1326M

Universidade Federal de Minas Gerais
Escola de Engenharia
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica
Um Sistema Sem Fio Microcontrolado para

Registro de Atividade Eletrosiológica e um
Aparato Customizável para
Condicionamento Comportamental em
Animais de Laboratório
Aluno: Paulo Aparecido Amaral Júnior
Orientador: Prof. Dr. Hermes Aguiar Magalhães
Coorientador: Prof. Dr. Márcio Flávio Dutra Moraes
Este trabalho foi realizado no Núcleo de Neurociências da UFMG

(Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências
Biológicas), com o auxílio nanceiro da CAPES.
Belo Horizonte, Dezembro de 2016

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Escola de Engenharia
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica
Um Sistema Sem Fio Microcontrolado para

Registro de Atividade Eletrosiológica e um
Aparato Customizável para
Condicionamento Comportamental em
Animais de Laboratório
Aluno: Paulo Aparecido Amaral Júnior
Orientador: Prof. Dr. Hermes Aguiar Magalhães
Coorientador: Prof. Dr. Márcio Flávio Dutra Moraes
Dissertação de Mestrado submetida à Banca Examina-

dora designada pelo Colegiado do Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Elétrica da Escola de Enge-
nharia da Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito para obtenção do Título de Mestre em Enge-
nharia Elétrica.
Belo Horizonte, Dezembro de 2016

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iii
iv
v
Certicado do CEUA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
CEUA
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
CERTIFICADO
Certificamos que o projeto intitulado "Desenvolvimento e Padronização de Uma Caixa de Condicionamento
Microcontrolada, de Baixo Custo e com Grande Escalabilidade e Flexibilidade Experimental", protocolo do CEUA:
250/2016 sob a responsabilidade de Marcio Flavio Dutra Moraes que envolve a produção, manutenção e/ou
utilização de animais pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto o homem) para fins de pesquisa
científica (ou ensino) - encontra-se de acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, do
Decreto nº 6.899 de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle da
Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovado pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA) DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, em reunião de 23/09/2016.
Vigência do Projeto 15/10/2016 a 15/10/2020

*Espécie/linhagem Rato isogênico219
Nº de animais 20
Peso/Idade 250g / 65(dias)
Sexo masculino
Origem Biotério
Considerações posteriores:
23/09/2016 Aprovado na reunião do dia 19/09/2016.
Belo Horizonte, 21/10/2016.
Atenciosamente,
Sistema Solicite CEUA UFMG

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Avenida Antônio Carlos, 6627 – Campus Pampulha
Unidade Administrativa II – 2º Andar, Sala 2005
31270-901 – Belo Horizonte, MG – Brasil
Telefone: (31) 3409-4516
www.ufmg.br/bioetica/ceua - cetea@prpq.ufmg.br
1/1
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vi
Aos meus pais, Paulo e Silvana, com carinho.

vii
Agradecimentos
Para ser sincero, tenho que admitir que dicilmente eu teria conseguido con-
cluir meu trabalho de mestrado se não fosse pelo amparo, tanto intelectual como
espiritual, de inúmeras pessoas que conviveram comigo durante essa jornada na
universidade.
Sendo assim, gostaria de começar por agradecer aos meus pais, Paulo e Silvana,
e à minha irmã, Carol. Todo o seu carinho e amor para comigo são de grande
sustentação e incentivo, e sou muito grato por todas as bênçãos e alegrias que vocês
já me proporcionaram na vida.
Também gostaria de agradecer à minha companheira, Luiza, com quem com-
partilho grande amor e amizade. Muito obrigado, Linda, pelo interesse que você
tem em saber sobre os meus sonhos, as minhas diculdades, meus medos e ansieda-
des. Seu companheirismo e sensibilidade são, para mim, fonte de muita inspiração
e força. Quero dizer-lhe também que você enche o meu coração de alegria e me faz
sonhar como nunca, e isso sem dúvida me ajudou bastante em meu trabalho. Muito
obrigado.
Agradeço também, de uma forma geral, às minhas famílias Amaral e Barbosa,
que são um rico repertório de pessoas amorosas, inteligentes, simples, humildes,
batalhadoras e de pessoas que tomo, sem dúvida alguma, como verdadeiros exemplos
de vida. Com todos vocês, tenho a oportunidade de aprender princípios e valores
morais da mais alta importância. Eu sei que muitos de vocês torcem verdadeiramente
por mim e queria dizer que esse incentivo me sensibiliza de uma forma que talvez
vocês nem imaginem. Muito obrigado.
Também sou muito grato ao meu caro Prof. Hermes Aguiar Magalhães, que já
me acompanha de perto há aproximadamente três anos. Fiquei muito feliz quando
vi diante de mim a oportunidade de tê-lo como meu orientador, pois eu sabia o
quanto eu tinha a aprender com o senhor. Saiba que eu te admiro muito por sua
conduta e seus valores de vida, por sua competência prossional e por sua coragem
em retornar ao meio acadêmico depois de tantos anos afastado dele. Esteja certo de
que seu exemplo, seus conselhos e nossas conversas do dia a dia muito contribuíram
para o meu aprimoramento como ser humano. E muito obrigado por ter me oferecido
a oportunidade de participar da sua equipe na Ocina de Gestão de Projetos e
Empreendedorismo. Assim como eu aprendi bastante, tenho certeza que os alunos e
viii
professores da UFMG, e consequentemente, nosso país, têm muito a ganhar com a

visão empreendedora que você está trazendo para a universidade. Desejo-lhe muita
sabedoria e força em sua empreitada, pois reconheço as diculdades inerentes a uma
proposta de mudança de paradigma no ensino de uma universidade tão ampla e já
estruturada como a UFMG. Entretanto, tenho certeza que, inevitavelmente, o seu
trabalho será acolhido e terá resultados ainda melhores a cada ano que passar. Muito
obrigado por tudo, mestre.
Quero agradecer também ao meu caro Prof. Márcio Flávio Dutra Moraes. Muito
obrigado, mestre, por ter me recebido de braços abertos no NNC e por ter me
mostrado de maneira tão brilhante o universo magníco que é a ciência. A sua
paixão pelo que faz e a sua genialidade têm um enorme poder de inspiração. Isso
me ajudou a superar as minhas limitações no decorrer do meu trabalho. No início,
confesso que a sua personalidade forte e o seu interesse pela essência em detrimento
da aparência me acanharam bastante. Mas o tempo, que é o verdadeiro senhor da
razão, me mostrou os belíssimos ideais que você guarda no coração e o seu nobre
desejo de transformar o mundo através das pessoas. Muito obrigado por acreditar
no meu trabalho e pelo seu interesse em me ajudar e me esclarecer.
Ao caro Prof. Hani Camille Yehia, que me acompanhou e me incentivou no estágio
inicial do meu trabalho, também deixo meu muito obrigado. Tive a honra de ser seu
aluno ao longo do primeiro ano do meu mestrado e de ter contato com algumas de
suas ideias profundas e sensatas sobre a vida, que invariavelmente escapam durante
as aulas. Muito obrigado, Professor.
Ao Prof. Henrique Resende Martins, agradeço pela sua simpatia e solicitude,
bem como pelas contribuições feitas com tanto critério e interesse no dia da minha
defesa. Desejo ao senhor muito vigor em seu trabalho e inúmeras realizações em sua
carreira como professor na UFMG.
Agradeço também à Mariana Chamon, excelente aluna de iniciação cientíca do
Prof. Márcio. Obrigado pelo seu valioso trabalho e auxílio prestado no desenvolvi-
mento do sistema de controle da caixa de condicionamento, que fez parte do meu
trabalho de mestrado. Muito obrigado, Mari, e tudo de bom na reta nal de seu
curso.
Ao Flávio, ao Daniel, à Hyorrana, ao Cristiano Simões, ao Vinícius, ao Cayo
(como foi difícil escrever o nome de vocês, e não os apelidos!), enm, a todos do
NNC que conviveram comigo e zeram do meu trabalho um verdadeiro trabalho em
equipe. Digo, com a maior sinceridade, que o talento e a vocação que vocês têm para
o que fazem muito me impressionaram quando cheguei ao laboratório. Tenho certeza
que a competência de vocês será coroada com muitas conquistas. Muito obrigado
pelo carinho, pelas inúmeras conversas nas quais compartilhamos histórias, ideias e
conhecimentos. Saibam que vocês me ajudaram bastante a crescer como ser humano
e que vocês realmente tornam o NNC um laboratório especial. Me sinto privilegiado
ix
por tê-los conhecido e desejo a todos muita força e coragem ante os desaos da
ciência e da vida. Muito obrigado a todos!
Ao meu caro amigo Pedro Lopes, muito obrigado por sua ajuda espontânea
no período mais difícil do meu trabalho. Saiba que tê-lo de volta trabalhando no
NNC seria uma grande honra para todos do laboratório, mas, acima de tudo, quero
desejar-lhe muitas alegrias e realizações, independente do caminho que você decidir
trilhar. Grande abraço, Pedrão.
Agradeço à CAPES, a agência de fomento que me auxiliou nanceiramente ao
longo da realização deste trabalho, e também ao CNPq e à FAPEMIG, por nancia-
rem projetos de pesquisa com os quais tive proveitoso contato durante meu trabalho
de mestrado.
Por m, agradeço à vida, pela beleza do universo e dos seres que se relacionam
comigo, que tocam o meu coração e me ajudam a crescer. Agradeço à vida por
diariamente me oferecer meios de me aprimorar moralmente e intelectualmente, de
ajustar minha conduta, meus sentimentos e pensamentos de tal forma a garantir
uma felicidade cada vez mais inabalável. Eu sinceramente sinto o envolvimento de
uma força maior, uma causa, que não o acaso, para essa harmonia e beleza innita
do universo, e por isso não queria deixar de agradecer a que eu chamo de Deus, por
tudo o que já me aconteceu na vida. Muito obrigado!
x
Resumo
Para dissecar os circuitos neurais, o conceito de interagir bidirecionalmente com o

cérebro, registrando e modulando a atividade de neurônios, tem se tornado um obje-
tivo essencial em neurociência experimental. Uma técnica de observação com elevada
resolução temporal consiste em registrar, através de uma interface eletroquímica
(eletrodo), potenciais elétricos associados à atividade eletrosiológica no cérebro.
No entanto, ser capaz de monitorar múltiplos canais de registro por longos períodos
de tempo, com relação sinal-ruído apropriada e pouca susceptibilidade a artefatos
de movimento, representa um grande desao em neurociências. Além disso, sistemas
de registro tradicionais transmitem os dados eletrosiológicos por meio de cabos
que conectam os eletrodos a um sistema de aquisição remoto. Além de serem um
potencial causador de estresse e distração para os animais, esses cabos restringem
a dinâmica inerente ao comportamento animal e dicultam a coleta de dados ele-
trosiológicos durante a realização de paradigmas comportamentais. Para contornar
essas diculdades, projetamos e construímos um sistema com comunicação sem o
para registro de atividade eletrosiológica em ratos adultos. O sistema idealizado
é leve, de baixo custo e utiliza componentes comercialmente disponíveis. Ele é for-
mado por duas partes: uma headstage, a ser xada sobre a cabeça do animal, e uma
backpack, a ser apoiada em suas costas. Por meio de testes de bancada, revelamos
que o sistema proposto é capaz de transmitir cerca de 1 Mbps de dados à distâncias
como 8 m, continuamente por mais de duas horas até o esgotamento da bateria. Esse
sistema foi validado por meio de um experimento com animal anestesiado, no qual
comparamos os registros obtidos com os de um sistema padrão-ouro de qualidade.
Além disso, visando a utilização do sistema proposto no decorrer de paradigmas
comportamentais, também projetamos e construímos uma caixa microcontrolada e
operada via interface sem o para condicionamento comportamental em animais.
Essa caixa de condicionamento é uma prova de conceito para o desenvolvimento de
um sistema retroalimentado que permita modicar dinamicamente as condições de
contorno de experimentos comportamentais com base em padrões eletrosiológicos
registrados.
Palavras-chave: Eletrosiologia, Eletroencefalograa, Sistema de Registro Sem

Fio, Comportamento Animal, Paradigmas Comportamentais Retroalimentados.
xi
Abstract
In order to dissect neural circuits, the concept of bidirectional interaction with

the brain, recording and modulating the activity of neurons, has become an essential
goal in experimental neuroscience. An observation technique with high temporal reso-
lution consists of recording, through an electrochemical interface (electrode), electri-
cal potentials associated with the electrophysiological activity in the brain. However,
monitoring multiple recording channels for long periods, with proper signal-to-noise
ratio and low susceptibility to motion artifacts, represents a major challenge in neu-
roscience. Furthermore, traditional recording systems transmit electrophysiological
data by means of cables that connect the electrodes to a remote acquisition system.
In addition to being a potential stressor and distractor for animals, these cables
restrict the dynamics inherent in animal behavior and discourage the collection of
electrophysiological data during performance of behavioral paradigms. To circumvent
these diculties, we designed and built a system with wireless communication for re-
cording electrophysiological activity in adult rats. The idealized system is lightweight,
low cost and uses commercially available components. It consists of two parts: a he-
adstage, to be xed on the animal's head, and a backpack, to be supported on his
back. Through bench tests, we have shown that the proposed system is capable of
transmitting about 1 Mbps of electrophysiological data at distances of 8 m continu-
ously for more than two hours until battery is depleted. This system was validated
through an experiment with anesthetized animal, in which we compared the obtained
records with those of a gold-standard quality system. In addition, aiming to use the
proposed system in the course of behavioral paradigms, we also designed and built
a microcontrolled and wireless operated box for animal behavior conditioning. Such
conditioning box is a proof of concept for the development of a feedback system that
dynamically modies the boundary conditions of behavioral experiments based on
recorded electrophysiological patterns.
Keywords: Electrophysiology, Electroencephalogram, Wireless Recording Sys-
tem, Animal Behavior, Conditioning Box, Feedback Behavioral Paradigms.
xii
Sumário
Lista de Abreviaturas xiv

Lista de Figuras xv
Lista de Tabelas xix
1 Introdução 1
1.1 Descrição do Problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 O Núcleo de Neurociências da UFMG . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Motivação do Trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.4 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.5 Revisão de Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5.1 Eletrosiologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5.2 Sistemas de Registro Eletrosiológico com Transmissão Sem
Fio de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5.3 Caixas de Condicionamento do Comportamento Animal e Pa-
radigmas de Condicionamento Clássico e Operante . . . . . . 16
1.6 Especicações de Projeto do Sistema de Registro Proposto . . . . . . 19
1.7 Especicações de Projeto da Caixa de Condicionamento Proposta . . 20
1.8 Estado da Arte da Tecnologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.8.1 Circuitos Integrados Comerciais para Eletrosiologia . . . . . 21
1.8.2 Circuitos Integrados Comerciais para Transmissão Sem Fio de
Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.8.3 Baterias para Alimentação do Sistema de Registro . . . . . . . 25
1.8.4 Microcontroladores para Controle da Caixa de Condicionamento 27
1.9 Diretrizes Éticas para Utilização de Animais Neste Trabalho . . . . . 28
2 Uma Proposta de Sistema Sem Fio Para Registro Eletrosiológico 29

2.1 Considerações Preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2 Descrição do Sistema de Registro Proposto . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2.1 Visão Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
xiii
2.2.2 RHD2000 - Uma Família de Microchips para Eletrosiologia

Digital . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.3 ESP8266 - Um Microcontrolador com Interfaces WiFi e SPI . 33
2.2.4 Headstage e Backpack . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.5 Interface de Usuário para Operação do Sistema de Registro . . 40
2.2.6 Lista de Materiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3 Metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4 Resultados e Discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.1 Estimativa da Máxima Taxa de Amostragem do Sistema de
Registro Proposto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.4.2 Avaliação da Perda de Dados Eletrosiológicos no Protocolo
UDP em Função da Frequência de Amostragem, da Distância
e da Potência de Transmissão WiFi . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4.3 Estimativa da Autonomia do Sistema de Registro . . . . . . . 61
2.4.4 Avaliação da Precisão do Intervalo de Amostragem . . . . . . 62
2.4.5 Registros Eletrosiológicos com o Sistema Sem Fio e Compa-
ração com um Sistema Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3 Uma Proposta de Aparato Microcontrolado para Condicionamento

Comportamental 73
3.1 Considerações Preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2 Descrição da Caixa de Condicionamento . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.1 Visão Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.2 Caixa de Acrílico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.2.3 Estímulo Incondicionado - Circuito do Choque . . . . . . . . . 75
3.2.4 Estímulo Condicionado - Sistema de Áudio . . . . . . . . . . . 79
3.2.5 Interface de Usuário para Operação da Caixa de Condiciona-
mento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.2.6 Lista de Materiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.3 Metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.4 Resultados e Discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.4.1 Caracterização do Estímulo Condicionado (Som) . . . . . . . . 88
3.4.2 Caracterização do Estímulo Incondicionado (Choque) . . . . . 93
3.4.3 Protocolo de Condicionamento Clássico ao Medo . . . . . . . . 95
4 Conclusões 97
Referências Bibliográcas 103
xiv
Lista de Abreviaturas
ADC Analog-to-Digital Converter
CI Colículo Inferior
CS Estímulo Condicionado ou Conditioned Stimulus
CMRR Common-Mode Rejection Ratio
ECG Eletrocardiograma
EEG Eletroencefalograa
ECoG Eletrocorticograa
LFP Local Field Potential
FFT Fast Fourier Transform
FSK Frequency-Shift Keying
GPIO General Purpose Input/Output
IoT Internet of Things
MCU Microcontroller Unit
NNC Núcleo de Neurociências da Universidade Federal de Minas Gerais
PEARP Potencial Evocado Auditivo em Regime Permanente
PEART Potencial Evocado Auditivo em Regime Transitório
PWM Pulse-Width Modulation
RF Rádio Frequência
RISC Reduced Instruction Set Computer
SAR ADC Successive Approximation Register Analog-to-Digital Converter
TDT Tucker-Davis Technologies
TCP Transmission Control Protocol
UDP User Datagram Protocol
US Estímulo Incondicionado ou Unconditioned Stimulus
Lista de Figuras
1.1 Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico. . . . . . . 10

1.2 Sistema de registro sem o com tecnologia Bluetooth, baseado no chip
ADS1298 da Texas Instruments e no módulo PAN1721 da Panasonic. 12
1.3 Sistema de registro sem o com microcontrolador PIC, uma heads-
tage T16G100 modicada (TBSI Inc.) e transmissão Bluetooth com
o módulo BlueGiga Wraptor WT12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4 Sistema de registro eletrosiológico com um chip Neuroplat e trans-
missão sem o de dados via rádio frequência (módulo SDX-21LP). . . 14
1.5 Sistema de registro utilizado em primatas rhesus monkey, com trans-
missão sem o de dados eletrosiológicos de 100 canais a 7,8 kHz/canal. 15
1.6 Ilustração explicativa de um protocolo de condicionamento clássico
ao medo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1 Arquitetura organizacional do sistema de registro sem o proposto. . 30

2.2 Ilustração do sistema de registro sem o proposto. . . . . . . . . . . . 31
2.3 Família RHD2000 de microchips para eletrosiologia digital da Intan
Technologies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.4 Diagrama temporal da comunicação via interface periférica serial com
o RHD2000. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.5 Arquitetura organizacional interna do chip ESP8266. . . . . . . . . . 34
2.6 Chip ESP8266, suas dimensões físicas e seus módulos comerciais. . . . 35
2.7 Pinagem do módulo ESP-12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.8 Esquemático em software KiCad do circuito eletrônico que permite
colocar o ESP8266 em seus modos de execução ou de programação. . 37
2.9 Circuito que permite programar o ESP8266-12 (desenvolvido no soft-
ware Fritzing ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.10 Esquemático do circuito eletrônico da headstage no software KiCad. . 38
2.11 Placa de circuito impresso da headstage. . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.12 Esquemático do circuito eletrônico da backpack no software KiCad. . 40
2.13 Foto da backpack a ser posicionada sobre as costas do animal. . . . . 40
2.14 Interface do sistema de registro eletrosiológico sem o proposto. . . 41
xv
xvi
2.15 Desenho representativo do conteúdo do arquivo de registro criado pela

rotina da interface de usuário. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.16 Ilustração do método para estimar a velocidade média de transmissão
de dados através dos protocolos TCP, UDP e SPI. . . . . . . . . . . . 43
2.17 Ilustração do método para estimar a porcentagem média de pacotes
UDP recebidos com sucesso pela interface do sistema de registro sem
o, considerando diferentes cenários de uxo de dados e distância de
transmissão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.18 Ilustração do método para estimar a porcentagem média de pacotes
UDP recebidos com sucesso pela interface do sistema de registro sem
o, considerando diferentes cenários de distância de transmissão e
potência da antena WiFi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.19 Ilustração do método para avaliar a precisão da frequência de amos-
tragem de dados eletrosiológicos ditada pelo ESP8266. . . . . . . . . 49
2.20 Ilustração do método para medição de potencial evocado auditivo em
regime permanente no colículo inferior de um rato anestesiado. . . . . 52
2.21 Ilustração do método para medição de potencial evocado auditivo em
regime transitório no colículo inferior de um rato anestesiado. . . . . 53
2.22 Avaliação da taxa de transmissão de dados via socket TCP. . . . . . . 54
2.23 Avaliação da taxa de transmissão de dados via socket UDP. . . . . . . 55
2.24 Avaliação da taxa real de transmissão de dados via Interface Periférica
Serial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.25 Ciclo de trabalho do ESP8266 com a rotinaNNC_WiFi_ephys. . . . 57
2.26 Avaliação do desempenho da comunicação sem o baseada em socket
UDP em função de fs (frequência de amostragem total simulada) e
d (distância entre o módulo ESP8266 e o computador pessoal com a
interface do sistema de registro). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.27 Avaliação do desempenho da comunicação sem o baseada em socket
UDP quando a Interface Serial Periférica é posta em operação. . . . . 60
2.28 Avaliação do desempenho da comunicação sem o baseada em soc-
ket UDP em função de TXpower (potência da antena do módulo
ESP8266) e dist (distância entre o módulo ESP8266 e o computador
pessoal com a interface do sistema de registro). . . . . . . . . . . . . 61
2.29 Decaimento da tensão das baterias LS14250 (3,6 V) e CR2 (3 V),
candidatas à alimentação do sistema de registro sem o proposto. . . 62
2.30 Aumento da regularidade temporal na execução da função Requi-
sitar_Amostra() por meio de uma modicação no arquivo core_-
esp8266_timer.c da biblioteca do ESP8266. . . . . . . . . . . . . . . 65
xvii
2.31 Correção do defasamento observado ao longo do tempo entre os regis-

tros do sistema sem o e do sistema da TDT, por meio de uma mo-
dicação no arquivo core_esp8266_timer.c da biblioteca do ESP8266. 66
2.32 Promediação temporal de ciclos cardíacos do registro eletrosiológico
obtido pelo sistema da TDT e pelo sistema sem o proposto. . . . . . 67
2.33 Sinal puro e espectrograma do registro no colículo inferior de rato
Wistar anestesiado obtido com o sistema da TDT. . . . . . . . . . . . 68
2.34 Sinal puro e espectrograma do registro no colículo inferior de rato
Wistar anestesiado obtido com o sistema sem o. . . . . . . . . . . . 68
2.35 Aumento da energia do sinal registrado no colículo inferior de um
rato anestesiado, na banda centrada na frequência da moduladora e
com margem de +- 1 Hz (53,71 Hz +- 1 Hz), durante protocolo com
estimulação auditiva em 100 dB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.36 Experimento controle para constatar a invalidez da hipótese de con-
taminação eletromagnética entre o sistema de registro e o sistema de
estimulação auditiva. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.37 Potencial evocado auditivo em regime transitório, registrado no co-
lículo inferior de um rato anestesiado em resposta a pulsos de tons
puros em 10 kHz, com 50 ms de duração e intensidade de 100 dB. . . 70
2.38 Análise histológica para conrmação do posicionamento do eletrodo
no colículo inferior. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.1 Diagrama de blocos representativo da caixa de condicionamento cus-

tomizada proposta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2 Caixa de acrílico transparente com barras cilíndricas de aço inox,
eletricadas, formando seu piso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.3 Desenho esquemático do estímulo incondicionado (choque elétrico). . 77
3.4 Placa de circuito impresso com o circuito do choque elétrico aplicado
pelas barras da caixa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.5 Ilustração dos parâmetros programáveis do estímulo incondicionado
(choque) da caixa de condicionamento customizada proposta. . . . . . 79
3.6 Ilustração dos parâmetros programáveis do estímulo condicionado
(som) da caixa de condicionamento proposta. . . . . . . . . . . . . . 80
3.7 Foto da caixa de condicionamento durante a realização de um proto-
colo experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.8 Interface para operação da caixa de condicionamento proposta. . . . . 82
3.9 Ilustração do método para estimar a amplitude média da estimulação
elétrica aversiva da caixa de condicionamento construída. . . . . . . . 85
3.10 Possibilidade de ajuste da portadora do som reproduzido pela caixa
de condicionamento customizada proposta. . . . . . . . . . . . . . . . 88
xviii
3.11 Média e desvio-padrão da frequência da portadora do som reprodu-

zido pela caixa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.12 Média e desvio-padrão da frequência da portadora do som reprodu-
zido pela caixa, calculados por um método mais robusto (modelos
auto-regressivos). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.13 Possibilidade de ajuste de modulação do som reproduzido pela caixa
de condicionamento customizada proposta. . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.14 Média e desvio-padrão da frequência de modulação do som reprodu-
zido pela caixa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.15 Possibilidade de ajuste do volume do som reproduzido pela caixa de
condicionamento customizada proposta. . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
3.16 Padrão de estimulação elétrica bifásica aversiva (400µA) nas barras
que formam o assoalho da caixa de condicionamento customizada. . . 93
3.17 Média e desvio-padrão do choque elétrico da caixa de condiciona-
mento customizada proposta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.18 Efeito de variações na resistência equivalente do corpo do animal na
intensidade programada para o choque elétrico (estímulo incondicio-
nado). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.19 Avaliação da resposta comportamental de medo (freezing ) em um
protocolo de condicionamento clássico ao medo realizado com ratos
Wistar e com a caixa de condicionamento proposta. . . . . . . . . . . 95
xix
Lista de Tabelas
1.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

para registro de atividade eletrosiológica relatados na literatura. . . 17
1.2 Compilação das características principais dos circuitos integrados que
julgamos interessantes para a interface de eletrosiologia. . . . . . . . 23
1.3 Compilação das características principais dos circuitos integrados que
julgamos interessantes para transmissão sem o de dados. . . . . . . . 24
1.4 Alguns modelos comerciais de baterias interessantes para aplicações
com sistemas de registro sem o. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1 Conguração de pinos do ESP8266 para selecionar seu modo de ini-

cialização: FLASH ou UART download. . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2 Lista de materiais do sistema de registro eletrosiológico sem o pro-
posto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3 Frequência de amostragem e número de canais que resultam na frequên-
cia de amostragem total máxima. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4 Precisão dos intervalos de amostragem obtidos com o ESP8266 para
diferentes valores de fS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.5 Precisão dos intervalos de amostragem obtidos com o ESP8266 para
diferentes valores de fS , após modicação no arquivo core_esp8266_-
timer.c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.1 Lista de materiais da caixa de condicionamento customizada proposta. 83

3.2 Média e desvio-padrão da intensidade sonora ajustada através da in-
terface web. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
4.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

para registro de atividade eletrosiológica relatados na literatura. . . 99
xx
CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO 1
Capítulo 1
Introdução
1.1 Descrição do Problema

Um objetivo fundamental em neurociências consiste em reconhecer padrões tem-
porais, espaciais e neuroquímicos que caracterizem a forma como as redes neurais
processam informações coletadas de sistemas sensoriais primários e dão origem a
comportamentos que têm por nalidade última a manutenção da espécie e/ou do
indivíduo. Nesse sentido, modular a atividade de circuitos neurais, avaliar o impacto
que essa modulação tem em funções ou disfunções do cérebro e registrar informa-
ções siológicas sobre o sistema biológico são técnicas extremamente relevantes no
processo de dissecar os circuitos neurais.
Uma técnica poderosa e de elevada resolução temporal (da ordem de µs) para
extrair informações sobre o funcionamento do cérebro, consiste em registrar os po-
tenciais elétricos (também chamados de biopotenciais) associados à atividade de
circuitos neurais. No entanto, em experimentos cientícos com animais de labora-
tório, a grande maioria dos sistemas de registro transmitem os sinais adquiridos
através de cabos que conectam os eletrodos de registro a um sistema de aquisição
remoto, geralmente a alguns metros de distância do animal. Além de poderem cau-
sar estresse nos animais, impedindo a realização de registros de longa duração, os
cabos podem distraí-los durante experimentos e também tornam os biopotenciais
susceptíveis a artefatos de movimento.
Outro ponto muito importante é que se os cabos forem muito grosseiros e pesa-
dos, caso típico em experimentos com registro em múltiplos canais, eles restringem
a dinâmica inerente ao comportamento animal e podem inviabilizar conclusões de-
correntes da análise de parâmetros comportamentais.
Por consequência, é interessante que o sistema de registro seja capaz de trans-
mitir os dados por meio de um protocolo de comunicação sem o, ou ao menos
por meio de um cabo com um número reduzido de os, de forma que ele seja leve,
exível e interra menos no comportamento do animal. Grupos de pesquisa ainda
muito seletos, principalmente no âmbito nacional, desenvolveram sistemas de regis-

tro desse tipo. Além disso, as soluções estão ainda em processo de aperfeiçoamento
e necessitam de tempo para adquirirem mais robustez e terem sua documentação
bem estabelecida e compartilhada com outros laboratórios.
1.2 O Núcleo de Neurociências da UFMG

Este trabalho de mestrado foi realizado no NNC (Núcleo de Neurociências da
UFMG). O NNC é um grupo de pesquisa, ensino e extensão que desde 2000 (ano em
que foi credenciado no Diretório dos Grupos de Pesquisa do CNPq) vem contribuindo
com a ciência por meio de trabalhos que promovem melhor compreensão sobre o
funcionamento do cérebro. Nos últimos anos foram realizados diversos trabalhos de
graduação e pós-graduação em neurosiologia básica, epilepsia, isquemia cerebral,
memória, entre outros temas, por alunos de diversos cursos (sioterapia, farmácia,
medicina, enfermagem, engenharia, psicologia, etc).
Faz parte do cotidiano do laboratório a realização de protocolos experimentais
envolvendo animais, em particular ratos e camundongos, que servem de modelos para
os processos biológicos estudados, como as epilepsias, memória ou aprendizado.
De caráter multidisciplinar, o NNC tem uma estreita relação com a engenha-
ria, uma vez que uma infraestrutura apropriada em neuroengenharia é crucial para
o desenvolvimento de novos métodos de investigação cientíca, ou mesmo para a
implantação de metodologias já existentes. Nesse sentido, o grupo necessita das
ferramentas abordadas neste trabalho (como serão vistas adiante) para continuar
desenvolvendo pesquisa de ponta nas neurociências.
1.3 Motivação do Trabalho

Para o NNC, investigações cientícas com a técnica de registro de atividade
eletrosiológica já rendeu trabalhos importantes, em âmbito internacional, especi-
almente sobre as epilepsias (PEREIRA, 2014) (MEDEIROS et al., 2014) (MEDEI-
ROS; MORAES, 2014) (COTA et al., 2009). Em consequência, algo que interessa
muito ao NNC, mas que ainda não é possível com a arquitetura atual do seu sistema
de aquisição, consiste em realizar registros de longa duração (24 horas por dia, 7 dias
por semana, durante várias semanas) em modelos animais de epilepsia. O intuito é
identicar parâmetros eletrosiológicos que se alteram em momentos que antecedem
crises convulsivas espontâneas e recorrentes e que possam ser usados para prevê-las.
Além disso, o laboratório investiga a possibilidade de impedir o desencadeamento
dessas crises, tirando o cérebro de estados pré-ictais (que antecedem as crises) atra-
vés de estimulação elétrica dessincronizante de circuitos ictogênicos (que geram as
crises) (COTA et al., 2009) (MEDEIROS; MORAES, 2014) (MEDEIROS, 2014).

