Petição 260

870240005703
22/01/2024 15:25
29409162315007760
Outras petições - Tradução dos documentos apresentados no depósito
Número do Processo: BR 11 2023 024320 3
Dados do Depositante (71)
Depositante 1 de 1
Nome ou Razão Social: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD

JUNIOR UNIVERSITY
Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica
CPF/CNPJ: US0019034656
Nacionalidade: Norte Americana
Qualificação Jurídica: Pessoa Jurídica
Endereço: Office of the General Counsel Building 170, 3rd Floor, Main Quad,
P.O. Box 20386, Stanford, CA 94305-2038
Cidade:
Estado:
CEP:
País: Estados Unidos da América
Telefone:
Fax:
Email: brj@clarkemodet.com.br
Referência Petição
Pedido : BR112023024320-3
Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em

22/01/2024 às 15:25, Petição 870240005703
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Dados do Procurador
Procurador:
Nome ou Razão Social: Flávia Salim Lopes
Numero OAB:
Numero API: 488
CPF/CNPJ: 02341292712
Endereço: Rua do Passeio, 38, Setor 1 - 14º andar, Centro
Cidade: Rio de Janeiro
Estado: RJ
CEP: 20021-290
Telefone: (21)3223-9500
Fax: (21)3223-9501
Email: flopes@clarkemodet.com.br
Escritório:
Nome ou Razão Social: Clarke, Modet Propriedade Intelectual Ltda.
CPF/CNPJ: 33033101000118

22/01/2024 às 15:25, Petição 870240005703
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Documentos anexados
Tipo Anexo Nome
Comprovante de pagamento 2023_33339 GRU REL.pdf
Procuração 2023_33339 POA.pdf
Esclarecimento 2023_33339 ESCL REL.pdf
Relatório Descritivo 2023_33339 REL.pdf
Desenho 2023_33339 DES.pdf
Declaração de veracidade
Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e
verdadeiras.

22/01/2024 às 15:25, Petição 870240005703
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[bb.com.br] - Boleto gerado pelo sistema MPAG. 22/01/2024 11:06:57
INSTRUÇÕES:
A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o
sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU no campo Número de Referência na emissão do pagamento. Processo: 1120230243203 Serviço:
260-Outras petições
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00190.00009 02940.916238 15007.760174 6 96320000009000
CLARKE MODET PROPRIEDADE INTELECTUAL LTDA CPF/CNPJ: 33033101000118

RUA DO PASSEIO 38 SETOR 1 14 ANDAR CENTRO, RIO DE JANEIRO -RJ CEP:20021290
29409162315007760 29409162315007760 20/02/2024 90,00
INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37

RUA MAYRINK VEIGA 9 24 ANDAR ED WHITE MARTINS , RIO DE JANEIRO - RJ CEP: 20090910
2234-9 / 333028-1
00190.00009 02940.916238 15007.760174 6 96320000009000
20/02/2024
INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 2234-9 / 333028-1
22/01/2024 29409162315007760 DS N 22/01/2024 29409162315007760
29409162315007760 17 R$ 90,00
A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal.

O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo.
Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU n
o campo Número de Referência na emissão do pagamento.
Processo: 1120230243203
Serviço: 260-Outras petições
CLARKE MODET PROPRIEDADE INTELECTUAL LTDA CPF/CNPJ: 33033101000118

RUA DO PASSEIO 38 SETOR 1 14 ANDAR CENTRO,
RIO DE JANEIRO-RJ CEP:20021290
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22/01/2024 - BANCO DO BRASIL - 12:54:16
018300183 0001
COMPROVANTE DE PAGAMENTO DE TITULOS
CLIENTE: CLARKE MODET PROP INT LTD

AGENCIA: 0183-X CONTA: 131.742-3
================================================
BANCO DO BRASIL
------------------------------------------------
00190000090294091623815007760174696320000009000
BENEFICIARIO:
INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIED
NOME FANTASIA:
INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE I
CNPJ: 42.521.088/0001-37
PAGADOR:
CLARKE MODET PROPRIEDADE INTELECTUA
CNPJ: 33.033.101/0001-18
------------------------------------------------
NR. DOCUMENTO 12.215
NOSSO NUMERO 29409162315007760
CONVENIO 02940916
DATA DE VENCIMENTO 20/02/2024
DATA DO PAGAMENTO 22/01/2024
VALOR DO DOCUMENTO 90,00
VALOR COBRADO 90,00
================================================
NR.AUTENTICACAO D.E20.A5E.FED.AB3.1AD
================================================
Central de Atendimento BB
4004 0001 Capitais e regioes metropolitanas
0800 729 0001 Demais localidades.
Consultas, informacoes e servicos transacionais.
SAC BB
0800 729 0722
Informacoes, reclamacoes, cancelamento de
produtos e servicos.
Ouvidoria
0800 729 5678
Reclamacoes nao solucionadas nos canais
habituais agencia, SAC e demais canais de
atendimento.
Atendimento a Deficientes Auditivos ou de Fala

0800 729 0088
Informacoes, reclamacoes,cancelamento de cartao,
outros produtos e servicos de Ouvidoria.
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1/1
Ilmo. Senhor Diretor do Instituto Nacional da Propriedade Industrial
Pedido: BR 11 2023 024320 3 de 20/05/2022

PCT: PCT/US2022/030232 de 20/05/2022
Titular: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR
UNIVERSITY
Título: “SEQUENCIADOR VOLUMÉTRICO IN SITU DE ÚLTIMA GERAÇÃO”
ESCLARECIMENTO
A requerente vem, por meio desta, apresentar a via do relatório descritivo (97 folhas) e dos
desenhos (35 folhas) com a finalidade de completar a tradução do pedido PCT conforme
originalmente depositado.
Desde já, colocamo-nos à inteira disposição para sanar qualquer dúvida ou tomar qualquer
procedimento que se faça necessário.
Rio de Janeiro, 19 de janeiro de 2024.
Flávia Salim Lopes
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[0001] As amostras biológicas contêm informações genéticas

complexas e heterogêneas que abrangem as escalas de comprimento de
células individuais e tecidos inteiros. Padrões espaciais de ácidos nucleicos
dentro de uma célula podem revelar propriedades e anormalidades da função
celular; distribuições cumulativas de expressão de RNA podem definir um
tipo ou função celular; e variação sistemática nas localizações dos tipos de
células dentro de um tecido pode definir a função do tecido. A combinação
de informações de conectividade anatômica codificadas em ácidos nucleicos
e distribuições de tipo de célula em todo o tecido pode abranger muitas
regiões e seções de tecido. As técnicas para sequenciamento de ácido
nucleico in situ devem, portanto, ser capazes de unir resoluções tão
pequenas quanto moléculas individuais e tão grandes quanto cérebros
inteiros. Coletar e registrar eficientemente essas informações através de
diferenças de ordens de magnitude em comprimentos requer novas
invenções para potencializar a robustez, rapidez, natureza automatizada e
de alta produtividade operacional das técnicas de sequenciamento in situ.
[0002] É fornecido um dispositivo de sequenciamento para

sequenciamento automatizado in situ de amostras de tecido volumétrico. Em
particular, é fornecido um dispositivo de sequenciamento volumétrico in situ
automatizado capaz de operar em alta resolução em múltiplas amostras em
paralelo. O dispositivo de sequenciamento combina imersão automatizada
com funções automatizadas de sequenciamento in situ. O dispositivo de
sequenciamento é especialmente útil para o sequenciamento combinatório,
que se beneficia de sua capacidade de alta resolução. Métodos de fabricação
e uso do sequenciador também são fornecidos.
[0003] Em um aspecto, é fornecido um dispositivo de sequenciamento,
o dispositivo compreendendo: (a) um módulo de iluminação e detecção
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compreendendo um componente confocal de disco giratório compreendendo

uma pluralidade de linhas de laser para iluminação com correção de
iluminação plana, em que a pluralidade de linhas de laser é usada para
iluminar uma amostra com luz de excitação em um ou mais comprimentos
de onda, um filtro de emissão de passa-faixa, um divisor de imagem de
passagem longa, uma primeira câmera que detecta emissões de
fluorescência em um primeiro intervalo de comprimento de onda e uma
segunda câmera que detecta emissões de fluorescência em um segundo
intervalo de comprimento de onda, em que a primeira câmera e a segunda
câmera podem detectar emissões simultaneamente; (b) um módulo de
microscópio compreendendo uma mesa motorizada capaz de
posicionamento em múltiplos eixos ao longo dos eixos x, y e z, um
acionamento Z da objetiva, um revólver de objetiva compreendendo múltiplas
objetivas, em que cada objetiva fornece uma ampliação diferente, em que
um ou mais objetivas são objetivas de imersão, em que cada objetiva de
imersão tem um colar de imersão objetiva e óptica, em que a óptica
encaminha a luz das objetivas para o módulo de iluminação e detecção; (c)
um módulo de meio de imersão automatizado compreendendo i) um
recipiente compreendendo meios de imersão, ii) linhas fluídicas acopladas
ao recipiente e aos colares de imersão objetivas das objetivas do módulo de
microscópio, em que as linhas fluídicas transportam meios de imersão de e
para os colares de imersão de objetivas, em que os colares de imersão
capturam o excesso de meios de imersão, e iii) uma série de bombas
conectadas às linhas fluídicas e a um microcontrolador, em que o
microcontrolador controla a adição e remoção das bombas dos meios de
imersão através das linhas fluídicas, em que o módulo de meio de imersão
automatizado fornece volumes controlados do meio de imersão para os
colares de imersão de objetivas nos topos das objetivas durante a geração
de imagens; (d) uma placa de múltiplos poços, em que a mesa motorizada
pode ser movida para posicionar um poço da placa de múltiplos poços sob a
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objetiva usado para geração de imagens; (e) uma torre de acoplamento

fluídico, em que a torre de acoplamento fluídico está no topo da mesa
motorizada e posiciona as linhas fluídicas nos poços da placa de múltiplos
poços; (f) um módulo de gerenciamento fluídico compreendendo um válvula
rotativa simétrica compreendendo um mecanismo de válvula rotativa, uma
bomba, em que a bomba está conectada às linhas fluídicas e detectores de
bolhas, em que os detectores de bolhas estão posicionados em ambos os
lados das linhas fluídicas que levam à bomba, em que o módulo de
gerenciamento fluídico permite movimento unidirecional ou bidirecional de
reagentes, tampões e resíduos através das linhas fluídicas; (g) um reagente,
tampão e módulo de resíduos compreendendo uma i) bandeja deslizante, em
que cartuchos de reagentes e cartuchos de tampão podem ser posicionados
na bandeja deslizante e acoplado ao módulo de gerenciamento fluídico, ii)
um módulo de resíduos compreendendo um recipiente de resíduos, em que
o recipiente de resíduos é acoplado a uma linha fluídica da bomba de
gerenciamento de fluidos e iii) um mecanismo de capping, em que o
mecanismo de capping fecha o recipiente de resíduos quando o recipiente
de resíduos é removido do sistema para descarte de resíduos e abre o
recipiente de resíduos quando o recipiente de resíduos é colocado de volta
no sistema; (h) um módulo elétrico compreendendo: i) um primeiro meio de
controle de placa de firmware dispensando do meio de imersão automatizado
módulo e ii) uma segunda placa de firmware controlando o módulo de
gerenciamento de fluido e o módulo de reagente, tampão e resíduo, em que
o módulo elétrico regula a energia para os outros módulos do sistema; e (i)
um processador programado para fornecer uma interface de usuário e operar
os módulos do dispositivo de sequenciamento.
[0004] Em certas modalidades, a pluralidade de linhas de laser
compreende pelo menos 4 linhas de laser. Em certas modalidades, a
pluralidade de linhas de laser compreende pelo menos 5 linhas de laser. Em
algumas modalidades, o filtro de emissão passa-faixa é um filtro de emissão
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passa-faixa penta.
[0005] Em certas modalidades, a mesa motorizada tem um eixo z
piezo.
[0006] Em certas modalidades, o meio de imersão é água.
[0007] Em certas modalidades, o meio de imersão é filtrado e sem
bolhas.
[0008] Em certas modalidades, o dispositivo de sequenciamento
compreende ainda um anel de vedação tipo O-ring e um revestimento
embalado em plástico termorretrátil sobre cada objetiva.
compreende ainda um monitor de pressão para monitorar a pressão nas
linhas fluídicas, em que aumentos na pressão em uma linha fluídica podem
ser usados para detectar um bloqueio potencial da linha fluídica.
compreende ainda uma pluralidade de diodos emissores de luz (LEDs), em
que cada LED pode emitir luz para fornecer uma indicação de estado para o
sistema.
compreende ainda um componente de exibição para exibir informações e
fornecer uma interface de usuário.
[0012] Em certas modalidades, o processador é ainda programado
para realizar etapas compreendendo: (a) localizar uma amostra selecionada
na placa de múltiplos poços; (b) detectar um sinal no plano XY da amostra
selecionada em baixa ampliação usando aquisição de modo de geração de
imagens de campo amplo com compartimentação de câmera; (c) usar o sinal
para segmentar uma caixa delimitadora XY em torno da amostra; (d) gerar
imagens da amostra dentro da caixa delimitadora XY para produzir uma
imagem, em que a geração de imagens é realizada no modo de geração de
imagens confocal em Z em ampliação maior do que usado na etapa (b) com
compartimentação de câmera a fim de determinar a extensão Z aproximada
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da amostra, em que um único plano Z é coletado através do ponto médio da

extensão Z previamente determinada e através da extensão XY; (e) exibir a
imagem produzida na etapa (d); (f) fornecer uma interface para um usuário
refinar uma região XY desejada de interesse na amostra a ter adicionalmente
imagem gerada durante o sequenciamento da amostra selecionada; (g) gerar
imagens da amostra na região XY selecionada de interesse através as
extensões Z amostra das anteriormente; (h) calcular um volume da região de
interesse na amostra e exibir o volume de amostra calculado da região de
interesse para o usuário; (i) segmentar a imagem da amostra na região de
interesse ao longo das extensões Z; (j) fornecer uma interface ao usuário
para que o usuário ajuste as extensões Z do volume da amostra antes de
iniciar o sequenciamento, em que as extensões de geração de imagens
derivadas da região de interesse definida pelo usuário são automaticamente
convertidas em campos de visão montados apropriados para uma
determinada objetiva de geração de imagens e ajustar as posições da mesa
do microscópio, o posicionamento Z da objetiva e as ligações piezo para
geração de imagens da região de interesse ao longo dos eixos XYZ durante
o sequenciamento; e (k) reiterar as etapas (a)-(j) para definir regiões de
interesse para cada amostra na placa de múltiplos poços que o usuário
pretende sequenciar.
para realizar etapas compreendendo: fornecer uma interface ao usuário para
o usuário selecionar uma ou mais amostras para sequenciamento e um
protocolo de sequenciamento, em que o usuário é limitado em quantas
amostras podem ser selecionadas dependendo das quantidades de tampão
e reagentes que estão disponíveis e o protocolo de sequenciamento
selecionado; fornecer restrições sobre o tempo total de sequenciamento,
dados totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total máximo de regiões
de interesse em todas as amostras que devem ser sequenciadas e imagens
geradas e sugerir protocolos que maximizem o sequenciamento das regiões
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de interesse desejadas em amostras dentro das restrições.

para otimizar a paralelização de sequenciamento de amostra dependendo do
número de amostras a serem sequenciadas e tipos de imagem a serem
usadas no sequenciamento.
para realizar etapas compreendendo: realizar uma varredura confocal rápida
em Z em uma posição XY inicial de uma dada montagem de amostra para
determinar um perfil Z da amostra na posição XY inicial; determinar a
interface superior e inferior da amostra usando um método de segmentação;
e definir a posição Z da objetiva a uma distância fixa da interface no início da
montagem de amostra, em que o desvio em Z da amostra em relação à mesa
e a objetiva através de rodadas é reduzido para abaixo de uma tolerância
selecionada para facilitar o registro de subpixel a jusante através de rodadas
durante o processamento pós-aquisição.
[0016] Em certas modalidades, o sequenciamento é o
sequenciamento in situ de um ácido nucleico alvo em uma amostra de tecido.
Em algumas modalidades, a amostra de tecido é um pedaço de tecido
espesso com uma espessura de 50-200 µm. Em outras modalidades, a
amostra de tecido é um pedaço de tecido fino com uma espessura de 5-20
µm. Em algumas modalidades, o sequenciamento in situ é sequenciamento
sequencial ou combinatório in situ.
[0017] Em outro aspecto, é fornecido um método de uso do dispositivo
de sequenciamento, descrito neste documento, o método compreendendo:
carregar amostras na placa de múltiplos poços; selecionar quais amostras na
placa de múltiplos poços são sequenciadas; selecionar um protocolo de
sequenciamento; e sequenciar ácidos nucleicos nas amostras selecionadas
usando o dispositivo de sequenciamento descrito neste documento. Em
certas modalidades, o sequenciamento é o sequenciamento in situ de um
ácido nucleico alvo em uma amostra de tecido. Em algumas modalidades, a
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amostra de tecido é um pedaço de tecido espesso com uma espessura de

50-200 µm. Em outras modalidades, a amostra de tecido é um pedaço de
tecido fino com uma espessura de 5-20 µm. Em algumas modalidades, o
sequenciamento in situ é sequenciamento sequencial ou combinatório in situ.
[0018] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por
computador, o computador realizando etapas compreendendo: (a) localizar
uma amostra selecionada na placa de múltiplos poços; (b) detectar um sinal
no plano XY da amostra selecionada em baixa ampliação usando aquisição
de modo de geração de imagens de campo amplo com compartimentação
de câmera; (c) usar o sinal para segmentar uma caixa delimitadora XY em
torno da amostra; (d) gerar imagem da amostra dentro da caixa delimitadora
XY para produzir uma imagem, em que a geração de imagens é realizada no
modo de geração de imagens confocal em Z com ampliação mais alta do que
a usada na etapa (b) com compartimentação de câmera a fim de determinar
a extensão Z aproximada da amostra, em que um único plano Z é coletado
através do ponto médio da extensão Z previamente determinada e através
da extensão XY; (e) exibir a imagem produzida na etapa (d); (f) fornecer uma
interface para um usuário selecionar uma região XY desejada de interesse
na amostra a ter adicionalmente imagem gerada durante o sequenciamento
da amostra selecionada; (g) gerar imagem da amostra na região XY
selecionada de interesse através das extensões Z amostradas
anteriormente; (h) calcular um volume de amostra da região de interesse e
exibir o volume de amostra calculado da região de interesse para o usuário;
(i) segmentar a imagem da amostra na região de interesse ao longo das
extensões Z; (j) fornecer uma interface ao usuário para que o usuário ajuste
as extensões Z do volume de amostra antes de iniciar o sequenciamento, em
que as extensões de geração de imagens derivadas da região de interesse
definida pelo usuário são automaticamente convertidas em campos de visão
montados apropriados para uma determinada objetiva de geração de
imagens e para ajustar as posições da mesa do microscópio, posicionamento
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Z da objetiva e ligações piezo para geração de imagens da região de

interesse ao longo dos eixos XYZ durante o sequenciamento; e (k) reiterar
as etapas (a)-(j) para definir regiões de interesse para cada amostra na placa
de múltiplos poços que o usuário pretende sequenciar.
computador, o computador realizando etapas compreendendo: fornecer uma
interface ao usuário para o usuário selecionar uma ou mais amostras para
sequenciamento e um protocolo de sequenciamento, em que o usuário é
limitado em quantas amostras podem ser selecionadas dependendo das
quantidades de tampão e reagentes disponíveis e o protocolo de
sequenciamento selecionado; fornecer restrições sobre o tempo total de
sequenciamento, dados totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total
máximo de regiões de interesse em todas as amostras que devem ser
sequenciadas e imagens geradas e sugerir protocolos que maximizem o
sequenciamento das regiões de interesse desejadas em amostras dentro das
restrições. Em algumas modalidades, o computador é ainda programado
número de amostras a serem sequenciadas e tipos de geração de imagens
a serem usadas no sequenciamento.
computador, o computador realizando etapas compreendendo: realizar uma
varredura confocal rápida em Z em uma posição XY inicial de uma dada
montagem de amostra para determinar um perfil Z da amostra na posição XY
inicial; determinar a interface superior e inferior da amostra usando um
método de segmentação; e definir a posição Z da objetiva a uma distância
fixa da interface no início da montagem de amostra, em que o desvio em Z
da amostra em relação à mesa e a objetiva através de rodadas é reduzido
para abaixo de uma tolerância selecionada para facilitar o registro de
subpixel a jusante através de rodadas durante o processamento pós-
aquisição.
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[0021] Em outro aspecto, é fornecido um meio legível por computador

não transitório compreendendo instruções de programa que, quando
executadas por um processador em um computador, fazem com que o
processador realize qualquer um dos métodos implementados por
computador, descritos neste documento.
[0022] Em outro aspecto, um módulo de meio de imersão
automatizado compreendendo: (a) um recipiente compreendendo meios de
imersão; (b) linhas fluídicas acopladas ao recipiente e aos colares de imersão
de objetivas das objetivas do módulo de microscópio, em que as linhas
fluídicas transportam meios de imersão de e para um colar de imersão de
objetiva em um objetiva de imersão, em que o colar de imersão captura o
excesso de meios de imersão; e (c) uma série de bombas conectadas às
linhas fluídicas e a um microcontrolador, em que o microcontrolador controla
a adição e remoção das bombas do meio de imersão através das linhas
fluídicas, em que o módulo de meio de imersão automatizado fornece
volumes controlados do meio de imersão para os colares de imersão de
objetivas no topo das objetivas durante a geração de imagens.
[0023] Em outro aspecto, é fornecido um método de uso do módulo de
meio de imersão automatizado, o método compreendendo o uso do módulo
de meio de imersão automatizado para distribuir meio de imersão a um colar
de imersão de objetiva fixado a uma objetiva de imersão de um microscópio.
[0024] Em outro aspecto, é fornecido um módulo de gerenciamento
fluídico, o módulo compreendendo uma válvula rotativa simétrica
compreendendo um mecanismo de válvula rotativa, uma bomba, em que a
bomba está conectada às linhas fluídicas e detectores de bolhas, em que os
detectores de bolhas estão posicionados em ambos os lados das linhas
fluídicas que levam à bomba, em que o módulo de gerenciamento fluídico
permite movimento bidirecional ou unidirecional de reagentes, tampões e
resíduos através das linhas fluídicas.
[0025] Em outro aspecto, é fornecido um módulo de reagente, tampão
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 17/140

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e resíduo, o módulo compreendendo: (a) uma bandeja deslizante, em que

cartuchos de reagente e cartuchos de tampão podem ser posicionados na
bandeja deslizante e acoplados ao módulo de gerenciamento fluídico; (b) um
módulo de resíduo compreendendo um recipiente de resíduos, em que o
recipiente de resíduos é acoplado a uma linha fluídica da bomba de
gerenciamento de fluidos; e (c) um mecanismo de capping, em que o
mecanismo de capping fecha o recipiente de resíduos quando o recipiente
no sistema.
[0026] A FIG. 1 mostra o dispositivo de sequenciamento incluindo seus

vários módulos.
[0027] A FIG. 2 mostra uma câmera dupla capaz de geração de
imagens duplo nos modos de campo amplo e confocal.
[0028] A FIG. 3 mostra 5 linhas de laser cobrindo 405 nm, 488 nm, 561
nm, 637 nm e 730 nm e uma unidade de condicionamento de feixe.
[0029] A FIG. 4 mostra um diagrama dos componentes do
microscópio.
[0030] A FIG. 5 mostra uma ponta de seis posições com objetivas com
ampliação de 4x, 20x, 40x e 60x. Os colares de água são mostrados nas
objetivas 40x e 60x.
[0031] A FIG. 6 mostra um sistema de acoplamento fluídico acionado
manualmente para uma placa de múltiplos poços com 24 poços.
[0032] A FIG. 7 mostra o sistema de acoplamento fluídico com uma
placa de múltiplos poços no topo de uma mesa motorizada XY com uma
ponta e piezo Z.
[0033] A FIG. 8 mostra o sistema de distribuição de fluido
automatizado.
[0034] A FIG. 9 mostra um diagrama dos componentes do sistema de
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distribuição de fluido automatizado.

