FONTES E APLICAES DE TANINOS E TANASES EM ALIMENTOS

Vania BATTESTIN* Luis Katsumi MATSUDA* Gabriela Alves MACEDO*

RESUMO: Os taninos ocorrem em uma ampla variedade de vegetais, so classificados em hidrolisveis e condensados. O cido tnico um tanino hidrolisvel, que quebrado por enzimas. So utilizados para estabilizao da cerveja, curtimento de pele e produo de resinas. Atualmente, so empregados em processos biotecnolgicos para produo de enzimas como a tanase, que hidrolisa steres e ligaes laterais de taninos hidrolisveis produzindo cido glico e glicose. A maior aplicao desta enzima tem sido para produo de cido glico, que utilizado na produo de trimetropim e snteses de steres como propil galato, usado como antioxidante na indstria de alimentos. A enzima tambm aplicada no processamento de cerveja e clarificao de sucos, processamento de chs instantneos e tratamento de efluentes contaminados com compostos fenlicos. PALAVRAS-CHAVE: Taninos; tanase; biotecnologia; alimentos.

Taninos Os taninos pertencem a um grupo de compostos fenlicos provenientes do metabolismo secundrio das plantas e so definidos como polmeros fenlicos solveis em gua que precipitam protenas 17. Apresentam alto peso molecular (500-3000 Da) e contm grupos hidroxilafenlicos em quantidade suficiente para permitir a formao de ligaes cruzadas com protenas 12. O contedo de taninos nas plantas pode variar de acordo com as condies climticas e geogrficas, podem apresentar uma composio qumica variada, sendo muitas vezes, pouco conhecida. Na forma no oxidada, os taninos reagem com protenas atravs de pontes de hidrognio ou ligaes hidrofbicas. Quando no oxidados, os taninos se transformam em quinonas, as quais formam ligaes covalentes com alguns grupos funcionais das protenas, principalmente os grupos sulfdricos da cistena e -amino da lisina 28. Os taninos so amplamente distribudos dentro do reino vegetal, sendo comuns tanto em espcies gimnospermas como angiospermas. Dentro das angiospermas, os taninos so mais comuns nas dicotiledneas do que nas monocotiledneas. Algumas famlias de dicotiledneas ricas em taninos so as leguminosas, anacardiaceas, combretaceas, rhizoporacea, mirtacea, polinaceae. Os taninos so encontrados principalmente nos vacolos das plantas. Nestes locais eles no interferem no metabolismo da planta, somente aps leso e morte das plantas agem e tm metabolismo eficiente 28 . Algumas madeiras apresentam teor de polifenis acima de 35% como o cerne do Quebracho 24, a casca de Accia Negra e de espcies provenientes de manguezal tambm possuem altos teores de polifenis 23. A maioria dos vegetais portador de tanino, podem ser encontrados nas razes, no lenho, na casca, nas folhas, nos frutos, nas sementes e na seiva. O teor e a espcie de tanino variam, no s de um vegetal para outro como tambm de uma parte para outro do mesmo vegetal conforme Tabela 01 34.

Introduo Os taninos ocorrem em uma ampla variedade de vegetais, podendo ser encontrados nas razes, na casca, nas folhas, nos frutos, nas sementes e na seiva. So classificados em dois grupos: taninos hidrolisveis e condensados. Tanase uma enzima extracelular, induzvel, produzida na presena de cido tnico por fungos, bactrias e leveduras 1. Embora existam muitas aplicaes industriais da tanase em potencial, poucas so efetivamente empregadas devido essencialmente ao custo de produo da enzima, que ainda elevado. A enzima tem vasta aplicao na indstria de alimentos, sucos, cervejaria, cosmticos, farmacutica e indstria qumica. Ela principalmente utilizada para produo de cido glico, chs instantneos, na estabilizao da cor do vinho, refrigerantes a base de caf, processo de tratamento de couro, detanificao de alimentos e para tratamento de efluentes na indstria de couros 21.

*Faculdade de Engenharia de Alimentos Departamento de Cincia de Alimentos - 13083-862, UNICAMP Campinas - SP-Brasil

Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004

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Tabela 01 - Teor de taninos totais em algumas espcies vegetais.