Com um esquema de registro e estimulação elétrica integrado ao processamento
computacional em tempo real para extração e interpretação de caraterísticas dos
registros eletrosiológicos, tem-se um sistema em malha fechada muito apropriado
para pesquisa nessa área.
Outra possibilidade que interessa muito ao NNC é a realização de paradigmas que
envolvem comportamento social e interação entre indivíduos. Um sistema sem o,
desde que com dimensões físicas e peso apropriados, permitiria o registro simultâneo
em múltiplos animais durante interação entre eles, evitando problemas de entrelaça-
mento entre os cabos de conexão. Seria possível elaborar protocolos experimentais
que permitem avaliar os mecanismos neurosiológicos associados ao reconhecimento
de indivíduos, dominância entre membros de um grupo, entre outros.
Outro aspecto motivacional desse trabalho de mestrado é a necessidade de criar
alternativas mais exíveis para as ferramentas e equipamentos de pesquisa em neuro-
ciências. A realização de experimentos customizados não é viável com os equipamen-
tos comerciais e exige dos grupos de pesquisa uma infraestrutura multidisciplinar
para desenvolver, validar e utilizar novos equipamentos que permitam desvendar im-
portantes questões nas neurociências. Grupos de pesquisa que adotaram esta abor-
dagem têm mostrado grande sucesso em contemplar, modelar e explicar processos
neurosiológicos que estariam fora do alcance da investigação via ferramentas co-
mercialmente disponíveis.
Outro ponto importante e antagônico é a questão nanceira: o cientista necessita
de investimentos para montar seu laboratório e alavancar a sua produção cientíca,
mas, ao mesmo tempo, dele é exigida uma elevada produção cientíca para que
consiga uma boa captação de investimentos. Isso afeta sobretudo cientistas recém-
ingressados na academia. Por isso, também existe o interesse em construir equipa-
mentos mais acessíveis e, como será visto, este trabalho também tem esse viés.
Um reexo dessas diculdades de desenvolvimento na pesquisa em neurociências
é a iniciativa admirável de grupos de pesquisadores que buscam estabelecer uma
colaboração em escala global para fomentar o desenvolvimento de soluções mais e-
xíveis e acessíveis, sem perda de robustez e desempenho. Nesse âmbito, um trabalho
notável em eletrosiologia, campo que é de especial interesse para o NNC, é o da
comunidade Open Ephys (de Open Electrophysiology ) (OPEN-EPHYS, 2011), um
grupo de neurocientistas que tem o intuito de compartilhar e sistematizar o desen-
volvimento de soluções diversas em eletrosiologia, sob os lemas de código aberto,
exibilidade e baixo custo.
Diante do exposto, podemos resumir a motivação deste trabalho de mestrado
nos seguintes itens:
• Há grande interesse em realizar registros eletrosiológicos de longa duração

em ratos e camundongos, com sistema sem o ou ao menos baseado em um

cabo com poucos os e exível, que sobretudo possa apoiar a pesquisa sobre
as epilepsias e que permita registro durante paradigmas comportamentais di-
versos. No entanto, isso esbarra em restrições inerentes à arquitetura atual dos
sistemas de registro do laboratório, que são baseados na tradicional e restritiva
forma de transmitir os sinais eletrosiológicos por meio de cabos e que, não
raro, limitam as condições de experimentação.
• Há também restrições provocadas pelas caixas de condicionamento do com-

portamento animal disponíveis no laboratório, que são modelos comerciais
pouco exíveis e que não são apropriados para a realização de paradigmas
comportamentais retroalimentados com modicação dinâmica de parâmetros
experimentais.
• Com sólido know-how em engenharia, uma forte característica do NNC, inte-

ressa ao laboratório o desenvolvimento de ferramentas e equipamentos mais
acessíveis para pesquisa em neurociências, sobretudo para apoiar pesquisado-
res recém-formados na construção da infra-estrutura de seus laboratórios.
1.4 Objetivos
Objetivos Gerais
De um ponto de vista mais geral, são dois os objetivos deste trabalho de mestrado:
1. Desenvolver um sistema de registro de atividade eletrosiológica em múltiplos

canais, que seja apropriado para a realização de registros de longa duração e
que permita a coleta de dados eletrosiológicos em animais de laboratório ao
longo de paradigmas comportamentais em neurociências.
2. Desenvolver uma ferramenta para a realização de paradigmas comportamen-

tais customizáveis e retroalimentados com ratos e camundongos, que permita
modicar dinamicamente as condições de contorno experimentais.
Objetivos Especícos
De um ângulo mais especíco, podemos dividir cada um dos dois objetivos gerais
em subitens, a saber:
1. Sistema de registro:
(a) Projetar, construir e validar um sistema de registro com uma headstage

digital, capaz de transmitir dados de múltiplos eletrodos através de uma
quantidade reduzida de os (utilizando um protocolo de comunicação

serial), ou mesmo com transmissão sem o de dados (através de um pro-
tocolo de comunicação sem o). Esse sistema deve ser apropriado para
utilização em ratos e camundongos, que são animais comumente utilizados
no Núcleo de Neurociências da UFMG (laboratório onde este trabalho foi
desenvolvido). Suas especicações de projeto são apresentadas na Seção
1.6.
(b) Analisar e selecionar soluções disponíveis no mercado, para estabelecerem
a interface para eletrosiologia do sistema de registro proposto e a trans-
missão de dados eletrosiológicos por meio de comunicação sem o. Além
disso, eleger modelos de baterias e, se necessário, reguladores de tensão,
compatíveis com o nível da tensão de operação dos circuitos integrados
escolhidos do mercado e com a faixa de peso dos animais.
(c) Implementar rotinas em software responsáveis por realizar a aquisição de
sinais eletrosiológicos e transmiti-los a uma interface remota via comu-
nicação serial cabeada ou protocolo sem o.
headstage (a ser posicionada
(d) Projetar as placas de circuito impresso da
sobre a cabeça dos animais em experimentação) e da backpack (a ser
posicionada sobre as costas dos animais) e encaminhá-las para fabricação.
(e) Desenvolver uma interface de usuário amigável para conguração e ope-
ração intuitiva do sistema de registro sem o.
(f) Determinar as características físicas e de desempenho do sistema de re-
gistro proposto: tamanho, peso, máxima taxa de amostragem, autonomia
ou tempo de duração com alguns modelos de bateria, alcance da comu-
nicação sem o, entre outros.
(g) Validar o sistema de registro por meio da aquisição de sinais eletrosio-
lógicos e de sua comparação com sinais adquiridos por outro sistema de
registro, considerado como padrão de qualidade.
2. Ferramenta para a realização de paradigmas comportamentais:
(a) Projetar, construir e validar uma caixa de condicionamento microcontro-

lada. Em princípio, consideraremos o protocolo de condicionamento clás-
sico ao medo, realizado com estímulos auditivos (estímulo condicionado;
CS) e estímulos elétricos aversivos (choque; estímulo incondicionado; US),
por ser um paradigma comum no NNC. No entanto, o intuito é a utiliza-
ção futura da caixa em protocolos diversos. As especicações de projeto
da caixa são apresentadas na Seção 1.7.
(b) Especicar uma plataforma de hardware ou um microcontrolador com ca-

racterísticas (poder de processamento, número de pinos GPIO, periféricos
e interfaces para comunicação) que permitam a construção de uma caixa
de condicionamento exível e com capacidade de crescer e se adaptar a
novos contextos e paradigmas experimentais. A essa capacidade chama-
mos de escalabilidade, ou seja, a caixa construída neste trabalho deve ser
escalável.
(c) Implementar um tipo de estímulo condicionado, gerado por um sistema
de reprodução de áudio dentro da caixa de condicionamento. O som deve
ser um tom puro, possivelmente modulado em amplitude, e deve ter in-
tensidade, duração, frequência da portadora e frequência da moduladora
programáveis. Futuramente, outros estímulos do tipo CS devem ser in-
corporados à caixa.
(d) Implementar um tipo de estímulo incondicionado, gerado por um sistema
de estimulação elétrica aversiva por meio de barras eletricadas no as-
soalho da caixa. O estímulo elétrico deve ter sua duração e amplitude
programável. Em um momento posterior, outras formas de US devem ser
incorporadas à caixa.
(e) Determinar as características do CS e do US da caixa, demonstrando
sua conabilidade e capacidade de produzir respostas comportamentais
esperadas em protocolos de condicionamento clássico ao medo.
(f) Desenvolver uma interface amigável onde o experimentador possa operar
a caixa e programar o protocolo experimental que deseja executar.
(g) Por meio da realização de um protocolo de condicionamento clássico ao
medo, obter uma comprovação biológica da funcionalidade da caixa de-
senvolvida.
1.5 Revisão de Literatura

1.5.1 Eletrosiologia
O cientista inglês Richard Caton (1842 - 1926) é considerado aquele a descobrir a
natureza elétrica dos fenômenos associados ao funcionamento do cérebro (CATON,
1875). Em seus primeiros experimentos, que datam de 1875, ele utilizou um galvanô-
metro conectado a cérebros expostos de coelhos e macacos e mostrou ser possível
registrar em papel o perl das correntes iônicas produzidas dentro do cérebro.
Alguns anos depois, na década de 1880, o siologista polonês Adolf Beck (1863 -
1942) conseguiu medir, também com eletrodos na superfície do cérebro de animais,
alterações na atividade elétrica em decorrência de estimulação sensorial luminosa
(COENEN; FINE; ZAYACHKIVSKA, 2014). Esse experimento foi muito importante

pois revelou a possibilidade de medir potenciais evocados no cérebro.
No ano de 1924, o psiquiatra alemão Hans Berger (1873 - 1941), utilizando tam-
bém um galvanômetro, foi o primeiro a detectar em humanos as correntes iônicas
produzidas pelo cérebro, utilizando eletrodos posicionados no couro cabeludo de seus
pacientes (BERGER, 1931). Esse foi um marco muito importante, considerado por
muitos o início da eletroencefalograa, e contribuiu fortemente para que essa técnica
se disseminasse e progredisse.
Poucos anos depois, em 1932, o pesquisador G. Dietsch foi o primeiro a aplicar
uma técnica matemática (a análise de Fourier) para extrair dados numéricos dos
registros e analisá-los de maneira mais objetiva, marcando o início do que denomi-
namos EEG quantitativo (QEEG) (KAISER, 2005).
Já na década de 1950, o neurosiologista William Grey Walter (1910 - 1977) apre-
sentou suas contribuições à eletroencefalograa, mostrando que com a utilização de
eletrodos menores do que os utilizados por Hans Berger e em maior quantidade, seria
possível delinear mapas topográcos de ativação cerebral (WALTER et al., 1964).
Uma das primeiras aplicações dessa técnica foi tentar identicar regiões corticais
ictogênicas no cérebro de pacientes com epilepsia, por meio da localização espacial
de redes neurais responsáveis pela produção de disparos interictais, que são uma
assinatura eletrográca da desordem cerebral em questão (HARNER et al., 1986).
Com o passar dos anos, as técnicas de registro da atividade elétrica no cérebro se
aprimoraram bastante, sendo que hoje existem diversos tipos de eletrodos de regis-
tro, padrões de posicionamento de eletrodos e técnicas diversas para processamento
de sinais eletroencefalográcos (TEPLAN, 2002) (LOTTE et al., 2007) (BUZSÁKI;
ANASTASSIOU; KOCH, 2012). A depender do posicionamento dos eletrodos de re-
gistro, os sinais captados possuem características distintas e recebem nomenclaturas
particulares, como explicado a seguir.
Eletroencefalograa (EEG)
O termo eletroencefalograa é atribuído ao registro de potenciais por meio de
eletrodos no couro cabeludo (NIEDERMEYER; SILVA, 2005). Nesse caso, as in-
formações trazidas pelos sinais estão fortemente relacionadas à atividade neural em
camadas superciais do córtex, em um raio de aproximadamente 10 cm2 em torno
do eletrodo.
Eletrocorticograa (ECoG)
Por sua vez, a eletrocorticograa (ECoG) consiste em registrar a atividade neural
em regiões superciais do cérebro, diretamente no córtex, e não no escalpo, através
de eletrodos invasivos (ENGEL et al., 2005). Essa técnica possibilita a obtenção de

sinais com resolução espacial da ordem de 5 mm em torno do eletrodo e relação
sinal-ruído muito superior ao EEG, uma vez que os eletrodos de registro estão mais
próximos da fonte dos sinais elétricos. O próprio tecido cerebral e, principalmente,
o crânio, atenuam e distorcem os sinais elétricos produzidos dentro do cérebro e que
se propagam até o escalpo.
Potencial de Campo Local (LFP)

Também é possível detectar o perl de atividade elétrica associado a populações
locais de neurônios em regiões subcorticais. Nesse caso, os sinais de registro são
denominados potenciais de campo local ou local eld potential (LFP) e representam
a atividade conjunta de neurônios em um raio de até 3 mm em torno do eletrodo
(LEUNG, 1990).
Registros Multi-unitário
É possível ainda detectar potenciais de ação de um único neurônio (ANDER-
SEN; BLISS; SKREDE, 1971). Nesse tipo de registro, é exigida alta frequência de
amostragem, de 15 kHz a 20 kHz, para que os potenciais de ação tenham sua forma
de onda bem denida. Além disso, é comum que a atividade de mais de um neurônio
seja captada pelo eletrodo (por isso dizemos registro multi-unitário), mas os poten-
ciais de ação de neurônios diferentes geralmente possuem ocorrências e pers tem-
porais distintos, o que permite sua discriminação por meio de técnicas como análise
em componentes principais ou análise em componentes independentes (LEWICKI,
1998).
Componentes Principais de um Sistema de Registro Eletro-

siológico
A digitalização dos sinais eletrosiológicos cerebrais requer um elaborado circuito
de condicionamento de sinais, como mostra a Figura 1.1, retirada do site da Intan
Technologies (fabricante do chip RHD2000, utilizado nesse trabalho).
O circuito se inicia com os eletrodos de registro, que formam uma interface
eletroquímica que converte as correntes iônicas siológicas em potenciais elétricos.
Uma vez que a amplitude desses biopotenciais é muito pequena (da ordem de µV ),
é necessário amplicá-los para que se consiga obter uma boa relação sinal-ruído com
os conversores analógico-digitais existentes.
Em alguns sistemas, existe um estágio inicial de pré-amplicação, com amplica-
dores de instrumentação posicionados o mais próximo possível do animal, geralmente
sobre a cabeça, com o objetivo de tornar os biopotenciais menos susceptíveis aos ar-
tefatos de movimento do cabo de conexão ao sistema de aquisição de sinais. Uma
vez que a linha de base (valor médio) dos sinais pode não estar em torno de 0 V com
relação à referência do circuito de aquisição, o ganho deve ser pequeno (da ordem
de 10 vezes) para que não haja saturação dos pré-amplicadores nesse estágio.
Em seguida, ltros passa-altas são usados para colocar a linha de base dos sinais
próxima de 0 V, bem como para atenuar oscilações indesejadas de baixa frequência.
No terceiro estágio, novamente são usados amplicadores de instrumentação,
responsáveis por elevar ainda mais a amplitude dos sinais eletrosiológicos a uma
faixa apropriada para os conversores analógico-digitais utilizados em estágio pos-
terior (amplitude da ordem de Volts). Aqui, o ganho pode ser bem mais elevado
(da ordem de até 100 vezes), pois não há tanta preocupação com a possibilidade
de saturação, já que os sinais de baixa frequência já foram atenuados no estágio
anterior.
No quarto estágio, são usados ltros passa-baixas para atenuar oscilações indese-
jadas de alta frequência que não carregam informações biológicas, sendo atribuídas
a outras fontes. A frequência de corte ideal para o ltro passa-baixas deve satisfazer
o critério de Nyquist, ou seja, deve ser menor que ou igual à metade da frequência
de amostragem, para que oscilações de alta frequência não sejam equivocadamente
interpretadas como de baixa frequência (efeito denominado aliasing ).
Na etapa seguinte, pode haver vários conversores AD (um por canal) ou um
multiplexador analógico que permite a amostragem de vários canais usando um único
conversor AD. Finalmente, os sinais são digitalizados e enviados a um computador.
1.5.2 Sistemas de Registro Eletrosiológico com Transmissão

Sem Fio de Dados
Os sistemas de registro com transmissão analógica cabeada dos sinais eletrosi-
ológicos a um sistema remoto de amplicação, ltragem e digitalização apresentam
limitações importantes que reetem nos protocolos experimentais em neurociências.
Por exemplo, nessa arquitetura, os sinais medidos estão susceptíveis à interferên-
cia eletromagnética do ambiente, sobretudo quando o cabo de conexão se movi-
menta, provocando o que designamos artefatos de movimento (SIA; MACNEIL;
SIGG, 1971). Esses artefatos quase sempre se manifestam em uma região do es-
pectro de frequências que corresponde também à região do sinal eletrosiológico,
dicultando consideravelmente sua eliminação por meio de técnicas clássicas de pro-
cessamento de sinais. Portanto, é comum se deparar com situações em que os sinais
eletrosiológicos obtidos durante um experimento foram gravemente contaminados
com artefatos de movimento, impossibilitando a análise das informações biológicas
que caram escondidas no registro ruidoso.
Figura 1.1: Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico (retirado do site

da Intan Technologies).
Uma estratégia para contornar o problema dos artefatos de movimento consiste

em transferir parte do sistema de amplicação para sobre a cabeça dos animais
(MORAES; GALVIS-ALONSO; GARCIA-CAIRASCO, 2000) (WANG et al., 2014),
para aumentar a amplitude dos sinais antes de transmiti-los pelo cabo. Isso tem o
efeito de atenuar o impacto dos artefatos de movimento.
Nos últimos anos, graças ao desenvolvimento tecnológico, tornou-se possível pro-
duzir em escalas miniaturizadas (da ordem de milímetros) circuitos integrados com
todos os componentes do circuito de condicionamento de biopotenciais. Uma con-
sequência imediata disso foi o surgimento de headstages contendo todos os estágios

de amplicação e condicionamento, com ganhos de até 5000 vezes antes da trans-
missão pelo cabo. Isso diminui ainda mais os efeitos dos artefatos de movimento,
otimizando a relação sinal-ruído dos registros e protegendo as informações inerentes
ao sistema biológico.
No entanto, em headstages analógicas, cada canal de registro acrescenta um o
no cabo de conexão ao sistema de aquisição, dicultando a monitoração em uma
quantidade elevada de canais, como 64, por exemplo. Uma estratégia para evitar
esse problema é integrar conversores analógico-digitais às headstages, de forma que
os dados de todos os canais possam ser transmitidos serialmente em uma quantidade
reduzida de os, utilizando um protocolo de comunicação digital, como USB, UART,
SPI, I2C, entre outras (WANG et al., 2014). Com isso, os cabos de conexão podem
ser mais sutis e leves.
Não obstante todos esses avanços, os neurocientistas ainda sentem as restrições
provocadas pela transmissão cabeada de biopotenciais. Além de distrair os animais
durante paradigmas comportamentais, a presença desse cabo de conexão pode causar
estresse, prejudicar a coleta de dados comportamentais e até mesmo impossibilitar
experimentos cientícos (como é o caso de um experimento com registro simultâneo
em múltiplos animais para pesquisa em comportamento social). Isso força a elabo-
ração de protocolos experimentais simplicados e limita o alcance da investigação
cientíca.
Em vista disso, nos últimos anos, grande esforço tem sido empregado no desen-
volvimento de sistemas sem o para eletrosiologia. Os parágrafos seguintes contêm
considerações sobre alguns trabalhos relatados na literatura que nos despertaram o
interesse. Em seguida, apresentamos também uma tabela que resume as principais
características de alguns dos sistemas discutidos.
O trabalho de Ghomashchi et al. (2014), ilustrado na gura 1.2, mostra um
sistema baseado em Bluetooth, extremamente barato (o sistema completo custa
menos que US$100,00) e de relativa fácil implementação, uma vez que é baseado
em componentes comerciais, que são: o chip ADS1298 da Texas Instruments para
eletrosiologia, o módulo PAN1721 da Panasonic para transmissão em Bluetooth
(módulo baseado no chip CC2541 da Texas Instruments), conector de 14 pinos para
eletrodos da Advanced Interconnections, bateria modelo CR2032 e um conversor
step-up para fornecer tensão regulada de 3V.
Um aspecto negativo do sistema apresentado é a máxima taxa de transmissão de
dados, de apenas 50 kbps, que limita a frequência de amostragem total a empregar
nos experimentos. Segundo o autor, esta limitação é decorrente do protocolo utilizado
para comunicação sem o, o Bluetooth 4.0 BLE. Apesar de não estar claro no texto
do artigo a utilidade do sistema para o grupo de pesquisa em questão, sua validação
foi feita com registros de potenciais evocados no córtex visual primário de um rato,
Figura 1.2: Sistema de registro sem o com tecnologia Bluetooth, baseado no chip
ADS1298 da Texas Instruments e no módulo PAN1721 da Panasonic. Adaptado de
Ghomashchi et al. (2014).
através da modulação a 4 Hz da luminosidade no ambiente experimental.

Motivado pelo interesse em monitorar os disparos de neurônios do hipocampo
durante atividade exploratória de ratos, o trabalho de Hampson, Collins e Deadwy-
ler (2009) mostra o sistema de registro construído por eles, que também utiliza
Bluetooth para transmissão de dados. Neste trabalho, foi adotada uma estratégia
interessante para otimizar a relativa baixa taxa de transmissão de dados conseguida
por eles com o protocolo Bluetooth V2.0 (115200 bits por segundo; módulo Blu-
eGiga Wraptor WT12): são transmitidos apenas trechos de 1 ms com a forma de
onda dos potenciais de ação detectados por um microcontrolador (dsPIC30F6010),
amostrados a 25 kHz, em 16 canais. Cada potencial de ação é transmitido junto
com um marcador para sua localização temporal ao longo do experimento. A inter-
face para eletrosiologia consiste de uma modicação da headstage T16G100 (TBSI
Inc.). Esse sistema está ilustrado na gura 1.3.
Além da reduzida velocidade de comunicação sem o, um ponto que consideramos
negativo neste trabalho é o peso do sistema: a headstage tem 16,5 g e a backpack
43,8 g. Tendo como base o peso de ratos Wistar na fase adulta (aproximadamente
270 g), animais muito utilizados na pesquisa cientíca realizada pelo NNC, julgamos
que o sistema de registro apresentado por aquele autor pode causar fadiga e estresse,
Figura 1.3:Sistema de registro sem o com microcontrolador PIC, uma headstage

T16G100 modicada (TBSI Inc.) e transmissão Bluetooth com o módulo BlueGiga
Wraptor WT12. Adaptado de Hampson, Collins e Deadwyler (2009).
pois corresponde a mais de 20% do peso dos animais (como será visto na Seção 1.6,
consideramos 5% do peso do animal na fase adulta um valor apropriado para o peso
do sistema de registro).
Um sistema simples para registro sem o, mas que integra o conceito de opto-
genética à headstage é o apresentado no artigo de Ameli et al. (2013). O sistema é
simples porque possui apenas dois canais para registro eletrosiológico, com resolu-
ção de apenas 8 bits, e um único canal para estimulação óptica com optogenética. O
sistema completo pesa apenas 7,4 g e taxa de transmissão de dados é de 320 kbits/s
(20 kHz em cada um dos dois canais de 8 bits), implementada com o módulo CC430
da Texas Instruments (tem suporte para comunicação por rádio frequência na faixa
sub-1 GHz). A alimentação do circuito da headstage é feita por um supercapaci-
tor, periodicamente recarregado através de um sistema de transferência de energia
por acoplamento indutivo (KIANI; JOW; GHOVANLOO, 2011) (RAMRAKHYANI;
MIRABBASI; CHIAO, 2011).
Por sua vez, objetivando registrar a atividade eletrosiológica durante paradig-
mas comportamentais em ratos, um grupo de pesquisa da universidade de Harvard
(SZUTS et al., 2011) projetou um sistema de registro sem o de 64 canais, com
elevada taxa de transmissão de dados (mais de 20 Mbits/s). A comunicação sem o
é baseada em transmissão serial por rádio frequência a 2,380 GHz, com o módulo
SDX-21LP, muito utilizado em aplicações que requerem stream de vídeo em tempo
real (por isso a taxa de transmissão do sistema é elevada). É interessante notar
que, nesse sistema, a digitalização dos sinais não é realizada na headstage, nem na
backpack. Os dados são transmitidos analogicamente e digitalizados logo após o sis-
tema receptor dos sinais de RF, que ca acoplado a um computador remoto com a
interface do sistema de registro. Foi possível detectar ruído de aproximadamente 4
µV na transmissão dos sinais e no algoritmo de reconstrução, bem como uma ligeira
distorção dos sinais devida à não-linearidades no circuito transmissor. A autonomia
do sistema, que é alimentado por duas baterias CR2 de 3 V, é de 6 horas. Mais
uma vez, salientamos a questão do peso do sistema, que parece-nos excessivo para
utilização em ratos adultos com tipicamente 270 g: a headstage pesa 27 g e backpack
pesa 40 g.
Figura 1.4: Sistema de registro eletrosiológico com um chip Neuroplat e transmissão

sem o de dados via rádio frequência (módulo SDX-21LP). (a) Visão geral dos
componentes do sistema; (b) Foto de um rato carregando o sistema sem o quando ele
aparece na extremidade do tubo (objeto do contexto experimental); (c) Taxa de disparo
de um neurônio inibitório na região V1 do córtex motor primário, quando o animal deixa
o interior do tubo (três ocasiões separadas). Deniu-se t = 0 seg como o instante em que
os olhos do animal atravessaram o plano imaginário na extremidade do tubo. Essa gura
foi adaptada de Szuts et al. (2011).
Já no trabalho de Miranda et al. (2009), é apresentado um dos sistemas que mais

nos chamou a atenção. Sua taxa de transmissão de dados é de 24 Mbits/s e permite
empregar uma frequência de amostragem de 30 kHz em cada um dos 32 canais

do sistema. A transmissão sem o é feita através de modulação por chaveamento
de frequência ou FSK (frequency-shift keying ) de uma portadora com frequência
ajustável de 3,7 GHz a 4,1 GHz. Além disso, a autonomia do sistema é extremamente
elevada: com duas baterias LS14250 de 3,6 V, o sistema funciona ininterruptamente
por 33 horas. O autor ressalta a importância desse sistema, que já se encontra em
sua terceira versão (duas versões anteriores em Santhanam et al. (2007) e Chestek et
al. (2009)), para a pesquisa que seu laboratório conduz em primatas não-humanos
da espécie rhesus monkey. A pesquisa é centrada no desenvolvimento de próteses
neurais para a reabilitação de pessoas com deciências motoras provocadas por lesões
no cérebro (SCHWARTZ, 2004).
Um dos sistemas mais impressionantes que captamos na revisão bibliográca é
mostrado no trabalho de Yin et al. (2014), que apresenta um sistema de registro com
100 canais, com capacidade para transmitir até 200 Mbits/s (7,8 kHz/canal) por um
link de comunicação sem o. Com apenas uma bateria LS14250, o sistema é capaz
de operar por 48 horas, consecutivamente. O sistema é utilizado em primatas rhesus
monkey, para a realização de protocolos experimentais que se inserem no tema das
interfaces cérebro-máquina. O peso da headstage, de mais de 40 g, não é apropriado
para utilização em roedores. Esse sistema encontra-se ilustrado na gura 1.5.
Figura 1.5: Sistema de registro utilizado em primatas rhesus monkey, com transmissão
sem o de dados eletrosiológicos de 100 canais a 7,8 kHz/canal. (a) Projeto 3D assistido
por computador (CAD) dos componentes do neurosensor sem o; (b) Ilustração do
experimento realizado para validação in vivo do sistema desenvolvido. A seta vermelha
indica o neurosensor sem o; (c) Trechos de 3 segundos dos sinais adquiridos em 96
canais com o sistema de registro sem o; (d) Representação do neurosensor em diagrama
de blocos; (e) Trecho de 1 segundo do sinal coletado no canal 6. De cima para baixo: sinal
original (sem tratamento), ocorrências de disparos de 3 neurônios, sinal ltrado com ltro
passa-altas e, por m, potencial de campo local (sinal ltrado com ltro passa-baixas).
Adaptado de: Yin et al. (2014).
Outro trabalho interessante é o de Ativanichayaphong et al. (2008), em que um

grupo de pesquisa americano elaborou um sistema sem o para registro e estimulação
elétrica em ratos, com o propósito de estudar o processamento da dor e os efeitos da
estimulação elétrica da medula espinhal como uma possível terapia para tratamento
de dor crônica em humanos. O sistema pesa cerca de 38 g, utiliza duas baterias
2CR-1/3N de 6 V e funciona continuamente por aproximadamente 6 horas. Neste
trabalho, a taxa temporal de disparos neuronais na medula espinhal é tomada como
medida de dor e é estimada em tempo real por meio de uma rotina em software
LabVIEW, com o intuito de ativar o estimulador elétrico quando o nível de dor
ultrapassa um valor pré-determinado.
Um sistema que também despertou muito o nosso interesse devido à sua capaci-
dade de acionar um sistema de estimulação elétrica com base na atividade do cérebro
é relatado em Angotzi et al. (2014). O sistema processa em tempo real os sinais ele-
trosiológicos de 8 canais, que são transmitidos por FSK a 2,4 GHz, e aciona 8
canais para estimulação bifásica, com frequência, amplitude e duração programáveis
via interface de usuário.
A Tabela 1.1 resume as principais características de alguns dos sistemas que
abordamos. Os parâmetros levados em conta para a organização dessa tabela são
importantes para os desenvolvedores e/ou usuários do sistema de registro. O número
de canais e a taxa de transmissão de dados, por exemplo, se relacionam com os
tipos de registro eletrosiológicos passíveis de se realizar. Além disso, o alcance da
comunicação sem o merece atenção pois deve ser compatível com o tamanho do
ambiente experimental pretendido. O peso dos componentes do sistema, por sua vez,
é extremamente relevante pois deve ser leve o suciente para ser carregado pelos
animais em que se pretende utilizar o sistema de registro. Consumo e autonomia
também podem denir se um determinado protocolo experimental é realizável ou não
com o sistema em questão. Por m, importa-nos saber se os sistemas construídos em
outros laboratórios são baseados em componentes comerciais ou não para avaliarmos
a tendência mundial no desenvolvimento de soluções para pesquisa em neurociências.
1.5.3 Caixas de Condicionamento do Comportamento Ani-

mal e Paradigmas de Condicionamento Clássico e Ope-
rante
Os paradigmas comportamentais em neurociências consistem em protocolos que
têm o intuito de originar e/ou avaliar processos cerebrais relevantes no estudo. Por
exemplo, em estudos que envolvem memória em ratos, um procedimento comum
para excitar a memória dos animais é submetê-los a uma tarefa de reconhecimento
social (ENGELMANN; LANDGRAF, 1994), na qual eles são postos em contato
com o cheiro de outro animal, com o qual já tiveram contato anteriormente. O
Tabela 1.1: Compilação das características principais de alguns sistemas sem o para
registro de atividade eletrosiológica relatados na literatura.
tempo ao longo do qual o animal direciona sua atividade ao processamento do olfato

