2 Toxidade aguda nos lactentes E4
3.2.2.1 Sinais clínicos de toxidade aguda E4
O único sinal clínico de toxidade aguda observada entre os lactentes foi fraqueza
(E4G3), ou seja, que as progenitoras receberam a maior dose (1874 mg/kg) de ORCD, porém
este sinal somente foi observado após o desmame em alguns animais do grupo. Segundo Hale
(2004) nos primeiros dias da lactação, os fármacos transferem-se mais facilmente para o leite
materno, pois as células alveolares são menores e o espaço intercelular torna-se mais largo. A
via pela qual o medicamento é administrado à mãe tem importância pelos níveis alcançados
no plasma materno e, posteriormente no leite humano. Dessa forma, muitos fármacos
administrados topicamente ou inalados não atingem níveis plasmáticos significativos,
possuindo níveis lácteos não mensuráveis (CHAVES; LAMOUNIER, 2004).
O leite é composto por três frações (aquosa, lipídica e protéica), sendo que os
fármacos e seus respectivos metabólitos podem estar presentes em quaisquer destas porções,
247
devido às características físico-químicas Souza et al. (2007). Conforme Anderson (2005) a

excreção dos fármacos para o leite materno depende de algumas características (peso
molecular; lipossolubilidade; capacidade de ligação às proteínas; grau de ionização; meia-vida
de eliminação; biodisponibilidade e concentração plasmática materna). Sua passagem entre o
plasma e o leite é bidirecional. No presente estudo, os sinais clínicos de toxidade observados
pode caracterizar uma evidencia, indireta, quanto a presença de metabólitos nos lactentes. No
entanto, estudo bromatológico deve ser realizado para confirmar ou descartar a presença ou
não de metabólitos no leite materno de ratas tratadas com ORCD.
3.2.2.2 Desenvolvimento ponderal dos lactentes durante a lactação (tratamento) E4
A evolução ponderal dos lactentes do grupo E4G3 foi estatisticamente diferente dos
grupos controle E4G1 e tratado (366,89 mg/kg) E4G2 entre os 7º dpn e o 19º dpn. Os valores
médios, da massa corporal, foram maiores no grupo tratado (1874 mg/kg) E4G3 e estão
representados no gráfico (Figura 16).
50
E4G1
a,b
40 E4G2
a,b E4G3
Massa (g)
30
a
20 a,b
10 a
a
0
1 7 14 19
(E4G3), sobre a massa corporal da progênie (período de lactação), de ratas lactantes tratadas no final
da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5
mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados
pelos índices a(em relação ao E2G1), b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância
248
A dieta materna durante os períodos críticos de desenvolvimento exerce um papel

importante na regulação da homeostase dos descendentes e pode trazer consequências até a
vida adulta (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). Neste estudo, apesar da diminuição do
consumo de ração, pelas lactantes ser significativo no grupo E4G3 (1874 mg/kg), no período
de tratamento (dpn 13-19), a massa corporal dos lactentes não diminui, com evolução
ponderal normal e massa corporal maior neste grupo.
3.2.2.3 Desenvolvimento ponderal dos descendentes após lactação (pós-tratamento) E4
A evolução ponderal dos filhotes após a lactação seguiu normalmente, ao usar como
parâmetro o período antecedente (lactação). Contudo, entre o dpn 59 e dpn 74 a evolução de
massa corpórea dos descendentes do E4G3 (17.84 g) foi menor (p<0,05) em relação ao grupo
E4G2 (42.36 g) (Figura 17).
250
E4G1
200 a,b b E4G2
a,b E4G3
Massa (g)
150
100
a,b
50
0
24 49 59 74
(E4G3), sobre a massa corporal da progênie (período de pós-lactação), de ratas lactantes tratadas no
final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5
mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados
pelos índices a(em relação ao E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância
Passos et al. (2001) demonstrou que filhotes de ratas lactantes submetidas à

desnutrição protéica ou energética apresentam, na vida adulta, uma alteração no
comportamento alimentar diferente em resposta ao tipo de desnutrição sofrida na lactação,
provavelmente devido à composição do leite das mães. Alguns estudos demonstraram que a
restrição protéica em ratas lactantes pode levar a alterações metabólicas e fisiológicas na prole
249
que podem ser permanentes, mesmo que o animal tenha livre acesso à ração normal após o
desmame (RAMOS et al., 1997; PASSOS et al., 2000). Estes estudos reforçam o conceito de
“imprinting metabólico” (WATERLAND; GARZA, 1999) que se traduz por uma alteração
permanente de uma determinada função, conseqüente à algum evento ocorrido em um período
crítico nos primeiros dias de vida.
3.2.2.4 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E4
O desenvolvimento geral da progênie de ratas tratadas, no período de lactação, com

ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) não apresentaram diferenças em relação ao controle
E4G1 ao analisar os seguintes parâmetros: aparecimento de penugem, erupção dos incisivos,
aparecimento de pêlos e, nos descendentes machos, descida bilateral dos testículos e
separação prepucial). O ORCD provocou diminuição do tempo de descolamento dos
pavilhões auriculares (Figura 18), abertura dos olhos (Figura 19) e abertura do canal vaginal
das descendentes fêmeas (Tabela 10).
A B
Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3)
sobre o descolamento do pavilhão auricular de lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Pavilhão auricular antes
do descolamento (B) Pavilhão auricular após descolamento (ponta da seta).
250
A B
Figura 19. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3)
sobre a abertura palpebral ocular bilateral de lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Palpebras antes da abertura
(B) Palpebras após a abertura (ponta da seta).
Tabela 10. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento geral da progênie
de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3

