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•
ANTE
¥ú¥; ao ar

FAFÁ
 DNA -

molécula

cadeias lineares :

nucleotídeo

÷
' "
-

p -

<
"
resíduo de

ácido fosfórico livre CH

2

11
'
base pirimídica
-

p -

"

cha

púnica
>
base

ligação tosfodiéster -
À .

"

cha

" "
grupo hidroxilo O \
' '
3

cadeias complexas :
dupla hélice

ligação por pontes de

hidrogénio entre bases azotados

| complementaridade
c O de

bases
T A

exterior : duas cadeias açucar

-

fosfato ( backbone)
interior : bases azotados
 estruturas :

1. hélice para a direita ; + comum

2. A DNA
-

hélice para a direita ; +

compacta

3. 2- DNA
-
hélice para a
esquerda ; infeção uírica

|
t C -
G →
3 pontes de H → +
energia
→ + temperatura de
melting
Desnaturação
pontes de H
energia
A T →
+
-
→ 2 -

=
elevação da temperatura a 90°C / → -

temperatura de me/
ting
=
soluções com valores extremos ãõµ
-

soluções concentradas em foram ida ou ureia

=

soluções com baixa força iónica ( poucos iões )

nucieossoma

H Hu
z÷gg
,u_FF-F_-F€
m#¥ o
÷ :-. ÷ ÷ : : ::: : :

✗ × 3
-

.. .am
total entre cada
nucleossomas
2 × HZA -

HZB historias
= 200

modificações pós tradicionais das historias

1. anti / transferase aceitação desacetilase-desacetila.com
-
× .

V V

provoca a descoordenação da provoca a compactação da

cromatina -

transcrição ativa cromatina -

transcrição inativa

ex : sirtuinas ( t NAD
+ )

3. meti / transferiase -
meti / ação 4. desmetilase -
des meti / ação
v v

provoca a compactação da provoca a descoordenação da

cromatina -

transcrição inativa cromatina -

transcrição ativa

↳ à HPI
adquirem capacidade de se
ligar enzima

1- oligomerização -

forma complexos nucleo proteicos

à meti / tranferase Hzka

a
liga se promove a
- - -

meti / ação de outras historias

formação de hetero cromatina cadeia

=
em

5.
fosfor ilação 6 .

ubiqui tiração
 durante a replicação :

a × 11-3 / Hh > mantém -

se Unidos e dividem -
se equitativamente

'
✗ × HZA / HZB dissociam completamente

> são sintetizadas novas historias

após a
replicação :

enzimas que intervêm na formação dos nucleossomas ao trazerem

as novas historias

( nucleossome
NAP
assembty proteínas
CAF ( cromossoma assembly factor )

header
-
writer complex :
conseguem
ler as modificações nas historias

Hz / 11-4 , que são herdadas da célula -

mãe

"

transferem grupos meti / O / anti / O para que aquela região do

genoma
mantenha as características de historias idênticas à da molécula
de DNA que está a ser replicada

ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMAS DURANTE A MITOSE

fibra de 2hm ansas que se unem

s nas bases por intervenção
do SMC
-
fibra de 30hm
dentro de nvcleossomas |
de 10mm de diâmetro
>
por ziguezague condensação
e enrolamento
1
braços dos cromossomas metafísicas

= Estado máximo de

condensação da

cromatina
 REPLICAÇÃO
Ineficaz subunidades ; quebra pontes de
6 as
lig .
por H e/
gasto de ATP

""""

%í%%%%%g•""""
"

④""""nm"""""""lr
mantém
Ing EIEEDINI-dinmdingu.pro/-eins- a abertura da dupla hélice
-

condutora /
cadeia
Ieading

÷:: : : : ÷É
"

:
"

:
1111111€lÉÉÉÉ

DIE RETIREIPELE sintetiza os primos ; RNA polimerase = adiciona

ribonucleotideos

PIPELINE sintetiza nuclear de os

- -

( sintetiza Okazaki )
na cadeia
Iagging os
fragmentos de
 condutora /
cadeia
Ieading
1111111111111111111111111111111111111111-11111111111111111111111111111111111111111111111171

✗
f-t.fi#''E'. \
-

é
'

' ' '