(parâmetro geralmente medido por análise de vídeo), é uma medida que pode revelar
se o animal se lembrou ou não do seu colega (os ratos tendem a explorar/cheirar por
mais tempo quando não reconhecem).
A análise do comportamento do animal em paradigmas comportamentais pode
revelar importantes evidências a respeito dos processos cerebrais em estudo (SHET-
TLEWORTH, 2001) e apoiar a investigação cientíca sobre aprendizado (WAG-
NER; RUDY; WHITLOW, 1973), ansiedade (LANG; DAVIS; ÖHMAN, 2000), medo
(PHELPS; LEDOUX, 2005) e até mesmo processos mais complexos, como a intera-
ção social (WEY et al., 2008). Além disso, estudos baseados em paradigmas compor-
tamentais também contribuem para avaliação do efeito de fármacos em distúrbios e
funções do cérebro (OHYAMA et al., 2016).
O condicionamento operante e o condicionamento clássico são paradigmas tradi-
cionais e consolidados na neurociência para o estudo do aprendizado e da memória.
O condicionamento operante consiste em manipular, dentro de um esquema de re-
compensa/punição, estímulos discriminativos no contexto do experimento (como
som, luz ou imagens em uma tela), para desencadear no animal um processo de
aprendizagem associativa, que permite investigar a interação entre circuitos neu-
rais durante processos sensório-motores e cognitivos (NARGEOT; SIMMERS, 2011)
(ISHIKAWA et al., 2014).

Por sua vez, o condicionamento clássico, concebido por Ivan Pavlov (1849 - 1936),
também envolve o aprendizado associativo, mas consiste em um processo de apren-
dizagem no qual respostas inatas em animais (e.g., como medo ou salivação), natu-
ralmente evocadas por estímulos incondicionados (US) (por exemplo, choque elétrico
ou cheiro de comida) passam a ser evocadas por estímulos condicionados (CS), ou
seja, naturalmente neutros (como estímulos sonoros ou estímulos visuais em uma
tela de LCD) e que se tornaram importantes após um protocolo de apresentação pa-
reada dos dois estímulos (ROGAN; STÄUBLI; LEDOUX, 1997) (ERLICH; BUSH;
LEDOUX, 2012) (LIKHTIK et al., 2014). Um esquema ilustrativo de um protocolo
típico de condicionamento clássico ao medo está mostrado na gura 1.6.
Figura 1.6: Ilustração explicativa de um protocolo de condicionamento clássico ao

medo. Adaptada de Maren, Phan e Liberzon (2013).
Dito isso, com o intuito de sistematizar a investigação cientíca baseada em

paradigmas comportamentais em animal, o psicólogo behaviorista B. F. Skinner
(1904 - 1990) idealizou a chamada caixa de Skinner ou caixa de condicionamento. Nos
primeiros experimentos com essa caixa, ela era equipada com alavancas ou botões
cujo acionamento feito pelo próprio animal ocasionava a entrega de água ou comida
(reforço para o comportamento) (SKINNER, 1990) (SKINNER, 1953). No entanto,
com o passar do tempo, as caixas de condicionamento se aprimoraram bastante,
passando a incorporar estímulos discriminativos, como som e luz dentro da caixa, e
estímulos punitivos, como choque elétrico com amplitude controlada (DUNCAN et
al., 1970) (BABICH et al., 1965) (PINEÑO, 2014) (LACY; STRICKLAND; SMITH,
2014), dentre outros recursos para experimentação cientíca.
No NNC, o uso de caixas de condicionamento é muito comum. Um trabalho
muito interessante realizado recentemente é o de Mourão et al. (2015) em que, por
meio da realização de um paradigma de condicionamento clássico ao medo em ratos
submetidos a microestimulação elétrica no complexo amigdaloide, ele pode revelar
aspectos temporais da codicação feita pelo cérebro da informação sensorial. Em
seus experimentos, ele utilizou um modelo de caixa comercializada por uma empresa
brasileira chamada Insight. Esta caixa permite congurar apenas a amplitude do
choque na faixa de 100 µA a 1000 µA e a duração dos estímulos auditivos.
1.6 Especicações de Projeto do Sistema de Regis-

tro Proposto
Alguns dos requisitos apresentados a seguir são comuns a qualquer sistema de
registro, seja ele cabeado ou sem o, como número de canais, taxa de rejeição em
modo comum dos bioamplicadores, etc. Por outro lado, alguns são mais aplicáveis
aos sistemas sem o, como peso e autonomia (tempo de duração da bateria). Abaixo,
seguem as nossas especicações para o projeto do sistema de registro, baseadas no
conhecimento que temos das características dos sinais biológicos e das necessidades
experimentais, como utilização em ratos e camundongos adultos.
• O nível de ruído referente aos eletrodos de registro deve ser menor do que 5
µV pico a pico.
• Os bioamplicadores devem ter relação de rejeição em modo comum (CMRR)

superior a 80 dB1 , valor que julgamos aceitável para registro com eletrodos
invasivos, como é o caso do presente trabalho.
• O sistema deve possuir no mínimo 16 canais e ter desejável escalabilidade nesse

aspecto, ou seja, o sistema deve ser facilmente adaptável para aumentar em
número de canais, uma vez que esta é uma característica importante de todo
sistema de registro.
• A taxa de transmissão de dados eletrosiológicos (taxa efetiva, não levando em

consideração o overhead do protocolo de comunicação) deve ser superior a 2
Mbits/s. Considerando que uma amostra é representada por 16 bits, esta taxa
permitiria uma frequência de amostragem total de 125 kHz (por frequência de
amostragem total, nos referimos à soma das frequências de amostragem em-
pregadas em cada canal utilizado no experimento). Dessa forma, poderíamos
elaborar um experimento com amostragem de 25 kHz em 5 canais, 12,5 kHz
em 10 canais, 5 kHz em 25 canais, dentre outras possibilidades.
1 No caso ideal, um amplicador diferencial possui ganho de modo-comum nulo, ou seja, ele
elimina por completo os sinais de modo comum aplicados em suas entradas não-inversora (V + )
e inversora (V- ). Sua saída VOut é então determinada pela equação VOut = AD × (V + −
V - ), em que AD é o valor do ganho diferencial do amplicador. No entanto, os amplicadores
diferenciais apresentam, na prática, ganho de modo-comum (ACM ) não-nulo, e sua tensão de saída
é determinada pela equação VOut = AD × (V + − V - ) + 1/2 × ACM (V + + V - ). A relação de
rejeição de modo-comum é determinada pela razão entre os ganhos diferencial e de modo-comum,
segundo a equação CM RR = AD /ACM
• O ganho dos bioamplicadores e a resolução do conversor AD utilizado para di-

gitalização dos sinais eletrosiológicos devem ser tais que o erro de quantização
seja menor do que 0,5 µ V com relação aos eletrodos de registro (é interessante
que o ganho dos amplicadores seja programável, mas não consideramos isso
uma restrição de projeto).
• A relação entre o consumo total do sistema sem o e a capacidade da bateria

utilizada para alimentação do circuito deve permitir a realização de experimen-
tos com registro ininterrupto por, no mínimo, uma hora. Sabemos que quanto
maior a autonomia do sistema de registro sem o, mais interessante ele se torna
e maiores são as possibilidades de investigação cientíca. Por exemplo, um sis-
tema sem o para registro com duração da ordem de 10 horas seria apropriado
para o estudo da atividade cerebral durante o sono. Ou, uma autonomia tão
longa quanto 24 horas possibilitaria a realização de estudos sobre a dinâmica
de redes neurais ictogênicas por meio da análise da atividade eletrosiológica
de estruturas corticais e subcorticais em modelos animais de crises convulsi-
vas espontâneas, uma área de estudo que é especialmente interessante para
o NNC. No entanto, temos ciência de que uma autonomia de 1 hora já será
suciente para a realização de diversos protocolos experimentais de interesse
para o NNC.
• O peso da headstage não deve exceder 1 g. Essa restrição se deve principalmente

ao peso reduzido de camundongos adultos, que é de 25 g a 30 g. Já no caso do
sistema com transmissão sem o de dados, consideramos que o sistema será
utilizado apenas em ratos adultos, de forma que a backpack deve pesar menos
que 13 g (aproximadamente 5% do peso de um rato adulto, que é cerca de
270 g). Uma backpack com peso apropriado para os camundongos, apesar de
ser de grande interesse, é um desao muito grande que não consideramos uma
restrição de projeto.
1.7 Especicações de Projeto da Caixa de Condi-

cionamento Proposta
Tendo em vista que a realização de protocolos de condicionamento clássico ao
medo (que envolve estímulos auditivos e estímulos elétricos aversivos) é muito comum
no NNC, consideramos válido especicar no projeto da nossa caixa customizável os
estímulos condicionado e incondicionado de som e choque, respectivamente, com a
característica adicional de que eles sejam mais exíveis (com relação à programação
de suas características) do que nas caixas comerciais disponíveis no laboratório. Não
obstante, o projeto da caixa deve permitir, com relativa facilidade e sem grandes
modicações, que outros tipos de estímulos e recursos sejam incorporados ao sistema,

como estimulação visual por meio de luz estroboscópica, controle de acesso à comida
e água por meio do acionamento de servomotores, entre outros.
Abaixo, seguem as especicações de projeto da caixa de condicionamento custo-
mizável:
• A caixa de condicionamento deve ter uma interface de usuário amigável, que

permite sua operação e programação dos estímulos condicionado e incondicio-
nado de maneira fácil e intuitiva.
• As dimensões da caixa devem ser, aproximadamente, 30 cm x 20 cm x 20 cm

(comprimento x largura x altura), típicas das caixas comercialmente disponí-
veis.
• O CS a ser desenvolvido é a reprodução de estímulos auditivos.
• O estímulo sonoro da caixa deve ser um tom puro com possibilidade de modu-
lação em amplitude. Os parâmetros duração, intensidade, frequência da porta-
dora e frequência da moduladora do som devem ser programáveis. Além disso,
a intensidade sonora máxima medida dentro da caixa de condicionamento deve
ser igual ou superior a +110 dB. Estabelecemos esse requisito de projeto por-
que parte da pesquisa em epilepsia no NNC utiliza ratos Wistar audiogênicos
(WAR) como modelo de crises convulsivas audiogênicas ou reexas, sendo que
a indução dessas crises ocorre por estimulação sonora em intensidade próxima
de +110 dB.
• O US a ser desenvolvido é a estimulação elétrica aversiva.
• O estímulo elétrico aversivo deve ter amplitude ajustável entre 400 µA e 1000
µA e deve ser aplicado sequencialmente através das barras que formam o piso
da caixa, na forma de pulsos de corrente elétrica (alternada ou contínua) com
alguns milissegundos de duração.
• Os parâmetros programáveis do estímulo elétrico aversivo devem ser: dura-

ção do estímulo (tempo total de aplicação de choque), duração dos pulsos de
corrente e intensidade do choque.
1.8 Estado da Arte da Tecnologia

1.8.1 Circuitos Integrados Comerciais para Eletrosiologia
Nosso interesse principal não consiste em projetar e construir circuitos eletrô-
nicos customizados, mas em identicar componentes comerciais apropriados para
compor o sistema de aquisição de sinais eletrosiológicos, incluindo amplicação,

ltragem e digitalização dos sinais, bem como uma interface digital tradicional para
comunicação, como USB, UART, SPI ou I2C. Acreditamos ser possível, a partir
dos módulos e chips comerciais recentemente desenvolvidos, encapsular todos esses
aspectos do sistema e acelerar o processo de desenvolvimento do sistema.
Em nossa busca pelos componentes comercializados, alguns nos chamaram mais
a atenção, em especial os circuitos integrados da Texas Instruments e os da Intan
Technologies. Esses chips, em encapsulamentos tão pequenos quanto 8 mm x 8 mm,
possuem elevado grau de integração, dispondo de todo o sistema de aquisição e
digitalização de sinais biológicos, além de uma interface SPI para comunicação serial.
Suas principais características foram reunidas na Tabela 1.2.
Pela tabela, podemos notar que alguns parâmetros são mais favoráveis aos chips
da Texas Instruments, como a faixa de preço (abaixo dos US$100,00) e a resolução
do conversor AD (24 bits), por exemplo. Além disso, esses chips possuem elevada
relação de rejeição em modo comum (110 dB no ADS1299 e 115 dB no ADS1298).
Não obstante essas características, optamos pelos chips da Intan, pelos seguintes
motivos:
1. Os chips da Intan possibilitam o registro em uma quantidade maior de canais

(até 32 no mesmo chip), além de possuírem recurso para medição da impedân-
cia dos eletrodos de registro in situ, facilitando a detecção de eletrodos com
algum tipo de defeito ou irregularidade.
2. Em aplicações com eletrodos invasivos (que é o nosso caso), em que a relação

sinal-ruído tende a ser muito melhor do que nas aplicações com eletrodos de
superfície, a CMRR de +82 dB dos chips da Intan é, ao nosso ver, suciente.
3. A largura de banda dos bioamplicadores é programável via interface periférica

serial, tornando o chip exível para a aquisição de sinais biológicos de carac-
terísticas distintas, como ECG, EEG, potenciais de ação, entre outros (cabe
observar que, apesar de a largura de banda ser programável, não é possível
congurar ltros diferentes para canais individuais, ou seja, essa conguração
é comum a todos os canais).
4. Acreditamos que as soluções da Intan se desenvolverão mais rapidamente do

que as soluções da Texas, já que a primeira é uma empresa especializada em ele-
trosiologia miniaturizada e concentra todo o seu esforço no desenvolvimento
dessas soluções.
5. Os sistemas de registro da Open Ephys (abordada no nal da Seção 1.3) são ba-
seados na família RHD2000, de forma que, baseando também nossos projetos
nesses mesmos chips, estaremos facilitando uma possível colaboração com essa
Tabela 1.2: Compilação das características principais dos circuitos integrados que
julgamos interessantes para a interface de eletrosiologia.
comunidade de neurocientistas, bem como favorecemos a utilização e adapta-

ção, de nossa parte, das soluções disponibilizadas por ela.
Durante a revisão bibliográca e busca pela internet, tomamos conhecimento de

outras empresas que comercializam soluções miniaturizadas e completas para pes-
quisa em neurociências, incluindo sistemas para eletrosiologia. É o caso da Neu-
ralynx e a Blackrock Microsystems, cujos sistemas merecem especial atenção por
serem extremamente modernos e completos. Esta última, por exemplo, divulgou em
seu site que em breve disponibilizará para o mercado um sistema digital de registro
com metodologia o.
Cientes de que essas soluções de mercado são extremamente relevantes para a
pesquisa em neurociências, ressaltamos, no entanto, que o caráter delas é essencial-
mente comercial, uma losoa diferente da que procuramos incorporar e desenvolver
com este trabalho (a losoa de código aberto e de baixo custo).
1.8.2 Circuitos Integrados Comerciais para Transmissão Sem

Fio de Dados
Nos últimos anos, surgiu no mercado um número elevado de módulos com ca-
pacidade de comunicação sem o e com características muito distintas de consumo,
capacidade de transmissão de dados, protocolo de comunicação, entre outras. Dessa
forma, muito difícil seria contemplar todos eles no escopo deste trabalho. Apesar
disso, tivemos a oportunidade de encontrar alguns módulos que merecem nossa aten-
ção. Eles e suas características principais estão agrupados na Tabela 1.3.
Tabela 1.3: Compilação das características principais dos circuitos integrados que
julgamos interessantes para transmissão sem o de dados.
O nRF24 e o CC3100 não possuem um microcontrolador programável integrado

aos módulos e funcionam apenas como uma ponte serial-wireless. Eles, portanto,
requerem o uso de um microcontrolador externo, mas essa arquitetura parece-nos
pouco interessante.
Por outro lado, todos os outros módulos que constam na Tabela 1.3 possuem
microcontrolador integrado. Os chips da Espressif se destacam por seu elevado poder
de processamento (80 MHz no ESP8266 e 240 MHz no ESP32) e elevada capacidade
de transmissão de dados via WiFi (54 Mbits/s no ESP8266 e 150 Mbits/s no ESP32).
No entanto, o ESP32 parece ainda não estar disponível para comercialização. No
mínimo, sua aquisição é ainda muito restrita.
Optamos por trabalhar com o módulo ESP8266 pelos seguintes motivos:
1. Produto acessível (aproximadamente US$5,00) e já amplamente comerciali-

zado.
2. Possui microcontrolador integrado programável e com elevado poder de proces-

samento, com um clock de 80 MHz, sendo ainda possível alterá-lo via software
para 160 MHz.
3. O protocolo WiFi (IEEE 802.11 b/g/n) possibilita elevada taxa de transmissão

de dados, de até 54 Mbits/s com o protocolo UDP, o que o torna apropriado
para transmissão de grande quantidade de dados eletrosiológicos por unidade
de tempo.
1.8.3 Baterias para Alimentação do Sistema de Registro

A bateria é um elemento muito importante dos sistemas de registro sem o. Sua
capacidade de carga geralmente tem relação direta com o seu peso e tamanho, de
forma que baterias que duram mais tempo para uma determinada taxa de descarga,
tendem a ser maiores e mais pesadas.
Estamos cientes de que sistemas de registro sem o muito pesados ou grandes
podem se tornar inutilizáveis em pequenos animais, ao passo que sistemas com auto-
nomia reduzida podem se tornar pouco interessantes frente aos sistemas tradicionais
com eletrônica cabeada, que são alimentados diretamente pela rede elétrica ou por
baterias maiores que não necessitam ser carregadas pelo próprio animal. Por con-
sequência, a escolha da bateria deve ser criteriosa e deve apresentar uma relação de
compromisso entre tamanho/peso e tempo de duração.
Em nossa tentativa de identicar modelos adequados ao nosso sistema de registro,
nos demos conta de que existem poucas opções que nos atendem tanto na faixa de
consumo em que estamos operando (70 a 100 mA) quanto na faixa de peso desejada
para o sistema de registro (no máximo 13 g). Elaboramos a Tabela 1.4 para resumir
as principais características daquelas que julgamos interessantes, algumas das quais
estão presentes em sistemas de registro sem o relatados na literatura e discutidos

na Seção 1.5.2.
Tabela 1.4: Alguns modelos comerciais de baterias interessantes para aplicações com
sistemas de registro sem o.
As baterias CR2032 (3 V) e similares (LIR2032, CR2025, CR2016, entre outras)

são mais leves e mais apropriadas para aplicações com consumo relativamente re-
duzido, da ordem de 1 mA (relógios de pulso são uma aplicação muito comum).
Quanto ao ESP8266, entretanto, a corrente elétrica exigida por ele (60 mA com pul-
sos superiores a 100 mA durante a transmissão de pacotes WiFi) é muito superior
à faixa apropriada para aquelas baterias, de tal forma que elas não são apropriadas
para o nosso sistema.
Por sua vez, as baterias CR2 (3 V) são mais apropriadas para aplicações que
envolvem consumo de até algumas dezenas de mA. Elas são comumente utilizadas
em câmeras fotográcas menos modernas e conseguem manter seu nível de tensão
mesmo quando dela são exigidos pulsos de corrente de até 2500 mA (valor típico ne-
cessário para produzir o ash de luz nas câmeras). Essa característica é interessante
pois sugere que o modelo CR2 responde bem aos pulsos de corrente elétrica inerentes
ao envio de dados via antena WiFi do ESP8266. Além disso, modelos recarregáveis
dessa bateria são facilmente encontrados para aquisição. Como será visto no Capí-
tulo 2, realizamos alguns testes com esse modelo de bateria e obtivemos resultados
interessantes.
Outro modelo que nos chamou bastante a atenção é o LS14250, de uma empresa
francesa chamada SAFT. Ela possui uma carga armazenada de 1200 mAh, um valor
elevado se comparado às outras baterias que destacamos. No entanto, suas especi-
cações sugerem uma descarga contínua máxima de 35 mA e aponta que a bateria

tem capacidade para fornecer pulsos de corrente de até 100 mA. Uma vez que o
consumo do ESP8266 ultrapassa esses limites, é provável que a capacidade nominal
dessa bateria seja reduzida quando utilizada no sistema de registro aqui proposto.
No Capítulo 2, essa hipótese é conrmada através de um teste de registro contínuo
até o esgotamento da bateria. Mesmo assim, os resultados foram satisfatórios e a
LS14250 é apropriada para o nosso sistema de registro sem o.
Outro modelo bastante interessante é o das baterias utilizadas em aparelhos
auditivos amplicadores (Power One P675i+, ZeniPower A675P, Rayovac 675 Co-
chlear, Toshiba 675P High Power, iCellTech CI Plus, NEXcell 675P, and HearClear
675i+). Elas são apropriadas para uma faixa de consumo de até algumas dezenas de
mA e possuem uma carga de 550 mAh, valor elevado se considerarmos seu peso de
apenas 1,6 g. Apesar de terem tensão nominal em 1,4 V, podemos combiná-las em
série para conseguirmos níveis mais altos de tensão. Além disso, podemos utilizar
reguladores de tensão (e.g., família TPS757xx da Texas Instruments) ou conversores
step-up (e.g., NCP1402 da ON Semiconductor ) para obtermos tensão regulada em
3,3 V. Por serem de aplicação especíca, ainda não sabemos até que ponto essas
baterias reagiriam bem aos pulsos de corrente elétrica inerentes à transmissão sem
o. Não obstante essas considerações, se conseguirmos reduzir o consumo do nosso
sistema de registro sem o, algo que tende a acontecer com os novos módulos com
protocolo de comunicação sem o que serão desenvolvidos nos próximos anos, essas
baterias podem se tornar mais adequadas e permitir inclusive a construção de uma
backpack mais leve, apropriada para camundongos.
1.8.4 Microcontroladores para Controle da Caixa de Condi-

cionamento
Agora, no contexto da caixa de condicionamento, as restrições de consumo, peso
e tamanho não são relevantes como no contexto do sistema de registro sem o. É
interessante que a arquitetura de hardware para o controle da caixa seja exível e
apropriada para atender a demandas que possam surgir em momentos posteriores.
Essas características requerem basicamente duas coisas: elevada quantidade de pi-
nos GPIO disponíveis para controle de dispositivos externos e o suporte a diversos
protocolos de comunicação (USB, UART, SPI, I2C, entre outros).
A plataforma Arduino (D'AUSILIO, 2012), além de apresentar essas caracterís-
ticas, é uma solução de relativo baixo custo, altamente exível, amplamente adotada
em soluções de projetos em eletrônica e tem losoa de código aberto. Consequên-
cias disso são que a documentação relacionada é abundante e a comunidade que
trabalha com essa plataforma é extensa, tem espírito colaborativo, de compartilhar
ideias, e tem estado continuamente ativa por meio de fóruns de discussão que ofe-
recem grande suporte aos desenvolvedores. Esses são os motivos que nos levaram
a escolher o Arduino como a plataforma que será usada para controlar a caixa de
condicionamento customizável.
Como será visto no Capítulo 3, para dispensar a necessidade de conectar a placa
Arduino diretamente a um computador para operação da caixa, resolvemos utilizar o
ESP8266 (o mesmo modelo de microcontrolador utilizado no sistema de registro pro-
posto) como uma ponte WiFi entre o Arduino e o PC. Arquitetamos um protocolo
de comunicação entre os dois microcontroladores para que o ESP8266 participasse
do esquema de controle da caixa e transferisse para o Arduino os parâmetros pro-
gramados pelo usuário através de uma interface web.
1.9 Diretrizes Éticas para Utilização de Animais Neste

Trabalho
Todos os experimentos com animais realizados no decorrer deste trabalho foram
conduzidos de acordo com as recomendações da Comissão de Ética no Uso de Ani-
mais da Universidade Federal de Minas Gerais (CEUA-UFMG). Por essa mesma
Comissão, fomos devidamente autorizados a realizar os protocolos de registro ele-
trosiológico com eletrodos invasivos em ratos Wistar, descritos no Capítulo 2, sob
o número de processo 264/2015. Além disso, também fomos autorizados, sob o nú-
mero de processo 250/2016, a utilizar animais para comprovarmos biologicamente a
funcionalidade da caixa de condicionamento construída no decorrer deste trabalho
(descrita no Capítulo 3).
Foram tomados todos os cuidados para evitar o sofrimento dos animais. Além
disso, nossos protocolos experimentais foram especicados de maneira a utilizar o
menor número possível de animais para as comparações estatísticas desejadas. As
diretrizes do CEUA-UFMG estão de acordo com as recomendações da Sociedade
Brasileira de Neurociências e da Behavior Guidelines for Animal Experimentation
para manejo e uso de animais em experimentos cientícos.
CAPÍTULO 2. SISTEMA DE REGISTRO SEM FIO 29
Capítulo 2
Uma Proposta de Sistema Sem Fio
Para Registro Eletrosiológico
2.1 Considerações Preliminares

A solução proposta para o sistema de registro eletrosiológico sem o do NNC
consiste na união de duas tecnologias recentemente disponibilizadas no mercado. A
primeira delas é a família RHD2000 de microchips, lançada em 2013 pela empresa
americana Intan Technologies e que teve grande aceitação pela comunidade cientíca
com trabalhos em eletrosiologia. A segunda tecnologia que elegemos para operar
junto com as soluções da Intan é o chip ESP8266, lançado em 2014 pela empresa
chinesa Espressif. Esse chip é um microcontrolador que possui tanto interface WiFi
(protocolo 802.11 b/g/n) quanto interface periférica serial (SPI), o que o torna hábil
para realizar uma conexão sem o entre chips da Intan e dispositivos remotos que
também tenham protocolo WiFi, eliminando a necessidade de utilizar cabos para
transportar as informações biológicas capturadas pelos eletrodos implantados até
um sistema remoto.
Outro aspecto importante de todo sistema com transmissão sem o para eletro-
siologia é a alimentação do sistema, que em praticamente todos os casos é baseada
em baterias. A sua capacidade de carga, seu peso e tamanho afetam diretamente
características muito relevantes do sistema de registro, que são: autonomia (tempo
máximo de registro contínuo até a bateria se esgotar), peso e dimensões físicas do sis-
tema. Vale observar que, em alguns casos, essas baterias podem estar acompanhadas
de reguladores de tensão.
Por m, uma interface se faz necessária para prover aos experimentadores formas
de interação com o sistema de registro, seja por meio da visualização dos sinais
eletrosiológicos adquiridos ao longo do experimento, seja por meio da conguração
de parâmetros experimentais, como frequência de amostragem ou largura de banda
dos ltros analógicos, entre outras funcionalidades.
Diante dessas considerações, o presente capítulo tem o propósito de esclarecer

detalhadamente esses elementos relevantes do sistema de registro sem o que estamos
propondo.
2.2 Descrição do Sistema de Registro Proposto

