UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO
GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

CAROLINA OLIVETO BASTOS PEREIRA

ANÁLISE DE UM POLIMORFISMO NO GENE AURKC E A OCORRÊNCIA DE

SÍNDROME DE DOWN

NITERÓI
2018
 II

CAROLINA OLIVETO BASTOS PEREIRA

ANÁLISE DE UM POLIMORFISMO NO GENE AURKC E A OCORRÊNCIA DE

SÍNDROME DE DOWN

Trabalho de conclusão de curso apresentado

ao curso de graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel. Área: Fisiologia e Farmacologia.

Orientadora: Profª. MÁRCIA R. AMORIM DOS SANTOS

NITERÓI
2018
III
 IV

CAROLINA OLIVETO BASTOS PEREIRA

ANÁLISE DE UM POLIMORFISMO NO GENE AURKC E A OCORRÊNCIA DE

SÍNDROME DE DOWN

Trabalho de conclusão de curso apresentado

ao curso de graduação em Biomedicina da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel. Área: Fisiologia e Farmacologia.

Aprovada em 28 de Junho de 2018.

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________
Drª. Fabiana Barzotto Kohlrausch (IB/UFF)

_________________________________________________
Dr. Marcelo Aguiar Costa Lima (IB/UERJ)

_________________________________________________
Drª. Márcia Rodrigues Amorim dos Santos (IB/UFF)

_________________________________________________
Drª. Luciana Souza de Paiva - Suplente (IB/UFF)

NITERÓI
2018
 V

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuiram direta ou

indiretamente para a realização deste trabalho e com a minha formação humana e
acadêmica até aqui. Para citar alguns: minha família, que sempre me ofereceu
apoio, especialmente meus pais a quem sou grata por todos os esforços, as
oportunidades e o amor. A minhas avós pelo carinho. Aos exemplos de simplicidade
e bondade que foram minha bisavó Dina e meu avô Antônio. A minha família de
Niterói (Vicente, Tia Carmela e Vicentinho) que me acolheu tão bem durante estes
anos de faculdade como segunda casa. Ao meu melhor amigo e companheiro
durante estes quatro anos e meio, Alexander, provavelmente uma das melhores
pessoas que já pude conhecer, que esteve ao meu lado durante cada momento. Aos
amigos da faculdade e os de fora dela, por todas as alegrias vividas ao longo desses
anos. Aos amigos do laboratório, pela companhia e almoços divertidos, por vivermos
os desesperos e as felicidades a cada resultado obtido. A minha orientadora Márcia,
por ter me dado a oportunidade de entrar no laboratório e vivenciar cada vez mais
esta área fascinante que é a genética. A Joissy por ter me ensinado e ajudado a
aprender as técnicas tão pacientemente. A coordenação do curso de Biomedicina
por toda a ajuda. A comissão avaliadora por aceitar o convite. Por último mas não
menos importante: obrigada a você, leitor, por dar significado às palavras e ao
conhecimento aqui contido.
 VI

Answers

I kept my answers small and kept them near;

Big questions bruised my mind but still I let
Small answers be a bulwark to my fear.

The huge abstractions I kept from the light;

Small things I handled and caressed and loved.
I let the stars assume the whole of night.

But the big answers clamoured to be moved

Into my life. Their great audacity
Shouted to be acknowledged and believed.

Even when all small answers build up to

Protection of my spirit, still I hear
Big answers striving for their overthrow

And all the great conclusions coming near.

Elizabeth Jennings, A Way of Looking (1955)

 VII

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. IX

LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. X

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................. XI

RESUMO ............................................................................................................................. XII

ABSTRACT ........................................................................................................................ XIII

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 14

1.1 SÍNDROME DE DOWN ......................................................................................... 14

1.2 PRINCIPAIS MECANISMOS GENÉTICOS NA SÍNDROME DE DOWN ............... 15

1.2.1 Não disjunção meiótica................................................................................... 15

1.2.2 Translocação Robertsoniana .......................................................................... 17

1.2.3 Mosaicismo .................................................................................................... 17

1.3 FATORES DE RISCO ........................................................................................... 18

1.3.1 Idade materna avançada ................................................................................ 18

1.3.2 Polimorfismos em genes da via do folato........................................................ 19

1.4 PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR E A ANEUPLOIDIA ....................................... 20

1.5 AS AURORA QUINASES ...................................................................................... 20

1.5.1 Aurora quinase A ............................................................................................ 23

1.5.2 Aurora quinase B ............................................................................................ 23

1.5.3 Aurora quinase C ............................................................................................ 23

1.5.3.1 O gene AURKC .............................................................................................. 25

1.5.3.2 O polimorfismo rs758099 ................................................................................ 26

2. JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 27

3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 27

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 28

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 28

4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 29

4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO .................................................................................. 29

 VIII

4.1.1 Amostras de mães .......................................................................................... 29

4.1.1.2 Critérios de inclusão ......................................................................................... 29

4.1.1.3 Critérios de exclusão......................................................................................... 29

4.1.2 Amostras de crianças...................................................................................... 30

4.1.2.2 Critérios de inclusão ......................................................................................... 30

4.1.2.3 Critérios de exclusão......................................................................................... 30

4.1.3 Considerações éticas ..................................................................................... 30

4.2 QUANTIFICAÇÃO E DILUIÇÃO DE DNA .............................................................. 30

4.3 GENOTIPAGEM POR PCR EM TEMPO REAL (qPCR) ........................................ 31

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................ 33

5. RESULTADOS ............................................................................................................. 34

5.1 MÃES ......................................................................................................................... 34

5.1.2 Estratificação por faixa etária ....................................................................... 35

5.1.3 Análise de Aborto Espontâneo...................................................................... 37

5.2 CRIANÇAS ............................................................................................................ 39

5.3 ANÁLISE DE TRANSMISSÃO DOS ALELOS ....................................................... 41

6. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 42

7. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 47

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 48

ANEXOS.............................................................................................................................. 55

ANEXO 1: QUESTIONÁRIO PARA MÃES ....................................................................... 55

ANEXO 2: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ........................................................... 56

 IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Foto de uma criança com Síndrome de Down, indicando as características faciais
mais comumente observadas na síndrome.......................................................................... 14

Figura 2. Cariótipo de uma mulher portadora de Síndrome de Down .................................. 15

Figura 3. Mecanismos da divisão meiótica ilustrados por exemplificação com uma célula
germinativa e dois cromossomos ......................................................................................... 16

Figura 4. Isoformas das Aurora quinases A, B e C e seus resíduos e domínios .................. 21

Figura 5. Localização das proteínas AURKA, AURKB e AURKC na mitose e meiose I ....... 22

Figura 6. Rede ilustrando as principais interações da proteína AURKC com outras proteínas
em Homo sapiens. ............................................................................................................... 25

Figura 7. Localização do gene AURKC e do polimorfismo rs758099 em duas

representações do cromossomo 19. .................................................................................... 25

Figura 8. Gráficos de amplificação do PCR em tempo real para o polimorfismo rs758099 . 32

Figura 9. Gráfico de discriminação alélica de uma placa de 96 poços para o polimorfismo

rs758099.............................................................................................................................. 32
 X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo rs758099 em mães ............. 34

Tabela 2. Cálculos de associação entre genótipos para mães ............................................ 35

Tabela 3. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em mães < 40

anos..................................................................................................................................... 36

Tabela 4. Cálculos de associação entre genótipos para mães jovens (<40 anos) ............... 36

Tabela 5. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em diferentes

grupos de mães analisados quanto ao AE ........................................................................... 37

Tabela 6. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães SD AE x Não AE 38

Tabela 7. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães CT AE x Não AE 38

Tabela 8. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães CT AE x SD AE . 39

Tabela 9. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em crianças .. 40

Tabela 10. Cálculos de associação entre genótipos para crianças ...................................... 40

Tabela 11. Teste de desequilíbrio de transmissão de alelos do polimorfismo rs758099 em

mães controle e caso ........................................................................................................... 41
 XI

LISTA DE ABREVIATURAS

AE - Aborto Espontâneo

APC/C - Complexo promotor da anáfase/ciclossomo

CEP-IPPMG - Comitê de Ética em Pesquisa do IPPMG

CPC - Complexo passageiro cromossomal

CT - Grupo controle do estudo

EHW - Equilíbrio de Hardy-Weinberg

FIV – Fertilização in vitro

ICSI - Injeção intracitoplasmática de espermatozóides

IMG - Idade materna gestacional

IPPMG - Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

MCC - Complexo do checkpoint mitótico

OR - Odds Ratio ou razão de chances

PCR- Reação em Cadeia da Polimerase

qPCR - Reação em cadeia da polimerase em tempo real

RFU - Unidades relativas de fluorescência

SAC - Checkpoint de montagem do fuso (do inglês Spindle assembly checkpoint)

SD - Síndrome de Down

TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TDT - Teste de desequilíbrio de transmissão