Descolamentos dos pavilhões auriculares
(Até o dpn 3) 64.28% 100% a 75.67% a
(Após o dpn 3) 35.71% - 24.32% a
Aparecimentos de penugem (até o dpn 5) 100% 100% 100%
Erupção dos incisivos (até o dpn 9) 100% 100% 100%
Aparecimentos de pêlos (até o dpn 8) 100% 100% 100%
Abertura dos olhos (até o dpn 14) 46.51% 78.37% a 100% a

a
(após o dpn 14) 53.49% 21.63% -
Descendentes Machos
Descida bilateral dos testículos (até o dpn 17) 100% 100% 100%
Separação prepucial completa (a partir do dpn 33) 100% 100% 100%
Descendentes Fêmeas
Abertura do canal vaginal
(dpn33 ao dpn 45) 46.67% 94.11% a
95.00% a
(dpn46 ao dpn 57) 53.33 5.89% 5.00%
a
(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste qui-quadrado. (p <
0,05).
251
O tempo normal para o início da abertura do canal vaginal se inicia no dpn 30,
contudo, nesse experimento, a abertura se deu a partir do dpn 33, tanto no experimento 3
como no experimento 4. No entato, no E4 a abertura iniciou mais cedo nos grupos tratados
(E4G2 e E4G3). Compostos antiestrogênicos podem promover um retardo no período de
abertura do canal vaginal e alterar a regularidade do ciclo estral (MARTY, CRISSMAN;
CARNEY, 1999). Semelhantemente, Muller (2007) estudou o extrato da M. citrifolia e,
apesar de encontrar toxidade no desenvolvimento pré-natal, a exposição in utero e lactação ao
extrato não provocou efeitos adversos sobre o desenvolvimento geral dos descendentes
(massa ao nascimento, período para o descolamento dos pavilhões auriculares abertura dos
olhos, aparecimento de pêlos e índice de viabilidade até o 4º dia pósnatal) dos grupos tratados
quando comparados com o grupo controle.
O ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) diminuiu, respectivamente, o dia do 1º estro
(40.92 ± 1.97 e 42.5 ±1.14). Contudo, é importante ressaltar que o ORCD, nas doses
administradas, não foi capaz de alterar o tempo de intervalos entre estros e regularidade do
ciclo (Tabela 11).
Tabela 11. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo estral, período de
15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3
Intervalos entre estros (dias) 5.5 ± 0.58 5.54 ± 0.77 6.53 ± 0.65
Dia do 1º estro (dpn) 50.78 ± 1.12 40.92 ± 1.97a 42.5 ±1.14a
Ciclo regular (n) 13.33% 5.55% 5.0%
(E4G2) e ORCD 1874 mg/kg (E4G3). As variáveis com medidas ordinais foram aplicadas ANOVA, seguido do
teste de Tukey, e variáveis com percentual foi alicado o qui-quadrado. a (p < 0,05).
A duração de cada fase do ciclo estral das descendentes fêmeas não foi alterada pela
ingestão de leite materno de lactantes exposta ao ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg). Os
valores médios de cada fase e o erro padão da média da estão representados na Tabela 12.
252
Tabela 12. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase do ciclo estral,
período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-
dpn14).
E4G1 E4G2 E4G3
Proestro 1.06 ± 0.20 0.88 ± 0.16 1.1 ± 0.19
Estro 2.33 ± 0.33 1.94 ± 0.29 2.5 ± 0.21
Metaestro 7.06 ± 0.26 7.76 ± 0.44 6.85 ± 0.40
Diestro 4.6 ± 0.48 4.41 ± 0.45 4.55 ± 0.35
(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado ANOVA, seguido do este
de Tukey. Os valores não diferiram entre si ao nível de 5% (p>0,05).
Segundo Goldman et al. (2007), durante o ciclo estral da rata, três ou mais gerações de
corpo lúteo podem estar presentes no ovário provenientes dos vários ciclos ovulatórios destes
animais. A pineal, sincronizada pelo ciclo claro/escuro, determina as mudanças periódicas na
função reprodutiva em várias espécies animais (REITER, 1993; WEAVER et al., 1993;
TEIXEIRA et al., 2002). Exposições no período de desenvolvimento a compostos capazes de
desregular o sistema endócrino podem causar efeitos imediatos por interferir com a
diferenciação normal, assim como podem provocar efeitos latentes que são revelados
posteriormente em resposta a hormônios endógenos na maturidade (SILBERGELD, FLAWS;
BROWN, 2005).
3.2.2.4.1 Avaliação da atividade motora E4
Os descendentes (E4G2 e E4G3) que receberam leite materno, de ratas lactantes

