ISBN 978-85-61091-05-7 VI EPCC Encontro Internacional de Produo Cientfica Cesumar 27 a 30 de outubro de 2009

APLICAO BIOTECNOLGICA DE MATRIZES INORGNICAS PREPARADAS PELO PROCESSO SOL-GEL PARA IMOBILIZAO DAS BACTRIAS KLEBSIELLA OXYTOCA
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Marcos Vinicius Isaias Lima; 2Leandro da Silva Clementino; 3Jos Eduardo Gonalves.

RESUMO: microorganismos em sua grande variedade desempenham funes como componentes fundamentais de cadeias alimentares, ciclos biogeoqumicos, assim ajudam as plantas no seu crescimento, adaptao e desenvolvimento. As bactrias isoladas identificadas como Klebsiella oxytoca, foram submetidas a ensaios visando quantificar a produo de cido indolactico (AIA) em meio de cultura NFbmalato suplementado com triptofano. No Brasil, h um forte incentivo para a produo de CDs a baixo custo, devido grande disponibilidade e facilidade de obteno do substrato amido, sendo que o seu emprego na produo das CDs agregar valor a esta matria-prima. Os extratos dos sobrenadantes das culturas, incubados por diversos perodos de tempo, foram submetidos anlise espectrofotomtrica para quantificao do AIA. As cepas de Klebsiella oxytoca produziram AIA e -CD em maior porcentagem quando imobilizadas com matrizes produzidas no processo sol-gel.

PALAVRAS-CHAVE: Klebsiella oxytoca, processo sol-gel, AIA, -ciclodextrinas.

1 INTRODUO O processo sol-gel oferece uma versatilidade na formao dos compostos, principalmente por possibilitar a sntese de sistemas multicomponentes em que a estequiometria, tamanho de partculas, poros, microestrutura e homogeneidade podem ser muito bem controladas. Dentre os compostos de constituio simples, utilizados para a preparao de novos materiais via processo sol-gel, destacam-se os alcxidos, sendo mais particularmente conhecidos os dos elementos silcio, alumnio, zircnio e titnio, largamente empregados (AIROLD, FARIAS, 2004; DUTOIT et al., 1997). Nos ltimos anos, xidos binrios do tipo SiO2/MxOy, TiO2/MxOy preparados pelo processo sol-gel tambm tm sido utilizados com o propsito de obter materiais com caractersticas diversas. Gel ou xerogel preparados por esse mtodo so considerados novos materiais com utilizao em diversos fins, por apresentarem alta rea superficial e oferecerem a possibilidade de reagir com cidos de Brnsted, resultando num cido imobilizado altamente disperso (GONALVES et al., 1999).