Produtos Abacaxi Folha Caule Sorgo Mandioca Caj Caf (casca) Folha de couve flor Folha de brocli Couve Taioba Folhas Limbo Caule

Teor de tanino

Referncia

0,81 % 0,61 % 0,60 2,61 % 0,62 1,11 % 0,35 0,72 % 1,31 2,97 % 0,21 g/100mg 0,325 g/100mg 0,290 g/100mg

Santos et al., 2001 Santos et al., 2001 Rodrigues, 1991 Carvalho et al., 1993 Embrapa 1992 Filho et al., 2000 Santos et al., 2000 Santos et al., 2000 Santos et al., 2000

1,0 g/100mg 1,17 g/100mg 0,82 g/100mg

Santos, 2000 Santos, 2000 Santos, 2000

Estrutura e fontes dos taninos

HO

HO O

n C O

O C O

C O m HO OH OH

FIGURA 1 - Estrutura qumica de tanino hidrolisvel 26.

R
HO O C R O O O R O O R
FIGURA 2 - Estrutura molecular de galotaninos 7

Galotaninos: A Figura 02 mostra a estrutura qumica dos

galotaninos. Os grupos fenlicos que esterificam o ncleo glicosdico so constitudos por cido glico (ou galoil), seu dmero ou um oligmero conforme Figura 03. As molculas so usualmente compostas de um ncleo de glicose e 6 a 9 grupos galoil. O mais comum dos galotaninos o cido tnico (Figura 01) 30.

72

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HO

HO

HO

HO

OH

HO

OH

a) Taninos hidrolisveis: Os taninos hidrolisveis esto presentes em folhas, galhos, cascas e madeiras de vrias rvores como por exemplo: Terminalia, Phyllantus e Caesalpina, dentre outros gneros. So constitudos de misturas de fenis simples, tais como o pirogalol e cido elgico, e tambm steres do cido glico ou diglico com acares, como a glicose 19. Os taninos hidrolisveis so unidos por ligaes ster-carboxila, sendo prontamente hidrolisveis em condies cidas ou bsicas 15. A unidade bsica estrutural desse tipo de tanino um poliol, usualmente D-glucose, com seus grupos hidroxilas esterificados pelo cido glico (galotaninos) ou pelo hexadihidroxifnico (elagitaninos). A Figura 01 mostra a estrutura qumica do cido tnico (tanino hidrolisvel).

(l,m,n = 0,1,2 ou 3)

HO

HO

HO

HO

HO

HO

HO

HO

C O

O O

HO

As principais caractersticas dessa classe de compostos so: solubilidade em gua, exceto os de elevado peso molecular; possuem a habilidade de ligar-se a protenas, combinar-se com celulose e pectina para formar complexos insolveis 30. Os taninos so classificados em dois grupos: taninos hidrolisveis e taninos condensados ou proantocianidinas 32, 9.

HO

HO

(A)
O C OH O OH OH OH OH C OH

(B)

OH

mostra Figura 06. O cido tnico um tpico tanino hidrolisvel, que quebrado por enzimas a glicose e cido glico 18. A Tabela 02 apresenta os taninos hidrolisveis que so sintetizados por uma ampla variedade de vegetais e rvores e muitos desses tem sido usados como alimentao animal 16. Tabela 2 - Ocorrncia de taninos hidrolisveis em vegetais e rvores
Famlia Espcie Rhus sp Caesalpinia sp. Acacia sp Fagaceae Quercus sp. Castanea sp. Combretaceae Myrtaceae Terminalia sp. Eucalyptus sp. Tipo de tanino Galotaninos, elagitaninos Galotaninos, elagitaninos Galo-, galatos catequina Galotaninos, elagitaninos Elagitaninos Elagitaninos Elagitaninos

FIGURA 3 - Estruturas moleculares dos cidos glico (A) e diglico (B)7

Elagitaninos: A Figura 04 mostra a estrutura molecular

de elagitaninos. Nesta classe de taninos, os grupos fenlicos utilizados so molculas de cido hexahidroxidifnico (Figura 05), que pode espontaneamente se dehidratar para formar sua dilactona estvel, o cido elgico conforme