expostas ao ORCD (366,89 mg e 1874 mg/kg), entre o 13º e 19º dpn tiveram sua atividade
exploratória diminuída (p< 0,05), com valores médios e EPM, respectivamente, 118.91± 5.82
e 122.51± 4.89 em relação a E4G1 (143.71 ± 5.47) (Tabela 13).
253
Tabela 13. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da
progênie (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).
E4G1 E4G2 E4G3
Quadrantes 143.71 ± 5.47 118.91± 5.82a 122.51± 4.89a
Rearings 47.34 ± 2.01 47.62±2.64 48.48 ± 1.71
(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. a(p< 0,05). Foi aplicado ANOVA,
seguido do teste de Tukey.
O teste de campo aberto tem sido amplamente utilizado para quantificar movimentos
locomotores e de exploração dos animais de laboratório em experimentos com roedores
(EILAN, 2003). De maneira diferente ao experimento 3, o ORCD (366,89 e 1874 mg/kg),
provavelmente, diminuição da atividade motora dos lactentes expostos durante a lactação. É
importante ressaltar a diferença entre humanos e roedores em relação ao SNC. No homem
alterações no sistema nervoso central ocorrem no desenvolvimento pré-natal e em roedores
após o nascimento (SMART; DOBBING, 1974).
254
4 CONCLUSÃO
O tratamento com ORCD nas doses 366,89 mg/kg (10% da DL50) e 1874 mg/kg (50%
da DL50) no período pré-natal (desenvolvimento fetal) e pós-natal (lactação) nos permite
concluir que:
No período pré-natal (desenvolvimento fetal):
 A dose 366,89 mg/kg não provoca toxidade materna sistêmica, somente sinais
clínicos;
 A dose 1874 mg/kg provoca toxidade sistêmica materna elevada, com óbito de 100%;
 A dose 366,89 mg/kg alteraram alguns parâmetros reprodutivos (viabilidade e

desmame);
 A dose 366,89 mg/kg não altera o desenvolvimento ponderal e geral da progênie;
 A dose 366,89 mg/kg altera (diminui) o desenvolvimento sexual da fêmea;
 A dose 366,89 mg/kg altera (aumenta) a atividade motora da progênie exposta;
No período pós-natal (lactação):
 A dose 366,89 mg/kg provocou toxidade aguda com sinais clínicos;
 A dose 1874 mg/kg provoca toxidade materna sistêmica;
 A dose 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alterou os parâmetros reprodutivos;
 A dose de 1874 mg/kg elevou os níveis de creatinina no plasma, mas não causou lesão
renal;
 As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg aumentou a produção de hemácias;
 As doses de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg não causaram lesão hepática;
 As alterações nas células hepáticas foram compatíveis com a própria condição materna
(ratas puerpéricas);
 A dose de 1874 mg/kg provocou toxidade aguda nos lactentes;

255
 A dose de 1874 mg/kg aumentou a massa corporal dos filhotes;
 As doses de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg alteraram (aumento) do desenvolvimento

geral e sexual da progênie;
 A dose de 1874 mg/kg altera (diminui) a atividade motora dos lactentes;
 Necessidade de estudo bromatológico do leite e toxicocinética;

256
5 REFERÊNCIAS
ALCORN, J; MCNAMARA, J. Pharmacokinetics in the newborn. Advanced Drug Delivery

Reviews, v. 55, n. 5, p. 667-686, 2003.
AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS, Committee on drugs. The transfer of drugs and

other chemicals into human milk. Pediatrics., v. 108, p 776-89, 2001.
ANDERSON, P.O. Amamentação e uso de drogas. In: CARVALHO, M.R.; TAMEZ, R.N.
Amamentação: bases científicas. 2a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; p. 246-266,
2005.
ANDERSON, P.O.; POCHOP, L.S.; MANOGUERRA, A.S. Adverse drug reactions in

breastfed infants: Less than imagined. Clin Pediatr., v. 42, p. 325-340.
ARAUJO C., J. Estudo da eficiencia do tratamento de efluentes domesticos da cidade de

Araraquara-SP na remocao de hormonios sexuais. 84f. Dissertacao (Mestrado em Quimica
Analitica), Instituto de Quimica - Universidade de Sao Carlos, Sao Paulo, 2006.
BAIRD, D. T. Clinical uses of antiprogestogens. Journal of Society for Gynecologic

Investigation, v. 7, n.1, 2000.
BAIRD, D. T.; WEEBB, R.; CAMPBELL, B. K.; HARKNESS, L.M.; GOSDEN, R.G. Long-
term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at –
196 c. Endocrinology, v. 140, p. 462-471, 1999.
BEDRAN, J. N. The use of drugs on pregnancy and lactation. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, v.212, 1988.
BEGG, E. J.; DUFFULL, S. B.; HACKETT,L.P.; ILETT, K. F. Studying drugs in human

milk: time to unify the approach. Journal of Human Lacting, v. 18, p. 323-332, 2002.
BERNARDI, M.M. Exposição aos medicamentos durante o período perinatal. In:

Farmacologia aplicada à medicina veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p.897,
2007.
BORGES, D. R. Exames bioquímicos. In KALIL, A.N.; COELHO, J.; STRAUSS, E. Fígado

e vias biliares. São Paulo: Revinter, p. 11-16, 2001.
BRASIL. Ministério da Saúde, Secretaria de Políticas de Saúde, Área Técnica de Saúde da

Criança. Amamentação e uso de drogas. Brasília: Ministério da Saúde; 2000.