[0035] A FIG. 10 mostra um invólucro para amostras sensíveis à luz
no topo de uma mesa personalizada que fornece isolamento de vibração. As
5 linhas de laser com uma unidade de condicionamento de cobertura e feixe
e uma estação de trabalho com um processador para geração de imagens
de alta produtividade operacional de dados são mostradas em uma prateleira
abaixo do topo da mesa. Um componente de exibição 4K conectado à mesa
também é mostrado.
[0036] A FIG. 11 mostra as portas de placa para o sistema de
distribuição de fluido automatizado.
[0037] A FIG. 12 mostra a montagem das partes modulares do
dispositivo de sequenciamento.
[0038] A FIG. 13 mostra esquemas de um módulo fluídico autônomo
que se acopla a uma configuração de geração de imagens existente incluindo
1) um microscópio e mesa, 2) uma placa de múltiplos poços e 3) um
sequenciador, mostrado de vários ângulos.
[0039] A FIG. 14 mostra um esquema de uma placa de múltiplos poços
e tampa.
com múltiplas linhas fluídicas conectadas à placa de múltiplos poços e
inseridas em alguns poços selecionados da placa de múltiplos poços.
com múltiplas linhas fluídicas conectadas à placa de múltiplos poços e
inseridas em todos os poços da placa de múltiplos poços.
[0042] A FIG. 17 mostra uma placa de múltiplos poços com uma
cobertura sobre os poços. Para cada poço da placa de múltiplos poços, a
cobertura compreende um suporte para uma linha fluídica que guia a
inserção da linha fluídica em um orifício na cobertura sobre o poço.
[0043] A FIG. 18 mostra um esquema do 1) microscópio e mesa, 2)
placa de múltiplos poços coberta e 3) sequenciador de vários ângulos com a
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placa de múltiplos poços conectada ao sequenciador ou removida do

sequenciador.
[0044] A FIG. 19 mostra um projeto de um sistema de distribuição de
fluido automatizado compacto.
[0045] A FIG. 20 mostra um projeto de um sistema de distribuição de
fluido automatizado compacto.
[0046] A FIG. 21 mostra projetos para bandejas de tampão e reagente.
[0047] A FIG. 22 mostra um projeto de uma bandeja de tampão
contendo um transportador para garrafas vedadas de tampões e uma tag
RFID para rastreamento.
[0048] A FIG. 23 mostra projetos alternativos para uma bandeja de
tampão. Na parte superior, é mostrada uma bandeja de tampão com tampas
para tampões individuais. Na parte inferior, é mostrada uma bandeja de
tampão projetada para conter garrafas vedadas de tampões.
[0049] A FIG. 24 mostra um projeto de uma bandeja de reagente
contendo um transportador para tubos Eppendorf, uma vedação e uma tag
RFID para rastreamento.
[0050] A FIG. 25 mostra uma estação de pesagem para verificação de
enchimento de reagente, um acessório para conter consumíveis de reagente
na balança e um coletor de enchimento.
[0051] A FIG. 26 mostra uma estação de enchimento de tampão.
[0052] A FIG. 27 mostra objetivas com colares nas objetivas 40x e 60x.
[0053] A FIG. 28 mostra um diagrama de fluido para fornecer fluido aos
colares nas objetivas 40x e 60x.
[0054] A FIG. 29 mostra um colar de alimentação. A objetiva 60x tem
1 anel de vedação tipo O-ring e a objetiva 40x tem 2 anéis de vedação tipo
O-ring.
[0055] A FIG. 30 mostra um microscópio com conexões para um
dispensador de água de imersão.
[0056] A FIG. 31 mostra um dispensador de água de imersão para uso
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com um microscópio Nikon Ti2e com conexões para as objetivas 40x e 60x.
[0057] A FIG. 32 mostra um esquema de um invólucro para amostras
sensíveis à luz no topo de uma mesa com uma prateleira por baixo para uma
estação de trabalho e um componente de exibição fixado à mesa.
[0058] A FIG. 33 mostra um esquema de um invólucro para amostras
sensíveis à luz no topo de uma mesa com uma prateleira por baixo para uma
estação de trabalho e um componente de exibição na mesa.
[0059] A FIG. 34 mostra um diagrama de fluídica para o sistema de
distribuição de fluido automatizado mostrando conexões de linhas de fluido
para a bandeja de reagente, bandeja de tampão, bomba peristáltica, válvula
rotativa acionada por motor, sensores de pressão e detectores de bolhas.
[0060] A FIG. 35 mostra um diagrama fluídico com uma série de
bombas conectadas às linhas de fluido com conexões ao módulo de meio de
imersão e as objetivas de microscópio 40x e 60x.
[0061] A FIG. 36 mostra um diagrama fluídico com conexões a uma
bomba de seringa, válvula rotativa acionada por motor e placa de múltiplos
poços.
[0062] A FIG. 37 mostra um esquema de válvula dupla de aspiração.
[0063] É fornecido um sequenciador para sequenciamento

automatizado in situ de amostras de tecido volumétrico. Em particular, é
fornecido um dispositivo de sequenciamento volumétrico in situ automatizado
capaz de operar em múltiplas amostras em paralelo. Métodos de fabricação
e uso do sequenciador também são fornecidos.
[0064] Antes que o sequenciador para sequenciamento automatizado
in situ de amostras de tecido volumétrico e métodos de fabricação e uso de
tal sequenciador sejam descritos, deve ser entendido que esta invenção não
está limitada a dispositivos, métodos ou composições particulares descritos,
como tal podem, é claro, variar. Também deve-se entender que a
terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 21/140

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modalidades específicas apenas e não pretende ser limitante, uma vez que
o escopo da presente invenção, será limitado somente pelas reivindicações
anexas.
[0065] Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que
cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos
que o contexto dite claramente o contrário, entre os limites superior e inferior
desse intervalo também é especificamente divulgado. Cada intervalo menor
entre qualquer valor declarado ou valor intermediário em um intervalo
declarado e qualquer outro valor declarado ou intermediário nesse intervalo
declarado é abrangido pela invenção. Os limites superior e inferior desses
intervalos menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos no
intervalo, e cada intervalo em que nenhum ou ambos os limites estão
incluídos nos intervalos menores também está abrangido na invenção,
sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo declarado.
Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos
excluindo qualquer um de ambos desses limites incluídos estão também
incluídos na invenção.
[0066] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos
e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como
comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção
pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou
equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática
ou teste da presente invenção, alguns métodos e materiais potenciais e
preferenciais são descritos agora. Todas as publicações mencionadas neste
documento são incorporadas neste documento por referência para divulgar
e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as
publicações são citadas. Entende-se que a presente divulgação substitui
qualquer divulgação de uma publicação incorporada na medida em que haja
uma contradição.
[0067] Como será evidente para os versados na técnica ao ler esta
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divulgação, cada uma das modalidades individuais descritas e ilustradas

neste documento tem componentes e características discretas que podem
ser facilmente separadas ou combinadas com as características de qualquer
uma das outras várias modalidades sem sair do escopo ou espírito da
presente invenção. Qualquer método citado pode ser executado na ordem
dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que seja logicamente
possível.
[0068] Deve também ser notado que conforme usado neste
documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares um , uma e
o/a incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente o
contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma célula inclui uma
pluralidade de tais células e a referência ao o peptídeo inclui a referência a
um ou mais peptídeos e equivalentes destes, por exemplo, oligopeptídeos
ou polipeptídeos conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.
[0069] As publicações discutidas neste documento são fornecidas
apenas para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido.
Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a
presente invenção não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude
da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem
ser diferentes das datas reais de publicação que podem precisar ser
confirmadas independentemente.
Definições
[0070] O termo cerca de , particularmente em referência a uma
determinada quantidade, pretende abranger desvios de mais ou menos cinco
por cento.
[0071] Os termos peptídeo , oligopeptídeo , polipeptídeo e
proteína são usados de forma intercambiável neste documento para se
referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos também se
aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de
aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido
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correspondente de ocorrência natural, bem como a polímeros de

aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos de ocorrência
não natural. Tanto as proteínas de comprimento total quanto os fragmentos
destas são abrangidas pela definição. Os termos também incluem
modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, fosforilação,
glicosilação, acetilação, hidroxilação, oxidação e semelhantes, bem como
aminoácidos e polipeptídeos quimicamente ou bioquimicamente modificados
ou derivatizados com estruturas principais peptídicas modificadas. Os termos
também incluem proteínas de fusão, incluindo, mas não se limitando a,
proteínas de fusão com uma sequência de aminoácidos heteróloga, fusões
com sequências líderes heterólogas e homólogas, com ou sem resíduos de
metionina terminal N; proteínas imunologicamente marcadas; e
semelhantes. Os termos incluem polipeptídeos incluindo um ou mais de uma
fração de ácido graxo, uma fração lipídica, uma fração de açúcar e uma
fração de carboidrato.
[0072] Conforme usado neste documento, o termo ácido nucleico
alvo é qualquer molécula de ácido nucleico polinucleotídico (por exemplo,
molécula de DNA; molécula de RNA, ácido nucleico modificado, etc.)
presente em uma única célula. Em algumas modalidades, o ácido nucleico
alvo é um RNA codificador (por exemplo, mRNA). Em algumas modalidades,
o ácido nucleico alvo é um RNA não codificante (por exemplo, tRNA, rRNA,
microRNA (miRNA), miRNA maduro, miRNA imaturo; etc.). Em algumas
modalidades, o ácido nucleico alvo é uma variante de splice de uma molécula
de RNA (por exemplo, mRNA, pré-mRNA, etc.) no contexto de uma célula.
Um ácido nucleico alvo adequado pode, portanto, ser um RNA não
submetido a splice (por exemplo, pré-mRNA, mRNA), um RNA parcialmente
submetido a splice ou um RNA totalmente submetido a splice, etc. Os ácidos
nucleicos alvo de interesse podem ser expressos de forma variável, isto é,
têm uma abundância diferente, dentro de uma população de células, em que
os métodos da invenção permitem o perfil e a comparação dos níveis de
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expressão de ácidos nucleicos, incluindo, sem limitação, transcritos de RNA,

em células individuais. Um ácido nucleico alvo também pode ser uma
molécula de DNA, por exemplo, um genômico desnaturado, viral, plasmídeo,
etc. Por exemplo, os métodos podem ser usados para detectar variantes do
número de cópias, por exemplo, em uma população de células cancerígenas
na qual um ácido nucleico alvo está presente em abundância diferente no
genoma das células na população; células infectadas por vírus para
determinar a carga e a cinética do vírus e semelhantes.
[0073] Os termos oligonucleotídeo , polinucleotídeo e molécula de
ácido nucleico , usados de forma intercambiável neste documento, referem-
se a formas poliméricas de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja
ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas
sem limitação a DNA ou RNA de fita simples, fita dupla ou múltiplas fitas,
DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero incluindo
bases de purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeo naturais,
química ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas. A
estrutura principal do polinucleotídeo pode incluir açúcares e grupos fosfato
(como pode ser tipicamente encontrado em RNA ou DNA), ou grupos de
açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, a estrutura
principal do polinucleotídeo pode incluir um polímero de subunidades
sintéticas, tais como fosforamiditas e/ou fosforotioatos e, assim, pode ser um
fosforamidato de oligodesoxinucleosídeo ou um oligômero de fosforamidato-
fosfodiéster misto. Peyrottes et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:1841-1848;
Chaturvedi et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:2318-2323. O polinucleotídeo
pode incluir um ou mais L-nucleosídeos. Um polinucleotídeo pode incluir
nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de
nucleotídeos, uracil, outros açúcares e grupos de ligação, tais como
fluororibose e tioato e ramificações de nucleotídeos. A sequência de
nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um
polinucleotídeo pode ser modificado para incluir fosforamidato N3 -P5 (NP),
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fosforociamidato de morfolino (MF), ácido nucleico bloqueado (LNA), 2 -O-

metoxietil (MOE) ou 2 -fluoro, ácido arabino-nucleico (FANA), que pode
potencializar a resistência do polinucleotídeo à degradação da nuclease
(consulte, por exemplo, Faria et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:40-44;
Toulme (2001) Nature Biotechnol. 19:17-18). Um polinucleotídeo pode ser
modificado ainda após a polimerização, como por conjugação com um
componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta
definição são caps, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de
ocorrência natural por um análogo e introdução de meios para fixar o
polinucleotídeo a proteínas, íons metálicos, componentes de marcação,
outros polinucleotídeos ou um suporte sólido. Moléculas de ácido nucleico
imunomoduladoras podem ser fornecidas em várias formulações, por
exemplo, em associação com lipossomas, microencapsulados, etc.,
conforme descrito em mais detalhes neste documento. Um polinucleotídeo
usado na amplificação é geralmente de fita simples para máxima eficiência
na amplificação, mas pode, alternativamente, ser de fita dupla. Se de fita
dupla, o polinucleotídeo pode primeiro ser tratado para separar suas fitas
antes de ser usado para preparar produtos de extensão. Esta etapa de
desnaturação é tipicamente afetada pelo calor, mas pode alternativamente
ser executada usando álcali, seguido por neutralização.
[0074] Por isolado entende-se, quando se refere a uma proteína,
polipeptídeo ou peptídeo, que a molécula indicada é separada e discreta de
todo o organismo com o qual a molécula é encontrada na natureza ou está
presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do
mesmo tipo. O termo isolado em relação a um polinucleotídeo é uma
molécula de ácido nucleico desprovida, no todo ou em parte, de sequências
normalmente associadas a ela na natureza; ou uma sequência, como existe
na natureza, mas com sequências heterólogas em associação com a
mesma; ou uma molécula desassociada do cromossomo.
[0075] Os termos indivíduo , sujeito , hospedeiro e paciente são
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usados de forma intercambiável neste documento e referem-se a

invertebrados e vertebrados, incluindo, mas não se limitando a, artrópodes
(por exemplo, insetos, crustáceos, aracnídeos), cefalópodes (por exemplo,
polvos, lulas), anfíbios (por exemplo, rãs, salamandras, cecílias), peixes,
répteis (por exemplo, tartarugas, crocodilianos, cobras, anfisbenas, lagartos,
tuatara), mamíferos, incluindo mamíferos humanos e não humanos, tal como
primatas não humanos, incluindo chimpanzés e outros primatas e espécies
de macacos; animais de laboratório, tais como camundongos, ratos, coelhos,
hamsters, porquinhos-da-índia e chinchilas; animais domésticos, tais como
cães e gatos; animais de fazenda, tais como ovelhas, cabras, porcos, cavalos
e vacas; e aves, tais como aves domésticas, selvagens e de caça, incluindo
galinhas, perus e outras aves galináceas, patos e gansos. Em alguns casos,
os métodos da invenção encontram uso em animais experimentais, em
aplicações veterinárias e no desenvolvimento de modelos animais para
doenças, incluindo, mas não se limitando a, roedores, incluindo
camundongos, ratos e hamsters; primatas e animais transgênicos.
[0076] O termo usuário , conforme usado neste documento, refere-se
a uma pessoa que interage com um dispositivo e/ou sistema divulgado neste
documento para realizar uma ou mais etapas dos métodos atualmente
divulgados. O usuário pode ser um sujeito usando o dispositivo de
sequenciamento descrito neste documento.
Dispositivo de Sequenciamento
[0077] É fornecido um sequenciador para sequenciamento
automatizado in situ de amostras de tecido volumétrico. Em particular, é
fornecido um dispositivo de sequenciamento volumétrico in situ automatizado
capaz de operar em múltiplas amostras em paralelo. Em algumas
modalidades, o dispositivo de sequenciamento compreende um módulo de
iluminação e detecção, um módulo de microscópio, um módulo de meio de
imersão automatizado, uma placa de múltiplos poços, uma torre de
acoplamento fluídico ou módulo fluídico autônomo, um módulo de
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gerenciamento fluídico, um reagente, tampão e módulo de resíduos, um

módulo elétrico e um processador.
[0078] Em algumas modalidades, o módulo de iluminação e detecção
compreende um componente confocal de disco giratório compreendendo
uma pluralidade de linhas de laser para iluminação com correção de
iluminação plana, em que a pluralidade de linhas de laser é usada para
iluminar uma amostra com luz de excitação em um ou mais comprimentos
de onda, um filtro de emissão de passa-faixa, um divisor de imagem de
passagem longa, uma primeira câmera que detecta emissões de
fluorescência em um primeiro intervalo de comprimento de onda, e uma
segunda câmera que detecta emissões de fluorescência em um segundo
intervalo de comprimento de onda, em que a primeira câmera e a segunda
câmera podem detectar emissões simultaneamente. Em certas modalidades,
a pluralidade de linhas de laser compreende pelo menos 4 linhas de laser.
Em algumas modalidades, a pluralidade de linhas de laser compreende 5
linhas de laser usadas com um filtro de emissão de passa-faixa penta. Em
certas modalidades, a mesa motorizada tem um eixo z piezo. Em outras
modalidades, o acionamento do eixo z da objetiva é usado e a mesa
motorizada z é mantido constante.
[0079] O módulo de microscópio compreende uma mesa motorizada
capaz de posicionamento em múltiplos eixos ao longo dos eixos x, y e z, um
objetivas, em que cada objetiva fornece uma ampliação e óptica diferentes,
em que a óptica encaminha a luz das objetivas para o módulo de iluminação
e detecção. As objetivas podem incluir objetivas de imersão em que cada
objetiva de imersão tem um colar de imersão de objetiva. Em certas
modalidades, uma objetiva de imersão compreende ainda um anel de
vedação tipo O-ring e um revestimento embalado em plástico termorretrátil
de uma placa de múltiplos poços, em que a mesa motorizada, por exemplo,
para impedir derramamentos que podem danificar a óptica ou as partes
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mecânicas do microscópio. As objetivas também podem incluir objetivas

secas que não têm colar de imersão. Em algumas modalidades, o módulo de
microscópio compreende um microscópio confocal. Em algumas
modalidades, o módulo de microscópio compreende um microscópio
epifluorescente.
[0080] O módulo de meio de imersão automatizado compreende i) um
recipiente compreendendo meios de imersão, ii) linhas fluídicas acopladas
ao recipiente e aos colares de imersão de objetivas das objetivas do módulo
de microscópio, em que as linhas fluídicas transportam meios de imersão de
e para os colares de imersão de objetivas, em que os colares de imersão
capturam o excesso de meios de imersão e iii) uma série de bombas
automatizado fornece volumes controlados dos meios de imersão para os
colares de imersão de objetivas nos topos das objetivas durante a geração
de imagens. Em certas modalidades, o meio de imersão é água. Em certas
modalidades, o meio de imersão é filtrado e sem bolhas.
[0081] A mesa motorizada pode ser movida para posicionar um poço
da placa de múltiplos poços sob a objetiva usada para geração de imagens.
Em algumas modalidades, uma torre de acoplamento fluídico está no topo
da mesa motorizada e posiciona as linhas fluídicas nos poços da placa de
múltiplos poços para permitir a adição ou remoção da amostra dos poços
usando a linha fluídica. Em algumas modalidades, a interface de
acoplamento fluídico não está fixada à mesa motorizada. Em vez disso, é
usado um módulo de interface de acoplamento fluídico autônomo, que é
colocado manualmente por um usuário sobre a placa de amostra e afixado à
mesa, em que a interface de acoplamento fluídico acopla as linhas fluídicas
às amostras durante o sequenciamento.
[0082] O gerenciamento fluídico compreende uma válvula rotativa
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simétrica compreendendo um mecanismo de válvula rotativa, uma bomba,

em que a bomba está conectada às linhas fluídicas e detectores de bolhas,
em que os detectores de bolhas estão posicionados em ambos os lados das
linhas fluídicas que levam à bomba, em que o módulo de gerenciamento
fluídico permite movimento unidirecional ou bidirecional de reagentes,
tampões e resíduos através das linhas fluídicas. Uma série de detectores de
bolhas pode ser usada para garantir que a linha de fluido de imersão esteja
sem bolhas. Além disso, as bolhas podem ser evitadas adicionando um
volume de fluido, removendo o excesso de fluido, então adicionando mais
fluido e movendo a mesa para a borda do poço e de volta para o centro da
amostra para remover quaisquer bolhas adicionais que possam se formar
durante a adição de fluido de imersão.
[0083] O módulo de reagente, tampão e resíduo compreende i) uma
bandeja deslizante, em que cartuchos de reagente e cartuchos de tampão
podem ser posicionados na bandeja deslizante e acoplados ao módulo de
gerenciamento fluídico; ii) um módulo de resíduo em que o módulo de resíduo
compreende um recipiente de resíduos acoplado a uma linha fluídica da
bomba de gerenciamento de fluidos, e iii) um mecanismo de capping, em que
o mecanismo de capping fecha o recipiente de resíduos quando o recipiente
no sistema.
[0084] O módulo elétrico compreende: i) uma primeira placa de
firmware que controla a distribuição de meio a partir do módulo de meio de
imersão automatizado e ii) uma segunda placa de firmware que controla o
módulo de gerenciamento de fluido e o módulo de reagente, tampão e
resíduo, em que o módulo elétrico regula a energia para os outros módulos
do sistema.
compreende ainda um monitor de pressão para monitorar a pressão nas
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linhas fluídicas, em que aumentos na pressão em uma linha fluídica podem