HO HO HO HO HO HO HO HO

HO O C O O HO O C O O O C

C O O O C O

ET
G

O HO HO HO HO

O
CO OC CO

G
5

OG O
2

GT
OG

4 2 3

O O O CO OG OG O G O G

HO

FIGURA 05 - Estrutura molecular do cido hexahidroxidifnico 7

O HO O HO HO O O

FIGURA 7 - Metabolismo do cido glico (G) em taninos hidrolisveis: pentagaloilglicose o precursor dos galotaninos (GT) e elagitaninos (ET)16 O composto central, pentagaloilglicose, o ponto inicial para a sntese de muitas estruturas complexas de taninos, consiste em um polyol central, como a glicose, a qual cercada por diversas unidades de cido glico. Adicionalmente, as unidades de cido glico podem ser unidas atravs de ligaes depsdicas conforme indica Figura 08. 73

FIGURA 06 - Estrutura molecular do acido elgico 7 Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004

HO

HO

HO

HO

HO

O O

CO O O

G G

O G

O G

HO

HO

HO

OC CO

HO

HO

HO

HO

HO

O C HO HO HO

HO

HO

HO

HO

HO

HO

GO

GO
3

O 1 G O

HO

O 1 G

Pentagaloilglicose ET ET
O OG OG OG O

CO CO

OG

HO

GO

OG

ET

HO

HO

HO C O

OG O

GO

HO

ET

ET

OH

HO

OH

O G

H O

OH

GO

OG

OC

OC O

HO

OH

FIGURA 4 - Estrutura molecular de elagitaninos 7

GO

OG

HO

HO

HO

HO

HO HO

G G

OG OG

O G O O O HO HO

O O

GO

O H

OH

HO

HO

OH

OH

OH OH

Anacardiaceae Leguminosae

Fonte: HARVEY 16

A Figura 07 mostra as relaes de biossntese entre diferentes compostos de taninos hidrolisveis.

H O

H O

H O

OH

HO

O G

acar O Ligao depsidica parte superior cido glico

Importncia industrial dos taninos a) Estabilizao da cerveja: A cerveja um produto de origem vegetal, susceptvel a alteraes em sua composio e estabilidade fsico-qumica, e que contm gs carbnico (CO2), lcool etlico, diversos sais inorgnicos e aproximadamente 800 compostos orgnicos. Um mtodo para reduzir a concentrao protica na cerveja a utilizao de cido tnico (tanino hidrolisvel). A quantidade de cido tnico a ser dosada depende de vrios parmetros, como matrias-primas empregadas, contedo de protenas cidas, nmero de clulas de levedura, tempo de maturao e temperatura, teor de oxignio e especificaes de qualidade (tempo de prateleira - shelf life, estabilidade contra turvao e estabilidade organolptica). O objetivo reduzir a concentrao de protenas atravs de precipitao como complexos tanino-proteicos, que so retirados da cerveja atravs de sedimentao ou centrifugao/filtrao 31. b) Curtimento de pele animal: Um dos segmentos industriais que se utiliza matria prima proveniente dos vegetais o de curtimento de pele animal para sua transformao em couro e nesse setor ocupa papel destacado a utilizao de tanino vegetal 23. c) Produo de resinas: Em geral, as resinas utilizadas na indstria de painis de madeira so obtidas a partir de produtos derivados do petrleo. Entretanto, as resinas produzidas com tanino vegetal podem apresentar caractersticas de ligao interna, viscosidade e tempo de formao de gel semelhantes s resinas comerciais conhecidas. Um aspecto importante para o emprego de tanino na produo de adesivos o seu teor de componentes polifenis reativos (condensveis). Na determinao do teor de polifenis, os taninos do tipo flavonol so precipitados atravs da condensao com formaldedo em meio cido (reao de Stiasny) 23. Degradao de taninos