BUSCHMANN, J. Critical aspects in reproductive and developmental toxicity testing of

nvironmental chemicals. Reproductive Toxicology, v. 22, p. 157–163, 2006.
257
CASTRO V. L., CHIORATO S. H.; PINTO N. F. Relevance of developmental testing of

exposure to methamidophos during gestation to its toxicology evaluation. Toxicology
Letters, v. 118, p. 93-102, 2000.
CHAMPAGNE, F.A.; FRANCIS, D.D.; MAR, A.; MEANEY, M.J. Variations in maternal
care in the rat as a mediating influence for the effects of environment on development.
Physiology & Behavior, v. 79, p. 359-371, 2003.
CHAVES, R.G.; LAMOUNIER, J.A. Uso de medicamentos durante a lactação. Jornal de

Pediatria, v. 80, n.5, 2004.
CLAUDIO, L.; BEARER, C.F.; WALLINGA, D. Assessment on the U.S enviromental

protection agency methods for identification of hazards to developing organisms, part II: the
developing toxicity testing guideline. American Journal of industrial Medicine, v. 35, n. 6, p.
555-563, 1999.
COOPER, R.I.; GOLDMAN, J.M; VANDENBERGH, J.G. Monitoring of the estrus cycle in
the laboratory rodent by vaginal lavage. Fem Reprod Toxicol, v. 3, p. 45-56, 1993.
COSTA-SILVA, J.H; LYRA, M.M.A.; LIMA, C.R.; ARRUDA, V.M.; ARAÚJO, A.V.;
RIBEIRO, A.R.; ARRUDA, A.C.; FRAGA, M.C.C.A.; LAFAYETTE, S.S.L.;
WANDERLEY, A.G. Estudo toxicológico reprodutivo da Caropa guianensis Aublet
(Andiroba) em ratas wistar. Acta Farmacéutica Bonaerense, v.25, n.3, p.425-428, 2006.
DIMECH, G. S.; GONÇALVES, E. S.; ARAÚJO, A. V.; ARRUDA, V. M.; BARATELLA,

E. L.; WANDERLEY, A. G. Avaliação do extrato hidroalcoólico de Mentha crispa sobre a
performance reprodutiva em ratos Wistar. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n.2,
p.152-157, 2006.
EILAN, D. Open-field behavior withstands drastic changes in arena size. Behav. Brain Res.,
v.142, p.53-62, 2003.
ERLINGER, S. Cholestasis. In: SCHIFF, E.R., SORREL, M.F., MADDREY, W.C. Schiff’s
diseases of the liver. Philadelphia: Lippincott Raven Publishers,p.60729, 1999.
FAU, D.; LEKEHAL, M.; FARRELL, G.; MOREAU, A.; FELDMANN, G. ; HAOUZI, D.;
PESSAYRE, D. Diterpenoids from germander, an herbal medicine, induce apoptosis in
isolated rat hepatocytes Gastroenterol, v.133, n. 4, p.1334-1346, 1997.
FRITZ, H.; GIESE, K. Evaluation of Teratogenie Potencial of Chemicals in the Rat.

Pharmacol., v.40, n.1, p.1-28, 1990.
GIKNIS, M.; CLIFFORD, C. Clinical laboratory parameters for Crl: WI(Han) Rats.
Charles River Laboratories, 2008.
GOLDMAN JM, MURR AS, COOPER RL. The rodent estrous cycle: characterization of
vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Res B., v. 80, p. 84–97,
2007.
258
GOMES C.M.; FRANTZ, P.J.; SUANVITTO, G.L.; ANSELMO-FRANCI, J.A.; LUCION,

A.B. Neonatal handling induces anovulatory estrous cycles in rats. Brazilian Journal of
Medical and Biological Research, v.32, p.239-1249, 1999.
GOURLAY, T.; ASIMAKOPOULOS, G.; TAYLOR, K.M. Leukocyte biology and

pathogenicity in cardiac surgery and cardiology: the need for leukocyte depletion. In:
MATHEIS, G.; MORITZ, A.; SCHOLZ M, eds. Leukocyte depletion in cardiac surgery and
cardiology. Basel: Karger; p.1-12, 2002.
HALE, T.W. Drug therapy and breastfeeding: pharmacokinetcs, rick factors, and effects on
milk production. Neoreviews, v.5, n.4, p.164-172, 2004.
HANSEN, J.M.; HARRIS, C. Redox control ofteratogenesis. Reproductive toxicology, v.35,

p.165-179, 2013.
HARMEYER, J.; SCHULUMBOHM, C. Pregnancy impairs ketone body disposal in late

gestaing ewes: Implications for onset of pregnancy toxaemia. Research in veterinary
Science, v. 81, p. 254-264, 2006.
HERRERO-MERCADO, M.; WALISZEWSKI, S.M.; CABA, M.; MARTINEZ-