UFF- Universidade Federal Fluminense

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro

 XII

RESUMO

A Síndrome de Down (SD) é a principal causa genética de deficiência

intelectual, sendo a aneuploidia viável mais prevalente mundialmente. A não
disjunção meiótica é responsável por aproximadamente 95% dos casos de SD,
podendo ocorrer também por outros dois mecanismos genéticos: a translocação
robertsoniana e o mosaicismo. A etiologia da não disjunção cromossômica e os
fatores moleculares que atuam neste processo ainda não foram completamente
elucidados. Contudo, existem muitos genes e proteínas que atuam na divisão celular
e que já foram associados à ocorrência de aneuploidia, infertilidade e aborto
espontâneo, cujo papel ainda não foi avaliado em relação à SD. Assim, o presente
trabalho teve como objetivo geral analisar se haveria associação entre a presença
do polimorfismo rs758099 no gene AURKC e a ocorrência de SD, em mães de
portadores e em portadores da Síndrome de Down quando comparados a grupos
controles de mães e crianças sem doenças genéticas. Para isso, utilizaram-se
amostras de DNA obtidas de bochecho de indivíduos de grupos caso e controle,
genotipadas por PCR em tempo real através do sistema de sondas TaqMan™. No
total, 333 amostras de DNA de mães (219 mães controles e 114 mães de pacientes
com Síndrome de Down) e 341 amostras de DNA de crianças (227 crianças controle
e 114 crianças com SD) foram genotipadas. No grupo de mães caso, o alelo C
apresentou frequência de 68%, enquanto o alelo T, 32%. No grupo controle a
frequência alélica foi semelhante: 67% para o alelo C e 33% para o alelo T. As
frequências genotípicas foram similares entre os grupos caso (CC = 45%, CT = 45%
e TT = 10%) e controle (CC = 45%, CT = 43% e TT = 12%). Para as crianças, a
frequência do alelo C foi de 72% no grupo caso e 68% no grupo controle, enquanto
o alelo T foi encontrado em 28% das amostras do grupo caso contra 32% do grupo
controle. As frequências genotípicas observadas foram CC = 44%, CT = 49% e TT =
7% no grupo controle, enquanto CC = 53%, CT = 39% e TT = 8% no grupo caso.
Não foi encontrada associação significativa entre o polimorfismo e a SD quando
analisados os grupos mães caso e controle (T x C: OR = 0,95, IC 95% = 0,65 - 1,41,
p = 0,83), contudo o teste de desequilíbrio de transmissão indicou que a transmissão
do alelo selvagem C estaria sendo favorecida em detrimento do alelo polimórfico T
na população controle. Este fato pode ser um indicativo de que o alelo T de alguma
maneira estaria associado a um maior número de abortos e gestações aneuplóides.
É importante a realização de mais estudos em modelos in vitro e in vivo para avaliar
a expressão destas proteínas e o o papel destes polimorfismos no ciclo celular e na
ocorrência de aneuploidias.

PALAVRAS CHAVE: Síndrome de Down, AURKC, polimorfismos, não disjunção.

 XIII

ABSTRACT

Down Syndrome (DS) is the main genetic cause of intellectual deficiency,

being the most prevalent viable aneuploidy worldwide. Meiotic non-disjunction is
responsible for approximately 95% of DS cases, which can also occur by two other
genetic mechanisms: Robertsonian translocation and mosaicism. The etiology of
chromosomal non-disjunction and the molecular factors that take part in this process
are still not completely elucidated. However, there are many known genes and
proteins that play a role in cell division and are associated to the occurrence of
aneuploidy, infertility and spontaneous abortion, whose role in DS hasn’t been yet
evaluated. Thus, this work has the main goal of analyzing whether there is an
association between the presence of a polymorphism in a cell cycle related gene and
the occurrence of DS, precisely the variant rs758099 found in the AURKC gene, in
mothers of DS children and in syndromic children when compared to control groups
of mothers and children with no genetic diseases. For this purpose, DNA extracted
from saliva samples was analyzed through Real Time PCR (qPCR) using TaqMan™
probes. 333 maternal samples were genotyped; of those, 219 were part of the control
group and 114 were mothers of a child with DS. 341 children samples were
genotyped, of which 227 came from a control group and 114 had DS. In the maternal
case group, the C allele had a frequency of 68%, while the T allele presented a
frequency of 32%. In the maternal control group allele frequencies were similar: 67%
for the C allele and 33% for the T allele. Genotypic frequencies were also similar
between the groups: in the case group, CC = 45%, CT = 45% and TT = 10%, while
in the control group, CC = 45%, CT = 43% and TT = 12%. In the children groups, a C
allele frequency of 72% in the case group versus 68% in the control group was
found, while the T allele had a frequency of 28% in the case group versus 32% in the
control group. Observed genotypic frequencies were CC = 44%, CT = 49%, TT = 7%
in the control group and CC = 53%, CT = 39%, TT = 8% in the case group. Statistical
analysis did not show any significant association between DS and the polymorphism
when both case-control child-mother groups were analyzed (T x C: OR = 0,95 [CI
95% = 0,65 - 1,41], p = 0,83). However, a transmission disequilibrium test indicated
that allele C would be favored for transmission when compared to polymorphic allele
T in the control population of this study. This could indicate that allele T can
somehow be associated to other pathogenic variants, giving rise to a higher number
of spontaneous abortion and aneuploid pregnancy. It is important to carry out further
studies in in vitro and in vivo models to evaluate the expression of these proteins and
the role of these polymorphisms in cell cycle and in the occurrence of aneuploidy.

KEYWORDS: Down syndrome, AURKC, polymorphisms, non-disjunction.

 14

1. INTRODUÇÃO

1.1 SÍNDROME DE DOWN

A Síndrome de Down (SD) é a principal causa genética de deficiência

intelectual (SHERMAN et al., 2007), sendo uma das anomalias cromossômicas mais
comuns (WEIJERMAN; WINTER, DE, 2010) e a aneuploidia mais viável em
humanos (GRIFFITHS et al., 2000). Estima-se que a prevalência mundial da
síndrome seja de 10 a cada 10.000 nascidos vivos (WEIJERMAN; WINTER, DE,
2010); no Brasil, a proporção estimada é de um sindrômico a cada 600 nascidos
vivos (BRANDÃO; FONSECA; MADI, 2012).

Além da deficiência intelectual, os indivíduos portadores da síndrome possuem

outros sinais e sintomas extremamente variáveis, sendo os mais presentes a
hipotonia, a baixa estatura e a cardiopatia congênita. Indivíduos com SD também
possuem um risco de 10 a 20% maior de desenvolver leucemia (ASIM et al., 2015) e
um risco aumentado de Alzheimer precoce (ASIM et al., 2015; ZIGMAN, 2013). Os
aspectos faciais característicos são: boca aberta com língua protrusa, prega
epicantal nas pálpebras, manchas de Brushfield circundando a íris e ponte nasal
baixa (NUSSBAUM; MCINNES; WILLARD, 2008).

Figura 1. Foto de uma criança com Síndrome de Down, indicando as características faciais mais comumente
observadas na síndrome. Modificada de <http://noahsdad.com/grandpa/>. Acesso em 25/02/2018.
 15

Essencialmente, a SD tem como causa a trissomia do cromossomo 21.

Contudo, ela pode se originar por três mecanismos genéticos principais: não
disjunção meiótica (90-95% dos casos), translocação robertsoniana (2-4%) e
mosaicismo (2-4%) Há ainda casos por trissomia parcial do 21, apesar de muito
mais raros. (NUSSBAUM; MCINNES; WILLARD, 2008; COPPEDÈ, F., 2016).

Figura 2. Cariótipo de uma mulher portadora de Síndrome de Down. Destacada em azul está a trissomia do
cromossomo 21. Disponível em <http://biotech.gsu.edu/4564/lecture3.html>. 25/02/2018.

1.2 PRINCIPAIS MECANISMOS GENÉTICOS NA SÍNDROME DE DOWN

1.2.1 Não disjunção meiótica

A meiose é um processo natural de divisão celular que ocorre unicamente em

células germinativas (diplóides), cujo objetivo é gerar gametas (haplóides). Ela
possui duas etapas de segregação cromossômica (meiose I e meiose II), que estão
divididas em subfases, dentre as quais a Anáfase se destaca pela ocorrência do
processo de disjunção dos cromossomos. A meiose I é a fase da divisão reducional,
pois nela há a redução do número de cromossomos pela metade. Durante a meiose
I ocorre também a recombinação genética ou crossing over, onde há a troca de
segmentos homólogos de DNA entre cromátides não-irmãs, produzindo uma grande
variedade genética nos gametas. Os erros nesta recombinação podem levar a
alterações na segregação cromossômica (NUSSBAUM; MCINNES; WILLARD,
2008). Até o momento a não disjunção meiótica é o único fator de risco comprovado
 16

associado à origem materna da SD, mas seus mecanismos moleculares ainda não
foram elucidados (COPPEDÈ, F., 2016).

A disjunção cromossômica é a separação dos cromossomos homólogos, que

acontece durante a Anáfase I (meiose I) e das cromátides irmãs que ocorre na
Anáfase II (da meiose II). Quando esta separação falha em qualquer destas etapas,
ocorre então a não disjunção meiótica, acarretando na produção de gametas com
um número anormal de cromossomos. Como podemos observar na Figura 3, no
processo de divisão normal da espécia humana, são gerados quatro gametas com o
total de 23 cromossomos cada. Na ocorrência de não disjunção cromossômica
durante a Meiose I, são gerados dois gametas com um cromossomo extra (podendo
originar um embrião com trissomia) e dois gametas com um cromossomo a menos
(podendo originar um embrião com monossomia). Quando há não disjunção apenas
durante a Meiose II, 50% dos gametas gerados serão normais (com 23
cromossomos) e 50% serão desbalanceados.

Assim, se ocorrer uma não disjunção meiótica envolvendo o cromossomo 21,

poderá haver a fertilização deste gameta pelo gameta normal do parceiro, levando à
formação de um indivíduo com 47 cromossomos e trissomia do cromossomo 21,
caracterizando a Síndrome de Down.

Figura 3. Mecanismos da divisão meiótica ilustrados por exemplificação com uma célula germinativa e dois
cromossomos. Imagem de autoria própria. 25/02/2018.