FIGURA 8 - Exemplo de uma ligao depsdica que formada entre o grupo fenlico superior e o grupo inferior de uma unidade de cido glico 16. b)Taninos condensados Os taninos condensados (TC) ou proantocianidinas so constitudos por unidades flavanol: flava-3-ols (catequina) ou flavan 3,4-diols (leucoantocianinas). Eles esto presente em maior quantidade nos alimentos normalmente consumidos 12, 32. Os TC podem conter duas a cinqenta unidades flavanides; possuem estruturao complexa; so resistentes hidrlise, mas podem ser solveis em solventes orgnicos aquosos, dependendo de sua estrutura. A Figura 09 ilustra a estrutura qumica dos taninos condensados. Os pigmentos antocianidinas so os responsveis por um vasto conjunto de nuances rosa, vermelha, violeta e azul em flores, folhas, frutos, sucos e vinhos. Tambm so responsveis pela adstringncia de frutas, sucos e vinhos, e em muitos casos so compostos bioativos em plantas medicinais 30.

R HO O OH OH HO

OH OH OH O OH OH OH

FIGURA 9 - Estrutura qumica de tanino condensado 22. interessante notar que muitas espcies produzem tanto galotaninos ou elagitaninos, enquanto outras produzem misturas complexas contendo galotaninos, elagitaninos e taninos condensados. Por exemplo, Accia, Acer e Fagaceae so conhecidas por produzirem ambos os taninos, condensados e hidrolisveis 6, 25. 74 Tanino acil hidrolase conhecida como tanase (EC 3.1.1.20) uma enzima que hidrolisa steres e ligaes laterais de taninos hidrolisveis produzindo glicose e cido glico 5. Tanase uma enzima extracelular, induzvel, produzida na presena de cido tnico por fungos, bactrias e leveduras1. A Figura 10 mostra a reao de hidrlise do cido tnico. Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004

HO

HO HO

HO HO O O O

parte inferior cido glico

Bhat et al. 7 foram os primeiros a reportar que o cido tnico (tanino hidrolisvel) podia ser degradado por linhagens de Aspergillus niger. A maioria das espcies fngicas tem sido utilizadas para a biodegradao de efluentes da indstria de couros, pertencentes ao gnero Aspergillus e Penicillium. A degradao dos taninos pode se dar atravs de bactrias, fungos, leveduras, tanase microbiana, e interaes com a microflora do tratogastrointestinal de ruminantes. Tanase

COOH

CH2OR1 O OR2 OR2 OR2 OR2

3.1.1.20

9
OH OH

+
OH

CH2OH O OR2 1 OH OH OH

C=O

C=O

OH OH

OH

OH

OH O C=O

R1

R2
OH OH OH

FIGURA 10 - Hidrlise do cido tnico, R1 (galoil) e R2 (digaloil) 2. A primeira deciso para o desenvolvimento do processo de produo de enzimas a seleo da linhagem do microrganismo. Enzimas extracelulares so preferidas, pois dispensam mtodos de ruptura da clula, os quais so dispendiosos 10. Propriedades da tanase

devido essencialmente ao custo de produo da enzima, que ainda elevado. A enzima tem vasta aplicao na indstria de alimentos, sucos, cervejaria, cosmticos, farmacutica e indstria qumica. Ela principalmente utilizada para produo de cido glico, chs instantneos, na estabilizao da cor do vinho, refrigerantes a base de caf, processo de tratamento de couro, detanificao de alimentos e para tratamento de efluentes na indstria de couros 5. a) Ch instantneo: Uma das principais aplicaes industriais da tanase o emprego no processamento de ch instantneo, a fim de eliminar complexos insolveis indesejados, conhecidos como creme de ch, resultados da polimerizao de polifenis (taninos) e da interao de cafena e protenas com tais componentes, fenmeno que ocorre quando a bebida mantida a baixas temperaturas. A utilizao de tanase evita o emprego de substncias qumicas para a eliminao do creme, garantindo um produto final de excelente qualidade, solvel em gua e caracterizado pelo alto contedo de componentes aromticos e colorao apropriada 33 . A Figura 12 mostra o processo de desesterificao dos compostos fenlicos pela tanase para fabricao de chs instantneos.