2.2.1 Visão Geral
A Figura 2.1 reúne todos os componentes do sistema de registro desenvolvido
neste trabalho e o ilustra por meio de um diagrama de blocos.
Figura 2.1: Arquitetura organizacional do sistema de registro sem o proposto.
Pela gura, notamos que no chip RHD2000 da Intan, 16 canais para eletrosiolo-
gia são multiplexados no tempo e amostrados por meio de um conversor analógico-
digital de 16 bits. Cada canal é formado por dois amplicadores em cascata: o pri-
meiro tem ganho de apenas duas vezes e realiza um ltro passa-altas, com frequência
de corte programável dinamicamente (0,1 Hz a 500 Hz) através de registradores in-
ternos ao chip; já o segundo tem ganho de 96 vezes e realiza um ltro passa-baixas,
com frequência de corte também programável (100 Hz a 20 kHz) via registradores.
Através de uma Interface Periférica Serial (SPI) de 16 bits, as amostras digitalizadas
são enviadas para o ESP8266, que as armazena em um buer circular e as despacha
em pacotes de dados via interface WiFi (socket UDP ) a um computador remoto, que
recebe e exibe os dados eletrosiológicos em painéis próprios, bem como os armazena
em disco para análises posteriores.
Por sua vez, a Figura 2.2 ilustra os componentes do sistema de registro por meio
de fotos da headstage, da backpack, da interface de usuário desenvolvidas e outras
ilustrações.
Figura 2.2: Ilustração do sistema de registro sem o proposto.
2.2.2 RHD2000 - Uma Família de Microchips para Eletro-

siologia Digital
A Intan Technologies é uma conceituada empresa americana especializada no
desenvolvimento de circuitos integrados próprios para aplicações em eletrosiologia.
Em 2013, ela lançou uma família de microchips, a RHD2000, com o seguinte perl:
• chips de 16 ou 32 canais para eletrosiologia, de 8 mm x 8 mm.
• bioamplicadores unipolares (modelos RHD2116 e RHD2132) ou diferenciais

(modelo RHD2216), com ruído típico da ordem de 2 µVRM S com relação aos
eletrodos de registro;
• ganho xo e igual a 192;
• baixo consumo, da ordem de 1 mA;
• possibilidade de ligar/desligar bioamplicadores individuais para otimização

do consumo do chip;
• largura de banda dos bioamplicadores programável;
• multiplexador (MUX) analógico de alta velocidade, que permite a aquisição

de aproximadamente 1 milhão de amostras por segundo.
• conversor analógico-digital de 16 bits
• erro de quantização do conversor A/D de 0,195 µ V com respeito à diferença

de potencial nos eletrodos.
• interface periférica serial por meio da qual os dados eletrosiológicos digitali-

zados são transmitidos
O diagrama de blocos que ilustra os componentes internos do modelo RHD2216

pode ser apreciado na Figura 2.3, bem como uma foto demonstrativa do quão pe-
quenos são esses chips.
Figura 2.3: Família RHD2000 de microchips para eletrosiologia digital da Intan

Technologies. À esquerda, os componentes internos ao modelo RHA2216 dispostos em um
diagrama de blocos. À direita, um chip dentro de um encapsulamento plástico QFN56 (8
mm x 8 mm) e um chip nu, além de um desenho com algumas de suas características.
No contexto da hierarquia mestre-escravo do protocolo SPI, os chips RHD2000

se portam como dispositivos escravos, respondendo a cinco comandos básicos: rea-
lizar conversão analógico-digital em um canal particular; executar rotina de auto-
calibração do conversor A/D; remover a calibração do conversor A/D; atualizar o
valor de um registrador em RAM (há 18 registradores em RAM de 8 bits, que servem
para congurar alguns aspectos do RHD2000, como a largura de banda dos bioam-
plicadores); ou ler o valor de um registrador em RAM ou ROM (há 9 registradores
em ROM que armazenam informações básicas do chip, como o número de canais, se
são unipolares ou bipolares, chip ID, entre outras).
Cada comando enviado pelo mestre na linha MOSI produz um resultado de 16
bits que é transmitido pela linha MISO dois comandos depois, conforme pode ser
apreciado na Figura 2.4, retirada do datasheet da Intan (TECHNOLOGIES, 2013).
O chip amostra a linha MOSI na borda de subida do clock serial. O mestre do
protocolo SPI deve seguir o mesmo padrão, amostrando a linha MISO na borda de
subida do clock serial (nesse caso, a interface periférica serial do dispositivo mestre
deve ser congurada com clock polarity (CPOL) = 0 e clock phase (CPHA) = 0).
Note que o conversor AD do RHD2000 inicia a amostragem do sinal analógico no
canal especicado pelos comandos CONVERT(C) na borda de descida do sinal CS .
Esse sinal deve ser retornado para +3,3V entre transferências sucessivas de 16 bits na
interface, mesmo quando o comando enviado não estiver requisitando uma conversão
analógico-digital.
Figura 2.4: Diagrama temporal da comunicação via interface periférica serial com o
RHD2000.
A interface SPI do chip obedece ao padrão de comunicação baseado em quatro

os, mas também suporta comunicação SPI diferencial com 8 os (um par de os
para cada linha de comunicação). A conguração diferencial confere maior estabili-
dade aos sinais SCK, MOSI, MISO e CS e é apropriada para as aplicações em que
a distância entre os dispositivos SPI superam alguns metros.
Após essa elucidação a respeito dos chips RHD2000 para eletrosiologia digital,
vejamos alguns detalhes do ESP8266, o microcontrolador que escolhemos para fazer
uma conexão sem o entre o RHD2000 e a interface do sistema de registro.
2.2.3 ESP8266 - Um Microcontrolador com Interfaces WiFi

e SPI
O ESP8266 é um microcontrolador lançado em 2014 por uma empresa da China,
a Espressif. A característica mais atraente desse chip é a sua capacidade de comu-
nicação sem o por meio do protocolo WiFi a 2,4 GHz, amplamente adotado em
redes sem o. Essa funcionalidade torna esse dispositivo extremamente interessante,
especialmente quando considerado no contexto da internet das coisas (Internet of
Things - IoT ), pois ele facilita bastante a conectividade, a troca de dados e o con-
trole remoto de outros dispositivos, solicitando o mínimo de infra-estrutura de redes
sem o, facilmente conseguida com os computadores modernos, smartphones, tablets,
entre outros. As principais características do ESP8266 estão resumidas na lista que
segue:
• microcontrolador Tensilica L106 de 32 bits, com clock a 80 MHz (podendo ser

ajustado para 160 MHz) e arquitetura RISC de 16 bits;
• tensão de operação em +3,3 V;
• possui suporte aos protocolos WiFi (IEEE 802.11 g/b/n), I2C, SPI e UART;
• o protocolo WiFi pode ser usado com TCP ou UDP;
• possui um conversor analógico-digital de aproximações sucessivas (SAR ADC)

de 10 bits e tensão de entrada com excursão entre 0 V e 1 V;
• 17 pinos GPIO, que podem ser multiplexados com outras funções (UART, I2C,
PWM, entre outras);
• 4 saídas para modulação por largura de pulso (PWM)
• 2 temporizadores em hardware, com resolução da ordem de µ s;
• 32 kB de RAM, aproximadamente;
• os módulos comerciais com o ESP8266 vêm com uma memória FLASH externa
de 512 kB para armazenar as rotinas programadas no ESP8266;
• possui dois modos principais de operação: modo UART download, que permite
programar o chip com novas rotinas, e modo FLASH, em que o chip inicializa
executando a rotina pré-programada na memória FLASH.
A arquitetura organizacional interna do ESP8266 está ilustrada na Figura 2.5.
Figura 2.5: Arquitetura organizacional interna do chip ESP8266.
O ESP8266 está disponível no mercado por meio de diversos módulos (ESP-

01, ESP-02, ..., ESP-12, ...), extremamente baratos, custando aproximadamente 5
dólares a unidade. As diferenças entre esses módulos são, basicamente, o tamanho e
a quantidade de pinos do chip ESP8266 disponíveis para acesso externo. Eles estão
Figura 2.6: Chip ESP8266, suas dimensões físicas e seus módulos comerciais.
mostrados na Figura 2.6, que também tem uma foto do chip ESP8266 e um desenho
com algumas de suas características.
No Brasil, os módulos mais comuns são o ESP-01 e o ESP-12. O primeiro possui
a limitação de ter apenas 8 pinos para acesso externo, sendo 2 para alimentação, 2
para reset e enable, 2 para comunicação UART e 2 pinos GPIO. Logo, o ESP-01
não é apropriado para aplicações que requerem o uso da SPI.
Por sua vez, o módulo ESP-12 possui vários pinos para acesso externo, inclusive
os do protocolo SPI, como mostra a Figura 2.7. Esse módulo apresenta-se no padrão
de grade com 2 mm de espaçamento entre seus pinos, o que é inconveniente para
sua conexão direta com placas de prototipagem, cujo padrão de grade é 2,54 mm. É
necessário, portanto, certo trabalho de bancada para adaptar o módulo para conexão
com o padrão tradicional de grade. Optamos por ligar, por meio de solda, os 16 pinos
laterais do ESP-12 a duas barras de 8 pinos no padrão 2,54 mm. Convém ressaltar
que isto é necessário apenas na etapa de prototipagem com o ESP8266, uma vez que
os projetos de placa de circuito impresso podem incluir footprints com o tamanho
exato dos módulos ou mesmo os dispensarem, incluindo apenas o chip ESP8266.
O interesse despertado pelo ESP8266 resultou na elaboração de uma biblioteca
para o chip no ambiente Arduino, com funções muito similares às das tradicionais
placas Arduino. O download dessa biblioteca pode ser feito através do repositório
que a Espressif mantém no GitHub.
Quanto às rotinas desenvolvidas com base nessa biblioteca, elas podem ser trans-
feridas para a memória FLASH do ESP8266 via comunicação UART com o micro-
controlador inicializado em seu modo UART download. A Tabela 2.1 mostra os
modos de operação do ESP8266 e como eles podem ser selecionados através dos
pinos GPIO0, GPIO2 e GPIO5 do módulo. O status desses pinos quando o chip é
energizado (ou seja, se eles estão em 0 V ou em +3,3 V) determinam se o modo de
operação será o UART download ou o modo FLASH.
Figura 2.7: Pinagem do módulo ESP-12.
Tabela 2.1: Conguração de pinos do ESP8266 para selecionar seu modo de

inicialização: FLASH ou UART download. O primeiro serve para executar a rotina já
programada anteriormente na memória FLASH do módulo e o segundo serve para
carregar novas rotinas.
Para comunicação via protocolo UART com o ESP8266, utilizamos o módulo

CP2102 da Silicon Labs, que é um conversor USB para UART. Basta conectá-lo em
uma porta USB de um computador com as rotinas implementadas e, em seguida,
conectar os pinos TX, RX e GND do CP2102 nos pinos RX, TX e GND, respectiva-
mente, do módulo ESP8266. Feito isso e colocado o microcontrolador em seu modo
de programação, basta aplicar o comando Upload no ambiente Arduino para iniciar
a compilação do projeto e sua transferência para o ESP8266. A Figura 2.8 mostra
o esquemático do circuito que montamos para prototipagem com o ESP8266.
Montamos esse circuito em uma placa de prototipagem comum, ilustrada na
Figura 2.9, para que pudéssemos constantemente carregar e testar as rotinas que
desenvolvíamos no ambiente Arduino.
A chave na parte superior esquerda do circuito serve para resetar o chip, o que
ocorre em bordas de subida no pino de RESET (quando pressionada, coloca o po-
tencial do pino em 0 V e quando liberada, retorna o pino a +3,3 V). Já a chave na
parte inferior direita controla o status do pino GPIO0. O ESP inicializa em modo
FLASH (modo de execução) quando é resetado/ligado com esta chave liberada, e
inicializa em modo de programação quando é resetado/ligado com esta chave pres-
Figura 2.8: Esquemático em software KiCad do circuito eletrônico que permite colocar
o ESP8266 em seus modos de execução ou de programação.
Figura 2.9: Circuito que permite programar o ESP8266-12 (desenvolvido no software

Fritzing ).
sionada. Para programar o chip utilizando portas USB, seus pinos TX e RX devem
ser conectados, respectivamente, aos pinos RX e TX de um conversor USB-Serial
(utilizamos o CP2102, da Silicon Labs ).
2.2.4 Headstage e Backpack

Como visto na Seção 1.5.2, os sistemas de registro com metodologia sem o geral-
mente se apresentam sicamente divididos em duas partes: a headstage, posicionada
sobre a cabeça dos animais em experimentação, e a backpack, posicionada sobre as
costas.
Na nossa headstage, optamos por colocar o chip RHD2000, um conector para
os eletrodos de registro (Omnetics Nano Strip Connector NSD-18-DD-GS ) e outro
conector para as linhas de comunicação SPI e os os VCC e GND para alimentação.
Dessa forma, a headstage cou extremamente leve (menos que 1 g) e de tamanho
muito reduzido (1,8 cm x 1,4 cm), ligeiramente menor do que as headstages adotadas
pela comunidade Open Ephys e que as placas comercializadas pela Intan (TECHNO-
LOGIES, 2016). A Figura 2.10 mostra o esquemático do circuito da headstage. Em
sua parte superior, está o conector da Omnetics (Nano Strip Connector NSD-18-
DD-GS) para conexão com os eletrodos de registro. Na parte central do esqumático,
encontra-se o chip da série RHD2000 da Intan e alguns componentes passivos (1
resistor e 3 capacitores) necessários para o correto funcionamento do chip. Por m,
na parte inferior, o conector com as linhas da comunicação via SPI (Master-Input
Slave-Output, Slave-Input Master-Output, Serial Clock e Chip Select ) e com os os
de alimentação da headstage (+3,3V e GND).
Figura 2.10: Esquemático do circuito eletrônico da headstage no software KiCad.
Por sua vez, a Figura 2.11, mostra o projeto da placa de circuito impresso e
a placa propriamente dita, que possui 1,8 cm de comprimento, 1,4 cm de largura

e 200 µm de espessura. As trilhas de circuito possuem 0,2 mm de largura e os
componentes SMD estão no padrão 0805 (2 mm x 1,2 mm).). Utilizamos o software
KiCad para construirmos e documentarmos todos os circuitos esquemáticos e as
placas de circuito impresso projetadas ao longo deste trabalho. As placas foram
fabricadas pela Stick Circuitos Impressos e montadas pela IGM Sistemas Eletrônicos,
ambas localizadas em Contagem/MG.
Figura 2.11: Placa de circuito impresso da headstage: (1) projeto da face de cima da
placa da headstage; (2) foto da face de cima da placa fabricada; (3) projeto da face de
baixo da placa da headstage; (4) foto da face de baixo da placa fabricada. À direita, foto
comparativa do tamanho da headstage com o de uma moeda de 10 centavos.
Nossa backpack, por sua vez, recebeu o restante dos componentes do sistema de
registro: o ESP8266, três resistores (necessários para garantir a inicialização do mó-
dulo WiFi em modo de execução) e a bateria. Seu circuito eletrônico está mostrado
na Figura 2.12. Na parte superior dessa gura, podemos notar o conector com os
os da comunicação SPI e os os de alimentação. Abaixo desse conector, está o
ESP8266, com seus três resistores de conguração à sua direita e a bateria à sua
esquerda.
A backpack e seus componentes, mostrados na Figura 2.13, cabem em um com-
partimento de 2,2 cm x 3,0 cm x 2,0 cm, que pode ser xado sobre as costas do
animal com o auxílio de jaquetas comerciais próprias para pesquisa com roedores.
Figura 2.12: Esquemático do circuito eletrônico da backpack no software KiCad.
Figura 2.13: Foto da backpack a ser posicionada sobre as costas do animal.
2.2.5 Interface de Usuário para Operação do Sistema de Re-

gistro
A interface de usuário do sistema de registro sem o que estamos propondo foi
elaborada com o software LabVIEW em sua versão 2011, com uma cópia devida-
mente licenciada instalada em um dos computadores do NNC. Ela é mostrada na
Figura 2.14.
Como diretrizes para a construção dessa interface, levamos em conta critérios de
usabilidade considerados importantes no projeto de interfaces grácas, como pre-
venção de erros que podem ser cometidos por parte do usuário ou a conrmação de
cada operação realizada pelo usuário (NIELSEN, 1995). O usuário pode congurar
os seguintes parâmetros:
1. frequência de amostragem, em Hertz: fS ∈ {1k, 2k, 3k, 4k, 5k, 10k, 20k, 30k,
Figura 2.14: Interface do sistema de registro eletrosiológico sem o proposto.
50k, 70k, 90k, 100k} Hz;
2. corte superior da largura de banda dos bioamplicadores do chip RHD2000

(ltro passa-baixas), em Hertz: fH ∈ {100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000,
1500, 2000, 2500, 3000, 5000, 7500, 10000, 15000, 20000} Hz;
3. corte inferior da largura de banda dos bioamplicadores do chip RHD2000

(ltro passa-altas), em Hertz: fL ∈ {0,10 ; 0,25; 0,30; 0,50; 0,75; 1; 1,5; 2; 2,5;
3; 5; 7,5; 10; 15; 20; 25; 30; 50; 75; 100; 150; 200; 250; 300; 500} Hz;
4. potência da antena de transmissão de dados WiFi do módulo ESP8266, em %:

T XP OW ER ∈ {5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100} %.
5. canais do chip RHD2000 a serem amostrados com taxa fS durante o experi-

mento: channels.
Cada parâmetro possui um campo por meio do qual o usuário especica seu
valor, além de um botão que deve ser pressionado para efetivamente congurar o
parâmetro. Além desses, também existem botões para conectar a interface ao sis-
tema de registro (procedimento feito para assegurar que a conexão sem o entre
a interface e o ESP8266 é bem-sucedida), iniciar registro e nalizar registro. To-
das as operações, exceto iniciar e nalizar registro, são seguidas de mensagens de
conrmação, orientando o usuário sobre o sucesso ou insucesso da operação.
Uma vez iniciado o experimento, a rotina da interface recebe os dados de registro
eletrosiológico enviados em pacotes UDP pelo ESP8266, exibe-os ao experimenta-
dor em grácos próprios e armazena-os em disco para processamento e análises
posteriores. O arquivo gerado é do tipo binário e contém um cabeçalho com os va-
lores dos parâmetros experimentais (fS , fH , fL e channels ), seguido das amostras
temporais de registro eletrosiológico arranjadas em um padrão que está ilustrado

na Figura 2.15.
Figura 2.15: Desenho representativo do conteúdo do arquivo de registro criado pela

rotina da interface de usuário.
A vantagem do arquivo binário, se comparado a arquivos de texto (.txt, .csv,

.xls, .xlsx, entre outros), é o tamanho do arquivo gerado, que é exatamente igual ao
tamanho do cabeçalho (8 bytes) mais 2 bytes para cada amostra, ao passo que os
arquivos de texto resultantes geralmente requerem muito mais bytes, pois têm seus
caracteres representados segundo a tabela ASCII, extremamente ineciente para
representar números. Por exemplo, o número 60000 pode ser representado por um
código binário de 2 bytes, mas, segundo a tabela ASCII, seria necessário 1 byte para
representar cada dígito, ou seja, 5 bytes.
Por outro lado, um aspecto negativo dos arquivos binários é que não basta um
duplo-clique para visualizar seu conteúdo de forma organizada, como é o caso da
maioria dos arquivos de texto. Uma vez que, para nós, a questão do espaço de
armazenamento é mais importante, optamos pelo formato binário do arquivo de
registro e pela elaboração de um script simples em MATLAB para realizar a leitura
desses arquivos.
2.2.6 Lista de Materiais

A Tabela 2.2 contém a lista de materiais do sistema de registro sem o proposto,
com uma estimativa do preço de cada componente.
2.3 Metodologia
Inicialmente, realizamos alguns testes para avaliarmos a velocidade de transmis-
são de dados nos dois protocolos de comunicação do sistema de registro sem o: a
comunicação SPI entre o ESP8266 e o RHD2000 da Intan e a comunicação WiFi
Tabela 2.2: Lista de materiais do sistema de registro eletrosiológico sem o proposto.
(pode ser baseada tanto em sockets UDP quanto ou sockets TCP) entre o ESP8266 e
a interface de usuário em um PC remoto. A Figura 2.16 ilustra a ideia para avaliar a
velocidade de comunicação dos protocolos em questão. Esse exame foi relevante uma
vez que revelou a taxa de amostragem máxima do sistema que estamos propondo
(ou ao menos uma estimativa dela), um parâmetro muito importante dos sistemas
de registro eletrosiológico.
Figura 2.16: Ilustração do método para estimar a velocidade média de transmissão de

dados através dos protocolos TCP, UDP e SPI.
Para examinarmos a velocidade da comunicação WiFi baseada em socket TCP,

elaboramos uma rotina simples para o ESP8266 que realizava o seguinte algoritmo:
1. Congura interface WiFi TCP, gerando uma rede WiFi com nome 'NNC WiFi
Ephys ' e senha especicada no código da rotina.
2. Aguarda conexão de um cliente TCP que criamos com o software LabVIEW.

Assim que o cliente se conecta, essa rotina executa um loop de 100 iterações
que consiste em: (1) enviar um pacote TCP de 1460 bytes (tamanho máximo
permitido pela versão 2.1.0 da biblioteca para o ESP8266 no software Arduino)
contendo números incrementais de 0 a 729 (cada um representado por 2 bytes)
e; (2) aguardar por 1 s antes de executar a próxima iteração.
3. Os ciclos de clock do ESP8266 (valor armazenado em um registrador do chip e

que aumenta de 80 contagens a cada µs, já que o clock principal do ESP8266
opera em 80 MHz) são registrados imediatamente antes e imediatamente de-
pois do envio de cada pacote TCP, de forma a obtermos, em cada iteração do
loop, uma estimativa do atraso da função responsável por enviar os pacotes
TCP.
4. Terminadas as 100 iterações, as medidas de atraso são enviadas ao PC para

cálculo da taxa média de transmissão de dados via WiFi TCP socket.
Repetimos esses procedimentos para pacotes TCP com 2/3 e 1/3, aproximada-
mente, do tamanho máximo permitido, para avaliarmos a inuência do tamanho do
pacote de dados na velocidade efetiva da comunicação.
Procedemos de maneira análoga para avaliarmos a velocidade da transmissão de
dados na comunicação WiFi baseada em socket UDP, com as diferenças de que: (1)
o tamanho máximo permitido para um pacote UDP é de 512 bytes (considerando a
versão 2.1.0 da biblioteca para o ESP8266); (2) o tempo de espera no loop antes da
próxima iteração foi reduzido para 100 ms, para diminuir o tempo de execução do
teste. Isto foi possível porque, como esperado e constatado na Seção 2.4, os pacotes
UDP são enviados a uma velocidade muito maior do que os pacotes TCP.
Em seguida, avaliamos a velocidade da interface periférica serial, seguindo no-
vamente a metodologia empregada para avaliar a comunicação WiFi TCP e WiFi
UDP. Apesar de, teoricamente, a velocidade do barramento SPI poder ser calculada
pela velocidade do clock SPI, que determina diretamente o tempo necessário para
se transmitir cada bit, temos ciência de que pequenos atrasos na execução das ro-
tinas da biblioteca SPI para o ESP8266 podem implicar em redução da velocidade
esperada da interface. Por esse motivo, decidimos examinar também a velocidade da
interface SPI. A rotina que elaboramos para esse teste realiza o seguinte algoritmo:
1. Congura interface SPI com clock a 20 MHz.

2. Congura interface serial UART a 115200 bits/s para comunicação com um
computador. É por meio dessa interface que serão enviados ao PC os valores
das estimativas do atraso da função responsável por enviar dados via SPI.
3. Aguarda recebimento de uma mensagem qualquer via interface serial UART.

Assim que uma mensagem é recebida, a rotina executa um loop de 100 iterações
que consiste em enviar 16 bits quaisquer (a interface SPI para comunicação
com o RHD2000 da Intan é de 16 bits) e aguardar por 100 ms antes de executar
a próxima iteração.
4. Os ciclos de clock do ESP8266 são registrados imediatamente antes e imedi-

atamente depois do envio de cada mensagem pelo barramento SPI, de forma
a obtermos, em cada iteração do loop, uma estimativa do atraso da função
responsável por enviar os dados via SPI.
5. Terminadas as 100 iterações, as medidas de atraso são enviadas ao PC para

cálculo da taxa média de transmissão de dados via interface periférica serial.
Após esses testes preliminares de avaliação da comunicação WiFi e SPI, inicia-

software do nosso sistema de registro e implementamos
mos o desenvolvimento do
a rotina 'NNC WiFi Ephys.ino' e a interface de usuário construída em software
LabVIEW. Uma vez programada no ESP8266, a 'NNC WiFi Ephys.ino' deve fazer
com que o microcontrolador congure o chip RHD2000 de acordo com comandos
vindos da interface de usuário no LabVIEW e conduza o processo de amostragem
em canais especícos do chip para eletrosiologia, simultaneamente ao stream dos
dados de registro para a interface. Nessa etapa, foi crucial a leitura detalhada das
especicações do chip RHD2000, para tomarmos conhecimento dos procedimentos e
cuidados necessários para congurá-lo corretamente.
Realizamos diversos testes de bancada com o intuito de revelar algumas carac-
terísticas importantes do sistema de registro que estamos propondo, principalmente
quanto ao consumo do sistema, alcance da comunicação sem o e também seu de-
sempenho para o caso do UDP, já que tal protocolo não garante a entrega dos
pacotes com os dados de eletrosiologia. Por desempenho da comunicação WiFi,
nos referimos à porcentagem de pacotes UDP recebidos com sucesso pela aplicação
da interface do sistema, um parâmetro que precisamos avaliar para saber se a quan-
tidade de dados eletrosiológicos perdidos nos pacotes não entregues por unidade de
tempo é desprezível ou não. A Figura 2.17 ilustra o método que empregamos.
Sabemos que o uxo de dados, ou número de bytes que trafegam por segundo na
rede gerenciada pelo ESP8266, bem como a qualidade ou intensidade do sinal dessa
rede, inuenciam no número de pacotes UDP perdidos por unidade de tempo. Logo,
começamos por avaliar o desempenho da comunicação sem o com UDP em função
da frequência de amostragem fS (proporcional ao tráfego de rede) e da distância
dist (relacionada com a intensidade do sinal da rede) entre o módulo ESP8266 e um
computador com a interface de usuário. Convém notar que, nesses testes, os dados
transportados pelos pacotes UDP eram todos ctícios, por não haver a necessidade
Figura 2.17: Ilustração do método para estimar a porcentagem média de pacotes UDP
recebidos com sucesso pela interface do sistema de registro sem o, considerando
diferentes cenários de uxo de dados e distância de transmissão.
de realizarmos registros eletrosiológicos nesse momento.
1. Ajustamos a potência da antena de transmissão de dados WiFi do ESP8266

para +10 dBm (50% do seu valor máximo) e a mantivemos constante durante
a realização desse teste.
2. Posicionamos o ESP8266 a 2 m de um computador pessoal (Processador Intel

i5, 2,67 GHz, 4 GB de memória RAM e sistema operacional de 64 bits 1 ) onde
estava instalada a interface do sistema de registro.
3. Por meio da interface, conguramos uma taxa de amostragem fS = 10 kHz,

de forma a simular um experimento com aquisição de dados eletrosiológicos,
adicionando a cada intervalo de amostragem correspondente 2 bytes de dados
(que representariam uma amostra vinda do RHD2216) aos pacotes UDP de
512 bytes dispostos em um buer circular. Cabe acentuar que os dois primeiros
bytes de cada pacote UDP representam uma identicação para os pacotes, um
número inteiro de 0 a 65535 que nos possibilita detectar eventuais perdas de
pacotes.
4. Após o envio de 10000 pacotes de dados, o processo de comunicação é interrom-

pido automaticamente e o número de pacotes perdidos durante a comunicação
sem o é calculado, por meio de um script em MATLAB que faz a leitura do
arquivo salvo em disco com os dados recebidos pela aplicação da interface.
5. Retornamos ao passo 2, porém ajustando diferentes valores para fS , a saber:

30 KHz, 50 kHz, 70 kHz, 90 kHz e 100 kHz.
1 As especicações do computador utilizado foram registradas para o caso de discutirmos, futu-
ramente, se o desempenho do computador pode afetar o desempenho da comunicação sem o, mas
julgamos ser este um ponto não muito relevante, pelo menos por enquanto.
6. Finalmente, retornamos ao passo 1, porém, separando o ESP8266 e o PC por

distâncias de 4 m, depois 6 m e, por m, 8 m (distância máxima conseguida
no local onde realizamos esse teste, que foi a sala 171 do bloco D3 do prédio
do ICB).
Nesse teste, a interface periférica serial foi mantida inativa, pois nossa intenção foi
avaliar apenas a interface WiFi, com o mínimo de variáveis que pudessem interferir
em nossa análise (os dados escritos no buer dos pacotes UDP correspondiam ao
valor de uma variável em software que incrementávamos após cada intervalo de
amostragem). Além disso, para cada valor de fS e de dist, realizamos 5 testes de
envio de 10000 pacotes e procedemos com análise de variância com medidas repetidas
no segundo fator (método ANOVA two way, com Frequência de Amostragem versus
Distância) e, quando necessário, foi feita análise post hoc de Tukey.
Em seguida, repetimos o teste anterior, colocando, dessa vez, a interface periférica
serial em operação com um clock a 20 MHz. Nesse teste, os dados escritos no buer
dos pacotes UDP correspondiam a valores recebidos durante o envio dos comandos
de conversão de amostra ao RHD2216 através da SPI (lembre-se de que o SPI é
um protocolo full-duplex, o que signica que ao mesmo tempo em que o ESP8266
envia dados ao RHD22166, ele também recebe dados do RHD2216 de comandos
anteriores). No entanto, esses valores eram aleatórios, uma vez não era necessário
registrar atividade eletrosiológica durante esse teste. A relevância do teste com a
SPI em funcionamento consiste em certicarmo-nos de que as interrupções geradas
durante o envio das mensagens de aquisição de dados ao RHD22166, operação que
tem prioridade máxima, não prejudicam a transmissão dos pacotes UDP, que tem
prioridade inferior. A análise estatística empregada foi a mesma que a do teste
anterior.
Feito isto, prosseguimos com mais um teste de bancada, ilustrado na Figura 2.18,
desta vez destinado a mensurar a inuência do parâmetro T XP OW ER no desempe-
nho da comunicação sem o com UDP. Importa-nos esclarecer a inuência desse
parâmetro pois ele afeta diretamente o consumo do nosso sistema de registro, bem
como a qualidade do sinal da rede WiFi. Obviamente, objetivamos o menor consumo
possível, no entanto, sem reduzir a intensidade do sinal da rede a ponto de prejudicar
a eciência da comunicação sem o. Procedemos da seguinte maneira:
1. Posicionamos o ESP8266 a 2 m de um computador pessoal onde estava insta-

lada a interface do sistema de registro.
2. O parâmetro fS foi mantido constante em 30 kHz e o barramento SPI foi

mantido inativo.
3. Por meio da interface do sistema de registro, conguramos o parâmetro T XP OW ER

em 10% da potência máxima, ou seja, em +2 dBm.
4. Iniciamos a simulação de aquisição de dados e, após o envio de 10000 pacotes