1 Acadmico do Curso Biomedicina - Centro Universitrio de Maring CESUMAR, Maring PR. Bolsista do Programa de Bolsas de Iniciao Cientfica do PROBIC/FUNDAO ARAUCRIA-Cesumar (PROBIC-Cesumar).marcos_viniciusbr@hotmail.com 2 Acadmico do Curso Biomedicina - Centro Universitrio de Maring CESUMAR, Maring PR. Bolsista do Programa de Bolsas de Iniciao Cientfica do PROBIC/FUNDAO ARAUCRIA-Cesumar (PROBIC-Cesumar).leandro_mga18@hotmail.com 3 Docente do CESUMAR. Departamento de Farmcia do Centro Universitrio de Maring CESUMAR, Maring PR. jegoncal@cesumar.br VI EPCC
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A imobilizao de enzimas e clulas microbianas um setor com ampla aplicao industrial devido maior facilidade de armazenamento e vida til do biocatalisador. As reaes realizadas com enzimas e microrganismos suportados apresentam vantagens sobre as condies tradicionais (no suportadas), pois so mais facilmente processadas, permitem processos contnuos e diminuem o nmero de operaes unitrias necessrias nas indstrias (QUINTANA et al., 1999). Atualmente mtodos usuais de imobilizao so baseados em quatro tcnicas alternativas: encapsulamento em matriz polimtrica, adsoro em superfcie, ligao covalente em suportes slidos insolveis em gua e ligao qumica cruzada com reagentes bifuncionais. Devido ao alto grau de variabilidade individual inerente aos sistemas biolgicos no existe um mtodo genrico e ideal para todo o universo dos microrganismos e reaes de interesse (BIECKERSTAFF, 1997). Os microrganismos apresentam uma grande diversidade gentica e desempenham funes como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos assim ajudam as plantas no seu crescimento, adaptao e desenvolvimento. Muitos destes microrganismos so encontrados no espao densamente enraizado do solo (rizosfera) e se aproveitam das excrees radiculares da planta que lhe serve como fonte de nutrientes, e estes, em adversidade e atividade microbiana do solo constituem fatores importantes na sustentabilidade dos ecossistemas. Apesar de sua grande importncia na manuteno da biosfera, estima-se que menos de 2% dos microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos, e isto no feito apenas em bases morfolgicas, mas tambm com mtodos genticos, bioqumicos e fisiolgicos (PRIMAVESI, 1982; NBREGA, et al., 2004; GONALVES, 2002). Sabe-se que o gnero Klebsiella e outros grupos de bactrias RPCP produzem e liberam um largo espectro de substncias reguladoras de crescimento de plantas, como auxinas, diversas giberelinas e citocininas. Entre as auxinas, o cido indolactico (AIA) o mais comum, as quais so conhecidas por estimular uma resposta rpida levando ao aumento do enlongamento celular e outra de longa durao estimulando a diviso e diferenciao celular nas plantas (EL-KHAWAS et al., 1999; BEYELER et al., 1997; TEIXEIRA et al., 2007). As ciclodextrinas (CDs) so maltooligossacardeos cclicos constitudos por um nmero varivel de unidades de glicose, unidos por ligao -1,4. As mais comuns so constitudas por 6, 7 e 8 unidades de glicose, respectivamente -CD, -CD e -CD. As vantagens em potencial do uso e da disponibilidade das CDs vm tendo papel decisivo no crescente interesse pelas mesmas. Elas so usadas em alimentos, frmacos, cosmticos, indstria txtil, indstria de papel, tecnologia qumica, qumica analtica, entre outros processos (MATIOLI, 2000). As CDs so produzidas, usualmente, a partir do amido pela reao de ciclizao das cadeias lineares de glucopiranose pela enzima ciclodextrina flicosiltransferase (CGTase). No Brasil, h um forte incentivo para a produo de CDs a baixo custo, devido grande disponibilidade e facilidade de obteno do substrato amido, sendo que o seu emprego na produo das CDs agregar valor a esta matria-prima (MATIOLI, 2000). Os sistemas com clulas imobilizadas tm sido amplamente revisado e aplicados em diversos processos biotecnolgicos. Sua aplicao oferece vantagens, tais como a habilidade em separar a massa celular no final do processo para posterior reutilizao, facilitando as operaes descontnuas. Tambm melhoram as caractersticas dos processos contnuos, quando da necessidade de operao por um perodo prolongado, aumentando a produtividade do reator (ABDEL-NABY et al., 2000). 2 MATERIAL E MTODOS 2.1.1 Crescimento da Klebsiella oxytoca
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A inoculao da Klebsiella oxytoca em estudo ser realizada pela transferncia de um inoculo com ala de platina para o meio lquido NFb malato livre de nitrognio mineral e mantido em agitador rotatrio (120 rpm) 28o C por 168 horas. As clulas bacterianas sero centrifugadas (5000 rpm) e lavadas duas vezes com 25 mL de soluo tampo (NaHPO4.7 H2O / KH2PO4, 0,1 mol L-1 pH 7) estril. 