É Fã
'
'
i
-
-
;
i

iiiiitiiiiiiiiiiiiiiiiííiíiiiiiiiiiiiiiiiíiíii
"

íÍÍiÍíÀÍ
'
" .

cadeia lenta /
Iagging

III remove degrada primos

-
e os

DE PEEL preenche os buracos

-

condutora /
cadeia
Ieading
1111111111111111111111111111111111111111-11111111111111111111111111111111111111111111111171
ÉÉÉÉÉÊÉ

;%%iííiíííúíiiííí
i-iiii-iiiiiiiiitiiiiiiiii.it:
iii
cadeia lenta /
Iagging

Dunãnigauçu
encontra o nick ,
fecha -
o e estabelece uma
ligação
fosfodiéster

enzimas

células procarióticas células eucarióticas função

primas e primas / DNA
polimerase ✗
adição de primos

☐NA polimerase o cadeia

lagging
DNA polimerase E.

DNA polimerase E cadeia

Ieading
as DNA polimerases têm de manter -
se unidas às moléculas de

DNA durante períodos longos .

é necessário . . .

Proteínas estabilizadoras da DNA polimerase

1) PCNA

permite a
Iig . da DNA polimerase às cadeias de DNA que se estão a

ATP ; heterotrimériã (3 proteínas

replicar ,
com
gasto de forma um anel

diferentes )

2) RFC

estabiliza a
liga da PCNA oi mal . de DNA ,
com
gasto de ATP

eucariotas procariotas

PCNA
sliding -

clamp proteicos

RFC
clamp loading protein
-

Topoisomerase
-

forma nicks ( corta lig

.

fosfodiéster ) para aliviar

o sobre enrolamento provocado pela abertura da nelicase

Topoisomerase I Topoisomerase II

Quebra uma
liga fosfodiéster catalisa a quebra da dupla
na cadeia simples ,
havendo cadeia de DNA

rotação rotação da moi .

para
aliviar o sobreenrolamento Evita que , aquando da

divisão celular na
segre
-

vota a restabelecer a reação g. ação para as v1 .

filhas ,

fosfodiéster ,
sem gasto de se enrolem

energia
Mecanismos de reparação :

1.
proofreading das DNA polimenases

.CM?.tr. .s. . . .atIYQ?.po1imerizanucleotideos

a enzima tem ? . . .

no exonuc / case no sentido

' '
' '
sentido 5 -
3 z
-
5

há uma incorporação errada de

um nucleotídeo

a. mecanismos de mismatcts reparar

crescimento bidirecional e simétrica de ✗
forquilhas de replicação :

vírus

bactérias

eucariontes

BACTÉRIAS -

replicação de cromossomas

inicia numa sequência rica em Adenina / Timina -

origem de
replicação
quando a
replicação inicia a 0.12 .

liga
-
se a uma prof . inibidora que a bloqueia
só após a nova cadeia estar metilada é que a helicase se
liga outra vez

termina quando as DNA polimerases estão em lados opostos

-
-
-

) ) )

EUCARIOTAS

em cada cromossoma existem multi pelas

origens de
replicação ( ar )

EEEEIEEEEE.EE.cáo_ :
permitem a
regulação de várias ar .

em simultâneo

ligam -
se às 0.12 .
:

012C
Corrigir recognition compilei ) + Proteínas CDCG e CDTI

s.a.s.si?:::ImiE.iaae.I
fosforila alguma das proteínas deste complexo ,
levando à
 nota :
>
a eu cromatina
replica antes da hetero cromatina
>
regiões transcritas ativamente são as primeiras a replicar
(
regiões não
>
codificam tess replicam
-

teto meros centro meros

_

e mais tarde

Encurtamento dos telómeros

fim da
replicação

ELEEEE.mg síntese perfeita

EIIagg.ing- final fragmento

=
mas para
primer ,
sem
espaço o

de 0k a Zak i

RNASEH
digere
>
o primer
transcrição por completar :