É importante lembrar que este evento ocorre durante a

ovogênese/espermatôgenese parental, e não no indíviduo sindrômico em si. Um
dado particularmente interessante é de que a maioria (~90%) dos casos de trissomia
 17

livre tem o erro na origem materna (a maioria durante a meiose I), enquanto os
outros 10% resultantes de erros de origem paterna ocorrem mais frequentemente
durante a meiose II (COPPEDÈ, F., 2016; OLIVER et al., 2009). Possíveis
explicações seriam de que a seleção contra números aberrantes de cromossomos
ocorre de maneira mais eficiente nos espermatozóides (DONATE et al., 2016), além
do fato de que o ovócito permanece com a meiose I interrompida durante muitos
anos até a fecundação, o que poderia comprometer sua habilidade de completá-la
corretamente (ALLEN et al., 2009). Há hipóteses que propõem um complexo efeito
intergeneracional na origem materna da não disjunção, sendo a dieta, o genótipo e o
estilo de vida da avó materna fatores que influenciariam os erros de recombinação
na meiose I materna, enquanto outros fatores ambientais, de dieta e estilo de vida
da mãe poderiam influenciar a conclusão ou origem de erros de recombinação na
meiose II (COPPEDÈ, F., 2016).

1.2.2 Translocação Robertsoniana

A translocação robertsoniana se caracteriza pela perda de braços curtos de dois

cromossomos acrocêntricos e a subsequente junção dos braços longos destes. Na
espécie humana os cromossomos acrocêntricos são os de número 13, 14, 15, 21 e
22. No que diz respeito à Síndrome de Down, usualmente há a translocação entre os
cromossomos 14 e 21 ou 21 e 22.

Um portador balanceado da translocação robertsoniana possui apenas 45

cromossomos. Somente genes codificadores de RNA ribossomal são perdidos e
estes estão presentes também em outros cromossomos acrocêntricos, portanto não
há manifestação fenotípica nestes indivíduos. Um portador balanceado de
translocação robertsoniana envolvendo o cromossomo 21 apresenta maior risco de
ter filhos portadores de SD, já que de seus gametas viáveis 1/3 possuiria tanto o
cromossomo translocado como o cromossomo 21 normal, acarretando em trissomia
parcial do 21 quando houver fecundação por um gameta normal do parceiro
(NUSSBAUM; MCINNES; WILLARD, 2008).

1.2.3 Mosaicismo

O mosaicismo acontece quando há em um mesmo indíviduo mais de uma

linhagem celular geneticamente diferente, contudo derivada de um mesmo zigoto.
 18

Ele pode ocorrer em células germinativas ou somáticas. Diferente dos mecanismos

anteriormente citados, o mosaicismo pode se originar de um evento único durante as
mitoses que acontecem na morfogênese do embrião portador de Síndrome de
Down. O embrião também pode adquirir o mosaicismo tendo herdado a trissomia a
partir da via da não disjunção na meiose em um dos gametas parentais, sendo que
durante suas próprias mitoses mecanismos que agem para corrigir esta trissomia
são acionados, de forma a gerar uma outra linhagem celular normal. Estes
mecanismos são a não disjunção mitótica ou o retardo de anáfase mitótica, onde o
cromossomo que sofre o retardo é eliminado da célula (PAPAVASSILIOU et al.,
2015).

Os indivíduos que possuem Síndrome de Down possuem um fenótipo

extremamente variável. No caso do mosaicismo, a gravidade do fenótipo já foi
correlacionada ao número de células afetadas (quanto mais células, mais grave –
contudo não necessariamente em todos os sintomas), ao período do
desenvolvimento do mosaicismo (quando ocorrer durante os estágios iniciais da
embriogênese, mais tecidos serão possivelmente afetados) e aos tecidos afetados
(dependendo do tecido, os sinais clínicos serão diferentes) (NUSSBAUM; MCINNES;
WILLARD, 2008; PAPAVASSILIOU et al., 2015).

1.3 FATORES DE RISCO

Alguns fatores de risco para a Síndrome de Down já são conhecidos e

estabelecidos na literatura, sendo eles relativos à origem materna da síndrome. Os
principais são a idade materna avançada e a presença de polimorfismos (variações
genéticas presentes com frequência maior que 1% na população em geral) em
genes da via do folato nestas mães. Outros fatores seriam a instabilidade genômica
e a ocorrência de erros na recombinação genética nas mães de indivíduos
sindrômicos. Os dados da literatura sobre fatores de risco paternos ainda são
controversos ou inconclusivos (COPPEDÈ, F., 2016).

1.3.1 Idade materna avançada

A idade materna avançada é um fator de risco comprovado. A partir dos 30 anos

de idade, o risco de ter um filho com SD aumenta de forma proporcional à idade
(COPPEDÈ, F., 2016). Contudo, ainda não foi possível explicar a complexa relação
 19

entre a idade materna avançada e os eventos moleculares que originam erros na

meiose. As principais hipóteses são de que possa ocorrer acúmulo de danos ao
DNA ou degradação de coesinas (necessárias para a separação correta dos
cromossomos) durante a permanência do ovócito na fase de prófase I; erros de
recombinação genética quando os ovócitos entram na prófase meiótica; variações
hormonais ou a incapacidade de detectar erros nos checkpoints do ciclo celular
relacionadas ao envelhecimento; ou uma combinação de eventos que ocorre em
diferentes estágios da meiose (COPPEDÈ, F., 2016; ROWSEY et al., 2013).

1.3.2 Polimorfismos em genes da via do folato

O folato é uma vitamina (também conhecida como vitamina B9) comumente

encontrada em alimentos como vegetais e frutas cítricas. Sua ingestão é essencial
para a síntese de ácidos nucleicos e a metilação correta do DNA, RNA, proteínas,
fosfolipídeos e neurotransmissores. No corpo humano ocorre o chamado
metabolismo do folato, onde a vitamina será metabolizada por diversas enzimas em
diferentes compostos que serão utilizados para a síntese de nucleotídeos ou para a
metilação (COPPEDÈ, F., 2015). A presença de polimorfismos em genes
participantes do metabolismo do folato foi relacionada ao risco da origem materna da
Síndrome de Down, onde estes polimorfismos poderiam resultar em níveis de
metilação comprometidos nas regiões peri-centroméricas do cromossomo 21,
aumentando a chance de ocorrer uma não disjunção meiótica (JAMES et al., 1999) e
também erros na recombinação genética (OLIVER et al., 2014). Os danos ao
metabolismo do folato nestas mães também podem colaborar com as modificações
epigenéticas que ocorrem durante o desenvolvimento do feto (determinando ou não
sua sobrevivência) e com o aparecimento dos sintomas associados à síndrome
(COPPEDÈ, F., 2015).

Inúmeros estudos acerca do tema surgiram nas últimas décadas e alguns

polimorfismos foram considerados como fatores independentes de risco materno,
sendo eles o MTHFR 677C>T, MTRR 66A>G e RFC1 80A>G, com algumas
diferenças de população para população possivelmente pela existência de
interações gene-gene e gene-ambiente, devendo ser levadas em conta a latitude,
pigmentação da pele e fatores nutricionais de cada população (COPPEDÈ, F., 2015;
COSTA-LIMA; AMORIM; ORIOLI, 2013).
 20

1.4 PROTEÍNAS DO CICLO CELULAR E A ANEUPLOIDIA

Atualmente, sabe-se que o controle preciso das diversas fases do ciclo celular é
feito por um maquinário molecular extremamente complexo, que envolve diferentes
tipos de proteínas atuando por meio de checkpoints (ou pontos de checagem) na
correção de possíveis erros na divisão celular (GREANEY; WEI; HOMER, 2018).
Observando com mais detalhes o processo de meiose, podemos destacar a
estrutura do cinetócoro, um complexo protéico presente nas cromátides que captura
microtúbulos de maneira não-simultânea. Para que a segregação cromossômica
ocorra corretamente, é necessário que cada cromossomo homólogo na meiose I e
cada cromátide irmã na meiose II esteja ligada a microtúbulos localizados em pólos
opostos do fuso meiótico. Contudo, a falta de simultaneidade na ação de cada
cinetócoro pode levar a erros na segregação cromossômica, caso a célula inicie a
anáfase antes de que cada par de homólogos consiga se ligar aos pólos do fuso,
levando alguns gametas a ficarem com mais ou menos cópias de um cromossomo
(não disjunção da meiose). Para prevenir este erro, existe o chamado checkpoint de
montagem do fuso (SAC), que consegue detectar a presença de um cinetócoro
desconectado, parando o progresso da meiose até que o cinetócoro consiga se
conectar ao microtúbulo do pólo oposto (SLUDER; MCCOLLUM, 2000).

A maquinaria do SAC conta com a atuação de várias proteínas, principalmente

as das famílias Mad (Mad1, Mad2) e Bub (BubR1, Bub1, Bub3), além de outras
quinases como Mps1, Aurora B e Aurora C (MUSACCHIO, 2015). O principal efetor
do SAC é o chamado complexo do checkpoint mitótico (MCC), composto pelas
proteínas Mad2, BubR1, Bub3 e Cdc20. Sua atuação se dá no sentido de impedir a
proteólise do complexo APC/C (complexo promotor da anáfase/ciclossomo), que é
requerida para iniciar a anáfase (GREANEY; WEI; HOMER, 2018; MUSACCHIO,
2015).

1.5 AS AURORA QUINASES

As Aurora quinases são enzimas serina/treonina quinases (ou seja, que

fosforilam resíduos serina ou treonina) altamente conservadas que regulam a
segregação e o alinhamento cromossômico durante a mitose e meiose
(GOLDENSON; CRISPINO, 2015). Juntamente com CDKs (quinases dependentes
 21

de ciclina) e PLKs (polo-like quinases), as Aurora quinases coordenam processos

individuais durante a divisão celular nos checkpoints que determinam a progressão
da mitose ou meiose (CARMENA et al., 2012).

Os três tipos de Aurora quinase conhecidas em mamíferos são a Aurora A

(AURKA), Aurora B (AURKB) e Aurora C (AURKC). Elas são expressas em altos
níveis em tecidos que se dividem rapidamente, como as células hematopoiéticas
(Auroras A e B) e células germinativas (apenas Aurora C), contudo estão pouco
expressas em tecidos adultos devido à baixa taxa proliferativa. Observou-se que as
Aurora quinases estão superexpressas em vários tipos de câncer, incluindo
diferentes tipos de Leucemia (GOLDENSON; CRISPINO, 2015).