2.1.2 Preaparao do meio NFb malato Para a preparao de 1000 mL do meio NFb malato ser utilizado: 5,0g de cido mlico; 0,5g de K2HPO4; 0,2g de MgSO4.7H2O; 0,1g de NaCL; 0,02g de CaCl2.2H2O; 2mL de soluo micronutriente; 2mL de azul de bromotimol 0,2%; 4mL de soluo FeEDTA; 1mL de soluo de vitaminas e 4,5g de KOH. Ajustar o pH para 6,5-6,8 com NaOH e completar o volume para 1000mL com gua destilada. Para a produo da soluo de micronutrientes 1000mL utilizar: 0,04g de CuSO4.5H2O; 1,20g de ZnSO4.7H2O; 1,40g de H3BO3; 1,0g de Na2MoO4.2H2O; 1,75g de MnSO4.H2O. Completar o volume para 1000mL de gua destilada. Preparao de soluo de vitaminas (1000mL) utilizar: 10mg de biotina (B1); 20mg de piridoxol-HCl. Dissolver em banho-maria e completar o volume para 1000mL com H2O destilada. 2.1.4 Imobilizao dos microrganismos nas matrizes inorgnicas A imobilizao das bactrias sero realizadas em enlenmeyer (250 mL) contendo gua destilada estril (50 mL), clulas integras do microrganismo previamente lavadas (ca. 1,2g, peso mido) e as matrizes inorgnicas (0,6g) esterilizada. A suspenso resultante ser agitada a 120 rpm, mantendo-se a temperatura em 28oC. Aps 12 horas o slido ser filtrado. Uma parte do material imobilizado ser estocada em recipientes estreis sob refrigerao para testar sua estabilidade e verificar a manuteno da sua atividade biocataltica aps perodos de estocagem (MARSAIOLI et al, 2001). 2.1.5 Preparo das amostras para microscopia eletrnica de varredura (MEV) Aps a adsoro das bactrias nas matrizes inorgnicas, os materiais sero colocados em presena de uma soluo tampo (NaHPO4.7 H2O / KH2PO4, 0,1 mol L-1 pH 7) contendo 2,5% de glutaraldedo por 24 horas. Aps este perodo as solues sobrenadantes sero descartadas e os materiais lavados trs vezes com solues etanlicas de 30%, 50%, 70%, 90% e 100% consecutivamente. O mesmo procedimento ser realizado com as clulas bacterianas no imobilizadas. O material permanecer em etanol absoluto at a realizao do ponto crtico, utilizando CO2 lquido alta presso. 2.1.6 Microscopia eletrnica de Varredura (MEV) As amostras para micrografia sero colocadas sobre a superfcie de uma fita dupla face aderida ao porta-amostra de alumnio. Para as micrografias das matrizes inorgnicas, das clulas bacterianas livres e imobilizadas ser depositada uma camada fina de ouro, atravs de um metalizador Shimadzu. As micrografias sero obtidas em um microscpio eletrnico de varredura Shimadzu. A tenso de acelerao utilizada para as amostras biolgicas ser de 15 KeV e para a matriz inorgnica de 20 KeV.
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2.1.7 Quantificao do cido indolactico em Klebsiella oxytoca imobilizada nas matrizes inorgnicas Amostras isoladas e imobilizadas de Klebsiella oxytoca sero cultivadas em meio lquido NFb malato livre de nitrognio mineral, ao qual foi adicionado o triptofano (100g.mL-1), os isolados sero cultivados a 28oC com agitao por um perodo de tempo variando de 24 168 horas. Aps cada um destes perodos os meios de cultura sero centrifugados, a seguir a 1 mL dos sobrenadantes sero adicionados 2 mL do reativo de Salkowski e depois de 25 minutos ser realizado a leitura em um espectrofotmetro Varian a 530 nm. O AIA ser utilizado como padro na concentrao de 10 100100g.mL-1. Os sobrenadantes das culturas em diferentes tempos de incubao sero alcalinizados a pH 6,8 e extrado com acetato de etila. A frao aquosa resultante ser acidificada a pH 2,8 e extrada com acetato de etila. As fraes orgnicas cida e bsica sero analisadas separadamente por cromatografia lquida de alta eficincia (EL-KAWA, 1999). 2.1.8 Determinao de -CD A concentrao de -CD medida pela descolorao de uma soluo de fenolfatalena a 550 nm, a qual ocorre depois da complexao com -CD. De acordo com a Teoria da Complexao (HAMON & MORAES, 1990), que leva em considerao a constante de equilbrio (K-CD), a concentrao da soluo de fenolftalena (a = 0,00005 M), a absorbncia das amostras (ABS) e de uma soluo isenta de -CD (ABSo), a equao para calcular a concentrao de -CD a que segue: C-CD = 6000 x a (1 ABS / ABSo) x [1 + ABSo / (K-CD x a x ABS)] A curva padro deve ser preparada com uma soluo de -CD 1 mM e a leitura, em espectrofotmetro a 550 nm, utilizando como branco gua destilada. A dosagem feita com 0,5 mL da amostra e 2,5 mL da soluo trabalho de fenolftalena. A soluo trabalho preparada pela adio de 2,0 mL de uma soluo estoque de fenolftalena 3 mM, 20 mL de uma soluo de tampo carbonato 0,6 M e pH 10,5 e completando-se o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico. A curva padro deve ser construda com no mnimo 20 pontos e a constante de equilbrio (K-CD) deve ser estimada, utilizando os dados de absorbncia em funo da concentrao, pelo programa Statistica. 3 RESULTADOS E DISCUSSO Amostras isoladas e imobilizadas de Klebsiella oxytoca foram cultivadas em meio lquido NFb malato livre de nitrognio mineral, ao qual foi adicionado o triptofano (100 g.mL-1), os isolados foram cultivadas a 28 oC com agitao por um perodo de tempo variando de 24 s 168 h. Aps cada um destes perodos os meios de cultura foram centrifugados, a seguir a 1 mL dos sobrenadantes foram adicionados 2 mL do reativo de Salkowski e depois de 25 min realizou-se a leitura em um espectrofotmetro a 530nm. O AIA foi utilizado como padro (10 -100 g.mL-1).
Tabela 1. Variao da concentrao de AIA em funo do tempo.