ser usados para detectar um bloqueio potencial da linha fluídica.
compreende ainda uma pluralidade de diodos emissores de luz (LEDs), em
que cada LED pode emitir luz para fornecer uma indicação de estado para o
sistema.
compreende um processador programado para fornecer uma interface de
usuário e operar os módulos do dispositivo de sequenciamento. Em algumas
modalidades, o dispositivo de sequenciamento compreende ainda um
componente de exibição para exibir informações e fornecer uma interface de
usuário.
para realizar etapas compreendendo: (a) localizar uma amostra selecionada
na placa de múltiplos poços; (b) detectar um sinal no plano XY da amostra
selecionada em baixa ampliação usando aquisição de modo de geração de
imagens de campo amplo com compartimentação de câmera; (c) usar o sinal
para segmentar uma caixa delimitadora XY em torno da amostra; (d) gerar
imagens da amostra dentro da caixa delimitadora XY para produzir uma
imagem, em que a geração de imagens é realizada no modo de geração de
imagens confocal em Z em ampliação maior do que usado na etapa (b) com
compartimentação de câmera a fim de determinar a extensão Z aproximada
da amostra, em que um único plano Z é coletado através do ponto médio da
extensão Z previamente determinada e através da extensão XY; (e) exibir a
imagem produzida na etapa (d); (f) fornecer uma interface para um usuário
refinar uma região XY desejada de interesse na amostra a ter adicionalmente
imagem gerada durante o sequenciamento da amostra selecionada; (g) gerar
imagens da amostra na região XY selecionada de interesse através as
extensões Z amostra das anteriormente; (h) calcular um volume da região de
interesse na amostra e exibir o volume de amostra calculado da região de
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interesse para o usuário; (i) segmentar a imagem da amostra na região de

interesse ao longo das extensões Z; (j) fornecer uma interface ao usuário
para que o usuário ajuste as extensões Z do volume da amostra antes de
iniciar o sequenciamento, em que as extensões de geração de imagens
derivadas da região de interesse definida pelo usuário são automaticamente
convertidas em campos de visão montados apropriados para uma
determinada objetiva de geração de imagens e ajustar as posições da mesa
do microscópio, o posicionamento Z da objetiva e as ligações piezo para
geração de imagens da região de interesse ao longo dos eixos XYZ durante
o sequenciamento; e (k) reiterar as etapas (a)-(j) para definir regiões de
interesse para cada amostra na placa de múltiplos poços que o usuário
pretende sequenciar.
para realizar etapas compreendendo: fornecer uma interface ao usuário para
o usuário selecionar uma ou mais amostras para sequenciamento e um
protocolo de sequenciamento, em que o usuário é limitado em quantas
amostras podem ser selecionadas dependendo das quantidades de tampão
e reagentes que estão disponíveis e o protocolo de sequenciamento
selecionado; fornecer restrições sobre o tempo total de sequenciamento,
dados totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total máximo de regiões
de interesse em todas as amostras que devem ser sequenciadas e imagens
geradas e sugerir protocolos que maximizem o sequenciamento das regiões
de interesse desejadas em amostras dentro das restrições. Em certas
modalidades, o processador é ainda programado para otimizar a
paralelização de sequenciamento de amostra dependendo do número de
amostras a serem sequenciadas e tipos de imagem a serem usadas no
sequenciamento.
para realizar etapas compreendendo: realizar uma varredura confocal ou
epifluorescente rápida em Z em uma posição XY inicial de uma dada
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da amostra em relação à mesa e a objetiva através de rodadas é reduzido
aquisição.
[0091] Em certas modalidades, o sequenciamento é o
sequenciamento in situ de um ácido nucleico alvo em uma amostra de tecido.
Em algumas modalidades, a amostra de tecido é um pedaço de tecido
espesso com uma espessura de 50-200 µm. Em outras modalidades, a
amostra de tecido é um pedaço de tecido fino com uma espessura de 5-20
µm. Em algumas modalidades, o sequenciamento in situ é sequenciamento
sequencial ou combinatório in situ.
Usos modulares dos Componentes do Sequenciador
[0092] Em algumas modalidades, os componentes fluídicos podem
atuar como um módulo de sequenciamento autônomo para uso com qualquer
sistema de geração de imagens compatível. As linhas de fluido à amostra
podem ser acopladas a uma placa de amostra e à mesa do microscópio
magneticamente e/ou mecanicamente, de modo que o acoplamento seja
facilmente fixável e destacável de uma posição engatada e de modo que os
componentes fluídicos sejam acoplados a poços de amostra. Em um caso
deste acoplamento, as linhas de fluido dirigidas a cada poço de amostra são
agrupadas e encaminhadas para cada poço de amostra por meio de uma
tampa de placa destacável (consulte o esquema), que se acopla por meio de
um guia mecânico e acessório magnético a um mesa do microscópio. Em
outra modalidade do acoplamento, uma torre de acoplamento modular é
fornecida para ser afixada à mesa do microscópio. Quando usados como um
módulo de sequenciamento autônomo, os componentes fluídicos facilitam o
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uso de kits de reagente e tampão e a automação da troca de fluido de

múltiplos poços de amostra através de múltiplos ciclos de adição e remoção
de fluido. Quando usados como um dispositivo para sequenciamento in situ,
os componentes fluídicos podem ser acoplados a uma configuração de
microscopia existente que é compatível com o formato de amostra, por
exemplo, um microscópio invertido. Quando usado com amostras de seção
fina (5-20 mm), o microscópio pode ser um microscópio epifluorescente com
3, 4 ou 5 canais de iluminação ou detecção. Quando usado com amostras
de seção fina ou espessa, o microscópio pode ser um microscópio
epifluorescente, um microscópio confocal (disco giratório ou varredura de
ponto), um microscópio de iluminação estruturado ou um microscópio de
folha de luz ou de folha de luz de plano oblíquo.
[0093] Um módulo de dispersão de água de imersão (IWD) pode ser
usado como um submódulo de um sistema fluídico integrado para um
sequenciador. Alternativamente, pode ser usado como um kit autônomo para
imersão automatizada de objetivas de imersão em microscópio. Em um caso,
é usado em conjunto com o módulo fluídico de reagente/tampão/consumíveis
para permitir o sequenciamento paralelo e automatizado de amostras em
uma configuração de microscópio separada e existente. Neste caso, o
reservatório de fluido de imersão e o resíduo de fluido de imersão são
externos ao dispositivo fluídico de modo que o usuário possa preencher
manualmente o reservatório de fluido de imersão e esvaziar o reservatório
de resíduos. O módulo de dispersão de água de imersão se conecta às
objetivas do microscópio por meio do colar de imersão, que é projetado para
fluir o líquido de imersão através do vidro de geração imagem da objetiva, de
modo que nenhuma bolha seja introduzida e o volume de líquido e a taxa de
fluxo sejam precisos e consistentes, enquanto fornece uma vedação
estanque contra o corpo da objetiva, de modo que o excesso de líquido possa
ser removido. As dimensões exatas do colar de imersão são ajustadas para
serem compatíveis a lentes objetivas específicas para garantir um ajuste
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adequado, mas a função dos outros subcomponentes do módulo de

dispersão de água de imersão é independente da fabricação do sistema de
geração de imagens.
[0094] O software que controla o sequenciador fornece uma camada
de abstração sobre o controle dos componentes de iluminação, detecção,
microscópio e mesa e, assim, pode ser usado modularmente com uma
variedade de configurações de geração de imagens, desde que um arquivo
de configuração apropriado ou outros plugins de hardware sejam fornecidos.
Assim, uma configuração particular de geração de imagens e microscopia
não é privilegiada na operação do sequenciador e do software, módulo de
imersão da objetiva, amostra, reagente e fluido tampão e consumíveis podem
ser usados modularmente e reconfigurados em uma ou mais combinações
de componentes.
[0095] Em algumas modalidades, o reagente e os componentes de
fluido tampão extraem fluidos de reservatórios reusáveis. Em outra
modalidade do sequenciador, o reagente e os componentes de fluido tampão
extraem fluidos de reservatórios consumíveis. Em um caso, os reservatórios
consumíveis são vedados depois de serem preenchidos e a vedação é
perfurada pelas agulhas de aspiração de líquidos do módulo fluídico de
reagente/tampão. Em um caso, as vedações são suportadas mecanicamente
na montagem do consumível para garantir a perfuração consistente da
vedação e para evitar forças excessivas nas agulhas de aspiração de
líquidos ou forças não alinhadas aos eixos paralelos das agulhas de
aspiração de líquidos. Os reservatórios consumíveis são normalmente
substituídos no início de cada uso do sequenciador e seu uso é rastreado
programaticamente através da detecção da identidade do consumível. Em
um caso, a detecção do consumível realizada através do uso de um RFID
integrado no consumível e um leitor de RFID no módulo fluídico
sequenciador. Em outra modalidade, a detecção do consumível é realizada
através do uso de um código de barras no consumível e um escâner de
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código de barras integrado no módulo fluídico sequenciador.

[0096] Em outra modalidade, o módulo de fluido extrai de tampões e
reagentes usados em ciclos de sequenciamento in situ. Em um caso do
módulo fluídico, alguns ou todos os tampões ou reagentes são resfriados por
um componente de refrigeração. Em algumas modalidades do módulo
fluídico, alguns ou todos os tampões ou reagentes são sensíveis à
temperatura, por exemplo, enzimas como ligase ou moléculas como ATP
envolvidas em químicas de sequenciamento SCAL, SEDAL ou SEDAL2. Em
outra modalidade, os módulos fluídicos de tampão e reagente extraem
líquidos usados em outras químicas de sequenciamento ou marcação cíclica,
por exemplo, oligos usados para hibridizar com sequências em uma amostra
ou oligos marcados com fluorescência usados para detectar eventos de
hibridização em uma amostra. Em outra modalidade, os módulos fluídicos de
tampão e reagente extraem líquidos usados para a marcação de amostras
com corantes. Em outra modalidade, os módulos fluídicos de tampão e
reagente extraem líquidos usados para reações químicas CLICK com a
amostra. Em outra modalidade, os módulos fluídicos de tampão e reagente
extraem líquidos para suprimir o sinal fluorescente na amostra. Em outra
modalidade, os módulos fluídicos de tampão e reagente extraem fluidos
contendo componentes enzimáticos que adicionam ou removem sinais de
uma amostra.
Métodos Implementados por Computador
[0097] A presente divulgação fornece sistemas e métodos
implementados por computador que encontram uso no uso do dispositivo de
sequenciamento descrito neste documento. Em certas modalidades, o
dispositivo de sequenciamento compreende um processador programado
para fornecer uma interface de usuário e operar os módulos do dispositivo
de sequenciamento. Em algumas modalidades, o dispositivo de
sequenciamento compreende ainda um componente de exibição para exibir
informações e fornecer uma interface de usuário. O sistema também pode
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compreender uma ou mais placas gráficas para processar e emitir

informações gráficas de uma imagem de tecido para o componente de
exibição.
[0098] Em algumas modalidades, um método implementado por
computador é usado para fornecer uma interface entre um usuário e o
firmware e hardware do sequenciador, por exemplo, para realizar a
configuração de execução de sequenciamento, selecionar opções de
execução de sequenciamento e selecionar e definir uma região de amostra
de interesse (ROI). Os métodos implementados por computador podem ser
usados para controlar os diferentes módulos do dispositivo de
sequenciamento e paralelização de sequenciamento através de amostras e
fornecer registro, monitoramento de erros, aquisição de dados,
gerenciamento e transferência e executar monitoramento de progresso.
[0099] Em uma modalidade, é fornecido um método implementado por
computador, o computador realizando etapas compreendendo: (a) localizar
uma amostra selecionada na placa de múltiplos poços; (b) detectar um sinal
no plano XY da amostra selecionada em baixa ampliação usando aquisição
de modo de geração de imagens de campo amplo com compartimentação
de câmera; (c) usar o sinal para segmentar uma caixa delimitadora XY em
torno da amostra; (d) gerar imagem da amostra dentro da caixa delimitadora
XY para produzir uma imagem, em que a geração de imagens é realizada no
modo de geração de imagens confocal em Z com ampliação mais alta do que
a usada na etapa (b) com compartimentação de câmera a fim de determinar
a extensão Z aproximada da amostra, em que um único plano Z é coletado
através do ponto médio da extensão Z previamente determinada e através
da extensão XY; (e) exibir a imagem produzida na etapa (d); (f) fornecer uma
interface para um usuário selecionar uma região XY desejada de interesse
na amostra a ter adicionalmente imagem gerada durante o sequenciamento
da amostra selecionada; (g) gerar imagem da amostra na região XY
selecionada de interesse através das extensões Z amostradas
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anteriormente; (h) calcular um volume de amostra da região de interesse e

exibir o volume de amostra calculado da região de interesse para o usuário;
(i) segmentar a imagem da amostra na região de interesse ao longo das
extensões Z; (j) fornecer uma interface ao usuário para que o usuário ajuste
as extensões Z do volume de amostra antes de iniciar o sequenciamento, em
que as extensões de geração de imagens derivadas da região de interesse
montados apropriados para uma determinada objetiva de geração de
imagens e para ajustar as posições da mesa do microscópio, posicionamento
Z da objetiva e ligações piezo para geração de imagens da região de
interesse ao longo dos eixos XYZ durante o sequenciamento; e (k) reiterar
as etapas (a)-(j) para definir regiões de interesse para cada amostra na placa
de múltiplos poços que o usuário pretende sequenciar.
[00100] Em outra modalidade, é fornecido um método implementado
por computador, o computador realizando etapas compreendendo: fornecer
uma interface ao usuário para o usuário selecionar uma ou mais amostras
para sequenciamento e um protocolo de sequenciamento, em que o usuário
é limitado em quantas amostras podem ser selecionadas dependendo das
quantidades de tampão e reagentes disponíveis e o protocolo de
sequenciamento selecionado; fornecer restrições sobre o tempo total de
sequenciamento, dados totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total
máximo de regiões de interesse em todas as amostras que devem ser
sequenciadas e imagens geradas e sugerir protocolos que maximizem o
sequenciamento das regiões de interesse desejadas em amostras dentro das
restrições. Em algumas modalidades, o computador é ainda programado
número de amostras a serem sequenciadas e tipos de geração de imagens
a serem usadas no sequenciamento.
[00101] Em outra modalidade, é fornecido um método implementado
por computador, o computador realizando etapas compreendendo: realizar
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uma varredura confocal rápida em Z em uma posição XY inicial de uma dada

da amostra em relação à mesa e a objetiva através de rodadas é reduzida
aquisição.
[00102] O método pode ser implementado em circuitos eletrônicos
digitais ou em software, firmware ou hardware de computador. A divulgação
e outras modalidades podem ser implementadas como um ou mais produtos
de programa de computador, isto é, um ou mais módulos de instruções de
programa de computador codificadas em um meio legível por computador
para execução por, ou para controlar a operação de, um aparelho de
processamento de dados. O meio legível por computador pode ser um
dispositivo de armazenamento legível por máquina, um substrato de
armazenamento legível por máquina, um dispositivo de memória, uma
composição de matéria efetuando um sinal propagado legível por máquina
ou qualquer uma combinação destes.
[00103] Um programa de computador (também conhecido como um
programa, software, aplicativo de software, script ou código) pode ser escrito
em qualquer forma de linguagem de programação, incluindo linguagens
compiladas ou interpretadas e pode ser implantado em qualquer forma,
incluindo como um programa autônomo ou como um módulo, componente,
sub-rotina ou outra unidade adequada para uso em um ambiente de
computação. Um programa de computador não corresponde
necessariamente a um arquivo em um sistema de arquivos. Um programa
pode ser armazenado em uma porção de um arquivo que contém outros
programas ou dados (por exemplo, um ou mais scripts armazenados em um
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documento de linguagem de marcação), em um único arquivo dedicado para

o programa em causa, ou em múltiplos arquivos coordenados (por exemplo,
arquivos que armazenam um ou mais módulos, subprogramas ou porções
do código). Um programa de computador pode ser implementado para ser
executado em um computador ou em múltiplos computadores que estão
localizados em um sítio ou distribuídos através de múltiplos locais e
interligados por uma rede de comunicação.
[00104] Em um aspecto adicional, o sistema para realizar o método
implementado por computador, conforme descrito, pode incluir um
processador, um componente de armazenamento (isto é, memória), um
componente de exibição e outros componentes tipicamente presentes em
computadores de uso geral. O componente de armazenamento armazena
informações acessíveis pelo processador, incluindo instruções que podem
ser executadas pelo processador e dados que podem ser recuperados,
manipulados ou armazenados pelo processador.
[00105] O componente de armazenamento inclui instruções. Por
exemplo, o componente de armazenamento pode incluir instruções para
fornecer uma interface de usuário para o dispositivo de sequenciamento,
operar o dispositivo de sequenciamento e processar dados de geração de
imagens de sequenciamento in situ, conforme descrito neste documento. O
processador de computador é acoplado ao componente de armazenamento
e configurado para executar as instruções armazenadas no componente de
armazenamento a fim de receber dados de geração de imagens de
sequenciamento in situ e analisar os dados de acordo com um ou mais
algoritmos, conforme descrito neste documento. O componente de exibição
exibe informações e fornece uma interface de usuário.
[00106] O componente de armazenamento pode ser de qualquer tipo
capaz de armazenar informações acessíveis pelo processador, como um
disco rígido, cartão de memória, ROM, RAM, DVD, CD-ROM, pendrive tipo
USB, memórias com capacidade de gravação e somente leitura. O
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processador pode ser qualquer processador bem conhecido, tal como

processadores da Intel Corporation. Alternativamente, o processador pode
ser um controlador dedicado, tal como um ASIC.
[00107] Em certas modalidades, os dados de geração de imagens de
sequenciamento in situ são carregados e armazenados em um sistema de
armazenamento de dados em nuvem. Em algumas modalidades, o sistema
de armazenamento de dados em nuvem é um sistema de armazenamento
em nuvem pública. Em outras modalidades, o sistema de armazenamento de
dados em nuvem é um sistema de armazenamento em nuvem privada. O
armazenamento de dados em nuvem pode ser usado para armazenar
imagens em bruto, arquivos processados intermediários e produtos de dados
finais. O processamento pode começar com o carregamento de um conjunto
de dados para o armazenamento em nuvem por um sistema de aquisição de
dados. Os parâmetros de configuração, como o esquema de codificação,
livro de códigos, parâmetros de aquisição de imagem e metadados de
amostra, podem ser inseridos por um usuário usando uma interface da web
de gerenciamento de dados ou gerados automaticamente a partir de um
arquivo de configuração carregado no armazenamento em nuvem
juntamente com os dados de sequenciamento. Cada conjunto de parâmetros
de configuração é armazenado em um banco de dados em nuvem. Em
alguns casos, múltiplas execuções de processamento usando diferentes
parâmetros de configuração podem ser aplicadas a um único conjunto de
dados para otimizar os parâmetros de processamento.
[00108] As instruções podem ser qualquer conjunto de instruções a
serem executadas diretamente (como código de máquina) ou indiretamente
(como scripts) pelo processador. A esse respeito, os termos instruções ,
etapas e programas podem ser usados de forma intercambiável neste
documento. As instruções podem ser armazenadas na forma de código
objeto para processamento direto pelo processador, ou em qualquer outra
linguagem de computador, incluindo scripts ou coleções de módulos de
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código fonte independentes que são interpretados sob demanda ou

compilados com antecedência.
[00109] Os dados podem ser recuperados, armazenados ou
modificados pelo processador de acordo com as instruções. Por exemplo,
embora o sistema não seja limitado por qualquer estrutura de dados
particular, os dados podem ser armazenados em registros de computador,
em um banco de dados relacional como uma tabela tendo uma pluralidade
de campos e registros diferentes, documentos XML ou arquivos simples. Os
dados também podem ser formatados em qualquer formato legível por
computador, tal como, mas não limitado a, valores binários, ASCII ou
Unicode. Além disso, os dados podem compreender qualquer informação
suficiente para identificar as informações relevantes, como números, texto
descritivo, códigos proprietários, ponteiros, referências a dados
armazenados em outras memórias (incluindo outros locais de rede) ou
informações que são usadas por uma função para calcular os dados
relevantes.
[00110] Em certas modalidades, o processador e o componente de
armazenamento podem compreender múltiplos processadores e
componentes de armazenamento que podem ou não ser armazenados
dentro do mesmo alojamento físico. Por exemplo, algumas das instruções e
dados podem ser armazenados em CD-ROM removível e outros dentro de
um chip de computador somente de leitura. Algumas ou todas as instruções
e dados podem ser armazenados em um local fisicamente remoto, mas ainda
acessível pelo processador. Semelhantemente, o processador pode
compreender uma coleção de processadores que podem ou não operar em
paralelo.
[00111] Em algumas modalidades, o método pode ser realizado
usando um sistema de computação em nuvem. Em algumas modalidades,
os arquivos de dados de imagem e a programação para processar os dados
de geração de imagens podem ser exportados para um computador em
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nuvem, que executa o programa e retorna uma saída para o usuário. O