VALENZUELA, C.; GOMEZ ARROYO, S.; VILLALOBOS PIETRINI, R.; CANTU
MARTINEZ, P.C.; HERNANDEZ-CHALATE, F: Organochlorine pesticide gradient levels
among maternal adipose tissue, maternal blood serum and umbilical blood serum. Bull
Environ Contam Toxicol, v. 86, p. 289–293, 2011.
HOLLAND, H. C.; WELDON, E. A note on a new technique of recording ambulation in the

open field test and its validation. Acta Psychol (Amst) v. 28. p. 293-300, 1968.
HOLEMANS, K., AERTS, L., VAN ASSCHE, F.A. Lifetime consequences of abnormal fetal
pancreatic development. Journal of Physiology, v. 574, p. 11-20, 2003.
KAUFMANN, W. Developmental neurotocity, In: KRINKE, G.J.(Ed). The Handbook of

experimental animais: the laboratory rat. San Diiego: Academic Press, p. 227-249, 2000.
LAMOUNIER, J.A.; CABRAL, C.M.; OLIVEIRA, B.C.; OLIVEIRA, A.B.; JÚNIOR,

A.M.O.; SILVA, A.P.A. O uso de medicamentos em puérperas interfere nas recomendações
ao aleitamento materno? J Pediatr., v. 78, p. 57-61, 2002.
LOEPER, J.; DESCATOIRE, V.; LETTERON, P.; MOULIS, C.; DEGOTT, C.;
DANSETTE,P.; FAU, D.; PESSAYRE, D. Hepatotoxicity of germander in mice.
Gastroenterol, v. 106, p.464, 1994.
MACLACHLAN, N.J.; CULLEN, J.M. Fígado, sistema biliar e pâncreas exócrino. In:
CARLTON, W.W. & MCGAVIN M.D. (Ed.). Patologia Veterinaria Especial de Thomson. 2ª
ed. ArtMed. Porto Alegre, p.122-131, 1998.
MANSON, J.M, KANG, Y.J. Test methods for assessing female reproductive and
developmental toxicology. In: HAYES. A.W. Principles and methods of toxicology. 3.ed.
New York: Raven Press. Cap.28, p. 989-1037. 1994.
259
MARCONDES, F. K; BIANCHI, F. J; TANNO, A. P. Determination of the estrous cycle

phases of rats: some helpful considerations. Braz. J. Bio., v. 62, n. 4, p. 609-614, 2002.
MARQUEZ, A.C.; RADEMACHER, M.A. Indicadores bioquímicos sanguíneos de los

desequilíbrios energéticos em ganado lechero. In: memórias del seminário internacional em
reproducción y metabolismo de la vaca lechera. Universidad de Caldas. Facultad de Ciencias
Agropecuarias, Manizales-Co, 1999.
MARTY, M.S.; CRISSMAN, J.W.; CARNEY, E.W. Evaluation of the EDSTAC Female
Pubertal Assay in CD Rats Using 17β-Estradiol, Steroid Biosynthesis Inhibitors, and a
Thyroid Inhibitor. Toxicologycal Sciences, v.52, n.2, p.269-277, 1999.
MEDEIROS R.M.T.; GÓRNIAK S.L.; GUERRA J.L. Effects of milk from goat
fed Crotalaria spectabilis seeds on growing rats. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.36, n.2,
p.97-100, 1999
MELLO, M. Avaliação da toxicidade reprodutiva do pesticida trifenil hidróxido de

estanho (TPTH) em camundongos. 2007. 131f. Tese (Doutorado em Vigilância Sanitária).
Fundação Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, 2007.
MELO, M.G.D.; DÓRIA, G.A.A.; SERAFINI, M.R.; ARAÚJO, A.A.S. Valores de referência
Hematológicos e Bioquímicos de Ratos (Rattus novergicus linhagem Wistar) provenientes do
biotério central da Universidade Federal de Sergipe. Scientia Plena, v.8, n. 4, 2012.
MESSIAS, J.B.; CARACIOLO, M.C.M.; OLIVEIRA, I.M. et al. Avaliação dos parâmetros
hematológicos e bioquímicos de ratas no segundo terço da gestação submetidas à ação do
extrato metanólico de Cereus jamacaru D.C., Cactaceae. Rev. Bras. de Farmacogn., v.20,
p.478-483, 2010.
MOHAN, A. R.; BENNETT, P. R. Drugs acting on the pregnant uterus. Current Obstetric
& Gynaecology, v. 16, p. 174-480, 2006.
MOORE, K.L; PERSAUD, T.V.N. Embriologia Basica. Ed. Elsevier Brasil, 2008.
MOTTA, V.T. Bioquímica Clínica para o Laboratório: Princípios e Interpretações. 4.ed.

Porto Alegre: Ed. Médica Missau; São Paulo: Robe Editorial, EDUCS-Caxias do Sul, p. 241-
260, 2003.
MULLER, J.C. Toxicidade Reprodutiva da Morinda citrifolia Linn. 103f. Dissertação