'
extremidade 3 de cadeia simples

teto meros vão encurtando

longo
-
>
ao de vários ciclos ,
os

progressivamente

telomerase -

eranscriptase reversa

integra uma sequência de RUA complementar à da extremidade

( GGOTTA ) e
_

final do teto mero cadeia repetitiva produz DNA a partir

desse

há espaço para o novo

primer e o novo
fragmento Okazaki

evita -
se o encurtamento dos teto meros
 ANÁLISE ÁCIDOS NUCLEICOS

ELETROFORESE

aplicar corrente elétrica

separar as moi . de DNA em função do tamanho

*
as moi . são carregadas migram ,
no
gel de
agarose ,

n-eq.am#te no sentido do
polo positivo

é necessário corar as rnol . de DNA

Brometo de etidio laranja fluorescente luz ultravioleta ;

-

e/

careiro
génio

corante inócuo -

verde fluorescente não é

; perigoso

* nota :

gel de
poliacrilamida :
permite separar mal . os pesos muito próximos
das sequenciação
{
eletroforese capilar : técnica de sequenciação + recente

IMPORTANTE SABER :
>
Eco 121 -

bactéria E. coli
|
enzimas de restrição : endonucleases |
deixa ✗ extremidades coesivas de cadeia

| simples
cortam em sítios específicos |
HIND 3
haemophilusinfluenz.ae
>
| bactéria
-

têm sequências de reconhecimento | corta a dupla cadeia sem deixar

especificas | sequências coesivas

hibridação do DNA

ligação de uma cadeia simples de DNA , por pontes de H com

outra sequência complementar ,

voltando -
se a formar a dupla hélice

sondas -

oligonucleotídeo de DNA que é complementar à sequência que interesse ,

sendo marcado com
algo que o torne visível

DNA / DNA DNA / RNA RNA / RNA

 Blotting
>
southern -

transferência de mal . de DNA separadas por eletrofore.se para a

superfície do filtro

transferência -
elétrica ou
passiva

montagem do sistema :

peso em cima

papel
filtro

gel de
agarose
solução condutora de corrente elétrica ( com sal )

dçEçããI- permite a hibridação com a sonda

marcação das sondas :

(
I) radio isótopos auto
com
radiografia
-

a) com
grupos fluorescência fluoresceina-FITC.rodomina
-

grupos químicos anticorpos / enzimas

-

3) com

> Nortnern
Blotting
-

transferemCia de mal . de RNA separadas por eletrofore.se para a

superfície do filtro

nota: identificar diferentes sequências de nucleotideos em mal . de RNA

podem ser identificadas com a

ajuda de sondas complementares

-
>
Hibridação in situ

permite localizar uma determinada sequência de ácidos nucleicos

diretamente no tecido

hibridação com sondas marcadas

após desnaturação do
°
cromossomas
-
DNA

expressão
°
mal .
específicas de RNA >
determinar níveis de

cromossoma
Paiting
>

sondas fluorescentes com cores diferentes

identificar zonas cromossómicas em metáfase

>
FISH

fluorescence in
situhybridization

sonda marcada com

dioxigenina ,
depois identificada com um

anticorpo específico
 •

ANALISE DE PROTEÍNAS

SDS PAGE Çdodeci /sulfato de sódio eletroforese em

gel de poliacrilamida)
-
-

1° passo :

iónico desnaturar te ( pH 7)
detergente com
carga negativa
eliminar as variáveis
carga e forma

1
lig peptidica
.
: I not . de
detergente
-

carga negativa repele

-
a da proteína =
desnaturação / linearização

Ditiotreitol ( BTT )
>
+ p
-

mercaptoetanol

mal . redutora

quebram as
Iig . dissulfureto ( SH -
SH ) =
linearização

proteínas linearizadas e com uma densidade de

carga
negativa igual para todas

Podem ser
separadas apenas em função do seu tamanho

2° passo :

eletroforese em gel de poliacrilamida ( PAGE )

*
poros de tamanho adequado
*
gel vertical
*
migram para o polo positivo

PAG 53 .
 GENOMA HUMANO csaão
genes
>

sequenciação do
genoma humano ( 1990 -
2003 )

1 1

MEI automática

*
gel de poliacrilamida * capilar ( 500 bases /
segundo )

A- radio isótopos

CONCLUSÕES :

> 1- 1.5% -

sequências codificadores de proteínas

sequências
> -

25 % intra nicas
-

>
80 90% material
genético não codificado
-
-

↳ 30% repetitivo disperso)