método pode incluir compressão opcional dos dados de geração de imagens
antes da transferência para reduzir o tamanho dos dados e aumentar a
velocidade de transferência. Durante o processo de aquisição de dados, as
imagens adquiridas são acopladas a arquivos de metadados detalhando as
especificações ópticas, posições da mesa e informações de
sequenciamento; a compressão opcional de dados de geração de imagens
como um processo separado da aquisição de geração de imagens; e o
descarregamento opcional de dados da aquisição para um meio de
armazenamento em nuvem remoto, um sistema de armazenamento fixado
em rede ou um sistema de arquivos grande separado.
[00112] Os componentes dos sistemas para a execução dos métodos
atualmente divulgados são ainda descritos nos exemplos abaixo.
Sequenciamento de Genes In Situ
[00113] O dispositivo de sequenciamento divulgado neste documento
pode ser usado para sequenciamento de genes in situ de um ácido nucleico
alvo em uma célula em um tecido intacto. O sequenciamento in situ pode ser
realizado por um método compreendendo: (a) contatar um tecido intacto fixo
e permeabilizado com pelo menos um par de primers oligonucleotídicos sob
condições para permitir hibridização específica, em que o par de primers
compreende um primeiro oligonucleotídeo e um segundo oligonucleotídeo;
em que cada um do primeiro oligonucleotídeo e do segundo oligonucleotídeo
compreende uma primeira região de complementaridade, uma segunda
sequência de região de complementaridade e uma terceira região de
complementaridade; em que o segundo oligonucleotídeo compreende ainda
uma sequência de código de barras; em que a primeira região de
complementaridade do primeiro oligonucleotídeo é complementar a uma
primeira porção do ácido nucleico alvo, em que a segunda região de
complementaridade do primeiro oligonucleotídeo é complementar à primeira
região de complementaridade do segundo oligonucleotídeo, em que a
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terceira região de complementaridade do primeiro oligonucleotídeo é

complementar à terceira região de complementaridade do segundo
oligonucleotídeo, em que a segunda região complementar do segundo
oligonucleotídeo é complementar a uma segunda porção do ácido nucleico
alvo, em que a primeira porção do nucleico alvo é adjacente à segunda
porção do ácido nucleico alvo; (b) adicionar ligase para ligar o segundo
oligonucleotídeo e gerar um círculo de ácido nucleico fechado; (c) realizar
amplificação de círculo rolante na presença de uma molécula de ácido
nucleico, em que a realização compreende usar o segundo oligonucleotídeo
como um modelo e o primeiro oligonucleotídeo como um primer para uma
polimerase para formar um ou mais amplicons; (d) incorporar o um ou mais
amplicons na presença de subunidades de hidrogel para formar um ou mais
amplicons incorporados em hidrogel; (e) contatar o um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel com a sequência de código de barras com um
conjunto de primers de sequenciamento sob condições para permitir a
ligação, em que o conjunto de primers de sequenciamento compreende um
terceiro oligonucleotídeo configurado para decodificar bases e um quarto
oligonucleotídeo configurado para converter bases decodificadas em um
sinal, em que a ligação ocorre apenas quando o terceiro oligonucleotídeo e
o quarto oligonucleotídeo são complementares às sequências adjacentes do
mesmo amplicon; (f) etapa de reiteração (e); e (g) geração de imagens do
um ou mais amplicons incorporados em hidrogel usando o dispositivo de
sequenciamento descrito neste documento para determinar uma sequência
de genes do ácido nucleico alvo in situ na célula no tecido intacto.
[00114] Em algumas modalidades, o sequenciamento in situ é
realizado usando Sequenciamento com Correção de erros por Anelamento e
Ligação Dinâmicos (SEDAL) para determinar uma sequência de um ácido
nucleico alvo. O método SEDAL compreende o contato de um ou mais
amplicons incorporados em hidrogel com a sequência de código de barras
com um par de primers sob condições para permitir a ligação, em que o par
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de primers inclui um terceiro oligonucleotídeo e um quarto oligonucleotídeo,

em que a ligação ocorre apenas quando o terceiro oligonucleotídeo e o
quarto oligonucleotídeo se ligam ao mesmo amplicon. Em algumas
modalidades, SEDAL é usado com STARmap. Em tais modalidades, o
método neste documento inclui operar à temperatura ambiente para melhor
preservação da morfologia do tecido com baixo ruído de fundo e redução de
erros. Em tais outras modalidades, o contato de um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel inclui eliminar o acúmulo de erros à medida que o
sequenciamento prossegue.
[00115] Em algumas modalidades, o contato de um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel ocorre duas vezes ou mais, incluindo, mas não se
limitando a, por exemplo, três vezes ou mais, quatro vezes ou mais, cinco
vezes ou mais, seis vezes ou mais, ou sete vezes ou mais. Em certas
modalidades, o contato do um ou mais amplicons incorporados em hidrogel
ocorre quatro vezes ou mais para espécimes de tecido fino. Em outras
modalidades, o contato do um ou mais amplicons incorporados em hidrogel
ocorre seis vezes ou mais para espécimes de tecido espesso. Em algumas
modalidades, um ou mais amplicons podem ser contatados por um par de
primers por 24 ou mais horas, 24 ou menos horas, 18 ou menos horas, 12
ou menos horas, 8 ou menos horas, 6 ou menos horas, 4 ou menos horas, 2
ou menos horas, 60 ou menos minutos, 45 ou menos minutos, 30 ou menos
minutos, 25 ou menos minutos, 20 ou menos minutos, 15 ou menos minutos,
10 ou menos minutos, 5 ou menos minutos, ou 2 ou menos minutos.
[00116] Os espécimes preparados usando os métodos em questão
podem ser analisados por qualquer um de vários tipos diferentes de
microscopia, por exemplo, microscopia óptica (por exemplo, microscopia de
campo claro, iluminação oblíqua, campo escuro, contraste de fase, contraste
de interferência diferencial, reflexão de interferência, epifluorescência,
confocal, etc.), microscopia a laser, microscopia eletrônica e microscopia de
sonda de varredura. Em alguns aspectos, um meio legível por computador
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não transitório transforma imagens em bruto adquiridas através de

microscopia de múltiplas rodadas de sequenciamento in situ primeiro em
identidades de genes decodificados e localizações espaciais e, então,
analisa a composição por célula da expressão gênica.
Primers de Oligonucleotídeo de SEDAL
[00117] Em algumas modalidades, os métodos divulgados incluem um
terceiro oligonucleotídeo e um quarto oligonucleotídeo. Em certos aspectos,
o terceiro oligonucleotídeo é configurado para decodificar bases e o quarto
oligonucleotídeo é configurado para converter bases decodificadas em um
sinal. Em alguns aspectos, o sinal é um sinal fluorescente. Em aspectos
exemplificativos, o contato de um ou mais amplicons incorporados em
hidrogel com a sequência de código de barras com um par de primers sob
condições para permitir a ligação envolve cada um do terceiro
oligonucleotídeo e do quarto oligonucleotídeo se ligando para formar um
produto estável para geração de imagens apenas quando ocorre uma
compatibilidade perfeita. Em certos aspectos, a sensibilidade de
incompatibilidade de uma enzima ligase é usada para determinar a
sequência subjacente da molécula de ácido nucleico alvo.
[00118] O termo perfeitamente compatível , quando usado em
referência a um duplex, significa que as fitas polinucleotídicas e/ou
oligonucleotídicas que compõem o duplex formam uma estrutura de fita dupla
entre si, de modo que cada nucleotídeo em cada fita sofra emparelhamento
de bases Watson-Crick com um nucleotídeo na outra fita. O termo duplex
inclui, mas não está limitado a, o emparelhamento de análogos de
nucleosídeos, tais como desoxinosina, nucleosídeos com bases de 2-
aminopurina, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) e semelhantes, que podem
ser empregados. Uma incompatibilidade em um duplex entre dois
oligonucleotídeos significa que um par de nucleotídeos no duplex não sofre
ligação Watson-Crick.
[00119] Em algumas modalidades, o método inclui uma pluralidade de
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terceiros oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 5 ou mais

terceiros oligonucleotídeos, por exemplo, 8 ou mais, 10 ou mais, 12 ou mais,
15 ou mais, 18 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais que
hibridizam com sequências de nucleotídeos alvo. Em algumas modalidades,
um método da presente divulgação inclui uma pluralidade de terceiros
oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 15 ou mais terceiros
oligonucleotídeos, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou
mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 primeiros oligonucleotídeos diferentes
que hibridizam com 15 ou mais, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou
mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 sequências nucleotídicas
alvo diferentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma
pluralidade de quartos oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a,
5 ou mais quartos oligonucleotídeos, por exemplo, 8 ou mais, 10 ou mais, 12
ou mais, 15 ou mais, 18 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou
mais. Em algumas modalidades, um método da presente divulgação inclui
uma pluralidade de quartos oligonucleotídeos, incluindo, mas não se
limitando a, 15 ou mais quartos oligonucleotídeos, por exemplo, 20 ou mais,
30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80
primeiros oligonucleotídeos diferentes que hibridizam com 15 ou mais, por
exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou
mais, e até 80 sequências nucleotídicas alvo diferentes. Uma pluralidade de
pares de oligonucleotídeos pode ser usada em uma reação, em que um ou
mais pares se ligam especificamente a cada ácido nucleico alvo. Por
exemplo, dois pares de primers podem ser usados para um ácido nucleico
alvo, a fim de melhorar a sensibilidade e reduzir a variabilidade. Também é
de interesse detectar uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvo em
uma célula, por exemplo, detectar até 2, até 3, até 4, até 5, até 6, até 7, até
8, até 9, até 10, até 12, até 15, até 18, até 20, até 25, até 30, até 40 ou mais
ácidos nucleicos alvo distintos.
[00120] Em certas modalidades, SEDAL envolve uma ligase com
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atividade impedida por incompatibilidades de base, um terceiro

oligonucleotídeo e um quarto oligonucleotídeo. O termo impedido neste
contexto refere-se à atividade de uma ligase que é reduzida em
aproximadamente 20% ou mais, tal como em 25% ou mais, tal como em 50%
ou mais, tal como em 75% ou mais, tal como em 90% ou mais, tal como em
95% ou mais, tal como em 99% ou mais, tal como em 100%. Em algumas
modalidades, o terceiro oligonucleotídeo tem um comprimento de 5-15
nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 5-13 nucleotídeos, 5-10
nucleotídeos ou 5-8 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a Tm do terceiro
oligonucleotídeo está à temperatura ambiente (22-25 °C). Em algumas
modalidades, o terceiro oligonucleotídeo é degenerado, ou parcialmente
deste. Em algumas modalidades, o quarto oligonucleotídeo tem um
comprimento de 5-15 nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 5-13
nucleotídeos, 5-10 nucleotídeos ou 5-8 nucleotídeos. Em algumas
modalidades, a Tm do quarto oligonucleotídeo está à temperatura ambiente
(22-25 °C). Após cada ciclo de SEDAL correspondente a uma leitura de base,
os quartos oligonucleotídeos podem ser removidos, o que elimina o acúmulo
de erros à medida que o sequenciamento prossegue. Em tais modalidades,
os quartos oligonucleotídeos são removidos por formamida.
[00121] Em algumas modalidades, o SEDAL envolve a lavagem do
terceiro oligonucleotídeo e do quarto oligonucleotídeo para remover
oligonucleotídeos não ligados, revelando posteriormente um produto
fluorescente para geração de imagens. Em certas modalidades
exemplificativas, pode ser usado um marcador detectável para detectar um
ou mais nucleotídeos e/ou oligonucleotídeos descritos neste documento. Em
certas modalidades, um marcador detectável pode ser usado para detectar
um ou mais amplicons. Exemplos de marcadores detectáveis incluem várias
porções radioativas, enzimas, grupos prostéticos, marcadores fluorescentes,
marcadores luminescentes, marcadores bioluminescentes, partículas
metálicas, pares de ligação proteína-proteína, pares de ligação proteína-
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anticorpo e semelhantes. Exemplos de proteínas fluorescentes incluem, mas

não se limitam a, proteína fluorescente amarela (YFP), proteína de
fluorescência verde (GFP), proteína de fluorescência ciano (CFP),
umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,
diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila, ficoeritrina e
semelhantes. Exemplos de marcadores bioluminescentes incluem, mas não
estão limitados a, luciferase (por exemplo, bacteriana, vaga-lume, besouro
de clique e semelhantes), luciferina, aequorina e semelhantes. Exemplos de
sistemas enzimáticos com sinais visualmente detectáveis incluem, mas não
se limitados a, galactosidases, glucorimidases, fosfatases, peroxidases,
colinesterases e semelhantes. Marcadores identificáveis também incluem
125 35 14
compostos radioativos como I, S, C ou 3H. Marcadores identificáveis
estão comercialmente disponíveis de uma variedade de fontes.
[00122] Os marcadores fluorescentes e a sua fixação aos
nucleotídeos e/ou oligonucleotídeos são descritos em muitas revisões,
incluindo Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals, Nona Edição (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller e
Manak, DNA Probes, 2ª edição (Stockton Press, Nova Iorque, 1993);
Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL
Press, Oxford, 1991); e Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology, 26:227-259 (1991). Metodologias particulares aplicáveis
à invenção são divulgadas na seguinte amostra de referências: Patentes dos
EUA N.ºs 4.757.141, 5.151.507 e 5.091.519. Em um aspecto, um ou mais
corantes fluorescentes são usados como marcadores para sequências alvo
marcadas, por exemplo, como divulgado pela Patente dos EUA N.º
5.188.934 (corantes de 4,7-diclorofluoresceína); Patente dos EUA N.º
5.366.860 (corantes de rodamina espectralmente resolvível); Patente dos
EUA N.º 5.847.162 (corantes de 4,7-diclororodamina); Patente dos EUA N.º
4.318.846 (corantes de fluoresceína substituídos com éter); Patente dos EUA
N.º 5.800.996 (corantes de transferência de energia); Lee et al.; Patente dos
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EUA N.º 5.066.580 (corantes de xantina); Patente dos EUA N.º 5.688.648
(corantes de transferência de energia); e semelhantes. A marcação também
pode ser executada com pontos quânticos, conforme divulgado nas
seguintes patentes e pedidos de patente: Patentes dos EUA N.ºs 6.322.901,
6.576.291, 6.423.551, 6.251.303, 6.319.426, 6.426.513, 6.444.143,
5.990.479, 6.207.392, 2002/0045045 e 2003/0017264. Conforme usado
neste documento, o termo marcador fluorescente inclui uma fração de
sinalização que transmite informação através das propriedades de absorção
e/ou emissão fluorescentes de uma ou mais moléculas. Tais propriedades
fluorescentes incluem intensidade de fluorescência, tempo de vida de
fluorescência, características do espectro de emissão, transferência de
energia e semelhantes.
[00123] Os análogos de nucleotídeos fluorescentes comercialmente
disponíveis prontamente incorporados em sequências nucleotídicas e/ou
oligonucleotídicas incluem, mas não estão limitados a, Cy3-dCTP, Cy3-
dUTP, Cy5-dCTP, Cy5-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.),
fluoresceína-12-dUTP, tetrametilrodamina-6-dUTP, TEXAS RED -5-dUTP,
CASCADE BLUE -7-dUTP, BODIPY TMFL-14-dUTP, BODIPY TMR-14-
dUTP, BODIPY TMTR-14-dUTP, RHODAMINE GREEN -5-dUTP,
OREGON GREENR 488-5-dUTP, TEXAS RED -12-dUTP, BODIPY
630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP, ALEXA FLUOR 488-5-
dUTP, ALEXA FLUOR 532-5-dUTP, ALEXA FLUOR 568-5-dUTP,
ALEXA FLUOR 594-5-dUTP, ALEXA FLUOR 546-14-dUTP,
fluoresceína-12-UTP, tetrametilrodamina-6-UTP, TEXAS RED -5-UTP,
mCherry, CASCADE BLUE -7-UTP, BODIPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-
14-UTP, BODIPY TR-14-UTP, RHODAMINE GREEN -5-UTP, ALEXA
FLUOR 488-5-UTP, LEXA FLUOR 546-14-UTP (Molecular Probes, Inc.
Eugene, Oreg.) e semelhantes. Os protocolos são conhecidos na técnica
para síntese personalizada de nucleotídeos com outros fluoróforos
(Consulte, Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345).
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[00124] Outros fluoróforos disponíveis para fixação pós-sintética

incluem, mas não estão limitados a, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR
532, ALEXA FLUOR 546, ALEXA FLUOR 568, ALEXA FLUOR 594,
ALEXA FLUOR 647, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G,
BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568,
BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650,
BODIPY 650/665, Cascade Blue, Cascade Yellow, Dansil, lissamina
rodamina B, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific
Blue, rodamina 6G, rodamina verde, rodamina vermelho, tetrametil rodamina,
Texas Red (disponível na Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.), Cy2,
Cy3.5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) e
semelhantes. Fluoróforos em conjunto com FRET também podem ser
usados, incluindo, mas não se limitando a, corantes PerCP-Cy5.5, PE-Cy5,
PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-Texas Red, APC-Cy7, PE-Alexa (610, 647, 680),
corantes APC-Alexa e semelhantes.
[00125] Partículas metálicas de prata ou ouro podem ser usadas para
potencializar o sinal de sequências nucleotídicas e/ou oligonucleotídicas
marcadas com fluorescência (Lakowicz et al. (2003) Bio Techniques 34:62).
[00126] A biotina, ou um derivado desta, também pode ser usada
como um marcador em uma sequência nucleotidíca e/ou uma
oligonucleotídica e subsequentemente ligada por um derivado de
avidina/estreptavidina marcado de forma detectável (por exemplo,
estreptavidina conjugada com ficoeritrina) ou um anticorpo anti-biotina
marcado de forma detectável. A digoxigenina pode ser incorporada como um
marcador e subsequentemente ligada por um anticorpo anti-digoxigenina
marcado de forma detectável (por exemplo, anti-digoxigenina
fluoresceinada). Um resíduo de aminoalil-dUTP pode ser incorporado em
uma sequência oligonucleotídica e subsequentemente acoplado a um
corante fluorescente derivatizado de N-hidroxi succinimida (NHS). Em geral,
qualquer membro de um par de conjugado pode ser incorporado em um
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oligonucleotídeo de detecção, desde que um parceiro de conjugado marcado

de forma detectável possa ser ligado para permitir a detecção. Conforme
usado neste documento, o termo anticorpo refere-se a uma molécula de
anticorpo de qualquer classe, ou qualquer subfragmento desta, tal como um
Fab.
[00127] Outros marcadores adequados para uma sequência
oligonucleotídica podem incluir fluoresceína (FAM), digoxigenina, dinitrofenol
(DNP), dansil, biotina, bromodesoxiuridina (BrdU), hexa-histidina (6×His),
aminoácidos fosforados (por exemplo, P-tyr, P-ser, P-thr) e semelhantes. Em
uma modalidade, os seguintes pares de hapteno/anticorpo são usados para
detecção, em que cada um dos anticorpos é derivatizado com um marcador
detectável: -biotina, -digoxigenina, dinitrofenol
-DNP, 5-Carboxifluoresceína -FAM.
[00128] Em certas modalidades exemplificativas, uma sequência
nucleotidíca e/ou uma oligonucleotídica pode ser indiretamente marcada,
especialmente com um hapteno que é então ligado por um agente de
captura, por exemplo, conforme divulgado na Patente dos EUA N.ºs
5.344.757, 5.702.888, 5.354.657, 5.198.537 e 4.849.336, publicação PCT
WO 91/17160 e semelhantes. Muitos pares diferentes de agentes de captura
de hapteno estão disponíveis para uso. Exemplos de haptenos incluem, mas
não estão limitados a, biotina, des-biotina e outros derivados, dinitrofenol,
dansil, fluoresceína, CY5, digoxigenina e semelhantes. Para a biotina, um
agente de captura pode ser avidina, estreptavidina ou anticorpos. Os
anticorpos podem ser usados como agentes de captura para os outros
haptenos (muitos pares de corante-anticorpo estando comercialmente
disponíveis, por exemplo, Molecular Probes, Eugene, Oreg.).
[00129] Em algumas modalidades, o sequenciamento in situ é
realizado usando sequenciamento por anelamento e ligação competitivos
(SCAL) para determinar uma sequência de um ácido nucleico alvo, o método
compreendendo realizar um ou mais ciclos de sequenciamento, cada ciclo
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compreendendo: (a) contatar o ácido nucleico alvo com um oligonucleotídeo

de leitura e um conjunto de sondas de decodificação marcadas com
fluorescência, em que o oligonucleotídeo de leitura compreende uma
primeira região de complementaridade que é complementar a uma sequência
de leitura no ácido nucleico alvo, e em que cada sonda de decodificação
compreende uma segunda região de complementaridade que é
complementar a um sítio de ligação da sonda no ácido nucleico alvo; (b) ligar
o oligonucleotídeo lido a uma das sondas de decodificação do conjunto de
sondas de decodificação marcadas com fluorescência para gerar um produto
de ligação fluorescente, em que a ligação ocorre apenas quando o
oligonucleotídeo lido e a sonda de decodificação se ligam a sequências
adjacentes no ácido nucleico alvo e tanto o oligonucleotídeo lido quanto a
sonda de decodificação têm sequências que são exatamente
complementares à sequência do ácido nucleico alvo; (c) remover sondas não
ligadas; (d) imageamento do produto de ligação fluorescente para detectar o
marcador fluorescente da sonda de decodificação que se ligou ao
oligonucleotídeo lido, em que o marcador fluorescente identifica um
nucleotídeo da sequência do ácido nucleico alvo; e (e) remoção do produto
de ligação fluorescente do ácido nucleico alvo ligando um oligonucleotídeo
competidor ao ácido nucleico alvo, em que o oligonucleotídeo competidor
compreende uma terceira região de complementaridade compreendendo
uma sequência que é complementar à sequência de leitura no ácido nucleico
alvo, em que o produto de ligação fluorescente se dissocia do ácido nucleico
alvo.
[00130] Em aspectos exemplificativos, a ligação envolve cada um dos
oligonucleotídeos lidos e uma sonda de decodificação marcada com
fluorescência que se liga para formar um produto estável para geração de
imagens apenas quando ocorre uma compatibilidade perfeita. Em certos
aspectos, a sensibilidade de incompatibilidade de uma enzima ligase é usada
para determinar a sequência subjacente da molécula de ácido nucleico alvo.
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A inclusão de um polímero de polietilenoglicol (PEG) na mistura de ligação