OH

OH Tanase OH gua ROH + OH O C OH cido Glico OH

A tanase uma glicoprotena esterase formada predominantemente por um cido glico esterase e uma depsidase. A tanase pode ser separada em duas esterases, uma esterase especfica para steres alifticos como metil galato, e outra depsidase que hidrolisa ligaes depsdicas como cido m-diglico conforme mostra Figura 11. A tanase presenta pH estvel na faixa de 3.5-8.0, com pH timo entre 5.5-6.0, temperatura de estabilidade entre 30C e 60C, tima na faixa de 30-40C, ponto isoeltrico de 4.0-4.5 e massa molecular entre 180kDa e 300kDa. Estas propriedades dependem fortemente das condies de cultura e tambm da linhagem utilizada. A tanase inibida por Cu2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+ e Mg2+ e inativada pela ao de o-fenantrolina, EDTA, 2mercaptoetanol, tioglicolato de sdio, sulfatos e cloretos de magnsio e clcio 2.

O R O C OH

FIGURA 12 - Desesterificao dos compostos fenlicos pela tanase 22. b) Fabricao de Vinhos: Na fabricao de vinhos, a aplicao de tanase nos resduos do tratamento de uva favorece a remoo de compostos fenlicos, estabilizando e incrementando a qualidade dos vinhos 22. Cerca de 50% da colorao do vinho se deve presena de taninos; a oxidao destes componentes (em contato com o ar, gerando quinonas) pode causar uma turbidez indesejvel e conseqentemente perda de qualidade do produto final. Tal turbidez pode ser evitada com o emprego da tanase, que impede a reao de oxidao2. c) Clarificao de sucos: A tanase tambm utilizada como agente clarificador em alguns sucos de frutas e em bebidas geladas a base de caf, onde seu uso se concentra na remoo de compostos fenlicos presentes no material vegetal a fim de evitar sua complexao e precipitao 21. d) Tratamento de efluentes: Adicionalmente a tanase tem um grande potencial de aplicao no tratamento de efluentes resultantes do processamento de couro, e cido tnico. Estes efluentes contm altas quantidades de taninos, principalmente polifenis, perigosos poluentes. O uso de tanase, a fim de decompor os taninos presentes, constitui em um tratamento de baixo custo e alta eficcia na remoo 75

OH O C MeO OH OH OH OH HO OH HOOC OH O O C

FIGURA 11 - Tanase esterase e depsidase 17. Aplicaes industriais da tanase Embora existam muitas aplicaes industriais da tanase em potencial, poucas so efetivamente empregadas Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004

deste composto. e) Produo de cido glico: Segundo Banerjee et al. 5 o cido glico tem vrias aplicaes na indstria qumica e farmacutica. utilizada para sntese de propil galato, pirogalol, trimetropim e resinas semicondutoras. O propil galato uma substncia amplamente utilizada como aditivo na indstria de alimentos e como antioxidante em leos e produtos ricos em lipdeos. A Figura 13 mostra o processo de produo do propil galato na presena de npropanol usando tanase. O pirogalol utilizado como conservante na indstria de alimentos22, o trimetropim uma droga antibacteriana utilizada na indstria farmacutica 2.