-

DNA ( em 1- andem ou
_ - i - r - r i r r
- , _

SEQUÊNCIAS REPETITIVAS NO GENOMA

EII NÉfuncionaim
tt
famílias de * DNA centromérico repetitivo DNA satélite
genes
-

*
sequências não codificam tes *
VNTRS -
minissatélites e microssatélites

) *
( teto meros -
TTAGG transpões
*
retrotransposoés -

< INES e SINES

ÊOUÊNCIASREPÍIFANODNA
"

☐ONOR DNA

1. transpões -
elementos móveis transposão

através de intermediários de DNA

<

~
DNA TARGET

CUT -
PASTE : DNA dador

desaparece ; bactérias

-
 ☐ONOR DNA

2. retrotransposoés -

elementos móveis -

através de intermediários de DNA retrotransposaõ

✓ RNA Polímeros e

mn
RNA intermediar te

✓ reversa Eranscriptase
CODY -
PASTE : enzima transcrito fase
reversa ; DNA dador intacto ; DNA TARGET

eucariontes-i-ogmacentra.IS
replicação e
>
DNA
transcrição > m RNA

,
-

tradução
ribossoma

regulação :
a

proteína

1. Durante a transcrição :

*
promotores -
a montante do
gene ; promovem a atuação da enzima

RNA Polimerase II -
TATA box / CCAAT box

*
entrancei -
a montante ou
jusante do
gene ; modelam a ação do promotor

✗ .
Durante o processamento de MRNA :

diferentes MRNÁS
* alternativa
splicing 1
gene diferentes proteínas
-

, >

3. Durante modificações pós -

tradicionais : 4. Epigenética

* *
empacotamento da cromatina
clivagem por enzima
proteoiítica

*
fosforilação *
modificação de historias

glicose ilação ação

* * do
meti / DNA
SUBSTRATO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA

}
" " " ° " " > " ° / " " "" "" BEN " " " • "
"
" " "" +° P + " "° ° £" " "
-

variação natural distintos

e-mseq.n-Eduficantes-frequeesa.ae
-

sem efeitos adversos •

1%
variantes ratas> •

SNPS seq .
repetitivas em 1- andem CNVS

1 1

microssatélites / minissatélites /

STR 's VNTR 's

* SNPS -

variações de uma Única base

pouco polimórficos ;
+ comum nas
regiões não -

codifica ntes

|
*
VNTR's / Minissatélites

seq .
repetitivas > 5 nucleotideos na unidade de
repetição ; " "
+ comum nas regiões subteloméricas ;
fingerprint
:
padrão
muito polimórfico estabelecido pela análise
simultânea • várias destas
*
STR 's / Microssatélites regiões
seq .
repetitivas com 1-5 nucleotideos ( +
vulgar CA ) ;

todo
em o
genoma ;
muito polimórficos

*
CNVÒ
variações no n° de cópias de
grandes segmentos ( 200 bp -
2M b)

→ ausência
presença ou do
segmento
→
repetições do
segmento
 MUTAÇÕES

aquisição -
herdadas ou somáticas ;

causa
-

espontâneas ou induzidas (
agentes mutagénicos ) ;

local certificantes não codifica estes

-

seq . ou

alelos Id ( mt )
wi
type Cwt )
mutationty.pe
-

ou

consequências patologias várias motor de evolução

-

ou

-
Sinónimas silenciosas
troca de base sem afetar o aa

SUBSTITUIÇÃO ( redundância do
codigo genético)
transversais :

|
pirimida
' '
purina
missense ex : anemia falei forme

I.
transição : troca de base afeta o aa

purina
< '
purina novo aa :
quimicamente . . .

não conservadoras aguente

pinimiaa pi.im.ua
.
, , *

* conservadoras -

parecido ✓

sinónimas mantém
-
não Proteína
alguma atividade

|
non sense ex Síndrome de Papi 110N Lefeure
-
:

codão normal > codão STOP

MRNA resultante :

* instável =
não há tradução
suficientemente estável prot não funcional
*
= .