de sequenciamento acelera substancialmente a adição de sinal em ácidos
nucleicos alvo. Os polímeros de PEG exemplificativos têm pesos
moleculares que variam de 300 g/mol a 10.000.000 g/mol. Em algumas
modalidades, um polímero PEG 6000 está presente durante a ligação do
oligonucleotídeo lido e uma sonda de decodificação marcada com
fluorescência.
[00131] Em certas modalidades, o conjunto de sondas de
decodificação marcadas com fluorescência compreende: uma primeira
sonda que codifica uma guanina, em que a primeira sonda compreende um
primeiro marcador fluorescente, uma segunda sonda que codifica uma
adenina, em que a segunda sonda compreende um segundo marcador
fluorescente, uma terceira sonda que codifica uma citosina, em que a terceira
sonda compreende um terceiro marcador fluorescente e uma quarta sonda
que codifica uma timina, em que a quarta sonda compreende um quarto
marcador fluorescente.
[00132] Em certas modalidades, cada sonda de decodificação
marcada com fluorescência codifica 1 a 3 bases adjacentes a uma junção de
ligação onde o oligonucleotídeo lido é ligado à sonda de decodificação
marcada com fluorescência, em que as sondas de decodificação marcadas
com fluorescência que codificam diferentes sequências de bases
compreendem diferentes marcadores fluorescentes.
[00133] Em certas modalidades, as sequências das sondas de
decodificação marcadas com fluorescência para um ciclo atual de
sequenciamento são otimizadas para minimizar a hibridização cruzada com
as sondas de decodificação marcadas com fluorescência para outros ciclos
de sequenciamento.
[00134] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo lido varia em
comprimento de 8 a 11 nucleotídeos, incluindo qualquer comprimento dentro
deste intervalo, tal como 8, 9, 10 ou 11 nucleotídeos de comprimento. Em
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algumas modalidades, o oligonucleotídeo lido tem uma temperatura de fusão

variando de 17 °C a 20 °C, incluindo qualquer temperatura de fusão dentro
deste intervalo, tal como 17 °C, 18 °C, 19 °C ou 20 °C.
[00135] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo competidor
compreende ainda uma quarta região de complementaridade
compreendendo uma sequência que é complementar a pelo menos uma
porção do sítio de ligação da sonda. Em algumas modalidades, a quarta
região de complementaridade do oligonucleotídeo competidor compreende
uma sequência que é totalmente complementar a todo o sítio de ligação da
sonda no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo
competidor compreende ainda uma quinta região de complementaridade
compreendendo uma sequência que é complementar a um sítio
complementar específico do competidor adjacente à sequência de leitura no
ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o sítio complementar
específico do competidor varia em comprimento de 2 nucleotídeos a 16
nucleotídeos, incluindo qualquer comprimento dentro deste intervalo, como
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos. Em certas
modalidades, para ciclos de sequenciamento após um ciclo de
sequenciamento inicial, o oligonucleotídeo competidor usado em um ciclo
anterior de sequenciamento está presente durante um ou mais ciclos
subsequentes de sequenciamento.
[00136] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo lido compreende
ainda uma sequência complementar específica do competidor. Em algumas
modalidades, a sequência complementar específica do competidor do
oligonucleotídeo lido varia em comprimento de 2 nucleotídeos a 16
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos. Em certas
modalidades, a sequência do oligonucleotídeo lido para um ciclo atual de
sequenciamento é otimizada para minimizar a hibridização cruzada com
oligonucleotídeos lidos para outros ciclos de sequenciamento.
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[00137] Em certas modalidades, múltiplos oligonucleotídeos lidos,

conjuntos de sondas de decodificação marcadas com fluorescência e
oligonucleotídeos competidores com especificidade para diferentes ácidos
nucleicos alvo são usados para sequenciar uma pluralidade de diferentes
ácidos nucleicos alvo simultaneamente ou sequencialmente.
[00138] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos competidores
removem produtos de ligação de uma rodada anterior de sequenciamento de
diferentes ácidos nucleicos alvo do que os ácidos nucleicos alvo atualmente
submetidos às etapas (a) ou (b) de um ciclo de sequenciamento. Em certas
modalidades, os oligonucleotídeos competidores removem produtos de
ligação de uma rodada anterior de sequenciamento dos mesmos ácidos
nucleicos alvo atualmente submetidos às etapas (a) ou (b) de um ciclo de
sequenciamento. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo competidor é
um oligonucleotídeo competidor específico de rodada compreendendo uma
quarta região de complementaridade compreendendo uma sequência que é
complementar à sequência de leitura para o próximo ciclo de
sequenciamento.
[00139] As leituras de sequenciamento podem estar em uma direção
forward de 5 para 3 ou em uma direção reverse de 3 para 5 . Para leituras
de sequenciamento na direção forward, cada sonda de decodificação
marcada com fluorescência tem uma modificação de fluoróforo na
extremidade 5 , e cada oligonucleotídeo lido tem um fosfato na extremidade
5 . Para leituras de sequenciamento na direção reverse, cada sonda de
decodificação marcada com fluorescência tem um fosfato na extremidade 5 ,
e uma modificação de fluoróforo na extremidade 3 .
[00140] Em certas modalidades, o sequenciamento é realizado com
codificação sequencial. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo lido
compreende uma sequência de leitura ortogonal sequencial única e uma
sequência complementar específica do competidor adjacente única para
cada ciclo de sequenciamento. Em algumas modalidades, a sequência de
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leitura ortogonal sequencial única varia em comprimento de 8 nucleotídeos a

11 nucleotídeos, incluindo qualquer comprimento dentro deste intervalo,
como 8, 9, 10 ou 11 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência
complementar específica do competidor adjacente única varia em
comprimento de 2 nucleotídeos a 16 nucleotídeos, incluindo qualquer
comprimento dentro deste intervalo, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15 ou 16 nucleotídeos. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo
competidor compreende uma sequência que é complementar à sequência de
leitura ortogonal sequencial única e à sequência complementar específica do
competidor adjacente única do oligonucleotídeo de leitura e pelo menos uma
porção da sequência da sonda de decodificação marcada com fluorescência
para cada ciclo de sequenciamento. Em algumas modalidades, a sequência
do oligonucleotídeo competidor tem complementaridade parcial ou
complementaridade total com a sequência da sonda de decodificação
marcada com fluorescência.
codificação combinatória. Em algumas modalidades, múltiplos
oligonucleotídeos lidos são usados para sequenciamento, em que cada
oligonucleotídeo lido compreende uma primeira região de
complementaridade compreendendo uma sequência de leitura combinatória
que é complementar a uma sequência de leitura em uma posição de leitura
combinatória separada no ácido nucleico alvo, em que a sequência de leitura
em cada posição separada no nucleico alvo é adjacente a um sítio de ligação
da sonda. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo lido compreende
ainda uma sequência complementar específica do competidor adjacente à
sequência de leitura. Em algumas modalidades, a sequência complementar
específica do competidor não é complementar à sonda de decodificação
marcada com fluorescência. Em algumas modalidades, a sequência de
leitura varia em comprimento de 8 nucleotídeos a 11 nucleotídeos, incluindo
qualquer comprimento dentro deste intervalo, como 8, 9, 10 ou 11
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nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência complementar

específica do competidor varia em comprimento de 2 nucleotídeos a 16
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos. Em algumas
modalidades, para cada posição de leitura combinatória separada, o
oligonucleotídeo competidor compreende uma sequência que é
complementar à sequência de leitura combinatória e à sequência
complementar específica do competidor do oligonucleotídeo lido e pelo
menos uma porção da sequência da sonda de decodificação marcada com
fluorescência para cada ciclo de sequenciamento. Em algumas modalidades,
a codificação combinatória usa um código de hamming.
[00142] Os métodos de sequenciamento descritos neste documento
podem ser usados para a sequenciamento do gene situ de um ácido nucleico
alvo em uma célula em um tecido intacto. Em algumas modalidades, o
método de sequenciamento gênico in situ de um ácido nucleico alvo em uma
célula em um tecido intacto compreende: (a) contatar um tecido intacto fixo
e permeabilizado com pelo menos um par de primers oligonucleotídicos sob
condições para permitir hibridização específica, em que o par de primers
compreende um primeiro oligonucleotídeo e um segundo oligonucleotídeo;
em que cada um do primeiro oligonucleotídeo e do segundo oligonucleotídeo
compreende uma primeira região de complementaridade, uma segunda
sequência de região de complementaridade e uma terceira região de
complementaridade; em que o segundo oligonucleotídeo compreende ainda
uma sequência de código de barras; em que a primeira região de
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oligonucleotídeo, em que a segunda região complementar do segundo

oligonucleotídeo é complementar a uma segunda porção do alvo ácido
nucleico, em que a primeira porção do nucleico alvo é adjacente à segunda
porção do ácido nucleico alvo; (b) adicionar ligase para ligar o segundo
oligonucleotídeo e gerar um círculo de ácido nucleico fechado; (c) realizar
amplificação de círculo rolante na presença de uma molécula de ácido
nucleico, em que a realização compreende usar o segundo oligonucleotídeo
como um modelo e o primeiro oligonucleotídeo como um iniciador para uma
polimerase para formar um ou mais amplicons; (d) incorporar um ou mais
amplicons na presença de subunidades de hidrogel para formar um ou mais
amplicons incorporados em hidrogel; (e) sequenciar um ou mais amplicons
de acordo com um método descrito neste documento. Em certas
modalidades, o sequenciamento é realizado com codificação sequencial. Em
outras modalidades, o sequenciamento é realizado com codificação
combinatória.
[00143] Em algumas modalidades, o contato do um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel ocorre duas vezes ou mais, incluindo, mas não se
limitando a, por exemplo, três vezes ou mais, quatro vezes ou mais, cinco
vezes ou mais, seis vezes ou mais, ou sete vezes ou mais, oito vezes ou
mais, nove vezes ou mais, dez vezes ou mais, onze vezes ou mais, ou doze
vezes ou mais. Em certas modalidades, o contato do um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel ocorre quatro vezes ou mais para espécimes de
tecido fino. Em outras modalidades, o contato do um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel ocorre seis vezes ou mais para espécimes de
tecido espesso. Em algumas modalidades, um ou mais amplicons podem ser
contatados por um par de primers por 24 ou mais horas, 24 ou menos horas,
18 ou menos horas, 12 ou menos horas, 8 ou menos horas, 6 ou menos
horas, 4 ou menos horas, 2 ou menos horas, 60 ou menos minutos, 45 ou
menos minutos, 30 ou menos minutos, 25 ou menos minutos, 20 ou menos
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ou 2 ou menos minutos. Em algumas modalidades, 12 ou mais ciclos de

sequenciamento são realizados, incluindo 13 ou mais ciclos, 14 ou mais
ciclos, 15 ou mais ciclos, 16 ou mais ciclos, 17 ou mais ciclos ou 18 ou mais
ciclos de sequenciamento. Em algumas modalidades, os métodos são
realizados à temperatura ambiente para preservação da morfologia do tecido
com baixo ruído de fundo e redução de erros. Em algumas modalidades, o
contato do um ou mais amplicons incorporados em hidrogel inclui eliminar o
acúmulo de erros à medida que o sequenciamento prossegue.
[00144] Os espécimes preparados usando os métodos em questão
podem ser analisados por qualquer um de vários tipos diferentes de
microscopia, por exemplo, microscopia óptica (por exemplo, microscopia de
campo claro, iluminação oblíqua, campo escuro, contraste de fase, contraste
de interferência diferencial, reflexão de interferência, epifluorescência,
confocal, etc.), microscopia a laser, microscopia eletrônica e microscopia de
sonda de varredura. Em alguns aspectos, um meio legível por computador
não transitório transforma imagens em bruto adquiridas através de
microscopia de múltiplas rodadas de sequenciamento in situ primeiro em
identidades de genes decodificados e localizações espaciais e, então,
analisa a composição por célula da expressão gênica.
[00145] O termo perfeitamente compatível , quando usado em
referência a um duplex, significa que as fitas polinucleotídicas e/ou
oligonucleotídicas que compõem o duplex formam uma estrutura de fita dupla
entre si, de modo que cada nucleotídeo em cada fita sofra emparelhamento
de bases Watson-Crick com um nucleotídeo na outra fita. O termo duplex
inclui, mas não está limitado a, o emparelhamento de análogos de
nucleosídeos, tais como desoxinosina, nucleosídeos com bases de 2-
aminopurina, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) e semelhantes, que podem
ser empregados. Uma incompatibilidade em um duplex entre dois
oligonucleotídeos significa que um par de nucleotídeos no duplex não sofre
ligação Watson-Crick.
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[00146] Em algumas modalidades, o método inclui uma pluralidade de

oligonucleotídeos lidos, incluindo, mas não se limitando a, 5 ou mais
oligonucleotídeos lidos, por exemplo, 8 ou mais, 10 ou mais, 12 ou mais, 15
ou mais, 18 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais que
hibridizam com sequências de nucleotídeos alvo. Em algumas modalidades,
um método da presente divulgação inclui uma pluralidade de
oligonucleotídeos lidos, incluindo, mas não se limitando a, 15 ou mais
oligonucleotídeos lidos, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50
ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 oligonucleotídeos lidos diferentes
alvo diferentes.
[00147] Em algumas modalidades, os métodos incluem uma
pluralidade de sondas de decodificação marcadas com fluorescência,
incluindo, mas não se limitando a, 4 ou mais sondas de decodificação
marcadas com fluorescência, por exemplo, 8 ou mais, 10 ou mais, 12 ou
mais, 16 ou mais, 18 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou
mais. Em algumas modalidades, um método da presente divulgação inclui
uma pluralidade de sondas de decodificação marcada com fluorescência
incluindo, mas não se limitando a, 15 ou mais sondas de decodificação
marcada com fluorescência, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou
mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 sondas de decodificação
marcada com fluorescência diferentes que hibridizam com 15 ou mais, por
mais, e até 80 sequências nucleotídicas alvo diferentes.
[00148] Uma pluralidade de pares de primers de oligonucleotídeos
pode ser usada em uma reação, em que um ou mais pares se ligam
especificamente a cada ácido nucleico alvo. Por exemplo, dois pares de
primers podem ser usados para um ácido nucleico alvo, a fim de melhorar a
sensibilidade e reduzir a variabilidade. Também é de interesse detectar uma
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pluralidade de diferentes ácidos nucleicos alvo em uma célula, por exemplo,

detectar até 2, até 3, até 4, até 5, até 6, até 7, até 8, até 9, até 10, até 12, até
15, até 18, até 20, até 25, até 30, até 40 ou mais ácidos nucleicos alvo
distintos.
uma ligase com atividade impedida por incompatibilidades de base, um
oligonucleotídeo lido e uma sonda de decodificação marcada com
fluorescência. O termo impedido neste contexto refere-se à atividade de
uma ligase que é reduzida em aproximadamente 20% ou mais, tal como em
25% ou mais, tal como em 50% ou mais, tal como em 75% ou mais, tal como
em 90% ou mais, tal como em 95% ou mais, tal como em 99% ou mais, tal
como em 100%. Em algumas modalidades, o terceiro oligonucleotídeo tem
um comprimento de 5-15 nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 5-
13 nucleotídeos, 5-10 nucleotídeos ou 5-8 nucleotídeos. Em algumas
modalidades, a Tm do terceiro oligonucleotídeo está à temperatura ambiente
(22-25 °C). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo lido é degenerado,
ou parcialmente deste. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo de
sonda de decodificação marcado com fluorescência tem um comprimento de
5-15 nucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 5-13 nucleotídeos, 5-
10 nucleotídeos ou 5-8 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a Tm do
quarto oligonucleotídeo está à temperatura ambiente (22 °-25 °C). Após cada
ciclo de sequenciamento correspondente a uma leitura de base, o produto
de ligação fluorescente é removido do ácido nucleico alvo ligando um
oligonucleotídeo competidor ao ácido nucleico alvo, em que o
oligonucleotídeo competidor compreende uma terceira região de
complementaridade compreendendo uma sequência que é complementar à
sequência de leitura no ácido nucleico alvo, em que o produto de ligação
fluorescente se dissocia do ácido nucleico alvo.
[00150] Em algumas modalidades, o sequenciamento envolve a
lavagem para remover oligonucleotídeos não ligados e sondas não ligadas,
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revelando posteriormente um produto fluorescente para geração de imagens.

Em certas modalidades exemplificativas, é usado um marcador fluorescente
detectável para detectar um ou mais nucleotídeos e/ou oligonucleotídeos
descritos neste documento. Em certas modalidades, um marcador
fluorescente detectável, tal como uma proteína fluorescente, corante
fluorescente ou ponto quântico fluorescente, é usado para marcar sondas.
[00151] Os marcadores fluorescentes e a sua fixação aos
nucleotídeos e/ou oligonucleotídeos são descritos em muitas revisões,
incluindo Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals, Nona Edição (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller e
Manak, DNA Probes, 2ª edição (Stockton Press, Nova Iorque, 1993);
Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL
Press, Oxford, 1991); e Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology, 26:227-259 (1991). Metodologias particulares aplicáveis
à invenção são divulgadas na seguinte amostra de referências: Patentes dos
EUA N.ºs 4.757.141, 5.151.507 e 5.091.519. Em um aspecto, um ou mais
corantes fluorescentes são usados como marcadores para sequências alvo
marcadas, por exemplo, como divulgado pela Patente dos EUA N.º
5.188.934 (corantes de 4,7-diclorofluoresceína); Patente dos EUA N.º
5.366.860 (corantes de rodamina espectralmente resolvível); Patente dos
EUA N.º 5.847.162 (corantes de 4,7-diclororodamina); Patente dos EUA N.º
4.318.846 (corantes de fluoresceína substituídos com éter); Patente dos EUA
N.º 5.800.996 (corantes de transferência de energia); Lee et al.; Patente dos
EUA N.º 5.066.580 (corantes de xantina); Patente dos EUA N.º 5.688.648
(corantes de transferência de energia); e semelhantes. A marcação também
pode ser executada com pontos quânticos, conforme divulgado nas
seguintes patentes e pedidos de patente: Patentes dos EUA N.ºs 6.322.901,
6.576.291, 6.423.551, 6.251.303, 6.319.426, 6.426.513, 6.444.143,
5.990.479, 6.207.392, 2002/0045045 e 2003/0017264. Conforme usado
neste documento, o termo marcador fluorescente inclui uma fração de
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sinalização que transmite informação através das propriedades de absorção

e/ou emissão fluorescentes de uma ou mais moléculas. Tais propriedades
fluorescentes incluem intensidade de fluorescência, tempo de vida de
fluorescência, características do espectro de emissão, transferência de
energia e semelhantes.
[00152] Os análogos de nucleotídeos fluorescentes comercialmente
disponíveis prontamente incorporados em sequências nucleotídicas e/ou
oligonucleotídicas incluem, mas não estão limitados a, Cy3-dCTP, Cy3-
dUTP, Cy5-dCTP, Cy5-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.),
fluoresceína-12-dUTP, tetrametilrodamina-6-dUTP, TEXAS RED -5-dUTP,
CASCADE BLUE -7-dUTP, BODIPY TMFL-14-dUTP, BODIPY TMR-14-
dUTP, BODIPY TMTR-14-dUTP, RHODAMINE GREEN -5-dUTP,
OREGON GREENR 488-5-dUTP, TEXAS RED -12-dUTP, BODIPY
630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP, ALEXA FLUOR 488-5-
dUTP, ALEXA FLUOR 532-5-dUTP, ALEXA FLUOR 568-5-dUTP,
ALEXA FLUOR 594-5-dUTP, ALEXA FLUOR 546-14-dUTP,
fluoresceína-12-UTP, tetrametilrodamina-6-UTP, TEXAS RED -5-UTP,
mCherry, CASCADE BLUE -7-UTP, BODIPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-
14-UTP, BODIPY TR-14-UTP, RHODAMINE GREEN -5-UTP, ALEXA
FLUOR 488-5-UTP, LEXA FLUOR 546-14-UTP (Molecular Probes, Inc.
Eugene, Oreg.) e semelhantes. Os protocolos são conhecidos na técnica
para síntese personalizada de nucleotídeos com outros fluoróforos
(Consulte, Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345).
[00153] Outros fluoróforos disponíveis para fixação pós-sintética
incluem, mas não estão limitados a, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR
532, ALEXA FLUOR 546, ALEXA FLUOR 568, ALEXA FLUOR 594,
ALEXA FLUOR 647, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G,
BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568,
BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650,
BODIPY 650/665, Cascade Blue, Cascade Yellow, Dansil, lissamina
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rodamina B, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific
Blue, rodamina 6G, rodamina verde, rodamina vermelho, tetrametil rodamina,
Texas Red (disponível na Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.), Cy2,
Cy3.5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) e
semelhantes. Fluoróforos em conjunto com FRET também podem ser
usados, incluindo, mas não se limitando a, corantes PerCP-Cy5.5, PE-Cy5,
PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-Texas Red, APC-Cy7, PE-Alexa (610, 647, 680),
corantes APC-Alexa e semelhantes.
[00154] Exemplos de proteínas fluorescentes incluem, mas não estão
limitados a, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde
superfolder, proteína fluorescente verde potencializada, Dronpa (uma
proteína fluorescente verde fotocomutável), proteína fluorescente verde-
amarela, proteína fluorescente amarela, proteína fluorescente vermelha,
proteína fluorescente laranja, proteína fluorescente azul, proteína
fluorescente ciana, proteína fluorescente violeta, mApple, mNectarine,
mNeptune, mCherry, mStrawberry, mPlum, mRaspberry, mCrimson3,
mCarmine, mCardinal, mScarlet, mRuby2, FusionRed, mNeonGreen,
TagRFP675 e mRFP1 e semelhantes.
[00155] Partículas metálicas de prata ou ouro podem ser usadas para
potencializar o sinal de sequências nucleotídicas e/ou oligonucleotídicas
marcadas com fluorescência (Lakowicz et al. (2003) Bio Techniques 34:62).
[00156] A biotina, ou um derivado desta, também pode ser usada
como um marcador em uma sequência nucleotidíca e/ou uma
oligonucleotídica e subsequentemente ligada por um derivado de
avidina/estreptavidina marcado de forma detectável (por exemplo,
estreptavidina conjugada com ficoeritrina) ou um anticorpo anti-biotina
marcado de forma detectável. A digoxigenina pode ser incorporada como um
marcador e subsequentemente ligada por um anticorpo anti-digoxigenina
marcado de forma detectável (por exemplo, anti-digoxigenina
fluoresceinada). Um resíduo de aminoalil-dUTP pode ser incorporado em
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uma sequência oligonucleotídica e subsequentemente acoplado a um