(Mestrado em Farmacologia) - Centro de biológicas, Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, 2007.
NEPOMUCENO, F.;LAS CASAS, L.; PETERS, V.M; GUERRA, M.O. Desenvolvimento

embrionário em ratas tratadas com Hypericum perforatum durante o período de implantação.
Rev. bras. farmacogn., v .15, n. 3, 2005.
NETO, T.M. Aleitamento materno e infecção. Acta Pediátrica Portuguesa, v. 1, n. 37, p. 23-
26, 2006.
260
NEUBERT, D.; KAVLOCK, R.J.; MERKER, H.J.; KLEIN, J. Risck assesment of

prenatally-induced advers healh effects. Berlim: Spring Verlag, p.565, 1992.
ODUOLA, T.; ADENIYI, F. A. A.; OGUNYEMI, E. O.; BELLO, I. S.; IDOWU, T. O.;
SUBAIR, H. G. Toxicity studies on an un ripe Carica papaya aqueous extract: biochemical
and haematological effects in Wistar albino rats. Journal of Medicinal Plant Research, v. 1,
n. 1, p. 001-4, 2007.
OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Fundamentos de toxicologia. 3ª

ed. São Paulo: Atheneu, 2008.
OLSON, D. M. The role of prostaglandins in the initiation of parturition. Best Pratice &
Research Clinical & Gynaecology, v. 17, n. 5, p. 717 – 730, 2003.
MAGNA COTTINI DA FONSECA PASSOS, M.C.F.; RAMOS, C.F.; TEIXEIRA, C.V.;

MOURA, E.G. Comportamento alimentar de ratos adultos submetidos à restrição protéica
cujas mães sofreram desnutrição durante a lactação. Rev. Nutr., v. 14, 2001.
PASSOS, M.C.; RAMOS, C.F.; MOURA, E.G. Short and long term effects of malnutrition in
rats during lactation on the body weight of offspring. Nutr Res., v.20, p.1603-1612, 2000.
PIANOWSKI, L.F. Desenvolvimento farmacêutico de um produto fitoterápico. Porto,

82p. Tese de Doutorado - Universidade do Porto, 2000.
RAMOS, C.F., LIMA, A.P.S., TEIXEIRA, C.V., BRITO, P. D., MOURA, E.G. Thyroid
function in post-weaning rats, which dams were fed a low protein diet during suckling.
Brazilian Journal of Medical Biology Research, Ribeirão Preto, v.30, n.1, p.133-137, 1997.
REITER, R.J. The melatonin rhythm: both a clock and calendar. Experientia, v.49, p.654-
664, 1993.
RIBEIRO FB, MESTRINER ACD, FREITAS O, RAMOS MFS, MESTRINER JUNIOR W

2007. Estudo de toxicidade aguda da Oleoresina de copaíba e fração volátil. 15º Simpósio
internacional de iniciação científica da USP, Ribeirão Preto-SP.
ROGERS, J.M; KALVLOCK, R.J. Developmental toxicology. In: KLAASEN, C.D. (Ed)
Cassarett and Doull’s toxicology: The basic science of poisons. 6ª ed. New York: Mc Graw-
Hill, p.107-132, 2001.
SACHETTI, C. G., et al. Developmental toxicity of copaiba oil-resin (Copaifera reticulata) in

rats. Toxicol Lett, v. 196, p.187-187, 2010.
SACHETTI, C. G., et al. Developmental toxicity of copaiba tree (Copaifera reticulata Ducke,
Fabaceae) oleoresin in rat. Food and Chemical Toxicology, v. 49, n. 5, p. 1080-1085, 2011.
SILBERGELD, E. K.; FLAWS, J. A.; BROWN, K. M. Organizational and activational effects

of estrogenic endocrine disrupting chemicals. Cadernos de Saúde Pública, v. 18, n. 2, p.
495-504, 2002.
261
SILVA, E.J.R.; AGUIAR, F.J.S; GONÇALVES, E.S. et al. Evaluation of the hydroalcoholic
extract of Calendula officinalis L.on biochemical and hematological parameters in female
Wistar rats. Rev. Bras. Framacogn., v.15, p. 88-93, 2005.
SMART JL, DOBBING J. Vulnerability of developing brain and behaviour. Br Med Bull, v.
30, p. 164–168, 1974.
SMITH, M.S.; FREEMAN, M.E.; NEILL, J.D. The control of progesterone secretion during
the estrous cycle and early pseudopregnancy in the rat: prolactin, gonadotropin and steroid
levels associated with rescue of the corpus luteum of pseudopregnancy. Endocrinology, v.96,
p.219-226, 1975.
SOUZA, Altamir Benedito et al. Avaliação da farmacoterapia de púrperas em alojamento

conjunto de um hospital universitário. Infarma, v. 19, n° 9/10, p.12-16, 2007.
SOUZA, Altamir Benedito et al. Avaliação da farmacoterapia de púrperas em alojamento

conjunto de um hospital universitário. Infarma, v. 19, n° 9/10, p.12-16, 2007.
SOUZA-JÚNIOR, O.G.; GARCIA, L.G, DAMOUS, S.H. Colite induzida por acido acético e
tratada com enema de óleo-resina de copaíba. Na Fac Med Univ Fed Pernamb., v.45, p.132-
135, 2000.
TEIXEIRA, A.A.C.; SIMÕES, M.J.; EVÊNCIO NETO, J., WANDERLEYTEIXEIRA, V.

Morphologic aspects of the endometrium, in the estrus phase, of pinealectomized rats. Rev.
Chil. Anat., v.20, n.2, p.145-149, 2002.
TILSON, H. A. The role of developmental neurotoxicology studies in risk assessment.