UDP, o processo de comunicação é interrompido automaticamente e o número
de pacotes perdidos é calculado, por meio de um script em MATLAB que faz
a leitura do arquivo salvo em disco com os dados recebidos pela interface.
5. Retornamos ao passo 2, porém ajustando diferentes valores para T XP OW ER ,

a saber: 25%, 50%, 75% e 100%.
6. Finalmente, retornamos ao passo 1, porém, separando o ESP8266 e o PC por

distâncias de 4 m, depois 6 m e, por m, 8 m.
Para cada valor de T XP OW ER e de dist, realizamos 5 testes de envio de 10000

pacotes e procedemos com análise de variância com medidas repetidas no segundo fa-
tor (método ANOVA two way, com Potência da Antena versus Distância) e, quando
necessário, foi feita análise post hoc de Tukey.
Figura 2.18: Ilustração do método para estimar a porcentagem média de pacotes UDP
recebidos com sucesso pela interface do sistema de registro sem o, considerando
diferentes cenários de distância de transmissão e potência da antena WiFi.
Após esse teste, demos sequência ao benchmarking do sistema de registro reali-

zando um teste em que examinamos a periodicidade da função Requisitar_Amos-
tra() da rotina NNC WiFi Ephys.ino, responsável por enviar os comandos de conver-
são de amostras ao chip da Intan nos canais especicados pelo usuário na interface.
Esse teste, ilustrado na Figura 2.19, é relevante pois o ESP8266 possui rotinas que
executam em background e coordenam o funcionamento do chip, especialmente a
sua interface WiFi. Essas funções têm prioridade elevada e podem gerar pequenos
atrasos no envio das mensagens de conversão, cuja regularidade temporal é crucial
para manter a delidade dos dados e da análise realizada sobre os mesmos através
de técnicas clássicas de processamento de sinais. Para tanto, zemos o seguinte:
1. O ESP foi programado com a rotina NNC WiFi Ephys.ino sem quaisquer
alterações, a não ser no início da função Requisitar_Amostra(), em que os
ciclos de clock do ESP8266 foram registrados, de forma a calcularmos, em

cada execução da função Requisitar_Amostra(), uma estimativa do intervalo
de tempo decorrido entre a execução atual e a execução anterior (intervalo que
deve corresponder ao período de amostragem de fS ).
2. Posicionamos o circuito com o ESP8266 a poucos centímetros de um compu-

tador pessoal onde estava instalada a interface do sistema de registro;
3. O parâmetro T XP OW ER foi mantido constante em 10% da potência máxima

(+2 dBm) durante a realização desse teste;
4. Após ajustarmos o parâmetro fS para 1 kHz, iniciamos a aquisição de dados

em 1 canal apenas;
5. Após 5000 execuções da função Requisitar_Amostra(), o processo de aquisi-

ção é interrompido automaticamente e os valores de intervalo de amostragem
calculados são enviados ao PC para análise estatística;
Repetimos este procedimento, porém, ajustando diferentes valores para fS , a

saber: 5 kHz, 10 kHz, 25 kHz, 50 kHz, 100 kHz.
Figura 2.19: Ilustração do método para avaliar a precisão da frequência de amostragem

de dados eletrosiológicos ditada pelo ESP8266.
Posteriormente, com o intuito de avaliar a autonomia do sistema de registro,

realizamos alguns testes em que acompanhamos o processo de descarga de dois
modelos de bateria para alimentação do sistema: a LS14250 (3,6 V) e a CR2 (3 V).
Não utilizamos reguladores de tensão. Além disso, nesse teste, incluímos o RHD2216
para que fosse considerado também o consumo do chip para eletrosiologia, apesar
de sabermos que ele é muito inferior ao consumo do microcontrolador WiFi.
Os parâmetros experimentais que estão diretamente ou indiretamente relaciona-
dos ao consumo do sistema são T XP OW ER , fS e número de canais. Para os dois mode-
los de bateria que avaliamos, zemos dois testes: no primeiro, ajustamos T XP OW ER
em 10%, fS em 1 kHz e número de canais igual a 8; já no segundo, aumentamos
a frequência de amostragem para 5 kHz, mantendo os outros parâmetros. Adap-
tamos a rotina NNC WiFi Ephys.ino para que, de 10 em 10 segundos, o valor da
tensão da bateria fosse registrado (utilizamos a função ESP.getVcc() da biblioteca
do ESP8266) e enviado ao PC logo em seguida por meio do protocolo UART (por
simplicidade, não quisemos embutir esse dado nos pacotes UDP com dados eletro-
siológicos). Procedendo dessa forma, obtivemos curvas de descarga das baterias ao
longo do tempo, além de uma estimativa do tempo de duração delas no sistema de
registro proposto.
Finalmente, para completar nossa avaliação sobre o sistema de registro sem o
proposto, realizamos alguns testes que envolveram, de fato, registros de atividade ele-
trosiológica. Em todos esses testes, utilizamos simultaneamente o sistema proposto
neste trabalho e um sistema comercial da Tucker-Davis Technologies (TDT), for-
mado por um pré-amplicador PZ2 e um processador digital de biopotenciais RZ2.
O sistema da TDT é extremamente moderno, porém, é baseado em transmissão
cabeada dos dados. Atualmente, ele é utilizado em grande parte dos experimentos
cientícos do NNC que envolvem registro eletrosiológico. Por esse motivo, o ado-
tamos como um padrão de qualidade para comparação dos dados adquiridos pelo
sistema de registro sem o.
Primeiro, registramos o eletrocardiograma (ECG) de um rato Wistar anestesiado,
posicionando uma agulha gengival abaixo do músculo peitoral maior esquerdo e outra
agulha abaixo do músculo peitoral maior direito.
Em seguida, realizamos outro tipo de registro eletrosiológico: o de potenciais
evocados auditivos em regime permanente (PEARP) e também em regime transitó-
rio (PEART), vericados na atividade neuronal registrada com eletrodo implantado
no colículo inferior (CI) no mesmo rato em que medimos o ECG. O CI é uma estru-
tura do mesencéfalo que faz parte da via auditiva do rato e, por isso, participa do
processamento de estímulos sonoros (MALMIERCA, 2004). Optamos por realizar o
registro de PEARP e PEART em particular pelo fato de serem um excelente marca-
dor de atividade siológica, favorecendo a análise crítica a realizar sobre o sistema
de registro sem o em validação. O procedimento cirúrgico se deu como descrito a
seguir:
1. Primeiramente, o animal foi anestesiado com uma solução de Uretana (140mg/kg),

de acordo com as recomendações do Comitê de Ética no Uso de Animais da
UFMG (CEUA-UFMG). Antes de passar para os procedimentos seguintes,
a indução anestésica do animal foi cuidadosamente conrmada e se manteve
estável durante a realização de todos os protocolos de registro.
2. Em seguida, foi feita a raspagem dos pelos na região superior da cabeça do

rato, seguida da higienização do local com uma solução de Iodopovidona.
3. Durante todo o procedimento cirúrgico, o animal foi mantido sobre uma manta
térmica com água quente, para auxiliar a manutenção da sua temperatura em
37,5 ◦ C .
4. O animal foi posicionado em um aparelho estereotáxico (Stoelting Co.) e -

xado por meio de barras auriculares. Em seguida foi feita incisão elíptica na
linha interauricular. Após o nivelamento dorso-ventral das suturas craniais,
realizamos trepanação para xação de dois parafusos de aço (Fine Science
Tools, no 19010-00), no osso nasal, onde foram soldados os de referência e
GND para o circuito de instrumentação. Fizemos mais uma trepanação nas
coordenadas AP: -9,0mm, LL: +1,4mm, em relação ao bregma (PAXINOS;
WATSON, 1998), região correspondente ao colículo inferior, para implantação
do eletrodo de registro monopolar (aço inoxidável com revestimento de teon-
Modelo: 791400, A-M Systems Inc., Carlsborg, WA, USA). O eletrodo e os
parafusos foram xados no crânio com acrílico de dentista.
5. Após a cirurgia, direcionamos o animal a uma caixa de isolamento acústico,

com a cabeça posicionada próxima à saída de um gerador de som (amplicador
AB100 e tweeter ST304, da Selenium). Em seguida, conectamos a referência,
GND e o eletrodo aos sistemas de registro sem o e da TDT, e iniciamos a
realização dos protocolos de registro.
No protocolo de registro ilustrado na Figura 2.20, medimos potenciais evocados

auditivos em regime permanente. Reproduzimos cinco trechos de som (tom puro de
10 kHz modulado em amplitude a 53,71 Hz) com duração de 30 s e espaçados entre si
de 30 s. Esse valor especíco de moduladora foi escolhido de forma a evitar vazamento
espectral na análise de frequência realizada sobre os PEART citefelix2005avoiding.
Simultaneamente na TDT e no sistema sem o, registramos o potencial captado pelo
eletrodo no colículo inferior, com uma taxa de amostragem de 3051,8 Hz e 3000 Hz,
respectivamente (a frequência de amostragem no sistema da TDT não é tão exível
e deve ser escolhida de uma lista de valores pré-programados). Após o protocolo, por
meio de scripts MATLAB, comparamos a energia calculada na faixa compreendida
entre +- 1 Hz com relação à frequência da moduladora, ou seja, de 52,71 Hz a 54,71
Hz, dos espectros de frequência dos sinais medidos pelos dois sistemas.
O segundo protocolo foi um procedimento controle para o primeiro. É impor-
tante comprovar que as alterações detectadas no sinal captado pelo eletrodo do
colículo inferior, durante a reprodução das faixas de som, correspondem de fato ao
processamento auditivo feito por neurônios daquela região, e não a uma possível con-
taminação eletromagnética por acoplamento entre o sistema de áudio e o sistema
de registro. Para isso, mostramos que não há alteração na energia da moduladora
quando obstruímos a saída do sistema de áudio com uma espuma, atenuando em
grande escala a intensidade do som. Convém observar que em todos os testes que en-
volveram reprodução de trechos de som, o sistema de estimulação auditiva utilizado
foi o próprio sistema da caixa de condicionamento construída, que será apresentada
no Capítulo 3.
Figura 2.20: Ilustração do método para medição de potencial evocado auditivo em

regime permanente no colículo inferior de um rato anestesiado.
Finalmente, realizamos um protocolo em que mensuramos potenciais evocados

auditivos em regime transitório. Como mostrado na Figura 2.21, reproduzimos um
sinal de áudio composto por 60 pulsos com 50 ms de duração de um tom puro
de 10 kHz, espaçados no tempo de 500 ms. Com o auxílio de um sinal marcador
do início e m de cada pulso sonoro (um sinal de trigger com a mesma referência
temporal que o registro do colículo e que também foi salvo em disco pelo sistema da
TDT), detectamos a resposta evocada no colículo inferior (visualizada com muita
diculdade por análise a olho nu do sinal registrado) e zemos uma promediação
temporal dessa resposta, com o intuito de enfatizarmos o PEART e cancelarmos o
efeito dos potenciais elétricos de regiões vizinhas ao colículo mas que se propagaram
até o eletrodo de registro.
Um procedimento necessário à sustentação dos resultados obtidos em experimen-
tos que envolvem implante de eletrodos no cérebro é a posterior comprovação de que
os eletrodos foram realmente posicionados no local planejado no procedimento cirúr-
gico. Portanto, após nossos protocolos de registro, o animal foi sacricado, conforme
estabelecido no parecer entregue à Comissão de Ética, e a posição dos eletrodos no
cérebro foi marcada por meio de uma lesão eletrolítica (com um gerador de cor-
rente, forçamos a passagem de 1 mA por 2 s através dos eletrodos). Em seguida,
Figura 2.21: Ilustração do método para medição de potencial evocado auditivo em

regime transitório no colículo inferior de um rato anestesiado.
conduzimos o animal ao CTPMag (Centro de Tecnologia e Pesquisa em Magneto

Ressonância da UFMG) e realizamos protocolos para obtenção de imagens de fatias
do cérebro. O scanner que utilizamos tem campo magnético estático de 4,7 Tesla, da
Oxford Systems, e é controlado por um gabinete UNITY Inova-200 Imaging Console,
da Varian. Os parâmetros para obtenção das imagens foram: Spin Echo com TR =
3000 ms, TE = 50 ms, 32 fatias coronais com um espaçamento de 1 mm, resolução
de 512 x 256 voxels em uma fatia de 3,2 x 3,2 cm.
Como uma forma alternativa de conrmar a posição dos eletrodos, removemos
o cérebro do animal e o mantivemos em solução de formaldeído 10% por 72 horas,
período que denominamos xação. Após a xação, o cérebro foi transferido para
uma solução de sacarose (30% p/v) e mantido em temperatura ambiente por apro-
ximadamente 72 horas. Por meio de um micrótomo de congelação (LUPE Indústria
e Comércio / MC-00), zemos cortes coronais do cérebro, espaçados de 50 µm, e
selecionamos as fatias que correspondem às coordenadas estereotáxicas referentes ao
implante do eletrodo de registro no colículo inferior. Em seguida, essas fatias foram
coradas para conrmação do implante, seguindo protocolo de marcação com solução
de vermelho neutro (vermelho neutro (1% p/v), acetato de sódio anidro (0,3% p/v)
e ácido acético glacial (0,12% v/v)).
2.4 Resultados e Discussão

2.4.1 Estimativa da Máxima Taxa de Amostragem do Sis-
tema de Registro Proposto
Os resultados do nosso teste de avaliação da taxa de transmissão de dados com
o protocolo TCP estão ilustrados na Figura 2.22. Por ela, podemos notar que a taxa
de transmissão, expressa em kbits/s, aumenta quando o tamanho dos pacotes TCP
cresce. Esse efeito é devido ao overhead do protocolo, ou seja, o atraso devido ao
envio do cabeçalho dos pacotes TCP, formado por um conjunto de 64 bytes que
são adicionados a todo pacote transmitido. O que ocorre é que pacotes com maior
número de dados atenuam o efeito do overhead.
Figura 2.22: Avaliação da taxa de transmissão de dados via socket TCP.
Além disso, é importante nos atentar à máxima taxa de transmissão obtida,

que foi de aproximadamente 56 kbps com pacotes de 1460 bytes (tamanho máximo
permitido). Tal taxa permitiria uma frequência de amostragem total de apenas 3500
amostras por segundo, dado que cada amostra do chip RHD2000 é representada por
16 bits. Dessa forma, não seria possível realizar registros com resolução temporal alta
o suciente para se detectar eventos eletrosiológicos rápidos (como o potencial de
ação) em múltiplos canais, o que limitaria as possibilidades de investigação cientíca
oferecidas por esse sistema de registro, se ele de fato fosse baseado no protocolo TCP.
Estaria tal sistema limitado a registros de relativa baixa frequência, como o potencial
de campo local, realizados em poucos canais.
Com relação ao protocolo UDP, nossos resultados podem ser apreciados na Figura
2.23. Novamente, podemos observar que, à medida que o tamanho dos pacotes UDP
aumenta, a taxa de transmissão de dados melhora, pois o efeito do overhead decresce

relativamente ao tempo necessário para enviar os bytes de dados.
Figura 2.23: Avaliação da taxa de transmissão de dados via socket UDP.
Em comparação com o TCP, as taxas de transmissão de dados obtidas foram

consideravelmente superiores. A taxa máxima de cerca de 13 Mbps é obtida com
pacotes UDP de 510 bytes (tamanho máximo permitido), é mais de 200 vezes su-
perior aos 56 kbps obtidos com pacotes TCP de 1460 bytes. Ela permitiria uma
frequência de amostragem total de mais de 800 mil amostras por segundo (16 bits
por amostra), um valor extremamente satisfatório, pois possibilitaria o registro da
atividade eletrosiológica com resolução temporal alta o suciente para se detectar
disparos de neurônios individuais em múltiplos canais simultaneamente (por exem-
plo, 20 kHz/canal em 16 canais).
A inferioridade observada na velocidade do protocolo TCP já era esperada. Esse
protocolo garante a entrega de pacotes enviados na rede através de um esquema de
conrmação do recebimento de mensagens, que denominamos handshaking, e isso
tende a retardar o processo de comunicação.
Quanto à Interface Periférica Serial, notamos que, apesar da elevada velocidade
do clock da interface, que deveria determinar diretamente a taxa de transmissão
de dados através dela, a função de envio e recebimento de dados (SPI_write ) da
biblioteca utilizada para o ESP8266 apresenta um atraso superior ao esperado entre
o envio de duas mensagens consecutivas. Dessa forma, para o caso do clock a 20 MHz,
notamos que os teóricos 20 Mbps são reduzidos a efetivos 4,67 Mbps (o RHD2000
suporta até 24 MHz para o clock SPI, mas não é possível ajustar esse valor exato
no ESP8266 pois o clock da interface SPI é obtido por divisões inteiras do clock
principal de 80 MHz, ou seja, 40 MHz, 26,67 MHz, 20 MHz, 16 MHz, e assim por
diante). Testamos também para 1 MHz e 10 MHz e os resultados estão ilustrados

na Figura 2.24.
Figura 2.24: Avaliação da taxa real de transmissão de dados via Interface Periférica
Serial.
No melhor caso, portanto, os 4,67 Mbps equivalem a uma frequência de amos-

tragem total máxima próxima de 290 kHz, um valor ainda bastante satisfatório, já
que permitiria, por exemplo, um protocolo experimental com amostragem de 18 kHz
em 16 canais. É esperado que em versões futuras da biblioteca do ESP8266 para o
ambiente Arduino, as funções de envio de mensagens pela SPI sejam otimizadas, o
que possibilitará frequências de amostragem ainda maiores.
Além das velocidades dos protocolos de comunicação, existe outro fator que
pode limitar a taxa de transmissão de dados: o ciclo de trabalho (duty cycle ) do
microcontrolador, que representa uma medida do quanto ele está sendo usado para
executar as rotinas nele programadas. O cálculo do ciclo de trabalho (em %) pode
ser feito através da equação 2.1, em que TP rocessamento é o período de tempo durante
o qual o microcontrolador está ocupado processando tarefas, e TDisponivel é o período
de tempo em que ele se encontra disponível:
TP rocessamento
Ciclo de trabalho [%] = × 100 (2.1)
TP rocessamento + TDisponivel
No caso da nossa rotina NNC_WiFi_ephys, o ciclo de trabalho depende princi-
palmente da frequência de amostragem de dados eletrosiológicos (quanto maior for
ela, mais tempo de processamento é gasto no stream dos dados) e da velocidade ajus-
tada para oclock SPI (quanto mais rápido for ele, menos tempo é gasto para enviar
mensagens via SPI). Por exemplo, para um clock de 20 MHz e uma frequência de
amostragem total de 50 kHz, calculamos um ciclo de trabalho de aproximadamente
35%. A Figura 2.25 ilustra as sinalizações feitas pelo ESP8266 através de dois pinos
GPIO, indicando início e m da execução da função Requisitar_Amostra() (curva
em amarelo) e da função que despacha os pacotes UDP com os dados eletrosioló-
gicos (curva em azul). É importante entender que, teoricamente, o ciclo de trabalho
máximo ocorre quando o término do envio de um pacote UDP é imediatamente
seguido do envio do próximo pacote.
Figura 2.25: Ciclo de trabalho do ESP8266 com a rotina NNC_WiFi_ephys. A curva

em amarelo ca em alto quando o ESP8266 está executando a função
Requisitar_Amostra(), que envia uma mensagem de conversão de amostra ao chip da
Intan através do barramento SPI. Por sua vez, a curva em azul ca em alto quando o
microcontrolador está enviando um pacote UDP à interface de registro.
Pela mesma gura, podemos perceber que mesmo durante o envio de pacotes
UDP, a função Requisitar_Amostra() é executada regularmente, pois essa função é
crítica. Esse comportamento tem o efeito de estender em quase 60% (aproximada-
mente 304 µs para 480 µs) o tempo necessário para enviar os pacotes UDP (processa-
dores com recursos de Acesso Direto à Memória (DMA) para operação do protocolo
SPI não teriam este problema, mas não é o caso do ESP8266).
A m de detectarmos qual a frequência de amostragem máxima que não viola
os limites do ciclo de trabalho do ESP8266, aumentamos gradativamente o valor
do parâmetro fS , até que, em 110 kHz, o microcontrolador passou a interromper
a execução da rotina NNC WiFi Ephys.ino logo que o processo de aquisição de
dados se iniciava, retornando uma mensagem de erro 'Watchdog Timer Reset'. Dessa
forma, constatamos que não é suciente a capacidade do ESP8266, carregado com
a versão atual da nossa rotina, para processar o uxo de dados resultante de uma
taxa de amostragem total tão alta quanto 110 kHz. Portanto, para que a aquisição
de dados possa se dar continuamente e sem erros, a soma das taxas de amostragem
empregadas em cada canal não deve exceder 100 kHz, aproximadamente. Esta é
uma restrição imposta pela interface de usuário que criamos para o sistema, que
impede que o limite para fS seja violado. A Tabela 2.3 indica algumas possibilidades
de conguração para fS e número de canais para experimentos com o sistema de

registro proposto.
Tabela 2.3: Frequência de amostragem e número de canais que resultam na frequência

de amostragem total máxima.
Possivelmente, versões futuras da biblioteca para o ESP8266 no ambiente Ar-

duino apresentarão desempenho melhor do que a versão atual. Além disso, a própria
rotina NNC_WiFi_ephys é passível de ser otimizada, algo que também melhoraria
o desempenho do microcontrolador com interface WiFi.
2.4.2 Avaliação da Perda de Dados Eletrosiológicos no Pro-

tocolo UDP em Função da Frequência de Amostragem,
da Distância e da Potência de Transmissão WiFi
Os resultados do nosso teste de desempenho da comunicação sem o com proto-
colo UDP em função da frequência de amostragem e da distância foram agrupados
na Figura 2.26.
Figura 2.26: Avaliação do desempenho da comunicação sem o baseada em socket UDP

em função de fs (frequência de amostragem total simulada) e dist (distância entre o
módulo ESP8266 e o computador pessoal com a interface do sistema de registro)2 .
Pela Figura 2.26, podemos notar como o número de pacotes recebidos com sucesso
é bastante elevado, com valor médio acima dos 99,6% em todos os cenários avaliados.
A análise estatística realizada (explicada em 2.3) indicou que houve redução no
desempenho da comunicação sem o quando aumentamos o valor do parâmetro
Frequência de Amostragem [F(5, 24) = 16,00, η 2 = 0,77, p < 0,01], mas não o
parâmetro Distância [F(3, 72) = 1,00, η 2 = 0,03, p = 0,47]. Pela análise post hoc,
concluímos que para fS = 90 kHz e fS = 100 kHz, o desempenho é inferior com
relação aos casos com fS = 10 kHz, 30 KHz, 50 kHz e 70 kHz. Na interação entre
os fatores Frequência de Amostragem e Distância não houve diferença signicativa
de desempenho [F(15, 72) = 1,00, η 2 = 0,20, p = 0,30].
Em termos práticos, uma perda de 0,4% de pacotes signica que os registros
eletrosiológicos oriundos do sistema proposto possuem fragmentos com informação
faltosa, que ao longo de 1 minuto de experimento completariam apenas 240 ms
de registro perdido. Apesar de não termos encontrado um valor de referência para
comparar a estatística dos dados perdidos durante a transmissão, consideramos que
esse efeito é desprezível frente às vantagens que o sistema de registro sem o oferece
se comparado aos sistemas com transmissão cabeada, ainda mais porque a posição
dos itens faltosos na série temporal dos registros é conhecida.
Algo que importa esclarecer na Figura 2.26, bem como nas Figuras 2.27 e 2.28,
mostradas a seguir, é que a faixa do desvio-padrão em torno dos valores médios
de desempenho ultrapassa, em alguns casos, o valor máximo de 100%. Isso pode
causar um certo estranhamento, mas há uma explicação plausível para isso. Nesses
testes, estamos estimando o valor da probabilidade de que um pacote UDP enviado
com dados eletrosiológicos seja recebido com sucesso pela interface do sistema de
registro. Assim sendo, o recebimento dos pacotes pode ser considerado como uma
variável aleatória, designada X, com distribuição de Bernoulli: P (X = 1) = p e
P (X = 0) = 1 − p, sendo X=1 pacote recebido e X=0 pacote perdido. O estimador,
designado X̄ , que consideramos para avaliar o valor de p baseia-se na média de 5
realizações de um experimento que consistiu no envio de 10000 pacotes. Portanto,
como se trata de uma variável de Bernoulli, temos E[X] = p e V ar[X] = p(1 − p)
e, dessa forma, a média e a variância do estimador é calculada de acordo com a
equação 2.2, onde IID signica que as variáveis aleatórias Xi são independentes e
identicamente distribuídas.
P
Xi IID E[X]
E[X̄] = E[ ] ⇒ E[X̄] = ×
N = E[X] = p
P N N

Xi IID V ar[X] V ar[X]
V ar[X̄] = V ar[ ] ⇒ V ar[X̄] =
×
N = (2.2)
N N2 N
Perceba que a variância do estimador tende a zero quando o número de observa-

ções da variável aleatória tende a innito. Se p = 99, 8% e N = 5, então a variância
calculada seria 0,20% e o desvio-padrão correspondente seria 4,47%. Nesse exemplo
(muito semelhante ao nosso caso), a faixa que corresponde a 4,47% em torno de
99,8% ultrapassaria o desempenho máximo de 100%. Portanto, isso ocorre quando
o valor de N não é elevado o suciente, o que parece ser o nosso caso. Escolhe-
mos N = 5 para que os testes de benchmarking nos permitissem avaliar o perl do
desempenho da comunicação sem o, mas sem se tornarem exaustivos.
Quanto ao teste que realizamos para certicarmo-nos de que as interrupções
provocadas pelo envio de mensagens na interface SPI (tarefa que tem prioridade
superior) não atrapalham o envio dos pacotes do protocolo UDP, os resultados estão
ilustrados na Figura 2.27.

quando a Interface Serial Periférica é posta em operação.
A análise estatística realizada indica que a operação da interface SPI a 20 MHz

não acarretou prejuízo de desempenho da comunicação sem o [F(1, 8) = 0,000, η 2
= 0,002, p = 0,901], para nenhum dos valores testados de frequência de amostragem
[F(3, 24) = 1,00, η 2 = 0,11, p = 0,42].
Também avaliamos o efeito da potência de transmissão WiFi, regulada pelo pa-
râmetro T XP OW ER , no percentual de pacotes perdidos durante simulação de um
experimento de registro. A análise estatística dos dados da Figura 2.28 revela que o
parâmetro Potência da Antena WiFi afeta o desempenho do protocolo de comuni-
cação do sistema [F(4, 20) = 5,00, η 2 = 0,47, p < 0,01]. A análise post hoc indica
que o cenário com T XP OW ER = 10% possui desempenho inferior aos cenários com
50%, 75% e 100% da potência de transmissão, com respectivamente p = 0,04, p =
0,02 e p = 0,03. Além disso, a interação entre esse e o parâmetro Distância também
afeta o desempenho da comunicação sem o [F(12, 60) = 3,00, η 2 = 0,38, p < 0,01].
Cabe notar, entretanto, que apesar das diferenças apontadas, o desempenho me-
dido em todos os cenários foi muito elevado (97,5% de sucesso no pior caso). Logo,
é plausível ajustar uma potência de transmissão de apenas 10% (+2 dBm) visando
aumentar a autonomia do sistema de registro sem o.

em função de TXpower (potência da antena do módulo ESP8266) e dist (distância entre
o módulo ESP8266 e o computador pessoal com a interface do sistema de registro).
2.4.3 Estimativa da Autonomia do Sistema de Registro

Os chips RHD2000 consomem cerca de 1 mA, ao passo que o ESP8266 consome
aproximadamente 56 mA. No entanto, o microcontrolador requer pulsos de corrente
superiores a 100 mA durante a transmissão de dados WiFi. Logo, a depender da
quantidade de pacotes enviados por unidade de tempo (algo que é determinado pela
frequência de amostragem empregada no experimento), o consumo médio do nosso
sistema de registro pode chegar a valores como 120 mA.
Uma equação comumente utilizada para estimar o tempo de duração de uma
bateria é:
Capacidade da bateria [mAh]