corante fluorescente derivatizado de N-hidroxi succinimida (NHS). Em geral,
qualquer membro de um par de conjugado pode ser incorporado em um
oligonucleotídeo de detecção, desde que um parceiro de conjugado marcado
de forma detectável possa ser ligado para permitir a detecção. Conforme
usado neste documento, o termo anticorpo refere-se a uma molécula de
anticorpo de qualquer classe, ou qualquer subfragmento desta, tal como um
Fab.
[00157] Outros marcadores adequados para uma sequência
oligonucleotídica podem incluir fluoresceína (FAM), digoxigenina, dinitrofenol
(DNP), dansil, biotina, bromodesoxiuridina (BrdU), hexa-histidina (6×His),
aminoácidos fosforados (por exemplo, P-tyr, P-ser, P-thr) e semelhantes. Em
uma modalidade, os seguintes pares de hapteno/anticorpo são usados para
detecção, em que cada um dos anticorpos é derivatizado com um marcador
detectável: -biotina, -digoxigenina, dinitrofenol
-DNP, 5-Carboxifluoresceína -FAM.
[00158] Em certas modalidades exemplificativas, uma sequência
nucleotidíca e/ou uma oligonucleotídica pode ser indiretamente marcada,
especialmente com um hapteno que é então ligado por um agente de
captura, por exemplo, conforme divulgado na Patente dos EUA N.ºs
5.344.757, 5.702.888, 5.354.657, 5.198.537 e 4.849.336, publicação PCT
WO 91/17160 e semelhantes. Muitos pares diferentes de agentes de captura
de hapteno estão disponíveis para uso. Exemplos de haptenos incluem, mas
não estão limitados a, biotina, des-biotina e outros derivados, dinitrofenol,
dansil, fluoresceína, CY5, digoxigenina e semelhantes. Para a biotina, um
agente de captura pode ser avidina, estreptavidina ou anticorpos. Os
anticorpos podem ser usados como agentes de captura para os outros
haptenos (muitos pares de corante-anticorpo estando comercialmente
disponíveis, por exemplo, Molecular Probes, Eugene, Oreg.).
[00159] Em algumas modalidades, um composto antioxidante é
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incluído nos tampões de lavagem e geração de imagens (isto é, tampões

antidesbotamento ) para reduzir o fotobranqueamento durante a geração de
imagens de fluorescência. Antioxidantes exemplificativos incluem, sem
limitação, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) e
Trolox-quinona, propil-galato, butil-hidroquinona terciária, hidroxianisol
butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, ácido ascórbico e tocoferóis. Tais
antioxidantes têm um efeito antidesbotamento nos fluoróforos. Ou seja, o
antioxidante reduz o fotobranqueamento durante o revestimento,
potencializa muito a razão sinal-ruído (SNR) de fluoróforos sensíveis e
permite geração de imagens SNR mais altas de amostras mais espessas.
Por um tempo de exposição fixo, incluir um antioxidante aumenta a SNR
aumentando a concentração do fluoróforo não branqueado durante a
exposição à luz. A inclusão de um antioxidante também remove os retornos
decrescentes de tempos de exposição mais longos (causados pelo tempo de
vida limitado do fluoróforo antes do fotobranqueamento), fornecendo maior
SNR, permitindo maiores tempos de exposição.
[00160] Um ciclo de sequenciamento exemplificativo começa
opcionalmente com uma breve lavagem de amostra, antes de prosseguir
para a primeira adição de sinal. Dependendo se a codificação sequencial ou
combinatória está sendo usada para uma rodada particular, o conjunto
correspondente de oligonucleotídeos lidos, sondas de decodificação
marcadas com fluorescência e seus competidores específicos de rodada são
adicionados e ligados. Em codificações combinatórias, o oligonucleotídeo
lido para uma determinada posição x é adicionado, mais um conjunto de
oligonucleotídeos codificadores de dibase marcados com fluorescência, mais
um oligonucleotídeo competidor para a posição anterior que foi marcada (a
menos que seja a primeira rodada de marcação, caso em que o
oligonucleotídeo competidor é omitido). Em codificações sequenciais, o
oligonucleotídeo lido para uma determinada rodada x, uma mistura de
fluoróforo de 4 canais e um oligonucleotídeo competidor x-1 redondo são
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adicionados, exceto se for a primeira rodada de marcação. A presença de

PEG na mistura de ligação de sequenciamento acelera substancialmente a
adição de sinal no alvo. Após a incubação da amostra em tampão de geração
de imagens, a amostra tem a imagem gerada e brevemente enxaguada antes
de prosseguir para o próximo ciclo de sequenciamento.
[00161] Além disso, a clivagem de fluoróforo de sondas ou remoção
de sonda pode ser usada para eliminar o transporte de sinal de uma rodada
para a próxima quando múltiplos ciclos de sequenciamento são usados. Por
exemplo, os fluoróforos podem ser removidos com formamida.
Alternativamente, corantes ligados a tiol podem ser usados com uma ligação
dissulfeto entre o fluoróforo e uma sonda oligonucleotídica, o que permite a
clivagem do fluoróforo da sonda oligonucleotídica em um ambiente redutor.
Agentes redutores de dissulfeto exemplificativos, que podem ser usados para
clivar ligações dissulfeto incluem, sem limitação, tris(2-carboxietil)fosfina
(TCEP), ditiotreitol (DTT) e b-mercaptoetanol (BME). Após a geração de
imagens de fluorescência durante uma rodada de sequenciamento, um
agente de remoção e/ou um agente redutor é adicionado, e as etapas de
lavagem subsequentes removem o sinal fluorescente difusivo antes de
realizar outra rodada de sequenciamento.
[00162] Os métodos divulgados neste documento também fornecem
um método de triagem de um agente candidato para determinar se o agente
candidato modula a expressão gênica de um ácido nucleico em uma célula
em um tecido intacto realizando um método descrito neste documento para
determinar a sequência gênica de um ácido nucleico alvo na célula no tecido
intacto e detectar o nível de expressão gênica do ácido nucleico alvo, em que
uma alteração no nível de expressão do ácido nucleico alvo na presença do
agente candidato em relação ao nível de expressão do ácido nucleico alvo
na ausência do agente candidato indica que o agente candidato modula a
expressão gênica do ácido nucleico na célula no tecido intacto.
[00163] Em certos aspectos, os métodos divulgados neste documento
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fornecem um tempo de processamento mais rápido, maior multiplexidade,

maior eficiência, maior sensibilidade, menor taxa de erro e mais tipos de
células espacialmente resolvidas, em comparação com as ferramentas de
análise de expressão gênica existentes. Os métodos fornecem técnicas
melhoradas de sequenciamento por ligação (SCAL e SEDAL2) para
sequenciamento in situ com redução de erros. Em alguns outros aspectos,
os métodos divulgados neste documento incluem sequenciamento espacial
(por exemplo, reagentes, chips ou serviços) para pesquisa biomédica e
diagnóstico clínico (por exemplo, câncer, infecção bacteriana, infecção viral,
etc.) com sensibilidade de célula única e/ou molécula única.
Amplificação Específica de Ácidos Nucleicos por meio de Ligação
Intramolecular (SNAIL)
[00164] Uma abordagem eficiente para gerar bibliotecas de cDNA a
partir de RNAs celulares in situ pode ser utilizada, que é referida neste
documento como SNAIL, para Amplificação Específica de Ácidos Nucleicos
por meio de Ligação Intramolecular. Em certas modalidades, o método inclui
o contato de um tecido intacto fixo e permeabilizado com pelo menos um par
de primers oligonucleotídicos sob condições para permitir a hibridização
específica, em que o par de primers inclui um primeiro oligonucleotídeo e um
segundo oligonucleotídeo.
[00165] Mais geralmente, o ácido nucleico presente em uma célula de
interesse em um tecido serve como um andaime para uma montagem de um
complexo que inclui um par de primers, referidos neste documento como um
primeiro oligonucleotídeo e um segundo oligonucleotídeo. Em algumas
modalidades, o contato do tecido intacto fixo e permeabilizado inclui a
hibridização do par de primers com o mesmo ácido nucleico alvo. Em
algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é RNA. Em tais modalidades, o
ácido nucleico alvo pode ser mRNA. Em outras modalidades, o ácido
nucleico alvo é DNA.
[00166] Conforme usado neste documento, os termos hibridizar e
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hibridização referem-se à formação de complexos entre sequências

nucleotídicas que são suficientemente complementares para formar
complexos por meio do emparelhamento de bases Watson-Crick. Quando
um primer hibridiza com o alvo (modelo), tais complexos (ou híbridos) são
suficientemente estáveis para servir a função de iniciação exigida, por
exemplo, pela DNA polimerase para iniciar a síntese de DNA. Será apreciado
que as sequências de hibridização não precisam ter complementaridade
perfeita para fornecer híbridos estáveis. Em muitas situações, híbridos
estáveis se formarão onde menos de cerca de 10% das bases são
incompatibilidades, ignorando alças de quatro ou mais nucleotídeos. Por
conseguinte, conforme usado neste documento, o termo complementar
refere-se a um oligonucleotídeo que forma um duplex estável com seu
complemento sob condições de ensaio, geralmente onde há cerca de 90%
ou mais de homologia.
Primers de oligonucleotídeo de SNAIL
[00167] Nos métodos em questão, os primers de oligonucleotídeo de
SNAIL incluem pelo menos um primeiro oligonucleotídeo e um segundo
oligonucleotídeo; em que cada um do primeiro oligonucleotídeo e do segundo
oligonucleotídeo inclui uma primeira região de complementaridade, uma
segunda região de complementaridade e uma terceira região de
complementaridade; em que o segundo oligonucleotídeo inclui ainda uma
sequência de código de barras; em que a primeira região de
oligonucleotídeo, em que a segunda região de complementaridade do
segundo oligonucleotídeo é complementar a uma segunda porção do ácido
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nucleico alvo, e em que a primeira região de complementaridade do primeiro

oligonucleotídeo é adjacente à segunda região de complementaridade do
segundo oligonucleotídeo. Em uma modalidade alternativa, o segundo
oligonucleotídeo é uma molécula circular fechada e uma etapa de ligação é
omitida.
[00168] A presente divulgação fornece métodos em que o contato de
um tecido fixo e permeabilizado inclui a hibridização de uma pluralidade de
primers oligonucleotídicos com especificidade para diferentes ácidos
nucleicos alvo. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma
pluralidade do primeiro oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a,
5 ou mais primeiros oligonucleotídeos, por exemplo, 8 ou mais, 10 ou mais,
12 ou mais, 15 ou mais, 18 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35
ou mais que hibridizam com sequências de nucleotídeos alvo. Em algumas
modalidades, um método da presente divulgação inclui uma pluralidade dos
primeiros oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 15 ou mais
primeiros oligonucleotídeos, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou
mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 primeiros
oligonucleotídeos diferentes que hibridizam com 15 ou mais, por exemplo,
20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e
até 80 sequências nucleotídicas alvo diferentes. Em algumas modalidades,
os métodos incluem uma pluralidade de segundos oligonucleotídeos,
incluindo, mas não se limitando a, 5 ou mais segundos oligonucleotídeos, por
mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais. Em algumas modalidades, um
método da presente divulgação inclui uma pluralidade dos segundos
oligonucleotídeos, incluindo, mas não se limitando a, 15 ou mais segundos
oligonucleotídeos, por exemplo, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou
mais, 60 ou mais, 70 ou mais, e até 80 primeiros oligonucleotídeos diferentes
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alvo diferentes. Uma pluralidade de pares de oligonucleotídeos pode ser

usada em uma reação, em que um ou mais pares se ligam especificamente
a cada ácido nucleico alvo. Por exemplo, dois pares de primers podem ser
usados para um ácido nucleico alvo, a fim de melhorar a sensibilidade e
reduzir a variabilidade. Também é de interesse detectar uma pluralidade de
diferentes ácidos nucleicos alvo em uma célula, por exemplo, detectar até 2,
até 3, até 4, até 5, até 6, até 7, até 8, até 9, até 10, até 12, até 15, até 18, até
20, até 25, até 30, até 40 ou mais ácidos nucleicos alvo distintos. Os primers
são tipicamente desnaturados antes do uso, tipicamente por aquecimento a
uma temperatura de pelo menos cerca de 50 °C, pelo menos cerca de 60 °C,
pelo menos cerca de 70 °C, pelo menos cerca de 80 °C e até cerca de 99
°C, até cerca de 95 °C, até cerca de 90 °C.
[00169] Em algumas modalidades, os primers são desnaturados por
aquecimento antes de entrar em contato com a amostra. Em certos aspectos,
a temperatura de fusão (Tm) dos oligonucleotídeos é selecionada para
minimizar a ligação em solução. A temperatura de fusão ou Tm de um
ácido nucleico é definida como a temperatura na qual metade da estrutura
helicoidal do ácido nucleico é perdida devido ao aquecimento ou outra
dissociação da ligação de hidrogênio entre pares de bases, por exemplo, por
tratamento ácido ou alcalino, ou semelhantes. A Tm de uma molécula de
ácido nucleico depende do seu comprimento e da sua composição de base.
Moléculas de ácido nucleico ricas em pares de bases GC têm uma Tm mais
alta do que aquelas com uma abundância de pares de bases AT. As fitas
complementares separadas de ácido nucleico se reassociam
espontaneamente ou se anelam para formar ácido nucleico duplex quando a
temperatura é reduzida abaixo da Tm. A maior taxa de hibridização de ácido
nucleico ocorre aproximadamente 25 graus C abaixo da Tm. A Tm pode ser
estimada usando a seguinte relação: Tm = 69,3 + 0,41(GC)% (Marmur et al.
(1962) J. Mol. Biol. 5:109-118).
[00170] Em certas modalidades, a pluralidade de segundos
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oligonucleotídeos inclui uma sonda cadeado. Em algumas modalidades, a

sonda inclui um marcador detectável que pode ser medido e quantificado. Os
termos marcador e marcador detectável referem-se a uma molécula
capaz de detecção, incluindo, mas não se limitando a, isótopos radioativos,
fluorescentes, quimioluminescentes, enzimas, substratos enzimáticos,
cofatores enzimáticos, inibidores enzimáticos, cromóforos, corantes, íons
metálicos, sols metálicos, ligantes (por exemplo, biotina ou haptenos) e
semelhantes. O termo fluorescente refere-se a uma substância ou uma
porção desta que é capaz de exibir fluorescência no intervalo detectável.
Exemplos particulares de marcadores que podem ser usados com a
invenção incluem, mas não estão limitados a ficoeritrina, corantes Alexa,
fluoresceína, YPet, CyPet, azul Cascade, aloficocianina, Cy3, Cy5, Cy7,
rodamina, dansil, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, ésteres
acradimum, biotina, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente
verde potencializada (EGFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína
fluorescente amarela potencializada (EYFP), proteína fluorescente azul
(BFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), luciferase de vaga-lume,
luciferase de Renilla, NADPH, beta-galactosidase, peroxidase de rábano
silvestre, glicose oxidase, fosfatase alcalina, cloranfenicol acetil transferase
e urease.
[00171] Em algumas modalidades, o um ou mais primeiros
oligonucleotídeos e segundos oligonucleotídeos se ligam a uma região
diferente do ácido nucleico alvo ou sítio alvo. Em um par, cada sítio alvo é
diferente e os sítios alvo são sítios adjacentes no ácido nucleico alvo, por
exemplo, geralmente não mais do que 15 nucleotídeos distantes, por
exemplo, não mais do que 10, 8, 6, 4 ou 2 nucleotídeos distantes do outro
sítio e podem ser sítios contíguos. Os sítios alvo estão tipicamente presentes
na mesma fita do ácido nucleico alvo na mesma orientação. Os sítios alvo
também são selecionados para fornecer um sítio de ligação único, em
relação a outros ácidos nucleicos presentes na célula. Cada sítio alvo tem
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geralmente de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, por

exemplo, de cerca de 19 a 23 nucleotídeos, de cerca de 19 a 21 nucleotídeos
ou de cerca de 19 a 20 nucleotídeos. O par de primeiros e segundos
oligonucleotídeos é selecionado de modo que cada oligonucleotídeo no par
tenha uma temperatura de fusão semelhante para ligação ao seu sítio alvo
cognato, por exemplo, a Tm pode ser de cerca de 50 °C, de cerca de 52 °C,
de cerca de 55 °C, de cerca de 58 °C, de cerca de 62 °C, de cerca de 65 °C,
de cerca de 70 °C ou de cerca de 72 °C. O teor de GC do sítio alvo é
geralmente selecionado para ser não mais do que cerca de 20%, não mais
do que cerca de 30%, não mais do que cerca de 40%, não mais do que cerca
de 50%, não mais do que cerca de 60%, não mais do que cerca de 70%,
[00172] Em algumas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo inclui
uma primeira, segunda e terceira região de complementaridade. O sítio alvo
do primeiro oligonucleotídeo pode se referir à primeira região de
complementaridade. Conforme resumido acima, a primeira região de
complementaridade do primeiro oligonucleotídeo pode ter um comprimento
de 19-25 nucleotídeos. Em certos aspectos, a segunda região de
complementaridade do primeiro oligonucleotídeo tem um comprimento de 3-
10 nucleotídeos, incluindo, por exemplo, 4-8 nucleotídeos ou 4-7
nucleotídeos. Em alguns aspectos, a segunda região de complementaridade
do primeiro oligonucleotídeo tem um comprimento de 6 nucleotídeos. Em
algumas modalidades, a terceira região de complementaridade do primeiro
oligonucleotídeo também tem um comprimento de 6 nucleotídeos. Em tais
modalidades, a terceira região de complementaridade do primeiro
oligonucleotídeo tem um comprimento de 3-10 nucleotídeos, incluindo, por
exemplo, 4-8 nucleotídeos ou 4-7 nucleotídeos.
[00173] Em algumas modalidades, o segundo primeiro
oligonucleotídeo inclui uma primeira, segunda e terceira região de
complementaridade. O sítio alvo do segundo oligonucleotídeo pode se referir
à segunda região de complementaridade. Conforme resumido acima, a
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segunda região de complementaridade do segundo oligonucleotídeo pode

ter um comprimento de 19-25 nucleotídeos. Em certos aspectos, a primeira
região de complementaridade do primeiro oligonucleotídeo tem um
comprimento de 3-10 nucleotídeos, incluindo, por exemplo, 4-8 nucleotídeos
ou 4-7 nucleotídeos. Em alguns aspectos, a primeira região de
complementaridade do primeiro oligonucleotídeo tem um comprimento de 6
nucleotídeos. Em alguns aspectos, a primeira região de complementaridade
do segundo oligonucleotídeo inclui a extremidade 5 do segundo
oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a terceira região de
complementaridade do segundo oligonucleotídeo também tem um
comprimento de 6 nucleotídeos. Em tais modalidades, a terceira região de
complementaridade do segundo oligonucleotídeo tem um comprimento de 3-
10 nucleotídeos, incluindo, por exemplo, 4-8 nucleotídeos ou 4-7
nucleotídeos. Em modalidades adicionais, a terceira região de
complementaridade do segundo oligonucleotídeo inclui a extremidade 3 do
segundo oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a primeira região de
complementaridade do segundo oligonucleotídeo é adjacente à terceira
região de complementaridade do segundo oligonucleotídeo.
[00174] Em alguns aspectos, o segundo oligonucleotídeo inclui uma
sequência de código de barras, em que a sequência de código de barras do
segundo oligonucleotídeo fornece informações de código de barras para
identificação do ácido nucleico alvo. O termo código de barras refere-se a
uma sequência de ácido nucleico que é usada para identificar uma única
célula ou uma subpopulação de células. As sequências de código de barras
podem ser ligadas a um ácido nucleico alvo de interesse durante a
amplificação e usadas para rastrear o amplicon até a célula da qual o ácido
nucleico alvo se originou. Uma sequência de código de barras pode ser
adicionada a um ácido nucleico alvo de interesse durante a amplificação
executando a amplificação com um oligonucleotídeo que contém uma região
incluindo a sequência de código de barras e uma região que é complementar
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ao ácido nucleico alvo, de modo que a sequência de código de barras seja

incorporada no produto de ácido nucleico alvo amplificado final (isto é,
amplicon).
Tecido
[00175] Conforme descrito neste documento, os métodos divulgados
incluem tecnologia de sequenciamento in situ de um tecido intacto pelo
menos contatando um tecido intacto fixo e permeabilizado com pelo menos
um par de primers oligonucleotídicos sob condições para permitir
hibridização específica. Espécimes de tecido adequados para uso com os
métodos descritos neste documento geralmente incluem qualquer tipo de
espécimes de tecido coletados de sujeitos vivos ou mortos, tais como, por
exemplo, espécimes de biópsia e espécimes de autópsia, dos quais incluem,
mas não estão limitados a, epitélio, músculo, tecido conjuntivo e nervoso. Os
espécimes de tecido podem ser coletados e processados usando os métodos
descritos neste documento e submetidos a análise microscópica
imediatamente após o processamento, ou podem ser preservados e
submetidos a análise microscópica em um momento futuro, por exemplo,
após armazenamento por um longo período de tempo. Em algumas
modalidades, os métodos descritos neste documento podem ser usados para
preservar espécimes de tecido em uma forma estável, acessível e totalmente
intacta para análise futura. Em algumas modalidades, os métodos descritos
neste documento podem ser usados para analisar um espécime de tecido
previamente preservado ou armazenado. Em algumas modalidades, o tecido
intacto inclui tecido cerebral, tal como pedaços de córtex visual. Em algumas
modalidades, o tecido intacto é um pedaço fino com uma espessura de 5-20
µm, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, 5-18 µm, 5-15 µm ou 5-
10 µm. Em outras modalidades, o tecido intacto é um pedaço espesso com
uma espessura de 20-200 µm, incluindo, mas não se limitando a, por
exemplo, 20-150 µm, 50-100 µm ou 50-80 µm.
[00176] Aspectos da invenção incluem a fixação de tecido intacto. O
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termo fixando ou fixação , conforme usado neste documento, é o processo

de preservação de material biológico (por exemplo, tecidos, células,
organelas, moléculas, etc.) de decaimento e/ou degradação. A fixação pode
ser realizada usando qualquer protocolo conveniente. A fixação pode incluir
o contato da amostra com um reagente de fixação (isto é, um reagente que
contém pelo menos um fixador). As amostras podem ser contatadas por um
reagente de fixação por um amplo intervalo de tempos, que pode depender
da temperatura, da natureza da amostra e do(s) fixador(es). Por exemplo,
uma amostra pode ser contatada por um reagente de fixação por 24 ou
menos horas, 18 ou menos horas, 12 ou menos horas, 8 ou menos horas, 6
ou menos horas, 4 ou menos horas, 2 ou menos horas, 60 ou menos minutos,
45 ou menos minutos, 30 ou menos minutos, 25 ou menos minutos, 20 ou
minutos, ou 2 ou menos minutos.
[00177] Uma amostra pode ser contatada por um reagente de fixação
por um período de tempo em um intervalo de 5 minutos a 24 horas, por
exemplo, de 10 minutos a 20 horas, de 10 minutos a 18 horas, de 10 minutos
a 12 horas, de 10 minutos a 8 horas, de 10 minutos a 6 horas, de 10 minutos
a 1,5 horas, de 15 minutos a 1 hora, de 10 minutos a 30 minutos, de 15
minutos a 30 minutos, de 30 minutos a 2 horas, de 45 minutos a 1,5 horas
ou de 55 minutos a 70 minutos.
[00178] Uma amostra pode ser contatada por um reagente de fixação
a várias temperaturas, dependendo do protocolo e do reagente usado. Por
exemplo, em alguns casos, uma amostra pode ser contatada por um
reagente de fixação a uma temperatura variando de -22 °C a 55 °C, onde
intervalos específicos de interesse incluem, mas não estão limitadas a 50 a
54 °C, 40 a 44 °C, 35 a 39 °C, 28 a 32 °C, 20 a 26 °C, 0 a 6 °C e -18 a -22
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°C. Em alguns casos, uma amostra pode ser contatada por um reagente de
fixação a uma temperatura de -20 °C, 4 °C, temperatura ambiente (22-25 °C),
30 °C, 37 °C, 42 °C ou 52 °C.
[00179] Qualquer reagente de fixação conveniente pode ser usado. Os
reagentes de fixação comuns incluem fixadores de reticulação, fixadores
precipitantes, fixadores oxidantes, mercuriais e semelhantes. Os fixadores
de reticulação unem quimicamente duas ou mais moléculas por uma ligação
covalente e um amplo intervalo de reagentes de reticulação pode ser usada.
Exemplos de fixadores de reticulação adequados incluem, mas não estão
limitados a aldeídos (por exemplo, formaldeído, também comumente referido
como paraformaldeído e formalina ; glutaraldeído; etc.), imidoésteres,
ésteres de NHS (N- Hidroxissuccinimida) e semelhantes. Exemplos de
fixadores precipitantes adequados incluem, mas não estão limitados a
álcoois (por exemplo, metanol, etanol, etc.), acetona, ácido acético, etc. Em
algumas modalidades, o fixador é formaldeído (isto é, paraformaldeído ou
formalina). Uma concentração final adequada de formaldeído em um
reagente de fixação é de 0,1 a 10%, 1-8%, 1-4%, 1-2%, 3-5% ou 3,5-4,5%,
incluindo cerca de 1,6% por 10 minutos. Em algumas modalidades, a
amostra é fixada em uma concentração final de 4% de formaldeído (tal como
diluído a partir de uma solução-mãe mais concentrada, por exemplo, 38%,
37%, 36%, 20%, 18%, 16%, 14%, 10%, 8%, 6%, etc.). Em algumas
modalidades, a amostra é fixada em uma concentração final de formaldeído
a 10%. Em algumas modalidades, a amostra é fixada em uma concentração
final de 1% de formaldeído. Em algumas modalidades, o fixador é
glutaraldeído. Uma concentração adequada de glutaraldeído em um
reagente de fixação é de 0,1 a 1%. Um reagente de fixação pode conter mais
de um fixador em qualquer combinação. Por exemplo, em algumas
modalidades, a amostra é colocada em contato com um reagente de fixação
contendo formaldeído e glutaraldeído.
[00180] Os termos permeabilização ou permeabilizar , conforme
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usados neste documento, referem-se ao processo de tornar as células