otimizao desta produo em escala industrial 2. Produo de tanase microbiana Tanino acil hidrolase (TAH) pode ser obtida a partir de fontes vegetal, animal e microbiana. A tanase est presente em muitas plantas ricas em taninos como myrobalan (Terminalia chebula), divi divi (Caesalpinia coriaria), dhawa (Anogeissus latifolia), konnam (Cassia fistula), babul (Acacia arabica) e avarum, principalmente em suas frutas, folhas, galhos e nas cascas 4. De fontes animais, TAH pode ser extrado do intestino bovino e das mucosas dos ruminantes. O meio microbiolgico a fonte mais importante de obteno da tanase, uma vez que as enzimas produzidas desta forma so mais estveis do que aquelas obtidas por outros meios. Alm disso, microrganismos podem produzir TAH em altas quantidades e de maneira contnua, com conseqente aumento de rendimento. Adicionalmente, microrganismos podem ser submetidos a uma manipulao gentica, resultando num aumento das concentraes de atividade de tanase. importante salientar que ainda no foram executados estudos envolvendo a produo de enzima, utilizando estas tcnicas 4. Deschamps et al. 11 isolaram linhagens bacterianas capazes de degradar o cido tnico e compostos correlatos de casca de pinheiro e carvalho em apodrecimento. A linhagem identificada como Cndida sp K1 na presena de cido tnico, produz tanase extracelular. Candida a nica linhagem de levedura, estudada como produtora de TAH. Aceita-se, em geral, que as bactrias so muito sensveis presena de cido tnico, porm bactrias como Bacillus, Corynebacterium, Klebsiela, Streptococcus bovis e Selemonas ruminantium so capazes de crescer neste composto e tambm de degrad-lo. Entretanto, os microrganismos mais estudados so os fungos filamentosos, entre eles Assochyta, Aspergillus, Chaetomiun, Mucor, Myrothecium, Neurospora, Rhizopus, Trichothecium e Penicillium. Adicionalmente, tambm foram estudadas as linhagens de Fusarium e Trichoderma 22. Recentemente, um estudo comparou a produo da enzima TAH por vrias espcies de fungos, encontrando Fusarium solani, Trichoderma viride e Aspergillus fischerii como os melhores produtores da enzima do que o Aspergillus niger, a linhagem mais utilizada e caracterizada como a melhor produtora de TAH 3. necessrio considerar que para uso industrial, os microrganismos produtores de TAH devem ter o certificado GRAS (Generally Recognized as Safe Reconhecido como Seguro) e no produzir antibiticos. Apesar de vrios microrganismos produzirem tanase, estas no so igualmente ativas com todos os taninos hidrolisveis. As tanases de leveduras so efetivas somente na decomposio do cido tnico, em contrapartida as tanases bacterianas e fngicas so eficientes na degradao de cido tnico e outros taninos hidrolisveis que ocorrem na natureza 30. A tanase pode ser produzida por fermentao

O GA-(GA)n-O GA-(GA)m-O
(l,m,n=0,1,2 ou 3)

GA O O GA

O-(GA)I-GA cido Tnico n-Propanol

Tanase

COOC 3H7
+

Glicose

HO

OH OH Propil Galato

FIGURA 13 - Produo de propil galato 35. f) Rao animal: As aplicaes de enzimas em raes para dietas animais vm crescendo muito na ultima dcada. Os efeitos antinutricionais dos taninos so bem conhecidos: complexam-se com protenas indisponibilizando-as, reduzindo o valor nutricional da dieta. O sorgo geralmente utilizado como um complemento de raes animais. No entanto, vrios cultivares de sorgo apresentam um alto contedo de taninos. A utilizao desta enzima pode ser efetuada de duas diferentes formas: por contato direto dos extratos enzimticos com o material a ser tratado, hidrolisando-se os polifenis e evitando-se uma polimerizao indesejada; ou pelo cultivo de linhagens de fungos produtores de tanase em substratos ricos em taninos, os quais so degradados a compostos simples, caracterizados pela sua semelhante forma de no se polimerizar ou no formar complexo com as protenas e/ou cafena presente nos materiais brutos. A fim de reduzir custos e viabilizar o uso de tanase, faz se necessria realizao de estudos em diversas reas de pesquisa a respeito da produo de tanase fngica em escala industrial. Por esta razo, necessrio que se alcance um completo entendimento a respeito da regulao, capacidade cataltica, especificidade e aspectos de 76

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Tabela 3 - Fontes de carbono e temperaturas utilizadas para a sntese de tanase por diferentes fungos filamentosos em fermentao submersa. Microrganismo Fonte de carbono Concentrao g/L Temperatura C Aspergillus flavus cido tnico 1,0 30

Aspergillus niger Penicillium chrysosporium Aspergillus niger LCF8 Aspergillus awamori

Fonte: PINTO 30.