As Aurora quinases possuem dois domínios: um regulatório na porção amino

terminal e um catalítico na carboxila terminal. As três quinases possuem alta
homologia entre si, especialmente no domínio catalítico, onde a similaridade chega a
mais de 70% entre as Auroras A, B e C (FU et al., 2007). Na figura abaixo, podemos
observar as isoformas das três quinases e seus resíduos e domínios. Tanto a
Aurora-A quanto a Aurora-B possuem KEN-Boxes e DAD/A-Boxes, ambos padrões
importantes para sua degradação, enquanto a Aurora-C possui apenas D-Boxes,
que também tem papel na regulação da degradação proteica, contudo não são
requeridas para a degradação das auroras A e B (NGUYEN, H. G. et al., 2005).

Figura 4. Isoformas das Aurora quinases A, B e C e seus resíduos e domínios. Modificada de (QUARTUCCIO;
SCHINDLER, 2015). 28/05/2018.
 22

Apesar da grande homologia, as auroras apresentam locais e atuações um

pouco distintas: A e B possuem papel majoritário na mitose, enquanto a Aurora C
tem grande importância no processo de meiose. A AURKA é funcional nos pólos do
fuso mitótico, a AURKB no centrômero, córtex celular e fuso da anáfase, e a AURKC
possui localização similar à B, contudo atua na meiose e mitose durante o início do
desenvolvimento (CARMENA; RUCHAUD; EARNSHAW, 2009). Uma observação
mais precisa do papel e da localização destas proteínas pode ser vista na Figura 5 a
seguir.

Figura 5. (A) Na mitose: Prófase - AURKA concentrada nos centrossomos duplicados, AURKB mais
concentrada no núcleo. Metáfase – AURKA nos pólos do fuso, AURKB nos centrômeros. Anáfase - AURKA
 23

continua nos pólos do fuso, AURKB se concentra no meio do fuso. Fase G1 - a expressão de ambas nas
células-filhas é reduzida. (B) Na meiose I: Prófase I - AURKA se concentra em volta dos centros organizadores
dos microtúbulos, AURKC pode ser encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma; a localização de
AURKB ainda não é conhecida. Metáfase I - AURKA se localiza nos pólos do fuso, AURKB nos microtúbulos do
fuso e potencialmente cinetócoros, AURKC encontrada tanto nos pólos do fuso quanto entre os
cromossomos bivalentes. Anáfase I - AURKA e AURKC se localizam nos pólos do fuso, enquanto AURKB e um
concentrado de AURKC ficam no meio do fuso. Os ovócitos de mamíferos ficam na metáfase da meiose II até
a fertilização, onde AURKA e AURKC ficam nos pólos do fuso (havendo também um concentrado de AURKC
no centrômero) e AURKB nos microtúbulos. Modificada de (NGUYEN, A. L.; SCHINDLER, 2017). 25/02/2018.

1.5.1 Aurora quinase A

A Aurora quinase A se associa com os polos do fuso mitótico para regular a

entrada da célula na mitose, a maturação dos centrossomos e a montagem do fuso,
através de sua interação com outras proteínas auxiliares (CARMENA; RUCHAUD;
EARNSHAW, 2009). Ela atua regulando a dinâmica do fuso também na meiose
(NGUYEN, A. L.; SCHINDLER, 2017). O polimorfismo F31L no gene AURKA já foi
associado a um risco aumentado de desenvolvimento de câncer esofágico, ovariano,
de mama e de pulmão de células não pequenas (GOLDENSON; CRISPINO, 2015).
As contribuições da Aurora A para a tumorigênese podem ocorrer pelo seu
funcionamento ou expressão anormal durante a segregação cromossômica, ou pela
degradação da proteína p53 já que a Aurora A a fosforila diretamente
(GOLDENSON; CRISPINO, 2015).

1.5.2 Aurora quinase B

A Aurora quinase B atua como uma subunidade catalítica que compõe o

chamado “Complexo passageiro dos cromossomos” (CPC), sendo uma proteína
móvel durante a mitose. Algumas de suas funções são o controle da citocinese, da
bi-orientação cromossômica e da condensação das cromátides, e a detecção de
erros na ligação entre cinetócoro-microtúbulos. Sua função precisa durante a meiose
ainda é desconhecida, mas há evidência de que a AURKB está expressa durante o
processo e de que poderia regular o alinhamento dos cromossomos (GOLDENSON;
CRISPINO, 2015; NGUYEN, A. L.; SCHINDLER, 2017).

1.5.3 Aurora quinase C

A Aurora quinase C também atua como uma subunidade catalítica do CPC na

meiose, portanto é considerada como uma proteína cromossômica passageira.
 24

Durante a meiose, atua no alinhamento e condensação dos cromossomos, na

junção dos centros organizadores de microtúbulos e corrigindo erros entre a ligação
cinetócoro-microtúbulos. Sua expressão ocorre principalmente nas células
germinativas em mamíferos, alguns tecidos somáticos e células neoplásicas
(NGUYEN, A. L.; SCHINDLER, 2017). Inicialmente, altos níveis de Aurora C foram
identificados somente nos testículos, o que sugeria um papel específico da proteína
na meiose dos gametas masculinos (BERNARD et al., 1998; YAN; CAO et al., 2005).
Contudo, observou-se que ela também se encontra superexpressa em ovócitos se
comparados seus níveis àqueles em células somáticas (ASSOU et al., 2006). Mais
recentemente, observou-se que a expressão de AURKC é maior em ovócitos se
comparada ao esperma e diferenciada no que diz respeito à variantes de splicing,
levando a acreditar que as funções que seus transcritos desempenham são distintas
em cada gameta (FELLMETH et al., 2015).

A Aurora C é essencial para a fertilidade masculina humana, sendo as

mutações no gene AURKC a causa genética mais frequente de macrozoospermia,
um tipo de infertilidade causada pela presença de quase 100% dos espermatozóides
com cabeças grandes e disformes (RAY et al., 2015). No que diz respeito à
fertilidade feminina, um estudo em ovócitos de ratos fêmeas mostrou que a
inativação da Aurora C ocasiona diversos erros na meiose, como a segregação
prematura e alinhamento incorreto dos cromossomos, junção anormal entre
cinetócoro e microtúbulos e a falha da citocinese na meiose I, resultando em
ovócitos poliplóides de tamanho anormal (YANG et al., 2010).

Já foram descritas três isoformas funcionais da Aurora C produzidas por

splicing alternativo (de 309, 275 e 290 aminoácidos) e oito transcritos
documentados, destes, dois levam à degradação mediada por mutação sem sentido
(QUARTUCCIO; SCHINDLER, 2015; ZERBINO et al., 2018). Prediz-se que haja
interação da Aurora C com outras 825 proteínas, segundo a plataforma GeneCards
(RAPPAPORT et al., 2017). Na plataforma STRING observam-se pelo menos 25
interações experimentalmente confirmadas, sendo 5 destacadas como mais
importantes, aqui ilustradas na Figura 6. Estas são interações da AURKC com as
proteínas AURKB, BUB1B (componente essencial do checkpoint mitótico, que inibe
a atividade do complexo promotor da anáfase [APC/C] e monitora o cinetócoro para
atividades que dependam da proteína motora CENPE), TTK (essencial para o
 25

alinhamento cromossômico por aumentar a atividade de AURKB), MAD2L1

(componente do SAC, que previne a anáfase até que os cromossomos estejam
corretamente alinhados na placa metafásica) e INCENP (outra proteína componente
do CPC, que provavelmente age por associação com AURKB ou AURKC)
(SZKLARCZYK et al., 2015).

Figura 6. Rede ilustrando as principais interações da proteína AURKC com outras proteínas em Homo
sapiens. Modificada de <https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=catYzRisSx1h>. 28/05/2018.

1.5.3.1 O gene AURKC

O gene AURKC localiza-se no braço longo do cromossomo 19, na região

19q13.43 (Figura 7) e possui sete éxons (KENT et al., 2002; YAN; WU et al., 2005).

Figura 7. Localização do gene AURKC (corpo azul da seta/caixa vermelha) em duas representações do
cromossomo 19. Modificada de (RAMOS et al., 2014; ZERBINO et al., 2018). 28/05/2018.
 26

A alteração mais comumente encontrada na estrutura do gene AURKC é uma

mutação que está relacionada ao fenótipo da macrozoospermia. Ela consiste em
uma deleção de citosina no éxon 3 (c.144delC), que leva à parada prematura da
tradução e consequentemente à produção de uma proteína truncada cujo domínio
quinase está ausente (DIETERICH, Klaus et al., 2007). DIETERICH et al., 2009
estimaram que esta mutação pode estar presente em 1/10.000 homens, sendo que
na população norte africana a frequência estimada para heterozigotos é de 1/50
indivíduos, podendo ser a causa mais frequente de infertilidade masculina na região
noroeste africana (Magreb).

1.5.3.2 O polimorfismo rs758099

O polimorfismo rs758099 está presente no íntron 2 do gene AURKC

(19:57231966). Ele consiste na troca de uma base citosina (C) por uma base timina
(T).