Toxicology pathology, v.28, n.1, p.149-156, 2000.
US EPA. Guidelines for reproductive toxicity risk assessment. EPA/630/R-96/009,

Washington, 1996.
VAN ASSCHE, F.A. et al. Long-term consequences for offspring of diabetes during
pregnancy. Br. Med. Bull., 2001. v. 60, p. 173-182.
WATERLAND, R.A.; GARZA, C. Potencial mechanisms of metabolic imprinting that lead to

chronic disease. American Journal of Clinical Nutrition, Bethesda, v.69, n.2, p.179-197,
1999.
WEAVER, D.R.; STEHLE, J.H.; STOPA, E.G.; REPPERT, S.M. Melatonin receptors in
human hypothalamus and pituitary: implications for circadian and reprodutive responses to
melatonin. Clin. Endocrinol. Metab., v.76, p.295-301, 1993.
ZENICK, H.; CLEGG, E.D. Assessment of male reproductive toxicity: A risk of

assessment approach. In Principles and methods of toxicology. In: New York: Raven Press,
p. 275-309, 1989.
262
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo de produtos naturais como fonte de medicamentos é uma tarefa extremante

árdua. Pois as agências reguladoras introduzem novas exigências de forma que possam
qualificar melhor o emprego desses produtos. No que tange os recursos da biodiversidade
vegetal da região Amazônica, estes representam grande alternativa para a descoberta e
introdução de novos fármacos na terapêutica. Sendo assim, o óleoresina de C. duckei aqui
estudado, representa não somente uma alternativa, mas um patrimônio farmacêutico do povo
amazônida, pelo seu emprego centenário sobre diversas patologias regionais e de ocorrência
no território brasileiro. A eficácia desse produto já está bem estabelecida pelo seu uso
tradicional, tornando-se uma ferramenta facilitadora do processo de chegada de um novo
produto (medicamento fitoterápico) ao mercado farmacêutico. Isto porque todo medicamento
deve atender a tríade (eficácia, qualidade e segurança).
Estudo dessa magnitude, envolvendo não somente os aspectos fitoquímicos (busca
de um marcador), também os aspectos toxicológicos (subcrônico e reprodutivo) fazem parte
da tríade do medicamento, que garantem a qualidade e a segurança do medicamento,
respectivamente. Este é um estudo pioneiro e até o presente, não existem na literatura dados
sobre a toxidade reprodutiva do óleoresina de C. duckei e toxidade subcrônica do creme
vaginal contendo este óleoresina. Em geral, os resultados obtidos nas diversas análises e
experimentos foram satisfatórios e de grande relevância para que esse produto amazônida
possa chegar ao mercado.
Assim, quanto à análise fitoquímica, sugere-se a utilização da técnica de esterificação
H&L em CG-EM, utilizando-se como marcador fitoquímico/farmacológico, o β-cariofileno.
Este fato deve-se a disponibilidade comercialmente, e por ser utilizado como padrão em
diversos trabalhos de quantificação de óleoresinas de diversas espécies de Copaifera. Em
relação ao tratamento subcrônico, o óleoresina de C. duckei (320 mg/kg) não provocou
toxidade sistêmica (machos e fêmeas) pelos parâmetros avaliados (massa corporal, consumo
de água e ração, dosagens bioquímicas e hematológicas). O creme vaginal contendo
óleoresina 2,5% (28 mg/kg) e o óleoresina (i.v) (40 mg/kg) não causaram toxidade sistêmica,
sugerindo apenas ação local, sugerindo-se segurança de uso do óleoresina de C. duckei, na
vias de administração e doses empregadas.
No que tange toxidade reprodutiva, o tratamento com óleoresina de C. duckei (366,89
mg/kg - 10% da DL50) e (1874 mg/kg - 50% da DL50) no período pré-natal (pré e pós-
263
implantação) doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alteraram a performance reprodutiva
materna, no entanto a maior dose (1874 mg/Kg) foi capaz de alterar, diminuindo o número de
fetos vivos e aumentando os índices placentários. As doses administradas em ratas prenhas
(366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) não causaram embriofetotóxidade e teratogenicidade, sendo
observado apenas da dose (1874 mg/kg em relação 366,89 mg/kg) sobre a diminuição da
ossificação das falanges anteriores.
Quanto ao tratamento no período pré-natal (desenvolvimento fetal) e pós-natal
(lactação), a menor dose 366,89 mg/kg não provocou toxidade materna sistêmica, somente
sinais clínicos e alteração de alguns parâmetros reprodutivos (viabilidade e desmame), no
entanto a maior dose 1874 mg/kg provocou toxidade sistêmica materna elevada, com óbito de
100%. A dose de 366,89 mg/kg alterou alguns parâmetros reprodutivos, mas não foi capaz de
alterar o desenvolvimento ponderal e geral da progênie, no entanto diminuiu o
desenvolvimento sexual das fêmeas e aumentou a atividade motora da progênie exposta. No
período pós-natal (lactação), a dose de 1874 mg/kg provocou toxidade materna sistêmica,
elevou os níveis de creatinina no plasma, mas não foi capaz de causar lesão renal e as
alterações nas células hepáticas foram compatíveis com a própria condição materna (ratas
puerpéricas). Com relação aos parâmetros hematológicos, a duas doses aumentaram a
produção de hemácias, no entanto não alterou os parâmetros reprodutivos. As doses testadas
de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg aumentaram o desenvolvimento geral e sexual da progênie,
porém a maior (1874 mg/kg) diminuiu a atividade motora dos lactentes. Assim, sugere-se
estudos adicionais, tal como bromatológico do leite e toxicocinética para melhor definir
alguns efeitos.
Por fim, a realização deste trabalho demonstrou a complexidade que envolve o estudo
de um produto fitoterápico, já que trabalhou-se com um fitocomplexo. Além disso, de forma
pormenorizada, qualificou o uso desse produto, por via intravaginal, para infecções
ginecológicas baixas e processos inflamatórios. As doses utilizadas nos ensaios foram
elevadas, para que os possíveis efeitos tóxicos pudessem aparecer e ser avaliados (subcrônico
e reprodutivo). Assim, a partir dos resultados obtidos, podemos inferir que em doses
terapêuticas, este produto pode ser seguro, inclusive em mulheres na idade fértil, sem
comprometimento da performance reprodutiva.
Outros trabalhos poderão ser realizados, com intuito de garantir as exigências
atribuídas pela Agencia Reguladora Brasileira, ANVISA, e demonstrar e contribuir com a
valorização da biodiversidade amapaense e amazônica, no que se refere ao potencial de
264
princípios ativos existentes que necessitam ser estudados em diversos níveis, para que os
qualifiquem como matéria-prima ativa para um possível produto farmacêutico.
265
APÊNDICE