Duração estimada [h] = × 0, 7 (2.3)
Consumo do sistema [mA]
Mesmo que de forma genérica, por meio da multiplicação por 0,7, essa equação
leva em conta o efeito da resistência interna da bateria, que tende a dissipar parte da
energia contida nela. Segundo essa equação e considerando um consumo médio de 90
mA, a bateria LS14250, que tem carga de 1200 mAh, duraria cerca de 9 horas. No
entanto, importa considerar que o consumo máximo recomendado no documento
com as especicações técnicas dessa bateria (SAFT, 2009)) é de 35 mA (apesar

de estar explícito, no mesmo documento, que é possível trabalhar com consumos
maiores do que o valor recomendado). Sendo assim, é razoável esperar que a bateria
não dure as 9 horas indicadas pelo cálculo matemático.
Já para a CR2, com 800 mAh, seu tempo de duração seria cerca de 6 horas,
considerando também um consumo de 90 mA. Nesse caso, as especicações desse
modelo indicam que a faixa de consumo do nosso sistema, incluindo os pulsos de
corrente do ESP, estão abaixo dos limites recomendados. A Figura 2.29 mostra, ao
longo do tempo, o decaimento da tensão das baterias em teste.
Figura 2.29: Decaimento da tensão das baterias LS14250 (3,6 V) e CR2 (3 V),
candidatas à alimentação do sistema de registro sem o proposto. A última amostra de
cada uma das curvas mostradas corresponde ao momento em que o sistema deixou de
funcionar.
Pela gura, é possível notar a presença de reduções súbitas do valor da tensão

da bateria, sobretudo na LS14250. Esses fenômenos são indesejáveis pois podem
gerar oscilações na referência do conversor AD do chip para eletrosiologia, o que
culmina com oscilações no próprio registro. No entanto, esse efeito pode facilmente
ser atenuado com o uso de capacitores colocados em paralelo com a bateria ou de
reguladores de tensão.
2.4.4 Avaliação da Precisão do Intervalo de Amostragem

A frequência de amostragem dos sinais eletrosiológicos não é determinada pelo
chip da Intan, mas pela periodicidade dos comandos de conversão enviados a ele.
Dessa forma, avaliamos a periodicidade da rotina Requisitar_Amostra(), disparada
por um temporizador em hardware do módulo ESP8266 3 . A Tabela 2.4 ilustra os
3 O ESP8266 possui dois temporizadores em hardware, designados timer0 e timer1. O timer0
possui funções mais restritas para sua conguração, e dentre elas não encontramos alguma que
resultados que obtivemos.
Tabela 2.4: Precisão dos intervalos de amostragem obtidos com o ESP8266 para
diferentes valores de fS . Os dados de média e desvio-padrão foram calculados com base
em 5000 amostras.
Pelos dados da tabela, percebemos que o desvio-padrão é cada vez maior quando
aumentamos a frequência de amostragem. Na verdade, os desvios temporais no envio
dos comandos de conversão para o chip da Intan são mais ou menos constantes,
independente da frequência de amostragem congurada. No entanto, o efeito deles
é cada vez mais grave à medida em que o intervalo a ser temporizado se torna
menor. Por exemplo, um atraso de 1 µs no envio de um comando de conversão
representaria um desvio de apenas 0,1 % se estivéssemos amostrando a 1 kHz. Porém,
se estivéssemos amostrando a 50 kHz, esse mesmo desvio representaria um erro de
5 %.
Apesar de não conhecermos um valor padrão de desvio máximo aceitável para
a frequência de amostragem em um experimento de registro eletrosiológico, nosso
bom senso sugere que os valores observados, como o de 722 ns para fS = 50 kHz,
não são desprezíveis e podem ameaçar a conabilidade dos dados coletados durante
algum experimento. Tal irregularidade poderia acarretar, por exemplo, a distorção
do espectro de frequências do sinal, uma vez que os métodos de estimação, em sua
maioria ou talvez todos eles, levam em consideração um período de amostragem
ideal, ou seja, constante ao longo do tempo.
Assim sendo, buscamos entender o motivo dessas oscilações nas temporizações
e descobrimos que esse motivo é simples: esses desvios não estão relacionados ao
temporizador em si, ou seja, o temporizador consegue gerar os intervalos de amos-
tragem com precisão elevada, da ordem de nanossegundos. O fato é que o ESP8266
possui funções intrínsecas responsáveis por gerenciar seu protocolo WiFi, funções
essas que possuem prioridade superior à da rotina Requisitar_Amostra(). Dessa
possibilitasse congurar a prioridade da rotina de interrupção associada ao temporizador, que
é a função Requisitar_Amostra(), responsável por enviar comandos periódicos de conversão ao
RHD2000. Por sua vez, o timer1 possui uma API (Application Programming Interface) mais ela-
borada e permite congurar a prioridade da sua rotina de interrupção. Isto nos é importante pois a
função Requisitar_Amostra() deve ter prioridade mais alta dentre todas as outras funções execu-
tadas pelo microcontrolador. Por esse motivo, o timer1 foi o que nós utilizamos durante os testes
de avaliação da regularidade da frequência de amostragem.
forma, quando o temporizador indica o instante em que sua rotina de interrupção

deve ser executada, o momento exato em que efetivamente o processador a executa
é inuenciado por aquelas rotinas do protocolo WiFi.
Sabendo disso, descobrimos uma forma de atribuir prioridade máxima à rotina
Requisitar_Amostra(), alterando um arquivo da biblioteca do ESP8266 que estamos
utilizando4 . Cabe notar que alterar arquivos da biblioteca não é um procedimento
recomendado, pois pode facilmente acarretar incoerências na implementação da bi-
blioteca e provocar mau funcionamento do ESP8266. Esperamos que em versões
posteriores da biblioteca, a questão do ajuste da prioridade das rotinas de interrup-
ção dos temporizadores seja tratada e resolvida.
Para certicarmo-nos de que a modicação que zemos não gera mau funciona-
mento e de fato melhora a precisão da frequência de amostragem, repetimos os testes
que havíamos realizado anteriormente. A Tabela 2.5 mostra, em números de média
e desvio-padrão, a melhora satisfatória que obtivemos para algumas das frequências
da Tabela 2.4. Para fS = 10 kHz, o desvio-padrão foi reduzido em mais de 25 vezes.
Para fS = 25 kHz, a redução foi de aproximadamente 8,5 vezes e, nalmente, em fS
= 50 kHz, calculamos um desvio-padrão cerca de 6 vezes inferior, em comparação
com o cenário mostrado na Tabela 2.4.
Tabela 2.5: Precisão dos intervalos de amostragem obtidos com o ESP8266 para
diferentes valores de fS , após modicação no arquivo core_esp8266_timer.c. Os dados de
média e desvio-padrão foram calculados com base em 5000 amostras em fS .
Por sua vez, a Figura 2.30 dá uma noção visual da considerável melhora na
regularidade dos intervalos de amostragem para fS = 50kHz .
Apesar de ainda ser possível perceber oscilações nos intervalos de amostragem,
elas se tornaram eventos pontuais, de modo que estamos, agora, muito mais segu-
ros com relação à delidade dos dados eletrosiológicos obtidos com esse sistema.
Diferentemente do cenário anterior, acreditamos que não há ameaça às interpreta-
ções decorrentes da análise dos dados. Além disso, como podemos notar no detalhe
destacado na gura, essas oscilações tendem a se compensar em temporizações con-
secutivas. Apesar de este comportamento não ter sido planejado por nós, ele ajuda
a manter a referência temporal associada às amostras do registro. Por exemplo, se
os erros de temporização produzissem, em sua maioria, intervalos de amostragem
4 A alteração que zemos foi na linha 45 do arquivo core_esp8266_timer.c. Substituí-
mos ETS_FRC_TIMER1_INTR_ATTACH(timer1_isr_handler, NULL) por ETS_FRC_TI-
MER1_NMI_INTR_ATTACH(timer1_isr_handler).
Figura 2.30: Aumento da regularidade temporal na execução da função

Requisitar_Amostra() por meio de uma modicação no arquivo core_esp8266_timer.c
da biblioteca do ESP8266.
ligeiramente maior do que o esperado, ao longo do tempo isto produziria um defa-

samento temporal entre o sinal medido e o sinal real. Esse efeito foi vericado, mas
corrigido pela medida que tomamos, como mostra a Figura 2.31.
Cabe notar, entretanto, que com a biblioteca alterada o módulo WiFi funcio-
nou normalmente para frequências de amostragem de até 60 kHz, mas passou a
reinicializar, imprimindo mensagens de erro na porta serial, quando conguramos
frequências de amostragem superiores àquele valor. O motivo mais provável para
isso ter acontecido é que as funções do protocolo WiFi, agora com prioridade rela-
tivamente menor, não conseguem gerenciar o uxo de dados eletrosiológicos a 60
kHz, o que não acontecia quando elas tinham prioridade máxima. Não obstante,
entendemos que é preferível sacricar uma parcela da taxa de amostragem máxima
permitida em prol de mais regularidade temporal na coleta de amostras, do que uti-
lizar valores maiores de fS com a precisão que havíamos conseguido com a biblioteca
original.
2.4.5 Registros Eletrosiológicos com o Sistema Sem Fio e

Comparação com um Sistema Padrão
A Figura 2.32, mostra a promediação temporal que realizamos ao longo de 24
ocorrências do ciclo cardíaco (onda P, seguida do complexo QRS e, por m, onda
T). Na parte inferior dessa gura, que compara os sinais promediados oriundos do
registro dos dois sistemas, podemos notar que o complexo QRS do sinal registrado
pela TDT apresenta uma amplitude relativamente maior (69,86 µV ) do que a am-
Figura 2.31: Correção do defasamento observado ao longo do tempo entre os registros

do sistema sem o e do sistema da TDT, por meio de uma modicação no arquivo
core_esp8266_timer.c da biblioteca do ESP8266.
plitude do sinal registrado pelo sistema sem o. Isso pode estar associado à ligeiras
diferenças entre as respostas em frequência dos ltros dos dois sistemas. Apesar de
termos congurado as mesmas frequências de corte inferior fL e superior fH (passa-
altas em 0,5 Hz e passa-baixas em 100 Hz) para todos os registros simultâneos que
realizamos com os dois sistemas, os ltros do chip RHD2000 apresentam uma ate-
nuação em frequências próxima de fH e fL dentro da faixa de passagem, o que não
acontece no sistema da TDT. Como indicado na gura, a oscilação do sinal eletro-
cardiográco no complexo QRS se aproxima de uma oscilação senoidal de 83 Hz. Se
consultarmos as especicações do RHD2000, veremos que a resposta em frequência
dos ltros analógicos já apresentam uma atenuação de cerca de 1 dB (11%) em 83

Hz, quando fH é congurado em 100 Hz. A diferença de amplitude entre os sinais
registrados é de aproximadamente 69,86 µV (que equivale a 12,72%), valor próximo
do esperado.
Figura 2.32: Promediação temporal de ciclos cardíacos do registro eletrosiológico

obtido pelo sistema da TDT e pelo sistema sem o proposto.
Por sua vez, as Figuras 2.33 e 2.34 ilustram os sinais coletados no teste com
estimulação auditiva e registro de potenciais evocados em regime permanente no
colículo inferior. Em adição, elas mostram os espectrogramas dos respectivos sinais
(janelas de aproximadamente 2,5 segundos de duração, com sobreposição pela me-
tade e com 4096 pontos para cálculo do espectro de frequências com o algoritmo da
transformada de Fourier de tempo curto (STFT)). Conforme explicado em 2.3, o
som reproduzido foi um tom de 10 kHz modulado em amplitude a 53,71 Hz. Como
medida para comparação dos registros obtidos pelos dois sistemas, tomamos a ener-
gia do potencial evocado em regime permanente, calculada numa faixa de 2 Hz de
comprimento centrada na frequência de modulação sonora. Além disso, normaliza-
mos o cálculo da energia com base no valor da energia basal média na mesma faixa de
frequências durante o período de silêncio inicial, cuja duração é de aproximadamente
40 segundos.
Já na Figura 2.35, que destaca a energia normalizada do PEART ao longo do
protocolo experimental para os dois sistemas, podemos notar que, no registro da
TDT a energia aumentou cerca de 6 vezes com relação à energia basal média. Por
sua vez, no registro do sistema sem o, este aumento foi de aproximadamente 4
vezes. Se lembrarmo-nos das observações feitas nos registros de ECG, a amplitude
relativamente menor do potencial evocado registrado pelo sistema sem o já era
esperada, mas talvez de uma forma mais branda (em 53,71 Hz, a atenuação dos
ltros do RHD2216 é aproximadamente 1%). Portanto, aqui levantamos uma ou-
tra hipótese para a causa de discrepâncias entre os sinais medidos: uma possível
Figura 2.33: Sinal puro e espectrograma do registro no colículo inferior de rato Wistar
anestesiado obtido com o sistema da TDT.
Figura 2.34: Sinal puro e espectrograma do registro no colículo inferior de rato Wistar
anestesiado obtido com o sistema sem o.
diferença entre a impedância dos eletrodos de registro dos dois sistemas. Apesar
de não termos medido esse parâmetro quando da realização dos testes em questão,
pretendemos tomar nota deles nos testes que realizarmos futuramente.
Figura 2.35: Aumento da energia do sinal registrado no colículo inferior de um rato

anestesiado, na banda centrada na frequência da moduladora e com margem de +- 1 Hz
(53,71 Hz +- 1 Hz), durante protocolo com estimulação auditiva em 100 dB.
Para constatarmos que a atividade na frequência da moduladora está de fato

atrelada ao processamento neuronal no colículo inferior, e não a uma possível con-
taminação eletromagnética por acoplamento entre o sistema de registro e o sistema
de estimulação auditiva, realizamos um experimento controle (descrito em 2.3) cu-
jos resultados estão mostrados na Figura 2.36. Pelos dados, chegamos à conclusão
de que a hipótese da contaminação eletromagnética não é verdadeira, uma vez que
quando obstruímos a mangueira exível (saída do sistema de áudio) com espuma,
bem como tampamos o ouvido do animal experimental, a energia na banda em torno
da frequência de modulação não foi estatisticamente diferente da energia basal.
Figura 2.36: Experimento controle para constatar a invalidez da hipótese de

contaminação eletromagnética entre o sistema de registro e o sistema de estimulação
auditiva.
Outro teste que realizamos consistiu no registro de potenciais evocados em re-

gime transitório. Pela Figura 2.37, podemos comparar a resposta evocada registrada
no colículo inferior pelos dois sistemas (para ns de comparação, a gura também
apresenta um sinal de referência, extraído de Meeren et al. (2001)). Cada curva foi
obtida por meio de promediação temporal de respostas evocadas em um trecho com
60 pulsos de tons puros em 10 kHz, com 50 ms de duração, intensidade de 100 dB
e aplicados duas vezes por segundo durante 30 segundos. Aqui também a questão
da resposta em frequência dos ltros do RHD2000 e da impedância dos eletrodos de
registro pode ter interferido no perl do potencial evocado registrado.
Figura 2.37: Potencial evocado auditivo em regime transitório, registrado no colículo

inferior de um rato anestesiado em resposta a pulsos de tons puros em 10 kHz, com 50 ms
de duração e intensidade de 100 dB. As curvas mostradas foram obtidas através de
promediação temporal de 60 respostas evocadas e o sinal de referência (curva em preto)
foi extraído de Meeren et al. (2001).
Por m, após esses protocolos experimentais com rato anestesiado, realizamos
procedimento para conrmação da posição do eletrodo implantado no colículo in-
ferior. Constatamos que o procedimento cirúrgico de implante foi realizado com
sucesso, conforme pode ser observado na Figura 2.38.
Figura 2.38: Análise histológica para conrmação do posicionamento do eletrodo no

colículo inferior.
CAPÍTULO 3. CAIXA DE CONDICIONAMENTO 73
Capítulo 3
Uma Proposta de Aparato
Microcontrolado para
Condicionamento Comportamental
3.1 Considerações Preliminares

Neste capítulo, tratamos de apresentar as características principais da caixa de
condicionamento que nos propomos a construir, bem como demonstramos as suas
funcionalidades e exibilidade no tocante ao controle de parâmetros dos estímulos
condicionado (som) e incondicionado (choque). Além disso, apresentamos os resul-
tados de alguns testes aos quais submetemos a caixa, para comprovarmos a aplica-
bilidade do equipamento em experimentos envolvendo paradigmas comportamentais
(no caso, condicionamento clássico ao medo).
Os testes se dividiram em duas categorias: (1) testes de bancada, que não envol-
veram o uso de animais e se destinaram exclusivamente a delinear as características
dos estímulos condicionado e não-condicionado da caixa; (2) teste por meio de um
experimento de condicionamento clássico ao medo, que, obviamente, envolveu o uso
de animais e objetivou obter uma comprovação biológica da funcionalidade do apa-
rato.
3.2 Descrição da Caixa de Condicionamento

3.2.1 Visão Geral
A Figura 3.1 contém um diagrama de blocos que ilustra os componentes da caixa
de condicionamento construída.
A caixa possui um tipo de CS (veja Seção 1.5.3, na página 16) na forma de tre-
chos sonoros constituídos por tons puros possivelmente modulados em amplitude,
Figura 3.1: Diagrama de blocos representativo da caixa de condicionamento

customizada proposta.
com intensidade, frequência da portadora e frequência da moduladora programáveis.

Além disso, a caixa possui um tipo de US, na forma de estimulação elétrica aver-
siva por meio de choques aplicados ao animal em experimentação através de barras
eletricadas no piso da caixa.
O usuário do equipamento programa o protocolo experimental que deseja realizar
através de uma interface web, escrita em linguagem HTML no âmbito da rotina que
é programada no ESP8266. Assim que esse microcontrolador recebe os parâmetros
passados pelo usuário, ele calcula os instantes, a contar do início do experimento,
em que os estímulos condicionado e/ou não-condicionado deverão ser acionados ou
desligados. Esses instantes são sinalizados ao Arduino Due por meio de dois pinos
GPIO, um para controlar o som e outro para controlar o choque, utilizando uma
lógica binária: 1 (ou +3,3V) signica `acionar estímulo' e 0 (ou 0V) signica `desligar
estímulo'. Além disso, o ESP8266 transfere os parâmetros do som e do choque via
interface serial periférica para o Arduino Due, para que esse seja capaz de reproduzir
os estímulos em conformidade com as características programadas pelo experimen-
tador.
Imediatamente após o início do experimento, que é disparado pelo experimen-
tador através do botão START da interface web, o ESP8266 inicia a contagem do
tempo realizar o acionamento preciso dos estímulos. O sinal de áudio, gerado por
meio de um conversor digital-analógico de 12 bits do Arduino Due (pino DAC), é
conectado à entrada de um amplicador de áudio, para podermos trabalhar com
intensidades sonoras acima de +100 dBm dentro da caixa. Por sua vez, o sinal am-
plicado é conectado a um alto-falante que, nalmente, reproduz o estímulo sonoro.

Quanto ao choque, por meio de sinais de controle em 8 pinos GPIO, a placa
Arduino Due controla o potencial das barras da caixa de condicionamento, gerando
padrões de estimulação elétrica aversiva conforme programado pelo usuário.
3.2.2 Caixa de Acrílico

A caixa propriamente dita é constituída por chapas de acrílico transparente de
0,5 cm de espessura, tem 34 cm de comprimento, 20 cm de largura e 30 cm de
altura. Seu assoalho, ou piso, é composto por 16 barras cilíndricas de aço inox, cada
uma com 25 cm de comprimento e 0,5 cm de diâmetro, dispostas paralelamente e
espaçadas de 1,5 cm. Além disso, a caixa possui uma tampa, também em acrílico,
porém na cor preta, que tem a função de impedir que os animais escapem da caixa
caso apresentem comportamento de fuga, sobretudo diante dos estímulos aversivos
de choque elétrico aplicados durante protocolos experimentais. Há no centro da
tampa um orifício com 2,5 cm de diâmetro, por onde é introduzida e xada uma
mangueira exível que, como será explicado em detalhes na Seção 3.2.4, serve para
conduzir o som reproduzido pelo alto falante até o interior da caixa.
Figura 3.2: Caixa de acrílico transparente com barras cilíndricas de aço inox
eletricadas formando o piso.
3.2.3 Estímulo Incondicionado - Circuito do Choque

O princípio básico que rege a aplicação de choques elétricos controlados nos
animais dentro da caixa de condicionamento consiste em criar diferenças de potencial
entre as barras onde o animal se apoia. Como, geralmente, não se sabe com quais
barras ele está fazendo contato físico em certo momento, o que se faz é uma varredura
sequencial pelas barras de tal forma que, onde quer que o animal esteja no interior da
caixa, ele sinta a sensação provocada pelo choque praticamente de forma contínua.
A Figura 3.3 ilustra o circuito do estímulo elétrico aversivo. Que o leitor sinta-se
à vontade para consultar essas guras ao longo das explicações que se seguirão a
respeito dos componentes do circuito.
Para criar diferenças de potencial entre as barras, conectamos cada uma delas
à saída de um tradicional circuito com transistor em conguração emissor-comum,
de tal forma que podemos controlar seu potencial por meio de sinais de controle
aplicados por um microcontrolador à base dos transistores.
Para gerar os potenciais das barras, usamos uma fonte de tensão construída a
partir de um transformador isolado 1:2, de 1 A, em cujo circuito primário conectamos
a tensão da rede elétrica (127 VAC), e em cujo circuito secundário conectamos uma
ponte reticadora de diodos e um capacitor eletrolítico de 100 µF por 350 V, para
xar (praticamente) a tensão de saída do circuito em um valor próximo de 310 V
√
(aproximadamente 220 2 V ). Esse potencial de 310 V é que de fato usamos para
eletricar o assoalho da caixa.
É importante salientar que, em nenhum momento, tamanha diferença de poten-
cial é aplicada diretamente ao rato, mas é aplicada a um conjunto de resistores em
série, entre os quais o resistor equivalente representado pelo animal, o que resulta
em um nível de corrente elétrica limitado e de acordo com valores relatados e aceitos
na literatura (entre 400 µA e 1000 µA). Dessa forma, a diferença de potencial que
de fato se cria no corpo do animal (com valores típicos de resistência equivalente de
10 kΩ) é da ordem de 5 V.
Aqui, cabe notar que existe certa variabilidade na condutância do corpo dos
animais de laboratório (WALTERS; TULLIS, 1966), tanto entre diferentes animais
(diferenças de peso é um fator importante) quanto para um mesmo animal ao longo
dos dias de experimentação, e esse é um parâmetro que invariavelmente faz parte do
circuito e sobre o qual não temos controle. Essa variabilidade implica, por sua vez,
em variações indesejadas na amplitude da corrente elétrica programada para o expe-
rimento. Poder-se-ia perguntar se este efeito é capaz de ameaçar a conabilidade dos
dados obtidos em um experimento realizado na caixa. Se, no entanto, trabalharmos
com tensões relativamente elevadas no circuito das barras, estaremos menos suscep-
tíveis quanto a esta questão, já que os resistores do circuito do choque deverão ter
valores relativamente mais elevados, tornando o ajuste da intensidade do choque
menos sensível a variações na condutância do animal (ou na resistência equivalente
do mesmo). Circuitos baseados em fontes de corrente não seriam susceptíveis a tais
variações, no entanto, julgamos não haver a necessidade de trabalharmos com fontes
desse tipo.
A Figura 3.3 mostra como sinais de controle gerados pelo Arduino Due, em 8
Figura 3.3: Desenho esquemático do estímulo incondicionado (choque elétrico).
pinos GPIO, excitam a base de transistores de junção bipolar (BC548) com pulsos
de +3,3V. Cada pulso desses tem o efeito de saturar o transistor bipolar com uma
corrente de 2,5 mA em sua base, fazendo com que a corrente IF ∼= 20 mA percorra
o LED dentro do optoacoplador (PC817), que por sua vez emite luz com intensidade
suciente para saturar o fototransistor pareado com esse LED dentro do encapsu-
lamento do PC817. Em consequência, o potencial da barra correspondente se torna
praticamente nulo. Isso é feito de maneira rápida e sequencial pelas barras, de forma
que, eventualmente, o animal estará se apoiando simultaneamente em uma barra
que está conectada à referência do circuito e em outra que não está. Neste cenário, o
corpo do animal oferece um caminho para a passagem de corrente elétrica que tende
a uir entre os potenciais de +310 V e GND (pinos de saída da ponte reticadora).
O resistor de 100 kΩ presente no circuito de cada barra, bem como os resistores de
100 kΩ e de 500 kΩ (este último ajustável), comum ao circuito de todas as barras e
conectados em série com o terminal de +310 V, limitam a corrente elétrica a valores
menores do que 1,55 mA, aproximadamente.
Projetamos uma placa com o circuito do choque, mas alguns ajustes ainda estão
sendo feitos antes de encaminhar o projeto para fabricação. A versão atual da placa,
mostrada na Figura 3.4 contém 3 optoacopladores PC817 para cada barra, pois o
modelo que temos no laboratório não suporta 310 V sozinho. Além disso, ela tem
os transistores de controle do potencial das barras e alguns resistores para ajuste da
corrente na base daqueles transistores e no circuito de entrada dos optoacopladores.
Por m, podemos notar a presença de alguns furos circulares regularmente espaça-
dos, colocados dessa forma para permitir o encaixe da placa pela extremidade das
barras, que é rosqueada e facilita a xação por meio de porcas, bem como o contato
das barras com o circuito na placa.
Figura 3.4: Placa de circuito impresso com o circuito do choque elétrico aplicado pelas
barras da caixa. Na parte superior, o aspecto da placa como visto do editor de placas do
KiCad e na parte inferior, sua vista tridimensional.
Em se tratando dos parâmetros do choque, programáveis via interface web da

caixa (3.2.5), estão eles ilustrados na Figura 3.5 e listados a seguir:
• duração do pulso de choque em uma barra (tpulso_choque_ON ), especicado em

milissegundos;
• tempo de espera entre barras na varredura sequencial para aplicação da esti-

mulação elétrica aversiva (tpulso_choque_OF F ), especicado em milissegundos;
• duração da estimulação elétrica aversiva ou tempo de varredura pelas barras

(durchoque ), especicado em segundos.
O primeiro parâmetro, (tpulso_choque_ON ), dene o tempo durante o qual as bar-

ras serão conectadas (uma por vez) no potencial GND. O segundo parâmetro,
Figura 3.5: Ilustração dos parâmetros programáveis do estímulo incondicionado

(choque) da caixa de condicionamento customizada proposta.
(tpulso_choque_OF F ), especica o tempo que deverá ser contado entre desconectar

uma barra do potencial nulo e conectar a próxima barra nesse potencial. A ideia
que reside em haver esses dois parâmetros está no fato de que, mantendo a relação
tpulso_choque_ON + tpulso_choque_OF F constante e regulando a largura individual desses
dois intervalos, é possível controlar o ciclo de trabalho (duty cicle ) do choque ou,
em outras palavras, a quantidade de carga que irá sensibilizar o animal.
Por m, a duração do estímulo aversivo, durchoque , dene o tempo durante o qual
será realizada a varredura sequencial pelas barras, ou a duração do US.
Compreendido o circuito do choque, entendamos agora a implementação do es-
tímulo condicionado da caixa de condicionamento, no nosso caso, o som.
3.2.4 Estímulo Condicionado - Sistema de Áudio

O estímulo condicionado da caixa de condicionamento construída no contexto
deste trabalho consiste na reprodução de estímulos sonoros. Cada trecho de som
possui quatro características que podem ser programadas através da interface de
usuário descrita em 3.2.5. Eles estão ilustrados na Figura 3.6 e listados a seguir:
• frequência da portadora (fportadora ), especicada em Hertz;
• frequência da moduladora (fmoduladora ), especicada em Hertz;
• intensidade ou volume (vol), especicado em porcentagem do volume máximo;
• duração (dursom ), especicado em segundos.
Com base nos valores desses quatro parâmetros, que são especicados através
da interface web da caixa, construímos a forma de onda do som por meio de um
Figura 3.6: Ilustração dos parâmetros programáveis do estímulo condicionado (som) da

caixa de condicionamento proposta.
algoritmo que implementamos na rotina NNC Intellicage Arduino.ino, que se baseia

na equação 3.1:
Som(t) = V olume × sin(2πfCarrier t) × (1 + sin(2πfM odulator t)) (3.1)
Produzido o sinal analógico correspondente ao estímulo sonoro, o passo seguinte

consiste em conectar esse sinal a um alto-falante, para que ele seja convertido em
uma onda sonora audível. Estamos trabalhando com o Super Tweeter1 da Selenium,
modelo ST304, 40 WRM S , 8 Ω, mostrado na Figura 3.7.
Por estarmos interessados em registrar a atividade eletrosiológica de animais
no decorrer de paradigmas comportamentais dentro da caixa e uma vez que o alto-
falante é um potencial gerador de interferência eletromagnética, tomamos o cuidado
de desacoplá-lo eletromagneticamente do ambiente da caixa, alojando-o no interior
de uma caixa metálica (uma gaiola de Faraday), de 30 cm x 18 cm x 20 cm, com um
pequeno orifício de 2,5 cm de diâmetro em um de seus lados, onde acoplamos uma
mangueira exível de borracha plástica, com aproximadamente 1 m de comprimento
e 2 cm de diâmetro, que tem a função de captar e conduzir o som reproduzido pelo
alto falante até o contexto da caixa de condicionamento.
Este procedimento tem o efeito de fazer com que o som chegue no interior da
caixa consideravelmente atenuado. Portanto, decidimos adicionar um estágio de am-
plicação de áudio entre o Arduino Due e o alto-falante. O amplicador que estamos
utilizando atualmente é o AB100, de 100 WRM S e 4 Ω, da marca NCA. A Figura
3.7 mostra a caixa de condicionamento durante a realização de um protocolo, em
1 Os alto-falantes possuem nomes particulares dependendo da sua resposta em frequência. Por
exemplo, os woofers respondem melhor na faixa de 50 Hz a 5000 Hz, aproximadamente (sons
graves e médio-graves). Os tweeters são próprios para sons mais agudos, de 5000 Hz a 20000 Hz,
aproximadamente.
que podemos notar também o amplicador de áudio sob a caixa de blindagem com
o alto-falante e a mangueira exível.
Figura 3.7: Foto da caixa de condicionamento durante a realização de um protocolo

experimental.
3.2.5 Interface de Usuário para Operação da Caixa de Con-

dicionamento
A interface de usuário para operação da caixa de condicionamento construída ao
longo deste trabalho foi elaborada via script html, escrito dentro do contexto da nossa
rotina NNC_Intellicage_ESP8266.ino que é programada no ESP8266. Através dos
recursos que a biblioteca do ESP8266 tem para o desenvolvimento de aplicações web,
nós publicamos a interface através de uma página web, como mostrado na Figura
3.8.
As informações passados pelo experimentador através dessa interface são envia-
das ao ESP8266, que participa conjuntamente com o Arduino Due do esquema que
desenvolvemos para controle da caixa: o ESP8266 controla, através de dois pinos
GPIO, os instantes exatos de início e m dos estímulos de som e choque gerados
pelo Arduino Due, que por sua vez reproduz o som e o choque conforme os pa-
drões programados pelo experimentador através da interface. Assim sendo, é neces-
sário repassar ao Arduino Due o valor dos parâmetros fportadora , fmoduladora , volume,
Figura 3.8: Interface para operação da caixa de condicionamento proposta.
tpulso_choque_ON e tpulso_choque_OF F . Isto é feito através de comunicação via SPI entre

os microcontroladores.
3.2.6 Lista de Materiais

A Tabela 3.1 contém a lista de materiais da caixa de condicionamento customi-
zada, com uma estimativa do preço de cada componente.
3.3 Metodologia
Implementadas as rotinas de geração e controle dos estímulos condicionado e
incondicionado, criada a interface para programação do experimento e operação da
caixa e montado os circuitos de som e choque, realizamos testes de bancada para
comprovar o quão regular são os estímulos sonoros gerados pelo Arduino Due ao
longo de trechos longos (30 s). Esse teste é extremamente relevante para nós, uma
vez que nos experimentos que envolvem medição do potencial evocado auditivo no
colículo inferior, o planejamento do local exato para se implantar o eletrodo depende
da frequência da portadora, pois devemos levar em consideração a característica de
tonotopia da via auditiva do rato (de forma semelhante aos humanos), ou seja, sons
com diferentes frequências excitam neurônios de diferentes regiões do CI (MAL-
MIERCA et al., 2008) (CHEUNG et al., 2012). Portanto, é necessário atestar que
não há irregularidades no som reproduzido pela caixa que ameacem a medição dos
potenciais evocados auditivos no CI.
Os registros do padrão sonoro foram feitos a uma taxa de amostragem de 96
kHz por meio de um microfone (posicionado sempre a aproximadamente 10 cm da
Tabela 3.1: Lista de materiais da caixa de condicionamento customizada proposta.
saída de áudio na mangueira exível) e do software Audacity. Para delinearmos as

características do estímulo registrado, procedemos da seguinte forma:
1. Programamos, via interface da caixa, um experimento que consistiu em repro-

duzir três trechos de tom puro com 30 s de duração, sendo (fportadora ) = 5 kHz
no trecho inicial, 10 kHz no trecho intermediário e 15 kHz no trecho nal.
2. Registramos o padrão sonoro e, por meio de um script em MATLAB, calcu-

lamos ciclo a ciclo o período do tom puro em cada trecho de som, detectando
os pontos que correspondiam a cumes (ou cristas) de um ciclo de portadora e
calculando o intervalo de tempo compreendido entre pontos sucessivos.
3. Obtivemos, assim, três conjuntos de amostras (um para cada trecho) com me-
didas do período da portadora efetivamente reproduzida pela caixa. Por meio
do inverso desses valores, conseguimos estimativas de (fportadora ) e calculamos
a média e o desvio-padrão desse parâmetro.
Em seguida, de forma muito semelhante à descrita anteriormente, nos ocupamos

em comprovar a regularidade da modulação em amplitude feita pelo Arduino Due.