A presença deste polimorfismo foi associada à doença arterial coronariana num

estudo longitudinal que analisou o genoma inteiro de 2756 indivíduos caucasianos
nos Estados Unidos (HIGGINS et al., 1996). Na literatura, foi descrito um risco
aumentado de desenvolvimento de câncer gástrico relacionado ao polimorfismo
(MESIC et al., 2016). No mesmo trabalho, foram identificados através de testes in
silico sítios putativos de reconhecimento de fatores de transcrição onde se localiza o
polimorfismo. Quando o alelo C estava presente, domínios de ligação das proteínas
NF-1, NF-Y, ENKTF- 1, XBP-1, CTF, POU2F1 e PEA3 foram identificados. Quando o
alelo T estava presente foram encontrados os domínios NF-1, NF-Y, TFII-I e GATA-1
(MESIC et al., 2016). É interessante notar que os fatores de transcrição GATA estão
ligados ao controle do desenvolvimento de diversos tecidos, coordenando a
maturação celular por meio do controle proliferativo e a sobrevivência celular de
acordo com sua ativação ou repressão. Já foram observadas aberrações estruturais
do GATA-1 na leucemia megacarioblástica aguda em pacientes com Síndrome de
Down e down-regulation de outros tipos de GATA em diversos cânceres (ZHENG;
BLOBEL, 2010).
 27

2. JUSTIFICATIVA

Apesar da Síndrome de Down ser a maior causa de origem genética de

deficiência intelectual, ainda não estão completamente esclarecidos os mecanismos
moleculares e os fatores de risco associados à sua ocorrência, especialmente no
que diz respeito à não disjunção meiótica na gametogênese parental. Assim,
justifica-se a elaboração deste trabalho, que pretende avaliar se um polimorfismo
(rs758099) em um gene relacionado ao ciclo celular (AURKC) poderia ser um fator
associado a um maior risco de não disjunção, mecanismo que origina
aproximadamente 95% de todos os casos da síndrome.

Atualmente sabe-se que variantes em genes que atuam no ciclo celular estão
associadas a ocorrência de instabilidade cromossômica, observada em tumores e
em quadros de infertilidade. As Aurora quinases são uma família de proteínas
amplamente estudadas quanto a ocorrência de tumores, e a Aurora quinase C
particularmente no que diz respeito a alterações da fertilidade e nos gametas.
Contudo, não há trabalhos conhecidos que investiguem a associação entre o gene
codificante da Aurora C (AURKC) ou o polimorfismo rs758099 e a Síndrome de
Down. Desta forma, este trabalho se propõe a contribuir para a relevante discussão
sobre os aspectos moleculares da não disjunção meiótica na SD, podendo adicionar
dados inéditos a literatura.
 28

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

 Avaliar a associação entre a presença de um polimorfismo no gene

codificante da aurora quinase C, que participa do controle do ciclo celular, e a
ocorrência de Síndrome de Down.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar a frequência do polimorfismo rs758099 em um grupo amostral de

mães de crianças com Síndrome de Down e mães controle;

 Determinar a frequência do polimorfismo rs758099 em um grupo amostral de

crianças com Síndrome de Down e crianças controle;

 Analisar se há associação entre a presença do polimorfismo rs758099 no

gene AURKC e a ocorrência de Síndrome de Down;

 Analisar se há associação entre a presença do polimorfismo rs758099 no

gene AURKC e a ocorrência de aborto espontâneo em mães caso e controle.
 29

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO

A população deste estudo consiste em mães e crianças, sendo ambas

divididas em dois subgrupos: caso (SD) ou controle (CT). As amostras de DNA
utilizadas neste projeto foram coletadas no Instituto de Puericultura e Pediatria
Martagão Gesteira (IPPMG) na Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
Solicitou-se às mães (tanto aquelas classificadas no grupo caso quanto no controle)
o preenchimento de um questionário para obtenção de dados clínicos, com
informações quanto a idade materna gestacional, ocorrência de aborto espontâneo,
uso de remédios, dentre outros (Anexo 1).

4.1.1 Amostras de mães

As amostras de DNA do grupo de mães caso provêm de mães de pacientes

portadores de Síndrome de Down atendidos nos ambulatórios de Genética Médica
do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG)/Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), enquanto as amostras de DNA de mães controle
foram coletadas de mães de crianças não portadoras da Síndrome de Down ou
outras trissomias, acompanhadas no ambulatório de pediatria do IPPMG.

4.1.1.2 Critérios de inclusão

 Mães de pacientes portadores de SD com trissomia livre do 21

acompanhados nos ambulatórios de Genética Médica da UFRJ – Grupo caso;
 Mães de pacientes sem SD, sem histórico de doenças genéticas,
acompanhados no ambulatório de Pediatria da UFRJ – Grupo controle.

4.1.1.3 Critérios de exclusão

 Mães de crianças portadoras de SD por mosaicismo ou translocação

robertsoniana;
 Mães cujos filhos possuíssem outra doença genética ou anomalia
cromossômica.
 30

4.1.2 Amostras de crianças

As amostras de DNA de crianças caso provêm de pacientes portadores de

Síndrome de Down atendidos nos ambulatórios de Genética Médica do IPPMG,
enquanto as amostras de DNA de crianças controle foram coletadas de crianças não
portadoras da Síndrome de Down ou outras trissomias, acompanhadas no
ambulatório de Pediatria do IPPMG.

4.1.2.2 Critérios de inclusão

 Crianças portadoras de SD por trissomia livre do 21 acompanhadas nos

ambulatórios de Genética Médica da UFRJ – Grupo caso;
 Crianças não-sindrômicas e sem histórico de doenças genéticas,
acompanhadas no ambulatório de Pediatria da UFRJ – Grupo controle.

4.1.2.3 Critérios de exclusão

 Crianças portadoras de SD por mosaicismo ou translocação robertsoniana;

 Crianças que possuíssem outra doença genética ou outra anomalia
cromossômica.

4.1.3 Considerações éticas

Este é um subprojeto que pertence a um projeto mais amplo de pesquisa em

Síndrome de Down, cuja realização foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do IPPMG (CEP-IPPMG), segundo documento em anexo (Anexo 2). A participação
de cada indivíduo no estudo foi voluntária e concedida pelo preenchimento e
assinatura de um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).

4.2 QUANTIFICAÇÃO E DILUIÇÃO DE DNA

Neste projeto foram utilizadas amostras de DNA previamente coletadas através

de raspado oral (swab) e/ou bochecho com soro fisiológico. Estas foram extraídas
previamente por membros do Laboratório de Genética Humana da UFF, seguindo
protocolo específico (BARBOZA et al., 2016). Para a utilização destas na
genotipagem por PCR em Tempo Real, foi necessária a quantificação de cada
amostra em espectrofotômetro (NanoVue Plus) e posterior diluição utilizando água
 31

Nuclease-Free, de forma que a concentração do DNA de cada amostra estivesse a

10ng/μl.

4.3 GENOTIPAGEM POR PCR EM TEMPO REAL (qPCR)

As amostras foram genotipadas através da técnica de qPCR, utilizando-se de mix

contendo H2O Nuclease-Free (Promega), TaqMan™ Genotyping Master Mix
(Applied Biosystems™) e a sonda TaqMan™ específica (Identificação:
C___2581008_1_, ThermoFisher Scientific), previamente validada. No sistema
TaqMan™, cada sonda alelo-específica estará marcada com uma molécula repórter
fluorescente (VIC™ ou FAM™) e um composto que bloqueia a fluorescência,
chamado de quencher. A sonda alelo-específica se ligará ao DNA quando
reconhecer sua sequência, e a DNA Polimerase irá clivar a molécula repórter,
produzindo fluorescência. Esta será detectada pelo aparelho de qPCR, que
discrimina o alelo de acordo com a fluorescência. A sonda que não pareia com o
alelo presente no DNA não se ligará corretamente, assim não ocorrerá clivagem da
molécula ou emissão de fluorescência. Se o polimorfismo específico for detectado, a
ligação da sonda ao DNA será desestabilizada, o que reduz a eficiência do
quencher. Assim, um aumento na fluorescência detectada por FAM™ ou VIC™
indicará homozigose para alelos FAM™ ou VIC™ específicos, enquanto o aumento
na fluorescência detectada por ambas indica heterozigose (SHEN; ABDULLAH;
WANG, 2009). No caso da sonda utilizada, o alelo selvagem (C) está marcado com
VIC™, enquanto o alelo mutante (T) está marcado com FAM™.

A reação de qPCR foi realizada em placas de 96 poços, sendo que cada poço
continha 5 μl de mix (1,5 μl de Master Mix, 0,18 μl de sonda e 1,32 μl de H2O) e 2 μl
de DNA a 10ng/μl. O aparelho utilizado para a ciclagem foi o termociclador CFX 96
Real-Time System (BioRad) e o protocolo de ciclagem para amplificação seguiu o
descrito no artigo de MESIC et al., 2016. Posteriormente, analisamos os gráficos de
amplificação e de discriminação alélica produzidos pelo programa CFX Manager
Software 2.1 após as reações de amplificação. Nas figuras 8 e 9 a seguir podemos
observar estes gráficos, que indicam os padrões de fluorescência e os respectivos
genótipos obtidos para o polimorfismo rs758099 ao fim do processo da qPCR.
 32

Figura 8. Gráficos de amplificação, indicando ciclos x unidades relativas de fluorescência (RFU). Em 1, há

detecção apenas de VIC, indicando um genótipo homozigoto selvagem (CC). Em 2, ocorre detecção apenas de
FAM, indicando um genótipo homozigoto recessivo (TT). Em 3, ambos os fluoróforos são identificados,
indicando um genótipo heterozigoto (CT). Imagens obtidas e editadas do programa CFX Manager Software 2.1.
28/05/2018.

Figura 9. Gráfico de discriminação alélica de uma placa de 96 poços. O eixo horizontal indica a RFU para o
alelo T (marcado com FAM), enquanto o eixo vertical indica a RFU para o alelo C (marcado com VIC). Assim,
pode-se observar os genótipos obtidos, de acordo com a legenda de cores. Imagem obtida e editada do
programa CFX Manager Software 2.1. 28/05/2018.
 33

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todas as análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 7,

e os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.
Inicialmente, as amostras foram analisadas quanto ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW), para comprovar o equilíbrio populacional e validar os grupos genotipados.
Para observar se haveria um desvio significativo das frequências alélicas e
genotípicas obtidas entre os grupos, utilizamos o teste de Chi-Quadrado (χ²) e o teste
de Fisher quando possível, sendo este escolhido pela precisão obtida no valor de p
para grupos com número amostral pequeno. Em seguida foram comparadas as
frequências genotípicas e alélicas obtidas em diferentes combinações para observar
a razão de chances (ou Odds Ratio - OR) de um determinado genótipo polimórfico
ocorrer no grupo caso em comparação ao grupo controle. O intervalo de confiança
de 95% do OR foi calculado utilizando o método de Baptista-Pike, como
recomendado pelo software.