Mutação intro rica :

-

* * • • saia, *ii. * e
alternativos ativa crugplicsplice sites ;
que competem
não intro exão ;
com os locais normais
enzimas
distinguem de

durante o processamento perda funcional

perda funcional _ promotor

ex : Síndrome de ×
Frágil
 DELEÇAÕ + INSERÇÃO
1 1 1 1

In -
trame Frameshift grande deteção / inserção dinâmicas

inserção / deteção de inserção/ deteção não deteção / duplicação parcial/ expansão de seq .

3 em 3 ; não altera múltipla de 3 , surge integral do

gene repetidas de tri rodeo
- -

calão stop pre tidos '

cada vez +
a
redding trame um
-

maturo ex : instável

perda parcial de deteção integral -

neuropatia
funcionalidade perda de função hereditária ex :
Doença de Huntin -

duplicação integral -

doença gton
ex :
distrofia musa .
ex :
distrofia musc . de Charco t -

Marie -

Tooth
de Becker de Duchenne 1A
; Doença tipo
de Tay Sachs
-

ETEITOSFUNCIONAisjnmftp.cn
"

da de função ganho de
função dominante -

negativa
ou anti mórfica

nipo mórfica prot níveis aumentados da hetero Zi

góticos a
prof C/ a
=
com
-

atividade reduzida expressão genética ou alteração afeta a normal

desenvolvimento de uma
v

Amórfica -

prot.com nova função atua

antagonista comente com

atividade nula o apelo correspondente normal

predominantemente her -

Haplo insuficiência ind dadas atividade proteica alterada

-

metade inativada
hetero
zigótiaos ; ou

da prof . normal e outra doenças

alteração ;
Huntington
codificações
Doença de
a modifica ex : comum nos
genes que
-

poderão afetar não com prot . estruturais ,

como o

a cel .

homozigotos
= + severo cola
génio
ex : Síndrome de ex :
Osteogenesis imperfeita
enzimas afetadas -

waardenburg tipo I
atividade catalítica

do produto do
gene
normal é suficiente
para levar a cabo as

metabólicas
reações das vias
CLONAGEM E PCR

c-iagemdeDNAA.in
vivo all -
based clonig ( RDNA )

( PER)
* all free DNA
cloning
-

1. RDNA

vetores meio de suporte

-

plasmídeos
-
mal . de DNA circulares ,
extra -
cromossómicas e com capacidade de

auto -

replicação

↳
codificam proteínas de resistência a antibióticos , metais pesados ,

mutagéneos ,
etc . . .

enzimas de restrição :
permitem a
introdução do DNA de interesse no plasmídeo

corte :

no eixo de simetria t.3.lu.pt :[ nd?

-

. .

" "
escada
f.t.i.cl?y..E.n.d..s
-

em

ex : TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA

introdução dos plasmídeos na bactéria ( E. Coli )

*
Método Químico adição de Cacela →
bactérias permissivas à entrada de DNA
-

"
*
Eletroporaçao -

campo elétrico de alta voltagem → "

buracos temporários na

membrana celular →
entrada de DNA
 ✗ .
PCR

amplificação enzimática de um
fragmento específico de DNA localizado

entre dois primos

1. Desnaturação / Des hibridação

Quebra das ( cadeia
pontes de
hidrogénio dupla >
cadeias simples )

95°C -
10
seg
.

{
definição da
seg . a amplificar :

2.
Annealing
à
ligação dos REIS manualmente acesso
seg decide se onde
-

* -
colocar
:

o primer tomara e reversa

60°C 20
seg
-
.

|
*
ferramentas bio informáticas

3. Extensão / Polimeração
adição de desoxirribonucleotídeos ( DNTP 's )
-

forma a cadeia complementar de DNA

>
enzima Taqpolimerase ( a + estável a temp . elevadas )

72°C
205cg
-
.

repetição por ciclos ( 30 -

35 )

%? só a
partir do 3° ciclo é
que se obtêm fragmentos que correspondem exatamente à

de interesse
seq .

n° de moto .
=
2C (e = n° de ciclos)

se fosse utilizado apenas 1 ciclo =

uma única extensão com um comprimento
muito maior que o pretendido

fase exponencial produto é duplicado

-

a cada ciclo

fase linear reagentes vão sendo

consumidos
-

reação = vei . de diminui

fase de plateu
-

deteção do end -

point ;
30 ciclos
atingidos