(membranas celulares, etc.) de uma amostra permeável a reagentes
experimentais, tais como sondas de ácido nucleico, anticorpos, substratos
químicos, etc. Qualquer método e/ou reagente conveniente para
permeabilização pode ser usado. Os reagentes de permeabilização
adequados incluem detergentes (por exemplo, Saponina, Triton X-100,
Tween-20, etc.), fixadores orgânicos (por exemplo, acetona, metanol, etanol,
etc.), enzimas, etc. Os detergentes podem ser usados em uma variedade de
concentrações. Por exemplo, 0,001%-1% de detergente, 0,05%-0,5% de
detergente ou 0,1%-0,3% de detergente pode ser usado para
permeabilização (por exemplo, 0,1% de saponina, 0,2% de tween-20, 0,1-
0,3% de triton X-100, etc.). Em algumas modalidades, o metanol em gelo por
pelo menos 10 minutos é usado para permeabilizar.
[00181] Em algumas modalidades, a mesma solução pode ser usada
como o reagente de fixação e o reagente de permeabilização. Por exemplo,
em algumas modalidades, o reagente de fixação contém 0,1%-10% de
formaldeído e 0,001%-1% de saponina. Em algumas modalidades, o
reagente de fixação contém 1% de formaldeído e 0,3% de saponina.
[00182] Uma amostra pode ser contatada por um reagente de
permeabilização por um amplo intervalo de tempos, o que pode depender da
temperatura, da natureza da amostra e do(s) reagente(s) de
permeabilização. Por exemplo, uma amostra pode ser contatada por um
reagente de permeabilização por 24 ou mais horas, 24 ou menos horas, 18
ou menos horas, 12 ou menos horas, 8 ou menos horas, 6 ou menos horas,
4 ou menos horas, 2 ou menos horas, 60 ou menos minutos, 45 ou menos
15 ou menos minutos, 10 ou menos minutos, 5 ou menos minutos, ou 2 ou
menos minutos. Uma amostra pode ser contatada por um reagente de
permeabilização a várias temperaturas, dependendo do protocolo e do
reagente usado. Por exemplo, em alguns casos, uma amostra pode ser
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 79/140

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contatada por um reagente de permeabilização a uma temperatura variando

de -82 °C a 55 °C, onde intervalos específicos de interesse incluem, mas não
estão limitadas a 50 a 54 °C, 40 a 44 °C, 35 a 39 °C, 28 a 32 °C, 20 a 26 °C,
0 a 6 °C, -18 a -22 °C e -78 a -82 °C. Em alguns casos, uma amostra pode
ser contatada por um reagente de permeabilização a uma temperatura de -
80 °C, -20 °C, 4 °C, temperatura ambiente (22-25 °C), 30 °C, 37 °C, 42 °C ou
52 °C.
[00183] Em algumas modalidades, uma amostra é colocada em
contato com um reagente de permeabilização enzimática. Reagentes de
permeabilização enzimática que permeabilizam uma amostra degradando
parcialmente a matriz extracelular ou proteínas de superfície que impedem a
permeação da amostra por reagentes de ensaio. O contato com um reagente
de permeabilização enzimática pode ocorrer em qualquer ponto após a
fixação e antes da detecção do alvo. Em alguns casos, o reagente de
permeabilização enzimática é a proteinase K, uma enzima comercialmente
disponível. Nesses casos, a amostra é colocada em contato com a
proteinase K antes do contato com um reagente pós-fixação. O tratamento
com proteinase K (isto é, contato por proteinase K; também comumente
referido como digestão com proteinase K ) pode ser realizado ao longo de
um intervalo de tempos a um intervalo de temperaturas, ao longo de um
intervalo de concentrações enzimáticas que são empiricamente
determinados para cada tipo de célula ou tipo de tecido sob investigação. Por
exemplo, uma amostra pode ser contatada pela proteinase K por 30 ou
minutos, 10 ou menos minutos, 5 ou menos minutos ou 2 ou menos minutos.
Uma amostra pode ser contatada por 1 µg/ml ou menos, 2 µg/m ou menos,
4 µg/ml ou menos, 8 µg/ml ou menos, 10 µg/ml ou menos, 20 µg/ml ou
menos, 30 µg/ml ou menos, 50 µg/ml ou menos, ou 100 µg/ml ou menos de
proteinase K. Uma amostra pode ser contatada por proteinase K a uma
temperatura variando de 2 °C a 55 °C, onde intervalos específicos de
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 80/140

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interesse incluem, mas não estão limitados a: 50 a 54 °C, 40 a 44 °C, 35 a

39 °C, 28 a 32 °C, 20 a 26 °C e 0 a 6 °C. Em alguns casos, uma amostra
pode ser contatada pela proteinase K a uma temperatura de 4 °C,
temperatura ambiente (22-25 °C), 30 °C, 37 °C, 42 °C ou 52 °C. Em algumas
modalidades, uma amostra não é colocada em contato com um reagente de
permeabilização enzimática. Em algumas modalidades, uma amostra não é
colocada em contato com a proteinase K. O contato de um tecido intacto com
pelo menos um reagente de fixação e um reagente de permeabilização
resulta na produção de um tecido fixo e permeabilizado.
Ligase
[00184] Em algumas modalidades, os métodos divulgados incluem a
adição de ligase para ligar o segundo oligonucleotídeo e gerar um círculo de
ácido nucleico fechado. Em algumas modalidades, a adição de ligase inclui
a adição de DNA ligase. Em modalidades alternativas, o segundo
oligonucleotídeo é fornecido como um círculo de ácido nucleico fechado e a
etapa de adição de ligase é omitida. Em certas modalidades, a ligase é uma
enzima que facilita o sequenciamento de uma molécula de ácido nucleico
alvo.
[00185] O termo ligase , conforme usado neste documento, refere-se
a uma enzima que é comumente usada para unir polinucleotídeos ou para
unir as extremidades de um único polinucleotídeo. As ligases incluem ligases
polinucleotídicas de fita dupla dependentes de ATP, ligases de DNA ou RNA
de fita dupla dependentes de NAD-i e ligases polinucleotídicas de fita
simples, por exemplo, qualquer uma das ligases descritas em EC 6.5.1 .1
(ligases dependentes de ATP), EC 6.5.1 .2 (ligases dependentes de NAD +),
EC 6.5.1 .3 (ligases de RNA). Exemplos específicos de ligases incluem
ligases bacterianas, tais como E. coli DNA ligase e Taq DNA ligase,
Ampligase® DNA ligase termoestável (Epicentre®Technologies Corp., parte
de lllumina®, Madison, Wis.) e fago ligases, tais como T3 DNA ligase, T4
DNA ligase e T7 DNA ligase e mutantes destes.
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 81/140

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Amplificação do Círculo Rolante

[00186] Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem a
etapa de realizar a amplificação do círculo rolante na presença de uma
molécula de ácido nucleico, em que a realização inclui usar o segundo
oligonucleotídeo como um modelo e o primeiro oligonucleotídeo como um
primer para uma polimerase para formar um ou mais amplicons. Em tais
modalidades, um modelo de polinucleotídeo circular de fita simples é
formado por ligação do segundo nucleotídeo, cujo polinucleotídeo circular
inclui uma região que é complementar ao primeiro oligonucleotídeo. Após a
adição de uma DNA polimerase na presença de precursores de dNTP
apropriados e outros cofatores, o primeiro oligonucleotídeo é alongado por
replicação de múltiplas cópias do modelo. Este produto de amplificação pode
ser facilmente detectado por ligação a uma sonda de detecção. Em algumas
modalidades, a polimerase é pré-incubada sem dNTPs para permitir que a
polimerase penetre na amostra uniformemente antes de realizar a
amplificação do círculo rolante.
[00187] Em algumas modalidades, apenas quando um primeiro
oligonucleotídeo e um segundo oligonucleotídeo hibridizam com a mesma
molécula de ácido nucleico alvo, o segundo oligonucleotídeo pode ser
circularizado e amplificado em círculo rolante para gerar uma nanobola de
cDNA (isto é, amplicon) contendo múltiplas cópias do cDNA. O termo
amplicon refere-se ao produto de ácido nucleico amplificado de uma reação
de PCR ou outro processo de amplificação de ácido nucleico. Em algumas
modalidades, os nucleotídeos modificados com amina são injetados na
reação de amplificação do círculo rolante.
[00188] As técnicas para amplificação do círculo rolante são
conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Baner et al, Nucleic Acids
Research, 26:5073-5078, 1998; Lizardi et al, Nature Genetics 19:226, 1998;
Schweitzer et al. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 97:101 13- 1 19, 2000; Faruqi et
al, BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur et al, Nucl. Acids Res. 29:el 18, 2001 ;
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Dean et al. Genome Res. 11:1095-1099, 2001; Schweitzer et al, Nature

Biotech. 20:359-365, 2002; Patentes dos EUA 6.054.274, 6.291.187,
6.323.009, 6.344.329 e 6.368.801). Em algumas modalidades, a polimerase
é a polimerase de DNA phi29.
[00189] Em certos aspectos, a molécula de ácido nucleico inclui um
nucleotídeo modificado com amina. Em tais modalidades, o nucleotídeo
modificado com amina inclui uma modificação da fração N-
hidroxissuccinimida do ácido acrílico. Exemplos de outros nucleotídeos
modificados com amina incluem, mas não estão limitados a, uma
modificação da fração 5-Aminoalil-dUTP, uma modificação da fração 5-
Propargilamino-dCTP, uma modificação da fração N6-6-Aminohexil-dATP ou
uma modificação da fração 7-Deaza-7-Propargilamino-dATP.
Incorporação de Amplicon em uma Configuração de Tecido de hidrogel
[00190] Em algumas modalidades, os métodos divulgados incluem
incorporar um ou mais amplicons na presença de subunidades de hidrogel
para formar um ou mais amplicons incorporados em hidrogel. A química de
tecido de hidrogel descrita inclui a fixação covalente de ácidos nucleicos ao
hidrogel sintetizado in situ para limpeza de tecidos, difusão de enzimas e
sequenciamento de múltiplos ciclos, enquanto um método de química de
tecido de hidrogel existente não pode. Em algumas modalidades, para
permitir a incorporação de amplicon na configuração do tecido de hidrogel,
os nucleotídeos modificados com amina são injetados na reação de
amplificação do círculo rolante, funcionalizados com uma fração de
acrilamida usando ésteres de N-hidroxissuccinimida de ácido acrílico e
copolimerizados com monômeros de acrilamida para formar um hidrogel.
[00191] Conforme usado neste documento, os termos hidrogel ou
rede de hidrogel significam uma rede de cadeias poliméricas que são
insolúveis em água, por vezes encontradas como um gel coloidal em que a
água é o meio de dispersão. Em outras palavras, os hidrogéis são uma classe
de materiais poliméricos que podem absorver grandes quantidades de água
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sem se dissolver. Os hidrogéis podem conter mais de 99% de água e podem

incluir polímeros naturais ou sintéticos, ou uma combinação destes. Os
hidrogéis também possuem um grau de flexibilidade muito semelhante ao
tecido natural, devido ao seu conteúdo significativo de água. Uma descrição
detalhada de hidrogéis adequados pode ser encontrada no pedido de patente
dos EUA 20100055733 publicado, especificamente incorporado neste
documento por referência. Conforme usado neste documento, os termos
subunidades de hidrogel ou precursores de hidrogel significam
monômeros hidrofílicos, pré-polímeros ou polímeros que podem ser
reticulados ou polimerizados , para formar uma rede de hidrogel
tridimensional (3D). Sem estar limitado por qualquer teoria científica,
acredita-se que esta fixação do espécime biológico na presença de
subunidades de hidrogel reticula os componentes do espécime para as
subunidades de hidrogel, assegurando assim os componentes moleculares
no lugar, preservando a arquitetura do tecido e a morfologia celular.
[00192] Em algumas modalidades, a incorporação inclui copolimerizar
o um ou mais amplicons com acrilamida. Conforme usado neste documento,
o termo copolímero descreve um polímero que contém mais do que um tipo
de subunidade. O termo abrange polímero que inclui dois, três, quatro, cinco
ou seis tipos de subunidades.
[00193] Em certos aspectos, a incorporação inclui limpar o um ou mais
amplicons incorporados em hidrogel, em que o ácido nucleico alvo é
substancialmente retido no um ou mais amplicons incorporados em hidrogel.
Em tais modalidades, a limpeza inclui remover substancialmente uma
pluralidade de componentes celulares de um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel. Em algumas outras modalidades, a limpeza inclui
remover substancialmente lipídios e/ou proteínas do um ou mais amplicons
incorporados em hidrogel. Conforme usado neste documento, o termo
substancialmente significa que a quantidade original presente na amostra
antes da limpeza foi reduzida em aproximadamente 70% ou mais, tal como
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 84/140

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em 75% ou mais, tal como em 80% ou mais, tal como em 85% ou mais, tal
como em 90% ou mais, tal como em 95% ou mais, tal como em 99% ou mais,
tal como em 100%.
[00194] Em algumas modalidades, a limpeza dos amplicons
incorporados em hidrogel inclui a realização de eletroforese no espécime.
Em algumas modalidades, os amplicons são submetidos a eletroforese
usando uma solução tampão que inclui um surfactante iônico. Em algumas
modalidades, o surfactante iônico é dodecil sulfato de sódio (SDS). Em
algumas modalidades, o espécime é submetido a eletroforese usando uma
voltagem que varia de cerca de 10 a cerca de 60 volts. Em algumas
modalidades, o espécime é submetido a eletroforese por um período de
tempo que varia de cerca de 15 minutos até cerca de 10 dias. Em algumas
modalidades, os métodos envolvem ainda incubar o espécime limpo em um
meio de montagem que tem um índice de refração que é compatível ao do
tecido limpo. Em algumas modalidades, o meio de montagem aumenta a
clareza óptica do espécime. Em algumas modalidades, o meio de montagem
inclui glicerol.
Células
[00195] Os métodos divulgados neste documento incluem um método
para sequenciamento de genes in situ de um ácido nucleico alvo em uma
célula em um tecido intacto. Em certas modalidades, a célula está presente
em uma população de células. Em certas outras modalidades, a população
de células inclui uma pluralidade de tipos de células incluindo, mas não se
limitando a, neurônios excitatórios, neurônios inibitórios e células não
neuronais. As células para uso nos ensaios da invenção podem ser um
organismo, um único tipo de célula derivado de um organismo ou podem ser
uma mistura de tipos de células. Estão incluídas células de ocorrência natural
e populações de células, linhagens celulares geneticamente modificadas,
células derivadas de animais transgênicos, etc. Praticamente qualquer tipo e
tamanho de célula pode ser acomodado. As células adequadas incluem
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células bacterianas, fúngicas, vegetais e animais. Em uma modalidade da

invenção, as células são células de mamíferos, por exemplo, populações de
células complexas, tais como tecidos de ocorrência natural, por exemplo,
sangue, fígado, pâncreas, tecido neural, medula óssea, pele e semelhantes.
Alguns tecidos podem ser rompidos em uma suspensão monodispersa.
Alternativamente, as células podem ser uma população cultivada, por
exemplo, uma cultura derivada de uma população complexa, uma cultura
derivada de um único tipo de célula em que as células se diferenciaram em
múltiplas linhagens ou em que as células estão respondendo
diferencialmente ao estímulo e semelhantes.
[00196] Os tipos de células que podem encontrar uso na invenção em
questão incluem células-tronco e progenitoras, por exemplo, células-tronco
embrionárias, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco mesenquimais,
células da crista neural, etc., células endoteliais, células musculares,
miocárdicas, células musculares lisas e esqueléticas, células mesenquimais,
células epiteliais; células hematopoiéticas, tais como linfócitos, incluindo
células T, tais como células T Th1, células T Th2, células T ThO, células T
citotóxicas; células B, células pré-B, etc.; monócitos; células dendríticas;
neutrófilos; e macrófagos; células natural killer; mastócitos, etc.; adipócitos,
células envolvidas com órgãos particulares, tais como timo, glândulas
endócrinas, pâncreas, cérebro, tais como neurônios, glia, astrócitos,
dendrócitos, etc. e células geneticamente modificadas destes. As células
hematopoiéticas podem estar associadas a processos inflamatórios,
doenças autoimunes, etc., células endoteliais, células musculares lisas,
células do miocárdio, etc. podem estar associadas a doenças
cardiovasculares; quase qualquer tipo de célula pode estar associada a
neoplasias, como sarcomas, carcinomas e linfomas; doenças hepáticas com
células hepáticas; doenças renais com células renais; etc.
[00197] As células também podem ser células transformadas ou
neoplásicas de diferentes tipos, por exemplo, carcinomas de diferentes
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origens celulares, linfomas de diferentes tipos de células, etc. A American