Também foi feita uma análise de transmissão de cada alelo a partir do teste de
desequilíbrio de transmissão (TDT) (SPIELMAN; MCGINNIS; EWENS, 1993),
visando observar se haveria alguma diferença na transmissão do alelo polimórfico
quando comparado ao alelo selvagem de mães heterozigotas a seus filhos, em
ambos os grupos caso e controle.
 34

5. RESULTADOS

5.1 MÃES

Foram genotipadas no total 333 amostras de DNA de mães, sendo 219 mães
de crianças controles (Mães CT) e 114 mães de pacientes com Síndrome de Down
(Mães SD). As frequências genotípicas foram analisadas quanto ao Equilíbrio de
Hardy-Weinberg (EHW) em ambos os grupos. Não foi encontrada significância
(p<0,05) nos valores de p obtidos (Mães SD: χ²=0,35 e p=0,83; Mães CT: χ²=0,25 e
p=0,87), mostrando que as populações genotipadas se encontram em equilíbrio.

Na Tabela 1, são apresentados os valores das frequências alélicas e

genotípicas de mães SD e CT para o polimorfismo rs758099. No grupo de mães SD,
o alelo C possuiu frequência de 68%, enquanto o alelo T tinha frequência de 32%.
No grupo controle a frequência alélica foi semelhante: 67% para o alelo C e 33%
para o alelo T. As frequências genotípicas foram similares entre os grupos: para o
grupo caso, CC = 45%, CT = 45% e TT = 10%, enquanto no grupo controle, CC =
45%, CT = 43% e TT = 12%. Não houve significância estatística quando
comparadas as frequências alélicas e genotípicas dos grupos caso e controle.

Tabela 1. Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo rs758099 em mães.

rs758099 Mães SD Mães CT P-valor

Nº % Nº %

Alelos
C 104 0,68 193 0,67 0,84*
T 62 0,32 120 0,33
Genótipos
CC 52 0,45 99 0,45
CT 52 0,45 94 0,43 0,67
TT 10 0,10 26 0,12

Total 114 219

*= Calculado pelo teste de Fisher. Pelo teste de Chi-Quadrado: p = 0,83.
 35

A seguir (Tabela 2) foi calculado o valor de Odds Ratio (OR) para verificar uma
possível associação entre o alelo polimórfico da variante rs758099 e o risco
aumentado para ocorrência da SD por não disjunção meiótica. Para isto foram
utilizados diferentes modelos de comparação entre genótipos e considerou-se um
intervalo de confiança de 95% na análise (IC 95%). As comparações foram feitas
pelos testes de Fisher e Chi-Quadrado, ambos utilizando o método de Baptista-Pike
para o cálculo do intervalo de confiança. Não foram encontradas associações
estatisticamente significativas.

Tabela 2. Cálculos de associação entre genótipos para mães.

rs758099 - Mães P-valor P-valor

Comparações OR IC 95% por χ² por Fisher

TxC 0,95 0,65 - 1,41 0,83 0,84

TT x CC 0,73 0,33 - 1,57 0,44 0,55
CT x CC 1,05 0,65 - 1,69 0,83 0,90
TT x CT 0,69 0,31 - 1,49 0,37 0,43
TT x CT ou CC 0,71 0,34 - 1,51 0,38 0,45
TT ou CT x CC 0,98 0,62 - 1,56 0,94 >0,99

5.1.2 Estratificação por faixa etária

A média de idade obtida no grupo caso (34 anos) difere de maneira significativa
(p<0,0001) da média de idade obtida no grupo controle (26 anos). Considerando a
influência da idade materna gestacional (IMG) na ocorrência da não disjunção
cromossômica e buscando analisar de maneira mais abrangente a ocorrência da SD
provinda de mães jovens, estratificamos a população de forma a observar apenas os
grupos caso e controle de mães < 40 anos, idade em que o risco em ter um filho
com SD aumenta consideravelmente. Assim, a divisão deu origem a dois subgrupos:
Mães controle (CT) < 40 anos, composto por 208 amostras, e Mães caso (SD) < 40
anos, composto por 82 amostras. Cada subgrupo foi analisado para o EHW e não foi
observada significância estatística no teste de Chi-Quadrado (Mães SD <40 anos:
χ²=0,12 e p=0,93; Mães CT < 40 anos: χ² =0,20 e p=0,90).
 36

Foram calculadas as frequências alélicas e genotípicas dos subgrupos por

idade (Tabela 3). No grupo de mães caso com menos de 40 anos, a frequência
observada para o alelo C foi de 70% e para o alelo T de 30%. Já no grupo de mães
controle <40 anos, o alelo C obteve frequência de 66% e o alelo T, 34%. Não houve
significância estatística nas diferenças entre os subgrupos quando comparados
entre si.

Tabela 3. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em mães < 40 anos.

rs758099 Mães SD < 40 Mães CT < 40 P-valor

Nº % Nº %
Alelos
C 74 0,70 183 0,66 0,65*
T 41 0,30 115 0,34
Genótipos
CC 41 0,50 93 0,45
TC 33 0,40 90 0,43 0,68
TT 8 0,09 25 0,12
Total 82 208
*= Calculado pelo teste de Fisher. Pelo Chi-Quadrado: p = 0,58.

A seguir foram novamente utilizados diferentes modelos de comparações entre

alelos e genótipos dos subgrupos para verificar a razão de chances (OR) e observar
se há associações destes com a não-disjunção na Síndrome de Down. Como
observado na Tabela 4, não houve significância estatística nas combinações entre
ambos os grupos.

Tabela 4. Cálculos de associação entre genótipos para mães jovens (<40 anos).

rs758099 Mães < 40 anos P-valor P-valor

Comparações OR IC 95% por χ² por Fisher
TxC 0,88 0,56 - 1,39 0,58 0,65
TT x CC 0,72 0,31 - 1,75 0,47 0,52
CT x CC 1,20 0,70 - 2,08 0,50 0,58
TT x CT 1,14 0,49 - 2,70 0,76 0,82
TT x CT ou CC 0,79 0,36 - 1,76 0,58 0,68
TT ou CT x CC 1,23 0,73 - 2,07 0,41 0,43
 37

5.1.3 Análise de Aborto Espontâneo

Como a AURKC está associada na literatura a problemas de fertilidade,

analisamos também a ocorrência de aborto espontâneo (AE) entre os grupos de
mães e sua relação com o polimorfismo. Foram criados 4 subgrupos: mães controle
que tiveram aborto espontâneo (subgrupo Mães CT - AE, com 53 amostras) e que
não tiveram aborto (Mães CT – Não AE, com 160 amostras), e o mesmo para mães
caso, sendo os subgrupos Mães SD - AE (33 amostras) e Mães SD – Não AE (79
amostras).

Das mães caso analisadas 29,46% tiveram aborto espontâneo enquanto nas
mães controle 24,88% abortaram. As frequências alélicas e genotípicas para cada
subgrupo foram calculadas, não havendo significância estatística nas diferenças
entre os subgrupos quando comparados entre si (Tabela 5). Contudo, é interessante
observar que a diferença entre os genótipos obtidos nos dois subgrupos de mães
SD obteve p=0,07, próximo do corte de significância de p<0,05.

Tabela 5. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em diferentes grupos de mães
analisados quanto ao AE.

rs758099 Mães SD - AE Mães SD - Não AE P-valor Mães CT - AE Mães CT - Não AE P-valor

Nº % Nº % Nº % Nº %
Alelos
C 28 0,58 74 0,73 0,22* 44 0,62 143 0,67 0,58**
T 23 0,42 38 0,27 31 0,38 87 0,32
Genótipos
CC 10 0,30 41 0,52 22 0,41 73 0,45
TC 18 0,55 33 0,42 0,07 22 0,41 70 0,44 0,46
TT 5 0,15 5 0,06 9 0,17 17 0,10
Total 33 79 53 160
*= Calculado pelo teste de Fisher. Pelo Chi-Quadrado: p = 0,17
**= Calculado pelo teste de Fisher. Pelo Chi-Quadrado: p = 0,58

A seguir foram feitas comparações entre alelos e genótipos dos subgrupos

para verificar a razão de chances (OR), a fim de observar se há associações destes
com a ocorrência do aborto espontâneo e a presença ou ausência de Síndrome de
 38

Down. Como observado na Tabela 6, houve significância estatística quando o p-

valor foi obtido por χ² na comparação TT x CC entre os grupos SD AE x Não AE, o
que indicaria tendência à proteção da ocorrência de AE quando CC está presente se
comparado a TT. Contudo, pelo fato do intervalo de confiança estar entre 0,06 -
1,00, e também pelo p valor resultante do teste de Fisher (p=0,10), não é possível
afirmar que há proteção.

Tabela 6. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães SD AE x Não AE.

rs758099 – SD AE x SD Não AE P-valor P-valor

Comparações OR IC 95% por χ² por Fisher
TxC 0,63 0,32 - 1,21 0,17 0,22
TT x CC 0,24 0,06 - 1,00 0,04* 0,10
CT x CC 0,45 0,18 - 1,10 0,08 0,12
TT x CT 0,55 0,15 - 2,04 0,38 0,48
TT x CT ou CC 0,38 0,11 - 1,30 0,14 0,16
TT ou CT x CC 2,05 0,85 - 4,84 0,10 0,10
*p<0,05

Quando comparados os genótipos específicos em grupos de mães controles

(CT AE x Não AE), não foram observados valores estatisticamente significativos,
como apresentado na Tabela 7.