cido tnico Sacarose cido tnico Sacarose Extrato de tanino cido tnico

20,0 30,0 20,0 20,0 ------25,0 - 45,0

28 28 33 37

lquida, submersa e slida. Fermentao lquida em superfcie: Poucos trabalhos tratam da produo de tanase por este tipo de processo. Ganga et al.14 testaram diferentes espcies de Aspergillus e diferentes meios de cultura, e em todos os experimento afirmaram que a atividade de tanase foi significativamente maior nos extratos celulares, indicando que a enzima seria preferencialmente intracelular. Lekha et al 21 , observaram que a enzima completamente intracelular nas primeiras 48 horas de fermentao, sendo excretada aps esse tempo. Esta fermentao torna-se invivel tecnicamente devido baixa produtividade da enzima 30. Fermentao Submersa: A tanase produzida na presena de um indutor, assim a utilizao do cido tnico como indutor ou nica fonte de carbono, fundamental (Tabela 03). Apesar de outras fontes de carbono poderem estar presentes nos meio, a concentrao de cido tnico o fator predominante na produo de tanase. Diferentes fontes de nitrognio, inorgnicas e orgnicas, como sulfatos de amnio, nitrato de sdio e peptona, tm sido utilizados para a produo de tanase 30. Fermentao slida: O termo fermentao slida ou fermentao semi-slida aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos slidos sem a presena de gua livre circulante. A gua presente nestes sistemas encontra-se complexada com a matriz slida, formando uma fina camada adsorvida superfcie das partculas 30. O primeiro relato sobre sntese por fermentao slida relativamente pequeno quando comparado a outras enzimas produzidas por este processo e, a maioria foi publicada nesta ltima dcada. O primeiro relato de produo de tanase por fermentao slida data de 1917, onde se utilizou a linhagem de Aspergillus oryzae crescendo sobre farelo de trigo. Neste trabalho observou-se que a produo de tanase era maior medida que se aumentava a concentrao de tanino no meio. A partir de 20% de tanino, o crescimento do fungo foi inibido 22. Segundo Lagemaat et al. 20 a fermentao slida para a produo de enzimas oferece um grande nmero de vantagens sobre o mtodo de fermentao submersa e lquida convencional. O meio de produo simples, utiliza

subprodutos agroindustriais ricos em taninos como casca de uva, caj, caf ou subprodutos como farelo de trigo, arroz ou aveia, acrescidos de cido tnico. Lekha et al.21, estudaram o processo de produo de tanase por fermentao slida utilizando farelo de trigo com 6% de cido tnico. A adio de nitrognio e sais minerais no apresentou efeito na produo de tanase provavelmente porque o farelo de trigo j fornecia carbono, nitrognio e outros fatores de crescimento necessrios. Nishira & Mugibayashi 27 estudaram a produo de tanase em farelo de trigo com 4% de tanino por diferentes fungos: Penicilium, Aspergillus, Rhizopus, Thricothecium roseum, Mucor ptanii, Neurospora, Myrothecium verrucaria e Chaetomicium lobosum, a 25C por um perodo de 3 a 10 dias. As linhagens que apresentaram maior produo foram Aspergillus e Penicillium. O processo de fermentao slida oferece aplicaes promissoras para produo de compostos bioativos, enzimas e cidos orgnicos que podem ser gerados por diferentes subprodutos agrcolas como resduos de batata doce, beterraba e cenoura. Alm deste aspecto, os volumes do fermentador e de efluentes resultantes podem ser menores 20. Estudos comparativos da produo de tanase por A . niger empregando trs mtodos de fermentao revelaram que a fermentao slida produziu 2,5 a 4,8 vezes mais enzima

160 120

80 40

0 0 2 4 6 8

FIGURA 14 - Comparao da produo de tanase por A. niger PKL 104 em trs diferentes tipos de fermentao: slida, lquida e submersa 21.