Para isto, adotamos o seguinte metodologia:

duzir três trechos de tom puro de 5 kHz modulado em amplitude com 30 s de
duração, sendo (fmoduladora ) = 53,71 Hz no trecho inicial, 92,77 Hz no trecho
intermediário e 200 Hz no trecho nal.
2. Registramos o padrão sonoro e, em um script MATLAB, estimamos o enve-

lope da moduladora em cada trecho de som (utilizamos a função hilbert do
MATLAB) e detectamos os pontos que correspondiam a cumes (ou cristas)
de um ciclo de moduladora. Em seguida, calculamos o intervalo de tempo
compreendido entre pontos sucessivos.
3. Obtivemos, assim, três conjuntos de amostras (um para cada trecho) com me-
didas do período da moduladora efetivamente reproduzida pela caixa. Por meio
do inverso desses valores, conseguimos estimativas de (fmoduladora ) e calculamos
a média e o desvio-padrão desse parâmetro.
Em seguida, realizamos um teste para comprovar a correta funcionalidade do

ajuste da intensidade do som, conforme descrito a seguir:

duzir 10 trechos de tom puro em 10 kHz, cada um com 1 s de duração, sendo
que no trecho inicial o volume especicado foi de 100% e nos trechos seguin-
tes o volume foi progressivamente diminuído de 10%, até alcançar o volume
equivalente a 10% no trecho nal.
2. Registramos o padrão sonoro e, em seguida, por meio de um script em MA-

TLAB, calculamos a amplitude média do sinal em cada trecho de 1 s (detec-
tamos a amplitude das oscilações do sinal sonoro, ciclo a ciclo) e, novamente,
comparamos os valores obtidos à luz dos valores programados de volume do
som.
Quanto ao choque, elaboramos alguns testes de bancada que comprovassem a

regularidade da intensidade do estímulo de choque elétrico produzido pela caixa. O
método está descrito a seguir e ilustrado na Figura 3.9.
1. Conectamos as barras 1 e 7 por meio de um resistor de 10 kΩ, como uma

forma de simularmos a resistência equivalente de um rato que poderia estar se
apoiando nessas barras, caso se dispusesse perpendicularmente a elas.
2. Através da interface web para operação da caixa, programamos o US com um

padrão de 5 ms de choque aplicado sequencialmente nas barras por 2 segundos.
3. Com o auxílio de um osciloscópio digital, registramos a 25000 amostras por

segundo o valor da intensidade do choque, indiretamente, por meio da queda
de potencial através do resistor que adicionamos ao circuito.
4. Feito isso, selecionamos os trechos de choque durante os 2 s de estímulo (pois

a corrente ui pelo animal de forma pulsada), calculamos a média e desvio-
padrão da amplitude e comparamos com o valor esperado. Fizemos isso para
cinco valores programados diferentes (400 µA, 600 µA, 800 µA e 1000 µA),
ajustados previamente a cada um dos testes usando o potenciômetro de ajuste
do choque e um amperímetro para medição da corrente elétrica ajustada. O
processamento e análise estatística foram feitos por meio de um script em
MATLAB.
Figura 3.9: Ilustração do método para estimar a amplitude média da estimulação

elétrica aversiva da caixa de condicionamento construída.
Além disso, submetemos a caixa a um teste que elucidasse a questão levantada

na Seção 3.2.3, sobre variações na amplitude do choque programado causadas por
variações ou diferenças na resistência equivalente dos animais em experimentação.
Simulamos uma variação de 5 kΩ em torno do valor 20 kΩ (WALTERS; TULLIS,
1966) e medimos a intensidade do choque nos três cenários (15 kΩ, 20 kΩ e 25 kΩ),
procedendo da seguinte maneira:
1. Conectamos as barras 3 e 9 por meio de um resistor de 20 kΩ, como uma

forma de simularmos a resistência equivalente de um rato que poderia estar se
apoiando nessas barras.
2. Através da interface web para operação da caixa, programamos o choque com

um padrão de tpulso_choque_ON = 5 ms, tpulso_choque_OF F = 0 ms, aplicado
sequencialmente nas barras durante 2 segundos (duração típica em protocolos
de condicionamento clássico ao medo).
3. Com o auxílio de um osciloscópio digital, registramos indiretamente a 25000

amostras por segundo o valor da intensidade do choque, por meio da queda de
potencial através do resistor que adicionamos ao circuito.
4. Feito isso, selecionamos os trechos de choque durante os 2 s de estímulo (note

que a corrente ui pelo animal de forma pulsada), calculamos a média e desvio-
padrão da amplitude e comparamos com o valor esperado. Fizemos isso para
apenas um valor de intensidade do choque, 400 µA, calibrado previamente ao
teste por meio de um potenciômetro de ajuste do choque e de um amperímetro
para medição da corrente elétrica.
5. Repetimos os procedimentos anteriores, sem alterar o ajuste da intensidade

do choque, mas substituindo o resistor de 20 kΩ por um resistor de 15 kΩ e,
posteriormente, por um de 25 kΩ (15 kΩ em série com 10 kΩ).
Finalmente, tendo constatado a correta funcionalidade dos sistemas de estimu-

lação auditiva e elétrica aversiva, avaliamos respostas comportamentais em ratos
Wistar submetidos a protocolo de condicionamento clássico ao medo. Dessa forma,
obtivemos uma comprovação biológica da funcionalidade do aparato construído nesse
trabalho. A realização do respectivo protocolo se deu em três dias consecutivos, da
seguinte forma:
• O estímulo condicionado constituiu-se de trecho sonoro de um tom puro em

10 kHz, modulado em amplitude a 53,71 Hz, com 30 segundos de duração e
cerca de +85 dB de intensidade (medida dentro da caixa).
• O estímulo incondicionado constituiu-se de estimulação elétrica aversiva a 400

µA, aplicada durante dois segundos nas patas do animal dentro da caixa. Os
parâmetros tpulso_choque_ON e tpulso_choque_OF F (veja Seção 3.2.3) foram con-
gurados em 5 ms e 0 ms, respectivamente.
• No primeiro dia do protocolo, foi feita a etapa de habituação ou pré-treino dos

animais (8 ratos Wistar, todos do sexo masculino e com peso na faixa de 270
g a 310 g). Nessa etapa, apresentamos 6 vezes (6 trials ) o CS individualmente
a cada um dos animais, em um ambiente diferente do da nossa caixa de condi-
cionamento. A esse ambiente chamamos de contexto A, uma caixa de acrílico
preto de 30 x 20 x 25 cm3 (apenas uma das faces laterais é transparente).
Entre cada apresentação do CS, foi respeitado um intervalo que variou de 30
segundos a 120 segundos, escolhidos de forma pseudoaleatória (pelo próprio
experimentador) e sempre múltiplo de 30 segundos.
• No segundo dia, foi realizada a etapa de condicionamento ou treino dos ani-

mais, dentro da caixa de condicionamento proposta, a que chamamos de con-
texto B. A utilização de dois contextos diferentes teve o intuito de evitar a
inuência contextual no aprendizado dos animais, pois objetivamos que eles

construíssem uma associação entre CS e US, e não entre US e o contexto.
Novamente, assim como no primeiro dia, apresentamos 6 vezes o CS individu-
almente a cada um dos animais. No entanto, para condicionamento e análise
estatística, os animais foram divididos em dois grupos de 4 animais:
1. Grupo pareado, onde os 6 CS foram apresentados de forma pareada com

US, aplicado sempre nos dois segundos nais de cada estimulação auditiva
de 30 segundos.
2. Grupo não-pareado, onde nenhuma ocorrência de US coincidiu temporal-
mente com a de um CS. Para conseguirmos isso, foi escolhido de forma
pseudoaleatória (novamente, o próprio experimentador determinou) um
intervalo de 30 segundos a 120 segundos entre cada ocorrência de CS e
US.
3. O teste de retenção foi realizado no terceiro e último dia de protocolo. Ele
consistiu na precisa repetição do procedimento realizado no pré-treino (os
animais foram reapresentados à sequência de CS novamente no contexto
A, sem a apresentação do US).
4. O aprendizado da tarefa de condicionamento foi quanticado pelo tempo
de duração da resposta defensiva de congelamento (freezing ) dos ratos,
caracterizada por ausência de movimentos (exceto aqueles decorrentes da
respiração). O processo de quanticação se deu por análise de gravações
de vídeo da etapa de teste de cada animal, feita por um experimentador
cego (que não participou da realização desse protocolo experimental). A
resposta comportamental de medo foi considerada apenas durante cada
apresentação de CS e seu tempo total de duração foi contabilizado da
seguinte forma: cada trecho de CS foi segmentado em 6 janelas de 5
segundos, de forma que, para cada janela, se o animal tiver apresen-
tado resposta de freezing por 3 segundos ou mais, considerou-se que a
resposta comportamental ocorreu naquela janela. Além disso, a resposta
comportamental dos animais também foi quanticada no pré-treino, para
demonstrarmos que, antes do protocolo de condicionamento, o estímulo
auditivo não tinha nenhuma relevância emocional para os animais e, por
isso, não induz resposta de medo. A análise estatística do comportamento
foi feita através de análise de variância com medidas repetidas.
3.4 Resultados e Discussão

3.4.1 Caracterização do Estímulo Condicionado (Som)
Utilizando o microfone de um notebook, registramos sinais de áudio reprodu-
zidos pela caixa de condicionamento com diferentes portadoras, empregando uma
frequência de amostragem de 96 kHz. Na Figura 3.10, à esquerda, podemos ver tre-
chos de 700 µs de duração de sinais com portadora em 5 kHz, 10 kHz e 15 kHz, de
cima para baixo. À direita, a densidade de potência espectral de um trecho de 25 s
dos sinais mostrados à esquerda, calculado em MATLAB por meio do algoritmo da
transformada rápida de Fourier (FFT). Por m, na parte inferior da gura, temos
o espectrograma (janelas de 5 ms de duração, com 2,5 ms de sobreposição e com
512 pontos para cálculo do espectro com o algoritmo da transformada de Fourier de
tempo curto (STFT)) de um registro sonoro de um protocolo simulado que consistiu
em tocar, por 1 segundo, sons com portadora em 2 kHz, 4 kHz, 6 kHz, ..., 16 kHz,
18 kHz e 20 kHz. Note que os trechos com portadora na faixa compreendida entre
6 kHz e 14 kHz possuem relativa maior energia na frequência da portadora, se com-
parados aos outros trechos, notadamente o trecho inicial, cuja energia da portadora
em 2 kHz apresenta-se atenuada. Isto se deve à resposta em frequência do alto fa-
lante utilizado (consultada nas especicações do Super Tweeter ST304, Selenium),
que apresenta atenuações em frequências inferiores a 3.5 kHz (aproximadamente) ou
superiores a 18 kHz (aproximadamente).
Figura 3.10: Possibilidade de ajuste da portadora do som reproduzido pela caixa de

condicionamento customizada proposta.
A Figura 3.11 mostra a média e o desvio-padrão calculados para a frequência da

portadora em trechos de 20 segundos de tons puros de 5 kHz, 10 kHz e 15 kHz.
Figura 3.11: Média e desvio-padrão da frequência da portadora do som reproduzido

pela caixa. Para fCARRIER ajustado em 5 kHz, 10 kHz e 15 kHz, respectivamente,
obtivemos 5999, 23999 e 48979 estimativas para cálculo das estatísticas.
Podemos notar como o desvio-padrão aumenta para valores maiores de fCARRIER .

Na verdade, a elevada variância nas medidas de fCARRIER não se deve ao estímulo
sonoro em si, mas à metodologia (descrita em 3.3) que utilizamos para estimar a
frequência da portadora ciclo a ciclo. A precisão da detecção dos picos do sinal se-
noidal do registro sonoro é bastante sensível à frequência de amostragem empregada
e à frequência da portadora. No nosso caso, com uma amostragem de 96 kHz, é
fácil perceber pela Figura 3.10 que, quando ajustamos fCARRIER em 10 kHz e em
15 kHz, nossa resolução temporal (cerca de 10 µs) deixou de ser suciente para
que o sinal de áudio medido tivesse um envelope bem descrito, como ocorreu para
fCARRIER = 1kHz . Este efeito prejudica a detecção dos picos em cada ciclo, de forma
que o erro chegou a valores como 15 µs, que representa mais de 20% do período da
portadora de 15 kHz.
Insatisfeitos com isso, adotamos uma metodologia diferente, um pouco mais ro-
busta com relação à fS e fCARRIER e que produziu resultados que melhor descrevem
as características do estímulo condicionado da caixa que construímos. Segmentamos
o sinal sonoro medido em janelas contendo 5 ciclos da portadora e estimamos os
parâmetros a1 e a2 de um modelo auto-regressivo de segunda ordem que representa
o sinal em cada janela. Utilizamos a função ar do MATLAB, com o método dos
Mínimos Quadrados para estimação do modelo mostrado na equação 3.2.
Y [Z] 1
= (3.2)
E[Z] 1 + a1 z + a2 z −2
−1
A frequência f = w/2π dos polos z = eσT + jwT

da função de transferência do mo-
delo obtido (sendo T = (96kHz)− 1 o período de amostragem) representa a frequên-
cia aproximada da portadora medida na janela de 5 ciclos. Podemos calculá-la con-
forme a equação 3.3:
z = eσT +jwT ⇒ z = cos(σT ) + jsen(wT ) = Real + jImag

sen−1 (Imag) sen−1 (Imag)
Imag = sen(wT ) ⇒ w = ⇒f = (3.3)
T 2πT
Como pode ser apreciado na Figura 3.12, essa técnica possibilitou a obtenção de re-
sultados com desvio-padrão consideravelmente menor em comparação com a técnica
anterior.
Figura 3.12: Média e desvio-padrão da frequência da portadora do som reproduzido

pela caixa, calculados por um método mais robusto (modelos auto-regressivos). Para
fCARRIER ajustado em 5 kHz, 10 kHz e 15 kHz, respectivamente, obtivemos 5999, 23999
e 48979 estimativas para cálculo das estatísticas.
No pior caso, que foi para a portadora de 15 kHz, o valor médio de fCARRIER
foi apenas 0,92% diferente do valor esperado. Não acreditamos que esse desvio seja
signicativo a ponto de prejudicar a medição do potencial evocado (como discutido
na Seção 3.3). Logo, a nosso ver, o ajuste da frequência da portadora está sendo
realizado de maneira satisfatória.
A Figura 3.13, por sua vez, mostra sinais de áudio com portadora em 1 kHz e
com diferentes moduladoras, reproduzidos pela caixa de condicionamento e medidos
na saída do amplicador de áudio por meio de um osciloscópio com frequência de
amostragem de 50 kHz. À esquerda, podemos ver trechos de 50 ms de duração de
sinais modulados em 53,71 Hz, 92,77 Hz e 200 Hz, de cima para baixo. À direita, está
a densidade de potência espectral nesses trechos, calculada por meio do algoritmo da
transformada rápida de Fourier (FFT). Pela análise dessa gura, é possível notar os
pico de potência espectral na frequência da portadora, bem como dois picos laterais,
distantes do pico central pelo valor da frequência de modulação. Essa característica
é típica de sinais modulados em amplitude. Além disso, nota-se a presença de picos
de potência associados à interferência eletromagnética da rede elétrica (60 Hz e
harmônicos).
Figura 3.13: Possibilidade de ajuste de modulação do som reproduzido pela caixa de

condicionamento customizada proposta.
Os resultados dos testes em que avaliamos a regularidade da frequência de mo-

dulação do estímulo sonoro, para fmoduladora em 53,71 Hz, 92,77 Hz e 200,00 Hz,
estão ilustrados na Figura 3.14.
No pior caso, para fM ODU LADORA = 92, 77Hz , o valor médio se desvia de apenas
0,19% do valor programado. Considerando a estratégia que adotamos na análise dos
potenciais evocados, em que calculamos a energia do espectro de frequências em uma
faixa de 1 Hz centrada em fM ODU LADORA , acreditamos que esse desvio é desprezível
e não distorce os resultados do cálculo de energia. Portanto, o ajuste da frequência
da moduladora também está sendo realizado satisfatoriamente.
Por m, avaliamos a funcionalidade do ajuste da amplitude do som reproduzido
pela caixa, como ilustrado na Figura 3.15.
A Tabela 3.2 mostra os valores médios e desvio-padrão da amplitude sonora
ao longo dos trechos de 1 segundo correspondentes a cada valor ajustado para o
parâmetro volume. No pior caso, que foi para volume = 70%, o valor médio foi
apenas 2,5% diferente do valor esperado. Na verdade, não existe uma restrição tão
Figura 3.14: Média e desvio-padrão da frequência de modulação do som reproduzido

pela caixa.
Figura 3.15: Possibilidade de ajuste do volume do som reproduzido pela caixa de

condicionamento customizada proposta. Foram reproduzidos trechos de áudio com
diferentes intensidades sonoras, gravados por microfone com o software Audacity
utilizando uma frequência de amostragem de 96 kHz.
forte com relação à regularidade da amplitude do som. O que geralmente se nota em

trabalhos com estimulação auditiva em caixas de condicionamento é que, manter a
amplitude dos estímulos sonoros em uma faixa de, por exemplo, 75 dB a 85 dB, é
suciente.
Tabela 3.2: Média e desvio-padrão da intensidade sonora ajustada através da interface

web.
3.4.2 Caracterização do Estímulo Incondicionado (Choque)

Para ns de ilustração, a Figura 3.16 mostra o padrão de estimulação elétrica nas
barras da caixa de condicionamento, com tpulso_choque_ON = 5ms e tpulso_choque_OF F =
0ms e uma corrente elétrica calibrada para 400 µA. Para obtermos as curvas mos-
tradas na gura, medimos a diferença de potencial através de resistores de 10 kΩ
colocados entre as barras 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6 e 7 e 8 e calculamos a corrente elétrica
por meio da Lei de Ohm (tensão (V) = resistência (Ω)× corrente elétrica (A)).
Figura 3.16: Padrão de estimulação elétrica bifásica aversiva (400µA) nas barras que
formam o assoalho da caixa de condicionamento customizada.
Pode-se perceber um aumento no desvio-padrão do choque a 800 µA e 1000 µA.

Isto provavelmente não se deve ao estímulo do choque em si, mas à baixa resolução
Figura 3.17: Média e desvio-padrão do choque elétrico da caixa de condicionamento

customizada proposta. Para cada valor de intensidade que avaliamos, foram obtidas
50000 amostras de amplitude do choque elétrico ao longo dos trechos de 2 segundos que
programamos via interface web.
do osciloscópio (8 bits) utilizado para registrar as formas de onda nesse teste e ao

ajuste da escala de tensão que tivemos que fazer para evitar que houvesse saturação
da escala vertical do osciloscópio quando medimos os dois valores superiores de
choque. Esse ajuste implicou em uma piora da resolução da medida de corrente
elétrica, que era de 6,25 µA quando medimos os choques de 400 µA e o de 600 µA,
mas passou a ser de 15,63 muA quando medimos os choques de 800 µA e de 1000
µA.
Com relação ao teste que zemos para avaliar a susceptibilidade da amplitude
programada para o choque à eventuais variações na condutância do corpo dos ani-
mais em experimentação, os resultados estão ilustrados na Figura 3.18. Por ela,
podemos ver que uma variação de 50% em torno de 20 kΩ na resistência simulada
do rato provocou, no pior caso (25 kΩ), uma variação correspondente de apenas
4,74% (cerca de 18 µA) na amplitude programada do choque. Entendemos que o
efeito disso no protocolo experimental é desprezível e não oferece riscos à integri-
dade dos dados comportamentais obtidos com a caixa customizada. Vale lembrar
que essa variação na amplitude do choque foi pouco signicativa porque a tensão de
operação do circuito do choque é cerca de 310 V, de forma que a corrente elétrica
programada é, em grande parte, determinada pelos resistores de conguração do
circuito (superiores a 100 kΩ), e não pelo animal em si.
Figura 3.18: Efeito de variações na resistência equivalente do corpo do animal na

intensidade programada para o choque elétrico (estímulo incondicionado).
3.4.3 Protocolo de Condicionamento Clássico ao Medo

Os resultados mostrados na gura 3.19 são os resultados de um protocolo de
condicionamento clássico ao medo, realizado como descrito na Seção 3.3 e com o
auxílio da caixa de condicionamento proposta. Esse protocolo foi realizado pela aluna
Hyorrana Pereira Pinto (PINTO, 2016), no âmbito de seu trabalho de doutorado
e com permissão da CEUA-UFMG (número de processo 264/2015). Os resultados,
gentilmente cedidos pela aluna, permitem constatar a integral funcionalidade do
aparato customizado e, por isso, são de extrema importante para esse trabalho de
mestrado.
Figura 3.19: Avaliação da resposta comportamental de medo (freezing ) em um

protocolo de condicionamento clássico ao medo realizado com ratos Wistar e com a caixa
de condicionamento proposta.
Pela análise da gura, podemos vericar que, no pré-treino, os grupos pareado e

não-pareado não apresentaram distinção signicativa, do ponto de vista estatístico,

com relação à manifestação de resposta de congelamento. Além disso, o tempo de
freezing foi inferior a 10% em todos os trials.
No entanto, no teste (etapa que se deu no dia seguinte à etapa de condiciona-
mento dos animais), notamos como os ratos do grupo pareado passaram a mani-
festar comportamento de medo por tempo signicativamente superior com relação
aos ratos do grupo não-pareado. Em quatro dos seis trials o percentual de freezing
daquele grupo foi superior a 50%. Isso signica que o condicionamento foi bem su-
cedido e, consequentemente, também o foi o projeto da caixa de condicionamento
customizada, que atingiu a nalidade para a qual foi desenvolvida: a realização de
um paradigma comportamental microcontrolado com arquitetura customizável e que
permita a manipulação dinâmica de parâmetros experimentais.
CAPÍTULO 4. CONCLUSÕES 97
Capítulo 4
Conclusões
Esta dissertação de mestrado teve como diretriz o desenvolvimento de um sistema

que permitisse monitoração de atividade eletrosiológica neural em ratos e camun-
dongos, em múltiplos canais e por longos períodos de tempo, e que fosse apropriado
para registro no decorrer de paradigmas comportamentais. É crucial que o cabo que
conecta os eletrodos de registro ao sistema de aquisição de biopotenciais seja o mais
exível e leve possível, contendo uma quantidade reduzida de os, ou mesmo que ele
seja eliminado (que é o caso dos sistemas de registro com uma interface de comuni-
cação sem o). Sabemos que o desenvolvimento tecnológico e ferramental constitui
uma importante etapa no desenvolvimento das ideias em neurociências e, por isso,
os resultados alcançados neste trabalho representam um grande passo para o Núcleo
de Neurociências da UFMG e, possivelmente, outros laboratórios no Brasil.
Desenvolvemos um sistema de registro onde os sinais eletrosiológicos de 16
canais são digitalizados em uma headstage (posicionada sobre a cabeça do animal),
eliminando os tão indesejados artefatos de movimento. A resolução do registro é
de 195 nV referentes aos eletrodos e as dimensões físicas e o peso da headstage (de
apenas 0,5 g e 1,4 cm x 1,8 cm), as torna apropriada para utilização tanto em ratos
quanto em camundongos.
Além disso, desenvolvemos uma backpack, contendo uma bateria e um micro-
controlador, que transmite os dados eletrosiológicos por meio de um protocolo de
comunicação sem o (UDP sobre o protocolo de internet (IP)), resultando em um
sistema de registro com características equiparáveis e, em alguns aspectos, até su-
periores em relação aos sistemas sem o relatados na literatura cientíca recente.
A backpack tem aproximadamente 10 g, é facilmente carregada por ratos adultos e
pode ser colocada em um compartimento de 2,2 cm x 3,0 cm x 2,0 cm.
Para congurar e operar o sistema de registro, bem como visualizar os sinais
eletrosiológicos medidos, construímos uma interface em software LabVIEW. Além
disso, vericamos que cerca de 99,8% dos pacotes transmitidos, à distâncias de até
8 m, são recebidos com sucesso pela aplicação da interface do sistema.
Outra característica importante do sistema proposto é que ele é totalmente ba-