Type Culture Collection (Manassas, VA) coletou e disponibiliza mais de 4.000
linhagens celulares de mais de 150 espécies diferentes, mais de 950
linhagens celulares de câncer, incluindo 700 linhagens celulares de câncer
humano. O Instituto Nacional do Câncer compilou dados clínicos,
bioquímicos e moleculares de um grande painel de linhagens de células
tumorais humanas, estes estão disponíveis na ATCC ou no NCI (Phelps et
al. (1996) Journal of Cellular Biochemistry Supplement 24:32-91). Estão
incluídas diferentes linhagens celulares derivadas espontaneamente ou
selecionadas para características de crescimento ou resposta desejadas de
uma linhagem celular individual; e podem incluir múltiplas linhagens celulares
derivadas de um tipo de tumor semelhante, mas de pacientes ou sítios
distintos.
[00198] As células podem ser não aderentes, por exemplo, células
sanguíneas incluindo monócitos, células T, células B; células tumorais, etc.,
ou células aderentes, por exemplo, células epiteliais, células endoteliais,
células neurais, etc. A fim de perfilar células aderentes, elas podem ser
dissociadas do substrato ao qual estão aderidas e de outras células, de uma
maneira que mantenha sua capacidade de reconhecer e se ligar a moléculas
de sonda.
[00199] Tais células podem ser adquiridas de um indivíduo usando,
por exemplo, uma extração, uma higienização, uma lavagem, dissecção
cirúrgica, etc., de uma variedade de tecidos, por exemplo, sangue, medula,
um tecido sólido (por exemplo, um tumor sólido), ascite, por uma variedade
de técnicas que são conhecidas na técnica. As células podem ser obtidas a
partir de amostras fixas ou não fixas, frescas ou congeladas, inteiras ou
desagregadas. A desagregação do tecido pode ocorrer mecanicamente ou
enzimaticamente usando técnicas conhecidas.
[00200] Aspectos, incluindo modalidades, da presente matéria
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descrita acima podem ser benéficos sozinhos ou em combinação com um ou

mais outros aspectos ou modalidades. Sem se limitar à descrição anterior,
são fornecidos abaixo certos aspectos não limitativos da divulgação
numerada de 1-34. Conforme será evidente para aqueles versados na
técnica mediante leitura desta divulgação, cada um dos aspectos numerados
individualmente pode ser usado ou combinado com qualquer um dos
aspectos individualmente numerados anteriores ou seguintes. Isto pretende
fornecer suporte para todas tais combinações dos aspectos e não se limita
às combinações dos aspectos explicitamente fornecidos abaixo:
1. Um dispositivo de sequenciamento que compreende:
(a) um módulo de iluminação e detecção compreendendo um
componente confocal de disco giratório compreendendo uma pluralidade de
linhas de laser para iluminação com correção de iluminação plana, em que a
pluralidade de linhas de laser é usada para iluminar uma amostra com luz de
excitação em um ou mais comprimentos de onda, um filtro de emissão de
passa-faixa, um divisor de imagem de passagem longa, uma primeira câmera
que detecta emissões de fluorescência em um primeiro intervalo de
comprimento de onda, e uma segunda câmera que detecta emissões de
fluorescência em um segundo intervalo de comprimento de onda, em que a
primeira câmera e a segunda câmera podem detectar emissões
simultaneamente;
(b) um módulo de microscópio compreendendo uma mesa motorizada
capaz de posicionamento em múltiplos eixos ao longo dos eixos x, y e z, um
objetivas, em que cada objetiva fornece uma ampliação diferente, em que
uma ou mais objetivas são objetivas de imersão, em que cada objetiva de
imersão tem um colar de imersão de objetiva, e óptica, em que a óptica
encaminha a luz das objetivas para o módulo de iluminação e detecção;
(c) um módulo de meio de imersão automatizado compreendendo i)
um recipiente compreendendo meio de imersão, ii) linhas fluídicas acopladas
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ao recipiente e aos colares de imersão de objetivas das objetivas de imersão

do módulo de microscópio, em que as linhas fluídicas transportam meio de
imersão de e para os colares de imersão de objetivas, em que os colares de
imersão capturam o excesso de meio de imersão e iii) uma série de bombas
automatizado fornece volumes controlados dos meios de imersão para os
colares de imersão de objetivas nos topos das objetivas de imersão durante
a geração de imagens;
(d) uma placa de múltiplos poços, em que a mesa motorizada pode ser
movida para posicionar um poço da placa de múltiplos poços sob a objetiva
usada para a geração de imagens;
(e) uma torre de acoplamento fluídico, em que a torre de acoplamento
fluídico está no topo da mesa motorizada e posiciona as linhas fluídicas nos
poços da placa de múltiplos poços;
(f) um módulo de gerenciamento fluídico compreendendo uma válvula
rotativa simétrica compreendendo um mecanismo de válvula rotativa, uma
bomba, em que a bomba está conectada às linhas fluídicas, e detectores de
bolhas, em que os detectores de bolhas estão posicionados em ambos os
lados das linhas fluídicas que levam à bomba, em que o módulo de
gerenciamento fluídico permite movimento unidirecional ou bidirecional de
reagentes, tampões e resíduos através das linhas fluídicas;
(g) um módulo de reagente, tampão e resíduo compreendendo i) uma
bandeja deslizante, em que cartuchos de reagente e cartuchos de tampão
podem ser posicionados na bandeja deslizante e acoplados ao módulo de
gerenciamento fluídico; ii) um módulo de resíduo compreendendo um
recipiente de resíduos, em que o recipiente de resíduos é acoplado a uma
linha fluídica da bomba de gerenciamento de fluidos, e iii) um mecanismo de
capping, em que o mecanismo de capping fecha o recipiente de resíduos
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quando o recipiente de resíduos é removido do sistema para descarte de

resíduos e abre o recipiente de resíduos quando o recipiente de resíduos é
colocado de volta no sistema;
(h) um módulo elétrico compreendendo: i) uma primeira placa de
firmware que controla a distribuição de meio a partir do módulo de meio de
imersão automatizado e ii) uma segunda placa de firmware que controla o
módulo de gerenciamento de fluido e o módulo de reagente, tampão e
resíduo, em que o módulo elétrico regula a energia para os outros módulos
do sistema; e
(i) um processador programado para fornecer uma interface de usuário
e operar os módulos do dispositivo de sequenciamento.
2. O dispositivo de sequenciamento do aspecto 1, em que a
pluralidade de linhas de laser compreende pelo menos 5 linhas de laser.
3. O dispositivo de sequenciamento do aspecto 2, em que o filtro
de emissão passa-banda é um filtro de emissão penta-passa-banda.
4. O dispositivo de sequenciamento de qualquer um dos aspectos
1-3, em que a mesa motorizada tem um eixo z piezo.
1-4, em que o meio de imersão é água.
1-5, em que o meio de imersão é filtrado e sem bolhas.
1-6, compreendendo ainda um anel de vedação tipo O-ring e um
revestimento embalado em plástico termorretrátil sobre cada objetiva.
1-7, compreendendo ainda um monitor de pressão para monitorar a pressão
nas linhas fluídicas, em que aumentos na pressão em uma linha fluídica
podem ser usados para detectar um bloqueio potencial da linha fluídica.
1-8, compreendendo ainda uma pluralidade de diodos emissores de luz
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(LEDs), em que cada LED pode emitir luz para fornecer uma indicação de
estado para o sistema.
1-9, compreendendo ainda um componente de exibição para exibir
informações e fornecer uma interface de usuário.
1-10, em que o processador é ainda programado para executar etapas
compreendendo:
(a) localizar uma amostra selecionada na placa de múltiplos poços;
(b) detectar um sinal no plano XY a partir da amostra selecionada em
baixa ampliação usando aquisição de modo de a geração de imagens de
campo amplo com compartimentação de câmera;
(c) usar o sinal para segmentar uma caixa delimitadora XY em torno
da amostra;
(d) imagear a amostra dentro da caixa delimitadora XY para produzir
uma imagem, em que a geração de imagens é realizada no modo de a
geração de imagens confocal em Z com ampliação mais alta do que a usada
na etapa (b) com binning de câmera a fim de determinar a extensão Z
aproximada da amostra, em que um único plano Z é coletado através do
ponto médio da extensão Z previamente determinada e através da extensão
XY;
(e) exibir a imagem produzida na etapa (d);
(f) fornecer uma interface para um usuário selecionar uma região XY
desejada de interesse na amostra a ter ainda imagens geradas durante o
sequenciamento da amostra selecionada;
(g) imagear a amostra na região XY selecionada de interesse através
das extensões Z previamente amostradas;
(h) calcular um volume da região de interesse na amostra e exibir o
volume de amostra calculado da região de interesse ao usuário;
(i) segmentar a imagem da amostra na região de interesse ao longo
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das extensões Z;
(j) fornecer uma interface ao usuário para que o usuário ajuste as
extensões Z do volume de amostra antes de iniciar o sequenciamento, em
que as extensões de a geração de imagens derivadas da região de interesse
montados apropriados para uma determinada objetiva de a geração de
imagens e para ajustar as posições da mesa do microscópio, o
posicionamento da objetiva Z e os limites piezoelétricos para a geração de
imagens da região de interesse ao longo dos eixos XYZ durante o
sequenciamento; e
(k) reiterar as etapas (a)-(j) para definir regiões de interesse para cada
amostra na placa de múltiplos poços que o usuário pretende sequenciar.
compreendendo:
fornecer uma interface ao usuário para que o usuário selecione uma
ou mais amostras para sequenciamento e um protocolo de sequenciamento,
em que o usuário é limitado em quantas amostras podem ser selecionadas,
dependendo das quantidades de tampão e reagentes que estão disponíveis
e do protocolo de sequenciamento selecionado;
fornecer restrições sobre o tempo total de sequenciamento, dados
totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total máximo de regiões de
interesse em todas as amostras que devem ser sequenciadas e ter imagens
geradas, e
sugerir protocolos que maximizem o sequenciamento de regiões de
interesse desejadas em amostras, dentro das restrições.
1-12, em que o processador é ainda programado para otimizar a
paralelização de sequenciamento de amostra dependendo do número de
amostras a serem sequenciadas e tipos de a geração de imagens a serem
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usados no sequenciamento.
compreendendo:
realizar uma varredura confocal rápida em Z em uma posição XY inicial
de uma dada montagem de amostra para determinar um perfil Z da amostra
na posição XY inicial;
determinar a interface superior e inferior da amostra usando um
método de segmentação; e
definir a posição Z da objetiva a uma distância fixa da interface no início
da montagem de amostra, em que o desvio em Z da amostra em relação à
mesa e a objetiva através de rodadas é reduzido para abaixo de uma
tolerância selecionada para facilitar o registro de subpixel a jusante através
de rodadas durante o processamento pós-aquisição.
1-14, em que o sequenciamento é o sequenciamento in situ de um ácido
nucleico alvo em uma amostra de tecido.
16. O dispositivo de sequenciamento do aspecto 15, em que a
amostra de tecido é um pedaço de tecido com uma espessura de 20 µm a
200 µm.
1-16, em que o sequenciamento in situ é sequencial ou combinatório in situ.
1-17, em que o módulo de microscópio compreende um microscópio
epifluorescente, um microscópio confocal, um microscópio de iluminação
estruturado ou um microscópio de folha de luz ou de folha de luz de plano
oblíquo.
19. O dispositivo de sequenciamento do aspecto 18, em que o
microscópio confocal é um microscópio confocal de disco giratório ou
varredura de ponto.
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20. Um método para usar o dispositivo de sequenciamento de

qualquer um dos aspectos 1-19, o método compreendendo:
carregar amostras na placa de múltiplos poços;
selecionar quais amostras na placa de múltiplos poços são
sequenciadas;
selecionar um protocolo de sequenciamento; e
sequenciar ácidos nucleicos nas amostras selecionadas usando o
dispositivo de sequenciamento de qualquer um dos aspectos 1-19.
21. O método do aspecto 20, em que o sequenciamento é o
sequenciamento volumétrico in situ de amostras de tecido.
22. O método do aspecto 20 ou 21, em que as amostras de tecido
são pedaços de tecido com uma espessura de 20-200 µm.
23. O método de qualquer um dos aspectos 20-22, em que o
sequenciamento in situ é sequenciamento in situ sequencial ou combinatório.
24. Um método implementado por computador, em que o
computador executa etapas compreendendo:
(a) localizar uma amostra selecionada na placa de múltiplos poços;
(b) detectar um sinal no plano XY a partir da amostra selecionada em
baixa ampliação usando aquisição de modo de a geração de imagens de
campo amplo com compartimentação de câmera;
(c) usar o sinal para segmentar uma caixa delimitadora XY em torno
da amostra;
(d) imagear a amostra dentro da caixa delimitadora XY para produzir
uma imagem, em que a geração de imagens é realizada no modo de a
geração de imagens confocal em Z com ampliação mais alta do que a usada
na etapa (b) com binning de câmera a fim de determinar a extensão Z
aproximada da amostra, em que um único plano Z é coletado através do
ponto médio da extensão Z previamente determinada e através da extensão
XY;
(e) exibir a imagem produzida na etapa (d);
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(f) fornecer uma interface para um usuário selecionar uma região XY

desejada de interesse na amostra a ter ainda imagens geradas durante o
sequenciamento da amostra selecionada;
(g) imagear a amostra na região XY selecionada de interesse através
das extensões Z previamente amostradas;
(h) calcular um volume de amostra da região de interesse e exibir o
volume de amostra calculado da região de interesse para o usuário;
(i) segmentar a imagem da amostra na região de interesse ao longo
das extensões Z;
(j) fornecer uma interface ao usuário para que o usuário ajuste as
extensões Z do volume de amostra antes de iniciar o sequenciamento, em
que as extensões de a geração de imagens derivadas da região de interesse
montados apropriados para uma determinada objetiva de a geração de
imagens e para ajustar as posições da mesa do microscópio, o
posicionamento da objetiva Z e os limites piezoelétricos para a geração de
imagens da região de interesse ao longo dos eixos XYZ durante o
sequenciamento; e
(k) reiterar as etapas (a)-(j) para definir regiões de interesse para cada
amostra na placa de múltiplos poços que o usuário pretende sequenciar.
25. Um meio não transitório legível por computador compreendendo
instruções de programa que, quando executadas por um processador em um
computador, fazem com que o processador execute o método do aspecto 24.
fornecer uma interface ao usuário para que o usuário selecione uma
ou mais amostras para sequenciamento e um protocolo de sequenciamento,
em que o usuário é limitado em quantas amostras podem ser selecionadas,
dependendo das quantidades de tampão e reagentes disponíveis e do
protocolo de sequenciamento selecionado;
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 95/140

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fornecer restrições sobre o tempo total de sequenciamento, dados

totais adquiridos, taxa de aquisição e volume total máximo de regiões de
interesse em todas as amostras que devem ser sequenciadas e ter imagens
geradas, e
sugerir protocolos que maximizem o sequenciamento de regiões de
interesse desejadas em amostras, dentro das restrições.
27. O método implementado por computador do aspecto 26, em que
o computador é ainda programado para otimizar a paralelização de
sequenciamento de amostra dependendo do número de amostras a serem
sequenciadas e tipos de a geração de imagens a serem usados no
sequenciamento.
computador, fazem com que o processador execute o método do aspecto 26
ou 27.
realizar uma varredura confocal rápida em Z em uma posição XY inicial
de uma dada montagem de amostra para determinar um perfil Z da amostra
na posição XY inicial;
determinar a interface superior e inferior da amostra usando um
método de segmentação; e
definir a posição Z da objetiva a uma distância fixa da interface no início
da montagem de amostra, em que o desvio em Z da amostra em relação à
mesa e a objetiva através de rodadas é reduzido para abaixo de uma
tolerância selecionada para facilitar o registro de subpixel a jusante através
de rodadas durante o processamento pós-aquisição.
computador, fazem com que o processador execute o método do aspecto 29.
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31. Um módulo de meio de imersão automatizado compreendendo:

(a) um recipiente compreendendo meio de imersão;
(b) linhas fluídicas acopladas ao recipiente e aos colares de imersão
de objetivas das objetivas do módulo de microscópio, em que as linhas
fluídicas transportam meios de imersão de e para um colar de imersão da
objetiva em uma objetiva de imersão, em que o colar de imersão captura o
excesso de meios de imersão; e
(c) uma série de bombas conectadas às linhas fluídicas e a um
microcontrolador, em que o microcontrolador controla a adição e remoção de
bombas do meio de imersão através das linhas fluídicas, em que o módulo
de meio de imersão automatizado fornece volumes controlados do meio de
imersão para os colares de imersão objetiva no topo das objetivas durante a
geração de imagens.
32. Um método de uso do módulo de meio de imersão automatizado
do aspecto 31, o método compreendendo o uso do módulo de meio de
imersão automatizado do aspecto 31 para distribuir meio de imersão a um
colar de imersão de objetiva fixado a uma objetiva de imersão de um
microscópio.
33. Um gerenciamento fluídico compreendendo uma válvula rotativa
simétrica compreendendo um mecanismo de válvula rotativa, uma bomba,
em que a bomba está conectada às linhas fluídicas e detectores de bolhas,
em que os detectores de bolhas estão posicionados em ambos os lados das
linhas fluídicas que levam à bomba, em que o módulo de gerenciamento
fluídico permite movimento bidirecional ou unidirecional de reagentes,
tampões e resíduos através das linhas fluídicas.
34. Um reagente, tampão e módulo de resíduos, compreendendo:
(a) uma bandeja deslizante, em que cartuchos de reagente e cartuchos
de tampão podem ser posicionados na bandeja deslizante e acoplados ao
módulo de gerenciamento fluídico;
(b) um módulo de resíduos compreendendo um recipiente de resíduos,
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em que o recipiente de resíduos é acoplado a uma linha fluídica da bomba

de gerenciamento de fluidos; e
(c) um mecanismo de capping, em que o mecanismo de capping fecha
o recipiente de resíduos quando o recipiente de resíduos é removido do
sistema para descarte de resíduos e abre o recipiente de resíduos quando o
recipiente de resíduos é colocado de volta no sistema.
[00201]
[00202]
[00203]
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Sequenciador in situ volumétrico de última geração

Visão geral
[00204] 1. Fluídica integrada e plataforma confocal rápida e a geração
de imagens de até 5 canais
a.
b.
c.
d.
[00205]
[00206]
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92/97
[00207]
[00208]
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[00209] Uma nova torre de acoplamento fluídico colocada na mesa

XYZ posiciona linhas fluídicas em uma placa de amostra de múltiplos poços.
Este acoplador permite a fácil adição e remoção da amostra da mesa do
microscópio e o acoplamento de linhas fluídicas às amostras, enquanto
minimiza a carga estrutural na mesa do microscópio automatizado (o
excesso de peso na mesa inibe o posicionamento preciso e movimentos
rápidos). As quebras de feixe detectam se a amostra está totalmente
acoplada ao sistema e os elementos estruturais evitam danos às linhas
fluídicas ou danos ao usuário durante a operação.
[00210]
[00211]
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[00212]
[00213]
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95/97
[00214]
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[00215]
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BANEJA DE REAGENTE DE 18 POÇOS

24 inserções selecionáveis
para 1 válvula rotatória de
Reagente
saída acionada por motor
Sipper
Filtro conectado
ao ar
Sipper
BANEJA DE TAMPÃO DE 6 POÇOS Números de poços de reagente e tampão

Tampão
conectam diretamente aos números de

conexão de entrada de válvula 24 EXCETO
#20
Sensor de pressão A
Detecção de bolhas
Sensor de pressão D
Sensor de pressão B
Bomba de seringa
de 4 posições
Para anteparo, consulte folha 2

Consulte folha 2
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Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 123/140

19/35
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 124/140

20/35
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 125/140

21/35
Reagentes Tampões
Transporador
Garrafas vedadas
Consumível de carregamento de tampão
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 126/140

22/35
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23/35
Chapa de vedação a
quente
Transportador
Tubos eppendorf
Consumível de carregamento de reagente
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 128/140

24/35
Coletor de enchimento
Acessório para segurar o

consumível reagente à
balança
Balança para verificar

enchimento
Estação de pesagem
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 129/140

25/35
Estação de enchimento de tampão
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 130/140

26/35
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 131/140

27/35
3 Válvulas NC de Bomba peristáltica bi-

tEE de dois direcional de baixo
Filtro de fluxo
modos
seringa de
10 um
Sensor de bolhas
Para colar de
alimentação 40x
Bomba peristáltica bi-

A partir do colar de
direcional de alto fluxo
alimentação 40x
4 Válvulas SMC
A partir de de dois modos
transbordamento 40x
Para colar de
alimentação 60x
A partir da ponta do colar

de alimentação 60x
A partir de
transbordamento 60x
Residuo Fornecimento de H2O
Colar 60x tem 1 O-ring, 40x tem 2 O-rings

Colar de alimentação – Dispensa/extrai e pode reabastecer
enquanto trabalha a lacuna ao vidro de cobertura
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 132/140

28/35
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29/35
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30/35
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31/35
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32/35
Bandeja de reagentes de 18 poços

24 inserções selecionáveis
para 1 válvula rotatória de
Reagente saída acionada por motor
Sipper
Filtro conectado ao
ar
Tampao
Sipper
Bandeja de tampão de 6 poços Números de poços de reagente e tampão

conectam diretamente aos números de
conexão de entrada de válvula EXCETO #20
Sensor de pressão A
Sensor de pressão B
Bomba peristáltica de
baixo fluxo
Bomba de seringa
de 4 posições

Para anteparo, consulte folha 2 Consulte folha 2
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 137/140

33/35
A partir da bomba A partir da bomba de A partir da bomba de

Bomba peristática seringa de Porta C seringa de Porta B
peristáltica de baixo fluxo
de Alto fluxo
Anteparo Anteparo
superior inferior
Detecção de
bolhas
Alimenta Saída Alimenta

ção ção
Saída
Transbordamento
Transbordamento
Consulte folha 3
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 138/140

34/35
Bomba de seringa da
porta 8
24 inserções selecionáveis para 1

válvula rotatória de saída acionada
por motor
PLACA DE CULTURA DE 24
POÇOS
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 139/140

35/35
Aspiração
de resíduo
Bomba de
seringa 1 Aspiração de
linha de água
Linha de água
Resíduo de
imersão
Válvula 24 a 1
RESÍDUO
Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 140/140

Petição 260

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870240005703

Outras petições - Tradução dos documentos apresentados no depósito

Número do Processo: BR 11 2023 024320 3

Dados do Depositante (71)

Nome ou Razão Social: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD

Nacionalidade: Norte Americana

Qualificação Jurídica: Pessoa Jurídica

País: Estados Unidos da América

Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 1/140

Nome ou Razão Social: Flávia Salim Lopes

Numero API: 488

Endereço: Rua do Passeio, 38, Setor 1 - 14º andar, Centro

Cidade: Rio de Janeiro

Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 2/140

Tipo Anexo Nome

Comprovante de pagamento 2023_33339 GRU REL.pdf

Procuração 2023_33339 POA.pdf

Esclarecimento 2023_33339 ESCL REL.pdf

Relatório Descritivo 2023_33339 REL.pdf

Desenho 2023_33339 DES.pdf

Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 3/140

00190.00009 02940.916238 15007.760174 6 96320000009000

CLARKE MODET PROPRIEDADE INTELECTUAL LTDA CPF/CNPJ: 33033101000118

29409162315007760 29409162315007760 20/02/2024 90,00

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37

00190.00009 02940.916238 15007.760174 6 96320000009000

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 2234-9 / 333028-1

22/01/2024 29409162315007760 DS N 22/01/2024 29409162315007760

A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal.

CLARKE MODET PROPRIEDADE INTELECTUAL LTDA CPF/CNPJ: 33033101000118

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 4/140

COMPROVANTE DE PAGAMENTO DE TITULOS

CLIENTE: CLARKE MODET PROP INT LTD

Atendimento a Deficientes Auditivos ou de Fala

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 5/140

Ilmo. Senhor Diretor do Instituto Nacional da Propriedade Industrial

Pedido: BR 11 2023 024320 3 de 20/05/2022

Rio de Janeiro, 19 de janeiro de 2024.

Flávia Salim Lopes

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 8/140

[0001] As amostras biológicas contêm informações genéticas

[0002] É fornecido um dispositivo de sequenciamento para

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 9/140

compreendendo um componente confocal de disco giratório compreendendo

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 10/140

objetiva usado para geração de imagens; (e) uma torre de acoplamento

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 11/140

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 12/140

da amostra, em que um único plano Z é coletado através do ponto médio da

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 13/140

de interesse desejadas em amostras dentro das restrições.

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 14/140

amostra de tecido é um pedaço de tecido espesso com uma espessura de

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 15/140

Z da objetiva e ligações piezo para geração de imagens da região de

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 16/140

[0021] Em outro aspecto, é fornecido um meio legível por computador

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 17/140

e resíduo, o módulo compreendendo: (a) uma bandeja deslizante, em que

[0026] A FIG. 1 mostra o dispositivo de sequenciamento incluindo seus

Petição 870240005703, de 22/01/2024, pág. 18/140