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do que as fermentaes submersa e lquida, respectivamente conforme indica a Figura 14 21. O tempo timo de produo foi de apenas 3 dias, com 6 dias para outros mtodos. O trabalho observou ainda que atravs da fermentao slida, a tanase foi extracelular e mais estvel do que as produzidas por fermentao lquida e submersa. Estes estudos indicam claramente as vantagens da fermentao slida na produo de tanase. Um grande nmero de enzimas comerciais extracelulares (protease, amilase, pectinase, amiloglucosidade e renina) so produzidas com sucesso por fermentao slida no Japo 8. O interesse da fermentao slida para a produo de compostos de importncia comercial conseqncia da demanda por produtos com menor custo de produo. A explorao adequada da fermentao slida pode significar a reduo do custo de produo de tanase. O uso de resduos agroindustriais pode ajudar no somente a reduzir a poluio ambiental, mas tambm agregar valor s indstrias processadoras29. Estima-se que a produo de enzimas comerciais por fermentao slida represente somente 5% do mercado de vendas de enzimas 13. Os pontos de investigao mais explorados na fermentao slida so: Algumas das atuais linhas de pesquisa em fermentao slida so: Enriquecimento protico de materiais residuais, onde microrganismos selecionados aumentam o teor protico destes materiais de modo a serem utilizados na alimentao humana ou animal; Detoxicao de resduos, atravs da eliminao de substncias recalcitrantes que impeam sua aplicao intensiva; A produo de compostos de alto valor agregado, como enzimas e diferentes metablitos 30. O campo de aplicaes da fermentao slida muito vasto. A Tabela 04 apresenta uma sntese de recentes Tabela 4 - Aplicaes da Fermentao slida

publicaes sobre o tema. Em geral, os substratos para a fermentao slida so resduos ou subprodutos da agroindstria. Farelos, cascas, bagaos, e outros so materiais considerados viveis para a biotransformao por fermentao slida. Estas matrias primas so recursos naturais renovveis e geralmente produzidos em grandes quantidades, muitas vezes tornando-se um problema ecolgico e sanitrio 30. Sua estrutura macromolecular podendo ser composta de celulose, amido, pectina, lignina, hemicelulose e protenas os caracteriza como materiais extremamente heterogneos, que servem tanto como fonte de carbono e energia como suporte para o crescimento microbiano 29. O emprego de agroresduos ricos em taninos para produo de tanase objetivo de alguns estudos j publicados 36. Este raciocnio deve-se ao fato de a tanase ser uma enzima induzvel 2 que na presena do substrato tem sua produo evidenciada.

Concluso As tanases so enzimas com grande potencial de aplicao industrial mas com poucos casos comerciais evidenciados destas aplicaes. A produo de insumos de alto valor agregado bem como detanificao de resduos para raes ou resoluo de problemas ambientais so alguns exemplos que se tornariam viveis se o custo desta enzima fosse reduzido. Alm deste aspecto, o estudo das caractersticas de ao da tanase ainda pouca elucidada, dado a grande diversidade dos substratos (taninos) e a biodiversidade microbiana que sintetiza a enzima. Estes pontos por si s justificariam maior interesse e ateno ao assunto ora apresentado, de grande importncia em nosso pas, essencialmente agrcola.

Produto/Processo ENZIMAS Pectinases Hemicelulases Celulases Amilases Protease Tanase

Fonte: PINTO 30

Microrganismo principal Lentinus edodes Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus tamarii Trichoderma reesei Bacillus subtilis Aspergillus niger Aspergillus sp Rhizopus oryzae Bacillus subtilis Aspergillus niger Penicillium glabrum

Substrato Resduos de frutas Farelo de trigo e caf Palha de trigo Palha de trigo, sabugo de milho, bagao de cana Palha de trigo, farelo de trigo, sabugo de milho Resduos de banana Farelo de trigo, resduos de ch Farelo de trigo Farelo de trigo Farelo de trigo Farelo de trigo, Espuma de poliuretano Espuma de poliuretano

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BATTESTIN, V.; MATSUDA, L.K.; MACEDO, G.A. Source and application of tannin and tannase in foods. Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 1, p. 63-72, 2004. ABSTRACT: Tannins occur in an ample variety of vegetables and are classified in condensed and hydrolysable tannins. The tannic acid is a hydrolysable tannin that is broken by enzymes. Tannins are used for stabilization of the beer and resin production. Currently, they are used in biotechnological processes for enzyme production as tannase which hydrolyses ester and depside bonds of hydrolysable tannins releasing gallic acid and glucose. The major applications of this enzyme are in the production of gallic acid, which is used for the manufacture of an trimethoprim and synthesis of esters, such as propyl gallate, used as antioxidants in the food industry. The enzyme also has its applications in the production of beer and juices as a clarifier, in the manufacture of instant tea, and the treatment of wastewater contaminated with polyphenolic compounds. KEYWORDS: Tannins; tannase; biotechnological; foods.

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