seado em componentes comerciais (RHD2000 para eletrosiologia digital, da Intan
Technologies, ESP8266, um microcontrolador com interface WiFi da Espressif Sys-
tems e um nano strip connector de 18 pinos da Omnetics), a não ser pelas placas de
circuito impresso que projetamos. Isso facilita a implantação do sistema proposto
em outros laboratórios.
Com as baterias LS14250 ou CR2, o sistema permite registro contínuo por aproxi-
madamente duas horas, o que já é suciente para a realização de diversos protocolos
experimentais, como registro durante interação social, condicionamento clássico ao
medo ou condicionamento operante.
Não obstante o aspecto moderno e favorável ao comportamento animal da trans-
missão sem o de dados, vale lembrar que se o peso da backpack não for apropriado,
como é o caso de experimentos com camundongos, nossa headstage digital pode ser
usada para transmitir dados de múltiplos canais através de um cabo leve e exível,
que interfere menos no comportamento dos camundongos.
Dois aspectos do sistema proposto que esperamos melhorar futuramente é o con-
sumo e a frequência de amostragem máxima permitida. O ESP8266 apresenta um
consumo médio da ordem de 100 mA quando está transmitindo pela interface sem
o, valor relativamente elevado para as baterias comerciais na faixa de peso que
desejamos (poucos gramas). Quanto ao parâmetro frequência de amostragem, em
decorrência do atraso excessivo da função de envio de mensagens no barramento
SPI (indicando a necessidade de otimização da biblioteca para o ESP8266 no am-
biente Arduino) e do tempo de processamento exigido pelo próprio ESP8266 para
tratar o protocolo WiFi, a frequência de amostragem máxima conseguida foi de
aproximadamente 50 kHz (distribuídos entre os canais amostrados). Não obstante,
o cenário deve melhorar com as versões futuras da biblioteca para o ESP8266. A
versão utilizada neste trabalho foi a 2.1.0, mas já existem duas versões mais recentes:
a 2.2.0 e a 2.3.0. Portanto, em momento propício, vamos realizar novos testes para
vericar se as melhorias que esperamos já se consolidaram ou não.
Uma possibilidade à qual estamos receptivos é a de substituir o módulo ESP8266
por algum outro microcontrolador com protocolo de comunicação sem o que con-
some menos energia, desde que este não apresente taxa de transmissão de dados
consideravelmente inferior àquele. Isso nos daria o trabalho de adaptar as rotinas
que desenvolvemos para o ESP8266, mas é algo que consideramos perfeitamente
viável caso conseguíssemos reduzir o consumo em algo como 3 vezes (consumo entre
30 mA e 40 mA).
Convém ressaltar, neste ponto, que uma redução de 3 vezes no consumo do
sistema proposto provavelmente acarretaria um aumento muito maior do que 3 vezes
em sua autonomia, uma vez que as baterias apresentam capacidade nominal cada
vez maior para correntes de descarga menores. Logo, com um consumo de 33 mA
(cerca de 3 vezes menos do que 100 mA), provavelmente nosso sistema passaria a
funcionar continuamente por algo como 24 horas com uma bateria LS14250 ou com
uma CR2. Além disso, com uma faixa de consumo menor seria possível trabalhar
com baterias mais leves, o que reduziria o peso da backpack.
Apesar de não termos realizado testes para vericar os detalhes e as diculda-
des inerentes à xação e estabilidade das partes do sistema de registro junto ao
corpo dos animais em experimentação, presumimos que isso não será um grande
problema e poderá ser tratado nos próprios experimentos com utilização do sistema
aqui proposto. Antes de tudo, já temos algumas ideias, como a utilização de ímãs
de Neodímio (que já adquirimos e já se encontram no laboratório) para auxiliar
na xação da headstage e da backpack, como relatado em Rolston, Gross e Potter
(2009).
As características principais do sistema de registro desenvolvido estão resumidas
na Tabela 4.1, que é uma nova versão da Tabela 1.1 apresentada no Capítulo 2,
atualizada com os dados do sistema desenvolvido neste trabalho.
Tabela 4.1: Compilação das características principais de alguns sistemas sem o para
registro de atividade eletrosiológica relatados na literatura.
Como pode ser apreciado na tabela, o parâmetro peso é um aspecto em que nosso
sistema muito se destacou. Nossa headstage tem peso 10 vezes inferior ao da heads-
tage mais leve contemplada na revisão de literatura, que pesa 5 g (GHOMASHCHI

et al., 2014). Além disso, outro aspecto muito interessante do sistema aqui proposto
é o fato de ele se inserir no contexto da Internet of Things, uma vez que ele possui
capacidade de comunicação por protocolo WiFi. Nosso sistema é o único, dentre os
sistemas contemplados na revisão de literatura, que se comunica via protocolo WiFi
IEEE 802.11. Pretendemos explorar essa característica para construir interfaces que
permitam operar nosso sistema e visualizar os sinais eletrosiológicos adquiridos em
tempo real através de smartphones e tablets. Finalmente, é possível notar como o
sistema que propomos apresenta números intermediários de quantidade de canais e
taxa de transmissão de dados.
O sistema apresentado em Yin et al. (2014), com 100 canais para registro a 15
kHz/canal e com dois dias de autonomia, é utilizável apenas em animais de maior
porte do que ratos e camundongos (que interessam mais ao NNC), uma vez que a
headstage pesa mais de 40 g. Além disso, o sistema não é de código aberto, tampouco
é baseado em componentes comerciais, o que complica a implantação e a realização
de adaptações na solução proposta.
Outro sistema com características de destaque é o de Miranda et al. (2009), mas
ele também não é apropriado para pequenos roedores, uma vez que a headstage tem
25 g.
Por sua vez, o sistema de Szuts et al. (2011) possui ampla quantidade de canais
(64), elevado alcance (60 m) e alta taxa de transmissão de dados (20 kHz/canal).
Porém, mais uma vez, o sistema tem peso signicativo, não é apropriado para ca-
mundongos e pode gerar fadiga em ratos, com uma headstage de 27 g e uma backpack
de 40 g.
Com relação ao protocolo de comunicação sem o IEEE 802.11, apesar da elevada
velocidade do respectivo protocolo, não foi possível lograr os 54 Mbits/s indicados
nas especicações do chip ESP8266. Isso se deu por conta de dois fatores: (1) do
overhead de software da biblioteca do ESP8266 para o ambiente Arduino (espe-
cialmente o atraso das funções do protocolo SPI) e (2) dos limites impostos pela
capacidade de processamento do ESP8266.
Com relação aos circuitos integrados comercialmente disponíveis, muito recente-
mente tivemos uma excelente primeira impressão de um novo produto da Espressif,
o módulo ESP32. Ele apresenta características muito interessantes, como altíssimo
poder de processamento (clock a 240 MHz) e suporte aos protocolos WiFi e Blue-
tooth. No entanto, nosso entusiasmo inicial foi seguido de relativo desapontamento
quando demos conta de que o consumo desse módulo é superior ao do ESP8266, o
que vai contra o nosso intuito de reduzir o consumo do sistema de registro sem o
proposto.
Outro interessante lançamento, divulgado recentemente pela Intan, é a família
de chips denominada RHS2000, uma versão superior à utilizada nesse trabalho (a
RHD2000), que integrou um sistema de microestimulação elétrica aos chips mini-

aturizados. Como já desenvolvemos rotinas para comunicação e conguração dos
chips RHD2000, acreditamos que em poucas semanas podemos adaptar nossa he-
adstage e nosso software para que, além de registro, possamos também trabalhar
com microestimulação elétrica profunda do cérebro por um sistema com interface
sem o. Essa possibilidade é especialmente interessante para os trabalhos realizados
no NNC com investigação cientíca sobre previsão e supressão de crises epilépticas,
como abordado na Seção 1.3.
Além disso, seria interessante incorporar optogenética ao projeto do sistema de
registro, por meio de LEDs com diâmetro da ordem de nanômetros implantados no
cérebro e controlados por tensão em pinos GPIO do ESP8266. Essa ferramenta para
investigação cientíca tem sido muito utilizada para dissecar os circuitos neurais
(WIMMER et al., 2015).
Quanto ao aparato construído para condicionamento comportamental, além de
ser uma alternativa de baixo custo para as caixas de condicionamento disponíveis
no mercado, o intuito é que ela seja uma prova de conceito de uma alça retro-
alimentada na qual as condições de contorno experimentais possam ser modicadas
dinamicamente. Essa é uma mudança de paradigma em experimentação, que per-
mite manipular simultaneamente diversas variáveis contextuais e avaliar as reações
neurosiológicas/comportamentais correspondentes.
Com a caixa proposta, o experimentador pode programar as características dos
estímulos condicionado e incondicionado (intensidade, padrões temporais e duração).
Esses recursos não são comuns em modelos comerciais de caixas de condicionamento.
A escalabilidade também é uma característica importante da solução proposta, pois
sua arquitetura envolve a operação conjunta de dois microcontroladores (o ESP8266
e o Arduino Due), que permitem incorporar novos recursos e variáveis experimen-
tais aos protocolos sem grandes modicações de projeto. A ideia de adicionar novas
variáveis aos experimentos enriquece o trabalho cientíco e encoraja os grupos de
pesquisa a conceberem metodologias de investigação com suas próprias característi-
cas, contribuindo para o desenvolvimento da pesquisa.
A conabilidade das características programáveis dos estímulos da caixa (som e
choque) foi comprovada, sendo eles, portanto, apropriados para produzir respostas
comportamentais de medo. O único parâmetro cuja conguração não é feita através
da interface web é a intensidade do choque elétrico, que é regulada manualmente
por meio de um potenciômetro analógico. Não obstante, ele será substituído por
modelos comerciais de potenciômetro digital, cuja resistência é programável via in-
terface serial. Desta forma, após um processo de calibração da curva que representa
a amplitude do choque em função da resistência do potenciômetro, estaremos aptos
a ajustar a intensidade da estimulação elétrica aversiva também através da interface,
facilitando ainda mais o uso do equipamento.
Além disso, em um momento posterior, temos o intuito de equipar a caixa com

sensores infra-vermelho (para detecção da posição e movimento do animal dentro
da caixa), emissores de estímulos luminosos, como luz estroboscópica (outro tipo de
estímulo condicionado) e com um mecanismo de controle de acesso à comida e água
por parte dos animais, algo que pode ser realizado pelo acionamento de servomotores
controlados pelos microcontroladores da caixa. Este último mecanismo é comumente
utilizado em protocolos de condicionamento operante.
Apesar do aprimoramento que sabemos essencial, a caixa customizada já está
sendo utilizada com resultados satisfatórios em dois trabalhos de doutorado no NNC,
que envolvem a realização de protocolos de condicionamento ao medo.
No mais, esperamos que as soluções construídas ao longo deste trabalho des-
pertem o interesse de centros e grupos de pesquisa, tendo em vista que o trabalho
conjunto e colaborativo é muito importante para que essas ferramentas sejam me-
lhoradas e aperfeiçoadas. De nossa parte, muito satisfeitos caríamos caso essas
soluções efetivamente vierem a aumentar a qualidade, a quantidade e o impacto
das publicações cientícas do Núcleo de Neurociências e também do Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Elétrica da UFMG.
Referências Bibliográcas
AMELI, R. et al. A wireless and batteryless neural headstage with optical
stimulation and electrophysiological recording. In: IEEE. 2013 35th Annual
International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society
(EMBC). [S.l.], 2013. p. 56625665. 13
ANDERSEN, P.; BLISS, T. V.; SKREDE, K. Unit analysis of hippocampal
population spikes. Experimental Brain Research, Springer, v. 13, n. 2, p. 208221,
1971. 8
ANGOTZI, G. N. et al. A programmable closed-loop recording and stimulating

wireless system for behaving small laboratory animals. Scientic reports, Nature
Publishing Group, v. 4, 2014. 16
ATIVANICHAYAPHONG, T. et al. A combined wireless neural stimulating and

recording system for study of pain processing. Journal of neuroscience methods,
Elsevier, v. 170, n. 1, p. 2534, 2008. 16
BABICH, F. R. et al. Transfer of a response to naive rats by injection of

ribonucleic acid extracted from trained rats. Science, American Association for the
Advancement of Science, v. 149, n. 3684, p. 656657, 1965. 18
BERGER, H. On the electroencephalogram of man. sixth report. Electroencephalo-

graphy and clinical neurophysiology, p. 1630, 1931. 7
BUZSÁKI, G.; ANASTASSIOU, C. A.; KOCH, C. The origin of extracellular
elds and currents - eeg, ecog, lfp and spikes. Nature reviews neuroscience, Nature
Publishing Group, v. 13, n. 6, p. 407420, 2012. 7
CATON, R. Electrical currents of the brain. Journal of Nervous & Mental Disease,
v. 2, n. 4, p. 610, 1875. 6
CHESTEK, C. A. et al. Hermesc: low-power wireless neural recording system for

freely moving primates. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation
Engineering, v. 17, n. 4, p. 330, 2009. 15
CHEUNG, M. M. et al. Bold fmri investigation of the rat auditory pathway and
tonotopic organization. Neuroimage, Elsevier, v. 60, n. 2, p. 12051211, 2012. 82
COENEN, A.; FINE, E.; ZAYACHKIVSKA, O. Adolf beck: A forgotten pioneer

in electroencephalography. Journal of the History of the Neurosciences, Taylor &
Francis, v. 23, n. 3, p. 276286, 2014. 7
103
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 104
COTA, V. R. et al. Distinct patterns of electrical stimulation of the basolateral

amygdala inuence pentylenetetrazole seizure outcome. Epilepsy & Behavior,
Elsevier, v. 14, n. 1, p. 2631, 2009. 2, 3
D'AUSILIO, A. Arduino: A low-cost multipurpose lab equipment. Behavior

research methods, Springer, v. 44, n. 2, p. 305313, 2012. 27
DUNCAN, I. et al. The pattern of food intake in female brown leghorn fowls as
recorded in a skinner box. Animal Behaviour, Elsevier, v. 18, p. 245255, 1970. 18
ENGEL, A. K. et al. Invasive recordings from the human brain: clinical insights
and beyond. Nature Reviews Neuroscience, Nature Publishing Group, v. 6, n. 1, p.
3547, 2005. 8
ENGELMANN, M.; LANDGRAF, R. Microdialysis administration of vasopressin

into the septum improves social recognition in brattleboro rats. Physiology &
behavior, Elsevier, v. 55, n. 1, p. 145149, 1994. 16
ERLICH, J. C.; BUSH, D. E.; LEDOUX, J. E. The role of the lateral amygdala in
the retrieval and maintenance of fear-memories formed by repeated probabilistic
reinforcement. Frontiers in behavioral neuroscience, Frontiers, v. 6, p. 16, 2012. 18
GHOMASHCHI, A. et al. A low-cost, open-source, wireless electrophysiology

system. In: IEEE. 2014 36th Annual International Conference of the IEEE
Engineering in Medicine and Biology Society. [S.l.], 2014. p. 31383141. 11, 12, 100
HAMPSON, R. E.; COLLINS, V.; DEADWYLER, S. A. A wireless recording
system that utilizes bluetooth technology to transmit neural activity in freely
moving animals. Journal of neuroscience methods, Elsevier, v. 182, n. 2, p. 195204,
2009. 12, 13
HARNER, R. N. et al. Computed eeg topography in epilepsy. Revue neurologique,

v. 143, n. 5, p. 457461, 1986. 7
ISHIKAWA, D. et al. Operant conditioning of synaptic and spiking activity patterns

in single hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience, Soc Neuroscience,
v. 34, n. 14, p. 50445053, 2014. 18
KAISER, D. A. Basic principles of quantitative eeg. Journal of Adult Development,

Springer, v. 12, n. 2-3, p. 99104, 2005. 7
KIANI, M.; JOW, U.-M.; GHOVANLOO, M. Design and optimization of a 3-coil

inductive link for ecient wireless power transmission. IEEE transactions on
biomedical circuits and systems, IEEE, v. 5, n. 6, p. 579591, 2011. 13
LACY, R. T.; STRICKLAND, J. C.; SMITH, M. A. Cocaine self-administration
in social dyads using custom-built operant conditioning chambers. Journal of
neuroscience methods, Elsevier, v. 236, p. 1118, 2014. 18
LANG, P. J.; DAVIS, M.; ÖHMAN, A. Fear and anxiety: animal models and
human cognitive psychophysiology. Journal of aective disorders, Elsevier, v. 61,
n. 3, p. 137159, 2000. 17
LEUNG, L.-W. S. Field potentials in the central nervous system. Neurophysiological

Techniques: Applications to Neural Systems, Springer, p. 277312, 1990. 8
LEWICKI, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and
classication of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems,
Taylor & Francis, v. 9, n. 4, p. 5378, 1998. 8
LIKHTIK, E. et al. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in

learned fear and innate anxiety. Nature neuroscience, Nature Publishing Group,
v. 17, n. 1, p. 106113, 2014. 18
LOTTE, F. et al. A review of classication algorithms for eeg-based braincomputer

interfaces. Journal of neural engineering, IOP Publishing, v. 4, n. 2, p. R1, 2007. 7
MALMIERCA, M. S. The inferior colliculus: a center for convergence of ascending

and descending auditory information. Neuroembryology and Aging, Karger
Publishers, v. 3, n. 4, p. 215229, 2004. 50
MALMIERCA, M. S. et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior

colliculus of the rat. The Journal of Neuroscience, Soc Neuroscience, v. 28, n. 18,
p. 47674776, 2008. 82
MAREN, S.; PHAN, K. L.; LIBERZON, I. The contextual brain: implications for
fear conditioning, extinction and psychopathology. Nature Reviews Neuroscience,
Nature Research, v. 14, n. 6, p. 417428, 2013. 18
MEDEIROS, D. C. et al. Temporal rearrangement of pre-ictal ptz induced spike

discharges by low frequency electrical stimulation to the amygdaloid complex.
Brain stimulation, Elsevier, v. 7, n. 2, p. 170178, 2014. 2
MEDEIROS, D. d. C. Resposta evocada por estimulação elétrica cerebral
profunda como um marcador substituto de crise epiléptica induzida por infusão de
pentilenotetrazol em ratos. Tese (Doutorado) Universidade Federal de Minas
Gerais, 2014. 3
MEDEIROS, D. d. C.; MORAES, M. F. D. Focus on desynchronization rather

than excitability: a new strategy for intraencephalic electrical stimulation. Epilepsy
& Behavior, Elsevier, v. 38, p. 3236, 2014. 2, 3
MEEREN, H. et al. Auditory evoked potentials from auditory cortex, medial
geniculate nucleus, and inferior colliculus during sleepwake states and spike-wave
discharges in the wag/rij rat. Brain research, Elsevier, v. 898, n. 2, p. 321331,
2001. 70
MIRANDA, H. et al. A high-rate long-range wireless transmission system for

multichannel neural recording applications. In: IEEE. 2009 IEEE International
Symposium on Circuits and Systems. [S.l.], 2009. p. 12651268. 14, 100
MORAES, M. F. D.; GALVIS-ALONSO, O. Y.; GARCIA-CAIRASCO, N.
Audiogenic kindling in the wistar rat: a potential model for recruitment of limbic
structures. Epilepsy research, Elsevier, v. 39, n. 3, p. 251259, 2000. 10
MOURÃO, F. A. G. et al. Triggering dierent brain states using asynchronous

serial communication to the rat amygdala. Cerebral Cortex, Oxford, p. 112, 2015.
18
NARGEOT, R.; SIMMERS, J. Neural mechanisms of operant conditioning and

learning-induced behavioral plasticity in aplysia. Cellular and Molecular Life
Sciences, Springer, v. 68, n. 5, p. 803816, 2011. 17
NIEDERMEYER, E.; SILVA, F. L. da. Electroencephalography: basic principles,
clinical applications, and related elds. [S.l.]: Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
7
NIELSEN, J. 10 usability heuristics for user interface design. Fremont: Nielsen

Norman Group, 1995. 40
OHYAMA, M. et al. Asenapine reduces anxiety-related behaviours in rat
conditioned fear stress model. Acta neuropsychiatrica, p. 110, 2016. 17
OPEN-EPHYS. Open Ephys - Open-Source Electrophysiology. 2011. Acesso

realizado em Outubro de 2016. Disponível em: <http://www.open-ephys.org/>. 3
PAXINOS, G.; WATSON, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic,

San Diego, 1998. 51
PEREIRA, H. P. Avaliação da Via Acústica Através de Respostas Auditivas
Evocadas em Regime Permanente nos Ratos Wistar Audiogênicos. Dissertação
(Mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, 2014. 2
PHELPS, E. A.; LEDOUX, J. E. Contributions of the amygdala to emotion

processing: from animal models to human behavior. Neuron, Elsevier, v. 48, n. 2,
p. 175187, 2005. 17
PINEÑO, O. Arduipod box: A low-cost and open-source skinner box using an ipod
touch and an arduino microcontroller. Behavior research methods, Springer, v. 46,
n. 1, p. 196205, 2014. 18
PINTO, H. P. Trabalho de Doutorado em andamento. Tese (Doutorado)

Universidade Federal de Minas Gerais, 2016. 95
RAMRAKHYANI, A. K.; MIRABBASI, S.; CHIAO, M. Design and optimization of

resonance-based ecient wireless power delivery systems for biomedical implants.
IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems, IEEE, v. 5, n. 1, p. 4863,
2011. 13
ROGAN, M. T.; STÄUBLI, U. V.; LEDOUX, J. E. Fear conditioning induces

associative long-term potentiation in the amygdala. Nature, Nature Publishing
Group, v. 390, n. 6660, p. 604607, 1997. 18
ROLSTON, J. D.; GROSS, R. E.; POTTER, S. M. A low-cost multielectrode

system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid
recovery from stimulation artifacts. Frontiers in Neuroengineering, Frontiers, v. 2,
p. 12, 2009. 99
SAFT. Primary lithium battery LS 14250. [S.l.], 2009. Acesso realizado em Maio de
2016. Disponível em: <http://www.saftbatteries.com/force_download/LS14250.
pdf>. 62
SANTHANAM, G. et al. Hermesb: a continuous neural recording system for freely

behaving primates. IEEE Transactions on Biomedical Engineering, IEEE, v. 54,
n. 11, p. 20372050, 2007. 15
SCHWARTZ, A. B. Cortical neural prosthetics. Annu. Rev. Neurosci., Annual

Reviews, v. 27, p. 487507, 2004. 15
SHETTLEWORTH, S. J. Animal cognition and animal behaviour. Animal

behaviour, Elsevier, v. 61, n. 2, p. 277286, 2001. 17
SIA, J.; MACNEIL, D.; SIGG, E. A miniature three-channel preamplier for unit
recording in freely moving animals. Physiology & behavior, Elsevier, v. 7, n. 1, p.
121122, 1971. 9
SKINNER, B. F. Science and human behavior. [S.l.]: Simon and Schuster, 1953. 18
SKINNER, B. F. The behavior of organisms: An experimental analysis. [S.l.]: BF
Skinner Foundation, 1990. 18
SZUTS, T. A. et al. A wireless multi-channel neural amplier for freely moving

animals. Nature neuroscience, Nature Publishing Group, v. 14, n. 2, p. 263269,
2011. 13, 14, 100
TECHNOLOGIES, L. I. RHD2000 Series Digital Electrophysiology Interface

Chips. [S.l.], 2013. Acesso realizado em Abril de 2016. Disponível em:
<http://www.intantech.com/les/Intan_RHD2000_series_datasheet.pdf>. 32
TECHNOLOGIES, L. I. RHD2000-Series Amplier Evaluation System.

[S.l.], 2016. Acesso realizado em Setembro de 2016. Disponível em: <http:
//intantech.com/les/Intan_RHD2000_eval_system.pdf>. 38
TEPLAN, M. Fundamentals of eeg measurement. Measurement science review,

v. 2, n. 2, p. 111, 2002. 7
WAGNER, A. R.; RUDY, J. W.; WHITLOW, J. W. Rehearsal in animal

conditioning. Journal of Experimental Psychology, American Psychological
Association, v. 97, n. 3, p. 407, 1973. 17
WALTER, W. G. et al. Contingent negative variation: An electric sign of

sensori-motor association and expectancy in the human brain. Nature, v. 203, n. 2,
p. 380384, 1964. 7
WALTERS, G.; TULLIS, C. Skin resistance changes in the rat during repeated
encounters with electric shock. Psychonomic Science, Springer, v. 5, n. 9, p.
359360, 1966. 76, 85
WANG, J. et al. A low-cost, multiplexed electrophysiology system for chronic µecog

recordings in rodents. In: IEEE. 2014 36th Annual International Conference of the
IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. [S.l.], 2014. p. 52565259. 10,
11
WEY, T. et al. Social network analysis of animal behaviour: a promising tool for
the study of sociality. Animal behaviour, Elsevier, v. 75, n. 2, p. 333344, 2008. 17
WIMMER, R. D. et al. Thalamic control of sensory selection in divided attention.

Nature, Nature Publishing Group, v. 526, n. 7575, p. 705709, 2015. 101
YIN, M. et al. Wireless neurosensor for full-spectrum electrophysiology recordings
during free behavior. Neuron, Elsevier, v. 84, n. 6, p. 11701182, 2014. 15, 100

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Universidade Federal de Minas Gerais

Um Sistema Sem Fio Microcontrolado para

Aluno: Paulo Aparecido Amaral Júnior

Orientador: Prof. Dr. Hermes Aguiar Magalhães

Coorientador: Prof. Dr. Márcio Flávio Dutra Moraes

Este trabalho foi realizado no Núcleo de Neurociências da UFMG

Belo Horizonte, Dezembro de 2016

Universidade Federal de Minas Gerais

Um Sistema Sem Fio Microcontrolado para

Aluno: Paulo Aparecido Amaral Júnior

Orientador: Prof. Dr. Hermes Aguiar Magalhães

Coorientador: Prof. Dr. Márcio Flávio Dutra Moraes

Dissertação de Mestrado submetida à Banca Examina-

Belo Horizonte, Dezembro de 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Vigência do Projeto 15/10/2016 a 15/10/2020

Belo Horizonte, 21/10/2016.

Sistema Solicite CEUA UFMG

Universidade Federal de Minas Gerais

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Aos meus pais, Paulo e Silvana, com carinho.

professores da UFMG, e consequentemente, nosso país, têm muito a ganhar com a

Para dissecar os circuitos neurais, o conceito de interagir bidirecionalmente com o

Palavras-chave: Eletrosiologia, Eletroencefalograa, Sistema de Registro Sem

In order to dissect neural circuits, the concept of bidirectional interaction with

Lista de Abreviaturas xiv

2 Uma Proposta de Sistema Sem Fio Para Registro Eletrosiológico 29

2.2.2 RHD2000 - Uma Família de Microchips para Eletrosiologia

3 Uma Proposta de Aparato Microcontrolado para Condicionamento

1.1 Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico. . . . . . . 10

2.1 Arquitetura organizacional do sistema de registro sem o proposto. . 30

2.15 Desenho representativo do conteúdo do arquivo de registro criado pela

2.31 Correção do defasamento observado ao longo do tempo entre os regis-

3.1 Diagrama de blocos representativo da caixa de condicionamento cus-

3.11 Média e desvio-padrão da frequência da portadora do som reprodu-

1.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

2.1 Conguração de pinos do ESP8266 para selecionar seu modo de ini-

3.1 Lista de materiais da caixa de condicionamento customizada proposta. 83

4.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

1.1 Descrição do Problema

muito seletos, principalmente no âmbito nacional, desenvolveram sistemas de regis-

1.2 O Núcleo de Neurociências da UFMG

1.3 Motivação do Trabalho

crises) (COTA et al., 2009) (MEDEIROS; MORAES, 2014) (MEDEIROS, 2014).

• Há grande interesse em realizar registros eletrosiológicos de longa duração

em ratos e camundongos, com sistema sem o ou ao menos baseado em um

• Há também restrições provocadas pelas caixas de condicionamento do com-

• Com sólido know-how em engenharia, uma forte característica do NNC, inte-

1. Desenvolver um sistema de registro de atividade eletrosiológica em múltiplos

2. Desenvolver uma ferramenta para a realização de paradigmas comportamen-

(a) Projetar, construir e validar um sistema de registro com uma headstage

quantidade reduzida de os (utilizando um protocolo de comunicação

2. Ferramenta para a realização de paradigmas comportamentais:

(a) Projetar, construir e validar uma caixa de condicionamento microcontro-

(b) Especicar uma plataforma de hardware ou um microcontrolador com ca-

1.5 Revisão de Literatura

(COENEN; FINE; ZAYACHKIVSKA, 2014). Esse experimento foi muito importante

de eletrodos invasivos (ENGEL et al., 2005). Essa técnica possibilita a obtenção de

Potencial de Campo Local (LFP)

Componentes Principais de um Sistema de Registro Eletro-

1.5.2 Sistemas de Registro Eletrosiológico com Transmissão

Figura 1.1: Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico (retirado do site

Uma estratégia para contornar o problema dos artefatos de movimento consiste

sequência imediata disso foi o surgimento de headstages contendo todos os estágios

Palavras-chave: Eletrosiologia, Eletroencefalograa, Sistema de Registro Sem

2 Uma Proposta de Sistema Sem Fio Para Registro Eletrosiológico 29

2.2.2 RHD2000 - Uma Família de Microchips para Eletrosiologia

1.1 Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico. . . . . . . 10

2.1 Arquitetura organizacional do sistema de registro sem o proposto. . 30

1.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

2.1 Conguração de pinos do ESP8266 para selecionar seu modo de ini-

4.1 Compilação das características principais de alguns sistemas sem o

• Há grande interesse em realizar registros eletrosiológicos de longa duração

em ratos e camundongos, com sistema sem o ou ao menos baseado em um

1. Desenvolver um sistema de registro de atividade eletrosiológica em múltiplos

quantidade reduzida de os (utilizando um protocolo de comunicação

(b) Especicar uma plataforma de hardware ou um microcontrolador com ca-

Componentes Principais de um Sistema de Registro Eletro-

1.5.2 Sistemas de Registro Eletrosiológico com Transmissão

Figura 1.1: Diagrama de um sistema de registro eletrosiológico típico (retirado do site

Figura 1.3:Sistema de registro sem o com microcontrolador PIC, uma headstage

Figura 1.4: Sistema de registro eletrosiológico com um chip Neuroplat e transmissão

Dito isso, com o intuito de sistematizar a investigação cientíca baseada em

1.6 Especicações de Projeto do Sistema de Regis-

• Os bioamplicadores devem ter relação de rejeição em modo comum (CMRR)

• A taxa de transmissão de dados eletrosiológicos (taxa efetiva, não levando em

• O ganho dos bioamplicadores e a resolução do conversor AD utilizado para di-

• A relação entre o consumo total do sistema sem o e a capacidade da bateria

1.7 Especicações de Projeto da Caixa de Condi-

modicações, que outros tipos de estímulos e recursos sejam incorporados ao sistema,

compor o sistema de aquisição de sinais eletrosiológicos, incluindo amplicação,

3. A largura de banda dos bioamplicadores é programável via interface periférica

Durante a revisão bibliográca e busca pela internet, tomamos conhecimento de

estão presentes em sistemas de registro sem o relatados na literatura e discutidos

cações sugerem uma descarga contínua máxima de 35 mA e aponta que a bateria

Figura 2.1: Arquitetura organizacional do sistema de registro sem o proposto.

Figura 2.2: Ilustração do sistema de registro sem o proposto.

2.2.2 RHD2000 - Uma Família de Microchips para Eletro-

• chips de 16 ou 32 canais para eletrosiologia, de 8 mm x 8 mm.

• bioamplicadores unipolares (modelos RHD2116 e RHD2132) ou diferenciais

• ganho xo e igual a 192;

• possibilidade de ligar/desligar bioamplicadores individuais para otimização

• largura de banda dos bioamplicadores programável;

• interface periférica serial por meio da qual os dados eletrosiológicos digitali-

Figura 2.3: Família RHD2000 de microchips para eletrosiologia digital da Intan