Tese Com Ficha Catalografica - Clarissa

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Tese Com Ficha Catalografica - Clarissa

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Universidade Federal do Amapá - UNIFAP

Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação

CLARISSA SILVA LIMA

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

Orientador: Prof. Tit. José Carlos Tavares

Tese (doutorado) – Fundação Universidade Federal do Amapá,

1. Copaíba. 2. Óleoresina de copaíba. 3. Creme vaginal. 4. Toxidade

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLINICO EM RATOS SUBMETIDOS

Aprovada em: 30/05/2014

Palavras-chave: óleoresina de copaíba, creme vaginal, toxidade subcrônica e reprodutiva

Keywords: copaiba oleoresin, vaginal cream, subchronic and reproductive toxicity.

CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA

Tabela 1. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei 130

CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

Figura 1. Representção esquemática dos períodos críticos do desenvolvimento nos três 54

CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

Figura 1. Cromatograma do padrão trans-cariofileno obtido em Cromatógrafo Gasoso 97

Figura 1. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 126

Figura 3. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 127

CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 1 e 2 para avaliar a toxicologia 154

CAPÍTULO 4 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 3 e 4 para avaliar a toxicologia 211

CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

Quadro 1. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano 100

CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

OECD Organization for Economic Cooperation and Development

O conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos naturais advindos da

A ausência de informações sobre os riscos associados ao uso de alguns produtos,

2.1 BIODIVERSIDADE E OS PRODUTOS NATURAIS

Os componentes da biodiversidade podem fornecer uma ampla gama de produtos de

proporcionam uma diversidade estrutural de moléculas em diferentes alvos biológicos.

2.2 ENSAIOS DE TOXIDADE NÃO CLÍNICO DE PRODUTOS NATURAIS

Assim, a investigação do potencial tóxico de plantas medicinais pode elucidar

(VALADARES, 2006; BRASIL, 2013). A toxidade subaguda está relacionada a exposição

comprovar cientificamente em animais e em seres humanos tais propriedades (FUNARI;

tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais

2.3 O USO DE MEDICAMENTOS NA GESTAÇÃO

A gestação é uma condição fisiológica na qual o metabolismo materno pode ser

potencial de desenvolvimento do indivíduo e de sua habilidade de enfrentar variadas

básicos da teratologia. Esse artigo de revisão demonstra exemplos de teratógenos que

No entanto, nas bulas de medicamentos observa-se, frequente, o conflito entre

benefício própria. Se para muitos medicamentos as informações disponíveis são escassas,

2.3.1 Embriologia humana e comparada

Segundo Almeida et al. (2000), fecundidade é a capacidade para a reprodução, ao

produto final (número de indivíduos). Na mulher, a duração máxima da fertilidade é de varia

secreta progesterona e alguma quantidade de estrogênio (STOUFFER, 2006). Se o ovócito é

No contexto da biologia do desenvolvimento, é importante a compreensão dos

2.3.2 Toxicologia reprodutiva e legislação

Toxicologia reprodutiva é um termo é recente, uma área do conhecimento

toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos”, que

estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade, à ação de agentes teratogênicos e

Figura 2. Esquema geral. Segmentos I, II e III dos estudos de toxicologia reprodutiva.

O segmento I refere-se à toxidade crônica, avaliando os efeitos sobre a fertilidade de

anomalia ou malformação dependerá da etapa em que se encontra o desenvolvimento, de

2.4 O GÊNERO COPAIFERA

As árvores de copaíba são nativas da região tropical da América Latina e também da

sem se comunicarem (CASCON, 2004). É produzido e secretado por glândulas especiais

partir do ácido mevalônico ou do metileritritol fosfato. Os esqueletos carbônicos dos

Figura 3. Formação de terpenóides via condensação de unidades de isoprenílicas derivadas de duas

No citoplasma, a rota do mevalonato (MVA) produz IPP a partir de moléculas