Horas

[AIA] g.mL-1 por Clulas livres

[AIA] g.mL-1 por Clulas Imobilizadas

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24 48 72 168

50,2 51,5 43,8 55,6

7,1 32,7 40,8 92,1

Os resultados observados na Tabela 1 demonstram que as clulas livres apresentam uma taxa de converso de triptofano em AIA ~ 50 % no perodo de 24 a 168 h, enquanto que as clulas imobilizadas apresentam um aumento crescente na taxa de converso atingindo ~ 92 % no mesmo perodo. A diferena apresentada na converso deve-se ao fato de que as clulas imobilizadas no esto se multiplicando, convertendo assim quase todo triptofano em AIA, enquanto que as clulas livres utilizam parte deste aminocido para seu crescimento.

Figura 1. Micrografia da bactria Klebsiella oxytoca imobilizada na matriz SiO2/MnO

A figura 2 mostram que as micrografias observadas que tiveram uma boa adsoro da bactria foram as matrizes SiO2/TiO2 e SiO2/MnO2. Uma adsoro satisfatria na matriz V2O5/TiO2 e uma adsoro parcial nas matrizes V2O5/SiO2 e celulose/TiO2. Na imobilizao com SiO2/TiO2 observou-se um aumento de 20% na produo de -CD quando se passou de 1.2 para 3.0 g de biomassa. J quando imobilizadas com SiO2/MnO2 teve uma produo de 25% maior de -CD quando se utiliza 1.8g de biomassa.

A)

B)

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C)

D)

E)
Figura 2: Clula livre (A), SiO2/TiO2 (B), V2O5/TiO2 (C), V2O5/SiO2 (D), celulose/TiO2 (E).

4 CONCLUSO 1. A Klebsiella oxytoca apresentou uma capacidade de fixao de nitrognio muito similar a aos apresentados em outros trabalhados desenvolvidos com espcies deste gnero. REFERNCIAS AIROLDI, Cludio; FARIAS, Robson Fernandes de. Alcxidos como precursores na sntese de novos materiais atravs do processo sol-gel. Qumica. Nova, v. 27, n. 1, p. 8488, 2004. ABDEL-NABY, M.; REYARD, R. D.; ABDEL-FATTAH, A. F. Biosynthesis of cyclodextrin glucosyltransferase by immobilized Bacillus amyloliquefaciens in batch and continuous cultures. Biochemical Engineering Journal, v. 5, p. 1-9, 2000. BEYELER, M.; MICHAUX, P.; KELL, C.; HASS, D. Effect of enhanced production of indol-3-acitic by biological control Pseudomonas fluorescens CHAO on plant growth. In: Proceedings of the Fourth International Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. In: Ogoshi, A.; Kobayashi, K.; Homma, Y.; Kodama, F.; Kondo, M.; Akino, S. Sapporo, Japan, October 18-22, 1997, Sapporo University, p. 310-312. BIECKERSTAFF, G. F. Immobilization of Enzymes and Cells, Humana Presss, Totowa, New Jersey, 1997.

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