Tabela 7. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães CT AE x Não AE.

rs758099 – CT AE x CT Não AE P-valor P-valor

Comparações OR IC 95% por χ² por Fisher

TxC 0,86 0,50 - 1,47 0,59 0,59

TT x CC 0,57 0,23 - 1,37 0,24 0,31
CT x CC 0,96 0,49 - 1,86 0,90 >0,99
TT x CT 0,59 0,24 - 1,43 0,27 0,32
TT x CT ou CC 0,58 0,24 - 1,39 0,22 0,23
TT ou CT x CC 1,18 0,64 - 2,25 0,60 0,64

Analisamos também os grupos CT AE x SD AE quanto a estas comparações,

como ilustrado na Tabela 8. Não foi observada significância estatística.
 39

Tabela 8. Cálculos de associação entre genótipos para grupos de mães CT AE x SD AE.

rs758099 – CT AE x SD AE P-valor P-valor

Comparações OR IC 95% por χ² por Fisher

TxC 1,16 0,55 - 2,44 0,67 0,71

TT x CC 1,22 0,33 - 4,63 0,76 >0,99
CT x CC 1,80 0,69 - 4,48 0,23 0,33
TT x CT 0,67 0,20 - 2,19 0,54 0,75
TT x CT ou CC 0,87 0,29 - 2,99 0,82 >0,99
TT ou CT x CC 0,61 0,24 - 1,58 0,29 0,36

5.2 CRIANÇAS

Para que pudéssemos realizar a análise de transmissão alélica, foram

genotipadas no total 341 crianças, sendo 227 crianças controle (Crianças CT ou
grupo controle) e 114 crianças com Síndrome de Down (Crianças SD ou grupo
caso). Ambos os grupos foram analisados quanto ao EHW, não sendo encontrado
nenhum desvio estatisticamente significativo do equilíbrio (Crianças SD: χ²=0,22 e
p=0,89; Crianças CT: χ² =4,39 e p=0,11).

Foram calculadas as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo

rs758099 para ambos os grupos. A frequência do alelo C foi de 72% no grupo caso
contra 68% no grupo controle, enquanto o alelo T foi encontrado em 28% das
amostras do grupo caso contra 32% do grupo controle. Não foi observada
significância estatística se comparadas as frequências genotípicas e alélicas entre
os grupos. As frequências genotípicas observadas foram de CC = 44%, CT = 49% e
TT = 7% no grupo controle, enquanto CC = 53%, CT = 39% e TT = 8% no grupo
caso (Tabela 9).
 40

Tabela 9. Frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs758099 em crianças.

rs758099 Crianças SD Crianças CT P-valor

Nº % Nº %
Alelos
C 104 0,72 211 0,68 0,48*
T 54 0,28 128 0,32
Genótipos
CC 60 0,53 99 0,44
CT 44 0,39 112 0,49 0,17
TT 10 0,08 16 0,07

Total 114 227

*= Calculado pelo teste de Fisher. Pelo teste de Chi-Quadrado: p = 0,44.

Foram feitas comparações entre os genótipos ou alelos obtidos, como pode ser
observado na Tabela 10, a fim de observar se haveria associação destes com a
ocorrência de síndrome de Down. Não foram observadas associações
estatisticamente significativas (p<0,05).

Tabela 10. Cálculos de associação entre genótipos para crianças.

rs758099 - Crianças P-valor P-valor

por
Comparações OR IC 95% por χ²
Fisher

TxC 0,85 0,57 - 1,27 0,44 0,48

TT x CC 1,03 0,44 - 2,34 0,94 >0,99
CT x CC 0,64 0,40 - 1,02 0,07 0,07
TT x CT 1,59 0,66 - 3,69 0,28 0,35
TT x CT ou CC 1,26 0,56 - 2,82 0,57 0,66
TT ou CT x CC 0,69 0,44 - 1,09 0,11 0,13
 41

5.3 ANÁLISE DE TRANSMISSÃO DOS ALELOS

Por fim, analisamos a transmissão de cada alelo a partir do teste de

desequilíbrio de transmissão (TDT). Para isso foram consideradas apenas amostras
informativas de mães, ou seja, mães heterozigotas para o polimorfismo rs758099,
onde o alelo transmitido ao filho pode ter sua origem materna identificada, tanto por
obtenção do genótipo paterno ou por dedução a partir do genótipo da criança. Das
mães caso (Mães SD), apenas 23 amostras se mostraram informativas, enquanto
que no grupo de mães controles (Mães CT) foram consideradas 36 amostras. Como
observado na Tabela 11, a transmissão do alelo C foi de 56,5% e do alelo T 43,4%
no grupo caso, sem significância estatística. No grupo controle, a transmissão
observada do alelo C foi de 77,7% e do alelo T, 22,2%. A diferença entre estes
valores e os valores esperados mostraram significância estatística (p≤0,001), o que
indicaria que a transmissão do alelo selvagem C estaria sendo favorecida em
detrimento do alelo polimórfico T na população geral.

Tabela 11. Teste de desequilíbrio de transmissão de alelos do polimorfismo rs758099 em mães controle e
caso.

rs758099 Transmissão do alelo C Transmissão do alelo T P-valor P-valor χ2

por Teste
Observado Esperado Observado Esperado por χ2
Binomial

Mães SD 13 (56,5%) 11,5 (50%) 10 (43,4%) 11,5 (50%) 0,6776 0,5316 0,3913
Total = 23

Mães CT 28 (77,7%) 18 (50%) 8 (22,2%) 18 (50%) 0,0012* 0,0009* 11,11

Total = 36
* p<0,05
 42

6. DISCUSSÃO

As anomalias cromossômicas estão presentes em aproximadamente 50 a 60%

dos abortos espontâneos, e a maioria das aneuploidias são incompatíveis com a
vida. A síndrome de Down é a aneuploidia mais comumente encontrada em recém
nascidos vivos, porém as falhas nas proteínas que atuam na segregação dos
cromossomos, especialmente durante a meiose materna, ainda não foram
descobertas. Mutações germinativas no gene BUB1, que atua no checkpoint de
montagem do fuso (SAC), já foram associadas a erros meióticos e a ocorrência da
síndrome de aneuploidia variegada em mosaico (NATH ET AL., 2012). Portanto, a
análise de variantes nos genes que codificam proteínas atuantes do SAC poderia
contribuir para novas descobertas acerca deste tema.

Neste estudo, 674 amostras de DNA foram genotipadas para o polimorfismo

rs758099 no gene AURKC. Através das análises estatísticas realizadas e das
diferentes estratificações da amostra, podemos observar os resultados obtidos por
uma gama de aspectos distintos, desde a composição genética da população
observada até questões que afetariam diretamente a ocorrência da SD, como o
aborto espontâneo e a infertilidade.

As frequências alélicas obtidas neste estudo para o polimorfismo rs758099 em

geral seguiram a tendência de distribuição das frequências alélicas se comparadas
com as frequências obtidas pelo gnomAD de um total de 419 genomas
sequenciados na população Latina (C: 60% e T: 39%) e na população geral de
15,496 genomas (C: 68% e T: 31%) (LEK et al., 2016), corroborando a frequência
em geral obtida de 26 populações e 2504 indivíduos pelo 1000 Genomes Project -
Phase 3 (C: 63%, T: 37%) (GIBBS et al., 2015). Apesar disso, os dados aqui obtidos
são únicos no que diz respeito a uma análise de SD relacionada ao polimorfismo. De
certa maneira também podemos dizer que são únicos para a população brasileira
urbana, tendo em vista que os dados observados na literatura citada acima não
provêm do Brasil, e que os únicos dados brasileiros encontrados quanto a
frequência alélica deste polimorfismo foram vistos em populações indígenas. Estes
dados foram obtidos da plataforma ALFRED (The ALlele FREquency Database), e
indicam as frequências alélicas de 42 indivíduos da tribo Surui Paiter (C: 50%, T:
50%), que vivem na fronteira entre Rondônia e Mato Grosso, e 48 indivíduos da tribo
 43

Karitiana (C: 23%, T: 77%), que vivem em Rondônia (LI et al., 2008; RAJEEVAN et
al., 2003).

Outros dados populacionais interessantes são que em 504 indivíduos do leste

asiático, provindos de subpopulações da China, Japão e Vietnã, o alelo polimórfico é
encontrado mais frequentemente (T: 68%, C: 32%), enquanto que em 489 indivíduos
do sul asiático (Índia, Paquistão, Sri Lanka e Bangladesh) o oposto é observado (C:
63%, T: 37%). Em 661 genomas obtidos da população africana, observou-se que o
alelo C está presente com frequência de 75%, enquanto o T possui frequência de
25%. Em 503 indivíduos da população européia, o índice encontrado foi o mesmo.
Já em 347 genomas da população americana, as frequências estiveram mais
próximas da média geral (C: 64%, T: 35%) (GIBBS et al., 2015).

Foi observada diferença significativa entre a média de idades dos grupos caso
e controle em mães analisadas neste estudo, como já era esperado em uma coleta
ao acaso. Considerando a influência da idade materna na ocorrência da síndrome
de Down, a amostra foi analisada também através de um corte por idade
(considerando apenas mães <40 anos) e, assim como na análise sem corte por
idade, não observamos diferenças significativas nos resultados obtidos.

O teste de TDT indicou que a transmissão do alelo selvagem C estaria sendo

favorecida em detrimento do alelo polimórfico T na população geral do estudo. É
importante notar que variantes nos genes codificantes das aurora quinases já foram
relacionadas à infertilidade e à ocorrência de aneuploidia, a exemplo da mutação
mais comumente observada no gene AURKC (c.144delC), já abordada
anteriormente neste trabalho. KHELIFA, BEN et al. (2011) caracterizaram a variante
intrônica AURKC c.436-2A>G em dois irmãos com macrozoospermia, descobrindo
que esta levava à produção de uma proteína truncada, cujo éxon 5 estava ausente.
Em 11 tentativas de fertilização in vitro (FIV), 88 espermatozóides de aparência
normal foram selecionados para injeção intracitoplasmática de espermatozóides
(ICSI). A fertilização foi alcançada por 47 gametas, mas nenhum levou a gravidez, o
que sustenta a ideia de que estes embriões carregavam aneuploidias/euploidias
incompatíveis com a vida. DIETERICH et al., 2009, observaram em um paciente com
o fenótipo típico de macrozoospermia uma nova mutação no éxon 6 da AURKC
 44

(c.686G > A), que afeta a região quinase da proteína, levando a troca de um
aminoácido cistina por uma tirosina em uma região altamente conservada.

Seguindo esta hipótese, poderíamos especular que o polimorfismo estaria de

alguma maneira associado a outras variantes que em conjunto teriam ação deletéria,
sendo negativamente selecionado na população em geral já que seus portadores
poderiam ter menores taxas de fertilidade e consequentemente de reprodução bem
sucedida quando em combinação com outras variantes ou fatores externos. Assim,
supomos que no grupo de mães com SD esta seleção não estaria ocorrendo,
havendo um maior número de abortos e gestações aneuplóides, o que foi observado
neste trabalho (29,46% das mães caso analisadas tiveram AE contra 24,88% das
mães controle, apesar de não haver significância nesta diferença). Devemos levar
em conta que os números aqui obtidos são um pouco maiores que a média de AE
encontrada na população geral, que está em torno de 15% tanto globalmente quanto
no Brasil (CECATTI et al., 2010; QUENBY et al., 2002; NATH et al., 2012).
Esta ideia corrobora o fato de que obtemos significância estatística na comparação
TT x CC entre os grupos de mães com filhos portadores de síndrome de Down que
tiveram aborto espontâneo em comparação com as que não tiveram: o genótipo CC
conferiria “proteção” da ocorrência de aborto espontâneo enquanto o genótipo TT,
com dois alelos polimórficos, estaria mais associado à ocorrência do aborto
espontâneo. Contudo, é importante frisar que os números amostrais aqui analisados
não são grandes o suficiente para obtermos uma associação robusta
estatisticamente, sendo necessárias análises de um maior número de amostras para
que possamos observar estas associações com mais certeza. Também é válido
ressaltar que a maioria das variantes patogênicas encontradas são consideradas
raras na população em geral, portanto deletérias no que diz respeito à fertilidade e
aneuploidias.

Além disso, nem sempre as variantes ligadas ao gene AURKC são prejudiciais.
NGUYEN et al., 2017 observaram em ovócitos de dois tipos distintos de pacientes
(uma paciente com 32 anos e taxas de aneuploidia embriônica acima da média e
uma paciente com 35 anos e baixas taxas de aneuploidia embriônica) a ocorrência
de uma variante no gene da AURKC (AURKC c.235A > G) que não possuiu impacto
deletério na meiose do ovócito quando analisada em modelo animal (ovócito de
ratos), caracterizando-se então como uma variante não informativa quanto ao risco
 45

de aneuploidia. No mesmo trabalho foi encontrada uma variante no gene AURKB

que conferia ganho de função à proteína Aurora B, sendo então classificada como
benigna.

Ainda não há muitos dados disponíveis com relação ao polimorfismo aqui

estudado no que se refere às consequências da alteração intrônica, excetuando-se
aqueles apontados na análise in silico feita por MESIC et al., 2016, apresentados na
introdução deste trabalho. Outros polimorfismos intrônicos em genes participantes
do SAC como rs151658 (C>G) no gene TTK, rs1031963 (C>T) e rs1801376 (A>G)
no gene BUB1B também foram associados à instabilidade cromossômica que ocorre
no câncer gástrico (HUDLER et al., 2016), tal qual o observado no polimorfismo
rs758099 por MESIC et al., 2016.

Como abordado anteriormente, determinados polimorfismos (especialmente em

genes relacionados ao metabolismo do folato) e suas combinações podem
influenciar a ocorrência de aneuploidia, afetando também as taxas de aborto
espontâneo e fertilidade. ISOTALO; WELLS; DONNELLY, (2000) observaram que os
genótipos combinados 677CT/1298CC e 677TT/1298CC de polimorfismos no gene
MTHFR não foram encontrados em amostras sanguíneas de cordão umbilical de
neonatos se comparadas a amostras de tecido fetal, o que sugere viabilidade fetal
reduzida quando estas combinações estão presentes, demonstrando que
determinados haplótipos podem afetar a sobrevivência do feto. KIM et al. (2011)
também observaram que o polimorfismo MTHFR 1298A>C poderia ser um fator de
risco independente para AE. MCCOY et al. (2015) identificaram uma associação
entre supostas aneuploidias de origem mitótica e variantes genéticas no
cromossomo 4, mais precisamente no gene PLK4 (cuja proteína interage com a
AURKA e é essencial para a duplicação dos centríolos) ao analisarem o genoma
inteiro de embriões coletados de FIV e o DNA parental. O polimorfismo rs2305957
foi o que obteve associação mais significativa, onde o alelo polimórfico (que está
presente em diversas populações com frequências de 20-45%) conferiu uma taxa
significativamente maior de erro mitótico, e sua homozigosidade foi tida como um
preditor significativo de aneuploidia, especialmente das mais complexas (que
envolvem mais de dois cromossomos).
 46

Atualmente não se encontram na literatura trabalhos que associem as principais

proteínas atuantes do ciclo celular à síndrome de Down. Como perspectivas para
novos estudos nesta área, propomos a análise de mais polimorfismos em outros
genes que participam do checkpoint de montagem do fuso, como BUB1 e MAD2,
além dos genes codificadores das outras Aurora quinases. Uma ideia
particularmente interessante no que diz respeito à Aurora quinase C e seu
envolvimento com a infertilidade e anormalidades da gametogênese masculina seria
observar a relação de variantes que ocorrem no gene AURKC com a origem paterna
da não disjunção em SD, que também não está completamente elucidada, dada sua
ocorrência mais rara (HULTÉN et al., 2010).

Desta forma, podemos afirmar que mais estudos com maior número amostral e
com a utilização de modelos in vitro e in vivo para avaliar a expressão destas
proteínas são necessários para entendermos de maneira mais precisa o papel
destes polimorfismos e dos genes envolvidos no ciclo celular na ocorrência de
aneuploidias, especificamente na Síndrome de Down.
 47

7. CONCLUSÃO

 No grupo amostral de mães, encontramos frequências alélicas de C: 68% e T:

32% em casos e C: 67%, T: 33% em controles. As frequências genotípicas
observadas foram CC = 45%, CT = 45% e TT = 10% no grupo caso e CC =
45%, CT = 43% e TT = 12% no grupo controle.

 No grupo amostral de crianças, encontramos frequências alélicas de C: 72%

e T: 28% em casos e C: 68%, T: 32% em controles. As frequências
genotípicas observadas foram CC = 53%, CT = 39% e TT = 8% no grupo
caso e CC = 44%, CT = 49% e TT = 7% no grupo controle.

 Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre o

polimorfismo e a ocorrência de SD quando analisados os grupos caso e
controle de mães e também seus subgrupos divididos por idade materna
gestacional (IMG <40 anos).

 Não foi encontrada associação estatisticamente significativa entre o

polimorfismo e a SD quando analisados os grupos de crianças caso e
controle.

 O teste de TDT indicou que a transmissão do alelo selvagem C estaria sendo

favorecida em detrimento do alelo polimórfico T na população controle do
estudo.

 Houve significância estatística quando o p-valor foi obtido por χ² na

comparação TT x CC entre os grupos SD AE x Não AE (OR = 0,24, IC (95%)
= 0,06 - 1,00, p-valor por χ² = 0,04, p-valor por Fisher = 0,10).
 48

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 55

ANEXOS

ANEXO 1: QUESTIONÁRIO PARA MÃES

Projeto Síndrome de Down Ficha No _________ Data ____________

(controle)
Nome da Mãe: ______________________________________________ Idade:_____
Endereço _____________________________________________________________________
Tel: ______________________________
Raça mãe ( ) branca ( )parda ( ) negra ( ) indígena ( ) oriental/asiático
OBS: raça criança ________________
Local de nascimento: ( ) RJ ( ) SP ( ) ES ( ) MG
( ) outro especifique ______________________:
Nome da criança: ________________________________________ Idade:_____ DN__________
OBS: Idade materna na gestação: _________
Número de gestações: _____ AE ( ) sim ( ) não OBS: ______________________________
Houve alguma intercorrência na gestação? ( ) sim ( ) não
OBS: ______________________________________________________________
Fez pré natal? ( ) sim ( ) não ( ) SUS ( ) particular A partir de quando? ______
OBS: __________________________________________________
Você tem algum problema de saúde (ex: hipertensão, diabetes, depressão, asma, bronquite, etc)?
( ) sim ( ) não Qual? ___________________________
Você toma algum remédio regularmente? (uso contínuo)
( ) sim ( ) não Qual? ____________________________________________
Utilizou algum remédio na gestação de seu filho (a)?
( ) sim ( ) não Qual? ___________________________ Dose __________
Você fuma? ( ) sim ( ) não Quantos cigarros por dia? ____________
Você fumou durante a gestação? ( ) sim ( ) não OBS: __________________________
Costuma ingerir bebidas alcoólicas? ( ) sim ( ) não
Ingeriu na gestação? ( ) sim ( ) não
Tomou vitaminas na gestação? ( ) sim ( ) não
Sabe se algum tipo de vitamina faz bem para o bebê? ( ) sim ( ) não
Qual? ___________________
 56

ANEXO 2: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA